Một số phương pháp hóa phân loại xạ khuẩn – Phần 1

Chia sẻ: Nguyen Uyen | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

75
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Chuẩn bị thành tế bào 1. Tế bào ướt (1-2 ml) + 5ml nước cất vô trùng + hạt thủy tinh (loại lớn và nhỏ, đường kính 0.11-0.12mm). Phá tế bào bằng sóng siêu âm ca.180 trong 1- 1.5 giờ cho đến khi dung dịch trở nên trong. Chuyển sang ống falcon 50ml. Nếu ngừng công việc ở đây, giữ mẫu ở 4oC. 2. Ly tâm với tốc độ 3000g trong 30 phút. Chuyển dịch trên sang ống ly tâm tốc độ cao (có nắp đậy bên trong). Ly tâm với tốc độ 17000rpm trong 30 phút. Bỏ dịch...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Một số phương pháp hóa phân loại xạ khuẩn – Phần 1

Một số phương pháp hóa phân loại xạ khuẩn – Phần 1 C huẩn bị thành tế bào Tế bào ướt (1-2 ml) + 5ml nước cất vô trùng + hạt thủy tinh (loại lớn và 1. nhỏ, đường kính 0.11-0.12mm). Phá tế bào bằng sóng siêu âm ca.180 trong 1- 1.5 giờ cho đến khi dung dịch trở nên trong. Chuyển sang ống falcon 50ml. Nếu ngừng công việc ở đây, giữ mẫu ở 4oC. Ly tâm với tốc độ 3000g trong 30 phút. Chuyển dịch trên sang ống ly tâm 2. tốc độ cao (có nắp đậy bên trong). Ly tâm với tốc độ 17000rpm trong 30 phút. Bỏ dịch trên. Thêm 3ml SDS 4% (SDS có tác dụng loại lipid và protein). Nếu dừng 3. công việc ở đây, giữ mẫu ở nhiệt độ phòng. Giữ ở 100oC trong 40 phút, nhớ vặn chặt nắp. 4. Ly tâm với tốc độ 17000 rpm trong 30 phút ở 30oC (nếu giữ ở nhiệt độ 5. thấp, SDS sẽ bị kết tinh). Loại bỏ dịch trên. Rửa với nước ít nhất 3 lần với điều kiện giống trên (17000rpm, 30 phút) 6. Nếu cần thiết, xử lý bằng RNase và DNase. 7.
Đông khô qua đêm. 8. Phân tích thành phần acid amin trong thành tế bào 2-3mg thành tế bào + 200µl HCl 4N, vặn chặt nắp, giữ ở 100oC qua đêm 1. Làm khô bằng hút chân không (khoảng 1 ngày 1 đêm) 2. Thêm 200 µl nước cất, trộn đều, chuyển sang ống eppendorf, ly tâm với tốc 3. độ 12000 rpm trong 5 phút. Lọc mẫu. Chạy sắc ký bản mỏng TLC: 4. - Dung môi: Methanol 80ml Nước cất 17.5ml 6N HCl 4 ml Pyridine 10ml - Cellulose TLC Chuẩn (1µl): DAP, Ala, Gly, Glu, Lys - Mẫu: 3-5µl -
Nhận biết bằng phun ninhydrin, giữ ở 100oC trong 5 phút. Các acid - amin sẽ hiện lên dưới dạng các chấm màu tím. Để lâu, các chấm này dần dần biến mất, nhưng riêng chấm của DAP sẽ chuyển sang màu vàng. Chuẩn bị mẫu chạy HPLC: chuẩn bị cho cả mẫu và chuẩn 5. 10-20 µl (25nmol) mẫu, làm khô bằng hút chân không (khoảng 2h) - Thêm 20 µl Ethanol/DW/Triethylamine 2/2/1, trộn đều, làm khô bằng hút - chân không (khoảng 2h) Thêm 20 µl Ethanol/DW/Triethylamine/Phenylisothiocyanate 7/1/1/1, trộn - đều, giữ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút, làm khô bằng hút chân không (khoảng 2h) Thêm 0.5ml dung dịch A(dich chạy HPLC), lọc mẫu dùng làm mẫu chạy - HPLC Điều kiện chạy HPLC Độ hấp thụ (absorbance) 0.01 - Sử dụng UV detector ở bước sóng 254nm - Dung dịch A: 6% CH3CN, dung d ịch B: 60% CH3CN -
Tốc độ dòng chảy: 1ml/phút - Chương trình Thời gian Nồng độ dung dịch (phút) B(%) 0 0 15 70 15.1 100 25 100 25.1 0 Dừng 30 Phân tích thành phần menaquinone 100-500mg tế bào khô + 10-15 ml Chloroform: methanol (2:1), trộn bằng 1. khuấy từ chậm trong 2-3 giờ. Chuyển sang ống falcon, ly tâm 3000 rpm trong 5-10 phút, lấy dịch trên, làm 2. khô bằng cô quay
Hòa tan bằng 1,5 ml acetone, chuyển sang ống eppendorf, làm khô bằng hút 3. chân không Thêm 50 µl ethanol, chấm toàn bộ mẫu lên bản TLC silicagel, tránh ánh sáng 4. và nhiệt độ cao( không làm khô mẫu bằng máy sấy). Dung môi chạy TLC: Toluen. Sau đó, kiểm tra menaquinone bằng tia UV 5. (thường nằm dưới vạch màu vàng có thể nhìn thấy bằng mắt thường). Chuẩn: Vitamin K. Vạch ngang với vitamin K là menaquinone. Cạo vạch đã được nhận biết bằng UV, cho vào ống eppendorf, thêm 1,5ml 6. acetone, trộn đều. Ly tâm với tốc độ 3000 rpm trong 5 phút, lấy dịch trên, làm khô bằng Nitơ 7. lỏng. Thêm 50-100 µl ethanol, lọc và dùng làm mẫu chạy HPLC và Mass 8. spectrometer (MS) Điều kiện chạy HPLC 9. - Dung môi: Methanol: Propanol (2:1) Tốc độ dòng chảy: 0.2ml/min - Nhiệt độ cột: 40 oC -
Nhận biết bằng UV detector với bước sóng 275 nm - Sau khi phân tích, ứng với mỗi pick trên LC, sẽ có pick trên MS. Chỉ số của MS chính là chỉ số m/z, sau đó trừ đi 1(vì MS thêm vào 1 proton), rồ i so với giá trị trong bảng sẽ biết được là loại menaquinone nào. Quan trọng nhất là pick cuối c ùng và cao nhất (vì menaquinone rất dễ bị đứt gãy). VD: MK-9 (H4) có nghĩa là menaquinone có chứa 9 đơn vị isoprene, trong đó có hai đơn vị isoprene bão hòa. Menaquinone này có thể bị đứt gãy dễ dàng nên xuất hiện các pick nhỏ hơn. Xạ khuẩn có MK 7,8,9,10,11. Một vài loại có MK12. Phân tích thành phần đường trong tế bào 30-50mg tế bào khô + 1ml H2SO4 1N, lắc nhẹ, vặn chặt nút, giữ ở 100oC 1. trong 2 giờ. Để nguội, chuyển sang cốc thủy tinh, chỉnh pH 5.2-5.5 bằng dung dịch 2. Ba(OH)4 bão hòa. Chuyển sang ống eppendorf. Ly tâm với tốc độ 3000 rpm trong 5 phút, 3. chuyển dịch trên sang cốc thủy tinh, làm khô bằng hút chân không
Hòa tan bằng 300 µl DW, chuyển sang ống eppendorf, ly tâm với tốc độ 4. 3000rpm trong 5 phút, lấy dịch trên, lọc mẫu. Chạy sắc ký bản mỏng TLC: 5. - TLC cellulose 3 µl mẫu - 1 µl chuẩn - Chuẩn 1: galactose, arabinose, xylose 0.1% (w/v) hòa tan trong nước Chuẩn 2: rhamnose, mannose, glucose, ribose 0.1% (w/v) hòa tan trong nước Chuẩn 3: madurose (3-O -methyl-D-glucose) 0.1% (w/v) hòa tan trong nước Dung môi chạy TLC: n-buthanol:water:pyridine:toluene= 10:6:6:1 (v/v) - Để khô, phun Acidity phthalate aniline (phtalic acid 3.25g hòa tan trong 100 - ml dung d ịch n-buthanol bão hòa, thêm 2ml aniline). Giữ ở 100oC trong 4 phút Chuẩn bị dung dịch n-buthanol bão hòa: DW + n-buthanol (1:1), cho vào - bình tách mẫu, lắc trộn đều, loại lớp d ưới Chuẩn 1: Glucose: vàng
Mannose: vàng Ribose: đỏ Rhamnose: vàng Chuẩn 2: Galactose: vàng Arabinose: đỏArabinose: đỏ Xylose: đỏ Chuẩn 3: Madurose: vàng Điều kiện chạy HPLC: 6. Cột: cột trao đổi anion - Dung dịch A: Acid boric 0.1 M - + Hòa tan 6,2g acid boric trong 1L DW + Thêm KOH 4M đến pH 8 Dung dịch B: Acid boric 0.4M - - + Hòa tan 24,8g acid boric trong 1L DW
+ Thêm KOH 4M đến pH 9 Tốc độ dòng chảy: 0,5ml/min - Nhiệt độ: 65oC - Phản ứng nhận biết: - Dung dịch C: 5g arginine + 15g acid boric trong 500ml DW Tốc độ dòng chảy: 0,5ml/min Nhiệt độ: 150 oC Bước sóng: Ex=320nm, Em=430nm Chương trình Thời gian (phút) Nồng độ Sol B Dung dịch C: 0.2ml/min 0 0 50 100 57 100 57.1 0 dừng 65