LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: " ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR VÀ RT-PCR TRONG CHẨN ĐOÁN WSSV (White Spot Syndrome virus) VÀ GAV (Gill-associated virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG"

Chia sẻ: Cung Ru | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:74

Thêm vào BST

Báo xấu

211
lượt xem 37
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài được thực hiện nhằm xác định khả năng ứng dụng phương pháp RTPCR và PCR trong nghiên cứu tác nhân GAV và WSSV trên tôm sú giống ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Trong 169 mẫu tôm sú giống được phân tích bằng kit IQ2000 YHV/GAV và WSSV thì có 10,7% mẫu cho kết quả dương tính với GAV và 4,2% mẫu cho kết quả dương tính với WSSV.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: " ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR VÀ RT-PCR TRONG CHẨN ĐOÁN WSSV (White Spot Syndrome virus) VÀ GAV (Gill-associated virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG"

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN TRẦN VIỆT TIÊN ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR VÀ RT-PCR TRONG CHẨN ĐOÁN WSSV (White Spot Syndrome virus) VÀ GAV (Gill-associated virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH Ths. NGUYỄN MINH HẬU Ks. TRẦN THỊ MỸ DUYÊN 2007
LỜI CẢM TẠ Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản, Bộ Môn Sinh Học và Bệnh Thủy Sản đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài này Cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài Thầy Nguyễn Minh Hậu, chị Trần Thị Mỹ Duyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi. Các thầy, cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt 4 năm đại học Gia đình và bạn bè luôn ở bên tôi trong suốt thời gian qua Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu i
TÓM TẮT Đề tài được thực hiện nhằm xác định khả năng ứng dụng phương pháp RT- PCR và PCR trong nghiên cứu tác nhân GAV và WSSV trên tôm sú giống ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Trong 169 mẫu tôm sú giống được phân tích bằng kit IQ2000 YHV/GAV và WSSV thì có 10,7% mẫu cho kết quả dương tính với GAV và 4,2% mẫu cho kết quả dương tính với WSSV. Sáu mẫu dương tính với GAV được chọn để thực hiện qui trình của Cowley et al., 2000. Sản phẩm PCR cho kết quả ở 317 bp. Sau đó tiếp tục xác định khả năng ứng dụng khi kết hợp qui trình RT-PCR của Cowley et al. (2000) và qui trình RT-PCR phát hiện gen β-actin (Oanh, 2007) thì phát hiện đồng thời ARNtt của tôm ở vị trí 216 bp và GAV ở vị trí 317 bp. Việc phát hiện cho thấy khả năng ứng dụng β-actin làm đối chứng ARN của tôm trong kỹ thuật RT-PCR. Dựa trên kết quả đạt được, qui trình tương tự đối với WSSV cũng được thực hiện dựa theo qui trình phát hiện WSSV của OIE (2006). Theo qui trình này, sản phẩm PCR sẽ cho kết quả ở 941 bp và phát hiện đồng thời gen β-actin của tôm. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu ii
MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ --------------------------------------------------------------------- i TÓM TẮT -------------------------------------------------------------------------ii MỤC LỤC ------------------------------------------------------------------------iii DANH SÁCH BẢNG ------------------------------------------------------------ v DANH SÁCH HÌNH----------------------------------------------------------- vii CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU -----------------------------------------------------1 CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU-------------------------------------3 2.1 Tổng quan về tình hình nuôi tôm --------------------------------------3 2.1.1 Trên thế giới -------------------------------------------------------3 2.1.2 Ở Việt Nam --------------------------------------------------------4 2.2 Tổng quan về tình hình dịch bệnh trên tôm -------------------------5 2.2.1 Trên thế giới -------------------------------------------------------5 2.2.2 Ở Việt Nam --------------------------------------------------------8 2.3 Sơ lược về GAV --------------------------------------------------------9 2.3.1 Tác nhân gây bệnh ------------------------------------------------9 2.3.2 Phân bố ----------------------------------------------------------- 10 Trung tâm Học 2.3.3 Loài và giai đoạn cảm nhiễm ---------------------------------- 10 liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 2.3.4 Phương thức lây nhiễm ----------------------------------------- 10 2.3.5 Phương pháp chẩn đóan ---------------------------------------- 10 2.3.6 Một số nghiên cứu liên quan đến phương pháp (RT-PCR) phát hiện GAV --------------------------------------------------------- 13 2.4 Sơ lược về WSSV ----------------------------------------------------- 15 2.4.1 Tác nhân gây bệnh ---------------------------------------------- 15 2.4.2 Phân bố ----------------------------------------------------------- 16 2.4.3 Loài và giai đoạn cảm nhiễm ---------------------------------- 16 2.4.4 Phương thức lây nhiễm ----------------------------------------- 17 2.4.5 Phương pháp chẩn đóan ---------------------------------------- 17 2.4.6 Phương pháp phòng và xử lí bệnh ---------------------------- 19 2.4.7 Một số nghiên cứu liên quan đến phương pháp (PCR) phát hiện WSSV-------------------------------------------------------------- 20 2.5 Phương pháp PCR ----------------------------------------------------- 22 2.6 Phương pháp RT-PCR ------------------------------------------------ 24 2.7 Ứng dụng của kĩ thuật PCR trong thủy sản ------------------------ 25 CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ----------------- 26 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ----------------------------------- 26 iii
3.2 Vật liệu nghiên cứu---------------------------------------------------- 26 3.2.1 Dụng cụ----------------------------------------------------------- 26 3.2.2 Hóa chất ---------------------------------------------------------- 26 3.3 Phương pháp nghiên cứu --------------------------------------------- 28 3.3.1 Phương pháp thu mẫu------------------------------------------- 28 3.3.2 Phát hiện GAV với Kit IQ2000YHV/GAV ----------------- 28 3.3.3 Qui trình RT- PCR phát hiện GAV (Cowley et al., 2000) 30 3.3.4 Qui trình RT-PCR phát hiện gen β - actin của tôm (Oanh, 2007) ----------------------------------------------------------- 34 3.3.5 Phát hiện WSSV với Kit IQ2000WSSV --------------------- 36 3.3.6 Ly trích mẫu ----------------------------------------------------- 38 3.3.7 Phương pháp đo hàm lượng ADN, ARN bằng máy so màu quang phổ -------------------------------------------------------------- 39 3.3.8 Khuếch đại ADN (OIE, 2006)--------------------------------- 39 3.3.9 Xử lí số liệu ------------------------------------------------------ 41 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ----------------------------- 42 4.1 Khảo sát tỉ lệ cảm nhiễm tự nhiên GAV, WSSV của tôm sú giống ở một số tỉnh ĐBSCL ---------------------------------------------- 42 4.2 Thực hiện qui trình RT-PCR phát hiện GAV trên tôm theo Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơal., 2000 ----------------------------------- 43 phương pháp của Cowley et @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 4.3 Thực hiện qui trình RT-PCR phát hiện gen β-actin của tôm (Oanh, 2007) --------------------------------------------------------------- 45 4.4 Xác định khả năng ứng dụng của qui trình mRT-PCR phát hiện GAV và gen β-actin trên tôm--------------------------------------------- 47 4.5 Thực hiện qui trình PCR phát hiện WSSV trên tôm theo OIE (2006)------------------------------------------------------------ 48 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ --------------------------------- 55 5.1 Kết luận ----------------------------------------------------------------- 55 5.2 Đề nghị ------------------------------------------------------------------ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO----------------------------------------------------- 56 PHỤ LỤC------------------------------------------------------------------------- 62 iv
DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Diện tích, sản lượng và giá trị xuất khẩu hàng năm của nuôi trồng thủy sản Bảng 2.2: Sản lượng thủy sản phân theo khu vực địa phương (ĐV: Tấn) Bảng 2.3: Ước tính giá trị sản lượng thất thoát do dịch bệnh trên tôm ở Châu Á và Châu Mĩ Bảng 3.1: Trình tự 4 đoạn mồi sử dụng trong qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000 ) Bảng 3.2: Trình tự 2 đoạn mồi sử dụng trong qui trình RT-PCT phát hiện gen β – actin (Oanh, 2007) Bảng 3.3: Trình tự 4 đoạn mồi sử dụng trong qui trình PCR (OIE, 2006) Bảng 3.4: Thành phần hóa chất tham gia vào quá trình trộn hỗn hợp A tạo cDNA Bảng 3.5: Thành phần hóa chất tham gia vào quá trình trộn hỗn hợp B tạo cDNA Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Bảng 3.6: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 1 của qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000) Bảng 3.7: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuyếch đại bước 2 của qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000) Bảng 3.8: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuyếch đại của qui trình RT-PCR phát hiện gen β – actin (Oanh, 2007) Bảng 3.9: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 1 của qui trình OIE (2006) Bảng 3.10: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 2 của qui trình OIE (2006) Bảng 4.1: Hàm lượng ARN của 6 mẫu phân tích Bảng 4.2: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của qui trình mRT-PCR phát hiện GAV và gen β – actin trên tôm Bảng 4.3: Hàm lượng ADN của 3 mẫu phân tích v
Bảng 4.4: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 1 theo qui trình của OIE (2006) Bảng 4.5: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 2 theo qui trình của OIE (2006) Bảng 4.6: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 1 theo qui trình của OIE (2006) với hàm lượng khuôn và mồi tăng gấp đôi Bảng 4.7: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 2 theo qui trình của OIE (2006) với hàm lượng khuôn và mồi tăng gấp đôi Bảng 4.8: Hàm lượng ADN của 3 mẫu phân tích ly trích bằng DTAB/CTAB Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu vi
DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Sản lượng nuôi tôm nuôi và đánh bắt trên thế giới Hình 2.2: Sản lượng tôm nuôi một số nước trên thế giới. Hình 2.3: Sản lượng tôm nuôi trên thế giới năm 2001. Hình 2.4: Tôm bị nhiễm GAV. Mang tôm chuyển sang màu vàng. Hình 2.5: Tôm bị nhiễm GAV. Tòan thân tôm chuyển sang màu đỏ. Hình 2.6: Tôm bị nhiễm GAV. Tế bào biểu mô có hiện tượng nhân kết đặc Hình 2.7: Cơ quan lymphoid nhiễm GAV, mũi tên chỉ sự hiện diện của vi rút Hình 2.8: Cơ quan lymphoid của tôm nhiễm GAV, mũi tên chỉ sự hiện diện của vi rút khi lai In situ. Hình 2.9: Quan sát GAV dưới kính hiển vi điện tử. Hình 2.10: Vi-rút nhuộm âm ở trong huyết tương của tôm sú nhiễm bệnh WSSV, một số thể vi-rút có đuôi Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Hình 2.11: Vỏ của một tôm sú ấu niên bị bệnh đốm trắng Hình 2.12: Lát cắt mô dạ dày của tôm P.chinensis ấu niên bị bệnh đốm trắng Hình 2.13: Lát cắt mang của tôm P.chinensis ấu niên bị bệnh baculovirus đốm trắng Hình 3.1: Minh họa kết quả chạy PCR phát hiện YHV/GAV theo kit IQ2000 Hình 3.2: Minh họa kết quả chạy PCR phát hiện GAV theo qui trình RT- PCR (Cowley et al., 2000) Hình 3.3: Minh họa kết quả chạy PCR theo qui trình RT-PCR phát hiện gen β – actin (Oanh, 2007) Hình 3.4: Minh họa kết quả chạy PCR phát hiện WSSV theo kit IQ2000 Hình 4.1: Tỉ lệ cảm nhiễm GAV trên tôm sú giống Hình 4.2: Tỉ lệ cảm nhiễm WSSV trên tôm sú giống Hình 4.3: Kết quả chạy PCR bước 2 (6 mẫu) theo qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000) vii
Hình 4.4: Kết quả chạy PCR bước 2 (6 mẫu) theo qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000) với mẫu 123 pha loãng với hàm lượng khác nhau Hình 4.5: Kết quả chạy PCR bước 2 theo qui trình RT-PCR phát hiện gen β – actin (Oanh, 2007) với mẫu 123 và 124 Hình 4.6: Kết quả chạy PCR bước 2 theo qui trình RT-PCR phát hiện gen β – actin (Oanh, 2007) với mẫu 123 pha loãng với hàm lượng khác nhau Hình 4.7: Kết quả chạy PCR theo qui trình mRT-PCR phát hiện GAV và β – actin trên tôm Hình 4.8: Kết quả chạy PCR bước 2 theo qui trình của OIE (2006) Hình 4.9: Kết quả chạy PCR bước 2 theo qui trình OIE (2006) với hàm lượng khuôn và mồi tăng gấp đôi Hình 4.10: Kết quả kiểm tra ADN trên gel với agarose 1% Hình 4.11: Kết quả chạy PCR bước 2 mẫu 142 (với 4 hàm lượng ADN Trung tâm Học liệu ĐHtheo qui ThơOIE (2006)liệu học tập và nghiên cứu khuôn) Cần trình @ Tài Hình 4.12: Kết quả chạy PCR bước 2 theo qui trình OIE (2006) của mẫu ly trích bằng DTAB/CTAB viii
CHƯƠNG I GIỚI THIỆU Hiện nay ngành nuôi trồng thủy sản đã và đang ngày càng có vai trò quan trọng, đem lại hiệu quả kinh tế cao. Đặc biệt là ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), ngành nuôi trồng thủy sản đã trở thành thế mạnh của vùng trong những năm gần đây. Tổng diện tích có tiềm năng phát triển khả năng nuôi trồng thủy sản trong vùng trên 1.200.000 ha bằng gần 55% diện tích nuôi của cả nước (Bộ thủy sản, 2006). Ngành thủy sản với sự phát triển nhanh của mình đã tạo ra hàng loạt việc làm, nuôi trồng thủy sản chủ yếu ở qui mô hộ gia đình nên đã trở thành nguồn thu hút một lực lượng lao động đông đảo tham gia vào tất cả công đoạn sản xuất, làm giảm sức ép của nạn thiếu việc làm trên cả nước. Tuy nhiên ở khá nhiều nơi do phát triển ồ ạt, tự phát, thiếu quy hoạch người nuôi chưa có hiểu biết cơ bản về kỹ thuật nuôi tôm nhất là chưa nhận thức đúng mức về nguy cơ ô nhiễm môi trường và dịch bệnh trong quá trình nuôi tôm nên năng suất thấp, tổn thất là điều không tránh khỏi, gây khó khăn về đời sống kinh tế cho người nuôi tôm. Hiện nay có nhiều loại bệnh xuất hiện trong quá trình nuôi tôm nhưng nguy hiểm nhất là bệnh do vi-rút gây ra như Trung tâm Học liệu ĐH Cần (White @ Tài liệu học tập và nghiên cứu vi-rút gây bệnh đốm trắng Thơ Spot Syndrome Virus - WSSV), vi-rút gây hội chứng Taura (Taura Syndrome Virus - TSV), vi-rút gây bệnh đầu vàng (Yellow Head Virus - YHV).... Đặc biệt là vi-rút gây bệnh liên kết mang (Gill- associated Virus - GAV) bệnh này xuất hiện đầu tiên vào năm 1996 ở Queensland, Úc (Spann et al., 1997). Do chưa có thuốc chữa trị đặc hiệu nên công tác phòng ngừa và chẩn đoán bệnh sớm là rất cần thiết. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như mô bệnh học hay dựa trên kinh nghiệm của người nuôi không cho phép phát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh. Nhiều phương pháp như lai In situ, Western blot, PCR, RT-PCR được phát triển nhằm khắc phục những nhược điểm vừa kể trong việc phát hiện GAV, WSSV trên tôm sú giúp người nuôi phát hiện kịp thời, hạn chế đến mức thấp nhất thiệt hại do dịch bệnh gây ra, nâng cao năng suất (Phan Quốc Việt và ctv, 2003). Do đó đề tài “Ứng dụng kỹ thuật PCR và RT-PCR trong chẩn đoán WSSV (White Spot Syndrome Virus) và GAV (Gill associated virus) trên tôm sú (Penaeus monodon) ở đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện. 1
Mục tiêu của đề tài Xác định khả năng ứng dụng qui trình RT-PCR và PCR trong chẩn đoán phát hiện sớm vi-rút GAV, WSSV trên tôm sú (Penaeus monodon) ở đồng bằng sông Cửu Long. Nội dung của đề tài 1. Xác định tỉ lệ cảm nhiễm tự nhiên của GAV và WSSV trên tôm giống xét nghiệm tại Khoa Thủy sản từ tháng 2-5/2007 sử dụng kit IQ2000YHV/GAV và kit IQ2000WSSV 2. Thực hiện qui trình RT-PCR phát hiện GAV ở tôm sú theo phương pháp của Cowley et al. (2000) 3. Thực hiện qui trình RT-PCR phát hiện gen β – actin ở tôm sú theo Oanh (2007) 4. Xác định khả năng ứng dụng qui trình mRT-PCR phát hiện GAV và β - actin 5. Thực hiện qui trình PCR phát hiện WSSV trên tôm sú theo OIE (2006) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 2
CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan tình hình nuôi tôm 2.2.1 Trên thế giới Nghề nuôi tôm biển có lịch sử lâu đời, hiện nay đang giữ vai trò quan trọng trong nền kinh tế của các nước trong đó nuôi tôm thương phẩm mang lại giá trị to lớn cho người nuôi, sản lượng tôm nuôi của Châu Á và Nam Mỹ đạt 50.000 tấn vào năm 1970 và hơn 600.000 tấn năm 1988, tốc độ tăng trưởng hằng năm 20-30%, vượt qua thập kỉ 1985-1995, làm tăng sản lượng tôm nuôi trên thế giới xấp xỉ 400%, góp phần vào việc cung cấp 25% trong tổng sản lượng trên thế giới. Tiêu biểu nhất là Châu Á nơi nắm 75% tổng sản lượng thế giới, 25% còn lại thuộc về các nước Châu Mĩ La Tinh nơi mà Brazil là nước nổi bật nhất với sản lượng 90.000 tấn năm 2003. Hiện nay có 2 khu vực nuôi tôm lớn là Tây Bán Cầu và Đông Bán Cầu. Loài nuôi chủ yếu là P.monodon chiếm 86% sản lượng Đông Bán Cầu và 56% sản lượng thế giới, còn ở Tây Bán Cầu là P.vannamei. (http://en.wikipedia.org/wiki/Shrimp_farm"). Năm Trung tâm Học liệu ĐH nuôi đãThơquá 1,6 triệu tấn mang lại hơnvà nghiên cứu 2003 sản lượng tôm Cần vượt @ Tài liệu học tập 9.000 triệu đô la. Thêm vào đó việc xuất khẩu Thẻ chân trắng ở Châu Á đã tạo nên sự bùng nổ sản lượng, đặc biệt là Trung Quốc. Đến năm 2005 sản lượng đã tăng lên nhanh chóng đạt gần 6,5 triệu tấn. (Helga, 2004, 2007) 7 6 Sản lượng tôm nuôi 5 Sản lượng tôm đánh bắt Triệu tấn 4 3 2 1 0 1976 1978 1980 1982 1984 1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 3
Hình 2.1 Sản lượng nuôi tôm nuôi và đánh bắt trên thế giới. Nguồn: Globefish Thái Lan Indonexia Ecuado Ấn Độ Việt Nam Trung Quốc Khác Hình 2.2 Sản lượng tôm nuôi một số nước trên thế giới. Nguồn: Globefish 2.1.2 Ở Việt Nam Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Diện tích nuôi tôm ở ĐBSCL thời kỳ 1973-1974 đạt khoảng 70.000 ha. Ở Miền Bắc, trước năm 1975 có khoảng 15.000 ha nuôi tôm nước lợ. Đến giữa thập kỷ 90 (1994-1995), phát triển nuôi tôm ở Việt Nam có phần chững lại do gặp phải nạn dịch bệnh tôm. Trong các năm 1996 -1999, bệnh dịch có giảm nhưng vẫn tiếp tục gây thiệt hại cho người nuôi. Sự bùng nổ của nghề nuôi tôm thương phẩm được đánh dấu vào năm 2000, khi Chính phủ ban hành Nghị quyết 09, cho phép chuyển đổi một phần diện tích trồng lúa, làm muối năng suất thấp, đất hoang hoá sang nuôi trồng thủy sản. Diện tích nuôi tôm đã tăng từ 250.000 ha năm 2000, đến 2005 là 959.900 ha, nuôi tôm công nghiệp và bán công nghiệp hơn 36.559 ha. (Tạp chí Thủy sản, 2006). Theo số liệu hiện có, Việt Nam là nước có diện tích nuôi tôm vào loại lớn trên thế giới, vượt xa Indonexia, nước có diện tích nuôi tôm lớn nhất vào năm 1996, khoảng 360.000 ha. Phần lớn diện tích nuôi tôm ở Việt Nam tập trung ở ĐBSCL, rải rác dọc các cửa sông, kênh, rạch ven biển miền Trung và ở đồng bằng sông Hồng, sông Thái Bình ở miền Bắc. (http://www.vietlinh.com.vn/ html/tintuc) 4
Song song với việc mở rộng diện tích, sản lượng tôm nuôi cũng tăng mạnh từ những năm 90 và đặc biệt là từ sau năm 2000, Việt Nam trở thành một trong những nước có sản lượng tôm nuôi cao nhất trên thế giới. Việt nam Khác 5% Bangladet 6% 22% Inđônêxia Việt nam 11% Bangladet Inđônêxia Ấn Độ Ấn Độ 12% Trung Quốc Thái lan Thái lan Khác Trung Quốc 32% 12% Hình 2.3 Sản lượng tôm nuôi trên thế giới năm 2001.Nguồn:Globefish. Các loài tôm nuôi chính ở Việt Nam gồm tôm sú (Penaeus monodon), tôm he (Penaeus merguiensis), tôm nương (P.orientalis), tôm đất/rảo (Metapenaeus ensis), trong đó tôm sú là loài nuôi chủ đạo, đóng góp sản lượng cao nhất. Gần Trung tâm Học liệu trắng CầnMỹ (P.vannamei) liệu học đưa vào nuôi ở Việt cứu đây tôm chân ĐH Nam Thơ @ Tài cũng được tập và nghiên Nam. Công nghệ nuôi tôm ở Việt Nam trong 20 năm qua đã đạt được những tiến bộ đáng kể. Ở Việt Nam đã tồn tại cả 3 hình thức nuôi tôm là quảng canh (cải tiến), bán thâm canh và nuôi thâm canh. Đến năm 2005 sản lượng là 1.437,4 nghìn tấn, chiếm trên 70% tổng sản lượng và 60% trong số 3,35 tỉ đô la Mỹ kim ngạch xuất thủy sản của cả nước (Bộ Thuỷ sản, 2005). Năm 2003, giá trị kim ngạch xuất khẩu thủy sản của cả vùng đạt trên 1,28 tỷ đô la, chiếm trên 57% kim ngạch xuất khẩu của cả nước. Nuôi trồng thủy sản ở ĐBSCL chuyển mạnh sang sản xuất hàng hóa quy mô lớn, từng bước trở thành một nghề sản xuất quan trọng, phát triển rộng khắp và có nhiều tiềm năng vững chắc trong thời kỳ đẩy mạnh công nghiệp hóa và hiện đại hóa đất nước (Phạm Đình Đôn, 2006) 2.2 Tổng quan về tình hình dịch bệnh trên tôm 2.2.1 Trên thế giới Trong suốt 10 năm qua, nền công nghiệp tôm nuôi ở Châu Á-Thái Bình Dương và Châu Mỹ gặp phải khó khăn do sự tác động mạnh mẽ dịch bệnh do vi-rút gây nên (Walker, 1999). Tổng thiệt hại do vi-rút gây ra trung bình hàng năm cho thế giới khoảng hơn 1 tỷ đô la. Có ít nhất 4 loại vi-rút là nguyên nhân 5
gây bùng nổ dịch bệnh ở các trại nuôi tôm trên toàn thế giới là White Spot Syndrome Virus (WSSV), Yellow Head Virus (YHV), Taura Syndrome Virus (TSV), và Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV). Bảng 2.1 Diện tích, sản lượng và giá trị xuất khẩu hàng năm của nuôi trồng thủy sản Tổng sản lượng Sản lượng nuôi Giá trị xuất khẩu Diện tích mặt Năm thủy sản (tấn) thủy sản (tấn) (1.000 đô la) nước NTTS (ha) 1990 1.019.000 310.000 205.000 491.723 1991 1.062.163 347.910 262.234 489.833 1992 1.097.830 351.260 305.630 577.538 1993 1.116.169 368.604 368.435 600.000 1994 1.211.496 333.022 458.200 576.000 1995 1.344.140 415.280 550.100 581.000 1996 1.373.500 411.000 670.000 585.000 1997 1.570.000 481.000 776.000 600.000 1998 1.668.530 537.870 858.600 626.330 1999 1.827.310 614.510 971.120 630.000 2000 2.003.000 723.110 1.478.609 652.000 2001 2.226.900 879.100 1.777.485 887.500 2002 2.410.900 976.100 2.014.000 955.000 2003 2.536.361 1.110.138 2.199.577 902.229 2004 3.073.600 1.150.100 2.400.781 902.900 2005 3.432.800 1.437.400 2.738.726 959.900 2006 3.695.927 1.694.271 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 3.357.960 1.050.000 Bảng 2.3 Sản lượng thủy sản phân theo khu vực địa phương (ĐV: Tấn) Sản lượng khai thác Sản lượng Sản lượng STT Địa phương năm 2005 nuôi trồng Sản lượng Khai thác khai thác nội địa Tổng cả 3432766 1437355 1809689 185722 nước Đồng bằng 1 323845 215319 88238 20288 Sông Hồng 2 Đông Bắc 88092 45007 35471 7614 3 Tây Bắc 7313 5900 1413 4 Bắc Trung Bộ 239914 61115 166957 11842 Duyên Hải 5 410171 25871 379708 Nam Trung Bộ 6 Tây Nguyên 14185 10506 3679 7 Đông Nam Bộ 509114 90253 411173 7688 8 Đồng Bằng 1782211 925590 728015 128606 6
Sông Cửu Long Nguồn: Bộ Thủy sản 2006 Ở Châu Á, theo Chanratchakool et al. (1999). YHV là vi-rút gây thảm khốc và làm suy giảm nền kinh tế ở Châu Á. Bệnh được phát hiện đầu tiên ở Thái Lan vào năm 1990. Làm thất thoát hơn 30,6 triệu đô la năm 1992 và 650 triệu đô la vào năm 1994. Theo báo cáo của Walker (1999) thì vi-rút có họ hàng với YHV-GAV được phát hiện đầu tiên 1996 ở nông trại Bắc Queensland, Úc. Nhiễm 100% trên tôm sú tự nhiên. Thời kì 1994-1998 làm mất 32,5 triệu đô la, giảm 38% sản lượng. Cùng với YHV, WSSV góp phần làm tôm nuôi chết hàng loạt. WSSV được báo cáo đầu tiên vào năm 1992, 1993 ở Trung Quốc và Nhật Bản, năm 1994 WSSV đã gây thiệt hại 400 triệu đô la, ở Thái Lan hơn 500 triệu đô la năm 1996, Ecuador năm 1999 có khoảng 150.000 người mất việc do dịch bệnh tôm và thiệt hại hơn 580 triệu đô la năm 2000 (Toshiaki, 2003) Theo đó là báo cáo về TSV xuất hiện vào năm 1992 ở gần sông Taura ở Ecuador. Đến năm 1993-1994 làm giảm 90% sản lượng P.vannamei ở nước này. Làm hơn 26.000 người mất việc. Nhiều nông trại phải đóng cửa và 74% Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài lượng học tập và nghiên cứu thất nghiệp năm 1999. Giảm 15-25% sản liệu thế giới. (Graindorge and Griffith, 1999). Đồng thời bùng phát ở Honduran cũng làm giảm 18% sản lượng năm 1994 và 31% năm 1995 (Corralet et al., 1999) Bảng 2.3 Ước tính giá trị sản lượng thất thoát do dịch bệnh trên tôm ở Châu Á và Châu Mỹ Vi-rút Từ năm xuất hiện đến Giá trị sản lượng bị thất 2001 thoát (đô la) WSSV - Asia 1992 $4-6 billion WSSV-Americas 1999 >$ 1 billion TSV 1991-1992 $1-2 billion YHV 1991 $ 0.1-0.5 billion IHHNV* 1981 $ 0.5-1.0 billion Bao gồm sản lượng thất thoát của Gulf of California fishery 1989-1994 MBV (Peneaus mondon type baculovirus) làm tôm nuôi chết hàng loạt ở Đài Loan đến Mexico năm 1980 và ở Thái Lan 1990 (Flegel, 2004). Còn ở Úc thì MBV được báo cáo trên cả P.mondon và P.merguiensis. Năm 1984 trên 7
P.merguiensis ở Townsvill (Bắc Queensland) đã tìm thấy thể ẩn của MBV. Đến giữa 1994 thì vi-rút này gây tỉ lệ chết cao hơn 80% (Walker, 1999) IHHNVđược biết đến là loài vi-rút nhỏ nhất trên tôm, là nguyên nhân gây tỉ lệ chết nghiêm trọng (>90%) trên tôm giống và tôm trưởng thành P.Stylirostris , P.vannamei ở trại nuôi thâm canh ở Hawaii. Sau khi được phát hiện ở Hawaii 1981 thì IHHNV lại được tìm thấy ở những trại nuôi tôm ở Mỹ và tôm tự nhiên ở bờ biển Thái Bình Dương Hiện nay, ngày càng có nhiều loài vi-rút xuất hiện trên tôm. Theo Lightner, (2003) thì đã tìm thấy hơn 10 loài vi-rút gây bệnh trên tôm, chủ yếu là họ tôm he (Penaeid). Là nguyên nhân gây tỉ lệ chết cao và làm thất thoát sản lượng, ảnh hưởng nghiêm trọng đến đối với nghề nuôi tôm trên thế giới 2.2.2 Ở Việt Nam Song song với việc tăng diện tích, tăng sản lượng, tăng mức độ thâm canh thì tình hình dịch bệnh cũng tăng nhanh. Ở Việt Nam ngay từ những năm đầu thập niên 90, cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm công nghiệp, "dịch bệnh" tôm ở Việt Nam bắt đầu xuất hiện. Theo thống kê của Bộ Thủy sản (1995) từ năm 1993 – 1995 dịch bệnh tôm đã báo động trên toàn quốc, làm thiệt hại hàng ngàn tỷ đồng. Trong năm 1994 tổng diện tích nuôi tôm có dịch Trung tâm Học 84.558ĐH Cầnlượng thiệt hại ước tính học tập và giá khoảng cứu bệnh là liệu ha với sản Thơ @ Tài liệu là 5.225 tấn trị nghiên 294 tỷ đồng. Năm 1990, MBV đã gây tỉ lệ chết cao ở hàng loạt những trại giống. Trong trận dịch năm 1993 nghiên cứu thấy có sự xuất hiện của MBV, WSSV, YHV, Vibriosis làm mất hơn 100 triệu, đến năm 1994 đã làm thất thoát 70-80% giá trị kinh tế của đất nước (Lê Văn Khoa và ctv., 1999). Đến nay, dịch bệnh vẫn tồn tại và lây lan ngày càng rộng gây tổn thất nghiêm trọng. Thiệt hại nặng nhất là ĐBSCL vì đây là khu vực có phong trào nuôi tôm phát triển mạnh, tỷ lệ sản lượng tôm nuôi chiếm hơn 50% của cả nước. Trong thời gian từ trung tuần tháng 12/2001 đến nay, ở một số tỉnh ĐBSCL đã và đang xảy ra dịch bệnh trên tất cả các mô hình nuôi, tỷ lệ diện tích bị nhiễm bệnh chiếm khoảng 30-60% trên tổng diện tích nuôi (Theo Khuyến ngư Kiên Giang, 2003) và được coi là “đại dịch tôm sú”. Chủ yếu chết do đốm trắng và hiện tượng đỏ thân. Tại các vùng mới chuyển đổi, đã có 20.854 ha bị thiệt hại, một số vùng ở Cà Mau thiệt hại tới hơn 80%. Vụ đầu năm 2002, bệnh tôm lại tái diễn ở ĐBSCL. Đến hết tháng 9/2003, cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha. Các tỉnh, thành ven biển từ Ðà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả nước, Cà 8
Mau bị hơn 232 ha, nhất là miền Trung thất bại nặng nề khi tính đến ngày 8/3, toàn tỉnh Quãng Ngãi có 150 ha tôm bị chết trong tổng số 450 ha được thả nuôi. (Theo Lao Động, 2003). Khánh Hoà, Phú Yên, Quảng Nam, Ninh Thuận có hàng nghìn ha tôm bị nhiễm bệnh. Riêng thiệt hại của Khánh Hoà ước tính 26,6 tỷ đồng, Bình Định 40 tỷ (Mai Phương – Hà Yên, 2003). Còn ở các tỉnh miền Bắc như Bắc bộ, Thanh Hoá hơn 40% diện tích tôm nuôi bị bệnh, tập trung khu công nghiệp Hoằng Phụ, với 70/110 ha nuôi tôm bị bệnh. Nghệ An có 9,1-47,8% diện tích nuôi tôm bệnh đốm trắng, 25,6%-30,4% MBV, 25- 54,5% bệnh đầu vàng (Hà Anh, 2004). Trong vụ tôm sú năm nay (2007), tính đến thời điểm này ở các huyện vùng hạ dịch bệnh trên tôm sú đang bùng phát. Theo thông tin sơ bộ ban đầu, ở huyện Cần Giuộc diện tích thiệt hại khoảng 600 ha, huyện Cần Đước 637 ha, huyện Châu Thành khoảng 100 ha, rải rác ở huyện Tân Trụ là 5 ha và đang có chiều hướng phát triển lan rộng. (Theo báo Long An, 2007) Do thời tiết diễn biến phức tạp, năm 2007 ở các tỉnh miền Bắc và miền Trung dịch bệnh tôm sú xảy ra sớm hơn những năm trước và xảy ra hầu hết ở các huyện. Trong đó, Nghi Xuân 25 ha, Thạch Hà 15 ha, thị xã Hà Tĩnh 10 ha, Kỳ Anh 5 ha, Cẩm Xuyên 3 ha. (Theo báo Hà Tĩnh, 2007) Còn ở Bình Định, toàn tỉnh có 109 ha tôm nuôi bị dịch bệnh. Địa phương có Trung tâm Học liệu ĐHnuôi bị dịch bệnh làTài Mỹ với 43,6 tập và nghiên cứu nhiều diện tích tôm Cần Thơ @ Phù liệu học ha, tiếp đến là huyện Tuy Phước 29 ha, TP Quy Nhơn 23, Hoài Nhơn 13,4 ha. (Theo báo Bình Định, 2007) Theo thống kê của Sở Thuỷ sản tỉnh TT-Huế, đến thời điểm này, trên địa bàn tỉnh có hơn 800 ha/2.848 ha hồ tôm đã thả nuôi ở các huyện Phú Vang, Phú Lộc, Quảng Điền, Hương Trà bị nhiễm bệnh, làm chết hơn 60 triệu con tôm nuôi từ 20 - 60 ngày tuổi, gây thiệt hại cho người dân hơn 13 tỉ đồng. Trong số diện tích bị nhiễm bệnh, có đến 450 ha bị bệnh đốm trắng, số còn lại bị bệnh còi và đầu vàng. Đặc biệt, dịch bệnh năm nay lại đến sớm và lây lan nhanh hơn so với mọi năm, và đến thời điểm này vẫn chưa có dấu hiệu cho thấy dịch bệnh đã được khống chế. (Theo báo Lao Động, 2007) 2.3 Sơ lược về GAV 2.3.1 Tác nhân gây bệnh Theo Cowley et al. (2000) GAV (Gill associated virus) thuộc bộ Nidovirales, họ Roniviridae, loài Okavirus GAV là một lọai vi-rút mà nucleocapsid có dạng ống xoắn và thể vi-rút (virion) hình que, có vỏ bao, hình dạng giống vi-rút đầu vàng. Kích thước 9
nucleocapsid 16-18 x 166-435 nm. Axit nhân là ARN mạch đơn (ssARN) (Bùi Quang Tề, 2003). GAV được tìm thấy khá nhiều ở mang và cơ quan bạch huyết nhưng cũng được tìm thấy ở các tế bào máu. Khi lây nhiễm cấp tính tế bào máu sẽ giảm nhanh, ở cơ quan bạch huyết bị rối loạn tổ chức và không có cấu trúc ống bình thường và phát hiện được vi-rút trong các mô liên kết của tất cả các cơ quan chủ yếu (Subasinghe, 2001). 2.3.2 Phân bố GAV được phát hiện vào năm 1996 khi gây tỉ lệ chết cao ở 4 nông trại ở Queensland, Úc, và được báo cáo tìm thấy ở miền nam xứ Walve và miền bắc Territory (Herfort, 2004) 2.3.3 Loài và giai đoạn cảm nhiễm Spann và cộng tác viên đã nghiên cứu sự nhạy cảm của bốn loài tôm Peneaus monodon, Penaeus esculentus, Marsupenaeus japonicus, Fennerropennaeus merguiensis với GAV cho thấy lây nhiễm tự nhiên với GAV chỉ tìm thấy ở tôm Peneaus monodon, nhưng lây nhiễm thực nghiệm đã gây ra tử vong ở tôm Penaeus esculentus, Fennerropennaeus merguiensi. Tính kháng bệnh có liên quan đến tuổi và kích cỡ tôm đã được tìm thấy ở tôm Marsupenaeus Trung tâm Học liệu ĐH Cần là đặc hữu ở tômliệu học tập và nghiên cứu japonicus. Mặc khác GAV Thơ @ Tài Peneaus monodon khỏe mạnh ở vùng bắc Queensland. Hiện vẫn chưa rõ có phải việc gia tăng bệnh là do kết quả của streess môi trường dẫn đến triệu chứng lâm sàng của vi-rút trước khi hiện hữu, vì nó có thể xuất hiện với bệnh đầu vàng và bệnh đốm trắng hoặc liệu bệnh này phát sinh từ một lây nhiễm mới với một chủng gây bệnh của GAV (Bodad-reantaso et al., 2001). 2.3.4 Phương thức lây nhiễm Dạng lan truyền theo phương nằm ngang có hiệu quả nhất là do ăn thịt lẫn nhau, nhưng việc lan truyền cũng có thể do nguồn nước. GAV cũng có thể truyền theo phương thẳng đứng từ tôm bố mẹ còn khỏe. Vi-rút có thể lan truyền từ bố hoặc từ mẹ hoặc cả hai, nhưng không rõ sự lan truyền có trong trứng hay không (Bodad-reantaso et al., 2001) 2.3.5 Các phuơng pháp chẩn đóan bệnh Theo tài liệu của FAO về Hướng dẫn chẩn đoán bệnh trên động vật thủy sản Châu Á thì các phương pháp chẩn đóan GAV gồm: 2.3.5.1 Dự chẩn Các quan sát chung (Mức độ I) 10
Tôm bị nhiễm GAV cấp tính có biểu hiện lờ đờ, kém ăn, bơi lâu trên mặt nước hoặc quanh bờ ao. Thân tôm biến thành màu đỏ sẫm, đặc biệt các phần phụ bộ, cánh đuôi và phần miệng, mang biến sang màu vàng-hồng. Còn quan sát thấy kí sinh trùng bám trên mang bẩn. Những biểu hiện chung của GAV cấp tính luôn thay đổi và không phải luôn nhận thấy được, vì thế chúng không đáng tin cậy ngay cả chẩn đoán sơ bộ Hình 2.4 Tôm bị nhiễm GAV, mang tôm chuyển sang màu vàng ( Bùi Quang Tề, 2003) Tế bào/mô bệnh học (Mức độ II) Tiêu bản mô bệnh học nhuộm bằng H&E. Các cơ quan bạnh huyết của tôm bị Trung tâm Học liệu ĐHdạng tiểu quản@ Tài liệu học tập và bị phá vỡ, cứu bệnh mất cấu trúc Cần Thơ thông thường. Tại những nơi nghiên không có nhân hoặc tế bào rõ ràng với nhân phình to, ngưng kết hoặc tạo ra không bào. Foci của các tế bào không bình thường thấy ở trong các cơ quan bạch huyết và chúng bắt màu Eosin sẫm. Các mang của tôm bệnh có biểu hiện hư hại về cấu trúc như gắn kết các đầu tơ mang, hoại tử toàn bộ và mất lớp biểu bì của các lá mang sơ cấp và thứ cấp. Cấu trúc tế bào của mang biểu hiện bình thường tách biệt với foci nhỏ bắt màu kiềm của các tế bào hoại tử. Hình 2.5 Tôm bị nhiễm GAV. Toàn thân tôm chuyển sang màu đỏ. (D Callinan, trích dẫn bởi Herfort, 2004) 11