Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu bệnh do nấm Phytophthora spp. gây hại trên cây ăn quả có múi và biện pháp phòng chống theo hướng sinh học tại Cao Bằng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT

VIỆN KHOA HỌC NN VIỆT NAM

NGHIÊN CỨU BỆNH DO NẤM PHYTOPHTHORA SPP. GÂY

HẠI TRÊN CÂY ĂN QUẢ CÓ MÚI VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG

CHỐNG THEO HƯỚNG SINH HỌC TẠI CAO BẰNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI - 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT

VIỆN KHOA HỌC NN VIỆT NAM

NGUYỄN NAM DƯƠNG

NGHIÊN CỨU BỆNH DO NẤM PHYTOPHTHORA SPP. GÂY

HẠI TRÊN CÂY ĂN QUẢ CÓ MÚI VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG

CHỐNG THEO HƯỚNG SINH HỌC TẠI CAO BẰNG

Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật

Mã số: 9.62.01.12

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn: 1. TS. Hà Minh Thanh

2. TS. Đặng Vũ Thị Thanh

HÀ NỘI - 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả

nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng

được công bố hay dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được

cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày … tháng năm 2022

Tác giả luận án

Nguyễn Nam Dương

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực hiện các nghiên cứu, đến nay tôi đã hoàn thành nội dung

luận án “Nghiên cứu bệnh do nấm Phytophthora spp. gây hại trên cây ăn quả có múi và

biện pháp phòng chống theo hướng sinh học tại Cao Bằng”. Luận án được hoàn thành

không chỉ là công sức của bản thân tác giả mà còn có sự giúp đỡ, hỗ trợ tích cực của

nhiều cá nhân và tập thể.

Nhân dịp này, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến thầy

TS. Hà Minh Thanh, cô TS. Đặng Vũ Thị Thanh đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công

sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Thông tin và Đào

tạo - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học

tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn lãnh đạo Viện Bảo vệ thực vật, phòng Khoa học

và Hợp tác Quốc tế, lãnh đạo và tập thể cán bộ Bộ môn Bệnh Cây và Miễn dịch thực vật

cùng các anh, chị, em trong nhóm Nghiên cứu Bệnh hại trên cây ăn quả có múi, đã đã

giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn lãnh đạo địa phương cùng cán bộ và người dân ở

các vùng trồng cây ăn quả có múi tại Cao Bằng đã nhiệt tình hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong

quá trình thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận

lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên, khuyến khích tôi trong quá trình học tập và thực

hiện luận án./.

Hà Nội, ngày … tháng … năm 2022 Nghiên cứu sinh

Nguyễn Nam Dương

MỤC LỤC

Nội dung Trang

TT MỞ ĐẦU .............................................................................................................................. 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 4

1.1. Cơ sở khoa học của đề tài .............................................................................................. 4

1.2. Tổng quan về cây ăn quả có múi ................................................................................... 5

1.2.1. Nguồn gốc, xuất xứ, tình hình sản xuất và sử dụng ................................................... 5

1.2.2. Đặc điểm thực vật học của cây ăn quả có múi ........................................................... 8

1.2.3. Sâu bệnh hại trên cây ăn quả có múi tại Việt Nam .................................................... 8

1.3. Những nghiên cứu về nấm Phytophthora hại cây trồng................................................ 9

1.3.1. Thông tin chung về nấm Phytophthora ...................................................................... 9

1.4. Sản xuất cây ăn quả có múi tại Cao Bằng ................................................................... 35

1.4.1. Điều kiện tự nhiên của Cao Bằng ............................................................................. 35

1.4.2. Sản xuất cây ăn quả có múi tại Cao Bằng ................................................................ 36

1.4.3. Những nghiên cứu trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng ......................................... 39

1.5. Nhận xét chung và vấn đề quan tâm ............................................................................ 39

CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 41

2.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................................. 41

2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................... 41

2.2.1. Điều tra hiện trạng bệnh do nấm Phytophthora spp. gây hại trên cây ăn quả có múi

tại Cao Bằng. ...................................................................................................................... 41

2.2.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học, quy luật phát sinh gây hại của nấm Phytophthora

spp. gây hại trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng. ................................................................ 41

2.2.3. Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật đối kháng nấm Phytophthora spp. gây bệnh thối rễ,

chảy gôm trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng .................................................................... 41

2.2.4. Đánh giá khả năng sử dụng vi sinh vật đối kháng phòng trừ bệnh Phytophthora trên

cây ăn quả có múi tại Cao Bằng trong hệ thống quản lý tổng hợp cây trồng .................... 42

2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................................... 42

2.3.1. Địa điểm nghiên cứu................................................................................................. 42

2.3.2. Thời gian nghiên cứu ............................................................................................... 42

iii

2.4. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................................... 42

2.5. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................. 43

2.5.1. Phương pháp điều tra, thu thập mẫu: ........................................................................ 43

2.5.2. Phương pháp xác định tác nhân gây bệnh ................................................................ 43

2.5.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái của nấm Phytophthora ............................ 46

2.5.4. Nghiên cứu quy luật phát sinh gây bệnh thối rễ chảy gôm do nấm Phytophthora

trên cây ăn quả có múi. ....................................................................................................... 47

2.5.5. Phân lập, tuyển chọn, định danh vi sinh vật đối kháng nấm Phytophthora. ............ 49

2.5.6. Phương pháp xử lý số liệu: ....................................................................................... 58

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................................... 59

3.1. Hiện trạng sản xuất cây ăn quả có múi và bệnh thối rễ, chảy gôm trên cây ăn quả có

múi tại Cao Bằng ................................................................................................................ 59

3.1.1. Hiện trạng sản xuất cây ăn quả có múi tại Cao Bằng ............................................... 59

3.1.2. Thành phần bệnh hại trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng ..................................... 62

3.1.3. Triệu chứng bệnh thối rễ chảy gôm trên cây ăn quả có múi ở Cao Bằng ................ 64

3.1.4. Xác định nguyên nhân gây bệnh thối rễ chảy gôm .................................................. 66

3.2. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học, nuôi cấy của nấm Phytophthora ......................... 83

3.2.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm Phytophthora ............................................ 83

3.2.2. Quy luật phát sinh, gây hại của nấm Phytophthora spp. Trên cây ăn quả có múi tại

Cao Bằng. ........................................................................................................................... 90

3.3. Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật đối kháng nấm Phytophthora từ đất trồng cây ăn quả

có múi ở Cao Bằng. ............................................................................................................. 95

3.3.1. Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật đối kháng nấm Phytophthora ............................... 95

3.3.2. Xác định các vi sinh vật đối kháng và mức độ an toàn sinh học .............................. 97

3.3.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học, nuôi cấy của các VSV đối kháng có triển vọng ... 101

3.3.4. Khả năng ức chế nấm Phytophthora trong đất của các VSV đối kháng có triển vọng

.......................................................................................................................................... 104

3.4. Đánh giá khả năng sử dụng vi sinh vật đối kháng phòng trừ bệnh Phytophthora trên

cây ăn quả có múi tại Cao Bằng trong hệ thống quản lý tổng hợp cây trồng .................. 105

3.4.1. Khả năng trừ nấm Phytophthora của chế phẩm CB-1 ở các liều lượng khác nhau

.......................................................................................................................................... 105

3.4.2. Khả năng trừ nấm bệnh thối rễ chảy gôm Phytophthora của chế phẩm CB-1 trên

cây ăn quả có múi ............................................................................................................. 106

3.4.3. Nghiên cứu sử dụng chế phẩm CB-1 ..................................................................... 109

3.4.4. Đề xuất một số biện pháp quản lý tổng hợp bệnh thối rễ chảy gôm theo hướng sinh

học trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng. ........................................................................ 113

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................................ 117 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .......................................................................................................................................... 119

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 120

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

STT

Ký hiệu chữ viết tắt

Chữ viết đầy đủ

B.Phục Hòa

Bưởi Phục Hòa

BVTV

Bảo vệ thực vật

CĂQCM

Cây ăn quả có múi

CSB

Chỉ số bệnh

C.Trưng Vương

Cam Trưng Vương

CTV

Citrus tristeza virus

Công thức

ĐC

Đối chứng

ĐK

Đường kính

ĐKTN

Đường kính tản nấm

HLB

Huanglongbing

HQUC

Hiệu quả ức chế

HQPT

Hiệu quả phòng trừ

ITS

Internally transcribed spacers

NSLT

Năng suất lý thuyết

NSTB

Năng suất trung bình

PCR

Polymese Chain Reaction

Phytophthora

Q.Trà Lĩnh

Quýt Trà Lĩnh

Q.Trọng Con

Quýt Trọng Con

Bacillus

SXL

Sau xử lý

SXLCP

Sau xử lý chế phẩm

TLB

Tỷ lệ bệnh

TXL

Trước xử lý

VSV

Vi sinh vật

Xử lý

Streptomyces

DANH MỤC BẢNG

Nội dung Trang

TT Bảng

Bảng 1. 1. Diện tích cây ăn quả có múi ở một số nước trên thế giới (FAO, 2014) ............. 6

Bảng 1. 2. Các nước trồng cây ăn quả có múi có sản lượng lớn nhất trên thế giới (FAO,

2017) ..................................................................................................................................... 6

Bảng 1. 3. Các loài Phytophthora gây bệnh thực vật đã được phát hiện ở Việt Nam ...... 33

Bảng 3. 1. Diện tích trồng cây ăn quả có múi tại Cao Bằng (Năm 2019) .......................... 59

Bảng 3. 2. Tình hình sử dụng cây giống để trồng mới (Năm 2015) .................................. 60

Bảng 3. 3. Hiện trạng tuổi cây tại các vùng trồng cây ăn quả có múi tại Cao Bằng (Năm

2015) ................................................................................................................................... 61

Bảng 3. 4. Tình hình áp dụng các biện pháp kỹ thuật chăm sóc (Năm 2015) .................... 62

Bảng 3. 5. Thành phần bệnh hại trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng (Năm 2014 – 2019)

............................................................................................................................................ 63

Bảng 3. 6. Kết quả phân lập nấm Phytophthora trên vườn cây ăn quả có múi tại Cao Bằng

(Năm 2014 – 2015) ............................................................................................................. 67

Bảng 3. 7. Một số đặc điểm hình thái và sinh học 3 loài Phytophthora gây bệnh thối rễ

chảy gôm ............................................................................................................................. 69

Bảng 3. 8. Các nhóm hình thái phát triển tản nấm của các mẫu nấm trên môi trường V8 và

môi trường PDA (Năm 2014 – 2015) ................................................................................. 71

Bảng 3. 9. Kích thước bọc bào tử của các loài nấm Phytophthora (Năm 2015 – 2016) ... 72

Bảng 3. 10. Kết quả tìm kiếm trình tự gần gũi trên GenBank của 2 mẫu Phytophthora,

Phyt-01 và Phyt-02, dựa trên trình tự ITS (Năm 2015) ..................................................... 75

Bảng 3. 11. Kết quả tìm kiếm trình tự gần gũi trên GenBank của 2 mẫu Phytophthora,

Phyt-03 và Phyt-04, dựa trên trình tự ITS (Năm 2015) ..................................................... 76

Bảng 3. 12. Kết quả tìm kiếm trình tự gần gũi trên GenBank của 6 mẫu Phytophthora

(M1 – M6) dựa trên trình tự ITS (Năm 2015) .................................................................... 77

Bảng 3. 13. Kết quả lây bệnh nhân tạo trên quả cam Trưng Vương của các loài nấm

Phytophthora. (Năm 2015 – 2016) ..................................................................................... 80

vii

Bảng 3. 14. Kết quả lây bệnh nhân tạo trên cây cam Trưng Vương bằng các loài nấm

Phytophthora (Năm 2015 – 2016) ...................................................................................... 81

Bảng 3. 15. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của nấm P. palmivora Phyt-01 (Năm

2016) ................................................................................................................................... 84

Bảng 3. 16. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của nấm P. nicotianae (Năm 2016)

............................................................................................................................................ 84

Bảng 3. 17. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của nấm P. citrophthora ............... 86

Bảng 3. 18. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hình thành bọc bào tử của nấm

Phytophthora (Năm 2016) .................................................................................................. 87

Bảng 3. 19. Ảnh hưởng của môi trường dinh đưỡng đến sự phát triển của 03 loài nấm

Phytophthora (Năm 2016) .................................................................................................. 88

Bảng 3. 20. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng phát triển của 03 loài nấm Phytophthora

(Năm 2016) ......................................................................................................................... 90

Bảng 3. 21. Ảnh hưởng của địa hình đến mức độ bệnh thối rễ chảy gôm trên cây ăn quả

có múi tại Cao Bằng (Năm 2015 – 2017) ........................................................................... 93

Bảng 3. 22. Mức độ nhiễm bệnh thối rễ chảy gôm của các giống quýt tại Cao Bằng (Năm

2015) ................................................................................................................................... 93

Bảng 3. 23. Ảnh hưởng của tuổi cây đến bệnh thối rễ chảy gôm trên cây ăn quả có múi ở

Cao Bằng (Năm 2015) ........................................................................................................ 94

Bảng 3. 24. Phân lập và đánh giá khả năng đối kháng của vi sinh vật đối với nấm

Phytophthora spp. (Năm 2017) .......................................................................................... 95

Bảng 3. 25. Khả năng ức chế của các nguồn vi sinh vật có triển vọng với nấm

Phytophthora (Năm 2017) .................................................................................................. 96

Bảng 3. 26. Một số Đặc điểm sinh học của các nguồn vi sinh vật có có triển vọng (Năm

2017) ................................................................................................................................... 98

Bảng 3. 27. Khả năng đồng hóa nguồn Các bon của các nguồn vi sinh vật đối kháng

(Năm 2017) ......................................................................................................................... 98

Bảng 3. 28. Kết quả định danh các chủng VSV đối kháng nấm Phytophthora gây bệnh

trên cây ăn quả có múi (Năm 2017) ................................................................................... 99

Bảng 3. 29. Mức độ an toàn sinh học của các vi sinh vật đối kháng (Năm 2017) .......... 100 viii

Bảng 3. 30. Khả năng tổng hợp enzyme ngoại bào của các VSV đối kháng có triển vọng

(Năm 2017) ....................................................................................................................... 101

Bảng 3. 31. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của các loài VSV đối kháng

có triển vọng (Năm 2017) ................................................................................................. 102

Bảng 3. 32. Ảnh hưởng của pH đến khả năng phát triển của các loài VSV đối kháng (Năm

2017) ................................................................................................................................. 103

Bảng 3. 33. Hiệu quả hạn chế nấm Phytophthora trong đất của các loài VSV đối kháng

(Năm 2018) ....................................................................................................................... 104

Bảng 3. 34. Khả năng trừ nấm Phytophthora của chế phẩm CB-1 ở các liều lượng khác

nhau trong nhà lưới (Năm 2018) ...................................................................................... 106

Bảng 3. 35. Hiệu lực phòng trừ bệnh thối rễ, chảy gôm Phytophthora trên cam Trưng

Vương của chế phẩm và thuốc trừ nấm sinh học (Năm 2019) ......................................... 107

Bảng 3. 36. Hiệu quả trừ nấm Phytophthora trên đất vườn cam của các thuốc trừ nấm và

chế phẩm sinh học (Năm 2019) ........................................................................................ 107

Bảng 3. 37. Hiệu lực phòng trừ bệnh thối rễ chảy gôm của một số loại thuốc trừ nấm hóa

học và các chế phẩm CB-1, Bio-VASS.1 trên quýt Trà Lĩnh (Năm 2020) .................... 108

Bảng 3. 38. Hiệu quả của các phương pháp sử dụng CB-1 để trừ nấm Phytophthora trong

đất vườn cây ăn quả có múi (Năm 2019) ......................................................................... 110

Bảng 3. 39. Hiệu quả của số lần sử dụng và thời gian sử dụng chế phẩm CB-1 trừ nấm

Phytophthora trên đất vườn cây ăn quả có múi tại Cao Bằng (Năm 2019) .................... 111

Bảng 3. 40. Ảnh hưởng của phân bón và chế phẩm CB-1 tới bệnh thối rễ, chảy gôm

Phytophthora trên cam (Năm 2019) ................................................................................. 111

Bảng 3. 41. Hiệu lực phòng trừ nấm Phytophthora của chế phẩm CB-1 kết hợp với biện

pháp cắt tỉa, vệ sinh vườn (Năm 2019) ............................................................................ 112

DANH MỤC HÌNH

Nội dung Trang

TT Hình Hình 1. 1. Đặc điểm sinh sản của nấm Phytophthora ........................................................ 10

Hình 1. 2. Hình thái của nấm Phytophthora ....................................................................... 11

Hình 1. 3. Một số triệu chứng bệnh do nấm Phtophthora gây hại trên cây trồng .............. 12

Hình 3. 4. Phân lập nấm Phytophthora bằng bẫy cánh hoa hồng ...................................... 68

Hình 3. 5. Nấm Phytophthora spp. trên môi trường PSM ................................................. 68

Hình 3. 6. Các loài nấm Phytophthora hại trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng .............. 70

Hình 3. 7. Hình thái tản nấm của P. nicotianae và P. palmivora trên môi trường nuôi cấy

nhân tạo (sau 7 ngày, 28oC) ................................................................................................ 73

Hình 3. 8. Hình thái tản nấm của P. citrophthora trên môi trường PDA ........................... 73

Hình 3. 9. PCR nhân vùng gen ITS của các mẫu Phytophthora ........................................ 74

Hình 3. 10. Cây phát sinh dựa trên trình tự toàn bộ vùng ITS của các mẫu Phytophthora

Phyt-01 và Phyt-02 với các loài có quan hệ họ hàng gần .................................................. 75

Hình 3. 11. Cây phát sinh dựa trên trình tự toàn bộ vùng ITS của 2 mẫu Phytophthora

Phyt-03 và Phyt-04 với các loài có quan hệ họ hàng gần .................................................. 76

Hình 3. 12. Cây phát sinh dựa trên trình tự toàn bộ vùng ITS của 6 mẫu Phytophthora

(M1, M2 M3, M4, M5, M6) với đại diện các loài Phytophthora trên GeneBank ............. 78

Hình 3. 13. Lây bệnh nhân tạo bằng phương pháp áp thạch .............................................. 83

Hình 3. 14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm P. nicotianae .................. 85

Hình 3. 15. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm P. citrophthora .............. 85

Hình 3. 16. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của nấm P. citrophthora ........................ 90

Hình 3. 17. Khả năng ức chế của vi khuẩn BHA12.2 với nấm P. citrophthora ................ 96

Hình 3. 18. Khả năng ức chế của xạ khuẩn STL2.7 đối với nấm P. Citrophthora ............ 96

Hình 3. 19. . Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với sự sinh trưởng của S. misionensis ........... 103

Hình 3. 20. Thử nghiệm 1 số thuốc hóa học phòng trừ bệnh thối rễ chảy gôm trên cây

quýt Trà Lĩnh .................................................................................................................... 109

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Nội dung Trang

TT Biểu đồ

Biểu đồ 3. 1. Biểu đồ Diễn biến bệnh thối rễ, chảy gôm trên cây có múi tại Cao Bằng năm

2015 .................................................................................................................................... 91

Biểu đồ 3. 2. Biểu đồ Diễn biến bệnh thối rễ, chảy gôm trên cây có múi tại Cao Bằng năm

2016 .................................................................................................................................... 91

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Cây ăn quả có múi cam, quýt, chanh, bưởi… thuộc họ Rutaceae là những cây ăn

quả có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao, được phát triển trồng ở nhiều quốc gia trên thế

giới. Ở Việt Nam cây ăn quả có múi được trồng rộng khắp ở hầu hết các tỉnh trong cả

nước, từ trung du, miền núi phía Bắc đến đồng bằng sông Hồng, sông Cửu Long.

Diện tích trồng cam, quýt ở Việt Nam ngày càng được mở rộng, tới năm 2020 tổng

diện tích cây có múi trên cả nước là 235.216 ha. Trong đó, diện tích trồng cây có múi ở

các tỉnh phía bắc là 106.125 ha, các tỉnh Bắc Trung Bộ là 29.630 ha, các tỉnh duyên hải

Nam Trung Bộ và Tây Nguyên là 7.761 ha và các tỉnh phía nam là 91.702 ha (Bộ Nông

nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2020),

Cao Bằng là một tỉnh miền núi phía Bắc, có điều kiện đất đai, khí hậu rất thích hợp

cho cây ăn quả có múi phát triển. Tại Cao Bằng các giống quýt Trà Lĩnh, cam Trưng

Vương với chất lượng cao có hương vị đặc biệt đã mang lại nguồn thu nhập đáng kể cho

người nông dân. Với định hướng phát triển một số cây trồng bản địa thay thế một số cây

trồng kém hiệu quả, cam quýt là sự lựa chọn trong cơ cấu cây trồng hiện nay của nhiều

địa phương ở Cao Bằng. Tuy nhiên những năm gần đây diện tích, sản lượng cũng như

chất lượng của cam quýt Cao Bằng bị suy giảm mạnh, nhiều vườn bị thoái hóa nặng nề.

Việc mở rộng diện tích, đẩy mạnh thâm canh tăng năng suất là điều kiện thích hợp

cho nhiều loài sâu bệnh phát sinh gây hại trên cây có múi. Bên cạnh bệnh vàng lá

greening, bệnh thối rễ, chảy gôm, thối quả.... gây ra đã được phát hiện ở hầu hết các vùng

trồng cam quýt ở Cao Bằng. Khi bị bệnh cây ăn quả có múi trở nên còi cọc, tán lá biến

vàng, trên thân cành và đặc biệt phần gốc cây có xuất hiện các vết chảy gôm, gỗ bị biến

màu nâu đen, rễ bị thối đen và dễ tuột vỏ, hoa quả ít, khi bị bệnh nặng cây không cho quả

và có thể bị chết. Các vườn cây có múi bị bệnh được nông dân ở Cao Bằng gọi là những

vườn "cam buồn". Bệnh đã và đang gây hại trên nhiều vườn cam quýt tại vùng Hòa An,

Trà Lĩnh, tỉnh Cao Bằng.

Trên cây ăn quả có múi việc phòng trừ sâu bệnh hại nói chung và bệnh thối rễ,

chảy gôm nói riêng đang gặp rất nhiều khó khăn. Người dân chỉ phòng trừ bệnh khi thấy

cây có biểu hiện vàng lá hay chảy gôm trên thân, lúc đó cây đã bị bệnh nặng các biện

pháp phòng trừ thường không có hiệu quả, chỉ sau 1 – 2 vụ, cây bị chết. Ngoài ra cây có

múi là cây lâu năm, sau khi hết chu kỳ kinh doanh, cây con lại được trồng tái canh tại các

vườn mà mật độ nấm Phytophthora đã được tích lũy cao trong đất, dẫn tới cây nhanh

chóng bị nhiễm bệnh, cây sinh trưởng phát triển kém và có thể bị chết.

Bệnh thối rễ, chảy gôm trên cam quýt ở Cao Bằng mới chỉ sơ bộ được xác định là

do nấm Phytophthora spp. gây ra, các nghiên cứu chuyên sâu về bệnh chưa được tiến

hành. Do đó việc thực hiện đề tài Nghiên cứu bệnh do nấm Phytophthora spp. gây hại

trên cây ăn quả có múi và biện pháp phòng chống theo hướng sinh học tại Cao Bằng là

điều cần thiết nhằm xác định được nguyên nhân, đặc điểm, quy luật phát sinh và gây hại

của bệnh, để từ đó đưa ra các biện pháp quản lý bệnh an toàn và hiệu quả, đảm bảo sản

xuất cây ăn quả có múi ở Cao Bằng bền vững.

2. Mục tiêu, yêu cầu của đề tài

2.1. Mục tiêu của đề tài

Xác định được các loài Phytophthora là tác nhân gây bệnh trên cây ăn quả có múi

ở Cao Bằng cũng như đặc điểm sinh học của các loài nấm và các yếu tố ảnh hưởng đến sự

phát sinh và gây hại của bệnh thối rễ, chảy gôm cây ăn quả có múi và các biện pháp

phòng trừ bệnh hiệu quả tại Cao Bằng 2.2. Yêu cầu của đề tài

Đánh giá được thực trạng bệnh thối rễ, chảy gôm trên ăn quả cây có múi, xác định

được các loài Phytophthora là tác nhân gây bệnh và đặc điểm phát sinh gây hại của nấm gây

ra cho cây ăn quả có múi ở Cao Bằng.

Phân lập, tuyển chọn được các chủng vi sinh vật đối kháng nấm Phytophthora có hoạt

tính cao. Thử nghiệm khả năng sử dụng vi sinh vật đối kháng để phòng trừ nấm

Phytophthora gây bệnh trên cây ăn quả có múi.

Đề xuất được các biện pháp phòng chống hiệu quả bệnh do nấm Phytophthora spp.

gây hại trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng.

3. Tính mới và những đóng góp của đề tài

Đã xác định được 3 loài nấm Phytophthora palmivora, P. nicotianae và P.

citrophthora là tác nhân gây bệnh thối rễ, chảy gôm trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng

và bổ sung thêm nấm Phytophthora palmivora vào danh sách các loài nấm hại cây ăn quả

có múi ở các tỉnh miền núi phía Bắc.

Đã phân lập, tuyển chọn được ba loài vi sinh vật Bacillus amyloliquefaciens, B.

methylotrophicus và Streptomyces misionensis. đối kháng nấm Phytophthora có hiệu lực

ức chế đạt 82,2-85,7% trong môi trường nuôi cấy.

Chế phẩm CB-1 (hỗn hợp Bacillus amyloliquefaciens, B. methylotrophicus và

Streptomyces misionensis) đạt hiệu lực phòng trừ nấm Phytophthora từ 75,85 - 83,18%

trong nhà lưới và 73,1% trên đồng ruộng.

Đề xuất được quy trình sử dụng chế phẩm CB-1 phòng chống bệnh thối rễ, chảy

gôm trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng.

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

4.1. Ý nghĩa khoa học

Cung cấp bổ sung các dẫn liệu khoa học về các loài nấm Phytophthora gây bệnh

hại trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng, các yếu tố ảnh hưởng và các giải pháp phòng

chống bệnh.

Tuyển chọn và bổ sung được một số loài vi sinh vật đối kháng (tại Cao Bằng) có

khả năng sử dụng trong phòng chống bệnh do nấm Phytophthora gây ra.

4.2. Ý nghĩa thực tiễn

Các kết quả của đề tài là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về xây dựng và phát

triển quy trình quản lý tổng hợp bệnh thối rễ, chảy gôm nhằm phát triển bền vững cây ăn

quả có múi ở Cao Bằng và các địa phương có điều kiện tương tự, đồng thời là nguồn tài

liệu tham khảo có giá trị sử dụng trong nghiên cứu khoa học và đào tạo chuyên ngành bảo

vệ thực vật.

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Cơ sở khoa học của đề tài

Các loài nấm thuộc chi Phytophthora là tác nhân gây bệnh thối rễ, chảy gôm một

loại dịch hại kinh tế cho các vùng trồng cây ăn quả có múi trên thế giới. Trong chi nấm

này đã xác định được 10 loài gây bệnh cho cây ăn quả có múi, trong đó các loài P.

palmivora, P. nicotianae và P. citrophthora là những loài gây hại phổ biến và quan trọng

nhất. Quy luật phát sinh gây bệnh, các biện pháp quản lý bệnh do nấm Phytophthora đã

được nghiên cứu khá toàn diện và hệ thống tại các vùng trồng cây ăn quả có múi trên thế

giới.

Tại Việt Nam 9 loài nấm Phytophthora đã phát hiện gây hại trên các cây trồng

nông nghiệp. Các loài P. palmivora, P. nicotiane, P. cinamomi, P. capsisi và P. infestans

là những loài gây hại quan trọng trên các cây trồng có giá trị kinh tế cao sầu riêng, dứa và

hồ tiêu, cao su và cây thực phẩm họ Solanaceae (Đặng Vũ Thị Thanh, Ngô Vĩnh Viễn,

Drenth,2004). Các nghiên cứu về quy luật phát sinh gây hại và biện pháp quản lý bệnh

Phytophthora trên sầu riêng, hồ tiêu, dứa và các cây thực phẩm đã được nghiên cứu một

cách hệ thống bởi nhiều các tác giả ở Việt Nam (Mai Văn Trị và cs (2003), Nguyễn Vĩnh

Trường (2008), Phạm Ngọc Dung và cs (2007).

Nấm P. citrophthora đã được phát hiện hại lần đầu tiên trên cam ở Việt Nam vào

những năm 50 của thế kỷ 20 sau đó nấm P.nicotianae tiếp tục được phát hiện ở khắp các

vùng trồng cây ăn quả có múi ở Việt Nam (Đặng Vũ Thị Thanh, Ngô Vĩnh Viễn, Drenth,

2004). Tuy nhiên những nghiên cứu về bệnh Phytophthora trên cây có múi ở Việt Nam

còn rời rạc không liên tục và thường chỉ hạn chế ở mức điều tra tỷ lệ bệnh. Chưa có

nghiên cứu phát triển chiến lược quản lý bệnh, quản lý vườn ươm, tạo giống kháng bệnh.

Đặc biệt tại Cao Bằng chưa có những nghiên cứu về nguyên nhân gây bệnh và biên pháp

quản lý bệnh thối rễ, chảy gôm trên các cây cam quýt đặc sản. Nghiên cứu nấm

Phytopthora hại cây ăn quả có múi và sử dụng các chế phẩm sinh học quản lý bệnh tại

Cao Bằng là một điều cần thiết để đáp ứng được nhu cầu phát triển vùng cây ăn quả có

múi đặc sản của tỉnh Cao Bằng cũng như các vùng trồng cây ăn quả có múi ở Việt Nam.

1.2. Tổng quan về cây ăn quả có múi

1.2.1. Nguồn gốc, xuất xứ, tình hình sản xuất và sử dụng

1.2.1.1. Nguồn gốc, xuất xứ và tình hình sản xuất cây ăn quả có múi trên thế giới.

* Nguồn gốc

Cây ăn quả có múi là một trong những cây trồng lâu đời nhất. Castle (1987) cho

rằng cây có múi xuất hiện đầu tiên tại Trung Quốc khoảng năm 2201 đến 2205 trước

Công nguyên và đã được trồng trên 4000 năm. Các nghiên cứu gần đây cho rằng cây có

múi có nguồn gốc ở Himalaya (Wu và cs, 2018). Một số nghiên cứu trước chỉ ra rằng cây

có múi được trồng đầu tiên ở vùng Đông Nam Á, khu vực giữa Đông Bắc Ấn Độ, Bruma

của Myanmar và tỉnh Yunnan, Trung Quốc.

* Phân loại

Các cây ăn quả có múi Citrus thuộc tông Clauseneae, dưới họ Aurantioideae, họ

Rutaceae, bộ Rutales, ngành ngọc lan Lignosea, lớp cây 2 lá mầm Dicotylendones.

* Tình hình sản xuất

Hiện nay, cây có múi là một trong những cây quan trọng nhất trên thế giới. Sản

lượng quả của cây có múi trên thế giới ước tính khoảng 124,246,000 tấn (Citrus Fruit –

Fresh and Processed Statistical Bulletin 2016, FAO). Cây có múi có khả năng sinh trưởng

ở các vùng có vĩ độ 400N tới 400S. Tuy nhiên, các vùng trồng cây có múi thương mại chủ

yếu phân bố hạn chế ở hai vành đai vùng cận nhiệt đới, khoảng 20 đến 400N và S của

đường xích đạo (Castle, 1987).

Theo thống kê của FAO năm 2017, Brazil, Trung Quốc, Hoa Kỳ , Mexico, Ấn Độ

và Tây Ban Nha là các nước có diện tích trồng cây có múi lớn trên thế giới (bảng 1.1).

Brazil là nước trồng cây có múi lớn nhất với sản lượng hàng năm trung bình khoảng 20

triệu tấn và cũng là nước xuất khẩu lượng nước cam ép lớn nhất. Trung Quốc là nước

đứng thứ hai trên thế giới về sản xuất cây có múi với sản lượng khoảng 19,6 triệu tấn. Thị

trường tiêu thụ nước ép chủ yếu là các nước Đông Nam Á. Hoa Kỳ là nước đứng thứ ba

với sản lượng hàng năm khoảng 10 triệu tấn. Cam là sản phẩm tiêu dùng chủ yếu trên thị

trường Hoa Kỳ. Tại Hoa Kỳ phần lớn cam và các loại cây có múi khác được trồng ở các

bang Florida, Arizona và Texas. Mexico có sản lượng cây có múi hàng năm khoảng trên

6,8 triệu tấn, (bảng 1.2).

Bảng 1. 1. Diện tích cây ăn quả có múi ở một số nước trên thế giới

(FAO, 2014)

TT Tên nước Diện tích (ha)

1 Trung quốc 1,476,679

2 Brazil 942,267

3 Nigeria 730,000

4 Mexico 523,503

5 Mỹ 430,080

6 Tây Ban Nha 296,950

7 Ấn Độ 264,500

8 Iran 232,500

9 Ý 168,507

10 Argentina 145,000

11 Hy Lạp 143,883

12 Thế giới 7,295,135

Bảng 1. 2. Các nước trồng cây ăn quả có múi có sản lượng lớn nhất trên thế giới

(FAO, 2017)

TT Tên nước Sản lượng (tấn)

1 Brazil 20,682,309

2 Trung Quốc 19,617,100

3 Mỹ 10,017,000

4 Mexico 6,851,000

5 Ấn Độ 6,286,000

6 Tây Ban Nha 5,703,600

7 Iran 3,739,000

8 Ý 3,579,782

9 Nigeria 3,325,000

10 Thổ Nhĩ Kỳ 3,102,414

Nguồn: John Misachi, 21 Sep. 2017. www.worldatlas.com.

1.2.1.2. Tình hình sản xuất cây ăn quả có múi ở Việt Nam

Theo số liệu thống kê của Cục trồng trọt (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn,

2020), tổng diện tích cây có múi trên cả nước là 235.216 ha. Trong đó, diện tích trồng cây

có múi ở các tỉnh phía bắc là 106.125 ha, các tỉnh Bắc Trung Bộ là 29.630 ha, các tỉnh

duyên hải Nam Trung Bộ và Tây Nguyên là 7.761 ha và các tỉnh phía nam là 91.702 ha.

Cam là loại cây có múi được trồng phổ biến nhất với diện tích trên 130.000 ha, sau đó là

cây bưởi với diện tích trên 85.500 ha.

Cơ cấu chủng loại: Cam và bưởi hiện có diện tích lớn nhất trong sản xuất cây có

múi nước ta (khoảng 38% mỗi loại), tiếp theo là chanh (15,1%) và quýt (8,6%). Riêng tại

phía Bắc, diện tích trồng cam chiếm gần 45,6%, bưởi chiếm 40,2%, quýt 7,4% và chanh

7,9% trong cơ cấu diện tích cây có múi.

Nhiều địa phương đã hình thành các vùng sản xuất cây có múi hàng hóa tập trung

quy mô lớn như: cam Hà Giang, Tuyên Quang, Hoà Bình, Bắc Giang; bưởi Phú Thọ, Bắc

Giang, Hoà Bình; quýt Bắc Kạn… Diện tích và sản lượng cây có múi cả nước tăng liên

tục trong những năm gần đây; cơ cấu giống phong phú; chủ yếu được tiêu thụ dạng quả

tươi tại thị trường nội địa là chính. Tổng giá trị xuất khẩu năm 2019 là 47,5 triệu USD.

* Một số vùng trồng cây ăn quả có múi chủ lực ở phía Bắc

Hòa Bình: Có diện tích trồng cây ăn quả có múi lớn, chiếm khoảng 5% diện tích

của cả nước. Năm 2020, diện tích cây có múi của tỉnh đạt khoảng 11,500 ha, diện tích

kinh doanh khoảng 7,400 ha, sản lượng ước đạt 160,000 tấn.

Hà Giang: Toàn tỉnh Hà Giang đang có trên 8.800 ha cam, trong đó có trên 4.268

ha được sản xuất theo tiêu chuẩn VietGAP, chiếm trên 80% diện tích cho thu hoạch. Tổng

sản lượng cam niên vụ 2019 - 2020 ước đạt trên 71,7 nghìn tấn. Trong đó, cam sành có

diện tích trên 7.060 ha và có 4.268,2 ha được sản xuất theo tiêu chuẩn VietGAP, sản

lượng ước đạt trên 60,7 nghìn tấn; các loại cam Vinh và V2 có diện tích gần 1.800 ha, sản

lượng ước đạt trên 11.000 tấn.

Bắc Giang: Năm 2019, diện tích cây ăn quả có múi của huyện Lục Ngạn là 6.740

ha, trong đó, cây cam 4.142 ha, bưởi 2.252 ha và cây ăn quả có múi khác là 346 ha, ước

tổng sản lượng cây ăn quả có múi đạt 58.560 tấn, tăng hơn 5 nghìn tấn so năm trước.

Hưng Yên: Tỉnh Hưng Yên có diện tích trồng cây cam khoảng 1.600 ha, sản lượng

cam năm 2019 ước đạt hơn 30 nghìn tấn.

1.2.2. Đặc điểm thực vật học của cây ăn quả có múi

* Đặc điểm của rễ: Rễ cây ăn quả có múi thuộc loại rễ nấm (Micorhiza), trên lớp biểu bì

của rễ có nấm Micorhiza sống cộng sinh. Chủ yếu là rễ bất định, phân bố rất nông (10-

30cm), phân bố tương đối rộng và tập trung ở tầng đất mặt.

* Đặc điểm về thân, cành: Gồm, cành cơ bản, cành dinh dưỡng, cành quả. Tán cây rất đa

dạng, hình cầu, hình bán cầu, hình tháp, hoặc hình chổi xể.... Cành có thể có gai hoặc

không gai, có thể còn non thì có gai và gai bị rụng khi về già, v.v...

* Đặc điểm về lá: Lá đơn, mọc cách, mép lá có hình răng cưa, lá có eo. Độ lớn của eo lá,

hình dạng, kích thước lá, màu sắc lá, mật độ khí khổng, mật độ túi tinh dầu, v.v... tuỳ

thuộc vào giống, vào mùa vụ.

* Đặc điểm về hoa: Hoa lưỡng tính, có 2 dạng là hoa chùm và hoa đơn, hoa có mùi thơm,

cây phân hoá hoa từ sau khi thu hoạch đến trước khi nảy lộc Xuân đa số từ tháng 11 đến

đầu tháng 2 năm sau. Trên cây ăn quả có múi xuất hiện cả hoa phát triển đầy đủ và hoa dị

hình là những hoa bị thiếu khuyết 1 trong các bộ phận của hoa.

1.2.3. Sâu bệnh hại trên cây ăn quả có múi tại Việt Nam

Kết quả điều tra cơ bản thành phần sâu bệnh hại cây trồng của Viện Bảo vệ thực

vật trong những năm 1967 - 1968, 1977 - 1978, 1997 – 1998 và 2006- 2010 đã ghi nhận

trên cây ăn quả có múi có 96 loài côn trùng gây hại, trong đó đáng chú ý là rầy chổng

cánh và rệp là 2 đối tượng làm môi giới truyền bệnh, có 19 loại bệnh do nấm, 2 loại bệnh

do vi rút, 2 loại do bệnh vi khuẩn, 2 loại bệnh tuyến trùng, 4 loại do thực vật thượng đẳng

và 4 loại bệnh sinh lý. Trong đó bệnh vàng lá Greening, Tristeza, loét, chảy gôm, phấn

trắng được xem như những loại bệnh hại nguy hiểm trên cây ăn quả có múi. (Viện Bảo vệ

thực vật, 1976, 1999).

Có 25 loài sâu bệnh gây hại trên cây bưởi Phúc Trạch (12 loại bệnh và 13 loại sâu).

Thời điểm phát sinh của các loại sâu bệnh hại ở tất cả các tháng trong năm. Những loại

sâu, bệnh hại phổ biến, nguy hiểm là: bệnh đốm đen, chảy gôm, sâu đục cành, rầy, rệp,

ruồi vàng (Ngô Hồng Bình và cs, 2011). Theo Bealing và Nguyễn Minh Thảo (1997),

bệnh đốm dầu gây nặng nhất trên quýt và cam ở Nghệ An, chủ yếu trên các lá già và lá

bánh tẻ.

Ở đồng bằng sông Cửu Long, bên cạnh bệnh vàng lá greening, bệnh tristeza thì

bệnh chảy mủ Phytophthora spp. và nhện trắng trên quả rất phổ biến trên cây có múi (Hà

Minh Trung và cs, 1995).

Cây ăn quả có múi có nhiều loại bệnh gây hại như bệnh Greening, Tristeza, thối rễ

chảy gôm, thán thư, loét,…trong đó bệnh thối rễ chảy gôm là một trong những bệnh gây

hại nặng làm suy giảm năng suất, chất lượng của vườn cây ăn quả có múi trên thế giới nói

chung và tại Việt Nam nói riêng.

1.3. Những nghiên cứu về nấm Phytophthora hại cây trồng

1.3.1. Thông tin chung về nấm Phytophthora

1.3.1.1. Lịch sử và phân bố gây hại

Nấm Phyophthora được mô tả lần đầu tiên bởi Heinrich Anton de Bay năm 1875.

Ngày nay đã có 170 loài đã đượcphát hiện. Có hơn 60 loài Phytophthora đã được mô tả là

các loài gây bệnh cho cây trồng. Mỗi loài có thể gây bệnh cho từ một vài cho đến hơn

1000 loài cây trồng khác nhau (David and André Drenth, 2004). Tên Phytophthora có

nguồn gốc từ Hy Lạp, trong đó nghĩa của từ “Phyto” là cây trồng và từ “Phthora” là phá

hủy. Nấm Phytophthora thuộc giới Chromalveolata, ngành Heterokontophyta, lớp

Oomycetes, bộ Peronosporales, họ Pythiaceae và giống Phytophthora (Erwin & Ribeiro,

1996). Tới năm 2019, Trung tâm Nông nghiệp và Sinh học Quốc tế đã phân loại lại nấm

Phytophthora thuộc Eukaryota, giới Chromista, ngành Oomycota, lớp Oomycetes, bộ

Peronosporales, họ Peronosporaceae và giống Phytophthora (CABI, 2019. Invasive

Species Compendium. https://www.cabi.org/isc/datasheet/40958)

Phytophthora được xem như là sinh vật tương tự nấm (fungus-like organism).

Trong khi thành tế bào của nấm thật ban đầu là chitin, thì thành tế bào của Phytophthora

được cấu tạo từ cellulose (Lucas và cs, 1991). Mức bội thể của hai nhóm cũng khác nhau;

loài Phytophthora có thể lưỡng bội nhiễm sắc thể trong giai đoạn sinh dưỡng của chu kỳ

sống, trong khi các loài nấm thật phần lớn là thể đơn bội trong giai đoạn này. Đặc tính

sinh hóa cũng khác nhau, đặc biệt là sự bảo tồn cao con đường sinh tổng hợp axit amin

lysine.

Các loài nấm Phytophthora là nguồn bệnh nguy hiểm đối với cây hai lá mầm và

các ký chủ thực vật khác (Scott và cs., 2009, Erwin & Ribeiro, 1996). Phytophthora

infestans đã tàn phá các ruộng trồng khoa tây và gây nạn đói khủng khiếp ở Ai Len và

Châu Âu từ năm 1845 đến năm 1849, và hiện nay vẫn là nguồn bệnh quan trọng đối với

những cây trồng họ cà như cà chua và khoai tây. Bệnh thối rễ và thân đậu tương, do nấm

P. sojae gây ra, là vấn đề nghiêm trọng trong thời gian dài đối với sản xuất nông nghiệp.

1.3.1.2. Đặc điểm sinh học của nấm Phytophthora

Hình 1. 1. Đặc điểm sinh sản của nấm Phytophthora

Nguồn: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Phytophthora_life_cycle.png

Các loài Phytophthora có thể sinh sản hữu tính và vô tính. Khi giao phối, bao đực

(antheridia) phóng giao tử tới bao trứng (oogonium), hoặc bao trứng gặp bao đực (nhụy

kép), hoặc bao đực tiếp xúc với phần đầu dưới của bao trứng (nhụy bên) và cùng sản sinh

bào tử trứng (oospores). Dạng bào tử vô tính là hậu bào tử (chlamydospores), và bọc bào

tử (sporangia) sản sinh bào tử động (zoospores). Bào tử hậu có hình cầu, có sắc tố và vách

bào tử dày giúp cho sự tồn tại của nấm trong điều kiện tự nhiên bất thuận. Bọc bào tử có

thể được giữ vuông góc trên sợi nấm (khi còn non) hoặc bị rụng khi có gió hoặc căng

nước như kiểu cấu trúc lan truyền. Ngoài ra, bọc bào tử giải phóng du động bào tử có hai

sợi (không giống râu) giúp chúng bơi đến cây ký chủ.

Hình 1. 2. Hình thái của nấm Phytophthora

A: Bào tử nang. B: Du động bào tử. C: Hậu bào tử. D: Bào tử trứng. Nguồn: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Phytophthora_life_cycle.png

1.3.1.3. Triệu chứng bệnh do nấm Phytophthora hại cây trồng

Các loài nấm Phtophthora gây hại cho cây trồng bằng cách phá hủy các tế bào, gây

hoại tử cho lá, thân hoặc rễ. Nấm có thể làm cháy lá (blight), nấm làm nứt vỏ trên thân

hoặc cành gây chảy gôm, loét (canker), ở một điểm hoặc xung quang thân, cành. Cành

hoặc nhánh có thể bị chết khô (dieback). Nấm Phytophthora thâm nhập vào mạch dẫn

xylem, làm cho một phần hoặc toàn bộ tán cây thiếu nước, cây bị héo (wilt). Rất nhiều

loài Phytophthora xâm nhiễm rễ cây gây thối rễ (root rot), một số trường hợp hại toàn bộ

rễ tơ, một số trường hợp gây hoại tử và dẫn đến hiện tượng thối chóp rễ (crown rot). Rễ tơ

bị hoại tử sẽ dẫn đến cây, bị thiếu nước, trong thời gian dài lá sẽ bị héo hoặc tàn lụi

(decline). Rễ con bị thối sẽ dẫn đến rễ chính và thân cây bị tàn lụi cây bị chết nhanh

(sudden death). Vết bệnh từ rễ lan gây hại phần thân sát mặt gây ra thối thân (foot rot) hay

thối cổ rễ (collar rot), nấm gây thối nâu quả (brown rot).

Hình 1. 3. Một số triệu chứng bệnh do nấm Phtophthora gây hại trên cây trồng

Nguồn: https://www. forestPhytophthoras.org/Phytophthora-basics.

Forest Phytophhoras of the World 2019

A, B, Cháy rụi trên lá; C - Héo; D - Xì mủ, chết tán cây; E - Chết khô; F - Rụng lá; G – Thối rễ; H – Thối quả.

1.3.1.4. Những nghiên cứu về nấm Phytophthora gây hại trên trên cây ăn quả có múi

Năm 1836, một số diện tích trồng cây ăn quả có múi đã bị nấm Phytophthora phá

hủy tại đảo Azore, Bồ Đào Nha. Dịch bệnh do nấm Phytophthora gây ra trên cây ăn quả

có múi lần đầu tiên đã xuất hiện tại đảo Azore trong khoảng những năm 1832-1836. Nấm

được ghi nhận gây hại tại Pháp năm 1841, tại Ý từ năm 1855-1889, tại Úc từ năm 1860-

1879, tại Tây Ban Nha năm 1871, tại bang Califonia năm 1875, bang Florida năm 1876,

tại Hy Lạp, năm 1869-1880, năm 1906 tại Cu Ba, năm 1911 tại Paraguay, năm 1917 tại

Brazil, năm 1920 tại Mexico và năm 1935 tại Trinnidad (Erwin & Rebeiro, 1966).

Nấm Phytophthora tồn tại trong đất và nước, gây bệnh cho cây ăn quả có múi

(Graham and Menge, 1999, 2000). Nấm phân bố khắp thế giới và gây tổn thất sản lượng

đáng kể cho cây ăn quả có múi ở các vùng cận nhiệt đới có nhiều mưa (Graham và

Feichtenberger, 2015). Nấm gây chết cây con, thối rễ và cổ rễ trong vườn ươm, gây thối

gốc, thối rễ, chảy gôm và thối quả trong vườn kinh doanh. Bệnh thối gốc xuất hiện tại

phần thân sát mặt đất, tạo vết bệnh trên thân hoặc gây thối xung quanh chu vi thân và làm

cây bị chết (Sativa và Avinash, 2012)

Trong 10 loài Phytophthora được báo cáo gây hại trên cây ăn quả có múi trên toàn

thế giới, có 3 loại gây hại nghiêm trọng nhất gây bệnh chảy gôm, thối rễ và thối quả là

Phytophthora citrophthora, P. nicotianae và P. palmivora (Erwin and Ribeiro, 1996;

Graham and Menge, 2000).

Các loài nấm này gây hại phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh do vậy mức độ bị

bệnh của chúng là khác nhau ở các vùng (Matheron và cs., 1997). P. nicotianae và P.

palmivora là nguyên nhân chính gây bệnh trên cây ăn quả có múi ở Mỹ, trong đó loài nấm

P. citrophthora và P. parasitica là nguyên nhân gây bệnh trên cây ăn quả có múi ở phổ

biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Graham and Menge, 2000; Graham và cs., 1998).

Các loài nấm như P. boehmeriae, P. cactorum, P. cinnamon, P. citricola, P. dreschleri, P.

hibernalis, P. megasperma, P. palmivora và P. syngiae cũng gây hại trên các cây ăn quả

có múi ở các vùng khác nhau trên thế giới. (Erwin and Ribeiro, 1996; Naqvi, 2002b).

Những thiệt hại do bệnh thối rễ gây ra rất khó đánh giá do mối quan hệ giữa tổn

thất năng suất và rễ bị hại rất không tương ứng (Graham and Kosola 2000). Có khoảng

18% cây cam ngọt, 18-80% giống cam C. sinesix Osbeck và 10-80% quít 12-25 tuổi bị

nhiễm bệnh do các loài nấm Phytophthora trên tại bang Punjab. Ấn Độ. Tại bang

Madhya Prades, 20-25% vườn quít Nagpur đã bị niễm bệnh nặng do nấm P. parasitica,

P. citrophthora và P. palmivora. Tại bang Andhra Prades 20-100% vườn trồng chanh

chua đã bị nhiễm nặng bệnh do 3 loài nấm P. parasitica, P. citrophthora và P.

palmivora. Có tới hơn 20% cây con bị chết do bệnh Phytophthora gây ra trong vườn

ươm tại Ấn Độ, nơi hàng năm trồng khoảng 7 - 8 triệu cây (Naqvi, 2000).

Tại bang Florada (Mỹ) và Brazil, hầu như toàn bộ các vườn trồng cây đều bị nhiễm

nấm Phtytophthora, và tại Florida, ước khoảng 8-20% vườn cây bị bệnh thối rễ gây hại (J.

Graham1 and E. Feichtenberger 2015). Bệnh thối rễ có thể gây thiệt hại hàng năm từ 3-

6%, ước tính khoảng 30 đến 60 triệu USD (Graham and Menge, 1999). Bệnh thối rễ đã

gây giảm năng suất đên 46% và gây thiệt hại hàng năm khoảng 12,9 triệu USD đối với

ngành sản xuất cây ăn quả có múi tại California. (Naqvi, 2003).

1.3.1.5. Triệu chứng của bệnh Phytophthora trên cây ăn quả có múi

Nấm P. citrophthora và P. parasitica (P. nicotianae) được xác định là nguyên

nhân chính gây bệnh chảy gôm và bệnh thối rễ trên cây ăn quả có múi trên toàn thế giới

(Martin và cs., 2000; Siviero và cs., 2002; Timmer và cs., 2003). Nấm P. nicotianae là

loài phổ biến nhất xuất hiện ở các vùng cận nhiệt đới trên thế giới và gây bệnh thối cổ rễ

và thối rễ nhưng ít khi gây hại ở những phần xa mặt đất. Nấm P. palmivora là có độc tính

cao đối với rễ cây, gây bệnh thối nâu trong điều kiện bất lợi ở cả vùng cận nhiệt đới và

nhiệt đới (Graham và cs. 1998, 2011, 2014). Nấm P. citrophthora không những gây bệnh

thối rễ và xì mủ mà còn gây hại cả các phần trên thân và cành cây to.

Tại miền Trung Ấn Độ nấm P. parasitica, P. citrophthora và P. palmivora là

nguyên nhân gây bệnh thối rễ và thối chóp rễ trên giống C. jambhiri (chanh sần), một

loại cây dùng làm gốc ghép, và bệnh thối gốc thân, bệnh rụng lá trên giống quýt Nagpur.

(Naqvi, 2000, 2002). Tại Chi lê, nấm P. citrophthora và P. parasitica gây bệnh chảy

gôm trên chanh và cam ngọt, và nấm P. citrophthora còn gây bệnh thối quả, tại Tây Ban

Nha, nấm P. citriphthora gây bệnh trên giống cam nhỏ (C. clementina) và các giống lai

loại cam này (Alvarez và cs., 2008). Bệnh chảy gôm trên cây thường xuất hiện ở phần

trên cành ghép, đặc biệt là các cành chính, trong khi gốc ghép vẫn không bị nhiễm bệnh.

Sau đó, bệnh lây lan gây hại trên thân và cành cấp 2, dẫn đến toàn bộ cây bị phá hủy và

cây chết. Nấm Phytophthora gây chảy gôm cành được phát hiện nhiều trong mùa mưa tại

Nam Phi trên các giống cam nhỏ (Schutte 2007).

- Bệnh chết rạp cây con:

Bệnh chết rạp cây con rất nguy hiểm và phổ biến trên vườn ươm và vườn kinh

doanh. Tại miền Trung Ấn Độ, hơn 20% cây con đã bị chết khi nấm Phytophthora tấn

công và gây hại (Naqvi, 2002). Nguyên nhân gây bệnh chủ yếu là nấm Phytophthora

parasitica, P. citrophthora and P. palmivora. Bệnh có thể có thể xâm nhiễm ngay khi

cây mới nhú. Nguồn nấm trong đất xâm nhiễm vào phần gốc cây sát mặt đất và cây con

bị ngã rạp. Nấm Phytophthora spp. còn gây thối hạt hay hạt mới nảy mầm (Naqvi, 1996).

Cây con sẽ bị chết nhanh chóng khi điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thích hợp cho nấm phát

triển. Cây sẽ kháng được bệnh chết rạp khi chúng có những lá thật và phần thân sát mặt

đất đã cứng cáp hơn.

- Bệnh thối mắt ghép và chảy gôm:

Là hai loại bệnh quan trọng và phổ biến trên cây có múi. Bệnh thối mắt ghép xuất

hiện ở chồi ghép gần mặt đất, sau đó lan xuống gây bệnh cho các chồi trên gốc ghép

kháng bệnh (Erwin & Ribeiro, 1966). Vỏ cây nhiễm bệnh vẫn cứng nhưng nhựa (gôm) sẽ

chảy ra từ những vết nứt trên thân. Gôm có thể bị rửa trôi sau khi mưa to nhưng vẫn tồn

tại trên thân cây trong điều kiện khô hạn. Vết bệnh lan xung quang thân, dần dần hại hết

phần vỏ cây. Cây bị bệnh nặng bộ lá có màu xanh tái và gân có màu vàng. Vết bệnh

không lan rộng hay phát triển hoặc nấm gây bệnh bị chết, phần mô cây bị bệnh sẽ được

bao bọc bằng lớp tế bào đã hóa bần. Bệnh có thể gây hại vỏ và chết cây trong vườn ươm

hay cây con trên vườn trồng mới. Các cây nhiều tuổi, vỏ thân bị hại từng phần, lá rụng,

cành khô chết, và sinh trưởng phát triển kém, không đồng đều. (Timmer and Broadbent,

2003; Alvarez và cs., 2008).

- Bệnh thối rễ:

Nấm Phytophthora spp. gây hại phần vỏ rễ và gây thối toàn bộ xơ rễ. Vỏ rễ bị bệnh

trở nên xốp, biến màu và thẫm nước, bị phá hủy, chỉ còn lại sợi trắng ở phần trung tâm rễ

và hệ rễ như búi xơ. Đối với những gốc ghép nhiễm bệnh, vết bệnh có thể xuất hiện trên

chóp rễ và tán lá bị biến màu nhưng không có những triệu chứng trên thân cây. Bệnh thối

rễ gây hại nặng cả trong vườn ươm và vườn kinh doanh. Cây bị bệnh không có khả năng

duy trì trạng thái cân bằng nước, không hấp thu được chất khoáng, và dinh dương do

nấm tấn công liên tục. Kích thước quả và năng suất bị giảm, lá bị rụng nhiều và cành trên

tán cây bị chết khô. Bệnh thối rễ hay thối chóp rễ dưới đất có thể xuất hiện khi sử dụng

gốc ghép kháng bệnh. (Graham và Timmer, 2011)

- Bệnh thối quả:

Quả bị nhiễm nấm sẽ bị phá hủy, phần nhiễm bệnh có màu nâu nhạt, ban đầu vỏ

quả bị chai cứng. Sợi nấm màu trắng sẽ hình thành trên bề mặt vết bệnh khi thời tiết ẩm

ướt. Những quả sát mặt đất dễ bị nhiễm bệnh do nguồn nấm bắn lên (Graham và

Dewdney, 2014). Nếu điều kiện thời tiết thuận lợi với nhiệt độ từ 75-820F, và thời gian

ẩm ướt kéo dài (hơn 18h), bệnh sẽ gây hại cho toàn bộ quả trên cây. Quả bị nhiễm bệnh

thường dễ bị rụng. Các quả bị nhiễm nấm mà không thể hiện triệu chứng vẫn sẽ được thu

hái, nhưng khi bảo quản trong kho sau vài ngày triệu chứng bệnh sẽ xuất hiện và bệnh sẽ

lan sang quả khác. Trong kho bảo quản, các quả nhiễm bệnh có mùi hôi, hăng. Bệnh thối

quả gây hại nặng khi mưa kéo dài trùng với thời điểm quả bắt đầu chín. Tất cả các giống

cây có múi đều bị nhiễm bệnh, đặc biệt là chanh (Timmer and Broadbent, 2003; Alvarez

và cs., 2008).

1.3.1.6. Phương thức lan truyền của nấm Phytophthora trên vườn cây ăn quả có múi.

Phytophthora là loài nấm ưa nước sống trong đất. Chúng tồn tại trong đất ở dạng

bào tử có vách dày (hậu bào tử) và bào tử trứng có thể chống chịu với điều kiện khô hạn.

Khi độ ẩm và nhiệt độ cao, rễ bị nhiễm nấm sản sinh bọc bào tử và sẽ giải phóng du động

bào tử. Du động bào tử bơi trong nước trong khoảng cách ngắn hoặc được di chuyển bởi

mưa hoặc nước tưới. Khi tiếp xúc với rễ, du động bào tử tạo nang, nảy mầm và sau đó

xâm nhiễm vùng đầu rễ (Duniway, 1983). Khi nấm đã ký sinh vào vùng chóp rễ, vùng

xâm nhiễm lan nhanh ra vỏ rễ gây thối toàn bộ rễ tơ. Chu trình này được lặp lại khi điều

kiện thuận lợi và cây có nhiều rễ tơ.

Sự lan truyền ban đầu của nấm Phytophthora. trên các vườn cây ăn quả có múi là

do việc sử dụng gốc ghép nhiễm bệnh trong vườn ươm. Nguồn bệnh có thể tồn tại trong

đất hoặc trong rễ nhiễm bệnh. Phương thức của sự lan truyền đã được báo cáo bởi

Ristaino and Gimpertz (2000): (i) Nguồn bệnh lan truyền từ rễ sang rễ, mầm bệnh chuyển

động và xâm nhập vào rễ hoặc do sự va chạm giữa các rễ trong đất; (ii) Nguồn bệnh lan

truyền theo dòng nước; (iii) Nguồn bệnh lan truyền do các hạt đất bắn lên phần trên của

cây; (iv) Nguồn bệnh phát tán qua không khí từ vết bệnh trên lá, thân, quả và các bộ phận

khác của cây; (v) Lan truyền qua hoạt động của con người hoặc động vật không xương

sống chuyển động trong đất.

Các yếu tố môi trường có ý nghĩa quan trọng trong sự phát triển, gây hại, lan

truyền và sự tồn tại của nấm Phytophthora. Trong các vườn ươm vùng Vidarbha, mật độ

nấm P. parasitica và P. palmivora tăng khi nhiệt độ tăng, trong khi mật độ nấm P.

citrophthora lại giảm khi nhiệt độ tăng (Naqvi, 1990). Ngưỡng nhiệt độ của nấm P.

parasitica là 330C hoặc có thể hơn tại vùng Arizona. Du động bào tử của nấm P.

citrophthora hoạt động mạnh gấp 5 lần tại nhiệt độ 240C khi so với nhiệt độ 300C. Nấm P.

parasitica thích hợp với điều kiện ấm, nhiệt độ 30-320C, và thời tiết khô với lượng mưa

hàng năm khoảng 1150-1300 mm, (Matheron and Porchas, 1996)

1.3.1.7. Phân lập và giám định nấm Phytophthora spp.

Phương pháp bẫy quả và lá đã được sử dụng từ lâu để phân lập nấm Phytophthora

spp. Để phân lập nấm P. parasitica, P. citrophthora và P. palmivora, nhiều loại môi

trường đặc hiệu đã được sử dụng.

- Xác định loài Phytophthora dựa vào đặc điểm hình thái

Phương pháp này dựa vào đặc điểm của bọc bào tử, các cấu trúc sinh sản hữu tính

như bao đực (antheridium), bao trứng (oogonium), bào tử trứng (oospore), hình thức sinh

sản hữu tính (đồng tản- homothallic hay dị tản-heterothallic), có hay không có bào tử hậu

(chlamydospores) để xác định loài nấm.

Tuy nhiên, rất nhiều loài trong chi Phytophthora có rất ít khác biệt hoặc lại có sự

biến đổi đáng kể về hình thái, khiến cho việc xác định ở mức độ loài của một số mẫu mất

nhiều thời gian, công sức và chi phí (Duncan và Cooke, 2002). Do đó, bên cạnh việc sử

dụng đặc điểm hình thái, sử dụng phương pháp sinh học phân tử và phối hợp cả hai

phương pháp sẽ tăng thêm độ chính xác của việc xác định loài Phtophthora (Drenth và

cs., 2006).

- Xác định loài Phytophthora bằng phương pháp sinh học phân tử

Phương pháp ELISA (enzyme-link immunosorbent assay) đã được phát triển để

xác định nấm Phytophthora trong rễ và tàn dư đất. ELISA có độ nhạy cao và có thể xác

định được nấm Phytophthora ở mật độ thấp.

Một số kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để xác định loài Phytophthora gồm

có RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), AFLP (Amplified Fragment

Length Polymorphism), PCR – SSCP (Single Strand Comformational Polymorphism)

hoặc trực tiếp giải trình tự đoạn DNA đặc trưng cho các loài Phytophthora. (Kong và cs.,

2004).

Phytophthora cũng như các sinh vật nhân thật (Eukaryote) có cấu trúc rDNA được

tổ chức thành các đơn vị phiên mã và các đơn vị này có thể được lặp lại nhiều lần trên bộ

gen và kề nhau tạo thành từng cụm đơn vị phiên mã (Kong và cs., 2004). Một đơn vị

phiên mã của rDNA gồm các gen xếp theo thứ tự là 18S-5.8S-28S; xung quanh vùng gen

này là các ITS có trình tự khác nhau, ví dụ như xung quanh 5.8S là hai vùng ITS ký hiệu

là ITS1 (ở đầu 5‘) và ITS2 (ở đầu 3‘). Kong và cs. đã dùng mồi xuôi với trình tự ITS6: 5‘-

GAA GTC GTA ACA AGG-3‘, tại vị trí trong 18S rDNA và mồi ngược ITS7: 5‘-AGC

GTT CTT CAT CGA TGT GC-3‘, được định vị trên 5.8S rDNA để khuếch đại đoạn ITS

để xác định nhanh loài P. ramorum.

Hiện nay, việc trực tiếp giải trình tự và phân tích trình tự của các vùng ITS có

thể phân biệt mối quan hệ di truyền tới mức loài do các vùng ITS này có tốc độ đột

biến tương ứng với tốc độ tiến hóa loài (tiến hóa trung tính) (Duncan và Cooke, 2002). Do

đó, trình tự nucleotide của ITS cũng thường được áp dụng để xác định và đánh giá mối

quan hệ của các loài Phytophthora (Blair và cs., 2008). Appiah và cs. (2004) đã sử dụng

trình tự ITS để đánh giá 88 mẫu phân lập của P. palmivora được thu thập từ cây ca cao từ

những khu vực khác nhau trên thế giới. Cacciola và cs. cũng đã báo cáo việc sử dụng

trình tự ITS để xác định loài P. palmivora gây hại trên cây cọ lá rẻ quạt (Trachycarpus

fortunei).

Ngoài ITS, trình tự của nhiều vùng gen mã hóa như cytochrome c oxidase I và II

(COXI và COX II) ty thể của Phytophthora cũng được phân tích để xác định loài (Cooke

và cs., 2000, Crawford và cs., 1996). COX II hiện diện ở ty thể mã hóa cho enzyme xúc

tác bước cuối trong chuỗi vận chuyển electron giữa cytochrome c với oxy. Được biết

vùng gen này dễ bị biến đổi cấu trúc hơn so với DNA trong nhân, do đó nó đã được dùng

trong nghiên cứu tìm các mối quan hệ di truyền, đặc biệt là các mối quan hệ di truyền ở

mức dưới loài.

Tính gây bệnh của nấm Phytophthora spp.

Dịch du động bào tử thường được sử dụng để xác định tính gây bệnh của nấm

Phytophthora đối với cây ký chủ. Khi lây bệnh trên dâu tây bằng dịch nấm P. cactorum

được nuôi cấy trên môi trường cho thấy lá cây biến màu vàng, giảm sinh trưởng, trong vài

ngày cây bị chết. Tuy nhiên, nấm sinh trưởng trên môi trường thường không đồng đều

nên sự nhiễm bệnh cũng khác nhau.

1.3.1.8. Loài Phytophthora palmivora.

Phytophthora palmivora đầu tiên được Hart đặt tên là Phytophthora omnivore vào

năm 1899 cho nấm được phân lập từ quả ca cao (Theobroma cacao L) bị bệnh ở Trinidad.

Loài được đặt tên là P. palmivora bởi Butler vào năm 1919 (Waterhouse, 1983). Năm

1929 Ashby gọi là Pythium palmivorum cho tác nhân gây bệnh trên cây cọ. Nấm còn có

những tên khác P. faberi, P. theobromae (Ashby, 1929) Pythium palmivora và P. carica

(Erwin và Ribeiro, 1996). Loài P. palmivora được xếp vào group II theo khóa phân loại

của Stamps và cs. (1990) và trong clade 4 bởi Cooke và cs. (2000) dựa trên cơ sở giải

trình tự vùng ITS của genomic rDNA.

Bọc bào tử của P. palmivora có núm (papillate), dạng thuôn dài, hình elip đến

hình trứng và dễ rụng. Cuống (pedicel) ngắn (<5 µm), kích thước 37-62 x 21-37 (trung

bình 50 x 28) µm và có tỉ lệ dài/rộng 1,4-2,0 (trung bình 1,8) (Nobuya và cs., 2012). Bọc

bào tử có thể nảy mầm trực tiếp thành sợi nấm hoặc phóng thích bào tử động tùy thuộc

vào điều kiện môi trường. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, bọc bào tử Phytophthora

bắt đầu phóng thích bào tử động sau 15 phút đặt chúng vào nước ở nhiệt độ 20-25°C. Hậu

bào tử hình thành nhiều trên môi trường, có dạng hình hơi cầu, đường kính 20-35µm. Cơ

quan sinh sản hữu tính không hình thành ở dạng mẫu đơn, chúng chỉ sản sinh khi có ghép

cặp đôi kiểu A2. Bao trứng (oogonia), trong trường hợp ghép cặp đôi, có dạng hình cầu,

thành nhẵn trơn, có đường kính từ 26-32 µm. Bao đực (antheridia) có nhụy kép và kích

thước khoảng 14 x 14 µm. Bào tử trứng (oospores) căng, màu vàng nâu nhạt, đường kính

20-28 (trung bình 24) µm. (Nobuya và cs., 2012, Erwin and Ribeiro 1996). Nhiệt độ tối

thích cho loài này là 27,5-30°C với mức tối thiểu là 11°C và tối đa là 35°C (Waterhouse,

1983).

Phytrophthra palmivora xâm nhiễm vào cây ký chủ qua bọc bào tử và du động bào

tử trong điều kiện ẩm độ cao (Erwin & Ribeiro, 1996). P. palmivora có thể gây hại trên

rễ, thân, lá, hoa và quả gây các triệu chứng thối rễ, thối gốc, thối thân, cháy lá, thối hoa và

thối quả (Erwin& Ribeiro, 1996). Triệu chứng bệnh do loài này gây ra thường trên thân

gần gốc, đặc trưng là những vết loét có màu tối sũng nước và những vệt hóa nâu chạy dọc

theo mạch dẫn trên mô vỏ và mô gỗ (Drenth và Guest, 2004). Bào tử nang có thể lây lan

qua mưa gió, qua đất và nước trong đất (Drenth, 2001; Erwin & Ribeiro, 1996). Du động

bào tử có thể di chuyển trong nước hoặc trên bề mặt của bộ phận cây bị ướt, phát tán, qua

gió mưa, qua nước trên mặt đất chờ cơ hội xâm nhiễm vào cây (Erwin & Ribeiro, 1996).

Bào tử hậu phát triển từ sợi nấm, khi có điều kiện thích hợp sẽ nẩy mầm và tiếp theo sản

sinh các bọc bào tử. Bào tử noãn được hình thành khi có hai kiểu ghép cặp khác nhau,

được gọi là A1 và A2 hiện diện (Waterhouse, 1983). Qua sinh sản hữu tính có thể tạo ra

thế hệ con cháu thay đổi về mặt di truyền mà có thể khắc phục được tính kháng của ký

chủ (Erwin, 1996). Bào tử hậu và bào tử noãn là những cấu trúc quan trọng giúp chúng

sinh tồn được trong điều kiện bất lợi, có thể sống trong đất và tàn dư cây trồng trong lúc

cây chủ chưa có mặt (Erwin & Ribeiro, 1996). Khả năng này giúp chúng lưu tồn và phát

sinh phát triển trong điều kiện không thuận và tiếp tục gây bệnh cho cây khi gặp điều kiện

thuận lợi Drenth và Guest, 2004).

1.3.1.9. Phytophthora citrophthora

Nấm được R. E. Smith và E. H. Smith đặt tên là Pythiacystis citrophthora vào năm

1906. Tới năm 1925 được gọi là Phytophthora citrophthora. Loài P. citrophthora được

xếp trong ITS Clade 2a theo Cooke và cs. (2000) và Kroon và cs. (2012).

P. citrophthora có thể gây hại trên rễ, thân, lá, và quả gây các triệu chứng thối rễ,

thối gốc, chảy gôm và thối quả. Cây con và cây trong thời ký kinh doanh đều bị nhiễm

bệnh chảy gôm với triệu chứng tương tự nhau. Khi cây con bị nhiễm bệnh, bề mặt vỏ thân

bị lõm xuống và chảy gôm, gôm có dạng trong suốt trong điều kiện ẩm ướt và sẽ chuyển

màu nâu vàng trong điều kiện khô. Bộ rễ bị thối và cây con bị chết. Cây trưởng thành

cũng có thể bị chết khi các vết bệnh bao phủ toàn bộ vỏ thân. Gôm trên vỏ thân thể hiện

sự tiến triển của mức độ bệnh (Agrios, 2005).

Trên môi trường PDA, tản nấm P. citrophthora có màu trắng và hồng nhạt, trong

khi đó, trên môi trường V8, tản nấm có dạng hình sao khi mới nuôi cấy và có dạng bông

khi đã thành thục. Trên môi trường PDA, sợi nấm mọc phủ kín đĩa petri (đường kính 9

cm) sau 21 ngày và trên môi trường V8 là 10 ngày nuôi cấy. Sợi nấm không có vách

ngăn, phân nhánh, dạng chuỗi, bao xung quanh, trong suốt, nhẵn tới ráp, căng, hình tròn

đến hình trứng và không đồng đều. Hậu bào tử hình cầu và hình thành xen kẽ. Bọc bào tử

có dạng hình cầu, hình thoi, hình elip hay thuôn dài, đôi khi méo mó và không đối xứng

(Julinda và cs., 2017).

Theo Francis và cs. (2015), bọc bào tử của P. ctrophthora có hình trứng-quả lê

ngược, hình elip đến hình thoi, có núm, thường có 2 núm và 2 thùy, dễ rụng (cuống dài 5

đến 15µm), kích thước trung bình 50,6 (36,5-64,4) x 31,1 (23,6-38,6µm) và tỉ lệ dài/rộng

là 1,6 (1,3-2,3). Nấm có thể phát triển được ở nhiệt độ 5oC nhưng không phát triển ở nhiệt

độ 35oC.

1.3.1.10. Phytophthora parasitica

Nhiệt độ thích hợp nhất cho sợi nấm P. parasitica phát triển từ 86-900F. Điều kiện

tối ưu nhất cho sự hình thành bọc bào tử là mối quan hệ tương tác giữa nước và không

khí. Điều kiện dinh dưỡng suy kiệt và ánh sáng cũng kích thích sự sản sinh bọc bào tử từ

sợi nấm. Khi khô hạn một lượng nhỏ nước cũng kích thích được bọc bào tử sản sinh du

động bào tử trong điều kiện nhiệt độ thích hợp. Dưới điều kiện ẩm, bọc bào tử có thể nảy

mầm trực tiếp bằng cách hình thành ống mầm, nhưng kiểu nảy mầm không trực tiếp là

quan trọng hơn trong chu kỳ bệnh thối rễ.

Sự sản sinh hậu bào tử nấm P. parasitica xảy ra khi điều kiện bất thuận cho nấm

sinh trưởng, ví dụ như tình trạng suy kiệt dinh dưỡng, nồng độ oxy thấp và nhiệt độ

khoảng 50-640F. Yêu cầu về nước cho sự nảy mầm của hậu bào tử tương tự như bọc bào

tử. Hậu bào tử của nấm P. parasitica xuất hiện và ở trạng thái ngủ nghỉ khi nhiệt độ dưới

590F, và khi nhiệt độ từ 82-900F sẽ kích thích sự nảy mầm. Dinh dưỡng trong đất và rễ

cây cũng là điều kiện để hậu bào tử nảy mầm. Các yêu cầu cho sự nảy mầm của bào tử

trứng cũng gần giống như bào tử hậu. Bào tử trứng sinh trưởng thuần thục là yếu tố quan

trọng đối với khả năng nảy mầm và phát triển của nấm Phytophthora spp. Thời kỳ chênh

lệch nhiệt độ cao và thấp có thể là điều kiện tiên quyết cho sự nảy mầm đồng đều của nấm

Phytophthora (Timmer and Broadbent, 2003; Alvarez và cs., 2008).

P. parasitica, tồn tại trong tàn dư, rễ. Khi găp điều kiện bất thuận tại chỗ vỏ rễ bị

trầy xước, nấm sản sinh hậu bào tử và có thể tồn tại bền vững trong thời gian dài. Khi gặp

điều kiện thuận lợi, hậu bào tử nảy mầm gián tiếp để sản sinh bọc bào tử, du động bào tử

hoặc trực tiếp sản sinh sợi nấm. Khi cả 2 kiểu sinh sản cùng hiển diện, bào tử trứng được

sản sinh và giúp cho sự tồn tại của nấm. Bệnh thối gốc thân và chảy gôm trên thân xảy ra

khi du động bào tử hoặc mầm bệnh bắn lên phần thân ngay phía trên của chồi non. Phần

gỗ và độ ẩm xung quanh thân sẽ giúp cho vết bệnh phát triển. Vết bệnh vùng gốc thân

không thường xuyên sản sinh các mầm bệnh ít gây thành dịch bệnh. Mặc dầu vậy, dịch

bệnh cháy lá và thối nâu thường phổ biến hơn, đặc biệt trên các loài nhiễm bệnh như

chanh. Khi gặp điều kiện thuận lợi, quả và lá non có thể bị nhiễm từ nguồn bệnh bắn lên

từ đất.

Xâm nhiễm thứ cấp sau đó có thể do nguồn bệnh từ phần trên của cây sát mặt đất

phân tán do mưa bắn lên hoặc gió thổi khi đang mưa. Hiện tượng này ít xảy ra với nấm P.

parasitica, loài không dễ sản sinh bào tử nang trong không khí. nhưng hay xảy ra với nấm

P. citrophthora và các loài khác dễ sản sinh số lượng lớn bào tử nang trên bề mặt quả và

lá. Bệnh thối nâu rất phổ biến khi có nhiều loài xuất hiện và thời gian mưa kéo dài.

(Graham and Timmer, 1992).

Mật độ mầm bệnh (ID: inoculum density) có thể thay đổi trong một vụ, ở các vườn

trồng cây bang Florida, số lượng mầm bệnh trung bình từ 1-20/cm3 đất, nhưng thỉnh

thoảng lên tới 100-200/cm3. Timmer và cs., 2003 cho rằng ngưỡng mật độ gây hại trên

vườn kinh doanh là từ 10-20 CFU/cm3, nhưng trong vườn mới trồng, hoặc trên vườn gốc

ghép thì ngưỡng mật độ là 3-5 CFU/cm3. Mật độ mầm bệnh của nấm P. parasitica liên

quan trực tiếp đến sinh khối rễ sơ, nơi các rễ bị bệnh cung cấp dinh dưỡng cho sự gia tăng

số lượng mầm bệnh. Mật độ mầm bệnh của nấm P. citrophthora cao nhất > 100 CFU/cm3

được tìm thấy trong đất trồng cây có múi bị dịch bệnh thối nâu quả. Mặc dầu vậy, thông

thường mật độ mầm bệnh trong các vườn trồng cây ăn quả có múi thường biến thiên từ 1-

20 CFU/cm3.

1.3.1.11. Quản lý bệnh Phytophthora

Có hơn 60 loài Phytophthora đã được mô tả là các loài gây bệnh cho cây trồng.

Mỗi loài có thể gây bệnh cho từ một vài cho đến hơn 1000 loài cây trồng khác nhau. Chỉ

có sự kết hợp các biện pháp phòng trừ bệnh tổng hợp mới có hiệu quả phòng trừ bệnh .

Có 5 yếu tố cơ bản, liên quan chặt chẽ để quản lý bệnh đó là: (1) kỹ thuật canh tác, (2)

tạo giống kháng, (3) phòng trừ sinh học, (4) phòng trừ hóa học (David and André Drenth,

2004).

- Kỹ thuật canh tác

Hiệu quả của biện pháp này phụ thuộc vào khả năng sống của các loài

Phytophthora, kể cả các bào tử hoại sinh hay trong giai đoạn ngủ nghỉ. Nhìn chung, sợi

nấm và du động bào tử tồn tại khoảng vài tuần, trong khi hậu bào tử có thể tồn tại đến 6

năm, và bào tử trứng tồn tại đến 13 năm (Erwin và Ribeiro, 1996). Một số loài, mặc dầu

vậy, như loài P. cinnamomi, chủ yếu ở dạng hoại sinh, trong khi các loài khác như P.

palmivora thì không như thế (Timmer và cs, 2003).

+ Chuẩn bị đất: Biện pháp cần thiết, thiết lập vườn trước khi trồng cây cần phải có

hệ thống mương rãnh xung quanh luống trồng với độ sâu khoảng 80-100 cm, tầng đất

canh tác và lớp đất bề mặt phải khô, bằng phẳng để tránh bị ngập và úng nước, vì độ ẩm

bão hòa sẽ làm cho cây dễ bị nhiễm bệnh Phytophthora. Khi trồng lại, bỏ vườn hoang một

khoảng thời gian khoảng từ 6-12 tháng sẽ làm giảm đáng kể nguồn nấm bệnh

Phytophthora và các sinh vật gây hại khác trong đất như tuyến trùng…. Cây con phải

được trồng với độ sâu như trong vườn ươm để tránh sâu tiện gốc. Gốc cây phải được đắp

đất nổi để tránh nước ứ đọng dưới tán cây khi hệ rễ phát triển (Timmer và cs, 2003).

+ Trồng cây sạch bệnh, nguồn bệnh được tìm thấy trên vườn kinh doanh thường

lan truyền từ vườn ươm. Các cây có triệu chứng bệnh chảy gôm cần được loại bỏ trước

khi trồng. Nếu tỉ lệ cây trong vườn ươm bị bệnh chảy gôm cao và giá trị trung bình của ID

tại vùng rễ cao hơn 3-5 CFU/cm3 thì cần loại bỏ hoàn toàn những lô cây này.

Biện pháp phòng ngừa được sử dụng để quản lý bệnh chết cây con bằng cách sử

dụng hạt từ những quả khỏe, sạch bệnh và xử lý thuốc hóa học, sau đó gieo trên nền đất

đã khử trùng và sử dụng nguồn nước tưới sạch. Một số biện pháp được khuyến cáo trong

việc vệ sinh vườn ươm có thể tóm tắt như sau: xông hơi, khử trùng đất trước khi trồng;

hạn chế sự đi lại của con người và máy móc trên vườn; trồng cây trong các thùng chứa

khác nhau và đặt trên ghế băng hay dưới lát sỏi để tránh tiếp xúc với đất; kiểm tra thường

xuyên và loại bỏ những cây bị bệnh để tránh lây lan trong vườn; kiểm tra ít nhất một lần

mật độ mầm bệnh trong các thùng chứa vào tháng 4 và tháng 11; không tưới quá nhiều

nước; chọn vị trí vườn ươm không gần với vườn kinh doanh; không sử dụng các dụng cụ

đang dùng ở vườn kinh doanh (Naqvi, 2002a; Timmer và cs, 2003).

+ Kiểm dịch thực vật là vấn đề rất quan trọng trong quản lý cây giống vì hàng năm

có hàng triệu cây giống được sản xuất, tạo điều kiện dễ dàng cho sự lan truyền của nấm

Phytophthora. Với những vùng chưa ghi nhận sự xuất hiện của nấm Phytophthora thì

vấn đề kiểm dịch thực vật là hết sức quan trọng. Việc tiến hành công tác kiểm dịch thực

vật trong vườn ươm bao gồm các biện pháp như làm hàng rào ngăn ngừa động vật, gia

súc; hạn chế con người và xe cộ hoạt động trên vườn, loại bỏ đất trên xe, dụng cụ, giầy

ủng trước khi vào vườn, chỉ trồng cây không bị bệnh hoặc kháng bệnh, sửa chữa lại hệ

thống nước tưới (Naqvi, 2002a; Timmer và cs, 2003 Broadley, 1992).

+ Quản lý nước tưới: Một phần quan trọng trong chu kỳ sống của P. citrophthora

và P. nicotianae là tồn tại trong nước. Bọc bào tử giải phóng du động bào tử nếu độ ẩm

đất và không khí bão hòa. Du động bào tử được giải phóng sẽ tấn công rễ, thân, quả, cành

hoặc lá) thông qua nước. Việc quản lý nước tưới cần thực hiện theo các bước đơn giản

như sau: (i) sử dụng nước không có nguồn bệnh; (ii) giữ thân cây được khô ráo; (iii) tránh

đất bị ngập úng (Naqvi, 2002a, Graham & Feichtenberger, 2015).

+) vì đạm dạng ammonium trong thực tế

+ Quản lý phân bón: Trong những vườn cây có múi bị bệnh thối rễ, bón đạm dạng

-) tốt hơn đạm dạng ammonium (NH4

nitrate (NO3

sẽ chuyển hóa thành asparagine (C4H8N2O3) và glutamine (C5H10N2O3). Các axit amin

này là nguồn cung cấp dinh dưỡng lý tưởng cho P. nicotinanae và hấp dẫn du động bào tử

(Naqvi, 2002a; Graham & Feichtenberger, 2015).

+ Quản lý đất và cỏ dại: Loại bỏ bớt đất ở phần gốc cây bị bệnh chảy gôm sẽ tránh

vỏ cây bị ẩm lâu dài và giúp cho vết bệnh nhanh hồi phục. Cỏ dại xung quanh gốc cây sẽ

giúp cho bệnh chảy gôm phát triển. Do đó việc sử dụng thuốc trừ cỏ định kỳ sẽ giảm thiểu

sự phát triển của bệnh chảy gôm. Việc phun thuốc trên mặt luống tiêu diệt cỏ cũng làm

giảm những vết thương phần vỏ trên bề mặt thân, tránh được sự xâm nhập của nấm bệnh

(Graham & Timmer, 2006). Tuy nhiên cỏ dại mọc giữa hai luống trong mùa mưa sẽ làm

giảm sự phát triển của bệnh thối quả do làm giảm ảnh hưởng của mưa đối với đất. Chúng

còn hạn chế sự xuất hiện của nguồn bệnh, hạn chế nguồn bệnh xâm nhiễm lên quả, lá qua

việc bắn nước mưa.

+ Tỉa cành, tạo tán: Tỉa cành và tạo tán có thể ảnh hưởng đến mức độ nhiễm bệnh

nấm Phytophthora. Ví dụ, tỉa bớt các cành phía dưới có thể làm giảm bệnh chảy gôm và

sẽ làm giảm mức độ bệnh thối nâu quả. Biện pháp tỉa đau các bộ phận bị bệnh do thối

chân rễ hay thối rễ sẽ thu nhỏ không gian tán cây tránh cây bị đổ gục. Hơn nữa, nó sẽ giúp

cây hồi phục, tránh lây nhiễm do các nguồn bệnh đã bị loại bỏ và sẽ giúp cho việc sử

dụng thuốc hóa học có hiệu quả hơn.

- Tạo giống kháng bệnh

+ Gốc ghép: Mức độ gây hại và sự phát triển của bệnh thối gốc và thối rễ phụ

thuộc vào sự mẫn cảm của gốc ghép. Từ khi dịch bệnh trên cây có múi bùng phát năm

1860 tại Mediterranean, việc quản lý bệnh thối gốc và thối rễ do nấm Phytophthora đươc

dựa vào việc sử dụng gốc ghép kháng. Tại Nhật Bản, bệnh thối gốc rễ có tỉ lệ hại rất thấp

do việc sử dụng nhiều gốc ghép là cây cam 3 lá. Mặc dù việc sử dụng giống kháng là một

biện pháp canh tác hữu hiệu nhất để phòng chống bệnh thối rễ Phytophthora, tuy nhiên

một số gốc ghép kháng Phytophthora nhưng lại nhiễm một số bệnh khác hoặc có đặc tính

sinh trưởng không tốt. Gốc ghép kháng P. citrophthora có thể kháng cả P. nicotianae.

Tuy nhiên, không phải gốc ghép kháng được bệnh thối gốc là kháng được bệnh thối rễ. Ví

dụ, cam chua (C. aurantium L.) và “Carrizo” citrange (C. sinensis Osbeck × P. trifoliata

[L.] Raf) chống chịu được bệnh thối gốc nhưng nhiễm bệnh thối rễ (Naqvi, 2002a,

Graham, Dewdney & Timmer, 2011). Gốc ghép cam 3 lá kháng được cả hai bệnh trên.

Kết quả phân lập mầm bệnh trong đất của 14 loại cây gốc ghép ở cam 17 năm tuổi (ghép

cam Valencia chín muộn) trên một vườn trồng cho thấy mật độ mầm bệnh thấp nhất thu

được tại vùng đất xung quanh các gốc ghép Citrus aurantium, Citrus macrophylla,

Poncirus trifoliata, Cleopatra mandarin, citrumelo 4475 và Goutou. Ngược lại mật độ

cao nhất thu được tại các gốc ghép Citrus volkameriana, sunki mandarin and Carrizo

citrange. Nhìn chung, mật độ mầm bệnh thay đổi từ 100 mầm bệnh/g đất (xung quanh

vùng rễ gốc cam chua) đến 1200/g đất (xung quanh vùng rễ Citrus volkameriana) và có

sự liên quan đến khí hậu trong năm (Dalan và cs., 2016)

+ Ghép: Điểm ghép cần có độ cao ít nhất từ 40 cm trở lên để tránh nguồn bệnh

trong đất bắn lên do mưa hoặc khi tưới nước. Đa số các dòng, giống cây có múi sử dụng

mắt ghép mẫn cảm với bệnh Phytophthora. Khi ghép các mắt nhiễm bệnh như

clementines hoặc cam ngọt sẽ làm giảm độ chống chịu của gốc ghép. (Naqvi, 2002a,

Graham, Dewdney & Timmer, 2011).

- Phòng trừ bằng thuốc hóa học

Việc sử dụng thuốc hóa học để phòng trừ bệnh Phytophthora đã được sử dụng

rộng rãi từ khi các thuốc trừ nấm lưu dẫn có hiệu lực cao được sản xuất như metalaxyl và

Al ethyl-phosphyte (hay fosetyl-Al) (Davis, 2004; Timmer & Broadben, 2003). Gần đây,

metalaxyl đã được thay thế bởi metalaxyl-M (hoặc mefenoxam) do có hiệu quả cao ở liều

lượng thấp hơn. Một chiết xuất của axít phosphorous (H3PO3) là potassium phosphonate,

sản phẩm trên thị trường dưới dạng phân bón, có tính năng tương đương với Al

ethylphosphyte. Các loại thuốc hóa học này đều có hiệu lực với cả hai loài nấm P.

citrophthora và P. nicotinanae.

Có sự sai khác về hiệu lực của các loại thuốc hóa học: fosetyl-Al có hiệu quả tốt

hơn đối với nấm P. citrophthora, trong khi mefenoxam lại có hiệu quả tốt hơn đối với P.

nicotinanae. Mefenoxam di chuyển lên trên nên có hiệu quả khi sử dụng tưới vào đất

hoặc xử lý phần vỏ cây. Cả hai loại thuốc này có thể duy trì hiệu lực trong mô cây từ 3-4

tháng (Matheron & Porchas 1996). Mefenoxam gây độc trực tiếp đến sinh trưởng của sợi

nấm và sự nảy mầm của hai loại nấm Phytophthora. Phun hay quét thuốc lên cây với

nồng độ cao (6% mefenoxam và 10% fosetyl-Al) còn giúp cho cây hồi phục. Xử lý thuốc

lần đầu khi mới phát hiện bệnh và phải xử lý tiếp sau 3-4 tháng. Nếu cây bị bệnh trên

50% chu vi thì việc xử lý sẽ không có hiệu quả, cần phải thay thế cây khác. Cũng có thể

xử lý hoạt chất chứa đồng nhưng chỉ sử dụng ở trường hợp phòng bệnh khi hoạt chất

không xâm nhập vào cây. Cả hai loại thuốc mefenoxam và fosetyl-Al đều có hiệu quả

phòng chống thối rễ khi xử lý đất.

Cơ chế của chiết xuất axít phosphorous lại phụ thuộc vào khả năng của chúng kích

thích tính kháng của cây trồng dựa trên lượng độc tố thực vật (phytoalexins) mà cây sản

sinh, và ở mức độ ít hơn, có thể hạn chế sự phát triển của nguồn bệnh (Afek &

Sztejnberg, 1988). Chiết xuất của axít phosphorous có thể di chuyển lên trên hay xuống

dưới trong cây nên có thể tưới hay xuống đất hay phun trên lá, quả. Nên sử dụng chiết

xuất này ở dạng phòng chống, khi cây còn khỏe hoặc mới nhiễm bệnh và khi cây đang có

hoạt động sinh lý mạnh.

Hiện nay, một loại thuốc từ nấm mới, dimethomorph, xử lý quét thân với nồng độ

cao có hiệu quả như fosetyl-Al và mefenoxam trong việc hạn chế nứt và chảy gôm trên vỏ

cây (Matheron & Porchas, 1996). Tuy nhiên, fosetyl-Al và chiết xuất của axít

phosphorous có hiệu quả hơn khi phun trên lá.

Đối với cây con cần xử lý thuốc thường xuyên trong 2 năm nếu cây là giống mẫn

cảm với bệnh. Trên vườn kinh doanh, cần xử lý thuốc khi gặp một trong các trường hợp

sau: (i) cây ghép trên gốc ghép mẫn cảm với bệnh; (ii) vườn cây thường xuyên bị bệnh

thối rễ do yếu tố môi trường mà không thể khắc phục được; (iii) mật độ nguồn bệnh chạm

tới ngưỡng chuẩn khoảng 15-20 CFU/g hoặc cm3 đất.

Trong một số vùng đất mefenoxam bị phân hủy do hệ vi khuẩn trong đất trong

khoảng 14-28 ngày (Bailey & Coffey, 2008). Nếu xử lý qua hệ thống tưới thì thời gian

phân hủy thuốc nhanh hơn, từ 2-9 ngày. Xử lý thuốc mefenoxam qua hệ thống tưới là rất

hợp lý. Để tránh thuốc bị rửa trôi, pha thuốc vào lần cuối cùng trong một lần tưới.

Để tránh sự phân hủy thuốc cũng như bảo vệ hệ vi sinh vật đất có thể thay đổi sử

dụng chiết xuất của axít phosphorous. Sự thay đổi này cũng giúp hạn chế tính kháng

thuốc mefenoxam của nấm Phytophthora. Xử lý thuốc phòng chống bệnh thối gốc và thối

rễ cũng sẽ bảo vệ được quả đối với bệnh thối nâu cả ở giai đoạn trước và sau thu hoạch.

Thời gian xử lý thuốc phụ thuộc vào động thái của nguồn bệnh và giai đoạn sinh lý của

cây. Trong trường hợp bệnh thối rễ do P. nicotianae gây ra, xử lý thuốc hiệu quả nhất

ngay khi rễ bắt đầu phát triển vào mùa xuân, và xử lý lần hai trong mùa hè. Đối với bệnh

do nấm P. citrophthora và liên quan đến bệnh thối chân rễ, cần xử lý tiếp thuốc trong mùa

thu trước khi có mưa mùa đông.

- Phòng trừ bằng biện pháp sinh học

Kiểm soát sinh học dịch hại cây trồng là việc sử dụng có chủ đích các sinh vật

sống để ngăn chặn các hoạt động của quần thể hoặc của một tác nhân gây bệnh thực vật.

Trên thế giới nhiều vi sinh vật đối kháng đã được tuyển chọn, sử dụng cho sản xuất chế

phẩm sinh học kiểm soát nấm Phytophthora, tiêu biểu là một số loài Streptomyces,

Bacillus, Trichoderma, …

Trong xu thế phát triển nông nghiệp hữu cơ bền vững, nhiều tác nhân sinh học đã

được nghiên cứu để phòng trừ bệnh Phytophthora trên cây có múi. Một số nghiên cứu cho

thấy quản lý tổng hợp bệnh bằng cả biện pháp sinh học và hóa học cho hiệu quả cao đối

với bệnh Phytophthora (Gade và Lad, 2018). Một số loài vi sinh vật như Trichoderma

harzianum, T. virens, Pseudomonas fluorescens, Chaetomium globosum, Gliocladium

virens và Bacillus spp. có hiệu quả đối với Phytophthora trên cây có múi (Heller and

Hedtrich, 1994; Gade, 2012).

Gade và Koche (2012) cho thấy kết hợp Pseudomonas fluorescnes với thuốc hóa

học và phân hữu cơ có hiệu quả quản lý bệnh thối rễ và chảy gôm trên quýt Nagpur. Mật

độ mầm bệnh trong đất từ 24,33 (tháng 5/2008) giảm xuống 6,20 cfu/g đất (tháng

5/2010). Tỉ lệ bệnh thối rễ giảm từ 36,18% xuống 16,7% khi kết thúc thí nghiệm. Tương

tự, tỉ lệ bệnh chảy gôm cũng giảm khoảng 54,76%.

Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm của Heller và Hedtrich (1994) cho thấy

Chaetomium globosum, Gliocladium virens và Trichoderma viride có hiệu quả hạn chế

với tất cả các loài Phytophthora trong thí nghiệm. Một số dòng Bacillus và Trichoderma

phân lập có hiệu lực đối với bệnh thối rễ Phytophthora trong điều kiện nhà lưới.

Nấm Trichoderma:

Trichoderma là nấm bất toàn, thuộc họ Hypocreaceae, sinh sản vô tính bằng bào tử

bụi trên các giá bào tử có hình dạng khác nhau xếp thành chuỗi (đính bào tử) ở đầu ngọn

có cuống bào tử. Trichoderma spp hiện diện gần như trong tất cả các loại đất trồng trọt và

trong một số môi trường sống khác, phát triển nhanh ở 25-30°C, một số ít loài

Trichoderma tăng trưởng được ở 45°C. Nấm Trichoderma hiện diện với mật độ cao và

phát triển mạnh ở vùng rễ của cây trồng, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ.

Đa số các loài Trichoderma là nấm có ích, có một số loài là tác nhân gây bệnh hại.

Trichoderma có khả năng đối kháng với nhiều loài nấm bệnh, tuyến trùng hại cây

trồng thông qua cơ chế ký sinh, tổng hợp các enzym phân hủy thành tế bào nấm bệnh

(cellulase, glucanase, chitinase.v.v.) hoặc tổng hợp chất kháng sinh và cạnh tranh dinh

dưỡng. Nghiên cứu của Ezziyyanil và cs, xác định hỗn hợp Trichoderma harzianum và

Streptomyces rochei có thể hạn chế tới 75% mức độ gây hại của nấm P. capcisi (Heller và

Hedtrich, 1994).

Nhiều nghiên cứu xác nhận Trichoderma có khả năng tăng cường sinh trưởng, phát

triển thực vật thông qua tác dụng kích thích hình thành nhiều và phát triển mạnh hơn của

bộ rễ cây trồng. Trichoderma thông qua các enzyme ngoại bào có khả năng phân giải các

hợp chất hữu cơ trong đất, góp phần gia tăng độ phì nhiêu của đất trồng trọt.

Gade (2012) cho thấy, trong điều kiện phòng thí nghiệm, Trichoderma harzianum

có hiệu lực hạn chế nấm P. parasitica đến 84,96%. Trichoderma viride có hiệu lực hạn

chế sự sinh trưởng của sợi nấm P. paracitica tới 75,33%. Trong nhà kính, khi xử lý T.

viride (4g/kg) hỗn hợp với dịch chiết tỏi (5%) có hiệu lực giảm tỉ lệ bệnh (11,32%) khi so

với đối chứng (44,99%) (Pente và cs., 2015). Độ dài của chồi tăng (23,55 cm) và dung

tích tán cây tăng (10,89%) khi xử lý T. harzianum kết hợp cùng thuốc hóa học và phân vi

sinh và cũng làm giảm tỉ lệ bệnh thối rễ (Lende và cs., 2015).

Tại Việt Nam một số công trình nghiên cứu đã công bố cho thấy Trichoderma là

tác nhân sinh học tiềm năng trong kiểm soát nấm bệnh, tuyến trùng (Đặng Thùy Linh,

Nguyễn Văn Hòa, 2004; Trần Thị Thuần và cộng tác viên, 2004; Trần Kim Loang và

cộng tác viên, 2007; Phạm Ngọc Dung và cộng tác viên, 2008; Trần Kim Loang và cộng

sự 2008; Nguyễn Tăng Tôn và cộng tác viên, 2010; Đỗ Trung Bình, 2013; Lê Đức Khánh,

2015; Hà Minh Thanh, 2017; Nguyễn Văn Tuất 2017). Theo Đặng Thị Kim Uyên, (2007)

sử dụng phân hữu cơ và Trichoderma có hiệu quả phân hủy xác bã thực vật và diệt mầm

bệnh hại, giúp cây phát triển tốt hơn.

Vi khuẩn Bacillus

Bacillus là vi khuẩn hình que, gram dương, hiếu khí thuộc họ Bacillaceae, tồn tại

tự nhiên trong đất, nước và không khí, có khả năng tạo bào tử và sống sót trong các điều

kiện khó khăn. Nhiều loài Bacillus có khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào

(amylase, pullulanase, β-glucanase, β-galactosidase, xenlulaza, xylanaza, chitinaza,

esterase, lipase...) được khai thác sử dụng rộng rãi trong công nghiệp và đời sống. Một số

loài Bacillus có khả năng sinh tổng hợp chất hoạt động bề mặt và được khai thác sử dụng

để thay thế thuốc kháng sinh, tiêu biểu là B. subtilis, B. pumilus, B. licheniformis B.

amyloliquefaciens (Keswani và cs, 2019). Bacteriocins là sản phẩm tạo ra từ nhiều vi sinh

vật trong đó có Bacillus có tác dụng diệt khuẩn. Một số enzym như protease, chitinase,

glucanase, kháng sinh peptide được Bacillus tổng hợp có tác dụng ức chế, tiêu diệt vi

sinh vật gây bệnh và được khai tác sử dụng là probiotic cho người, vật nuôi, động vật thủy

sản (Yu và cs, 2002). Theo Mardanova và cs, (2017) nhiều chủng Bacillus có khả năng

đối kháng và hạn chế nấm bệnh hại hồ tiêu và cây rau màu.

Một số loài Bacillus đã được xác định có khả năng tăng cường sinh trưởng thực vật

(IAA, cytokinins và gibberellins ) và sử dụng trong sản xuất phân bón vi sinh vật, phân

bón chức năng.

Kết quả nghiên cứu của Das và cs. (2014) cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis có tác

dụng hạn chế nấm Phytophthora. Một số chủng vi khuẩn như Pseudomonas syringae,

Erwinia herbicola, Bacillus subtilis và Pseudomonas fluorescence phân lập từ vùng đất

cây có múi có khả năng kháng nấm gây bệnh chảy gôm trong điều kiện phòng thí nghiệm

(Kalita và cs., 1996).

Tại Việt Nam, nghiên cứu sử dụng Bacillus làm tác nhân sinh học kiểm soát vi

sinh vật gây bệnh hại cây trồng đã được một số tác giả công bố (Phạm Việt Cường và

cộng tác viên, 2003; Vũ Thúy Nga, 2008; Lê Thị Thanh Thủy và Lê Như Kiểu, 2016;

Nguyen và cs., 2019; Thi Phuong Hanh Tran và cs., 2019; T. H. T. Trinh và cs., 2019).

Môi trường dinh dưỡng khác nhau cũng ảnh hưởng đến hiệu lực của các vi sinh vật

nhưng chúng đều làm giảm mật độ của nguồn bệnh từ 41 đến 8 mầm bệnh/g đất cùng với

giảm tỉ lệ bệnh thối rễ và thối cổ rễ.

Xạ khuẩn - Streptomycetes

Streptomycetes là xạ khuẩn gram dương, dạng sợi ở họ Streptomycetaceae

(Phylum Actinobacteria, Order Actinomycetales), sống hoại sinh với hơn 500 loài phân

bố rộng rãi trong đất, nước và vùng rễ cây trồng. Gần 2/3 kháng sinh tự nhiên được tổng

hợp từ streptomycetes. Khoảng 7.600/43.000 các hoạt chất sinh học, 100.000 chất kháng

sinh đang được sử dụng trong y dược và nông nghiệp được sản xuất từ Streptomyces.

Streptomycetes đồng thời có khả năng tổng hợp nhiều enzyme quan trọng trong phân hủy

sinh học.

Streptomycetes là nhóm vi sinh vật nội sinh được quan tâm nghiên cứu nhiều trong

thời gian gần đây cho mục đích kiểm soát sinh học bệnh hại cây trồng. Nhiều chủng

Streptomyces đã được nghiên cứu đánh giá khả năng kiểm soát nấm bệnh Phytophthora

capsici gây bệnh trên ớt, hồ tiêu, cà chua và xác định hiệu lực kiểm soát đạt trên 70%

trong điều kiện nhà lưới, vườn ươm (Shi và cs, 2018). Một số chế phẩm sinh học có

nguồn gốc từ Streptomyces spp đã được thương mại hóa như Mycostop sản xuất từ S.

griseoviridis K61 ở Phần Lan, Đức, Actinovate®, Micro108®, Action Iron® sản xuất từ

S. Lydicus ở Hoa Kỳ hoặc YAN TEN sản xuất từ S. saraceticus KH400 ở Đài Loan.

Jauri và cs, (2017) cho biết, quần thể Streptomyces spp được tìm thấy nhiều trong

đất kìm hãm nấm bệnh (pathogen fungi-Suppressive Soils) là đất trồng không chứa mầm

bệnh hoặc chứa mầm bệnh nhưng không phát sinh hoặc ít phát sinh bệnh, đặc biệt đất

được bón phân xanh.

Theo Bubici (2018) trong thập kỷ qua, trên thế giới đã có 244 bài báo khoa học

được công bố về nghiên cứu sử dụng streptomycetes trong kiểm soát bệnh do nấm

Fusarium gây ra so với 950 bài báo về Trichoderma spp, 610 bài báo về Bacillus spp và

510 bài báo về Pseudomonas spp. Các kết quả nghiên cứu cho biết sử dụng Streptomyces

có thể giảm 31 ± 26% tỷ lệ bệnh hại cây trồng trên thực địa, 57 ± 9% trong điều kiện nhà

kính, đồng thời gia tăng sinh trưởng cây 2,1 ± 1,1 lần. Hoạt tính phân giải chitin là một

trong các hoạt tính quan trọng của Streptomyces spp trong kiểm soát sinh học nấm bệnh

và kích thích sinh trưởng thực vật. Streptomyces spp có tác động tương hỗ với các chất

hữu cơ và các vi sinh vật hữu ích khác trong kiểm soát sinh học nấm bệnh, thúc đẩy tăng

trưởng cây trồng. Bubici (2018) khuyến cáo nên sử dụng tổ hợp các vi sinh vật hữu ích

trong kiểm soát nấm bệnh hại rễ cây trồng.

Tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu ứng dụng xạ khuẩn kiểm soát

bệnh hại cây trồng và bước đầu đã phân lập, tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn có

khả năng đối kháng nấm Rhizoctonia solani gây bệnh đốm vằn trên lúa (Lê Minh Tường

và Ngô Thị Kim Ngân (2014), nấm đạo ôn trên lúa (Nguyễn Thị Phong Lan và cộng tác

viên, 2015), nấm Phytophthora spp gây thối thân sen (Đinh Hồng Thái và Lê Minh

Tường, 2016).

1.3.1.12. Tình hình nghiên cứu về nấm Phytophthora trên cây ăn quả có múi ở Việt Nam

Tại Việt Nam 10 loài nấm Phytopthora đã được phát hiện gây hại trên các cây

trồng nông nghiệp, đặc biệt nấm đã được phát hiện là những tác nhân gây hại quan trọng

trên một số cây ăn quả và cây công nghiệp có giá trị cao như cam, quýt, sầu riêng, hồ tiêu,

cao su. (Đặng Vũ Thị Thanh, Ngô Vĩnh Viễn, Drenth, 2004).

Nấm Phytophthora citrophthora được phát hiện trên cây cam ở vùng đồng bằng

sông Cửu Long vào năm 1950. Năm 1970 nấm được phát hiện gây hại trên cây cam ở

miền Bắc và miền Trung. Từ đó bệnh đã nhanh chóng lan rộng ở tất cả các vùng trồng cây

ăn quả có múi.

Nấm Phytophthora citrophthora tấn công vào thân và quả, kết quả dẫn đến triệu

chứng chảy gôm và thối quả. Bệnh phát triển nhanh vào mùa mưa và nghiêm trọng nhất là

vào tháng 7 và tháng 8. Tháng 3 năm 2002 tỷ lệ bệnh trên cây cam ở nông trường Cao

Phong – Ḥòa Bình là 10% nhưng vào tháng 8 đã tăng lên 20 – 30%. Trên quýt bệnh ảnh

hưởng nghiêm trọng, ở một vài vườn tất cả các cây đều bị bệnh và nhiều cây đã bị chết.

Năm 2002 nấm P.nicotiana được phát hiện gây hại trên cây ăn quả có múi ở tỉnh Tiền

Giang, nấm gây các triệu chứng sùi cành và chảy gôm (Đặng Vũ Thị Thanh, Ngô Vĩnh

Viễn, Drenth, 2004).

Năm 2002 trên các vùng trồng cây ăn quả có múi của tỉnh Lạng Sơn đã phát hiện

được nấm P.citricola và loài P. citrophthora gây hại. Triệu chứng bệnh thể hiện rất rõ

trong mùa mưa. Bệnh hại năng ở các vườn cam kinh doanh từ 5 tuổi trở nên, các vườn

trũng và các vườn có mật độ trồng cao, cây kém được vệ sinh chăm sóc.

Kết quả điều tra cơ bản sâu bệnh hại trên cây có múi của Viện Bảo vệ thực vât

trong những năm 2006 - 2010 đã phát hiện được nấm Phytophthora gây hại trên cây có

múi ở các vùng Hà Giang, Tuyên Quang, Phú Thọ, Hòa Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh thuộc 2

loài P. citrophthora và P. nicotiana. Cả 2 loài nấm này đều được phát hiện trên cam, trên

cây bưởi chỉ phát hiện được P. citrophthora, trên quýt và chanh chỉ phát hiện được P.

nicotiana (Đặng Vũ Thị Thanh và cs., 2010).

Nguyễn Thị Thuý Bình và Lê Đình Đôn, (2014) đã xác định được 2 loài nấm

Phytophthora palmivora và Phytophthora parasitica gây bệnh chảy nhựa trên thân cây

bưởi vùng Biên Hoà.

Bảng 1. 3. Các loài Phytophthora gây bệnh thực vật đã được phát hiện ở Việt Nam

TT Tên loài Ký chủ Bệnh Tác giả

1 P. botryosa Cao su Năm Phát hiện 1961 Nguyễn Hải Đường lá.

(1994)

2 Rụng loét sọc Thối quả P. cactorum Mận 1996 Đặng Vũ Thị Thanh

(1999)

3 P. capsici Hồ tiêu Chết nhanh 1998 Nguyễn Vĩnh Trường

4 P. cinnamomi Dứa Thối nõn (2002) 2001 Drenth (2002)

5 P. citrophthora Cam, quýt Thối quả, 1950 Roger (1951)

Whittle A M. (1992)

6 P. colocasiae chảy gôm Khoai mỡ Tàn lụi lá 1951 Roger (1951)

7 P. durian Durian Loét thân 2001 Drenth (2002)

8 P. infestans Tàn lụi lá 1951 Roger (1951)

9 P. nicotianae

Khoai tây, cà chua Dứa Thuốc lá Cam, quýt Thối nõn Đen thân Chảy gôm 2001 1967 2002

10 P. palmivora

Sầu riêng Dừa Ca cao Cao su lá, 2000 2002 2002 1965

Tàn lụi lá Loét thân Thối quả Rụng loét sọc, Drenth (2002) Viện BVTV (1975) Đặng Vũ Thị Thanh & cs. (2010) Drenth (2002) Drenth (2002) Drenth (2002) Nguyễn Hải Đường (1994)

Trên cây sầu riêng, Mai Văn Trị và cs (2001), Huỳnh Văn Thành và cs (2002) đã

sử dụng biện pháp tiêm Phosphonates vào thân cây sầu riêng bị nhiễm Phytophthora cho

thấy cây phục hồi và mức độ nhiễm bệnh giảm dần, sau đó cây lành bệnh và phục hồi và

cho năng suất trở lại.

Bệnh chảy gôm trên cây có múi có thể sử dụng thuốc Ridomil MZ 72WP và Aliette

80WP quét vào gốc, thân cành và tưới vòng quanh tán cây cho hiệu quả cao (Nguyễn Thị

Kim Sơn, 2003). Phun bổ sung phân bón qua lá kết hợp với thuốc Kasuran 47WP 0,2%,

Kocide 51,8DF 0,2% và dầu Caltex DC Tron Plus 0,5% có hiệu quả hạn chế bệnh đốm

dầu trên cây có múi (Nguyễn Thị Bích Ngọc, 2009)

Trong những năm gần đây, tại Việt Nam có một số công trình nghiên cứu thành

công trong sử dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ một số bệnh hại cây trồng

Theo Dương Minh và cộng sự (2003) các chủng nấm Trichoderma spp. được phân

lập từ các vườn trồng cam quýt tại Tiền Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long và Cần Thơ có

khả năng khống chế sự phát triển của nấm Fusarium solani gây bệnh thối rễ cam quýt, với

những mức độ hiệu quả khác nhau. Các chủng Trichoderma spp. có khả năng tiết

chitinase (chitinolytic enzym) cao đều đối kháng tốt với nấm bệnh Fusarium solani gây

bệnh thối rễ trên cam quýt.

Mai Văn Trị và Nguyễn Thúy Bình (2003) nhận xét bón phân hữu cơ sinh học có

làm tăng hoạt động của vi sinh vật đối kháng Actinomyces dẫn đến ngăn chặn sự phát

triển của nấm Phytophthora palmivora, làm giảm tỷ lệ bệnh trên vườn sầu riêng.

Kết quả nghiên cứu của Phạm Ngọc Dung và cộng sự (2007) cho thấy nấm

Trichoderma hazianum có khả năng ức chế cao đối với sự phát triển của sợi nấm

Phytophthora capsici, sợi nấm Phytophthora bị tiêu diệt sau 3 ngày cùng nuôi cấy trong

đĩa Petri. Cũng theo tác giả, một số chủng nấm Trichoderma có khả năng ức chế sự phát

triển của sợi nấm, sự nảy mầm của bào tử Phytophthora đồng thời phân hủy tốt một số

loại tàn dư thực vật, hữu dụng trong quá trình ủ phân hữu cơ, cung cấp phân hữu cơ cho

các vườn hồ tiêu.

Nguyễn Minh Châu (2009), sử dụng nấm Trichoderma trộn với phân hữu cơ bón

vào đất, tưới nước giữ ẩm để phòng trừ một số bệnh thối rễ, vàng lá, nứt gốc… cho vườn

cây ăn quả khá tốt.

Sử dụng chế phẩm Trichoderma - Nimbi bón vào gốc cây bị bệnh, cây bị bệnh

vàng lá gân xanh và vàng lá thối rễ phục hồi hơn 70%. Ngoài ra, Trichoderma - Nimbi

còn ngăn ngừa các bệnh như thối rễ trên cây cam, quýt do nấm Fusarium, nấm

Phytophthora gây ra (làm thối gốc, thân và trái cây), đồng thời còn có khả năng trị được

bệnh mốc hồng do nấm Corticium salmonicolor (Nguyễn Nhật Tâm, 2010).

Chế phẩm sinh học SH-1, Phyto-M và FusaT của Viện Bảo vệ Thực vật đã được

sử dụng để hạn chế sự gây hại của tuyến trùng và một số nấm gây hại vùng rễ cây hồ tiêu,

cà phê, sầu riêng, xoài, cây ăn quả có múi và các loại cây rau mầu (Lê Thu Hiền và cs.

2014; Hà Minh Thanh và cs. 2013).

1.4. Sản xuất cây ăn quả có múi tại Cao Bằng

1.4.1. Điều kiện tự nhiên của Cao Bằng

Vị trí địa lý

Tỉnh Cao Bằng được giới hạn trong tọa độ địa lý từ 22021'21" đến 23007'12" vĩ độ

Bắc và từ 105016'15 kinh độ Đông. Cao Bằng là tỉnh miền núi, biên giới nằm ở vùng

Đông Bắc, phía Bắc và Đông Bắc giáp Quảng Tây (Trung Quốc), đường biên giới dài trên

333 km, phía Tây giáp 2 tỉnh Hà Giang và Tuyên Quang, phía Nam giáp 2 tỉnh Bắc Kạn

và Lạng Sơn. Theo chiều Bắc – Nam 80 km (từ xã Đức Hạnh, huyện Bảo Lâm đến xã

Quang Trọng, huyện Thạch An). Theo chiều Đông – Tây 170 km (từ xã Lý Quốc, huyện

Hạ Lang đến xã Thạch Lâm, huyện Bảo Lâm). Trung tâm tỉnh là Thành phố Cao Bằng

cách thủ đô Hà Nội 286 km theo đường Quốc lộ 3, cách thành phố Lạng Sơn khoảng 130

km theo đường Quốc lộ 4A.

Địa hình

Địa hình của tỉnh khá phức tạp với độ cao trung bình so với mặt biển trên 300m,

thấp dần từ Bắc xuống Nam và từ Tây sang Đông. Địa hình của tỉnh được chia thành 3

vùng rõ rệt: Vùng địa trũng (vùng trung tâm), vùng núi đất và vùng đá vôi. Về địa thế,

tỉnh Cao Bằng có độ dốc cao, đặc biệt là ở những nơi có nhiều núi đá, có tới 75% diện

tích đất đai có độ dốc trên 250.

Nhìn chung, tỉnh Cao Bằng có địa hình khá đa dạng, bị chia cắt bởi hệ thống sông,

suối khá dày, núi đồi trùng điệp, thung lũng sâu,... và sự phức tạp của địa hình tạo ra

nhiều tiểu vùng sinh thái đặc thù, cho phép Cao Bằng phát triển đa dạng cây trồng, vật

nuôi. Tuy nhiên, đặc điểm địa hình như vậy đã ảnh hưởng lớn đến việc giao lưu phát triển

kinh tế - xã hội và đầu tư phát triển hệ thống hạ tầng cơ sở, đặc biệt là giao thông, đồng

thời đã tạo ra sự manh mún đất trong sản xuất nông nghiệp và dễ gây ra hiện tượng rửa

trôi, xói mòn đất trong mùa mưa.

Khí hậu

Cao Bằng mang tính nhiệt đới gió mùa lục địa núi cao và có đặc trưng riêng so với

các tỉnh miền núi khác thuộc vùng Đông Bắc. Có tiểu vùng có khí hậu á nhiệt đới. Cao

Bằng là cửa ngõ đón gió mùa Đông Bắc từ Trung Quốc tràn sang vào mùa Đông và chịu

ảnh hưởng của gió mùa Đông Nam vào mùa Hè.

1.4.2. Sản xuất cây ăn quả có múi tại Cao Bằng

Hiện nay ở Cao Bằng có hơn 11.000 ha đất có khả năng chuyển đổi thành vùng

trồng cây ăn quả nhưng hiện nay diện tích trồng cây ăn quả của tỉnh mới đạt 2.800 ha,

trong đó có trên 500 ha cây dẻ, trên 300 ha cây ăn quả có múi, 332 ha nhãn. Năng suất

các loại cây ăn quả chỉ đạt khoảng 50 tạ/ha. Nhìn chung, diện tích trồng cây ăn quả của

tỉnh Cao Bằng đều nhỏ lẻ, chăm sóc theo phương thức quảng canh, hiệu quả kinh tế thấp.

Cao Bằng có điều kiện khí hậu khắc nghiệt, mùa đông lạnh và chênh lệch nhiệt độ

trung bình ngày và đêm cao, nhưng chính sự khắc nghiệt đó, cùng với sự tiến hoá tự

nhiên đã góp phần làm nên hương vị cho nhiều giống cam quýt của tỉnh như cam Trưng

Vương và Quýt Hà Trì, quýt Trà Lĩnh…., trở thành cây trồng mũi nhọn của nhiều địa

phương trong tỉnh. Trong những năm gần đây, cam quýt tại đây ngày càng có giá trị cao

trên thị trường. Năm 2013 giá từ 30.000đ /kg, đặc biệt vào dịp Tết nguyên đán giá từ

50.000 – 70.000đ/kg, góp phần nâng cao đời sống của nông dân. Đặc biệt là cây làm giầu

cho nhiều hộ gia đình trong vùng, làm thay đổi bộ mặt nông thôn

Với định hướng phát triển một số cây trồng bản địa hiệu quả kinh tế thay thế một

số cây trồng kém hiệu quả, thực hiện chủ trương của tỉnh về phát triển sản phẩm truyền

thống của địa phương cây cam quýt là sự lựa chọn trong cơ cấu cây trồng hiện nay của

tỉnh Cao Bằng.

1.4.2.1. Tại Trà Lĩnh

Quýt Trà Lĩnh

Năm 2018, huyện Trà Lĩnh đã quy hoạch vùng sản xuất quýt theo hướng hình

thành vùng sản xuất chuyên canh, tập trung; nghiên cứu, áp dụng các tiến bộ khoa học -

kỹ thuật từ khâu phục tráng giống đến thu hoạch, bảo quản sản phẩm theo hướng sản xuất

sạch, sản xuất hữu cơ, đáp ứng nhu cầu phát triển sản phẩm bền vững. Đến nay, trên địa

bàn huyện Trà Lĩnh có 164ha cây quýt, trong đó 60ha đã cho thu hoạch, tập trung chủ yếu

ở các xã Quang Hán; Cao Chương; Cô Mười và thị trấn Hùng Quốc, năng suất đạt khoảng

từ 12-15 tấn/ha.

Trong thời gian tới, huyện Trà Lĩnh tiếp tục mở rộng diện tích trồng quýt tại các xã

thêm 20 ha. Đồng thời Liên kết với các công ty, hợp tác xã tiêu thụ sản phẩm quýt, ổn

định, nâng cao đời sống cho người dân, tiến hành quy hoạch thành vùng sản xuất tập

trung và sản xuất hữu cơ. Đây là hướng đi mới góp phần bảo tồn và nâng tầm thương hiệu

quýt Trà Lĩnh.

Quýt Trà Lĩnh: Cây bản địa, có tán hình bán cầu, phân cành khỏe, góc phân cành

hẹp, có gai. Cây ra hoa vào tháng 2, 3, hoa mọc từ nách lá, thu hoạch tháng 11 – 12. Quả

tròn dẹt, màu vàng da cam, khối lượng quả từ 150-180g, mỗi quả có từ 8-10 múi, tỷ lệ vỏ

chiếm từ 20-25% trọng lượng quả. Chất lượng quả tốt, hương vị ngọt sắc, có mùi thơm

cay, quả có tổng số từ 14 -30 hạt, tép màu vàng tươi, chất khô hòa tan từ 10-12%.

1.4.2.2. Tại Hòa An

Cam Trưng Vương

Huyện Hòa An hiện đang tiếp tục phối hợp với các nhà khoa học nghiên cứu, hỗ

trợ địa phương phát triển cam Trưng Vương theo hướng sản xuất hàng hóa với diện tích

khoảng 30 ha, nhằm sớm đưa sản phẩm cam Trưng Vương trở thành cây trồng đặc hữu

mũi nhọn trong cơ cấu ngành nông nghiệp của huyện. Tuy nhiên, để cam Trưng Vương

phát triển theo chuỗi giá trị, thực sự trở thành cây trồng hàng hóa, cần sự quan tâm đầu tư

nghiên cứu, phối hợp từ các nhà khoa học, nhà quản lý, doanh nghiệp, đặc biệt sự đồng

lòng của người dân trên địa bàn.

Cam Trưng Vương: Cây bản địa, có tán hình bán cầu, phân cành khỏe, nhiều gai.

Lá hình ovan, lá kèm nhỏ, mép lá có răng cưa nông, chót lá xẻ thùy. Cây ra hoa vào tháng

2, 3, thu hoạch tháng 11 - 12, quả hình tròn, cao thành, vỏ quả chín màu vàng đậm, nhẵn,

khối lượng quả trung bình đạt 7 quả/kg, hương vị thơm ngon.

Quýt Hà Trì

Hiện nay, trên địa bàn xã Hà Trì có trên 27 ha trồng quýt, phần lớn đều là cây

trồng lâu năm nên chất lượng và giá trị kinh tế đạt thấp.

1.4.2.3. Tại Thạch An

Quýt Trọng Con

Năm 2019, diện tích quýt trồng mới cả xã tăng thêm trên 8 ha. Với diện tích ngày

càng được mở rộng, cây quýt sẽ trở thành cây chủ lực trong công tác xóa đói giảm nghèo

và làm giàu cho nhân dân địa phương.

1.4.2.4. Tại Phục Hòa

Bưởi Phục Hòa

Hiên cây bưởi được trồng chủ yếu ở 4 xã Tà Lùng, Hòa Thuận, Cách Linh, Tiên

Thành huyện Phục Hòa với tổng diện tích khoảng 5,2ha, sản lượng đạt 38,7 tấn. Trong đó,

diện tích bưởi Phục Hòa là 4,5ha, chiếm 86,5% diện tích bưởi toàn huyện. Tuy nhiên, do

người dân tự nhân giống và trồng theo phương thức quảng canh, không được đầu tư,

chăm sóc nên năng suất giảm dần, chất lượng quả kém … Bên cạnh đó, phương pháp và

kỹ thuật trồng, trình độ thâm canh còn ở mức thấp, chưa chú trọng đến khâu nhân giống,

chọn giống bưởi. 2012

Bưởi Phục Hòa: Nguồn gốc từ giống bưởi Sa Điền (Trung Quốc), cây sinh trưởng

khoẻ, phân cành nhiều, cành lá mở rộng, tán có hình bán cầu, lá có hình ovan, xanh đậm,

Lộc non mới ra có mầu hơi phớt tím, cây ra hoa vào khoảng tháng 2 tháng 3 hàng năm,

chót hoa có mầu phớt tím, hoa mọc thành chùm hoặc mọc từ các nách lá. Quả hình trái lê,

thu hoạch vào tháng 11- tháng 12, vỏ quả khi chín có màu xanh vàng hoặc màu da cam,

quả dễ bóc, tép bó chặt, vị ngọt có mùi thơm, không he đắng

1.4.3. Những nghiên cứu trên cây ăn quả ó múi tại Cao Bằng

Năm 2001, Trung tâm Ứng dụng Khoa học và công nghệ tỉnh Cao Bằng đã thực

hiện đề tài xây dựng vườn gen cây ăn quả của tỉnh đã bình tuyển và lựa chọn được nhiều

chủng loại cây ăn quả đặc sản trong đó có các giống cây ăn quả có múi như cam Trưng

Vương, quýt Hà Trì, quýt Trà Lĩnh, … để lưu giữ trong nhà lưới.

Năm 2003, Chi cục bảo vệ thực vật Cao Bằng thực hiện đề tài điều tra đánh giá

sâu bệnh hại trên cam quýt tại Cao Bằng cho thấy, đã ghi nhận được 12 loại bệnh hại,

trong đó có 3 loại bệnh hại do vi rút và vi khuẩn, 8 loại bệnh hại do nấm. Có 4 loại bệnh

gây hại quan trọng làm ảnh hưởng rõ đến năng suất cũng như chất lượng của cam Trưng

Vương và quýt Hà Trì là bệnh Greening, bệnh Tristeza, vàng lá thối rễ, bệnh chảy gôm.

Cây cam quýt tại các vùng của tỉnh đang bị suy thoái nặng, nguy cơ bị bệnh vàng lá ngày

càng cao.

Đào Thanh Vân và cộng sự (2014) khi điều tra tại vùng trồng bưởi Phục Hòa các

tác giả đã nhận thấy, bưởi được trồng chủ yếu ở 4 xã Tà Lùng, Hòa Thuận, Cách Linh,

Tiên Thành. Người dân tự nhân giống và trồng theo phương thức quảng canh, không

được đầu tư, chăm sóc nên năng suất giảm dần, chất lượng quả kém.

Do nhận thức của người nông dân còn bị hạn chế, không bổ sung phân bón hàng

năm, độ mùn của đất giảm, độ phì nhiêu của đất trồng cam quýt đã cạn kiệt. Công tác

phòng trừ sâu bệnh cho cây cam quýt chưa được chú ý, thuốc đặc hiệu còn ít; Cây giống

chất lượng xấu, cây giống sản xuất ra chưa được kiểm tra chất lượng triệt để; Nguồn bệnh

hiện đang tồn tại trên đồng ruộng rất lớn.

1.5. Nhận xét chung và vấn đề quan tâm

Nấm Phytopthora là một trong những loài nấm gây hại quan trọng trên cây ăn quả

có múi. Các loài nấm P. nicotianae, P. citrophthora, P.palmivora được xác định là các tác

nhân chính gây bệnh thối rễ, chảy gôm, thối quả trên cây ăn quả có múi và đã được

nghiên cứu toàn diện về vị trí phân loại, đặc điểm sinh học và các biện pháp phòng trừ tại

các vùng sản xuất cây ăn quả có múi trên thế giới.

Ở Việt Nam nấm Phytophthora gây hại trên cây ăn quả có múi đã được phát hiện

từ những năm 1950 tại đồng bằng sông Cửu Long nhưng cho đến nay những nghiên cứu

về bệnh Phytophthora trên cây ăn quả có múi ở Việt Nam còn rời rạc không liên tục và

thường chỉ hạn chế ở mức điều tra tỷ lệ bệnh. Chưa có nghiên cứu phát triển chiến lược

quản lý bệnh, quản lý vườn ươm, tạo giống kháng bệnh tại các vùng sản xuất cây ăn quả

có múi. Đặc biệt tại Cao Bằng chưa có những nghiên cứu về nguyên nhân gây bệnh và

biện pháp quản lý bệnh thối rễ, chảy gôm thối quả trên các cây cam, quýt, bưởi đặc sản.

Việc nghiên cứu sử dụng các vi sinh vật đối kháng, để sản xuất chế phẩm sinh học

phòng trừ bệnh Phytophthora trên các cây trồng chính ở nước ta đã có những kết quả ban

đầu nhưng chỉ là những thử nghiệm trong phòng thí nghiệm hay trên vườn cây diện tích

nhỏ chưa đáp ứng được với yêu câu của sản xuất.

Điều kiện đất đai, khí hậu của Cao Bằng phù hợp cho cây ăn quả có múi phát triển.

Cây ăn quả có múi đã và đang đem lại hiệu quả kinh tế cao cho người dân tại Cao Bằng.

Mặc dù vậy việc sản xuất cây ăn quả có múi ở Cao Bằng mới đang ở những bước ban đầu

chưa có những nghiên cứu hệ thống để bảo vệ và phát triển sản xuất cây ăn quả có múi.

Hướng nghiên cứu xác định các loài nấm Phytopthora hại cây ăn quả có múi và sử

dụng các chế phẩm sinh học quản lý bệnh tại Cao Bằng là một điều cần thiết để đáp ứng

được nhu cầu phát triển vùng cây ăn quả có múi đặc sản của Cao Bằng.

CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Các loài nấm Phytophthora gây bệnh trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng.

Một số vi sinh vật đối kháng với nấm Phytophthora.

Các giống cây ăn quả có múi tại Cao Bằng (Cam Trưng Vương, Quýt Hà Trì, Quýt

Trà Lĩnh và bưởi Phục Hòa)

2.2. Nội dung nghiên cứu

2.2.1. Điều tra hiện trạng bệnh do nấm Phytophthora spp. gây hại trên cây ăn quả có

múi tại Cao Bằng.

Điều tra hiện trạng sản xuất CĂQCM và bệnh thối rễ, chảy gôm ở Cao Bằng.

Thu thập, phân lập, xác định nấm Phytophthora gây bệnh thối rễ, chảy gôm trên

CĂQCM ở Cao Bằng.

2.2.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học, quy luật phát sinh gây hại của nấm Phytophthora

spp. gây hại trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng.

Xác định các loài nấm Phytopthora gây bệnh thối rễ, chảy gôm trên CĂQCM bằng

đặc điểm hình thái và kỹ thuật phân tử.

Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường, nhiệt độ, pH,... đến sinh trưởng của

nấm các loài nấm Phytophthora gây bệnh trên CĂQCM tại Cao Bằng.

Nghiên cứu quy luật phát sinh, gây hại của nấm Phytophthora trên CĂQCM tại Cao

Bằng

2.2.3. Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật đối kháng nấm Phytophthora spp. gây bệnh thối

rễ, chảy gôm trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng

Thu thập, phân lập, tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng đối kháng cao với các

loài nấm Phytophthora gây hại trên cây có múi.

Định danh các vi sinh vật đối kháng và xác định mức độ an toàn sinh học

Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển và khả năng nuôi nhân

sinh khối và phát triển sản phẩm của các nguồn VSV đối kháng có triển vọng.

Đánh giá hiệu quả phòng trừ của chế phẩm với nấm Phytopthora gây bệnh thối rễ,

chảy gôm trên CĂQCM trong nhà lưới.

2.2.4. Đánh giá khả năng sử dụng vi sinh vật đối kháng phòng trừ bệnh Phytophthora

trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng trong hệ thống quản lý tổng hợp cây trồng

Nghiên cứu khả năng hạn chế bệnh thối rễ, chảy gôm của các biện pháp canh tác

(giống, đốn tỉa, bón phân, tưới nước…) và vi sinh vật đối kháng.

Nghiên cứu khả năng hạn chế bệnh thối rễ chảy gôm của các thuốc trừ nấm sinh

học và vi sinh vật đối kháng.

Nghiên cứu khả năng hạn chế bệnh thối rễ chảy gôm của các thuốc trừ nấm hóa

học và vi sinh vật đối kháng.

Đề xuất quy trình sử dụng vi sinh vật đối kháng trong quản lý tổng hợp bệnh do

nấm Phytophthora spp gây hại trên CĂQCM tại Cao Bằng.

2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.3.1. Địa điểm nghiên cứu

Các vùng trồng cây ăn quả có múi của Cao Bằng

Nhà lưới, Phòng thí nghiệm Bộ môn Bệnh cây và Miễn dịch Thực vật - Viện

Bảo vệ thực vật

2.3.2. Thời gian nghiên cứu

Từ năm 2014 – 2020.

2.4. Vật liệu nghiên cứu

- Các nguồn nấm Phytophthora . phân lập trên cây ăn quả có múi (cam, bưởi, quýt)

tại Cao Bằng.

- Các nguồn vi sinh vật đối kháng (Tichoderma spp., Bacillus app., Streptomyces

spp...)

+ Môi trường: PDA, PSA, PCA, PGA, CMA, CRA, PSM - Phytophthora

Selective, Medium); Môi trường Hugh& Leifson, Môi trường LB – vi khuẩn, môi trường

Gauze – xạ khuẩn.

Hóa chất sử dụng trong phương pháp PCR: Các Cặp mồi ITS4 và ITS5; Cặp mồi

Phy1F và Phy1R

Các chế phẩm sinh học SH-BV1, Phyto-M của Viện Bảo vệ thực vật

Các thuốc trừ nấm hóa học

- Máy PCR, máy điện di, kính hiển vi quang học, kính lúp soi nổi, máy đo pH, tủ

sấy, nồi hấp, các dụng cụ và vật liệu thí nghiệm, cần thiết khác.

2.5. Phương pháp nghiên cứu

2.5.1. Phương pháp điều tra, thu thập mẫu:

Điều tra thu thâp mẫu bênh thối rễ, chảy gôm, thối quả tại vùng sản xuất cây có múi

ở các huyện Hòa An, Trà Lĩnh, Thạch An, Nguyên Bình và Phục Hòa theo theo phương

pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật, 1997, Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia (QCVN 01 - 119:

2012/BNNPTNT).

Chọn tuyến điều tra đại diện cho các tuổi cây trên giống, điều kiện canh tác khác

nhau.

Mẫu đất và mẫu rễ được thu thập tại các cây bị bệnh ở độ sâu 20 cm, gạt bỏ

khoảng 5-7 cm lớp đất mặt để thu mẫu. Mỗi cây thu 4 điểm tại 4 hướng theo hình chiếu

tán của cây, cách mép khoảng 30-50 cm, và được trộn đều.

Thu thập mẫu, thân, quả bị bênh, ghi rõ ngày tháng, tên giống, bảo quản trong túi

polyethylen, lưu giữ trong phòng thí nghiệm.

2.5.2. Phương pháp xác định tác nhân gây bệnh

Xác định tác nhân gây bệnh theo chu trình Koch kết hợp với kỹ thuật sinh học

phân tử để xác định tên nấm

2.5.2.1. Phân lập nấm Phytophthora:

- Phân lập nấm từ mẫu bệnh: Mẫu bệnh được rửa dưới vòi nước chảy, để khô trong

phòng thí nghiệm. Cắt mẫu thành các miếng nhỏ 5 x 5 mm (bao gồm cả mô bệnh và mô

khỏe), Ngâm trong nước javen 2 phút, sau đó rửa bằng cồn 70° trong 1 phút, rửa sạch

bằng nước cất vô trùng, làm khô bằng giấy thấm vô trùng rồi đặt vào môi trường PSM.

Khi tản nấm đã phát triển với kích thước 1 – 2 cm, lấy phần đầu sợi nấm cấy truyền sang

môi trường PDA.

Theo dõi sự phát triển của tản nấm, thời gian hình thành bọc bào tử, mô tả hình

thái bọc bào tử, sợi nấm...

- Phân lập nấm từ mẫu đất: Sử dụng phương pháp mồi bẫy cánh hoa hồng của

Erwin & Ribeiro, 1996.

+ Cho đất vào 1/3 cốc, thêm nước cất vô trùng vào tới khi đạt 3/4 cốc chiều cao.

Khuấy nhẹ đất trong cốc bằng đũa thuỷ tinh, để lắng trong 2 giờ (tốt nhất để qua đêm).

+ Cắt cánh hoa hồng có kích thước 0,5 x 0,5 cm (1 mồi bẫy) và thả nhẹ vào cốc

nước làm mồi bẫy, để cốc qua đêm ở nhiệt độ 20-25°C.

+ Sau 1, 2 và 3 ngày, khi cánh hoa bị mất màu, quan sát bào tử nang của nấm

Phytophthora dưới kính hiển vi

+ Phân lập và làm thuần nấm như phương pháp phân lập từ mẫu mô cây bị bệnh.

2.5.2.2. Phương pháp lây bệnh nhân tạo

* Lây bệnh nhân tạo trên quả:

Quả cam Trưng Vương chín sinh lý được dùng để lây bệnh. Quả được khử trùng

bề mặt bằng NaClO 1%, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng, làm khô bằng giấy thấm

vô trùng.

Dung dịch nấm có mật độ 2 x 105 cfu/ml, nhúng miếng vải màn kích thước 1x1cm

vào dung dịch nấm áp lên bề mặt quả, 1 miếng/quả. Dùng băng dính đính miếng vải trên

bề mặt vỏ. Quả đối chứng sử dụng nước cất vô trùng. Các quả đã lây nhiễm và đối chứng

được đặt trong điều kiện ẩm độ, nhiệt độ 25-280C, trong bóng tối hoàn toàn từ 5 đến 7

ngày. Quan sát hàng ngày và ghi nhận, mô tả sự phát triển của bệnh.

* Lây bệnh trên cây con:

Lây bệnh cho cây con bằng cách lây trên thân cây và tưới vào gốc cây. Cây cam

Trưng Vương 12 tháng tuổi ghép trên gốc chấp được trồng trong chậu chứa hỗn hợp đất

phù sa, mùn và trấu khử trùng đặt ở nhiệt độ 25-280C, nấm được nhân nuôi trên môi

trường PDA. Thân cây được khử trùng bằng cồn 700, lật phần vỏ cây đường kính 5mm,

áp miếng thạch có chứa nấm 5 ngày tuổi áp lại miếng vỏ (Alvarez và cs. 2008). Nhỏ 1

giọt nước cất vô trùng và quấn kín bằng giấy parafilm, bao bằng giấy thiếc để hạn chế sự

thoát hơi nước của miếng thạch. Dung dịch nấm Phytophthora được tưới vào các cây thí

nghiệm, chăm sóc và tưới ẩm hàng ngày bằng máy phun sương. Cây đối chứng sử dụng

miếng thạch (PDA) không có nấm.

Thí nghiệm được thực hiện với 10 mẫu nấm mỗi mẫu lây bệnh cho 10 cây. Quan

sát, ghi nhận và mô tả vết bệnh sau 30 ngày lây nhiễm.

- Phân lập nấm từ các cây lây bệnh

Quả và cây sau khi xuất hiện vết bệnh sẽ được mô tả triệu chứng, tái phân lập nấm

So sánh triệu chứng của cây bị bệnh tự nhiên và cây lây bệnh nhân tạo, hình thái

nấm từ vết bệnh ngoài tự nhiên và mẫu nấm qua lây bệnh nhân tạo.

2.5.2.3. Phương pháp xác định loài nấm Phytophthora

- Xác định loài Phytophthora dựa vào đặc điểm hình thái học

Việc xác định loài Phytophthora dựa vào hình thái của bọc bào tử (sporang), núm

(papilla), các cấu trúc sinh sản hữu tính như bao đực, bao trứng, bào tử trứng (oospore)

theo khóa phân loại của Drenth, Sendall (2001), Erwin và Ribeiro (1996).

- Xác định loài Phyophthora bằng phương pháp PCR

+ PCR và giải trình tự

Mẫu nấm được nhân nuôi trên môi trường PDA (2.3.1.1) trong 5 ngày. DNA được

tách chiết từ các mẫu nấm đã nuôi cấy trên môi trường theo phương pháp CTAB

(Cetyltrimethyl ammonium bromide) của Doyle & Doyle (1987). Lấy 0,1 g đến 0,2 g sinh

khối nấm vào ống eppendorf dung tích 1,5ml có chứa 700 µl dung dịch đệm CTAB 2%

(0,1 M Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA, 2% CTAB, 100µg protease K, bổ sung 0,4% β-

mecaptoethanol trước khi sử dụng). Ủ dịch ở 65°C trong 45 phút, lắc nhẹ bằng cách đảo

ngược sau mỗi 15 phút. Cho 500 µl Clorofom : Isoamyl alcohol (24:1) vào ống và lắc nhẹ

trong 1 phút. Ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 10 phút và lấy 600 µl phần dịch nổi

chuyển sang ống eppendorf mới. Bổ sung 500 µl Clorofom : Isoamyl alcohol (24:1). Lặp

lại bước này 2 lần. Lấy 500 µl phần dịch nổi chuyển sang ống mới có chứa 700 µl

isopropanol lạnh (- 200C); Lắc nhẹ ống bằng cách đảo ngược và ly tâm ở 12000

vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ phần chất lỏng bên trên, rửa kết tủa DNA bằng 700 µl

ethanol 70%. Làm khô cặn DNA trong 30 phút và hòa cặn DNA với 100 µl đệm TE (10

mM Tris-HCl pH 8,0; 1 mM EDTA pH 8,0) và bổ sung 5 µl ribonuclease (RNAse 10

mg/ml) vào mỗi ống; đặt các ống trong tủ định ôn ở nhiệt độ 370C trong 1 h, sau đó lưu

giữ ở nhiệt độ -200C.

Phản ứng PCR. Hai mồi ITS4 và ITS5 (White và cs., 1990) đã được sử dụng để nhân

vùng ITS của các mẫu nấm. Trình tự mồi ITS5 và ITS4 như sau:

ITS4: 5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

ITS5: 5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’

Phản ứng PCR được thực hiện với DreamTaq Polymerase của hãng Fermentas với

nhiệt độ gắn mồi ở 52°C. Phản ứng PCR được thiết lập với tổng thể tích 25 µl với các

thành phần: 2 µl DNA (xấp xỉ 1-100 ng), 2,5 µl 10X Taq Buffer, 2,5 µl dNTP (200 µM),

1 µl cho mỗi primer (10 µM), 2,5 µl Mg2+ (25 mM), 0,1 µl Taq (5 units/µl) và nước cất 2

lần. Phản ứng khuếch đại PCR với chu trình gia nhiệt như sau: phá vỡ cấu trúc DNA ban

đầu ở nhiệt độ 940C trong 4 phút, 35 vòng khuếch đại cấu trúc ở nhiệt độ 940C trong 1

phút, ủ ở nhiệt độ 540C trong 1 phút, 720C trong 1,5 phút, sau 35 vòng, ủ thêm mẫu ở

nhiệt độ 720C trong 10 phút, duy trì nhiệt độ ở 40C. Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel

agarose dùng kít tinh chiết PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) theo

hướng dẫn của nhà sản xuất. Hàm lượng DNA được ước lượng nồng độ bằng điện di

agarose. Sản phẩm PCR được giải trình tự trực tiếp 1 chiều dùng mồi PCR tại Viện Công

nghệ sinh học tại Hà Nội. Trình tự nucleotide được biên tập và lắp ráp dùng phần mềm

Seqman (DNASTAR, LaserGene).

+ Phân tích trình tự: Dựa trên các trình tự thu được, việc tìm kiếm trên cơ sở dữ

liệu Genbank bằng dùng phần mềm trực tuyến BLAST tại NCBI (the National Center for

Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)

Các trình tự được căn trình tư đa chuỗi bằng phần mềm Clustal X ver. 2.0 (Larkin

và cs., 2007). Cây phả hệ được phân tích bằng phần mềm MEGA X (Kumar và cs., 2018).

2.5.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái của nấm Phytophthora

2.5.3.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái của nấm Phytophthora.

- Nấm được nhân nuôi trên môi trường PDA, CRA và V8A trong điều kiện 250C.

Quan sát màu sắc tản nấm, hình dạng, kích thước bào tử túi. Đo kích thước bào tử túi trên

kính hiển vi quang học (OLYMPUS CX41).

2.5.3.2. Nghiên cứu các dặc điểm sinh học, sinh thái của nấm Phytophthora

a. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Phytophthora

Cấy miếng thạch có nấm 5 mm vào chính giữa các hộp petri có chứa các môi

trường PDA, PCA, CMA, CRA, PSA và V8A. Thí nghiệm nhắc lại 3 lần, mỗi lần 3 đĩa

petri, các hộp ptri được để ở nhiệt độ 250C.

Chỉ tiêu theo dõi: đường kính tản nấm sau 2,4 và 6 ngày sau nuôi cấy.

b. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Phytophthora.

Khoanh nấm được nuôi cấy trong đĩa petri có chứa môi trường PDA ở điều kiện tối

hoàn toàn ở các nhiệt độ 5, 10,15, 20, 25, 30, 35 và 400C. Thí nghiệm nhắc lại 3 lần, mỗi

lần 3 đĩa petri.

Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính tản nấm sau 2,4 và 6 ngày sau nuôi cấy

c. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh bọc bào tử của nấm Phytophthora

Nấm được nhân nuôi trên môi trường V8A ở nhiệt độ 250C. Sau 24h rửa tản nấm

bằng nước cất khử trùng 3 lần và được đặt ở nhiệt độ 10,15,20,25,30 và 350C. Sau 48h,

chuyển nấm vào ống nghiệm, cho thêm 10 ml nước cất, lắc đều trong 30 giây và đếm số

lượng bọc bào tử bằng buồng đếm hồng cầu. Mỗi công thức nhắc lại 3 lần mỗi lần 3 đĩa.

d. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Phytophthora

Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường PDA ở 9 mức pH từ 4, đến 8 với

khoảng cách 0,5. Điều chỉnh pH trên môi trường bằng 0,1M NaOH hoặc 0,1M HCl. Sau

khi cấy truyền khoanh nấm, các đĩa petri được đặt trong tủ định ôn ở nhiệt độ 250C trong

điều kiện 12h tối/12h sáng. Thí nghiệm bao gồm 9 công thức (các mức pH), Mỗi công

thức nhắc lại 3 lần mỗi lần 3 đĩa.

Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính tản nấm sau 2,4 và 6 ngày sau nuôi cấy

2.5.4. Nghiên cứu quy luật phát sinh gây bệnh thối rễ chảy gôm do nấm Phytophthora

trên cây ăn quả có múi.

2.5.4.1. Nghiên cứu diễn biến phát sinh phát triển của bệnh thối rễ chảy gôm

Điều tra: Theo phương pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật 1997; Quy chuẩn kỹ thuật

Quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại trên cây ăn quả có múi (QCVN 01 -

119: 2012/BNNPTNT).

Điều tra trên vườn cây 8 tuổi, mỗi huyện điều tra 5 vườn mỗi vườn điều tra 5 điểm

theo đường chéo góc, mỗi điểm cố định 3 cây. Điều tra định kỳ 15 ngày/lần.

Phương pháp phân cấp bệnh trên thân (Theo Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 579: 2003)

Cấp 1: Có 1 vết bệnh trên thân (cành)

Cấp 3: Có 2 vết bệnh trên thân (cành) hoặc có 1 vết bệnh thân (cành) với chiều rộng

của vết bệnh chiếm <20 % chu vi vòng thân (cành)

Cấp 5: Có 3 - 4 vết bệnh trên thân (cành) hoặc 1 vết bệnh trên thân (cành) có chiều

rộng chiếm 20 - <50% chu vi vòng thân (cành)

Cấp 7: Có 4 -5 vết bệnh trên thân (cành) hoặc 1 vết bệnh trên thân (cành) có chiều

rộng chiếm từ 50 - <75% chu vi vòng thân (cành)

Cấp 9: Có trên 5 vết bệnh trên thân (cành) hoặc 1 vết bệnh trên thân (cành) có chiều

rộng chiếm từ 75% chu vi vòng thân (cành) trở lên

Ghi chú: chu vi thân (cành) được đo tại vị trí vết bệnh có chiều rộng lớn nhất

Phương pháp phân cấp bệnh trên lá: (Gade và Kloch 2012, Choudhari và cs. 2018)

Cấp 0: Lá không có màu vàng

Cấp 1. Lá biến vàng và lá rụng (1-10%)

Cấp 3. Lá biến vàng và lá rụng (11-25%)

Cấp 5. Lá biến vàng và lá rụng (26-50%)

Cấp 7. Lá biến vàng và rụng > 50%

Cấp 9. Cành bị khô

- Chỉ tiêu theo dõi: Mức độ phổ biến, Tỷ lệ bệnh % (TLB %), chỉ số bệnh % (CSB %).

Mức độ phổ biến: (+): số cây bị bệnh < 10%; (++): số cây bị bệnh từ >10-25%.

(+++): số cây bị bệnh >25-50% ; (++++): số cây bị bệnh >50%

Số cây bị bệnh Tỉ lệ bệnh (%) = x100

Tổng số cây điều tra

 (ni x vi) Chỉ số bệnh (%) = x 100 (N x k) Trong đó:  (ni x vi) là tổng tích số lá cây bị bệnh với trị số cấp bệnh tương ứng, k là trị

số cấp bệnh cao nhất. N là tổng số lá điều tra.

2.5.4.2. Tình hình bệnh thối rễ chảy gôm trên các giống cây ăn quả có múi

Điều tra trên các vườn trồng các giống cây ăn quả có múi đang được trồng phổ biến

tại Cao Bằng ở giai đoạn cây 8 năm tuổi. Mỗi giống chọn 5 vườn, mỗi vườn điều tra theo

5 điểm chéo góc, mỗi điểm 5 cây.

Phương pháp điều tra theo phương pháp điều tra diễn biến phát sinh phát triển của

bệnh

Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ bệnh (%) và chỉ số bệnh (%).

2.5.4.3. Tình hình bệnh thối rễ chảy gôm trên cây có múi ở các độ tuổi khác nhau

Điều tra trên các vườn cây có độ tuổi từ 2-3 năm, 5-6 năm, 8-10 năm và trên 10

năm. Mỗi tuổi cây chọn 5 vườn, mỗi vườn điều tra theo 5 điểm chéo góc, mỗi điểm 5 cây.

Phương pháp điều tra theo phương pháp điều tra diễn biến phát sinh phát triển của

bệnh

Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ bệnh (%) và chỉ số bệnh (%).

2.5.4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của địa hình đến bệnh thối rễ chảy gôm

Điều tra trên các vườn trồng ở khu vực có kiểu địa hình khác nhau. Mỗi kiểu địa

hình điều tra 3 vườn, mỗi vườn điều tra theo 5 điểm chéo góc, mỗi điểm 5 cây

Phương pháp điều tra: theo phương pháp điều tra diễn biến phát sinh phát triển của

bệnh

Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ bệnh (%) và chỉ số bệnh (%).

2.5.5. Phân lập, tuyển chọn, định danh vi sinh vật đối kháng nấm Phytophthora.

2.5.5.1. Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật đối kháng

Mẫu đất được thu thập tại các vườn cây ăn quả có múi không bị bệnh thối rễ, chảy

gôm hay bị bệnh nhẹ

Gạt bỏ khoảng 5-7 cm lớp đất mặt và đào sâu tới 20cm để thu mẫu. Mỗi cây thu 4

điểm tại 4 hướng theo hình chiếu tán của cây, cách mép khoảng 30-50 cm, và được trộn

đều.

Vi sinh vật đối kháng được phân lập theo phương pháp của Rupela và cs. (2003) và

được thực hiện như sau: Dùng micropipet đã vô trùng hút 0,1 ml dịch nấm Phytophthora

gây bệnh cấy vào đĩa petri chứa 30 ml môi trường PDA (lớp thạch thứ nhất) đã chuẩn bị

sẵn; Lắc nhẹ đĩa petri cho dịch nấm gây bệnh tràn đều trên bề mặt thạch, dùng que gạt vô

trùng gạt đều cho đến khi dịch nấm gây bệnh thấm hoàn toàn trên bề mặt thạch. Chú ý

không để dịch nấm gây bệnh dính vào thành đĩa petri; Sau khi bề mặt thạch khô (khoảng

4 h), phủ tiếp khoảng 15 ml đến 20 ml môi trường thích hợp với vi sinh vật đối kháng

(lớp thạch thứ hai) lên lớp thạch thứ nhất đã cấy nấm gây bệnh. Các đĩa thạch được để

khô trong 45 min; Dùng micropipet đã vô trùng hút 0,1 ml dịch pha loãng mẫu đất, rễ cây

có múi thu thập ở trên, cấy lên bề mặt lớp thạch thứ hai. Lắc nhẹ đĩa petri cho dịch mẫu

tràn đều trên bề mặt thạch, dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dịch mẫu thấm hoàn

toàn trên bề mặt lớp thạch thứ hai. Chú ý không để dịch mẫu dích vào thành đĩa petri. Các

đĩa thạch được nuôi cấy ở nhiệt độ khoảng 28 oC đến 32 oC trong thời gian từ 3 ngày đến

5 ngày.

Theo dõi, xác định vi sinh vật đối kháng trong quá trình nuôi, làm thuần các vi sinh

vật đối kháng và lưu giữ trên thạch nghiêng trong tủ lạnh. Vi sinh vật có hoạt tính đối

kháng là vi sinh vật hình thành khuẩn lạc tạo được vòng đối kháng (vòng trong suốt) bao

quanh khuẩn lạc

2.5.5.2. Đánh giá khả năng đối kháng nấm Phytophthora của các VSV phân lập

Khả năng đối kháng nấm Phytophthora của các vi sinh vật trong phòng thí nghiệm

được thực hiện theo phương pháp của Wen – Chuan Chung và cs. (2011), theo đó miếng

khuẩn lạc (0,5mm) nấm bệnh được cấy truyền tại điểm giữa của hộp petri, vi sinh vật đối

kháng được cấy đối xứng trong hộp petr, đối chứng không cấy vi sinh vật đối kháng và xác

định hoạt tính thông qua kích thước vòng ức chế sau 7-10 ngày theo công thức: H = (Dc –

Dt)/Dc x 100, trong đó: Dc là đường kính tản nấm ở công thức đối chứng, Dt là đường

kính tản nấm ở công thức cấy vi sinh vật đối kháng.

Hiệu quả đối kháng% = {(D - d) x 100}: D

Thang tính hiệu quả ức chế

HQUC ≤ 50% Thấp +

50% < HQUC ≤ 60% Trung bình ++

60% < HQUC ≤ 75% Cao +++

HQUC > 75 Rất cao ++++

2.5.5.3. Định danh các vi sinh vật đối kháng và xác định cấp độ an toàn sinh học

Vi sinh vật đối kháng có hoạt tính cao được định danh bằng phương pháp truyền

thống thông qua đặc điểm tế bào, khuẩn lạc và các phản ứng sinh hóa (Bergey' manual ...)

và phương pháp sinh học phân tử. Phương pháp sinh học phân tử định danh vi sinh vật

đối kháng được thực hiện như sau:

DNA được chiết từ các mẫu vi sinh vật nuôi cấy trên môi trường theo phương pháp

CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) của Doyle & Doyle (1987). DNA được hòa

trong 50 uL đệm TE và bảo quản ở -20⁰C.

Hai Mồi Phy1F và Phy1R (Hà Viết Cường và cộng sự, 2010) được dùng để nhân 1

đoạn ~ 800 bp từ vùng mã hóa 16S RNA ribosome của vi khuẩn

Phản ứng PCR được thực hiện với DreamTaq polymerase của hãng Fermentas với

nhiệt độ gắn mồi ở 500C.

Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose dùng kít tinh chiết PureLinkTM

Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hàm lượng DNA

được ước lượng nồng độ bằng điện di agarose. Sản phẩm PCR được giải trình tự trực tiếp

1 chiều dùng mồi PCR và kít BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied

Biosystems) trên máy PCR. Sản phẩm giải trình tự được tinh chiết, làm khô và gửi đọc tại

Viện Công nghệ sinh học tại Hà Nội. Trình tự nucleotide được biên tập và lắp ráp dùng

phần mềm Seqman (DNASTAR, LaserGene).

Dựa trên các trình tự thu được, việc tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu Genbank bằng

dùng phần mềm trực tuyến BLAST tại NCBI (the National Center for Biotechnology

Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Mức độ an toàn sinh học của các

vi sinh vật tuyển chọn được đánh giá gián tiếp bằng cách so sánh tên vi sinh vật đã định

danh với danh mục các vi sinh vật an toàn cấp độ 1 (không gây hại cho người, động, thực

vật và được sử dụng không hạn chế) của Cộng đồng châu Âu (TRBA 460, 466; 2015,

2016).

2.5.5.4. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của VSV đối kháng

a. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, pH:

Các vi sinh vật đối kháng tuyển chọn được nuôi cấy trong môi trường phù hợp với

từng loài ở các nhiệt độ 250C, 300C, 350C, 400C và 450C; pH ban đầu là 5; 6; 7; 8; 9. Xác

định mật độ vi sinh vật sau 48 giờ nuôi cấy theo TCVN 4884-1:2015: phương pháp định

lượng vi sinh vật - phần 1: đếm khuẩn lạc ở 300C bằng kỹ thuật đổ đĩa.

Vi khuẩn được cấy trên môi trường thạch đĩa petri LB đường kính 9cm (Tryptone

(10,0g) ; Yeast extract (5,0g); Sodium Cloride (10,0g); Nước cất (1000ml) ; Agar (10,0g);

pH (7,5 ± 0,2) theo hai phương pháp chấm điểm và cấy zia. Sau đó để ở các mức nhiệt độ

250C, 300C, 350C, 400C và 450C; pH ban đầu là 5; 6; 7; 8; 9, mỗi mức nhiệt độ và pH 3

đĩa. Đánh giá khả năng sinh trưởng của vi khuẩn sau 2, 3 ngày.

Xạ khuẩn được cấy trên môi trường thạch đĩa petri Gauze đường kính 9cm theo

các phương pháp chấm điểm và cấy zia. Sau đó để ở các mức nhiệt độ 250C, 300C, 350C,

400C và 450C; pH ban đầu là 5; 6; 7; 8; 9 khác nhau, mỗi mức nhiệt độ 3 đĩa. Đánh giá

khả năng sinh trưởng sau 3, 5, 7 ngày. Thành phần môi trường Gauze: Tinh bột tan (20g);

K2HPO4 (0,5g); MgSO4 (0,5g); KNO3 (1,0g); NaCl (0,5g); FeSO4 (0,01g); Nước cất

(1000ml); pH 6,8-7,0.

b. Xác định các phản ứng sinh lý, sinh hóa của VSV đối kháng

* Phương pháp xác định tính yếm khí của các nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn đối kháng

Môi trường sử dụng: Peptone 2g; NaCl 5g; KH2PO4 0.3g; Agar 3g; Bromthymol

blue (1%) 3ml; nước cất 1000 ml; pH = 7,0.

- Phương pháp thực hiện: Đổ 5ml môi trường vào ống nghiệm, hấp khử trùng

1210C trong 20 phút, thêm 0,5 ml Glucose 10% vào mỗi tuýp, cấy mỗi nguồn vi sinh vật

vào 2 tuýp, bổ sung 1 lớp dày khoảng 5mm parafilm lỏng (đã hấp khử trùng) để tạo điều

kiện kị khí sau đó để ở điều kiện nhiệt độ 280C. Nếu có sự chuyển màu từ xanh sang đỏ ở

cả 2 tuýp thì đó là vi khuẩn yếm khí.

* Phương pháp xác định khả năng đồng hóa nguồn các bon từ đường Glucose và

Sacarose của các nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng

Khả năng đồng hóa nguồn Cacbon của vi khuẩn:

+ Môi trường sử dụng : (NH4)2SO4 2g; MgSO4.7H2O 0,2g; NaH2PO4.H2O 0,5g;

CaCl2.2H2O 0,1g; K2HPO4 0,5g; Nước cất 1000 ml.

+ Nguồn các bon: D-glucose, Saccarose, tinh bột, Glycerol và Maltose.

+ Phương pháp thực hiện: Bổ sung nguồn các bon (1%) vào môi trường khoáng cơ

bản, chia vào các ống nghiệm (5ml) và hấp khử trùng ở 121oC, 30 phút. Lấy vi khuẩn

hoạt hóa trên môi trường KB bằng que cấy cho vào từng ống nghiệm riêng biệt, mỗi loài

vi khuẩn cấy 3 ống, 3 ống đối chứng không cấy vi khuẩn. Sau 2-5 ngày nhỏ dung dịch

Bromthymol Blue, nếu môi trường chuyển từ màu xanh sang da cam hoặc vàng nhạt là vi

khuẩn có khả năng đồng hóa nguồn các bon.

Khả năng đồng hóa nguồn Cacbon của xạ khuẩn:

+ Khả năng đồng hóa nguồn Carbon: Xạ khuẩn được nuôi cấy theo phương pháp

chấm điểm và cấy zia trên môi trường ISP-9 có bổ sung 1% các nguồn đường: D-glucose,

sacarose, cellulose, mannitol, maltose, glycerol. Môi trường ISP-9: (NH4)2SO4 (2,64g);

KH2PO4 (2,38g); K2HPO4.3H2O (5,65g); MgSO4.7H2O (1,0g); Dung dịch B (1ml);

Agar (20g); pH (7,0). Dung dịch B: CuSO4.5H2O (0,64g); FeSO4.7H2O (0,11g);

MnCl2.4H2O (0,79g); ZnSO4.7H2O (0,15g); Nước cất (100ml)

* Xác định hoạt độ enzym Amylaza, chitinase, β-glucanase và cellulase của các vi sinh

vật đối kháng

Để tìm hiểu cơ chế đối kháng, các vi sinh vật đối kháng tuyển chọn được đánh giá

xác định hoạt độ enzym Amylaza, chitinase, β-glucanase và cellulase. Phương pháp được

tiến hành theo Nguyễn Đức Lượng, (2004) thông qua đường kính vòng phân giải trên môi

trường cảm ứng tổng hợp của từng loại enzym.

2.5.5.5. Xác định khả năng đối kháng của vi sinh vật đối kháng trong điều kiện đất nhà

lưới.

Đất được khử trùng, trộn đều với 100ml dung dịch của 03 loài nấm Phytophthora

(mật độ 104 bào tử/ml). Sau 10 ngày, mỗi chậu có chứa 2kg đất được xử lý 10ml dung

dịch của các loài VSV đối kháng với mật độ 3,5 x 107 bào tử/ml.

Công thức thí nghiêm 5 công thức

1. B. amyloliquefaciens (BHA12.2),

2. B.methylotrophicus (BNB3.8),

3. S. misionensis (STL2.7)

4. Trichoderma hazianum .

5. Đối chứng xử lý nước cất

Các chậu được đặt trong nhà lưới, tưới ẩm hàng ngày. Thí nghiệm gồm 4 công

thức, 3 lần nhắc lại

Kiểm tra mật độ nấm Phytophthora tồn tại trong đất sau 15 ngày, 1 tháng, 2 tháng

và 3 tháng bằng mồi bẫy cánh hoa hồng.

Cho 10 gam đất vào cốc thêm vào mỗi cốc 90 ml nước cất quấy đều để qua đêm,

thả 25 cánh hoa hồng vào mỗi cốc nước có chứa dung dịch đất thí nghiệm và theo dõi

cánh hoa bị nhiễm nấm (tính biến màu của cánh hoa), tính tỷ lệ % cánh hoa bị biến màu.

Hiệu quả phòng trừ tính theo công thức Abbott

(𝐶−𝑇)×100

𝐶

HQPT (%) =

Trong đó:

+ C: Tỷ lệ bệnh ở công thức đối chứng ( Không xử lý)

+ T: Tỷ lệ bệnh ở công thức thí nghiệm ( xử lý vi sinh vật đối kháng)

2.5.5.6. Khả năng hạn chế nấm Phytophthora của chế phẩm CB-1 trong nhà lưới

Đất được khử trùng, trộn đều với 100ml dung dịch của 03 loài nấm Phytophthora

(mật độ 104 bào tử/ml). Sau 10 ngày, mỗi chậu có chứa 2kg đất được xử lý 2,5; 5,0 và

10g chế phẩm CB-1. Các chậu được đặt trong nhà lưới, tưới ẩm hàng ngày. Thí nghiệm

gồm 4 công thức, 3 lần nhắc lại

Công thức thí nghiệm:

Công thức

P. palmivora Phyto-1 2,5 P. nicotianae Phyto-3 2,5 P. citrophthora M2 2,5 CT1

5,0 5,0 5,0 CT2

10 10 10 CT3

Đ/C Đ/C Đ/C CT4

Kiểm tra mật độ nấm Phytophthora tồn tại trong đất sau 1 tháng, 2 tháng và 3

tháng bằng mồi bẫy cánh hoa hồng.

Hiệu quả phòng trừ tính theo công thức Abbott

2.5.5.7. Khả năng hạn chế nấm Phytophthora của chế phẩm CB-1 và một số chế phẩm

sinh học khác ngoài đồng ruộng.

Thí nghiệm diện hẹp gồm 7 công thức, mỗi công thức 5 cây được thực hiện trên

cây cam 7 – 8 năm tuổi tại xã Trưng Vương, huyện Hòa An với thuốc trừ nấm sinh học

Actinovate 1SP (Streptomyces lydicus WYEC 108), chế phẩm CB-1 và 1 số chế phẩm

khác, 3 lần nhắc lại.

Công thức thí nghiệm:

Công thức Nồng độ Công thức Nồng độ

CT 1: Actinovate 1SP 2,5g/cây CT 4. CB-1 80g/cây

CT 2. SH-BV 1 80g/cây CT 6. Bio-VAAS.1 80g/cây

CT 3. Phyto-M 80g/cây CT 7. Đ/C (không xử lý)

CT 4. Tricô ĐHCT 2,5g/cây

Phương pháp thực hiện: Chế phẩm được xử lý 2 lần, lần 1 sau khi thu hoạch quả

(T12 – T1), lần 2 vào trước mùa mưa (T4). Các chế phẩm được hòa vào nước để tưới vào

gốc với lượng 4L/cây.

Chỉ tiêu theo dõi: TLB (%) và CSB (%) ở 1, 3 tháng sau xử lý lần 2 và hiệu lực của

𝑇𝑎 ×𝐶𝑏

thuốc (%). Tính hiệu quả phòng trừ theo công thức Henderson Tillton

Hiệu lực (%) = (1 −

) × 100

𝑇𝑏 ×𝐶𝑎

Ta: Tỷ lệ bệnh (Chỉ số bệnh) ở công thức xử lý sau phun

Tb: Tỷ lệ bệnh (Chỉ số bệnh) ở công thức xử lý trước phun

Ca: Tỷ lệ bệnh (Chỉ số bệnh) ở công thức đối chứng sau phun

Cb: Tỷ lệ bệnh (Chỉ số bệnh) ở công thức đối chứng trước phun

Phương pháp lấy mẫu đất, rễ: Mẫu được lấy tại rìa tán cây theo 3 điểm của hình

tam giác đều lấy gốc cây làm trung tâm, độ sâu từ 10 – 20cm, mỗi mấu lấy 500g đất, 15g

rễ, trộn đều các điểm thành 01 mẫu. Lấy mẫu vào trước các đợt bón chế phẩm, mỗi công

thức 3 mẫu, ghi rõ thời gian, địa điểm lấy mẫu.

Thử nghiệm hiệu quả của thuốc BVTV đối với bệnh thối rễ, chảy gôm

Thử nghiệm diện hẹp được bố trí trên vườn quýt 10 năm tuổi tại xã Quang Hán,

huyện Trà Lĩnh với 07 công thức, mỗi công thức 10 cây, nhắc lại 3 lần.

Công thức thí nghiệm

CT Tên thuốc Hoạt chất

CT1: Aliette 80WP Fosetyl-aluminium 80% Nồng độ (%) 0,25

CT2: Ridomil gold 68WP Mancozeb 64%+Metalaxyl 4% 0,3

CT3: Vidoc 80WP Copper Oxychloride 80% 1%

CT4: Agri fos – 400 Axit Phosphoric 0,5%

CT5: CB-1 VSV đối kháng 80g/cây

CT6: Bio-VAAS.1 VSV đối kháng 80g/cây

CT7: Đ/C không xử lý

Phương pháp thực hiện: Thuốc được xử lý 2 lần mỗi lần cách nhau 7 ngày. Cây thí

nghiệm đều nhiễm bệnh ở mức độ nhẹ CSB% khoảng 5-7%. Gạt nhẹ lớp đất mặt xung

quanh tán và gốc cây để lộ phần rễ, sau đó xử lý nước thuốc vào phần rễ với liều lượng 10

lít/cây.

Chỉ tiêu theo dõi: TLB (%) và CSB (%) ở 1, 3 tháng sau xử lý lần 2 và hiệu lực của

thuốc (%).Tính hiệu quả phòng trừ theo công thức Henderson Tillton

2.5.5.8. Nghiên cứu sử dụng chế phầm CB-1 trong hệ thống quản lý tổng hợp bệnh thối rễ

chảy gôm

Nghiên cứu phương pháp sử dụng chế phẩm CB-1

Thử nghiệm diện rộng trên vườn quýt Trà Lĩnh 7 năm tuổi với 4 công thức, mỗi

công thức 30 cây, không nhắc lại.

Công thức thí nghiệm:

CT1: Ủ cùng phân hữu cơ CT3: Hòa chế phẩm và tưới

CT2: Bón trực tiếp chế phẩm CT4: Đối chứng

Phương pháp xử lý: Chế phẩm được xử lý 1 lần vào thời điểm sau thu hoạch với

liều lượng 80g/cây.

Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu lực phòng trừ nấm Phytophthora trong đất vườn cây có múi

của chế phẩm CB-1 theo phương pháp bẫy cánh hoa hồng, sau xử lý 1, 3, 6 tháng, tính

hiệu lực phòng trừ theo công thức Henderson Tillton .

Thử nghiệm số lần và thời điểm sử dụng chế phẩm CB-1

Thử nghiệm diện rộng trên vườn quýt Trà Lĩnh 7 năm tuổi với 4 công thức, mỗi

công thức 30 cây, không nhắc lại.

Công thức thí nghiệm:

CT1: Xử lý sau thu hoạch CT3: Sau thu hoạch + trước + cuối mùa mưa

CT2: Sau thu hoạch + trước CT4: Đối chứng

mùa mưa

Phương pháp xử lý: Chế phẩm được xử lý với nồng độ 80g/cây bằng phương pháp

tưới xung quanh tán cây.

Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu lực phòng trừ nấm Phytophthora trong đất vườn cây có múi

của chế phẩm CB-1 theo phương pháp bẫy cánh hoa hồng, sau xử lý 1, 3, 6 tháng, tính

hiệu lực phòng trừ theo công thức Henderson Tillton .

Sử dụng chế phẩm CB-1 và phân bón

Thử nghiệm diện rộng trên vườn quýt Trà Lĩnh 7 năm tuổi với 4 công thức, mỗi

công thức 30 cây, không nhắc lại.

Công thức thí nghiệm:

CT1: 50 kg phân chuồng + nền nông dân (2,0 kg NPK/cây)

CT2: Bón theo năng suất vụ trước (tương đương 30 kg quả/ cây)

(50kg phân chuồng+1,1 kg Urê+1,4 kg lân supe+0,6 kg kaliclorua +2 kg vôi

bột)/cây

CT3: CT 2 + chế phẩm CB-1.

CT4: Đối chứng (nền nông dân: 2,0 kg NP/cây)

Phương pháp xử lý: Chế phẩm được ủ cùng phân chuồng cho hoai mục trước khi

bón cho cây.

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh, chỉ số bệnh ở trước xử lỹ và sau xử lý 3, 6

tháng.Theo dõi năng suất của các công thức.

Sử dụng chế phẩm CB-1 kết hợp với tỉa cành, tạo tán và vệ sinh đồng ruộng

Thử nghiệm diện rộng trên vườn quýt Trà Lĩnh 7 năm tuổi với 4 công thức, mỗi

công thức 30 cây, không nhắc lại.

Công thức thí nghiệm:

CT1 - Chỉ cắt tỉa CT3 – Cắt tỉa + CB-1

CT2 – Cắt tỉa + Vệ sinh vườn CT4 – Cắt tỉa + vệ sinh vườn + CB-1

Phương pháp: Cắt tỉa theo quy trình chăm sóc cây ăn quả có múi của viện Bảo vệ

thực vật. cắt tỉa 04 đợt trong năm gồm sau thu hoạch, vụ xuân, hè và vụ thu. Vệ sinh vườn

gồm làm cỏ, loại bỏ cây tạp, quét vôi toàn bộ gốc và thân cây

Chế phẩm CB-1 được sử dụng với liều lượng 80g/cây/lần sử dụng, chế phẩm được

tưới 3 lần vào các thời điểm sau thu hoạch, trước và cuối mùa mưa, lượng nước tưới

4l/cây.

Chỉ tiêu theo dõi: Đánh giá hiệu lực phòng trừ nấm Phytophthora trong đất vườn

cây có múi theo phương pháp bẫy cánh hoa hồng sau xử lý 1, 3, 6 tháng, tính hiệu lực

phòng trừ theo công thức Henderson Tillton .

2.5.6. Phương pháp xử lý số liệu:

Số liệu được tổng hợp bằng phần mềm Microsoft Excel 2007 và xử lý thống kê

theo chương trình IRRISTAT 5.0.

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Hiện trạng sản xuất cây ăn quả có múi và bệnh thối rễ, chảy gôm trên cây ăn

quả có múi tại Cao Bằng

3.1.1. Hiện trạng sản xuất cây ăn quả có múi tại Cao Bằng

Hòa An, Trà Lĩnh, Nguyên Bình, Thạch An và Phục Hòa là các huyện trồng cây ăn

quả có múi chính của Cao Bằng, diện tích trồng đến năm 2014 là 208 ha với 6 loài cây có

múi đặc sản của Cao Bằng. Trong các loại cây ăn quả có múi này Cam Trưng Vương và

quýt Hà Trì được trồng tại huyện Hòa An, quýt Trà Lĩnh được trồng ở Trà Lĩnh, quýt

Hoa Thám được trồng tại huyện Nguyên Bình, quýt Trọng Con được trồng ở huyện

Thạch An, bưởi Phục Hòa được trồng tại huyện Phục Hòa. Trà Lĩnh là vùng trồng quýt

lớn nhất Cao Bằng. Diện tích quýt Trà Lĩnh năm 2019 đạt 164,5 ha chiếm 62,5% diện tích

cây có múi của tỉnh. Hòa An là vùng phù hợp cho cả cam và quýt phát triển. Tới năm

2019 diện tích trồng cây cây ăn quả có múi của tỉnh Cao Bằng đã đạt 263, (bảng 3.1).

Bảng 3. 1. Diện tích trồng cây ăn quả có múi tại Cao Bằng (Năm 2019)

Năm theo dõi (ha) TT Loại cây Địa điểm 2012 2013 2014 2019

C. Trưng Vương Hòa An 1 10,3 12,4 17,5 30,5

Q. Hà Trì Hòa An 2 9,5 11,7 16,6 27,3

3 93,5 Q. Trà Lĩnh Trà Lĩnh 112,3 144,5 164,5

Q. Hoa Thám Nguyên Bình 4 4,0 4,5 5,7 7,2

Q. Trọng Con Thạch An 5 11,7 12,5 14,2 22,4

B. Phục Hòa Phục Hòa 6 6,5 8,4 10,3 11,2

Tổng 135,5 161,8 208,8 263,1

Việc sử dụng cây giống để trồng mới ở các vùng trồng cây có múi tại Cao Bằng

khác nhau tùy thuộc vào tập quán của người dân. Khi trồng mới người dân tại Cao Bằng

đều trồng từ hạt, cành chiết hay bằng cây giống ghép trên gốc ghép bưởi. Trong những

năm gần đây cây giống ghép trên gốc ghép chấp đã dần được sử dụng để trồng (bảng 3.2):

Tại Hòa An theo tập quán người dân chủ yếu trồng mới bằng hạt (50%), tiếp đến là

trồng bằng cành chiết (23,3%), có 10% số hộ trồng cây ghép trên gốc bưởi và 16,7 % số

hộ trồng bằng cây giống ghép trên gốc ghép chấp. Cây giống ghép trên gốc ghép chấp là

cây giống được dự án phát triển cây ăn quả có múi kết hợp giữa tỉnh Cao Bằng và viện

BVTV cấp cho các hộ dân tham gia mô hình trồng mới của dự án.

Tại Trà Lĩnh: Trước đây người dân dều trồng bằng hạt và cành chiết, những năm

gần đây, nhiều hộ gia đình đã tự nhân giống bằng phương pháp ghép trên gốc bưởi tỷ lệ

vườn quýt trồng bằng cây giống ghép trên gốc bưởi khá cao đạt 53,3%.

Tại Phục Hòa tỷ lệ các hộ trồng bằng cành chiết cao hơn (66,7%) so với các hộ

trồng bằng cây ghép trên gốc bưởi (33,3%).

Tại Nguyên Bình và Thạch An người dân chủ yếu trồng bằng hạt, một số ít trồng

bằng cành chiết, các hộ trồng bằng cây giống ghép trên gốc ghép chấp đều là các hộ tham

gia dự án phát triển cây ăn quả có múi kết hợp giữa tỉnh Cao Bằng và viện BVTV.

Bảng 3. 2. Tình hình sử dụng cây giống để trồng mới (Năm 2015)

TT Địa điểm Giống ghép (%) Gốc Bưởi Gốc chấp

Số vườn điều tra 30 Giống bằng hạt (%) 50,0 Giống chiết cành (%) 23,3 10,0 16,7 1 Hòa An

30 13,3 20,0 53,3 13,4 2 Trà Lĩnh

15 0,0 66,7 33,3 0,0 3 Phục Hòa

15 60,0 13,3 0,0 26,7 4 Nguyên Bình

15 53,3 26,7 0,0 20,0 5 Thạch An

Các vườn cây ăn quả có múi tại Cao Bằng chủ yếu nằm trong độ tuổi từ 5 – 15 năm

tuổi, trong đó vườn cây dưới 5 năm tuổi chiếm 6,7 - 33,3%, cây từ 5 đến 10 năm tuổi là

nhiều nhất đạt 33,3 – 66,6% và chiếm ưu thế tại các vùng Hòa An, Phục Hòa Nguyên

Bình và Thạch An. Có 40% số vườn cây từ 10 đến 15 năm tuổi tại vùng Quýt Trà Lĩnh.

Vườn cây trên 15 năm tuổi chỉ đạt cao nhất 13,3% tại vùng trồng bưởi Phục Hòa. Các

vùng Hòa An, Trà Lĩnh vườn cây ăn quả có múi trên 15 năm tuổi không còn hay còn rất ít,

nguyên nhân là do sâu, bệnh gây hại nặng và người dân thường phải chặt đi trồng lại

nhiều lần (bảng 3.3).

Bảng 3. 3. Hiện trạng tuổi cây tại các vùng trồng cây ăn quả có múi tại Cao Bằng

(Năm 2015)

Tuổi cây (%) Số vườn TT Địa điểm điều tra Dưới 5 tuổi 5 - 10 năm 10-15 năm Trên 15 năm

1 Hòa An 30 33,3 46,7 20,0 0,0

2 Trà Lĩnh 30 16,7 33,3 40,0 10,0

3 Phục Hòa 15 13,3 40,0 33,3 13,3

4 Nguyên Bình 15 6,7 66,6 20,0 6,7

5 Thạch An 15 20,0 60,0 13,3 6,7

Tình hình áp dụng các biện pháp kỹ thuật chăm sóc cây có múi:

Về sử dụng phân bón: Các hộ sử dụng phân bón cho cây ăn quả có múi tại Trà

Lĩnh là 100%, tại Hòa An là 86,7% và 13,3 – 26,7% tại các huyện Phục Hòa, Thạch An

và Nguyên Bình. Đa số các hộ sử dụng phân hữu cơ từ nguồn sẵn có của gia đình với số

lượng ít, bón không đúng cách, mức bón trung bình khoảng 1-1,2 kg phân

chuồng/cây/năm, bón 1 lần vào thời điểm sau thu hoạch. Phân hóa học được bổ sung rất ít

hoặc không có. Việc bổ sung dinh dưỡng không đầy đủ dẫn đến nhiều vườn cây sinh

trưởng kém, dễ nhiễm sâu bệnh hại và tỷ lệ chết cây cao (bảng 3.4).

Về tỉa cánh tạo tán: Số hộ áp dụng kĩ thuật cắt tỉa cao nhất tại Trà Lĩnh đạt 53,3%,

tại các huyện Hòa An, Nguyên Bình, Thạch An là 26,7 – 33,3%, và tại Phục Hòa 100%

các hộ không cắt tỉa cho cây. Hầu hết các vườn cây được điều tra đều có bộ tán không cân

đối, cành tăm, cành sâu bệnh, cành vượt nhiều, cây xum xuê tạo điều kiện thuận lợi làm

cho sâu bệnh phát triển đặc biệt trong thời kỳ ra hoa, đậu quả (bảng 3.4)..

Về tưới nước: Kết quả điều tra cho thấy 66,7% các hộ trồng quýt tại Trà Lĩnh có

tưới nước bổ xung cho cây vào giai đoạn mùa khô. Các vùng trồng cây có múi khác do

điều kiện khó khăn về nước tưới cũng như người dân không quan tâm tới tưới nước cho

cây vào thời gian khô hạn, và những giai đoạn cây cần nước. Đây cũng là một trong

những nguyên nhân làm giảm năng suất và chất lượng vườn cây (bảng 3.4).

Về phòng trừ sâu bệnh: Tỷ lệ các hộ có sử dụng thuốc BVTV để phòng trừ sâu,

bệnh cao nhất tại Trà Lĩnh là 100%, tiếp đến là Hòa An 66,7%, các huyện Nguyên Bình

và Thạch An có tỷ lệ thấp khoảng 6,7 – 20,0%, tại Phục Hòa 100% số hộ không sử dụng

thuốc bvtv để phòng trừ sâu bệnh. Đa số các hộ sử dụng thuốc bảo vệ thực vật 3 đến 4

lần/năm để hạn chế sâu hại và bệnh vàng lá. Do không sử dụng đúng thuốc, đúng phương

pháp nên việc phòng trừ sâu bệnh ít hoặc không hiệu quả, nhiều vườn cây bị sâu bệnh hại

nặng (bảng 3.4).

Bảng 3. 4. Tình hình áp dụng các biện pháp kỹ thuật chăm sóc

(Năm 2015)

Số hộ phòng Số hộ bón Số hộ cắt Số hộ tưới Số hộ làm TT Địa điểm trừ sâu bệnh phân (%) tỉa (%) nước (%) cỏ (%) (%)

1 Hòa An 86,7 33,3 0,0 100 66,7

2 Trà Lĩnh 100 53,3 66,7 100 100

3 Phục Hòa 26,7 0,0 0,0 0,0 0,0

4 Nguyên Bình 13,3 33,3 0,0 20,0 6,7

5 Thạch An 33,3 26,7 0,0 26,7 20,0

Quýt Trà Lĩnh, cam Trưng Vương, Quýt Hà Trì, bưởi Phục Hòa là cây ăn quả có

múi được trồng tại Cao Bằng. Người dân trồng cây có múi chủ yếu bằng hạt và cành

chiết, Tại các vùng trồng người dân đã bắt đầu chú ý đến việc sử dụng phân bón cho cây

nhưng chỉ sử dụng phân hữu cơ sẵn có với số lượng ít. Hầu hết tại các vùng người dân

trồng cây có múi dựa vào “nước trời” chỉ có vùng Trà Lĩnh một số hộ dân đã tưới nước

đảm bảo cho nhu cầu sinh trưởng của cây khi trời khô hạn. Kỹ thuật cắt tỉa, và phòng trừ

sâu bệnh còn thiếu và chưa đúng thời điểm. Vườn cây có múi nhanh chóng bị suy thoái,

sâu bệnh gây hại nặng dẫn đến tuổi thọ của cây bị giảm.

3.1.2. Thành phần bệnh hại trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng

Từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 12 năm 2015 đã phát hiện được trên cây ăn quả

có múi tại Cao Bằng có 13 loại sinh vật gây hại, trong đó có 1 loài virus, 2 loài vi khuẩn,

9 loài nấm và 1 loài tảo (Bảng 3.5).

Bảng 3. 5. Thành phần bệnh hại trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng

(Năm 2014 – 2019)

STT Tên khoa học Tên Việt Nam Bộ phận bị hại Cây ký chủ

1 Tristeza Citrus tristeza virus Thời gian gây hại Toàn cây Cả năm Mức độ phổ biến + Cam, quýt

2 Toàn cây Cả năm +

Vàng lá greening Cam, quýt, bưởi

3 Bệnh loét 5 – 9 + Cam, bưởi

4 Candidatus Liberibacter asiaticus Xanthomonas campestris Dowson Phytophthora spp. 1-12 +++

Cành, lá, quả Rễ, thân, lá ,quả Cam quýt bưởi

Thối rễ, chảy gôm, thối quả 5 Muội đen 8 – 12 +

Meliola citricola Sydow

6 Đốm dầu Mycosphaerella citri 1 – 12 ++ Cành, lá, quả, Lá, quả Cam quýt bưởi Cam, quýt

7 Mốc xanh Quả 11,12,1 ++

8 2 – 5 + Cam, quýt, bưởi Quýt

quả Phấn trắng Whiteside Penicilium italicum Wehmer Oidium tingitanium Carter

9 Thán thư Cành, lá non, quả non Cành, quả 4 – 7 +++

Cam quýt bưởi

10 Thối quả Quả 11,12,1 +

Cam, quýt, bưởi

Collectotrichum gloeosporioides Penz. Geotrichum candidum Link. Fusarium sp.; 11 Rễ 5-10 +++

12 Corticium sp. Cành 5 - 9 +

Thối rễ, vàng lá Nấm hồng

13 Đốm tảo 7 - 10 +

Ghi chú: +: Số cây (số lá) bị bệnh : < 10% ++: Số cây (số lá) bị bệnh : 11% - 25% +++: Số cây (số lá) bị bệnh : 25 -50% ++++: Số cây (số lá) bị bệnh : >50%

Cephaleuros virescens Kunz. Thân, cành Cam quýt bưởi Cam quýt bưởi Cam quýt bưởi

Kết quả cho thấy, trong 13 loại bệnh, bệnh thối rễ, chảy gôm, thối quả

Phytophthora và bệnh thán thư Collectotrichum gloeosporioides là những bệnh gây hại

quan trọng, 25- 50% cây ở các vườn điều tra đã bị nhiễm các bệnh này. Bệnh thán thư làm

cây bị chết cành và rụng quả. Bệnh do nấm Phytophthora làm cây còi cọc, tán lá biến

vàng, một số cây bị nứt vỏ chảy gôm trên thân cành, quả bị thối rụng. Bệnh mốc xanh

quả, đốm dầu gây bệnh ở mức độ thấp. Bệnh thối quả do nấm Geotrichum candidum, các

bệnh nấm hồng, phấn trắng, muội đen tỉ lệ bệnh dưới 10%. Bệnh vàng lá Greening và

Tristeza xuất hiện ở mức độ thấp.

Kết quả điều tra cho thấy bệnh thối gốc chảy gôm Phytophthora là một trong

những bệnh đã gây thiệt hại lớn về năng suất và chất lượng sản phẩm của vùng sản xuất

cây có múi tại Cao Bằng.

Thành phần bệnh hại cây ăn quả có múi phát hiện ở Cao Bằng cũng phù hợp với

các kết quả điều tra cơ bản bệnh hại cây ăn quả có múi của Viện Bảo vệ thực vật trong

các năm 1967-1968, 1997-1998 và 2006- 2010.

Từ kết quả điều tra, đề tài đã tiếp tục các nghiên cứu, xác định triệu chứng, tác

nhân gây bệnh, quy luật phát sinh gây hại của bệnh thối rễ, chảy gôm trên cây có múi và

các giải pháp quản lý bệnh, tại Cao Bằng.

3.1.3. Triệu chứng bệnh thối rễ chảy gôm trên cây ăn quả có múi ở Cao Bằng

Bệnh gây hại tại tất cả các giai đoạn sinh trưởng của cây, từ trong vườn ươm và

vườn sản xuất. Bệnh hại trên rễ, thân, cành, lá và quả. Khi bị nấm xâm nhập, gây hại cây

cam, quýt, bưởi bị nhiễm bệnh có biểu hiện còi cọc, sinh trưởng phát triển kém và không

đồng đều, vỏ thân, cành bị nứt, chảy gôm từng phần, tán lá nhạt màu hay chuyển vàng, lá

rụng, cành khô chết. Quả bị nhiễm bệnh có vết bệnh màu nâu, vỏ cứng ở giai đoạn ban

đầu sau đó vết bệnh bị thối nứt, trời ẩm ướt trên bề mặt vết bệnh có lớp nấm trắng (hình

3.1, 3.2, 3.3).

- Trên cây con: Triệu chứng điển hình là các vết bệnh màu nâu tại phần gốc thân

sát mặt đất, cây bị lung lay, ngã đổ, cây chết khi bị bệnh nặng.

- Trên rễ: Khi bị bệnh, rễ tơ ít, rễ ngắn, bị mất mầu, phần vỏ trở nên xốp, vỏ rễ bị

thối và dễ tuột, chỉ còn lại lõi gỗ trắng ở phần trung tâm, cây không hút được nước và

dinh dưỡng, sinh trưởng phát triển kém, khi rễ bị bệnh tán lá chuyển màu vàng lá bị rụng,

cây cằn cỗi và có thể bị chết.

- Trên thân: Bệnh thường xuất hiện trên thân phần sát gốc, cổ rễ và tại các điểm

ghép. Giai đoạn đầu vỏ cây có dạng ngậm nước, vết bệnh không có hình dạng nhất định,

vùng bị bệnh xuất hiện những vết nứt và chảy gôm. Bên trong lớp vỏ bị bệnh, phần gỗ bị

hại có màu xám, thối nâu dạng sũng nước và nhìn thấy những mạch sợi đen hoặc nâu dọc

theo thớ gỗ. Triệu chứng bệnh lan nhanh ở vị trí thường có nước mưa đọng kéo dài, mặt

vỏ ẩm ướt và ở phần gốc cây nơi gần mặt đất có độ ẩm cao. Cây bị bệnh sinh trưởng và

phát triển kém, cằn cỗi và có thể bị chết khi bị bệnh nặng.

- Trên cành, lá: Trên cành, vết bệnh màu nâu, vỏ cành bị nứt và chảy gôm, lá bị

vàng, nhất là gân lá, sau đó lá bị rụng. Nấm có thể tấn công trên lá non và chồi non, vết

bệnh không có hình dạng nhất định, lá dễ bị thối và rụng trong điều kiện ẩm ướt.

- Trên quả: Vết bệnh ban đầu màu nâu nhạt, vỏ bị bì hóa, và sau đó bị thối và bị

rụng. Có thể quan sát thấy sợi nấm màu trắng trên vết bệnh khi điều kiện ẩm độ cao.

Các triệu chứng trên thường xuất hiện khi bệnh phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ từ 20-300C, ẩm độ không khí cao, đất trồng ẩm ướt, vườn thoát nước kém, trồng

dày và không được tỉa cành tạo tán thường xuyên.

A – Cây cam bị thối rễ chảy gôm; B – Triệu chứng chảy gôm trên gốc; C – Triệu chứng vàng lá, thối rễ do nấm Phytophthora; D – Triệu chứng chảy gôm trên thân, cành; E – Triệu chứng thối quả do nấm Phytophthora.

Hình 3. 1. Triệu chứng bệnh thối rễ chảy gôm trên cam Trưng Vương

Hình 3. 2. Triệu chứng bệnh thối rễ chảy gôm trên quýt Trà Lĩnh

A – Cây quýt bị vàng lá thối rễ do nấm Phytophthora; B – Cây quýt bị chết héo do nấm Phytophthora; C – Triệu chứng thối gốc do nấm Phytophthora; D – Triệu chứng thối rễ do nấm Phytophthora; E – Triệu chứng thối quả do nấm Phytophthora.

Hình 3. 3. Triệu chứng bệnh thối rễ chảy gôm trên bưởi Phục Hòa

A – Cây bưởi bị vàng lá thối rễ do nấm Phytophthora; B – Triệu chứng chảy gôm do nấm Phytophthora gây ra trên gốc bưởi

3.1.4. Xác định nguyên nhân gây bệnh thối rễ chảy gôm

Trên cây ăn quả có múi các triệu chứng cây còi cọc, chảy gôm, tán lá bị vàng, quả

bị thối hỏng… bên cạnh nấm Phytophthora còn có thể do một số loài nấm như Fusarium,

Pythium, Rhizoctonia… gây ra

Để xác định chính xác được nguyên nhân gây bệnh thối rễ, vàng lá tại Cao Bằng

việc thu thập 375 mẫu đất, mẫu rễ và mẫu mô cây, quả từ các cây có các biểu hiện triệu

chứng của bệnh vàng lá, thối rễ, thối gốc, chảy gôm, thối quả tại các vùng trồng các loại

cây ăn quả có múi Hòa An, Trà Lĩnh, Phục Hòa, Thạch An và Bình Nguyên đã được thực

hiện.

Việc xác định nấm gây các ra các triệu chứng bệnh trên đã được thực hiện theo

chu trình Koch, xác định tên nấm theo hình thái và kết hợp với phương pháp công nghệ

sinh học thông qua phản ứng PCR và giải trình tự gen tại Viện Bảo vệ thực vật.

3.1.4.1. Phân lập tác nhân gây bệnh trên cây có múi do nấm Phytophthora gây nên

Các mẫu mô và rễ cây bị bệnh được phân lập trên môi trường PSM và được làm

thuần nuôi cấy trên môi trường PDA. Phương pháp bẫy cánh hoa hồng (Erwin & Ribero,

1996) được áp dụng cho các mẫu đất. Từ 375 mẫu đất và các mẫu cây bị bệnh đã được

phân lập 142 mẫu nấm Phytophthora, kết quả trình bày tại bảng 3.6.

Bảng 3. 6. Kết quả phân lập nấm Phytophthora trên vườn cây ăn quả có múi tại Cao

Bằng (Năm 2014 – 2015)

Tỉ lệ (%) Tỉ lệ (%) Tỉ lệ (%) Cây trồng Số mẫu thu thập Số mẫu thu thập Số mẫu thu thập Địa điểm thu mẫu

Quýt Trà 25 72 25 40 25 Mẫu đất Số mẫu phân lập được nấm 18 Mô cây Số mẫu phân lập được nấm 10 Mô rễ Số mẫu phân lập được nấm 7 28 Tổng số mẫu phân lập được nấm 35

15 60 25 32 25 8 6 24 29 Lĩnh Hòa An 25

25 12 48 25 28 25 7 5 20 24 Cam, quýt Quýt Thạch

8 4 16 25 Quýt Nguyên 25 13 52 25 32 25

9 4 16 29 25 16 64 25 36 25

Bình Bưởi Phục Hòa

125 74 59,2 125 42 33,6 125 26 20,8 142 Tổng số

Kết quả bảng 3.6 cho thấy, nấm Phytophthora đã có mặt ở tất cả các vùng trồng và

gây hại trên tất cả các loài cây có múi của Cao Bằng. Có 59,2 % mẫu đất thu từ các vườn

cây bị bệnh phân lập được nấm Phytophthora từ thân, lá, quả bị bệnh là 33,6% và từ rễ bị

bệnh là 20,8%. Số mẫu nấm Phytophthora phân lập được từ các mẫu thu thập tại Trà Lĩnh

là 35 mẫu, tại Hòa An và Phục Hòa mỗi vùng là 29 mẫu, tại Nguyên Bình là 25 mẫu và

cuối cùng ở Thạch An là 24 mẫu.

Kết quả phân lập cũng chỉ ra rằng đất ở các vườn cây ăn quả có múi ở Trà Lĩnh đã

bị nhiễm nấm nặng hơn các vùng khác, có tới 72% mẫu đất ở đây phân lập được nấm

(bảng 3.6). Kết quả này cho thấy sự tích lũy của nguồn bệnh trên các vườn cây ăn quả có

múi tỷ lệ thuận với số cây và thời gian cây bị nhiễm bệnh trên vườn. Kết quả điều tra năm

2016 cho thấy vùng Trà Lĩnh là vùng bị bệnh thối rễ, chảy gôm nặng nhất của Cao Bằng.

Hình 3. 4. Phân lập nấm Phytophthora bằng Hình 3. 5. Nấm Phytophthora spp. trên môi

bẫy cánh hoa hồng trường PSM

3.1.4.2. Xác định loài Phytophthora dựa vào đặc điểm hình thái học

Hình thái của sợi nấm, của cành bọc bào tử, bọc bào tử, cách hình thành cành bọc

bào tử, hình thái của hậu bào tử và phương thức sinh sản hữu tính, cách mọc của tản nấm

trên các loại môi trường, kiểu dinh dưỡng, phổ ký chủ… là đặc điểm để định danh nấm

Phytophthora

Một số đặc điểm hình thái tế bào, khuẩn lạc của 3 loài Phytophthora gây bệnh thối

rễ chảy gôm cây có múi đã được mô tả bởi Erwin & Ribeico (1996) và được tổng hợp

trong bảng 3.7.

Bảng 3. 7. Một số đặc điểm hình thái và sinh học 3 loài Phytophthora gây bệnh thối rễ chảy gôm

Đặc điểm

P. nicotianae

P. palmivora

P. citrophthora

Hình dạng

Cầu, gần hình cầu (nhiều)

Sợi nấm phồng

Cách hình thành

Cầu, gần hình cầu, kéo dài, không đều

Cành bọc bào tử (Sporangiophore)

Dạng sim đơn, dài

Dạng sim đơn, dày

Cách hình thành trên cành bọc bào tử

Dạng san hô, cụm, tụ tập Dạng sim đơn, thưa, không phân nhánh Nội sinh từ bọc bào tử cũ, thành chuỗi;

Hình dạng

Trứng, elip, quả lê ngược

Cầu, trứng, elip, quả lê ngược, không đều

bào

tử

Bọc (Sporangium)

Kích thước (dài x rộng; µM) Núm bọc bào tử Bọc bào tử rụng khỏi cành bọc bào tử

Cầu, gần hình cầu, thường có sợi thứ cấp mọc ra Giữa sợi Không phân nhánh hoặc dạng sim, thưa Đơn độc hoặc dạng sim đơn, thưa Cầu, trứng, trứng ngược, quả lê ngược, không đều; một số có phần đỉnh kéo dài, phần gốc thót nhọn 15-46 x 11-38 Có, đôi khi có 2 núm Không rụng hoặc có rụng với cuống ngắn (<5 µM)

42-77 x 24-40 Có Có rụng với cuống ngắn (<5 µM)

24-40 x 9-16 Có Có rụng với cuống ngắn (<5 µM)

Hình dạng

Cầu, gần hình cầu

Cầu

bào

tử

Hậu (Chlamydospore)

Sinh sản hữu tính

Kích thước (µM) Vị trí hình thành Phương thức Cách bao đực (antheridium) giao phối bao trứng (oogonium)

Bào tử trứng (oospore)

15-43 Bên sợi, đỉnh sợi, giữa sợi Dị tản Bao đực bao quanh cuống bao trứng (amphigynous) Phần lớn choán không đầy bao trứng (aplerotic)

16-50 x 16-45 Đỉnh sợi, giữa sợi Dị tản Bao đực bao quanh cuống bao trứng (amphigynous) Choán đầy (plerotic) hoặc gần đầy bao trứng

16-43 Đỉnh sợi, giữa sợi Dị tản Bao đực bao quanh cuống bao trứng (amphigynous) Choán đầy (plerotic) bao trứng

Rộng (255 loài/90 họ)

Rộng (>1000 loài)

Rộng (~5000 loài)

Phổ ký chủ

Bán sinh dưỡng

Kiểu dinh dưỡng

Nhiệt độ sinh trưởng invitro (Tối thiểu (tối ưu) tối đa) (OC)

5-(27-32)-37

11-(27.5-30)-35

5-(24-28)-34

Nguồn trích dẫn Erwin và Ribeiro (1996)

Khi phát triển trên môi trường PDA, tản nấm màu trắng, có dạng bông xốp hoặc

mịn hay có dạng hình cánh hoa, hệ sợi nấm không vách ngăn, phân nhánh, sợi nấm xoăn

có dạng cành cây nổi lên từng cụm, hình thành nhiều u nhỏ. Bọc bào tử có hình cầu, hình

elip, hình trứng có khi dạng hình thang lệch. Bọc bào tử có từ một đến 2 núm rõ ràng, đính

trên đỉnh cành bọc bào tử. Bọc bào tử trưởng thành phóng bào tử động (zoospore) thông

qua lỗ hở, bào tử động có 2 lông roi ở 2 đầu, kích thước nhỏ 7-10 µm. Bào tử vách dày

(chlamydospora) hình cầu có kích thước từ 28-35µm. Các mẫu phân lập được trên cam,

quýt, bưởi cũng như tại các vùng khác nhau có đặc điểm hình thái khác nhau.

Đặc điểm phát triển của tản nấm, hình thái cành bọc bào tử, bọc bào tử và hậu bào

tử của nấm, đã được sử dụng để xác định các loài nấm Phytophthora gây hại trên cây ăn

quả có múi tại Cao Bằng.

Hình 3. 6. Các loài nấm Phytophthora hại trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng

A – Sợi nấm P.palmivora; B – Sợi nấm P. citrophthora; C – Sợi nấm P. nicotianae; D – Bọc bào tử nấm P.palmivora; E – Bọc Bào tử nấm P. citrophthora; D – Bọc Bào tử nấm P. nicotianae.

Sự phát triển của 142 nguồn nấm Phytophthora trên môi trường PDA được chia

thành 3 nhóm khác nhau. Nhóm (1) Tản nấm phát triển dạng bông, tản nấm có màu trắng

hơi trong trên môi trường V8, trên môi trường PDA, màu trắng đục. Nhóm (2) tản nấm

phát triển dạng bông mịn, màu trắng hơi trong trên môi trường V8 và trên môi trường PDA

hơi có dạng cánh hoa, màu trắng hơi đục. Nhóm (3) tản nấm có màu trắng hơi phớt hồng

trên môi trường V8, trên môi trường PDA tản nấm phát triển hình cánh hoa đặc trưng, màu

trắng. Nấm ở nhóm 2 có nhiều nhất 49,29% mẫu nấm và phân bố khá đều ở các vùng

điều tra, nấm ở nhóm 1 có it nhất chỉ 20,24% mẫu chủ yếu phân lập được từ các mẫu thu

ở Trà Lĩnh và Hòa An (bảng 3.8).

Bảng 3. 8. Các nhóm hình thái phát triển tản nấm của các mẫu nấm trên môi trường

V8 và môi trường PDA (Năm 2014 – 2015)

Nhóm Hình thái tản nấm

Thạch An

Tổng số

Phục Hòa

Hòa An

Tỷ lệ (%)

Trà Lĩnh

Số mẫu phân lập được tại các địa điểm Nguyên Bình

1 8 8 3 6 4 29 20,42

2 16 14 12 13 15 70 49,29

3 11 7 9 6 10 43 30,29

Tản nấm phát triển dạng bông mịn, tản nấm có màu trắng hơi trong trên môi trường V8 trên môi trường PDA hơi có dạng cánh hoa, màu trắng Tản nấm phát triển dạng bông xốp, màu trắng nhạt trên môi trường V8 và trắng đục trên môi trường PDA Tản nấm phát triển dạng bông màu trắng hơi phớt hồng trên môi trường V8, trên môi trường PDA tản nấm phát triển hình cánh hoa đặc trưng, màu trắng

Tổng số 35 29 24 25 29 142 100

Mười nguồn nấm đại diện cho 3 nhóm đã được lựa chọn để nghiên cứu xác định

nấm dựa trên cách mọc của tản nấm đặc điểm hình thái của sợi nấm của, cành bọc bào tử,

bọc bào tử và của hậu bào tử.

Nhóm 1

Các mẫu Phyt-01 và Phyt-02 được phân lập từ quýt Trà Lĩnh. Trên môi trường PDA

tản nấm phát triển dạng bông, có màu trắng hơi trong trên môi trường V8 trên môi trường

PDA hơi có dạng cánh hoa, màu trắng. Sợi nấm trong suốt, không vách ngăn, ít phân

nhánh và hơi phình lên ở vị trí phân nhánh. Cành bào tử ít phân nhánh, các bọc bào tử đính

trên đỉnh cành hay đỉnh nhánh của cành bào tử. Bọc bào tử thường có núm, hình elip, hình

trứng, nhưng phổ biến dạng quả lê, kích thước bọc bào tử từ 42,6-76,6 µm x 22,8-41,4 µm.

Bọc bào tử có cuống ngắn, kích thước từ 3,6 đến 4,8 µm. Theo khóa phân loại của Erwin

và Ribeico (1996) hai mẫu Phyt-01 và Phyt-02 được xác định là nấm Phytophthora

palmivora.

Bảng 3. 9. Kích thước bọc bào tử của các loài nấm Phytophthora

(Năm 2015 – 2016)

Kích thước bọc bào tử Loài nấm Ký chủ Tỉ lệ Dài (µm) Rộng (µm)

P.palmivora (Phyt-01) Quýt Trà Lĩnh 42.4-76.6 26.5-38.7 1.8

P.palmivora (Phyt-02) Quýt Trà Lĩnh 45.5-75.6 22.8-41.4 1.8

Trung bình 43,9 – 76,1 24,6-40.3 1.8

C. Trưng Vương

P.nicotianae (Phyt-03) Quýt Trà Lĩnh 13.4-44.3 16.4-39.4 1,0

P.nicotianae (Phyt-04) 16.2-48.5 13.3-36.5 1.3

Trung bình 14,8 - 46.4 14.5-38.3 1.2

P. citrophthora (M1) Quýt Trà Lĩnh 24.1-42.2 9.3-17.3 1.72

P. citrophthora (M2) 21.3-36.3 8.3-15.2 1.80

C. Trưng Vương

Quýt Trà Lĩnh C. Trưng Vương P. citrophthora (M3) 27.5-43.3 7.9-14.4 1.64

P. citrophthora (M4) 25.3-37.2 8.4-18.2 1.89

P. citrophthora (M5) Bưởi Phục Hòa 28.4-45.3 8.2-15.3 1.79

P. citrophthora (M6) Bưởi Phục Hòa 21.2-37.6 9.5-17.5 1.88

Trung bình 24.6-40.3 8.6-16.3 1.79

Nhóm 2

Hai mẫu Phyt-03 (phân lập từ quýt Trà Lĩnh) và Phyt-04 (phân lập từ cam Trưng

Vương) có tản nấm phát triển dạng bông xốp, màu trắng nhạt trên môi trường V8 và trắng

đục trên môi trường PDA. Sợi nấm trong suốt, không vách ngăn, hơi phình lên. Bọc bào tử

dạng hình cầu, hình trứng, có núm. Kích thước trung bình của bọc bào tử thay đổi từ 15,2-

46,8 µm x 14,5-38,3 µm. Không ghi nhận được sự xuất hiện của hậu bào tử trong các mẫu

quan sát. Theo khóa phân loại của Erwin và Ribeico (1996), các mẫu Phyt-03 và Phyt-04

thuộc về nấm Phytophthora nicotianae.

Nhóm 3

Các mẫu nấm M1và M2 (phân lập từ quýt Trà Lĩnh), M3và M4 (phân lập từ cam

Trưng Vương), M5 và M6 (phân lập từ bưởi Phục Hòa) tản nấm có dạng bông màu trắng

và có thể phớt hồng trên môi trường V8, trên môi trường PDA tản nấm có dạng cánh hoa,

màu trắng. Sợi nấm không vách ngăn, phân nhánh. Bọc bào tử hình elip, hình trứng, hình

quả chanh và một số trường hợp có hình dạng méo và không đối xứng, bọc bào tử được

sinh ra từ đoạn cuối cành bào tử, bọc bào tử có 1-2 núm. Bọc bào tử có kích thước từ 24,6-

40,3 µm x 8,6-16,3 µm. Các đặc điểm hình thái sợi nấm và bọc bào tử của các mẫu M1

M2, M3, M4, M5 và M6 tương tự như mô tả của Erwin và Ribeico (1996), của Hamm và

Hansen (1987) về nấm Phytophthora citrophthora.

Hình 3. 7. Hình thái tản nấm của P. nicotianae và P. palmivora trên môi trường nuôi cấy nhân tạo (sau 7 ngày, 28oC)

Hình 3. 8. Hình thái tản nấm của P. citrophthora trên môi trường PDA

(sau 7 ngày, 28C)

3.1.4.3. Xác định loài Phytophthora bằng kỹ thuật PCR

Để xác định chính xác tác nhân gây bệnh thối gốc, chảy gôm, các mẫu nấm phân

lập được từ các triệu chứng bệnh điển hình trên các giống cây có múi đã được giải trình tự

vùng liên kết gen ITS (internally transcribed spacers).

Cặp mồi ITS4 và ITS5 đã được sử dụng để xác định các mẫu nấm Phytophthora

gây bệnh trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng

ITS4: 5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

ITS5: 5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’

Phản ứng PCR nhân vùng gen mã vạch ITS của các mẫu Phytophthora đã được

thực hiện với cặp mồi ITS4 và ITS5. Sản phẩm PCR có kích thước xấp xỉ 0.8 kb, đã được

tinh chiết từ gen agarose và được giải trình tự trực tiếp (Hình 3.9)

Hình 3. 9. PCR nhân vùng gen ITS của các mẫu Phytophthora

(Các giếng từ 1 đến 10) bằng cặp mồi ITS4 và ITS5. M là thang DNA 1 kb (GeneRuler 1 kb, Thermo). Nhóm 1: mẫu Phyt-01 và mẫu Phyt-02

Hai mẫu Phyt-01 và Phyt-02 có sản phẩm PCR giống nhau với kích thước là 795

bp. So sánh trình tự gen trên GenBank tại NCBI xác định mẫu Phyt-01 và Phyt-02 thuộc

loài P. palmivora (Bảng 3.10).

Dựa trên kết quả tìm kiếm Genbank phân tích phả hệ đã được thực hiện. Kết quả

phân tích phả hệ cho thấy 2 mẫu Phyt-01 và Phyt-02 thuộc về nhóm loài P.palmivora (giá

trị thống kê boostrap của cụm bằng 99) (Hình 3.10)

Bảng 3. 10. Kết quả tìm kiếm trình tự gần gũi trên GenBank của 2 mẫu

Phytophthora, Phyt-01 và Phyt-02, dựa trên trình tự ITS (Năm 2015)

STT Loài xác định Mã GenBank

1 2 3 4 5 Phần trăm đoạn so sánh (%) 100 100 100 100 100 Mức đồng nhất trình tự (%) 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 MT052675 MK500842 MH401199 MF370566 MG434772 P. palmivora P. palmivora P. palmivora P. palmivora P. palmivora

Ghi chú: chỉ trình bày 5 trình tự gần nhất

Hình 3. 10. Cây phát sinh dựa trên trình tự toàn bộ vùng ITS của các mẫu

Phytophthora Phyt-01 và Phyt-02 với các loài có quan hệ họ hàng gần

Cây được xây dựng bằng phương pháp Neighbor-Joining sử dụng mô hình thay thế Kimura 2 tham số để ước lượng khoảng cách di truyền (thanh bar). Giá trị ở các nốt là giá trị thống kê boostrap dưới dạng % (1000 lần lặp) và chỉ trình bày các giá trị > 50%.

Nhóm 2 : Mẫu Phyt-03 và mẫu Phyt-04

Bảng 3. 11. Kết quả tìm kiếm trình tự gần gũi trên GenBank của 2 mẫu

Phytophthora, Phyt-03 và Phyt-04, dựa trên trình tự ITS (Năm 2015)

STT Loài xác định Mã GenBank

1 Phần trăm đoạn so sánh (%) 99 Mức đồng nhất trình tự (%) 99.9 KR827692 P. nicotianae

2 99 99.9 KJ865230 P. nicotianae

3 99 99.9 JF792541 P. nicotianae

4 99 99.9 JF792540 P. nicotianae

5 99 99.9 GU111681 P. nicotianae

Ghi chú: chỉ trình bày 5 trình tự gần nhất

Hình 3. 11. Cây phát sinh dựa trên trình tự toàn bộ vùng ITS của 2 mẫu

Phytophthora Phyt-03 và Phyt-04 với các loài có quan hệ họ hàng gần

Hai mẫu Phyt-03 và Phyt-04, có sản phẩm PCR kích thước bằng 824 bp. Phân tích

trình tự cho thấy cả 2 mẫu Phyt-03 và Phyt-04 đều có mức trình tự đồng nhất trình tự

100% với nhau. Trình tự của các mẫu được sử dụng để tìm kiếm chuỗi gần gũi trên

GenBank tại NCBI. Kêt quả tìm kiếm cho thấy loài gần gũi nhất là P. nicotianae (Bảng

3.11).

Dựa trên kết quả tìm kiếm Genbank, phân tích phả hệ đã được thực hiện. Kết quả

phân tích phả hệ cho thấy 2 mẫu Phyt-03 và Phyt-04 thuộc về nhóm loài P. nicotianae (giá

trị thống kê boostrap của cụm bằng 100%) (hình 3.11)

Theo các đặc điểm hình thái các mẫu Phyt-03 và Phyt-04 đã được xác định là nấm

P.nicotianae kết quả này hoàn toàn trùng khớp với các kết quả xác định nấm theo phương

pháp PCR

Nhóm 3: Mẫu M1 đến M6

Sản phẩm PCR của sáu mẫu từ M1 tới M6 đã được giải trình tư trực tiếp sau khi

loại bỏ các trình tự nhiễu ở 2 đầu, đoạn đọc được của 6 mẫu đều có kích thước bằng

811bp.

Phân tích trình tự cho thấy cả 6 mẫu đều có mức trình tự đồng nhất trình tự 100%

với nhau. Tiếp theo, trình tự của các mẫu được sử dụng để tìm kiếm chuỗi gần gũi trên

GenBank tại NCBI. Kêt quả tìm kiếm cho thấy loài gần gũi nhất là P. citrophthora (Bảng

3.12).

Bảng 3. 12. Kết quả tìm kiếm trình tự gần gũi trên GenBank của 6 mẫu Phytophthora

(M1 – M6) dựa trên trình tự ITS (Năm 2015)

Phần trăm đoạn Mức đồng nhất STT Loài xác định Mã GenBank so sánh (%) trình tự (%)

1 P. citrophthora 100 100 GU111603

2 P. citrophthora 100 100 GU111602

3 P. citrophthora 100 100 GU111601

4 P. citrophthora 100 100 GU111600

5 P. citrophthora 100 99.6 GU133066

Ghi chú: Chỉ trình bày 5 trình tự gần nhất

Dựa trên kết quả tìm kiếm Genbank, phân tích phả hệ đã được thực hiện. Kết quả

phân tích phả hệ cho thấy cả 6 mẫu từ M1 đến M6 phân nhóm rõ rệt trong cụm loài P.

citrophthora (giá trị thống kê boostrap của cụm bằng 100%).

Hình 3. 12. Cây phát sinh dựa trên trình tự toàn bộ vùng ITS của 6 mẫu

Phytophthora (M1, M2 M3, M4, M5, M6) với đại diện các loài Phytophthora trên

GeneBank

Theo các đặc điểm hình thái các mẫu M1, M2, M3, M4, M5 và M6 đã được xác

định là nấm P.citrophthora kết quả này hoàn toàn trùng khớp với các kết quả xác định nấm

theo phương pháp PCR.

Kết quả xác định nấm dựa theo các đặc điểm hình thái hoàn toàn trùng khớp với

các kết quả xác định nấm theo phương pháp PCR. Trên các mẫu đất và cây bị bệnh thu

thập được từ các vùng trồng cây ăn quả có múi của Cao Bằng đã phân lập được 3 loài nấm

P. citrophora, P. palmivora và P. nicotianae.

Kết quả phân lập và giám đã chỉ ra các loài P. nicotianae và P. citrophora là các tác

nhân chủ đạo gây bệnh trên cây có múi ở Cao Bằng

Khả năng gây bệnh của 10 mẫu nấm Phytophthora hại cây có múi phân lập được ở

Cao Bằng đã được đánh giá tại phòng thí nghiệm và nhà lưới của Viên Bảo vệ thực vật

trong 2 năm 2015-2016 trên quả và cây non cam Trưng Vương.

3.1.4.4. Kết quả lây bệnh nhân tạo trên quả cam Trưng Vương

Lây nhiễm bệnh nhân tạo trên quả cam Trưng Vương chín sinh lý bằng cách áp

miếng vải màn nhúng trong dịch nấm 2 x 105 bào tử/ml của với 03 loài nấm P. palmivora,

P. nicotianae và P. citrophthora vào mặt quả cam, giữ ẩm và đặt trong tối ở nhiệt độ từ 26

- 280C. Cả 10 mẫu nấm đều có khả năng lây bệnh cho quả cam Trưng Vương. Triệu chứng

bệnh xuất hiện cả ở 10 mẫu thí nghiệm sau 5 - 8 ngày lây nhiễm. Vùng quả bị nhiễm bệnh

có màu nâu, sau đó thâm đen, vỏ quả xung quanh chỗ nhiễm bệnh hơi cứng, vết bệnh bị

thối sau 10 - 15 ngày. Tuy nhiên các mẫu nấm khác nhau khả năng gây bệnh cho quả cam

có khác nhau. Các mẫu nấm Phyt-02 (P. palmivora), M4, M5 và M6 (P. citrophthora) thời

gian tiềm dục của bệnh chỉ có 5 - 6 ngày, Trong khi đó các mẫu Phyt-03 và Phyt-04 (P.

nicotianae) thời gian tiềm dục của bệnh kéo dài tới 7 - 8 ngày. Khả năng gây bệnh cho quả

cam Trưng Vương của các mẫu nấm thuộc loài P. palmivora, P. citrophthora đạt từ 70 -

90%, đặc biệt mẫu M3 (P. citrophthora) phân lập từ cam Trưng Vương có khả năng gây

bệnh cao nhất cho quả cam Trưng Vương (90%). Khả năng gây bệnh cho quả cam Trưng

Vương của loài P. nicotianae thấp hơn chỉ 60% số quả thí nghiệm bị nhiễm bệnh (bảng

3.13). 100% mẫu quả bị bệnh trong thí nghiệm đều tái phân lập được nấm Phytophthora.

Bảng 3. 13. Kết quả lây bệnh nhân tạo trên quả cam Trưng Vương của các loài nấm

Phytophthora. (Năm 2015 – 2016)

TT Triệu chứng Mẫu Nấm Cây ký chủ Tỉ lệ tái phân lập (%) Số quả lây bệnh Số quả nhiễm bệnh Thời gian ủ bệnh

Địa điểm thu thập Trà Lĩnh 10 8 5-7 80

Trà Lĩnh 10 7 Vết bệnh màu nâu nhạt, sau thâm đen, vỏ hơi cứng Vết bệnh màu nâu, đen 5-6 70

Trà Lĩnh 10 6 Vết bệnh màu nâu nhạt 7-8 60

Hòa An 10 6 Vết bệnh màu nâu đen 7-8 60

Trà Lĩnh 10 8 Vết bệnh màu nâu, sau bị thối 5-7 80

6 Vết bệnh màu nâu

Trà Lĩnh 10 7 6-7 70

Hòa An 10 9 Vết bệnh màu nâu đen 5-7 90

8 Vết bệnh thâm nâu

Hòa An 10 8 5-6 80

Phục Hòa 10 7 Vết bệnh màu nâu nhạt 5-6 70

P. palmivora – Q. Trà Lĩnh (Phyt-01) P. palmivora – Q. Trà Lĩnh Phyt-02 P. nicotianae – Q. Trà Lĩnh Phyt-03 P. nicotianae – C. Trưng Vương Phyt-04 P. citrophthora - Q. Trà Lĩnh M1 P. citrophthora - Q. Trà Lĩnh M2 P. citrophthora - C. Trưng Vương M3 P. citrophthora - C. Trưng Vương M4 P. citrophthora – B. Phục Hòa M5

Phục Hòa 10 8 Vết bệnh màu nâu đen 5-6 80

10 P. citrophthora – B. Phục Hòa M6 11 Đối chứng quả bình 10 0 - 0 Vỏ thường

3.1.4.5. Kết quả lây bệnh nhân tạo trên cây cam Trưng Vương non

Lây nhiễm cho cây cam non Trưng Vương đã được thực hiện theo phương pháp kép

(1) áp miếng thạch chứa nấm vào vết thương ở gốc cây và (2) tưới dịch nấm vào đất trồng

cây.

Bảng 3. 14. Kết quả lây bệnh nhân tạo trên cây cam Trưng Vương bằng các loài nấm

Phytophthora (Năm 2015 – 2016)

TT Mẫu Nấm & Cây ký chủ Địa điểm thu thập Triệu chứng Tỉ lệ tái phân lập (%) Số cây nhiễm bệnh

1 Số cây lây bệnh 10 8 Trà Lĩnh 80

2 10 10 Trà Lĩnh 100

3 10 10 Trà Lĩnh 100

4 8 10 Hòa An 80

5 10 10 Trà Lĩnh 100

6 8 10 Trà Lĩnh 80

Thời gian ủ bệnh 27- 29 28- 30 27- 29 27- 29 28- 30 27- 30 Vết bệnh màu nâu Vết bệnh màu nâu, Vết bệnh màu nâu Vết bệnh màu nâu Vết bệnh màu nâu Vết bệnh màu nâu

7 - C. Hòa An 10 10 100

P. palmivora – Q. Trà Lĩnh (Phyt-01) P. palmivora – Q. Trà Lĩnh (Phyt-02) P. nicotianae – Q. Trà Lĩnh (Phyt-03) P. nicotianae – C. Trưng Vương (Phyt-04) P. citrophthora - Q. Trà Lĩnh (M1) P. citrophthora - Q. Trà Lĩnh (M2) P. citrophthora Trưng Vương (M3) 28- 30

8 - C. Hòa An 10 10 100

P. citrophthora Trưng Vương (M4) 27- 29

9 Phục Hòa 10 10 100

P. citrophthora – B. Phục Hòa (M5)

10 P. citrophthora – B. Phục Hòa 10 10 100

Phục Hòa (M6)

11 Đối chứng 10 0 28- 30 28- 30 - 0

Vết bệnh màu nâu, bị thối Vết bệnh màu nâu, bị thối Vết bệnh màu nâu Vết bệnh màu nâu Thân cây bình thường

Kết quả lây bệnh (bảng 3.14) cho thấy, sau 27 - 30 ngày các cây trong thí nghiệm

lây bệnh bằng các loài nấm P. palmivora, P. nicotianae và P. citrophthora đã xuất hiện

triệu chứng bệnh, tỷ lệ cây bị bệnh đạt 80 - 100%. Tại các điểm lây nhiễm, mô cây biến

màu nâu, có hình dạng không rõ ràng, đoạn thân phía trên hay phần gốc sát mặt đất nơi

nấm xâm nhập bị thối, có hiện tượng chảy gôm. Bên trong lớp vỏ bị bệnh, phần gỗ có

những mạch màu đen. Một số cây rễ đã bắt đầu bị thối, thâm đen. Từ các cây bị bệnh trong

Kết quả lây bệnh này cũng phù hợp với đặc điểm dinh dưỡng và ký chủ của nấm

thí nghiệm đều tái phân lập được nấm Phytophthora.

đã được nghiên cứu trước đây. Cả 3 loài Phytophthora đều thuộc nhóm bán sinh dưỡng

(hemibiotroph) gồm 2 pha gây hại trên cây là pha sinh dưỡng (biotrophy) và pha hoại

dưỡng. Ở pha sinh dưỡng, chúng hình thành vòi hút để hấp thụ dinh dưỡng từ tế bào sống.

Ở pha hoại dưỡng chúng hấp thụ dinh dưỡng từ tế bào và mô chết hoặc đang chết

(Ludowici và cs., 2013). Tất cả các loài Phytophthora đều có kiểu gây bệnh bán sinh

dưỡng nhưng tính chất không giống nhau. Một số loài có tính gây bệnh gần giống ký sinh

chuyên tính, có phổ ký chủ hẹp và có quan hệ gen đối gen điển hình với cây ký chủ (ví dụ

P. infestans gây bệnh mốc sương cà chua, khoai tây). Trái lại, 3 loài Phytophthora gây

bệnh thối rễ chảy gôm lại có kiểu gây hại ngả về phía hoại dưỡng hơn, có nghĩa sau pha

sinh dưỡng ngắn ngủi, chúng nhanh chóng chuyển sang pha hoại dưỡng. Chúng có phổ ký

chủ rất rộng và không có quan hệ gen – đối gen điển hình với cây.

Kết quả lây bệnh nhân tạo trên quả, thân và phân lập lại nấm đã xác định các nguồn

nấm P. palmivora, P. nicotianae và P. citrophthora là tác nhân gây bệnh thối rễ chảy gôm

trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng.

Kết quả cũng cho thấy cả 3 loài nấm P. palmivora, P. nicotianae và P.

citrophthora đều gây bệnh trên quýt Trà Lĩnh. cam Trưng Vương, trên bưởi Phục Hòa P.

citrophthora chiếm ưu thế. Kết quả này cũng đã giải thích được nguyên nhân cây quýt Trà

Lĩnh bị bệnh thối rê, chảy gôm hại nặng nhất trong các cây ăn quả có múi ở Cao Bằng.

Hình 3. 13. Lây bệnh nhân tạo bằng phương pháp áp thạch

Kết quả xác định tác nhân gây bệnh thối rễ, chảy gôm trên cây ăn quả có múi ở Cao

Bằng tương tự với những kết quả điều tra của Viện Bảo vệ thực vật (1967-1968; 1997-

1998), Đặng Vũ Thị Thanh & nnk (2010) về tác nhân gây bênh thối rễ, chảy gôm cây ăn

quả có múi ở Việt Nam là do nấm P. nicotianae và P. citrophthora. Đồng thời kết quả

nghiên cứu tại Cao Bằng đã bổ sung thêm nấm P. palmivora một loài nấm gây hại trên

nhiều loại cây trồng vào danh sách các nấm gây hại cây ăn quả có múi.

3.2. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học, nuôi cấy của nấm Phytophthora

Các loài nấm P. palmivora (mẫu Phyt-01), P. nicotianae (mẫu Phyt-03) và P.

citrophthora (mẫu M2) đã được sử dụng trong các thí nghiệm nghiên cứu các đặc điểm

sinh học và nuôi cấy ở các điều kiện nhiệt độ, pH và môi trường dinh dưỡng… khác nhau.

3.2.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm Phytophthora

3.2.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng, phát triển của nấm Phytophthora

Các loài nấm Phytophthora đã được nuôi cấy trong các mức nhiệt độ 5, 10, 15, 20,

25, 30, 35 và 400C trên môi trường PDA. Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm

bệnh cây, Viện Bảo vệ thực vật.

Nấm P. palmivora có thể sinh trưởng và phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 10 đến

350C. Nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm phát triển trong khoảng từ 25 - 300C. Trong khoảng

nhiệt độ này đường kính tản nấm đạt 7,24 - 6,87 cm sau 6 ngày nuôi cấy (Bảng 3.15). Các

kết quả trên cũng phù hợp với nghiên cứu của Whaterhouse (1974).

Bảng 3. 15. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của nấm P. palmivora Phyt-01

(Năm 2016)

Đường kính tản nấm (cm) TT Điều kiện nhiệt độ (oC) 2 ngày 4 ngày 6 ngày

1 5 0,00 0,00 0,00 g

2 10 0,62 1,45 2,76 e

3 15 1,42 3,06 4,87 d

4 20 2,68 5,62 6,31 c

5 25 3,02 5,86 7,24 a

6 30 2,54 5,28 6,87 b

7 35 0,00 0,47 0,82 f

8 40 0,00 0,00 0,00 g

LSD 5% 0,24

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột biểu hiện các chữ cái giống nhau không sai khác có ý nghĩa

ở mức xác xuất P≤0.05 theo phân tích Duncan.

CV% 1,8

Bảng 3. 16. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của nấm P. nicotianae

(Năm 2016)

Đường kính tản nấm (cm) TT Điều kiện nhiệt độ (oC) 2 ngày 4 ngày 6 ngày

1 5 0,00 0,00 0,00 e

2 10 0,34 1,76 3,02 d

3 15 1,56 2,78 4,34 c

4 20 2,16 5,24 6,42 b

5 25 2,67 5,46 6,82 ab

6 30 2,89 5,78 7,12 a

7 35 0,82 1,86 3,15 d

8 40 0,00 0,00 0,00 e

LSD 5% 0,47

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột biểu hiện các chữ cái giống nhau không sai khác có ý

nghĩa ở mức xác xuất P≤0.05 theo phân tích Duncan.

CV% 2,1

Nấm P. nicotianae có thể sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 100C đến 350C.

Cũng tương tự như nấm P. palmivora khoảng nhiệt độ thích hợp cho nấm sinh trưởng từ

250C - 300C. Nấm phát triển thích hợp nhất ở nhiệt độ 300C, đường kính tản đạt 7,12cm

sau 6 ngày. Tại nhiệt độ 50C và 400C, không ghi nhận được sự sinh trưởng và phát triển

của nấm (bảng 3.16).

Hình 3. 14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm P. nicotianae

Nấm P. citrophthora phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 100C - 300C, nấm phát

triển tốt trong khoảng nhiệt độ từ 200C - 250C, trong đó thích hợp nhất là nhiệt độ 200C với

đường kính tản nấm 6,84 sau 6 ngày nuôi cấy. Nhiệt độ 100C và 300C, nấm cũng phát triển

nhưng chậm hơn (Bảng 3.17 và hình 3.15). Kết quả trên cũng phù hợp với các nghiên cứu

về nấm P. citrophthora của Graham và cs. (1998), Sativa và cs. (2012).

Hình 3. 15. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm P. citrophthora

Bảng 3. 17. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của nấm P. citrophthora

(Năm 2016)

Đường kính tản nấm (cm) TT Điều kiện nhiệt độ (oC) 2 ngày 4 ngày 6 ngày

5 0,00 0,00 0,00 f 1

10 0,31 1,63 2,89 e 2

15 1,42 2,65 5,87 c 3

20 2,47 5,72 6,84 a 4

25 2,36 5,18 6,32 b 5

30 1,78 4,26 5,16 d 6

35 0,00 0,00 0,00 f 7

40 0,00 0,00 0,00 f 8

LSD 5% 0,37

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột biểu hiện các chữ cái giống nhau không sai khác có ý

nghĩa ở mức xác xuất P≤0.05 theo phân tích Duncan.

CV% 1,6

3.2.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hình thành bọc bào tử của 03 loài nấm

Phytophthora.

Bọc động bào tử là cơ quan duy trì khả năng lan truyền và tồn tại của nấm

Phytophthora trong tự nhiên. Sự hình thành bọc động bào tử của nấm chịu nhiều tác động

của các yêu tố, trong đó có nhiệt độ môi trường sinh sống của nấm. Tác động của nhiệt độ

đến khả năng hình thành cơ quan sinh sản bọc động bào tử của nấm đã được tiến hành

nghiên cứu với cả 3 loài P.palmivora, P.nicotianae và P.citrophthora

Nấm được nuôi cấy trên môi trường V8A ở 250C sau 24 giờ tản nấm được rửa bằng

nước cất khử trùng và đưa vào các mức nhiệt độ thí nghiệm 10, 15, 20, 25, 30 và 350C.

Sau 48 giờ chuyển nấm vào ống nghiệm chứa nước cất lắc đều và đếm số lượng bọc bào tử

bằng buồng đếm hồng cầu.

Bảng 3. 18. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hình thành bọc bào tử của nấm

Phytophthora (Năm 2016)

Bọc Bào tử/đĩa petri (x 104)

TT Điều kiện nhiệt độ

P. palmivora Phyt-01 P. nicotianae Phyt-03 P. citrophthora M2

1 10 0,48 d 0,87 e 0,74 d

2 15 0,86 c 1,22 e 3,62 c

3 20 3,42 b 3,58 c 5,86 a

4 25 5,37 a 4,72 b 4,32 b

5 30 0,62 d 5,84 a 2,57 c

6 35 0,00 e 2,26 d 0,00 e

LSD 5% 0,34 0,52 0,67

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột biểu hiện các chữ cái giống nhau không sai khác có ý

nghĩa ở mức xác xuất P≤0.05 theo phân tích Duncan.

CV% 1,25 1,78 1,56

Khả năng sinh bọc bào tử của cả 3 loài nấm tương đồng với khả năng phát triển của

tản nấm Cả 3 loài nấm đều có khả năng hình thành bọc bào tử từ 100C.

Nấm P. palmivora, bọc bào tử được hình thành từ 10 - 300C, nấm hình thành các

bọc bào tử nhiều trong khoảng nhiệt độ từ 20 đến 250C nhưng thích hợp nhất ở 250C, số

lượng bọc bào tử sản sinh là 5,37 x 104 bọc bào tử/đĩa petri (bảng 3.18).

Nấm P. nicotianae đều hình thành được bọc bào tử trong tất cả các mức nhiệt độ

thí nghiệm. Khoảng nhiệt độ từ 20 đến 300C là điều kiện phù hợp cho nấm P. nicotianae

(Phyt-03) sản sinh bọc bào tử, trong đó nhiệt độ 300C là thích hợp nhất với lượng bọc bào

tử là 5,84 x 104 bọc bào tử/đĩa (bảng 3.18).

Nấm P. citrophthora nhiệt độ thích hợp để hình thành bọc bào tử nằm trong khoảng

nhiệt độ từ 15-250C nhưng bọc bào tử hình thành thích hợp nhất ở mức nhiệt độ 200C số

lượng bọc bào tử sản sinh là 5,86 x 104 bọc bào tử/đĩa petri (bảng 3.18).

Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra sự khác biêt vể yêu cầu nhiệt độ của các nấm

Phytophthora cũng như tác động của nhiệt độ tới sinh trưởng và phát triển của nấm. Trong

3 loài nấm P.nicotianae là loài có yêu cầu về nhiệt độ cao hơn để phát triển so với các loài

P. palmivora và P. citrophthora. Nhiệt độ thích hợp nhất để nấm P. nicotianae phát triển

tản nấm và bọc bào tử là 300C, của nấm P. palmivora là 250C nhưng của nấm P.

citrophthora chỉ có 200C. Kết quả nghiên cứu cũng sẽ góp phần để xác định được vùng

phân bố, thời gian gây hại nặng của từng loài nấm trên đồng ruộng. Nấm P.nicotianae sẽ

phát triển gây hại nặng cho cây trong các tháng mùa hè nóng ẩm, nấm P. citrophthora sẽ

gây hại nặng cho cây trong mùa xuân mưa phùn ẩm ướt.

Kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng của các nấm P.

palmivora, P. nicotianae và P. citrophthora cũng tương tự với các kết quả nghiên cứu của

Waterhouse (1974). Francis và cs. (2015), Timmer và cs., (1993); Timmer and Broadbent

(2003); Alvarez và cs. (2008).

3.2.1.3. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng của nấm Phytophthora

Các loài nấm P. palmivora, P. nicotianae và P. citrophthora đã được nhân nuôi trên

các môi trường PDA, PCA, PSA, CMA, CRA và V8A. Kết quả được trình bày tại bảng

3.19.

Bảng 3. 19. Ảnh hưởng của môi trường dinh đưỡng đến sự phát triển của 03 loài nấm

Phytophthora (Năm 2016)

P. citrophthora M2 P. palmivora Phyt-01 P. nicotianae Phyt-03

TT Môi trường nuôi cấy

1 PDA ĐKTN sau 3 ngày 4,36 ĐKTN sau 6 ngày 7,32 b ĐKTN sau 3 ngày 4,26 ĐKTN sau 6 ngày 7,25 b ĐKTN sau 3 ngày 4,84 ĐKTN sau 6 ngày 7,18 b

2 PCA 3,89 7,14 c 4,28 6,72 c 4,16 6,76 cd

3 PSA 3,62 6,45 d 3,94 6,28 d 4,36 6,57 d

4 CMA 4,73 7,42 ab 4,38 7,16 b 4,78 6,83 c

5 CRA 4,84 7,69 a 4,75 7,64 a 4,98 7,35 a

6 V8A 4,78 7,74 a 4,37 7,82 a 4,85 7,54 a

LSD 5% 0,26 0,34 0,21

CV% 2,17 1,75 1,68

Ghi chú: ĐKTN: đường kính tản nấm. Các giá trị trong cùng một cột biểu hiện các chữ cái

giống nhau không sai khác có ý nghĩa ở mức xác xuất P≤0.05 theo phân tích Duncan.

Cả 3 loài P. palmivora, P. nicotianae và P. citrophthora đều phát triển trên 6 loại

môi trường, sau nuôi cấy 6 ngày đường kính tản nấm đạt từ 6,28 – 7,82cm. Cả 3 loài nấm

đều phát triển kém hơn trên môi trường PSA đường kính tản nấm sau 6 ngày chỉ đạt từ

6,28 - 6,57cm. Môi trường V8A là môi trường thích hợp nhất cho nấm phát triển, đường

kính tản nấm đạt từ 7,54 – 7,82 cm sau 6 ngày. Tuy nhiên, mỗi một loài nấm có nhu cầu

dinh dưỡng khác nhau, nấm P. palmivora có đương kính tản nấm lớn hơn 7cm trên 5 loại

môi trường PDA, PCA, CMA, CRA và V8A, nấm P. nicotianae trên 4 môi trường PDA,

CMA, CRA và V8A và nấm P. citrophthora chỉ có đường kính tản nấm lớn hơn 7cm trên

3 loại môi trường PDA, CRA và V8A.

Các loại môi trường PDA, CRA và V8A thích hợp cho cả ba loài nấm phát triển.

Kết quả trên cũng chỉ ra trong 3 loài nấm, nấm P. citrophthora có nhu cầu chặt chẽ nhất về

dinh dưỡng và nấm P.palmivora lại có thể phát triển tốt trong nhiều môi trường dinh

dưỡng khác nhau.

3.2.1.4. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của nấm Phytophthora

Phytophthora là loài nấm tồn tại, phát triển trong đất, độ pH của đất có vai trò quan

trọng đối với sinh trưởng của nấm. Ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của

nấm đã được đánh giá trong điều kiện phòng thí nghiệm. Các loài nấm được nhân nuôi trên

môi trường PDA ở các mức pH từ 4,5 – 8,0.

Kết quả trình bày bảng 3.20 cho thấy, cả 3 loài Phytophthora có thể sinh trưởng và

phát triển trong phổ pH rộng từ chua đến kiềm nhẹ. Nấm có thể phát triển từ mức pH 4,5 –

8,0 nhưng pH từ 6 đến 7 là thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cả 3 loài. Ở

khoảng pH từ 6,0 - 7,0 sau 6 ngày nuôi cấy đường kính tản nấm của P. palmivora đạt từ

7,26 - 7,88 cm; của P. nicitianae từ 7,48 - 7,82 cm; với P. citrophthora đạt từ 7,62 -

7,83cm. Các yếu tố dinh dưỡng, nhiệt độ , pH không những chỉ ảnh hưởng đến tốc đô sinh

trưởng của tản nấm mà còn ảnh hưởng đến cách mọc của nấm trên môi trường (hình 3.16).

Khả năng thích ứng rộng này giúp chúng có thể tồn tại và gây hại cho nhiều loại cây trồng

trên nhiều vùng đất khác nhau.

Bảng 3. 20. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng phát triển của 03 loài nấm

Phytophthora (Năm 2016)

P. palmivora (Phyt-01) P. nicotianae (Phyt-03) P. citrophthora M2

TT pH

ĐKTN sau 3 N ĐKTN sau 6 N ĐKTN sau 3 N ĐKTN sau 6 N ĐKTN sau 3 N ĐKTN sau 6 N

1 4,5 1,52 3,36 e 1,72 3,68 e 1,67 3,85 f

2 5,0 1,84 3,64 e 2,12 3,96 de 1,97 4,02 ef

3 5,5 2,13 3,95 de 2,35 4,27 d 2,26 4,72 d

4 6,0 4,37 7,26 ab 4,62 7,48 b 4,87 7,62 b

5 6,5 4,78 7,45 a 4,84 7,61 ab 4,96 7,75 ab

6 7,0 5,03 7,88 a 5,08 7,82 a 5,12 7,83 a

7 7,5 3,18 6,63 c 3,87 6,15 c 3,82 6,45 c

8 8,0 2,84 4,31 d 2,17 3,98 de 2,68 4,15 e

LSD 5% 0,47 0,32 0,29

CV% 1,76 2,16 1,52

giống nhau không sai khác có ý nghĩa ở mức xác xuất P ≤0.05 theo phân tích Duncan.

Ghi chú: ĐKTN: đường kính tản nấm; N: ngày. Các giá trị trong cùng một cột biểu hiện các chữ cái

Hình 3. 16. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của nấm P. citrophthora

3.2.2. Quy luật phát sinh, gây hại của nấm Phytophthora spp. Trên cây ăn quả có múi

tại Cao Bằng.

3.2.2.1. Diễn biến bệnh thối rễ chảy gôm trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng

Cây có múi là một trong những cây trồng quan trọng của tỉnh Cao Bằng. Trong

những năm gần đây, bệnh thối rễ, chảy gôm đã gây hại khá nghiêm trọng tại các vùng

trồng cây có múi của Cao Bằng. Trong 2 năm 2015 và 2016 điều tra đánh giá hiện trạng

bệnh đã dược tiến hành trên tất cả các loài cây ăn quả có múi tại các vùng trồng của Cao

Bằng. Kết quả được trình bày tại biểu đồ 3.1 và 3.2.

Biểu đồ 3. 1. Biểu đồ Diễn biến bệnh thối rễ, chảy gôm trên cây ăn quả có múi tại

Cao Bằng năm 2015

Biểu đồ 3. 2. Biểu đồ Diễn biến bệnh thối rễ, chảy gôm trên cây ăn quả có múi

tại Cao Bằng năm 2016

Bệnh thối rễ chảy gôm phát sinh và gây hại cây ăn quả có múi trong suốt cả năm.

Các tháng mùa khô (từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau) triệu chứng bệnh thể hiện nhẹ hơn

so với các tháng mùa mưa (từ tháng 7 đến tháng 10). Các cây cam, quýt bị bệnh nặng hơn

cây bưởi.

Trên cây quýt bệnh hại năng nhất ở vùng Trà lĩnh, năm 2015, tỉ lệ bệnh trên quýt

Trà Lĩnh từ tháng 1 đến tháng 4 trung bình là 26,15%, trong khi đó từ tháng 7 đến tháng

10, tỉ lệ bệnh ghi nhận được trung bình là 37,58%. Năm 2016 bệnh ghi nhận cao hơn so

với năm 2015 do nấm ngày càng tích lũy, tấn công và gây hại. Năm 2016 trong các tháng

8,9 tỷ lệ bệnh thối rế, chảy gôm trên quýt ở Trà Lĩnh đạt 44,0%, tiếp theo là Hòa An tỷ lệ

bệnh đạt 24,0 - 26,3%, tạị Thạch An tỷ lệ bệnh đạt 18,6 - 20,0% và nhẹ nhất là Nguyên

Bình tỷ lệ bệnh đạt 14,6 - 17,3%.

Tại Hòa An cây cam bị bệnh nặng hơn cây quýt, năm 2015 trên quýt Tỷ lệ cây bị

bệnh dao động từ 9,3 - 18,6%, số cây nhiễm bệnh của cây cam dao động từ 20,0 - 29,3%.

Năm 2016 tỷ lệ bệnh trên cả cam và quýt đều tăng lên, Tỷ lệ bệnh trên cam đạt cao nhất là

34,6% và ở cây quýt đạt cao nhất là 26,6%.

Kết quả điều tra diễn biến bệnh thối rễ chảy gôm cây ăn quả có múi ở Cao Bằng

cũng tương tự như kết quả điều tra bệnh tại vùng cây ăn quả có múi ở Cao Phong, Hòa

Bình trong năm 2002. Bệnh thối rễ chảy gôm của cây cam ở Hòa Bình cũng phát triển

mạnh trong các tháng mùa mưa (Đặng Vũ Thị Thanh, Ngô Vĩnh Viễn, Drenth, 2004).

3.2.2.2. Ảnh hưởng của các yếu tố sinh thái đến sự phát triển của bệnh thối rễ chảy gôm

* Ảnh hưởng của của địa hình đến mức độ nhiễm bệnh thối rễ chảy gôm

Tại Cao Bằng cây có múi được trồng sát các chân núi đá vôi, trồng trên đồi, ven

suối và trên đất ruộng ở các thung lũng. Địa hình khác nhau sẽ dẫn đến điều kiện đất đai,

tiểu khi hậu của các vườn cây có múi sẽ khác nhau và sẽ ảnh hưởng khác nhau đến khả

năng gây hại của nấm Phytophthora với cây trồng.

Hiện trạng bệnh thối rễ chảy gôm của cây có múi được trồng ở các địa hình khác

nhau được trình bày ở bảng 3.21. Kết quả cho thấy, cả 3 loại cam, quýt, bưởi đều có tỷ lệ

bệnh cao nhất đối với các vườn nằm gần chân núi đá (34,6 – 50,3%), tiếp đến là các khu

vực trồng ở chân đồi, ven suối, đất ruộng (32,1 – 41,3%). Tỷ lệ bệnh thấp nhất khu vực

trồng ở đỉnh đồi (14,3 – 21,3%). Mức độ gây hại của bệnh (Chỉ số bệnh) trên các vườn

cam, quýt, bưởi được trồng ở các chân núi đá, chân đồi, ven suối, đất ruộng cũng cao hơn

rất nhiều so với các vườn ở đỉnh đồi và lưng đồi. Điều này có thể giải thích do các vườn ở

chân núi đá, chân đồi, ven suối, đất ruộng thường có độ ẩm cao hơn phù hợp cho nấm

Phytophthora phát triển gây hại cho cây hơn so với các vườn ở đỉnh đồi và lưng đồi (bảng

3.21).

Bảng 3. 21. Ảnh hưởng của địa hình đến mức độ bệnh thối rễ chảy gôm trên cây ăn

quả có múi tại Cao Bằng (Năm 2015 – 2017)

Cam (%) Quýt (%) Bưởi (%) TT Chân đất TLB CSB TLB CSB TLB CSB

1 Chân núi đá 50,3 21,4 47,2 24,3 34,6 21,6

2 Đất đỉnh đồi 14,3 3,6 16,7 4,2 21,3 13,2

3 Đất lưng đồi 27,4 5,3 26,3 6.3 25,6 14,6

4 Đất chân đồi 34,2 16,7 38,4 18,7 32,1 17,4

5 Ven suối 35,7 16,4 37,4 16,3 36,4 25,7

6 Đất ruộng 37,6 17,3 41,3 21,3 - -

* Ảnh hưởng của giống đến phát sinh và phát triển của bệnh thối gốc chảy gôm

Trong 2 năm 2015 và 2016 đã thực hiện điều tra mức độ nhiếm bệnh thối rễ, chảy

gôm của các giống quýt Trà Lĩnh, Hà Trì, Hoa Thám và Trọng Con, kết quả bảng 3.22.

Bảng 3. 22. Mức độ nhiễm bệnh thối rễ chảy gôm của các giống quýt tại Cao Bằng

(Năm 2015)

Mức độ nhiễm bệnh

Năm 2015 Năm 2016 Giống cây có múi Tỉ lệ bệnh (%) Chỉ số bệnh (%) Tỉ lệ bệnh (%) Chỉ số bệnh (%)

Quýt Trà Lĩnh 42,57 20,16 45,18 21,27

Quýt Hà Trì 16,47 7,28 20,46 7,72

Quýt Hoa Thám 10,45 6,37 12,58 6,84

Quýt Trọng Con 17,26 7,34 20,18 7,21

Kết quả thấy rằng, cả 4 giống quýt đều bị bệnh thối rễ chảy gôm. Giống quýt Trà

lĩnh bị nhiễm bệnh cao nhất có tới 42,5 – 45,1% số cây bị nhiễm bệnh với mức độ bệnh

nặng chỉ số bệnh đạt trên 20%. Giống quýt Hoa Thám bị bệnh nhẹ nhất tỷ lệ cây bị bệnh từ

10,4 – 12,5% và chỉ số bệnh từ 6,3 - 6,8% (bảng 3.22)

* Ảnh hưởng của tuổi cây đến phát sinh phát triển của bệnh thối rễ, chảy gôm

Bệnh thối rễ chảy gôm gây hại ở tất cả các tuổi cây. Thời điểm cây còn nhỏ, tán cây

thông thoáng, nước dễ bay hơi, dễ chăm sóc và phòng trừ số cây bị nhiễm bệnh ít, mức độ

hại của bệnh trên cây cũng nhẹ hơn. Trong 3 năm đầu các cây quýt và bưởi mẫn cảm với

bệnh hơn so với cam, tỷ lệ cây bị bệnh ở quýt và bưởi lớn hơn 12% và ở cam là 10%. Tại

các vườn từ 8 tuổi trở lên quýt là cây có số cây bị bệnh cao nhất 32,5% sau đó đến cam

24,4% và cuối cùng là bưởi 20,3%. Sự mẫn cảm của cam với bệnh đã có sự thay đổi theo

tuổi cây. Tuổi càng cao cây cam càng dễ bị nhiễm bệnh hơn, tại các vườn trên 10 tuổi số

cây cam bị nhiễm bệnh đã lên tới 37,2% (bảng 3.23).

Kết quả điều tra ở các độ tuổi khác nhau cũng đã cho thấy tại Cao Bằng cây quýt bị

bệnh thối rễ chảy gôm nặng nhất sau 10 năm có tới 42,3% cây bị bệnh và nhẹ nhất là cây

bưởi sau 10 năm có 24,1% cây bị bệnh (bảng 3.23).

Bảng 3. 23. Ảnh hưởng của tuổi cây đến bệnh thối rễ chảy gôm trên cây ăn quả có

múi ở Cao Bằng (Năm 2015)

Thời kỳ sinh trưởng

Dưới 3 năm 5 - 7 năm 8 - 10 năm Trên 10 năm Cây ký chủ TLB CSB TLB CSB TLB CSB TLB CSB

(%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%)

Quýt 12,81 4,52 21,36 5,47 35,26 12,48 42,37 19,38

Cam 10,38 3,62 16,38 5,25 24,46 10,57 37,26 17,83

Bưởi 12,27 5,36 16,25 6,78 20,35 9,76 24,18 10,72

Kết quả điều tra thực trạng bệnh đã khẳng định bệnh thối rễ chảy gôm là một bệnh

hại chính, quan trọng đối với cam, quýt, bưởi ở vùng Cao Bằng. Tốc độ lan truyền cũng

như mức độ hại của bệnh tăng lên rất nhanh sau 7-10 năm điều này sẽ ảnh hưởng rất lớn

đến chu kỳ sinh trưởng của cây, tuổi thọ của cây bị rút ngăn, năng suất chất lượng quả đều

giảm so với tiềm năng của giống.

3.3. Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật đối kháng nấm Phytophthora từ đất trồng cây ăn

quả có múi ở Cao Bằng.

Để có các vi sinh vật đối kháng nấm Phytophthora có khả năng phòng chống hiệu

quả bệnh thối rễ, chảy gôm trên cây có múi tại Cao Bằng công tác tuyển chọn các dòng vi

sinh vật đối kháng bản địa đã được tiến hành.

Các mẫu đất để phân lập tuyển chọn các vi sinh vật đối kháng đã được thu thập tại

các vườn cây có múi không bị bệnh hay bị bệnh nhẹ.

3.3.1. Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật đối kháng nấm Phytophthora

Từ 60 mẫu đất thu thập được ở Cao Bằng đã phân lập được 112 mẫu VSV có khả

năng đối kháng nấm Phytophthora, trong đó 6 mẫu có khả năng đối kháng rất cao, 31 mẫu

khả năng đối kháng cao, 30 mẫu khả năng đối kháng trung bình và 35 mẫu khả năng đối

kháng yếu (bảng 3.24). 6 mẫu có khả năng đối kháng rất cao là BHA12.2, BHA6.5,

STL2.7, SHA2.4 và SNB3.8, BNB9.8 được phân lập từ các vùng trồng cây có múi khác

nhau của Cao Bằng.

Bảng 3. 24. Phân lập và đánh giá khả năng đối kháng của vi sinh vật đối với nấm

Phytophthora spp. (Năm 2017)

Số chủng Khả năng đối kháng Số VSV phân TT Địa điểm +++ ++ + - mẫu lập được

1 Hòa An 15 29 10 11 2 6

2 Trà Lĩnh 15 31 8 9 2 12

3 Nguyên Bình 15 27 5 12 1 9

4 Phục Hòa 15 25 7 13 1 4

Tổng 60 112 30 35 6 31

HQUC ≤ 50% 50% < HQUC ≤ 60% 60% < HQUC ≤ 75% HQUC > 75

Thấp Trung bình Cao Rất cao

+ ++ +++ ++++

Ghi chú: Thang tính hiệu quả ức chế:

Bảng 3. 25. Khả năng ức chế của các nguồn vi sinh vật có triển vọng với nấm

Phytophthora (Năm 2017)

Khả năng ức chế

Phytopthora (PHA16.2) Phytopthora (PTL8.7) Phytopthora (PNB5.8) TT Nguồn VSV Trung bình (%) HQƯC (%) HQƯC (%) HQƯC (%)

ĐK vòng vô khuẩn (mm) ĐK vòng vô khuẩn (mm) ĐK vòng vô khuẩn (mm)

1 BHA12.2 25,9 b 79,6 26,6 b 81,8 27,7 a 85,2 82,2

2 BHA6.5 20,4 c 62,8 19,2 c 59,1 19,6 b 60,3 60,7

3 BNB3.8 27,8 ab 85,5 28,6 a 88,0 27,2 a 83,7 85,7

4 STL2.7 28,4 a 87,4 27,8 ab 85,5 26,5 a 81,5 84,8

5 SHA2.4 18,2 d 56,0 19,7 cd 60,6 18,8 bc 57,8 58,1

6 BNB9.8 16,3 d 50,2 17,7 d 54,5 17,2 c 52,9 52,5

Các giá trị trong cùng một cột biểu thị bằng các chữ giống nhau sai khác không có ý nghĩa

ở xác suất P ≤ 0,05 theo phân tích Duncan’s.

CV% 8,7 6,3 9,7

Hình 3. 17. Khả năng ức chế Hình 3. 18. Khả năng ức chế của xạ khuẩn STL2.7 đối

của vi khuẩn BHA12.2 với với nấm P. Citrophthora

nấm P. citrophthora

Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế của các nguồn vi sinh vật triển vọng

với nấm cho thấy, 6 nguồn VSV đều có khả năng ức chế cao đối với các nguồn nấm

Phytophthora thu thập ở các vùng khác nhau. Nguồn STL2.7 có khả năng ức chế cao

đường kính vòng vô khuẩn hình thành với 3 nguồn nấm Phytophthora lần lượt là 28,4,

27,8 và 26,5 mm và nguồn BNB3.8 có đường kính vòng vô khuẩn là 27,8, 28,6, và 27,2

mm. Hiệu quả ức chế trung bình với 3 nguồn nấm Phytophthora của 3 mẫu BNB3.8,

STL2.7 và BHA12.2 lần lượt là 85,7; 84,8 và 82,2% (Bảng 3.25).

Ngoài các nguồn VSV phân lập từ đất trồng cây ăn quả có múi ở tỉnh Cao Bằng,

một số nguồn nấm Trichoderma harzianum lưu giữ tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bệnh

cây và Miễn dịch thực vật, Viện Bảo vệ thực vật cũng được đánh giá khả năng đối kháng

với các loài nấm Phytophthora phân lập ở Cao Bằng.

Nguồn Trichoderma 01 được lựa chọn vì thời gian hình thành vòng đối kháng

nhanh và đường kính vòng đối kháng lớn nhất. Sau 2 ngày cả nấm Trichoderma và

Phytophthora spp. đều phát triển và lan nhanh trên môi trường. Từ ngày thứ 4 trở đi, nấm

Trichoderma đã tiếp cận và ký sinh sợi nấm Phytophthora làm cho tản nấm Phytophthora

không phát triển và bị khô sau 7 ngày.

Ba nguồn VSV đối kháng BNB3.8, STL2.7 và BHA12.2 và mẫu Trichoderma 01

được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.3.2. Xác định các vi sinh vật đối kháng và mức độ an toàn sinh học

Các nguồn vi sinh vật đối kháng có hoạt tính cao BHA12.2, BNB 3.8 và STL2.7 đã

được định danh bằng phương pháp truyền thống thông qua đặc điểm tế bào, khuẩn lạc và

các phản ứng sinh hóa theo tài liệu của Bergey và phương pháp sinh học phân tử.

Phương pháp PCR sử dụng cặp mồi Phy1F và Phy1R (Hà Viết Cường và cộng sự,

2010).

3.3.2.1. Định danh các vi sinh vật đối kháng theo đặc điểm sinh hóa hoc

Kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh học của 03 nguồn VSV đối kháng BHA12.2,

STL2.7 và BNB 3.8 được tổng hợp trong bảng 3.26. Dựa vào hình thái khuẩn lạc, hình thái

thế bào, phản ứng Gram và nhu cầu sử dụng oxy các mẫu BHA12.2, và BNB 3.8 được xác

định là các vi khuẩn hiếu khí, sinh bào tử, mẫu STL2.7 là xạ khuẩn.

Kết quả cho thấy, 3 nguồn vi sinh vật BHA12.2, BNB 3.8 và STL2.7 đều có khả

năng đồng hóa các nguồn cac bon D-glucose, Saccarose, tinh bột, Xenlulose, Glycerol và

Maltose màu sắc môi trường chuyển từ màu xanh (màu của đối chứng) sang màu da cam

và vàng nhạt.

Bảng 3. 26. Một số Đặc điểm sinh học của các nguồn vi sinh vật có triển vọng

(Năm 2017)

Nguồn Phản ứng TT Hình thái khuẩn lạc, tế bào VSV Gram Nhu cầu O2

Trên môi trường King’s B khuẩn lạc tròn

1 BHA12.2 màu trắng đục, mép khuẩn lạc nhăn, tế bào + +

hình gậy, sinh bào tử

Trên môi trường YS khuẩn lạc màu màu

2 STL2.7 nâu xám, bào tử hình bầu dục, chuỗi bào tử + +

đơn hoặc phân nhánh dạng xoắn

Trên môi trường PDA khuẩn lạc tròn, có

3 BNB3.8 màu trắng đục, bề mặt khuẩn lạc nhăn, tế + +

bào hình gậy, sinh bào tử

Bảng 3. 27. Khả năng đồng hóa nguồn Các bon của các nguồn vi sinh vật đối kháng

(Năm 2017)

TT Mẫu VSV Saccarose Xenlulose Glycerol Maltose D- glucose Tinh bột

++ + ++ ++ + + BHA12.2 1

++ + ++ + + + BNB3.8 2

+ ++ + + ++ ++ STL2.7 3

Các kết quả nghiên cứu hình thái khuẩn lạc, tế bào, nhuộm Gram. khả năng sử dụng

oxy và các nguồn các bon đã xác định đươc 2 mẫu VSV BHA12.2 và BNB3.8 thuộc giống

Bacillus và mẫu STL2.7 thuộc giống Streptomyces.

3.3.2.2. Định danh các vi sinh vật đối kháng bằng phương pháp PCR

Cặp mồi Phy1F và Phy1R đã được Sử dụng để xác định các nguồn BHA12.2,

BNB 3.8 và STL2.7.

Trình tự gen của 03 nguồn BHA12.2, STL2.7, BNB3.8 đã được so sánh so sánh

với các nguồn gen trên ngân hàng gen quốc tế. Trình tự gen của nguồn BHA12.2 tương

đồng 99,62% với loài Bacillus amyloliquefaciens được đăng ký với mã số Genbank

FN597644, mẫu BNB3.8 tương đồng 99,72 với loài Bacillus methylotrophicus được đăng

ký với mã số Genbank AB184285 và nguồn STL2.7 tương đồng 100% với loài

Streptomyces misionensis được đăng ký với mã số Genbank AB184285.

Bảng 3. 28. Kết quả định danh các chủng VSV đối kháng nấm Phytophthora gây bệnh

trên cây ăn quả có múi (Năm 2017)

Mã trình tự Loài Mã GenBank Mẫu VSV

Kích thước sản phẩm sau khi lắp ráp (bp) 1321 Phần trăm đồng nhất trình tự 99,62 FN597644

1436 99,72 AB184285 BNB3.8

1421 100 AB184285 STL2.7

BHA12.2 13B5ZAA012 13B5ZAA013 13B5ZAA004 13B5ZAA005 13B5ZAA024 13B5ZAA025 Bacillus amyloliquefaciens Bacillus methylotrophicus Streptomyces misionensis

Kết quả của các phản ứng sinh hóa và kỹ thuật sinh học phân tử đã xác định nguồn

BHA12.2 thuộc về vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens, nguồn BNB 3.8 thuộc về vi khuẩn

Bacillus methylotrophicus và nguồn STL2.7 thuộc về xạ khuẩn Streptomyces misionensis

3.3.2.3. Xác định mức độ an toàn sinh học của các loài vi khuẩn Bacillus

amyloliquefaciens, Bacillus methylotrophicus và xạ khuẩn Streptomyces misionensis

Theo Cộng đồng châu Âu các nhóm tác nhân sinh học, gồm vi khuẩn, vi rút, nấm,

ký sinh trùng được phân làm 4 cấp độ an toàn. Mức độ an toàn của các tác nhân sinh học

cụ thể như sau (TRBA 460, 466; 2015, 2016):

- Tác nhân sinh học có mức an toàn sinh học 1 là các tác nhân sinh học không có

nguy hiểm đối với sức khỏe người, động vật và môi trường sinh thái.

- Tác nhân sinh học có mức an toàn sinh học 2 là các tác nhân sinh học có nguy

hiểm tiềm tàng đối với sức khỏe người, động vật và môi trường sinh thái ở mức độ thấp và

hoàn toàn có thể khống chế được bằng các các biện pháp quản lý an toàn.

- Tác nhân sinh học có mức an toàn sinh học 3 là các tác nhân sinh học gây tác động

có hại ở mức độ trung bình đối với sức khỏe người, động vật và môi trường sinh thái. Các

tác động gây ra về cơ bản có thể phòng tránh được bằng các các biện pháp quản lý an toàn.

- Tác nhân sinh học có mức an toàn sinh học 4 là các tác nhân sinh học gây tác động

có hại ở mức độ cao đối với sức khỏe người, động vật và môi trường sinh thái. Các tác

động gây ra ngoài phạm vi giới hạn, hiện không có biện pháp phòng tránh.

Chỉ các sinh vật có mức an toàn ở cấp độ 1 và 2 mới được ứng dụng trong sản xuất

ở điều kiện bình thường.

Bảng 3. 29. Mức độ an toàn sinh học của các vi sinh vật đối kháng

(Năm 2017)

Thông tin nguồn mẫu TT Tên khoa học Cấp độ an toàn sinh học Cây trồng Vị trí Địa Điểm

1 Bacillus amyloliquefaciens Cam Đất Hòa An 1

(BHA12.2)

2 Bacillus methylotrophicus Quýt Đất Trà Lĩnh 1

Quýt Đất Trà Lĩnh 3 1

(BNB3.8) Streptomyces misionensis (STL2.7)

So với danh mục các vi khuẩn, vi nấm đã được phân cấp mức an toàn sinh học của

Cộng đồng Châu Âu nêu trên, 3 loài vi sinh vật đối kháng Bacillus amyloliquefaciens,

Bacillus methylotrophicus và Streptomyces misionensis được xác định thuộc nhóm tác

nhân sinh học có mức an toàn 1, là mức được ứng dụng trong sản xuất ở điều kiện bình

thường (bảng 3.29).

Bacillus là vi khuẩn có khả năng tạo bào tử và sống sót trong các điều kiện khó

khăn, được khai tác sử dụng là probiotic cho người, vật nuôi, động vật thủy sản và làm

thuốc bảo vệ thực vật sinh học (Yu và cs, 2002; Jang và cs, 2006; Chung và cs, 2008;

Shaligram and Singhal, 2010; Mardanova và cs, 2017; Keswani, 2019). Tại Việt Nam,

Bacillus đã được nghiên cứu sử dụng để kiểm soát nấm bệnh hại cây trồng (Phạm Việt

100

Cường và cộng tác viên, 2003; Vũ Thúy Nga, 2008; Lê Như Kiểu và cộng tác viên, 2011;

Nguyen và cs, 2019; Thi Phuong Hanh Tran và cs, 2019; T. H. T. Trinh và cs, 2019).

Xạ khuẩn Streptomyces đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong sản xuất từ

nhiều chục năm nay. Theo Watve và cs, (2001) khoảng 7.600/43.000 các hoạt chất sinh

học, 100.000 chất kháng sinh đang được sử dụng trong y dược và nông nghiệp được sản

xuất từ Streptomyces.

Tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu ứng dụng xạ khuẩn kiểm soát

bệnh khô vằn, đạo ôn trên lúa, bệnh thối thân trên hoa sen và bệnh trên cây cà chua (Lê

Minh Tường và Ngô Thị Kim Ngân (2014), (Nguyễn Thị Phong Lan và cộng tác viên,

2015), (Đinh Hồng Thái và Lê Minh Tường, 2016), (Nguyễn Thị Kim Cúc, 2014).

3.3.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học, nuôi cấy của các VSV đối kháng có triển vọng

Để có thể ứng dụng các vi sinh vật đối kháng vào phòng chống bệnh thối rễ, chảy

gôm cây có múi việc cần thiết phải tạo ra được một lượng lớn sinh khối của các vi sinh vật

này. Nắm rõ các đặc điểm sinh học, nuôi nhân sẽ giúp thành công trong việc tạo số lượng

lớn sinh khối.

Các đặc điểm sinh học nuôi cấy của 3 loài vi sinh vật đối kháng có triển vọng B.

amyloliquefaciens (BHA12.2), B.methylotrophicus (BNB3.8) và S. misionensis ( STL2.7)

tiếp tục được nghiên cứu

3.3.3.1. Khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào

Bảng 3. 30. Khả năng tổng hợp enzyme ngoại bào của các VSV đối kháng có triển

vọng (Năm 2017)

Đường kính vòng phân giải (mm) TT Loài Amylose Cellulose Chitin β-Glucanase

1 22,4  0,5 33,9  1,2 30,8  1,8 31,0  1,5

2 22,9  0,4 27,9  0,7 34,3  1,0 31,4  1,3

B.amyloliquefaciens BHA12.2 B.methylotrophicus BNB3.8 S. misionensis STL2.7 3 12,7  0,5 25,0  1,0 31,0  1,3 22,8  1,0

Kết quả nghiên cứu cho thấy cả 3 loài B. amyloliquefaciens (BHA12.2),

B.methylotrophicus (BNB3.8) và S. misionensis (STL2.7) đều có khả năng sinh tổng hợp

101

enzyme Amylase, Cellulase, Chitinase, β-Glucanase, trong đó đặc biệt là khả năng sinh

tổng hợp chitinase và β Glucanase là các enzyme có vai trò quan trọng trong ức chế, tiêu

diệt nấm gây bệnh hại cây trồng.

3.3.3.2. Khả năng sinh trưởng, phát triển của các VSV đối kháng trong các điều kiện nhiệt

độ, pH

* Ảnh hưởng của nhiệt độ

Các loài vi khuẩn B. amyloliquefaciens (BHA12.2), B.methylotrophicus (BNB3.8)

được nuôi nhân trên môi trường KB và xạ khuẩn S. misionensis (STL2.7) được nuôi nhân

trên môi trường Gauze và đặt ở các mức nhiệt độ 20, 25, 30, 35 và 400C kết quả trình bày

bẳng 3.31.

Bảng 3. 31. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của các loài VSV đối

kháng có triển vọng (Năm 2017)

Số lượng CFU/petri

Nhiệt độ B. amyloliquefacien B. methylotrophicus S. misionensis

(BHA12.2) (BNB3.8) (STL2.7)

132,5 c 145,8 c 128,4 c 20

254, 6 ab 257,6 ab 276,8 a 25

272,5 a 269,8 a 287,3 a 30

221,5 b 243,7 b 237,8 b 35

117,2 c 116,2 d 112,5 d 40

9,3 5,7 8,4 CV%

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột biểu thị bằng các chữ giống nhau sai khác không

có ý nghĩa ở xác suất P ≤ 0,05 theo phân tích Duncan’s.

Cả 3 loài B. amyloliquefaciens (BHA12.2), B.methylotrophicus (BNB3.8) và S.

misionensis (STL2.7) đều có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 200C đến 400C nhưng

khoảng nhiệt độ từ 25-300C thích hợp cho các VSV phát triển. Ở mức 300C số lượng tế

bào của các vi sinh vật này hình thành lớn nhất ( bảng 3.31).

102

Ảnh hưởng của pH

Các loài vi khuẩn B. amyloliquefaciens (BHA12.2), B.methylotrophicus (BNB3.8)

được nuôi nhân trên môi trường KB và xạ khuẩn S. misionensis (STL2.7) được nuôi nhân

trên môi trường Gauze và đặt ở các mức pH 5, 6, 7 và 8.

Trong môi trường axit yếu và trung tính (pH 6 - 7) cả 3 loài đều phát triển tốt

nhưng cả B. amyloliquefaciens (BHA12.2), B.methylotrophicus và S. misionensis (STL2.7)

đều phát triển thích hợp nhất trong môi trường trung tính( pH 7) lượng tế bào đạt từ 285,3-

293,6 cfu/g (bảng 3.32)

Bảng 3. 32. Ảnh hưởng của pH đến khả năng phát triển của các loài VSV đối kháng

(Năm 2017)

Số lượng CFU/petri

Nhiệt độ B. amyloliquefacien B. methylotrophicus S. misionensis

(BHA12.2) (BNB3.8) (STL2.7)

117,4 bc 122,6 b 5 142,6 b

265,7 a 277,5 a 6 267,8 a

285,1 a 293,6 a 7 288,4 a

121,4 b 104,6 bc 8 154,3 b

7,2 8,3 CV% 5,8

Hình 3. 19. . Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với sự sinh trưởng của S. misionensis

103

3.3.4. Khả năng ức chế nấm Phytophthora trong đất của các VSV đối kháng có triển

vọng

Hiệu lực ức chế nấm Phytophthora của các loài B. amyloliquefaciens (BHA12.2),

B.methylotrophicus (BNB3.8), S. misionensis ( STL2.7) và Trichoderma hazianum trong

đất, đã được thực hiện trong nhà lưới tại Viện Bảo vệ thực vật. Chậu đất chứa nấm

Phytophthora được xử lý bằng 100ml dịch 3,5 x 107 b cfu/ ml của các vi sinh vật đối

kháng. Hiệu quả ức chế nấm của các VSV đối kháng được xác định bằng mật độ của nấm

Phytophthora theo thời gian trong các công thức thí nghiêm theo phương pháp bẫy cánh

hoa hồng.

Bảng 3. 33. Hiệu quả hạn chế nấm Phytophthora trong đất của các loài VSV đối

kháng (Năm 2018)

Tỷ lệ cánh hoa hồng bị nhiễm nấm Phytophthora spp. (%) TT Loài vi sinh vật

Hiệu quả sau 3 tháng (%) 15 ngày 1 tháng 2 tháng 3 tháng

29,4ab 27,6a 25,8a 19,2a 79,42 1

30,7a 28,0a 27,3a 18,0a 80,7 2

32,7a 22,0b 20,7b 16,0b 82,9 3 B.amyloliquefaciens (BHA12.2) BNB3.8Bacillus methylotrophicus STL2.7 Streptomyces misionensis

4 Trichoderma harzianum 26,7b 21,3b 25,3a 17,3ab 81,4

5 Đối chứng (Nước cất) 95,3 94,7 96,7 93,3c -

CV (%) 6,6 8,9 7,9 10,2 -

Cả ba loài B.amyloliquefaciens (BHA12.2), B.methylotrophicus (BNB3.8), S.

misionensis ( STL2.7) và Trichoderma hazianum đều có khả năng hạn chế sự tồn tại và

phát triển của nấm Phytophthora trong đất. Sau 15 ngày xử lý đất nhiễm nấm Phtophthora

bằng các vi sinh vật đối kháng, sự tồn tại của nấm Phytophthora trong đất thí nghiệm đã

giảm rõ rệt, tại các công thức xử lý đất bằng VSV đối kháng số cánh hoa bị nhiễm nấm chỉ

104

còn 26,7-32,7% trong khi đó ở công thức đối chứng 95,3% cánh hoa đã bị nhiễm nấm (

bảng 3.33). Sau 3 tháng hiệu quả hạn chế nấm Phytophthora của xạ khuẩn Streptomyces

misionensis (mẫu STL2.7) đạt cao nhất 82,9% và vi khuẩn B. amyloliquefaciens

(BHA12.2) đạt thấp nhất 79,42% (bảng 3.33).

3.4. Đánh giá khả năng sử dụng vi sinh vật đối kháng phòng trừ bệnh Phytophthora

trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng trong hệ thống quản lý tổng hợp cây trồng

Kế thừa và ứng dụng công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học Phyto-M của Bộ môn

Bệnh cây và Miễn dịch thực vật, chế phẩm sinh học CB-1 đã được sản xuất thành công với

việc sử dụng 3 nguồn vi sinh vật đối kháng được thu thập tuyển chọn tại Cao Bằng.

Các nguồn vật liệu để sản xuất chế phẩm CB-1 bao gồm B. amyloliquefaciens

(BHA12.2)+B.methylotrophicus (BNB3.8) + S. misionensis ( STL2.7) + Trichoderma

hazianum +Saponin với tỷ lệ phối trộn

Nguồn vật liệu Tỷ lệ (%)

B: amyloliquefaciens 15%

B. methylotrophicus 15%

S. misionensis 20%

T. harzianum 40

Saponin 10%

Các nguồn vi sinh vật sử dụng để sản xuất chế phẩm đều đảm bảo mật độ 1 x 108

cfu/g. Chế phẩm sinh học CB-1 đã được đánh giá hiệu quả phòng chống nấm

Phytophthora gây bệnh thối rễ, chay gôm trên cây ăn quả có múi.

3.4.1. Khả năng trừ nấm Phytophthora của chế phẩm CB-1 ở các liều lượng khác nhau

Trong điều kiện nhà lưới chế phẩm CB-1 có tác dụng hạn chế sự phát triển của nấm

Phytophthora ở tất cả các liều lượng sử dụng (Bảng 3.34).

105

Bảng 3. 34. Khả năng trừ nấm Phytophthora của chế phẩm CB-1 ở các liều lượng

khác nhau trong nhà lưới (Năm 2018)

Liều lượng CB-1 Tỷ lệ cánh hoa hồng bị nhiễm nấm Phytophthora spp. (%) Hiệu lực trừ nấm TB sau 3 P. citrophthora M2 P. nicotianae Phyto-3 P. palmivora Phyto-1 (g/chậu) tháng (%) 1 tháng 3 tháng 1 tháng 3 tháng 1 tháng 3 tháng

2,5 28,7 20,2 c 29,6 22,5 b 28,2 23,1 b 75,85

5,0 20,6 16,4 b 21,8 15,7 c 22,6 16,5 c 82,19

10 19,7 15,8 b 18,4 14,3 c 21,7 15,8 c 83,18

Đ/C ( nước 92,5 91,4 a 92,8 90,3 a 89,8 91,2 a -

vô trùng )

CV% 12,7 11,4 13,5

Sau 1 tháng ở liều lượng sử dụng chế phẩm CB-1 thấp nhất (2,5g/chậu) tỷ lệ cánh

hoa bị nhiễm các loài nấm Phytophthora đạt từ 28,2- 29,6%, trong khi đó ở các công thức

đối chứng tỷ lệ cánh hoa bị nhiếm nấm đạt từ 89,8-92,8% (bảng 3.35). Công thức sử dụng

liều lượng 10 g/chậu tỷ lệ cánh hoa bị nhiễm nấm là thấp nhất (lần lượt là 19,7, 18,4 và

21,7% đối với P. palmivora, P. nicotianae và P. citrophthora). Sau 3 tháng, tỷ lệ cánh hoa

bị nhiễm nấm ở các công thức thí nghiệm giảm đáng kể và hiệu lực trừ nấm trung bình của

các liều lượng sử dụng 2,5, 5 và 10 g/chậu lần lượt là 75,85; 82,19 và 83,18% (bảng 3.34).

3.4.2. Khả năng trừ nấm bệnh thối rễ chảy gôm Phytophthora của chế phẩm CB-1 trên

cây ăn quả có múi

Hiệu lực trừ bệnh của các chế phẩm và thuốc trừ nấm sinh học với bệnh thối rễ,

chảy gôm Phytophthora đã được đánh giá trên vườn cam 7 – 8 năm tuổi tại xã Trưng

Vương, huyện Hòa An năm 2019, sau 6 tháng chế phẩm CB-1 có hiệu lực trừ bệnh thối rễ,

chảy gôm đạt 57,9% tương đương với các chế phẩm sinh học đang được sử dụng trong

phòng trừ nấm bệnh hại cây trồng như Bio-VAAS.1, SH-BV 1, Phyto-M. Năng suất quả

trung bình đạt 64,3 kg/cây cao hơn 2,9kg/cây so với đối chứng (báng 3.35).

106

Bảng 3. 35. Hiệu lực phòng trừ bệnh thối rễ, chảy gôm Phytophthora trên cam Trưng

Vương của chế phẩm và thuốc trừ nấm sinh học (Năm 2019)

Tỷ lệ bệnh (%)

TT Công thức

Hiệu lực (%) sau 6 tháng NSTB (kg/cây ) NSLT (tấn/h a)

1 Actinovate 1SP Trước XL 5,4 a Sau XL 3 tháng 17,3 b Sau XL 6 tháng 19,5 b 51,5 61,7 31,35

2 SH-BV 1 7,6 a 11,7 ab 17,2 ab 57,2 63,8 31,85

3 Phyto-M 8,3 a 13,8 a 16,6 a 58,7 65,7 33,15

4 Trico ĐHCT 7,2 a 16,8 b 20,8 b 48,3 61,3 31,46

5 CB-1 8,1 a 14,2 a 16,9 a 57,9 64,3 32,84

6 Bio-VAAS.1 8,0a 13,7 a 16,4 a 59,2 62,4 33,42

7 Đối chứng (không XL) 5,0a 20,5 c 40,2 c 61,4 30,5 -

CV (%) 18,2 17,6 19,5 15,9

Bảng 3. 36. Hiệu quả trừ nấm Phytophthora trên đất vườn cam của các thuốc trừ nấm

và chế phẩm sinh học (Năm 2019)

Tỷ lệ cánh hoa hồng bị nhiễm nấm Hiệu lực PT

Phytophthora spp. (%) TT Công thức sau 6 tháng

(%) Trước xử lý SXLCP 3 tháng SXLCP 6 tháng

1 Actinovate 1SP 10,0 a 19,3 b 24,7 c 63,4

2 SH-BV 1 9,3 a 16,0 ab 20,7 b 67,0

3 Phyto-M 10,7a 12,7 a 15,3 a 73,9

4 Trico ĐHCT 9,2 a 14,6 a 18, 2 b 68,9

5 CB-1 9,1 a 13,6 a 15,8 a 73,1

6 Bio-VAAS.1 9,3 a 12,3 a 14,3 a 75,2

7 Đối chứng 8,7 a 36,0 c 58,7 d -

(không XL)

Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột biểu thị bằng các chữ giống nhau sai khác không có ý nghĩa ở xác

suất P ≤ 0,05 theo phân tích Duncan’s. SXLCP: sau xử lý chế phẩm HLPT: Hiệu lực phòng trừ

CV (%) 19,3 15,7 18,4

107

Khả năng ức chế nấm Phytophthora trong đất vườn cam của các chế phẩm và thuốc

trừ nấm sinh học đã được đánh giá tại Cao Bằng. Phương pháp bẫy nấm bằng cánh hoa

hồng đã được sử dụng để xác định mật độ nấm Phytophthora tồn tại trong đất. Sau 6 tháng

xử lý, chế phẩm CB-1 có hiệu lực kiểm soát nấm Phytophthora đạt 73,1% tương đương

chế phẩm Bio-VAAS.1, Phyto-M và cao hơn so với thuốc trừ nấm sinh học Actinovate

1SP, và các chế phẩm sinh học Trico ĐHCT và SH-BV 1 (bảng 3.36).

Hiệu lực trừ bệnh của chế phẩm CB-1 đã được so sánh với với các thuốc trừ nấm

hóa học đang sử dụng tại địa phương. Trên vườn quýt 07 năm tuổi bị nhiễm bệnh thối rễ

chảy gôm nhẹ (CSB% từ 5-7%), tại Trà Lĩnh sau 6 tháng sử dụng hiệu quả phòng trừ bệnh

của chế phẩm CB-1 đạt 71,8% cao hơn so với 3 loại thuốc trừ nấm hóa học là Aliette

80WP, Rhidomil gold 68 WP và Vidoc 80WP. Chế phẩm CB-1 cũng có hiệu lực trừ bệnh

gần bằng chế phẩm Bio-VAAS.1. So với thuốc trừ nấm hóa học Agri-fos 400, hiệu quả

phòng trừ của chế phẩm CB-1 thấp hơn, nhưng an toàn hơn.

Bảng 3. 37. Hiệu lực phòng trừ bệnh thối rễ chảy gôm của một số loại thuốc trừ nấm

hóa học và các chế phẩm CB-1, Bio-VASS.1 trên quýt Trà Lĩnh (Năm 2020)

TT Phương pháp xử lý Tên thuốc BVTV CSB trước xử lý CSB sau 4 tháng Hiệu quả (%) CSB sau 9 tháng Hiệu quả (%)

1 Aliete 80 WP Quét gốc 3,91 5,35 59,12 7,16 64,85

2 3,72 5,46 56,15 8,57 55,77 Ridomil gold 68 WP Tưới vùng rễ + phun lên cây

3 Vidoc 80WP Quét gốc + Tưới vùng rễ 3,56 7,08 40,58 10,14 45,32

4 Agri-fos 400 Tiêm thân cây, phun lên lá 3,85 3,86 70,04 1,53 92,37

5 CB 1 Hòa nước tưới 3,62 6,74 44,3 5,32 71,8

6 Bio-VAAS.1 Hòa nước tưới 3,71 6,53 45,7 5,21 75,42

Ghi chú: TLB(%): Tỷ lệ bệnh, CSB(%): Chỉ số bệnh, HQPT(%): hiệu quả phòng trừ.

7 Đối chưng Tưới nước 3,92 13,12 - 20,42 -

108

Hình 3. 20. Thử nghiệm 1 số thuốc hóa học phòng trừ bệnh thối rễ chảy gôm trên

A – Tiêm thuốc Agri-fos 400; B – tưới thuốc Aliette 800WG; C – Tưới Boocđo; D – Bộ rễ phục hồi sau 9 tháng sử lý chế phẩm CB-1.

cây quýt Trà Lĩnh

Hiệu quả trực tiếp phòng chống bệnh thối rễ, chảy gôm Phytophthora trên cây cam

Trưng Vương đạt 57,9% và cây quýt Trà Lĩnh là 71,8% hiệu quả hạn chế nấm

Phytophthora trên đất vườn cây có múi đạt 73,1%. Hiệu lực của chế phẩm CB-1 tương

đương với các chế phẩm Bio-VAAS.1, Phyto-M đã được khuyến cáo trong trong phòng

trừ nấm Phytophthora gây bệnh trên cây có múi (Bảng 3.37 và hình 3.18)

Kết quả này đã gợi mở và cho phép tiếp tục nghiên cứu các phương pháp sử dụng

chế phẩm CB-1 để phòng trừ bệnh thối rễ, chảy gôm trên cây có múi tại Cao Bằng

3.4.3. Nghiên cứu sử dụng chế phẩm CB-1

3.4.3.1. Nghiên cứu phương pháp sử dụng chế phẩm CB-1

Để xác định phương pháp sử dụng chế phẩm CB-1 phòng trừ bệnh thối rễ, chảy

gôm hiệu quả nhất, một số cách sử dụng chế phẩm CB-1 đã được thử nghiệm tại Trà Lĩnh

109

(1) ủ cùng với phân hữu cơ để bón cho cây, (2) bón trực tiếp vào xung quanh tán cây và (3)

hòa chế phẩm vào nước và tưới phủ. Lượng chế phẩm được sử dụng 80g/cây. Mật độ nấm

Phytophthora trong đất vườn cây có múi đã được xác đinh theo phương pháp bẫy cánh hoa

hồng.

Bảng 3. 38. Hiệu quả của các phương pháp sử dụng CB-1 để trừ nấm Phytophthora

trong đất vườn cây ăn quả có múi (Năm 2019)

TT Phương pháp sử dụng Tỷ lệ cánh hoa hồng bị mất mầu do nhiễm nấm Phytophthora spp. (%) HQPT (%)

TXL 1 tháng 3 tháng 6 tháng

1 Ủ cùng phân chuồng bón cho cây 46,3 39,5 23,5 17,3 78,3

2 Bón trực tiếp quanh tán cây 45,4 43,7 26,2 19,3 75,2

3 Hòa chế phẩm và tưới cho cây 46,2 41,5 28,1 20,6 74,1

4 Đối chứng 46,7 96,2 86,4 80,3

Ghi chú: TXL – Trước xử lý, HQPT – Hiệu quả phòng trừ

Các phương pháp sử dụng CB-1 đều phát huy được hiệu quả hạn chế nấm

Phytophthora trong vườn cây có múi và không có sự sai khác nhiều. Sau 6 tháng hiệu quả

hạn chế nấm đạt từ 74,1-78,3% (bảng 3.38)

3.4.3.2. Xác định số lần và thời điểm sử dụng chế phẩm CB-1

Trên vườn cây có múi sử dụng chế phẩm CB-1 với số lần khác nhau trong những

thời gian khác nhau đều hạn chế được nấm Phytophthora , nhưng hiệu quả trừ nấm sẽ đạt

cao nhất khi sử dụng 3 lần trong chu kỳ sinh trưởng hàng năm của cây ở các thời điểm

sau khi thu hoạch, trước mùa mưa và cuối mùa mưa. Công thức xử lý chế phẩm CB-1

vào các thời điểm sau thu hoạch + trước mùa mưa + cuối mùa mưa có hiệu lực hạn chế

nấm Phytophthora cao nhất 79,3% (bảng 3.39).

110

Bảng 3. 39. Hiệu quả của số lần sử dụng và thời gian sử dụng chế phẩm CB-1 trừ

nấm Phytophthora trên đất vườn cây ăn quả có múi tại Cao Bằng (Năm 2019)

Tỷ lệ miếng hoa hồng bị mất mầu do HLPT nhiễm nấm Phytophthora spp. (%) TT Công thức (%) TSL 1 tháng 3 tháng 6 tháng

1 Xử lý 1 lần Sau thu 52,3 37,6 24,3 28,7 66,3

2 Xử lý 2 lần Sau thu hoạch + 40,7 21,3 13,4 19,1 71,1

3 trước mùa mưa Xử lý 3 lần Sau thu hoạch + 52,3 19,0 11,3 17,6 79,3 trước + cuối mùa mưa

4 Đối chứng 49,3 71,3 74,6 80,3

3.4.3.3. Sử dụng chế phẩm CB-1 và phân bón

Bảng 3. 40. Ảnh hưởng của phân bón và chế phẩm CB-1 tới bệnh thối rễ, chảy gôm

Phytophthora trên cam (Năm 2019)

Sau xử lý 6 Trước xử lý Sau xử lý 3 tháng Năng tháng Công suất TT thức TLB CSB TLB CSB TLB CSB (kg/cây) (%) (%) (%) (%) (%) (%)

12,42 3,24 18,34 5,28 26,27 9,36 43,64 CT1 1

14,63 3,62 20,47 6,18 31,26 11,42 50,28 CT2 2

13,47 3,42 17,29 5,54 27,18 10,25 53,17 CT3 3

12,68 2,96 21,36 6,72 33,27 11,46 35,84 CT4 4

LSD 5% ns ns ns

CV% 22,16 19,46 18,57

Ghi chú: NS. Không sai khác TLB. Tỉ lệ bệnh CSB. Chỉ số bệnh

CT1: 50 kg phân chuồng + nền nông dân (2,0 kg NPK/cây) CT2: Bón theo năng suất vụ trước(tương đương 30 kg quả/ cây) (50kg phân chuồng+1,1 kg Urê+1,4 kg lân supe+0,6 kg kaliclorua +2 kg vôi bột)/cây CT3: CT 2 + chế phẩm CB-1. CT4: Đối chứng (nền nông dân: 2,0 kg NP/cây)

111

Thí nghiệm được được bố trí tại Hòa An, trên vườn cam Trưng Vương 8 tuổi. Do

thí nghiệm được bố trí tại vườn có nền bệnh cao tỷ lệ bệnh đã lớn hơn 10%, sau 6 tháng

mặc dù có sự sai khác về mức độ bệnh ở các công thức, nhưng phân bón không có ý nghĩa

trong việc hạn chế bệnh mà chỉ có vai trò cung cấp thêm dinh dưỡng cho cây. Được cung

cấp đầy đủ dinh dưỡng hơn năng suất cam của các công thức thí nghiệm đều cao hơn năng

suất của công thức bón cho một cây 2,0 kg NPK theo nông dân. Công thức 3 tính toán

lượng phân bón theo năng suất cam vụ trước kết hợp với chế phẩm CB-1 đã giúp cây cam

đạt năng suất cao nhất (bảng 3.40).

3.4.3.4. Sử dụng chế phẩm CB-1 kết hợp với tỉa cành, tạo tán và vệ sinh đồng ruộng

Sử dụng chế phẩm CB-1 liều lượng 1kg/tấn ủ cùng phân hữu cơ trước khi bón 1

tháng. Bón phân sau khi thu hoạch với lượng 50kg/cây. Thời điểm trước mùa mưa hòa chế

phẩm với lượng 80g/cây (40kg/ha), tưới xung quanh tán cây (4l/cây). Thí nghiệm được bố

trí trên vườn 10 năm tuổi tại huyện Hòa An, mỗi công thức 30 cây. Sau 6 tháng thí nghiệm

ở công thức sử dụng chế phẩm kết hợp với tỉa cành và công thức tỉa cành, và vệ sinh

vườn, bón chế phẩm CB-1 đã hạn chế nấm Phytophthora, hiệu quả giảm nguồn nấm trong

đất đạt 70,8 - 73,9%. Công thức tỉa cành và vệ sinh vườn nhưng không sử dụng chế phẩm

đạt hiệu quả giảm nguồn nấm Phytophthora từ 31,4 – 35,9%.

Bảng 3. 41. Hiệu lực phòng trừ nấm Phytophthora của chế phẩm CB-1 kết hợp với

biện pháp cắt tỉa, vệ sinh vườn (Năm 2019)

Tỷ lệ cánh hoa hồng bị mất mầu do bị nhiễm nấm Phytophthora spp. (%) Công TT Trước thí Sau 1 Hiệu quả Sau 3 Hiệu Sau 6 thức Hiệu quả (%) nghiệm tháng TN (%) tháng TN quả (%) tháng TN

1 CT1 15,3 20,2 11,6 41,7 21,1 49,6 31,4

2 CT2 14,3 18,3 16,4 37,3 24,5 43,3 35,9

3 CT3 14 10,3 51,9 16,3 66,3 19,3 70,8

4 CT4 14,7 9,1 59,6 15,6 69,2 18,1 73,9

Ghi chú: CT1 - Chỉ cắt tỉa; CT2 – Cắt tỉa + Vệ sinh vườn; CT3 – Cắt tỉa + CB-1; CT4 – Cắt tỉa +

vệ sinh vườn + CB-1. Vệ sinh vườn gồm làm cỏ, loại bỏ cây tạp, quét vôi toàn bộ gốc và thân cây.

5 Đ/C 16 24,5 55,3 75,6

112

3.4.4. Đề xuất một số biện pháp quản lý tổng hợp bệnh thối rễ chảy gôm theo hướng

sinh học trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng.

Trên cơ sở hướng dẫn của Cục Bảo vệ thực vật về các biện pháp kỹ thuật phòng

chống bệnh Greening, bệnh vàng lá thối rễ và bệnh Tristeza hại cây ăn quả có múi và các

kết quả nghiên cứu trong khuôn khổ đề tài luận án, quy trình sử dụng vi sinh vật đối kháng

trong quản lý tổng hợp bệnh do nấm Phytophthora gây hại trên cây ăn quả có múi tại Cao

Bằng được đề xuất như sau:

Chuẩn bị đất trồng

Chọn đất có khả năng thoát nước, Các vườn gần chân núi đá, sông suối phải thiết kế

hệ thống thoát nước xung quanh vườn giúp thoát nước nhanh trong mùa mưa. Đất trồng lại

cần xử lý bằng vôi bột 20-30 ngày trước trồng.

Trồng mới

Cây giống Sử dụng cây giống sạch bệnh sử dụng cây được ghép trên gốc chấp là

gốc ghép có khả năng kháng với nấm Phytophthora, không dùng cây ghép trên gốc bưởi.

Kiểm tra kỹ bộ rễ trước khi trồng

Thời kỳ kiến thiết cơ bản từ 1 - 3 năm tuổi

+ Bón phân: Mỗi gốc bón 50kg phân hữu cơ + 01kg phân lân + 01kg vôi + 80g chế

phẩm sinh học CB-1 hoặc 1kg/tấn phân hữu cơ (ủ trước khi bón 1 – 2 tháng), bón vào giai

đoạn tháng 1 - 2 hàng năm.

Hòa phân đạm hoặc NPKvới nước để tưới 3 lần, vào tháng 3, 6 và tháng 12.

+Đốn tỉa tạo khung tán cho cây: Sau trồng 20 - 30 ngày, cắt ngọn cho cây phân

cành cấp 1 (từ vị trí mắt ghép trở lên khoảng 30 - 40 cm), chọn 3 cành cấp 1 khoẻ, phát

triển theo ba hướng tương đối đồng đều nhau, khi cành bánh tẻ, cắt ngọn cành cấp 1 để

phân cành cấp 2, tiếp tục cắt ngọn cành cấp 2 để hình thành cành cấp 3. Cành cấp 3 không

hạn chế về số lượng và chiều dài nhưng cần loại bỏ các cành mọc quá dày hoặc yếu.

+ Chăm sóc, phòng trừ sâu bệnh: Làm cỏ trong tán cây, cắt bỏ cành sát mặt đất,

cành sâu bệnh, thu gom, tiêu hủy tàn dư bệnh.

113

Thời kỳ kinh doanh

+ Bón phân: Liều lượng 50kg phân hưu cơ + 1,1 kg Urê + 1,4 kg lân supe + 0,6 kg

kaliclorua + 2 kg vôi bột cho 1 cây. Ủ phân hữu cơ cùng chế phẩm sinh học CB-1 với liều

lượng 1kg/tấn trước khi bón tối thiểu 1 tháng.

Thời điểm bón

Lần 1 (Sau khi thu hoạch, tháng 9): 100% phân hữu cơ + 100% P

Lần 2 (Trước khi ra hoa, tháng 1): 40% N + 30% K

Lần 3 (Vừa tắt hoa, tháng 3): 30% N + 30% K

Lần 4 (Sau đậu trái 8 tuần, tháng 5): 30% N + 40% K

Cách bón:

Bón phân hữu cơ: Đào các rãnh hình vành khăn hoặc các hố xung quanh rìa tán

cây, kích thước 30x30x30cm, bón phân, lấp đất và tưới nước.

Bón phân vô cơ: Xới nhẹ đất, rải phân theo hình chiếu của tán sau đó tưới ẩm.

Có thể sử dụng thêm phân bón qua lá và các sản phẩm phân bón vi lượng.

Đốn tỉa

Đốn tỉa sau thu hoạch: tháng 11-12 sau khi thu hoạch quả, cắt bỏ cành sâu bệnh,

các cành mọc ở giữa tán và cành xiên vào trong tán, cành đã cho quả, cành mọc thẳng ở

giữa thân cây,

Đốn tỉa vụ xuân: từ tháng 1- 3, cắt bỏ lộc xuân chất lượng kém, cành sâu bệnh, cành

mọc trong tán, những chùm hoa nhỏ, dày và nụ hoa dị hình.

Đốn tỉa vụ hè: từ tháng 4- 6, cắt bỏ cành hè mọc quá dày và yếu, cành sâu bệnh,

cành vượt, tỉa bỏ quả nhỏ, dị hình và tỉa thưa chùm quả dày.

Chăm sóc, Vệ sinh đồng ruộng

Làm cỏ trong tán cây, cắt bỏ cành sát mặt đất, cành sâu bệnh, thu gom, tiêu hủy tàn

dư bệnh.

Hàng năm rải vôi bột với lượng dùng 500kg/ha, rải 02 lần trên toàn bộ trên bề mặt

vườn, lần 1 sau thu hoạch, lần 2 trước mùa mưa để vệ sinh vườn, giảm nguồn nấm

Phytophthora trong đất, tăng độ pH đất.

114

Phòng trừ sâu bệnh

Loại bỏ những cây bị sâu, bệnh hại nặng không có khả năng phục hồi, xử lý đất

bằng vôi bột với lượng 1-2kg/ gốc.

Quét gốc và thân cây bằng vôi hay boocdo quét từ phần gốc sát mặt đất lên cao 1 –

1,2m

Biện pháp sinh học

Đối với các vườn cây chưa bị bệnh thối rễ chảy gôm: Hàng năm, sử dụng chế phẩm

sinh học CB-1 ủ cùng phân hữu cơ để bón cho cây sau thu hoạch.

Khi cây bị bệnh thối rễ, chảy gôm cần bón bổ sung chế phẩm sinh học CB-1 với

liều lượng bón khoảng 80g/cây/lần bón, rải hoặc hòa chế phẩm tưới xung quanh tán cây 3

lần/năm vào các thời điểm sau thu hoạch, đầu mùa mưa (T3,4) và cuối mùa mưa (T8,9).

Biện pháp hóa học

Chỉ sử dụng thuốc khi bệnh bùng phát mạnh, sử dụng các thuốc: Ridomil gold

68WP 2%; Agri fos 400; Aliette 80 WP 2% tưới 02 lần xung quanh tán cây, lần 2 cách lần

1 khoảng 20 ngày. Nồng độ thuốc pha theo khuyến cáo của nhà sản xuất.

Sau khi sử dụng thuốc hóa học từ 20 - 30 ngày, nên sử dụng chế phẩm sinh học CB-

1 để giúp phòng chống bệnh lâu dài và hiệu quả hơn cho cây.

Thu hoạch

Thời gian thu hoạch

Thời gian thu hoạch bắt đầu từ cuối tháng 11 đến tháng 1 năm sau. Việc để quả trên

cây và thu hoạch kéo dài có ảnh hưởng lớn đến quá trình phân hóa mầm hoa của cây để

cho quả vào năm sau.

Cam, quýt được xác định thuộc nhóm quả không tiếp tục chín sau thu hoạch do đó

cần thu hoạch đúng độ chín, khi vỏ quả vàng sậm, nhiều nước, có vị ngọt nhiều hơn chua,

túi tinh dầu trên vỏ nở, tùy theo mục đích bảo quản mà thu hái vào giữa hoặc cuối vụ.

Thu hoạch lúc trời mát, tránh nắng gắt làm các tế bào tinh dầu căng dễ vỡ. Không

thu hái khi thời tiết ẩm ướt, đặc biệt là lúc trời mưa hoặc sáng sớm khi chưa tan hết sương

vì quả dễ bị ẩm thối khi tồn trữ, các vi sinh vật có hại dễ dàng xâm nhập vào quả.

115

Phương pháp thu hoạch

Quá trình thu hái trên cây phải nhẹ nhàng, cẩn thận, không làm tổn thương đến bề

mặt của quả, không sử dụng những quả đã bị rơi xuống đất. Cắt cuống sát quả để tránh

cuống làm tổn thương đến các quả khác trong quá trình vận chuyển và bảo quản. Sử dụng

các dụng cụ thu hoạch như kéo cắt, kéo cắt liền giỏ để thu hoạch quả trên cao, không được

để rơi quả xuống đất. Khi thu hoạch nên mang bao tay vải. Các dụng cụ sau khi thu hoạch

phải lau chùi sạch sẽ để vào chỗ ngăn nắp.

Không để quả dưới nắng, vận chuyển nhanh nhất về nơi tập kết, tránh làm tổn

thương quả trong quá trình vận chuyển.

Xử lý quả sau thu hoạch

Cần phân loại quả trước khi đem đi tiêu thụ, cam, phân loại theo kích thước, trọng

lượng quả, loại bỏ quả bị dập, hỏng, có vết côn trùng cắn, trầy xước, thâm đen trên vỏ,...

Vệ sinh quả để loại bỏ chất bẩn bám dính trên vỏ quả, kể cả dư lượng hóa chất hay

phân bón qua lá. Rửa quả giúp loại bỏ một phần các vi sinh vật và nấm bệnh trên quả.

116

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

Tại Cao Bằng đã phát hiện được 13 loài sịnh vật gây hại trên cây ăn quả có múi.

Bệnh thối rễ, chảy gôm được xác định là bệnh hại chính quan trọng trên cây ăn quả có múi

tại Cao Bằng. Bệnh do các loài nấm Phytophthora gây ra. Bệnh gây hại trên tất cả các

vùng trồng cây ăn quả có múi ở Cao Bằng nhưng nặng nhất ở Trà Lĩnh.

Bệnh thối rễ, chảy gôm Phytophthora gây hại trên cây cam, quýt, bưởi vào tất cả

các tháng trong năm nhưng gây hại mạnh nhất vào mùa mưa, từ tháng 8 đến tháng 11. Cây

vào giai đoạn kinh doanh bị bệnh nặng hơn so với cây giai đoạn vườn ươm và kiến thiết cơ

bản. Mức độ bệnh của vườn cây ăn quả có múi tỉ lệ thuận với tuổi cây.

Từ 375 mẫu đất và các mẫu cam, quýt, bưởi bị bệnh thu thập được ở các vùng trồng

cây ăn quả có múi khác nhau của Cao Bằng đã phân lập được 142 mẫu nấm Phytophthora.

Đã xác định được 3 loài nấm Phytophthora palmivora, P. nicotianae và P. citrophthora. là

tác nhân gây bệnh thối rễ, chảy gôm trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng.

Nấm P. palmivora sinh trưởng, phát triển và hình thành bọc bào tử thích hợp nhất ở

nhiệt độ 250C, nấm P. nicotinanae là 300C nấm P. citrophthora phát triển tốt nhất ở nhiệt

độ 200C. Môi trường V8A, CRA và PDA, khoảng pH từ 6-7 thích hợp cho sự phát triển

của cả 3 loài.

Từ 60 mẫu đất của các vườn cây ăn quả có múi ở Cao Bằng đã phân lập và tuyển

chọn được 2 loài vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens (BHA12.2), B. methylotrophicus

(BNB3.8) và 1 loài xạ khuẩn Streptomyces misionensis (STL2.7) có khả năng hạn chế sinh

trưởng phát triển của nấm Phytophthora trong môi trường nuôi cấy từ 82,2-85,7%. Các

loài vi sinh vật này sinh trưởng và phát triển thích hợp trong khoảng nhiệt độ từ 25-300C

và pH 7. Trong đất nhà lưới sau 3 tháng hiệu quả hạn chế nấm Phytophthora của chế phẩm

CB-1 được sản xuất từ 3 loài B. Methylotrophicus, S. misionensi và T. harzianum ở các

liều lượng 2,5; 5,0 và 10,0g/chậu đạt từ 75,85 – 83,18%.

Chế phẩm CB-1 có hiệu lực trừ bệnh thối rễ chảy gôm trên cam Trưng Vương là

57,9% và hạn chế nấm Phytophthora trong đất vườn cam là 73,1%. Sau sử dụng 9 tháng

117

trên cây quýt Trà Lĩnh chế phẩm CB-1 có hiệu quả phòng trừ bệnh thối rễ, chảy gôm là

71,8%.

Chế phẩm CB-1 có thể sử dụng để phòng chống bệnh thối rễ, chảy gôm bằng cách ủ

với phân hữu cơ, bón trực tiếp cho cây hay hòa nước tưới cho cây. Sử dụng chế phẩm CB-

1, ba lần vào các thời gian sau khi thu hoạch, trước mùa mưa và sau mùa mưa có hiệu quả

phòng trừ nấm trong đất vườn đạt 79,3%. Cắt tỉa, vệ sinh vườn, bón phân hợp lý kết hợp

với chế phẩm CB-1 có hiệu quả phòng trừ nấm trong đất vườn trên vườn cây ăn quả có

múi đạt 73,9% và tăng năng suất quả.

2. Đề nghị

Tiếp tục đánh giá, nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm CB-1 phòng

trừ nấm Phytophthora gây bệnh thối rễ, chảy gôm trên cây ăn quả có múi và các cây trồng

khác

Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình quản lý bệnh thối rế, chảy gôm trên cây ăn

quả có múi tại Cao Bằng theo hướng hữu cơ bền vững, an toàn thực phẩm

118

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN

LUẬN ÁN

1. Nguyễn Thị Bích Ngọc, Nguyễn Nam Dương, Phạm Thị Dung, Lê Mai Nhất, Đỗ

Duy Hưng, Ngô Thị Thanh Hường (2016), “Quản lý bệnh thối gốc, thối rễ trên quýt

Trà Lĩnh tại Cao Bằng”, Tạp chí bảo vệ thực vật, số 1 (264), ISSN 2354 – 0710, tr

39 - 45.

2. Nguyễn Nam Dương, Ngô Thị Thanh Hường, Vũ Duy Minh, Hà Minh Thanh, Hà

Viết Cường (2021), “Kết quả nghiên cứu vi sinh vật đối kháng nấm Phytophthora

spp. gây bệnh trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng”, Tạp chí bảo vệ thực vật, số 4

(297), ISSN 2354 – 0710, tr. 3 - 8.

3. Nguyễn Nam Dương, Hà Minh Thanh, Nguyễn Thị Bích Ngọc, Ngô Thị Thanh

Hường, Vũ Duy Minh, Hà Viết Cường, Phạm Bích Hiên (2021), “Xác định nấm

Phytopthora spp. gây bệnh thối rễ, chảy gôm trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng”,

Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, số 11 (132), ISSN 1859 –

1558, tr 82 – 91.

4. Nguyễn Nam Dương, Hà Minh Thanh, Nguyễn Thị Bích Ngọc, Ngô Thị Thanh

Hường, Vũ Duy Minh, Hà Viết Cường, Phạm Bích Hiên (2021), “Khả năng sử

dụng tổ hợp vi sinh vật đối kháng CB-1 phòng trừ bệnh thối rễ chảy gôm do nấm

Phytopthora trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ

Nông nghiệp Việt Nam, số 11 (132), ISSN 1859 – 1558, tr 92 – 99.

119

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Bealing F.J., Nguyễn Minh Thảo (1997), Bệnh đốm dầu trên lá cam quýt, Kết quả

nghiên cứu khoa học về rau quả (1995-1996), NXB Nông nghiệp, tr. 67 - 70.

2. Đặng Vũ Thị Thanh, Mai Văn Quân, Vũ Duy Hiện, Lê Thị Thanh Thuỷ, Trịnh Xuân Hoạt, Đặng Đức Quyết, Nguyễn Thị Mai Chi, Ngô Gia Bôn (2010), Báo cáo điều tra cơ bản bệnh hại cây trồng từ năm 2006-2010, Viện Bảo vệ thực vật.

3. Đặng Vũ Thị Thanh, Hà Minh Trung (1997), “Phương pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật, tập 1, Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại cây trồng nông nghiệp và thiên địch của chúng”, NXB Nông nghiệp, tr 46 - 57.

4. Đặng Thùy Linh và Nguyễn Văn Hòa (2004), “Khả năng đối kháng và đặc tính phát triển của ba dòng nấm Trichoderma và ba dòng nấm Phytophthora phân lập từ sầu riêng, nhãn, dứa”, Báo cáo Khoa học, Viện NC CAQ Miền Nam.

5. Đinh Hồng Thái và Lê Minh Tường (2016), “Khảo sát khả năng đối kháng của xạ khuẩn đối với nấm Phytophthora sp. gây bệnh cháy lá, thối thân trên cây sen”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ số 3, tr 20 – 27.

6. Dương Minh và cộng sự (2003), “Khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp. nội địa đối với bệnh thối rễ cam quýt do nấm Fusarium solani tại đồng bằng sông Cửu Long”, Tạp chí khoa học Đại học Cần thơ, số 4 (12), tr.1-9. 7. Hà Minh Trung, Lê Văn Thuyết và Đặng Vũ Thị Thanh (1999), “Kết quả điều tra

bệnh cây ở các tỉnh phía Nam 1977-1979”, Nxb Nông nghiệp.

8. Hà Minh Thanh, Vũ Phương Bình, Trần Ngọc Khánh, Lê Thu Hiền, Nguyễn Văn Dũng (2013), “Nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh Phytophthora trên cây ăn quả có múi, xoài, sầu riêng và hồ tiêu”, Tạp chí Bảo vệ thực vật, số 6, tr. 42-48.

9. Huỳnh Văn Thành, Lê Ngọc Bình, Nguyễn Minh Châu (2003), “Kết quả phòng trừ bệnh Phytophthora gây thối rễ và chảy nhựa thân cây sầu riêng bằng phương pháp bơm thuốc Phosphonate”, Kỷ yếu Hội thảo khoa học BVTV phục vụ chuyển đổi cơ cấu cây trồng ở các tỉnh phía Nam và Tây nguyên, tr 98 – 103.

10. Lê Minh Tường và Ngô Thị Kim Ngân (2014), “Phân lập và đánh giá khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn đối với nấm Rhizoctonia solani Kunh gây bệnh đốm vằn trên lúa”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ số 4, tr 113 – 119.

11. Lê Minh Tường, Đinh Công Chánh, Nguyễn Trường Sơn (2018), “Đánh giá khả năng phòng trị của các chủng xạ khuẩn đối với bệnh vàng lá thối rễ cây có múi”, Tạp chí Bảo vệ thực vật số 3, tr 37 – 45.

120

12. Lê Thu Hiền, Trần Ngọc Khánh, Vũ Thị Phương Bình, Nguyễn Văn Dũng, Hà Minh Thanh (2014), “Nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học phòng trừ nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo vàng cà chua và dưa chuột”, Tạp chí Bảo vệ thực vật, số 4, tr 33-39.

13. Lê Thị Thu Hồng và Aubert B. (1996), Phòng chống bệnh nguy hiểm trên cây có múi

để mang lại hiệu qủa cho nhà vườn ở Việt Nam, NXB Nông nghiệp, tr.1-18.

14. Mai Văn Trị và Nguyễn Thị Thúy Bình (2003), “Ảnh hưởng của phân bón hữu cơ đối với sinh trưởng, năng suất và bệnh Phytophthora trên cây sầu riêng”, Kỷ yếu Hội thảo khoa học Bảo vệ thực vật phục vụ chuyển đổi cơ cấu cây trồng ở các tỉnh phía Nam và Tây Nguyên, tr 38 – 44.

15. Mai Văn Trị và Nguyễn Thị Thúy Bình (2003), “Phòng trừ bệnh Phytophthora trên cây sầu riêng bằng phương pháp tiêm thân với Phosphonate ở miền Đông Nam Bộ”, Kỷ yếu Hội thảo khoa học BVTV phục vụ chuyển đổi cơ cấu cây trồng ở các tỉnh phía Nam và Tây nguyên, tr 146 – 153.

16. Mai Văn Trị, Nguyễn Lộc Hiền, Nguyễn Thị Nguyên Vân, Huỳnh Kỳ (2016), “Phytophthora cinnamomi Rands gây thối rễ và loét thân cây bơ ở miền Đông Nam Bộ”. Tạp chí Khoa học – Trường Đại học Cần Thơ, 45b, tr 64-69.

17. Ngô Hồng Bình và CS (2011), “Nghiên cứu xác định nguyên nhân và biện pháp khắc phục hiện tượng suy giảm năng suất, chất lượng bưởi Phúc Trạch tại Hương Khê - Hà Tĩnh”, Báo cáo thực hiện đề tài, Viện Nghiên cứu Rau quả.

18. Nguyễn Minh Châu (2009), “Sử dụng chế phẩm Trichoderma để phòng trừ sâu bệnh

cho vườn cây ăn quả”, Website:http://www.phanbonmiennam.com.vn.

19. Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ vi sinh vật, tập 1, NXB Quốc Gia TP Hồ Chí

Minh.

20. Nguyễn Thị Kim Sơn và cs. (2003),“Bệnh chảy gôm do nấm Phytopthora sp. hại trên cây ăn quả có múi ở một số tỉnh miền Bắc và biện pháp phòng chống”, Báo cáo kết quả thực hiện đề tài, Viện Nghiên cứu Rau quả.

21. Nguyễn Nhật Tâm (2010), Một số biện pháp phòng trừ bệnh vàng lá gân xanh trên

cây có múi, Website: http://nimbivip.com 22. Nguyễn Vĩnh Trường (2008), "Kỹ thuật bẫy và

theo dõi nguồn bệnh Phytophthora gây bệnh thối gốc rễ cây hồ tiêu ở trong đất", Tạp chí Bảo vệ Thực Vật, 4 (2008), tr. 13-16.

23. Nguyễn Văn Tuất, Phạm Ngọc Dung (2012), Nghiên cứu nấm Phytophthora gây bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu và biện pháp quản lý bệnh hại tổng hợp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

24. Nguyễn Xuân Cảnh, Lê Thị Chinh, Phạm Hồng Hiển, Trịnh Thị Vân (2018), “Tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng

121

nấm Aspergillus flavus gây bệnh trên cam quýt”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 18 (6), tr: 154-161.

25. Phạm Ngọc Dung, Ngô Vĩnh Viễn, Nguyễn Văn Tuất, Nguyễn Thị Ly (2007), “Nghiên cứu phân lập, giám định nấm Phytophthora capsici từ đất và rễ gây bệnh chết nhanh (thối rễ) cây hồ tiêu tại Đắk Nông”, Tạp chí Khoa học và công nghệ thuộc Sở KH & CN tỉnh Đắk Nông.

26. Phạm Ngọc Dung, Ngô Vĩnh Viễn và CTV (2008), “Một số kết quả phòng trừ bệnh chết nhanh gây hại hồ tiêu tại Đăk Nông”, Tạp chí Bảo vệ thực vật, số 3, tr.15-21. 27. Phạm Thị Dung, Nguyễn Thị Bích Ngọc và CTV (2015), “Hiệu quả của một số loại thuốc hóa học phòng trừ bệnh chảy gôm do nấm Phytophthora citrophthora trên bưởi Thanh Trà tại Thừa Thiên Huế”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 01 (55), tr 53-59.

28. Phạm Thị Dung, Nguyễn Thị Bích Ngọc, Hà Viết Cường và CTV (2015), “Kết quả xác định loài nấm Phytophthora sp. Gây bệnh chảy gôm trên bưởi Thanh Trà tại Thừa Thiên Huế”, Tạp chí Bảo vệ thực vật, số 1, tr 11-15.

29. Phạm Hồng Hiển, Nguyễn Thị Chúc Quỳnh, Phùng Quang Tùng, Bạch Thị Điệp, Nguyễn Xuân Cảnh, “Nấm Phytophthora gây bệnh trên cây cam tại một số vùng trồng chính của Việt Nam”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 08 (129), tr 61-67.

30. Phạm Hồng Hiển, Đào Ngô Tú Quỳnh, Nguyễn Thị Diệu Hương, Nguyễn Thị Chúc Quỳnh, Phùng Quang Tùng, Bạch Thị Điệp, Nguyễn Xuân Cảnh (2019), “Tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm của chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với nấm Phtophthora gây bệnh trên một số loại cây ăn quả”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam, số 12 (109), tr 170-174.

31. Phạm Thị Vượng và CS (2008), Tuyển tập công trình nghiên cứu và chuyển giao

công nghệ, NXB Nông nghiệp, tr 46-47.

32. Rae D.J, Beattie G.A.C., Nguyễn Văn Tuất, Nguyễn Văn Cảm, Phạm Văn Lầm, Dương Anh Tuấn (2003), Sử dụng dầu khoáng làm vườn và dầu khoáng nông nghiệp trong phòng trừ tổng hợp sâu bệnh hại cây ăn quả có múi. NXB Nông nghiệp.

33. Trần Kim Loang, Đào Thị Lan Hoa, Lê Đăng Khoa, Hà Thị Mão, Lê Đình Đôn, Tạ Thanh Nam, Ngô Thị Xuân Thịnh (2006), "Nghiên cứu bệnh do nấm trên một số cây công nghiệp và cây ăn quả", Báo cáo đề tài trọng điểm cấp Bộ 2001- 2005, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.

34. Viện Bảo vệ thực vật (1976), Kết quả điều tra côn trùng và bệnh hại trên cây trồng ở

các tỉnh phía Bắc 1967-1968, NXB Nông nghiệp, 469 tr.

35. Viện Bảo vệ thực vật (1999), Kết quả điều tra côn trùng và bệnh hại trên cây trồng ở

các tỉnh phía Nam 1977-1978, NXB Nông nghiệp, 164 tr

122

36. Vũ Công Hậu (1996), “Trồng cây ăn quả ở Việt Nam” NXB Nông nghiệp, tr.100 -

146.

Tài liệu tiếng Anh

37. Agrios G.N. (2005), Plant Pathology. 5th ed. Elsevier, New York. 38. Alvarez L.A, Vicent A, De la Roca E, Bascón J, AbadCampos P, Armengol J. (2008a), “Branch cankers on citrus trees in Spain caused by Phytophthora citrophthora”, Plant Pathol.; 57, pp. 84–91.

39. Alvarez L.A, Vicent A, De la Roca E, Bascón J, AbadCampos P, Armengol J. (2008b), “Comparison of application methods of systemic fungicides to suppress branch cankers in Clementine trees caused by Phytophthora citrophthora”, Plant Dis., 92, pp.1357–1363.

40. Alvarez L.A, Gramaje D, Abad-Campos P, GarcíaJiménez, J. (2009), “Seasonal susceptibility of citrus scions to Phytophthora citrophthora and P. nicotianae and the influence of environmental and host-linked factors on the infection development”, Euro. J. Plant Pathol.; 124, pp. 621–635.

41. Aryantha, I.P., Cross, R. and Guest, D.I. (2000), “Suppression of Phytophthora cinnamomi in potting mixes amended with uncomposted and composted animal manures”, Phytopathology, 90, pp.775–782.

42. Ashby S.F. (1929), "Strains and taxonomy of Phytophthora palmivora Butler (P.

faberi Maubl.", Transactions of the British Mycological Society, 14 pp

43. Blair J.E., Coffey M.D., Park S.Y., Geiser D.M., Kang S. (2008), "A multi-locus phylogeny for Phytophthora utilizing markers derived from complete genome sequences", Fungal Genetics and Biology, 45, pp. 266–277.

44. Brasier, C.M. (2009), “Phytophthora biodiversity: how many Phytophthora species are there?” In: Goheen EM, Frankel SJ, eds. Phytophthoras in Forests and Natural Ecosystems. Albany, CA, USA: USDA Forest Service: General Technical Report PSW-GTR-221, pp.101–15.

45. Bubici, G., (2018). Streptomyces spp. as biocontrol agents against Fusarium species.

CAB Reviews 13, No. 050.

46. CABI (2019), Invasive Species Compendium. https://www.cabi.org/isc/datasheet/40958

47. Cacciola S.O., Pane A., Faedda R., Rizza C., Badalà F., di San Lio G.M. (2011), "Bud and root rot of windmill palm (Trachycarpus fortunei) caused by simultaneous infections of Phytophthora palmivora and P. nicotianae in Sicily", Plant Disease, 95, pp. 769.

123

48. Castle, W.S. (1987), Citrus rootstocks, in Rootstockfor Fruit Crops (ROM, R.C. &

CARLSON, R.F., Eds.) John Wiley and Sons, New York, USA, pp. 361-399.

49. Chambers, S.M., and Scott, E.S. (1995), “In vitro antagonism of Phytophthora cinnamomi and Phytophthora citricola by isolates of Trichoderma spp. and Gliocladium virens”, Journal of Phytopathology, 143, pp.471-477.

50. Choudhari, R. J., Gade, R. M., Lad, R. S., Adinarayana, J., Phanindra, K. B. V. N. (2018), “Epidemiological Relations to Phytophthora Spp. Causing Citrus Root Rot in Nagpur Mandarin”, Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci. Special Issue-6, pp. 406-417 51. Cohen, Y. and Coffey, M.D. (1986), “Systemic fungicides and the control of

Oomycetes”, Annual Review of Phytopathology, 24, pp.311-338.

52. Cooke D.E.L, Duncan J.M. (1997), “Phylogenetic analysis of Phytophthora species based on ITIS1 and ITIS2 sequences of ribosomal RNA gene repeat”, Mycol Res.; 101, pp. 667-77.

53. Cooke DEL, Drencht A, Duncan JM, Wagels G, Brasier CM. (2000), “A molecular phylogeny of Phytophthora and related oomycetes”, Fungal Genet Biol.,30,pp.17-23. 54. Crawford, A.R, Bassam, B.J, Drenth A, Maclean DJ, Irwin JAG. (1996), “Evolutionary relationships among Phytophthora species deduced from rDNA sequence analysis”, Mycol Res, 100, pp. 437-43.

55. Dalan, B., Abdelhak, T., Anas, F., Allal, D. and Hamid, B. (2016), “Influence of citrus rootstocks on soil population of phytophthra in the Gharb region in Morocco”, Int. J. of Recent Scientific Research. Vol. 7, Issue, 11, pp. 14230-14236.

56. Damalas, CA. and Koutroubas, SD. (2018). Current Status and Recent Developments in Biopesticide Use. Agriculture 2018, 8, 13; doi:10.3390/agriculture8010013. 57. Đặng Vũ Thị Thanh, Ngô Vĩnh Viễn, André Drenth (2004) . Phytophthora diseases in Viêt Nam. Diversity and Management of Phytophthora in Southeast Asia. Australian Center for International Agricultural Research, Canbera , p 83 – 89

58. Das, R., Mondal, B., Mondal, P., Khatua, D. C. and Mukherjee, N. (2014), Biological management of citrus canker on acid lime through Bacillus subtilis (S-12) in West Bengal, India.

59. David, I.G., André Drenth (2004), Principles of Phytophthora Disease Management. Diversity and Management of Phytophthora in Southeast Asia, pp.154-160, Edited by André Drenth and David I. Guest ACIAR Monograph 114 (printed version published in 2004) 154-238 pp.

60. Drenth A., Sendall B. (2001), Practical guide to detection and identification of Phytophthora, Version 1.0, CRC for Tropical Plant Protection, Brisbane, pp.1-42

124

61. Drenth A., Guest D.I. (2004), "Principles of Phytophthora diseases management", in Southeast Asia, ACIAR

Diversity and Management of Phytophthora Monograph, Canbera, Australia, 114, pp. 154-160.

62. Drenth A., Wagels G., Smith B., Sendall B., O‘Dwyer C., Irvine G., Irwin J.A.G. (2006), "Development of a DNA-based method for detection and identification of Phytophthora species", Australasian Plant Pathology, 35, pp. 147-159.

63. Duncan J.M., Cooke D.E.L. (2002), "Identifying, diagnosing and detecting

Phytophthora by molecular methods", Mycologist, 16, pp. 59-66.

64. Duniway JM. (1983), “Role of physical factors in the development of Phytophthora diseases”, In: Erwin DC, Bartnicki-Garcia S, Tsao PH, editors. Phytophthora: Its Biology, Taxonomy, Ecology and Pathology. American Phytological Society St. Paul, MN: Am. Phytopathological Society, p. 562.

65. Erwin, D. and Donald C. (1983), Phytophthora: its biology, taxonomy, ecology, and pathology, American Phytopathological Society Press, St. Paul, Minnesota, ISBN 0- 89054-050-0

66. Erwin, D. and Ribeiro O.K. (1996), Phytophthora Diseases Worldwide, The

American Phytopathological Society, Minnesota, USA. pp. 562.

67. Fang, J.G. and Tsao, P.H. (1995), “Efficacy of Penicillium funiculosum as a biological control agent against Phytophthora root rots of azalea and citrus”, Phytopathology, 85, pp.871-878.

68. FAO. (2016), Citrus Fruit – Fresh and Processed Statistical Bulletin. 69. Francis C. B. and Vicent, A. (2015), “Gummosis of citrus in Ghana caused by

Phytophthora citrophthora”, Australasian Plant Dis. Notes 10

70. Gade, R. M. (2012), “Biological and chemical management of Phytophthora root rot

/collar rot in citrus nursery”, The Bioscan, 7(4), pp.631- 635.

71. Gade, R. M. and Lad, R. S. (2016), An overview of citrus disease management in reference to climate change. In: Citrus Production Technology. 2, pp. 95-111. 72. Gade, R.M. and Lad, R.S. (2018), “Biological Management of Major Citrus Diseases in Central India-A Review”, Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci. Special Issue-6, pp.296- 308.

73. Gilles B, Katarzyna C, Bastien C, Tomasz O and Francois L. (2015), Biocontrol Endotherapy with Trichoderma spp. and Bacillus amyloliquefaciens against Phytophthora spp.: a Comparative Study with Phosphite Treatment on Quercus robur and Fagus sylvatica. 12 pages.

74. Graham JH, Menge JA. (1999), Root health: Fungal diseases. In: Timmer LW, Duncan LW, editors. Citrus health management. St. Paul (MN): APS Press. pp.126- 135.

125

75. Graham JH, Menge JA. (2000), “Phytophthora-induced diseases”, In: Timmer LW, Garnsey SM, Graham JH, editors. Compendium of citrus diseases. St. Paul (MN): APS Press, pp.12-1.

76. Graham JH, Dewdney MM. (2014), “Brown rot of fruit”, In: Rogers ME, Dewdney MM, editors. Florida citrus pest management guide. Lake Alfred (FL): University of Florida IFAS. pp.67-68.

77. Graham JH, Dewdney MM, Timmer LW. (2011), “Phytophthora foot rot and root rot”, In: Rogers ME Dewdney MM, Spann TM, editor: Citrrus pesst management guide, Lake Alfred (FL): University of Florida IFAS. pp.87-92.

78. Graham JH, Menge JL. (2000), “Phytophthora induces disease”, In: Timmer LW, Garnesy SM, Graham JH, editors), Compendium of Citrus diseases, American Phytopathological Society, St. Paul, MN, pp.12-15.

79. Graham JH, Timmer LW, Drouillard DL, Peever TL. (1998), “Characterization of Phytophthora spp. causing outbreaks of citrus brown rot in Florida”, Phytopathology, 88, pp.724-729.

80. Graham JH, Dewdney MM. (2014), “Brown rot of fruit”, In: Rogers ME, Dewdney MM, editors. Florida citrus pest management guide. Lake Alfred (FL): University of Florida IFAS, pp.67-68.

81. Graham JH, Dewdney MM, Timmer LW. (2011), “Phytophthora foot rot and root rot”, In: Rogers ME, Dewdney MM, Spann TM, editors. Citrus pest management guide. Lake Alfred (FL): University of Florida IFAS, pp.87-92.

82. Graham JH, Timmer LW. (1992), “Phytophthora diseases of Citrus”, In: Kumar J, Chaube HS, Singh US, Mukhopadhyay AN, editors. Plant diseases of international importance. New Jersy, Prentice-Hall Inc., pp.250-69.

83. Graham, JH, and Feichtenberger, E. (2015), “Citrus Phytophthora diseases: Management challenges and successes”, Jornal of citrus patholohy, 2 (1) pp.1-13 84. Graham, JH and L.W. Timmer. (1994), Phytophthora Diseases of Citrrus. IFAS,

University of Florida, SL 127.

85. Guest, D.I., Pegg, K.G. and Whiley, A.W. (1995), “Control of Phytophthora diseases of tree crops using trunk-injected phosphonates”, Horticultural Reviews, 17, 299-330. 86. Heller, W.E. and Hedtrich, R.T. (1994), “Antagonism of Chaetomium globosum, Gliocladium virens and Trichoderma viride to four soil-borne Phytophthora species”, Journal of Phytopathology, 141, pp.390-394.

87. Jauri P.V, Nora A., Carlos A.p., Linda K. (2018). Cropping history effects on pathogen suppressive and signaling dynamics in Streptomyces communities. Phytobiomes Journal, 2: 14-23.

126

88. Julinda, B.D., Henuki, Meity, S., Sinaga, S.R.I., Hidayta, H. (2017), “Morphological and molecular identificationof fungal pathogens causing gummosis disease of Citrus spp. in Indonesia”, BIODIVERSITAS Volume 18, Number 3, pp.1100-1108.

89. Kalita, P., Bora, L. C. and Bhagabati, K. N. (1996), “Phylloplane microflora of citrus and their role in management of citrus canker”, Indian Phytopath. 49, pp.234-237. 90. Keswani C., Singh HB., Hermosa R., G.Estrada C., Caradus J., He YW., Aichour SM., Glare TR., Borriss R., Vinale F. and Sansinenea E. (2019), “Antimicrobial secondary metabolites from agriculturally important fungi as next biocontrol agents”, Microbiology and Biotechnology, volume 103, pp.9287–9303.

91. Kong P., Hong C.X., Tooley P.W., Ivors K., Garbelotto M., Richardson P.A. (2004), "Rapid identification of Phytophthora ramorum using PCR-SSCP analysis of ribosomal DNA ITS-1", Letters in Applied Microbiology, 38, pp. 433-439.

92. Kroon LP, Brouwer H, de Cock AW, Govers F. (2012), “The Genus Phytophthora”,

Phytopathology, 102, pp.348-364.

93. Kumar, S., Stecher, G., Li, M., Knyaz, C., & Tamura, K. (2018), MEGA X: molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms, Molecular

biology and evolution, 35(6), pp.1547.

94. Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahl, D. A., Sogin, M. L., & Pace, N. R. (1985),

“Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 82(20), pp.6955-6959. 95. Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWilliam, H., & Higgins, D. G. (2007), Clustal W and Clustal X version 2.0.

bioinformatics, 23(21), pp.2947-2948.

96. Lende, A. S., Gade, R. M. and Shitole, A. V. (2015), “Management of Phytophthora root rot in Nagpur mandarin by using integrated approach”, In: Proceedings of National Conference on Harmony with Nature in Context of Bioresources and Environmental Health, The Bioscan, pp.332-336.

97. Lucas, J.A. (1991), Phytophthora based on a symposium held at Trinity College, Dublin, Ireland September 1989, British Mycological Society, Cambridge University Press, Cambridge, UK, ISBN 0-521-40080-5;

98. Levesque CA, Harlton CE, de Cock AWAM. (1998), “Identification of some oomycetes by reverse dot blot hybridisation”, Phytopathology., 88, pp.213- 22. 99. Mardanova AM., Hadieva GF., Lutfullin MT., Khilyas IV., Minnullina LF., Gilyazeva, AG., Bogomolnaya LM. and Sharipova MR. (2017), “Bacillus subtilis strains with antifungal activity against the phytopathogenic Fungi”, Agricultural Sciences, 8, pp.1-20.

127

100. Matheron ME, Porchas M. (1996), “Colonization of Citrus roots by Phytophthora citrophthora and P. parasitica in daily soil temperature fluctuations between favourable and inhibitory levels”, Plant Dis., 80, pp.1135-1140.

101. Marcin, N., Elzbieta, U. and Majid, R.F. (2011), “Potato and tomato late blight caused by Phytophthora infestans: An overview of pathology and resistance breeding", Plant Disease, 96, pp.4–17,

102. Martin RR, James D, Lévesque CA. (2000), “Impacts of molecular diagnostic

technologies on plant disease”, Annu Rev. Phytopathol., 38, pp.207-39.

103. Mekonen M, Ayalew A, Weldetsadik K and Seid A (2015). Assessing and Measuring of Citrus gummosis (Phytophthora spp.) in Major Citrus Growing Areas of Ethiopia. Journal of Horticulture 2015.

104. Naqvi SAMH. (2000), “Distribution of Phytophthora spp. And mating types pathogenic to citrus in Vidarbha and marathwada region of Maharashtra and Northeastern states of India”, In: Singh S, Gosh SP, editors. Proceeding of the “Hi- Tech Citrus management- Int. Symposium, citriculture, Nagpur india”, pp.1073-80.

105. Naqvi SAMH. (2002b), “Fungal diseases of citrus-Diagnosis and management”,

Technical Bulletin 5, NRC for citrus Nagpur, India;. pp.61.

106. Naqvi SAMH. (2002a), “Phytophthora diseases of Citrus in India and their integrated management”, National symposium on Perspectives in integrated palnt disease management organized by Indian Soc. of plant pathologists, Ludhiana NRC for Citrus, Nagpur and CICR, Nagpur at NRC for Citrus, Nagpur. 13-14th Feb. 2002 (Abstract).pp. 2122.

107. Naqvi SAMH. (1996), “Management of Phytophthora diseases of Citrus in India”, In: Rai V, Naik ML, Mohanacharry C, editors. Perspectives in Biological sciences. School of lifesciences, Ravishankar University, Raipur, India;. pp.271-181.

108. Naqvi SAMH. (1999e), “Major diseases of Citrus and their management. In:”

Citriculture”, (eds. Shyam Singh), NRC for Citrus, Nagpur;. pp.273-84.

109. Naqvi SAMH. (2000c), “Recent trends in disease management in citrus”, In: Singh S, Ghosh, SP, editors. Proceeding of Hi-Tech Citrus managementInt. Symp. Citriculture, Nagpur, India; pp.785-99

110. Nobuya T., Seiji. U., Youichi I., Masafumi M. (2012), “First First report of Phytophthora palmivora as a causal pathogenof citrus brown rot in Japan”. J. Gen Plant Pathol, 78, pp.233-236.

111. Pente, R., Gade, R. M., Belkar, Y. K. and Shinde, P. (2015), “Evaluation of botanicals and bioagents against Phytophthora root rot in citrus”, Trends in Biosciences, 8(3), pp.752-758.

128

112. Rajeev K, Mukherji KG, Dubey OP, editors. (1999a), “IPM system of AgricultureCash Crops”, Vol. 6. Aditya Books Pvt. Ltd. New Delhi India; pp.489- 503.

113. Ristaino JB, Gimpertz ML. (2000), “New frontiers in the study of dispersal and spatial analysis of epidemics caused by species of genus Phytophthora”, Ann Rev Phytopathology. 38, pp.541-76.

114. Spiegel-Roy, P. & Golschmidt, E. E. (1996), Biology ofcitrus, Cambridge

UniversityPress, UK., pp. 444.

115. Savita, Virk, G. S. and Nagpal, A. (2012), “Citrus diseases caused by Phytophthora

species”, In: GERF Bulletin of Biosciences, 3(1), pp.18-27.

116. Scott, P.M, Burgess, T.I., Barber, P.A., Shearer, B.L., Stukely, M.J, Hardy, G.E, Jung, T. (2009), “Phytophthora multivora sp. nov., a new species recovered from declining Eucalyptus, Banksia, Agonis and other plant species in Western Australia", Persoonia, 22, pp.1-13.

117. Shi L., Thinn N., Beibei G., Zhao W.J., Liu B.H and Zhang K.C., (2018). Antifungal and plant growth-promoting activities of Streptomyces roseoflavus strain NKZ-259. Biological control, Vol. 125, pp. 57-64.

118. Siviero A, Hurtado EL, Machado MA, Boava IP. (2002), “Aggresiveness of Phytophthora parasitica isolates on citrus”, Summa Phytopathol, 28, pp.171-77. 119. Schutte GC. (2007), “Evaluation of spray programmes for the control of Phytophthora citrophthora on Clementines in the Western Cape”, In: CRI annual research report for 2006, pp.346-54.

120. Timmer L, Garnsey S, Broadbent P. (2003), “Diseases of Citrus”. In: Ploetz RC, editor, Diseases of Tropical Fruits Crops. CABI Publishing, CABI International, Wallingford, UK, pp.163-95.

121. United Nations Conference on Trade and Development (2010), Market Information

in the Commodities Area: Citrus fruits CHARACTERISTICS.

122. United Nations Conference on Trade and Development (2017), Investment and the

digital economy, World Investment Report, pp. 252.

123. Vernière C, Cohen S, Raffanel B, Dubois A, Venars P, Panabieres F. (2004), “Variability in pathogenicity amongPhytophthora spp. Isolated from citrus in Corsica”, J. Phytopathol, 152, pp.476-83.

124. Waterhouse G.M., Newhook F.J., Stamps D.J. (1983), "Present criteria for classification of Phytophthora", Erwin D.C., Bartnicki-Garcia S., Tsao P.H. (Eds.), Phytophthora: Its Biology, Taxonomy, Ecology and Pathology, The American Phytopathological Society, St. Paul, pp. 139-147

129

125. Wen-Chuan Chung & Rey-Shung Wu & Chia-Ping Hsu & Hung-Chang Huang & Jenn-Wen Huang (2011) Application of antagonistic rhizobacteria for control of Fusarium seedling blight and basal rot of lily. Australasian Plant Pathol. (2011) 40:269–276

126. Whittle A M. (1992), “Diseases and pests of citrus in Vietnam”, FAO Plant

Protection Bulletin, 40 (3), pp.75-81.

127. Wu, G.A, Terol. J., Ibanez, V., López-García, A, Pérez-Román, E., Borredá, C., Domingo, C., Tadeo, F.R., Carbonell-Caballero, J., Alonso, R., Curk, F., Du, D., Ollitrault, P., Roose, M.L., Dopazo, J., Gmitter, F.G., Rokhsar, D.S., Talon, M. (2018), “Genomics of the origin and evolution of Citrus”, Nature, 554 (7692), pp.311-316.

128. Xiao Chen , Lin-Fang Hu , Xue-Shi Huang , Li-Xing Zhao , Cui-Ping Miao , You-Wei Chen , Li-Hua Xu , Li Han , Yi-Qing Li. (2019). “Isolation and Characterization of New Phenazine Metabolites with Antifungal Activity against Root-Rot Pathogens of Panax notoginseng from Streptomyces”. J. Agric. Food Chem. 67, 41, Pages 11403–11407.

129. Ying – Yu Chen, Pei – Chen Chen, Tung – Tsuan Tsay (2016). The biocontrol the of Streptomyces plicatus on antibiotic and

activity efficacy oomycete Phytophthora capsici. Biological Control; Volume 98, pp. 34-42.

130. Yan, H., Zhong, Y., Jiang, B., Zhou, B., Wu, B. and Zhong, G. (2017). Guanggan (Citrus reticulata) shows strong resistance to Phytophthora nicotianae. Scientia horticulturae, 225, 141-149.

130

PHỤ LỤC

1. Trình tự đoạn đọc được của 10 mẫu nấm Phytophthora

> Phyt-01

GGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCACACCTAAAAACTTTCCACGTGAACCG

TATCAAAACTTAGTTGGGGGTCTCTTTCGGCGGCGGCTGCTGGCTTCATTGCTG

GCGGCTGCTGTTGGGAGAGCTCTATCATGGCGAGCGTTTGGGCTTCGGTCTGA

ACTAGTAGCTTTTTTAAACCCATTCTTTATAACTGATTATACTGTAGGGACGAA

AGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCA

CATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATTGCAGGATTCA

GTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGGGAG

TATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATCAAACTTGGTTTTCTTCCTTCCGTGTAGTC

GGTGGTGGATGTGCCAGATGTGAAGTGTCTTGCGGCTGGTCTTCGGATCGGCT

GTGAGTCCTTTGAAATGTACTGAACTGTACTTCTCTTTGCTCCAAAAGCGTGGC

GTTGCTGATTGTGGAGGCTGCTTGCGTAGCCAGTCTGGCGACCAGTTTGTCTGC

TGTGGCATTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAA

CAGACGCTTATTAAATATTTCTTCAGCTGTGGTGGTATGAGTTGGTGAACCGTA

GCTATGTGAGCTTGGCTTTTGAATTGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGTGGCGG

CTTCGGCTGTCGAGGGTCGATCCATTTGGGAACTTGTGTATGCT

>Phyt-02

GGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCACACCTAAAAACTTTCCACGTGAACCG

TATCAAAACTTAGTTGGGGGTCTCTTTCGGCGGCGGCTGCTGGCTTCATTGCTG

GCGGCTGCTGTTGGGAGAGCTCTATCATGGCGAGCGTTTGGGCTTCGGTCTGA

ACTAGTAGCTTTTTTAAACCCATTCTTTATAACTGATTATACTGTAGGGACGAA

AGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAA

131

CTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTG

CGATACGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCA

TATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATC

AAACTTGGTTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGGTGGTGGATGTGCCAGATGTGAAG

TGTCTTGCGGCTGGTCTTCGGATCGG

CTGTGAGTCCTTTGAAATGTACTGAACTGTACTTCTCTTTGCTCCAAAAGCGTG

GCGTTGCTGATTGTGGAGGCTGCTTGCGTAGCCAGTCTGGCGACCAGTTTGTCT

GCTGTGGCGTTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTG

AACAGACGCTTATTGAATATTTCTTCAGCTGTGGTGGTATGATTGGTGAACCGT

AGCTATGTGAGCTTGGCTTTTGAAT

TGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGTGGCGGCTTCGGCTGTCGGGGGTCGATCC

ATTTGGGAACTTGTGTATGCT

>Phyt-03

CAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCACACCTAAAAAACT

TTCCACGTGAACCGTTTCAACCCAATAGTTGGGGGTCTTATTTGGCGGCGGCTG

CTGGCTTAATTGTTGGCGGCTGCTGCTGAGTGAGCCCTATCAAAAAAAAGGCG

AACGTTTGGGCTTCGGCCTGATTTAGTAGTTTTTTTTTCTTTTAAACCCATTCCT

TAATACTGAATATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAA

CTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTG

CGATACGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCA

TATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGGAAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATT

AAACTTGACTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGAGATGTCAGATGTGAA

GTGTCTTGCGATTGGTCTTCGGACCGGCTGCGAGTCCTTTTAAATGTACTAAAC

TGAACTTCTCTTTGCTCGAAAAGTGGTGGCGTTGCTGGTTGTGAAGGCTGCTAT

TGTGGCAAATTGGCGACTGGTTTGTCTGCTGCGGCGTTAATGGAAGAGTGTTC

GATTCGTGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAATGCACTTATTGGACGTTTTTCC

TGCTGTGGCGTGATGGACTGGTGAACCATAGCTCGGTGGCTTGGCTTTTGAATT

132

GGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGGGTGGCAGCTTCGGTTGTCGAGGGTCGATCCA

TTTGGGAACTTAATGTGTCTC

>Phyt-04

CAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCACACCTAAAAAACT

TTCCACGTGAACCGTTTCAACCCAATAGTTGGGGGTCTTATTTGGCGGCGGCTG

CTGGCTTAATTGTTGGCGGCTGCTGCTGAGTGAGCCCTATCAAAAAAAAGGCG

AACGTTTGGGCTTCGGCCTGATTTAGTAGTTTTTTTTTCTTTTAAACCCATTCCT

TAATACTGAATATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAGCAA

CTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTG

CGATACGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCA

TATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGGAAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACATT

AAACTTGACTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGAGATGTCAGATGTGAA

GTGTCTTGCGATTGGTCTTCGGACCGGCTGCGAGTCCTTTTAAATGTACTAAAC

TGAACTTCTCTTTGCTCGAAAAGTGGTGGCGTTGCTGGTTGTGAAGGCTGCTAT

TGTGGCAAATTGGCGACTGGTTTGTCTGCTGCGGCGTTAATGGAAGAGTGTTC

GATTCGTGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAATGCACTTATTGGACGTTTTTCC

TGCTGTGGCGTGATGGACTGGTGAACCATAGCTCGGTGGCTTGGCTTTTGAATT

GGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGGGTGGCAGCTTCGGTTGTCGAGGGTCGATCCA

TTTGGGAACTTAATGTGTCTC

>M1

CCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCACACCTAAAAAACTTTCCACGT

GAACCGTATCAACCCTTTTAGTTGGGGGTGTTGCTTGGCATTTTGCTGAGCCGC

GCCCTATCATGGCGAATGTTTGGACTTCGGTCTGGGCTAGTAGCTTTTTGTTTT

AAACCATTTAACAATACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAA

CTAGATAGCAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAAC

GCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAA

133

TTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGGGAGTATGCCTGTATCAGT

GTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGATGTGC

CAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTTGTGTGCCTTCGGGCCGAGGCTGCGAGTCC

TTTGAAATGTACTGAACTGTACTTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTGTTGCTGG

TTGTGGAGGCTGCCTGCGTGGCCAGTCGGCGGCCGGTTTGTCTGCTGCGGCGT

TTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGGCGC

TTATTGTATGCTTTTCCTGCTGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGT

GTGGCTTGGCTTTTGAACCGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGTGGCGGCTTCG

GCTGTCGAGTGTCGATCCATTTTGGGAACTTTTGTGTGCGCTTTCGAGTGTGCA

TCTCAATTG

>M2

CCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCACACCTAAAAAACTTTCCACGT

GAACCGTATCAACCCTTTTAGTTGGGGGTGTTGCTTGGCATTTTGCTGAGCCGC

GCCCTATCATGGCGAATGTTTGGACTTCGGTCTGGGCTAGTAGCTTTTTGTTTT

AAACCATTTAACAATACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAA

CTAGATAGCAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAAC

GCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAA

TTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGGGAGTATGCCTGTATCAGT

GTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGATGTGC

CAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTTGTGTGCCTTCGGGCCGAGGCTGCGAGTCC

TTTGAAATGTACTGAACTGTACTTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTGTTGCTGG

TTGTGGAGGCTGCCTGCGTGGCCAGTCGGCGGCCGGTTTGTCTGCTGCGGCGT

TTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGGCGC

TTATTGTATGCTTTTCCTGCTGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGT

GTGGCTTGGCTTTTGAACCGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGTGGCGGCTTCG

GCTGTCGAGTGTCGATCCATTTTGGGAACTTTTGTGTGCGCTTTCGAGTGTGCA

TCTCAATTG

134

>M3

CCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCACACCTAAAAAACTTTCCACGT

GAACCGTATCAACCCTTTTAGTTGGGGGTGTTGCTTGGCATTTTGCTGAGCCGC

GCCCTATCATGGCGAATGTTTGGACTTCGGTCTGGGCTAGTAGCTTTTTGTTTT

AAACCATTTAACAATACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAA

CTAGATAGCAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAAC

GCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAA

TTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGGGAGTATGCCTGTATCAGT

GTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGATGTGC

CAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTTGTGTGCCTTCGGGCCGAGGCTGCGAGTCC

TTTGAAATGTACTGAACTGTACTTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTGTTGCTGG

TTGTGGAGGCTGCCTGCGTGGCCAGTCGGCGGCCGGTTTGTCTGCTGCGGCGT

TTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGGCGC

TTATTGTATGCTTTTCCTGCTGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGT

GTGGCTTGGCTTTTGAACCGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGTGGCGGCTTCG

GCTGTCGAGTGTCGATCCATTTTGGGAACTTTTGTGTGCGCTTTCGAGTGTGCA

TCTCAATTG

>M4

CCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCACACCTAAAAAACTTTCCACGT

GAACCGTATCAACCCTTTTAGTTGGGGGTGTTGCTTGGCATTTTGCTGAGCCGC

GCCCTATCATGGCGAATGTTTGGACTTCGGTCTGGGCTAGTAGCTTTTTGTTTT

AAACCATTTAACAATACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAA

CTAGATAGCAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAAC

GCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAA

TTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGGGAGTATGCCTGTATCAGT

GTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGATGTGC

CAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTTGTGTGCCTTCGGGCCGAGGCTGCGAGTCC

TTTGAAATGTACTGAACTGTACTTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTGTTGCTGG

135

TTGTGGAGGCTGCCTGCGTGGCCAGTCGGCGGCCGGTTTGTCTGCTGCGGCGT

TTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGGCGC

TTATTGTATGCTTTTCCTGCTGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGT

GTGGCTTGGCTTTTGAACCGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGTGGCGGCTTCG

GCTGTCGAGTGTCGATCCATTTTGGGAACTTTTGTGTGCGCTTTCGAGTGTGCA

TCTCAATTG

>M5

CCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCACACCTAAAAAACTTTCCACGT

GAACCGTATCAACCCTTTTAGTTGGGGGTGTTGCTTGGCATTTTGCTGAGCCGC

GCCCTATCATGGCGAATGTTTGGACTTCGGTCTGGGCTAGTAGCTTTTTGTTTT

AAACCATTTAACAATACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAA

CTAGATAGCAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAAC

GCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAA

TTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGGGAGTATGCCTGTATCAGT

GTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGATGTGC

CAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTTGTGTGCCTTCGGGCCGAGGCTGCGAGTCC

TTTGAAATGTACTGAACTGTACTTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTGTTGCTGG

TTGTGGAGGCTGCCTGCGTGGCCAGTCGGCGGCCGGTTTGTCTGCTGCGGCGT

TTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGGCGC

TTATTGTATGCTTTTCCTGCTGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGT

GTGGCTTGGCTTTTGAACCGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGTGGCGGCTTCG

GCTGTCGAGTGTCGATCCATTTTGGGAACTTTTGTGTGCGCTTTCGAGTGTGCA

TCTCAATTG

>M6

CCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCACACCTAAAAAACTTTCCACGT

GAACCGTATCAACCCTTTTAGTTGGGGGTGTTGCTTGGCATTTTGCTGAGCCGC

GCCCTATCATGGCGAATGTTTGGACTTCGGTCTGGGCTAGTAGCTTTTTGTTTT

136

AAACCATTTAACAATACTGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAA

CTAGATAGCAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAAC

GCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAA

TTTTGAACGCATATTGCACTTCCGGGTTAGTCCTGGGAGTATGCCTGTATCAGT

GTCCGTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGATGTGC

CAGATGTGAAGTGTCTTGCGGTTTGTGTGCCTTCGGGCCGAGGCTGCGAGTCC

TTTGAAATGTACTGAACTGTACTTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTGTTGCTGG

TTGTGGAGGCTGCCTGCGTGGCCAGTCGGCGGCCGGTTTGTCTGCTGCGGCGT

TTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTGAACAGGCGC

TTATTGTATGCTTTTCCTGCTGTGGCGTGATGGGCTGGTGAACCGTAGCTGTGT

GTGGCTTGGCTTTTGAACCGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGTGGCGGCTTCG

GCTGTCGAGTGTCGATCCATTTTGGGAACTTTTGTGTGCGCTTTCGAGTGTGCA

TCTCAATTG

2. Trình tự đoạn đọc được của 6 mẫu vi sinh vật đối kháng

>BNB3.8

GCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGG

GTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACC

GGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGG

CTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGT

AACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCA

CACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAAT

CTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGG

TTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAG

GGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGC

AGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAG

GGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGG

AGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCC

ACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGC

137

GACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACA

GGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGG

GGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGA

GTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG

GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGA

CATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAG

GTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGC

AACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGG

TGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATG

CCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGC

GAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAG

TCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATG

CCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGA

GTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAG

GTGGACAGATGATT

>BHA12.2

AGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAA

CACGCTGGGTAACCTGCCTGTCAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCAGGGCTA

ATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGC

TACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCT

CACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGA

CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCA

ATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGA

TCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACC

TTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTCGTGCCAGCAGCCGCGGTA

aTACGTAGGtGGCAAGCGtTGTCCGGAATTATTGGgCGTAAAgGGCTCGCAGGCG

GtTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGA

AACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGT

138

GAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTC

TGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGAGCGAACAGGATTAGATACCC

TGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGTTTCCGCCCCT

TAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGA

CGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTT

TAATTCGAAGCAACCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCC

TAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCG

TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAGAGCGCAACCCTTGA

TCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAACC

GGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTAC

ACACGTGCTCAATGGGCAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCA

ATCCCACAAATCTGTTCTCAGTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAA

GCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAGGCCCGGTGAATA

>BNB9.8

TGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGG

TGAGTAACACGGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCG

GGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCT

TCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTACTAGTTGGTGAGGTAAC

GGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCCACT

GGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTC

CGCAATGGAGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTC

GGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGC

ACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTACTACGTGCCAGCAGCCGCG

GTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGCTCGCA

GGCGGTTTCTTAAGTCTGGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCA

TTGGACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGC

GGTGAAATGCGTAGAGATTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGG

TCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGAGCGAACAGGATTAGATACC

139

CTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTCCGCCCC

TTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAG

ACTAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTT

TAATTCGAAGCAACGCAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCC

TAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCG

TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGGCGCAACCCTTGA

TCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAAC

GGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTAC

ACACGTGCTACTGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAA

TCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTG

GAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCT

TGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAG

GTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGACAGATGATTGGGGT

>BHA6.5

GAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGT

AACACGTGGGTACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCT

AATACCGGATAACATTTTGAACCGATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGC

TGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCT

CACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGG

ACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGC

AATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGG

GTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCA

CCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCG

GTAAT

ACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTG

GTTTCTTAAGTTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAA

ACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTG

AAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCT

140

GTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCC

TGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCT

TTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAG

GCTGAAACTCAAAGGAATTGAGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGT

TTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGAAAAC

CCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTG

TCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCC

TTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACA

AACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGG

CTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGG

AGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTAC

ATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTT

CCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAA

GTCGGTGGGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGA

>STL2.7

ATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGA

GTAACACGTGGGAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTC

TAATACCGGATATGACCATCTTGGGCATCCTTGATGGTGTAAAGCTCCGGCGG

TGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAA

GGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAG

ACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGG

CGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTA

AACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCG

CCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTC

CGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAA

AGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGG

TAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAG

GAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCG

141

AAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAAC

GGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGC

ATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAAT

TGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGC

GAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCC

CCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA

GATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCG

TGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTC

AACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGG

GCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGTGG

AGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCC

CATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACG

TTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCG

AAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGC

GATTGGACGAA

>SHA2.4

TGCAAGTCGAACGGTGAAGCCCTTCGGGGTGGATCAGTGGCGAACGGGTGAG

TAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTC

TAATACCGGATATGACCTTCCTCCGCATGGGGGTTGGTGGAAAGCTCCGGCGG

TGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAA

GGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAG

ACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGG

CGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTA

AACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCA

CCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTC

CGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCCTGTCGCGTCGGATGTGAA

AGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCAGGCTAGAGTGTGG

TAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAG

142

GAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCG

AAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAAC

GTTGGGAACTAGGTGTTGGCCACATTCCACGTGGTCGGTGCCGCAGCTAACGC

ATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATT

GACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCG

AAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATGCCGGAAACGCCTGGAGACAGGTGCC

CCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAG

ATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGT

GTTGCCAGCGAGTAATGTCGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCG

GAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCA

CACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGCTGCGATGCCGTGAGGCGGAGCGA

ATCCCAAAAAGCCGGCCTCAGTTCGGATTGGGGTTTGCAACTTGACCCCATGA

AGTTGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATGCTGCGGTGAATACGTTCCCG

GGCCTTGTACACCCCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCG

GTGGCCTAACCCTCTGGGAAGGAGCCGTCCAAGGTGGACCAGCGATTGGGGG

AAGT

143

Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu bệnh do nấm Phytophthora spp. gây hại trên cây ăn quả có múi và biện pháp phòng chống theo hướng sinh học tại Cao Bằng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT

VIỆN KHOA HỌC NN VIỆT NAM

NGHIÊN CỨU BỆNH DO NẤM PHYTOPHTHORA SPP. GÂY

HẠI TRÊN CÂY ĂN QUẢ CÓ MÚI VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG

CHỐNG THEO HƯỚNG SINH HỌC TẠI CAO BẰNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI - 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT

VIỆN KHOA HỌC NN VIỆT NAM

NGUYỄN NAM DƯƠNG

NGHIÊN CỨU BỆNH DO NẤM PHYTOPHTHORA SPP. GÂY

HẠI TRÊN CÂY ĂN QUẢ CÓ MÚI VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG

CHỐNG THEO HƯỚNG SINH HỌC TẠI CAO BẰNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI - 2022

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả

nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng

được công bố hay dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được

cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày … tháng năm 2022

Tác giả luận án

Nguyễn Nam Dương

Hà Nội, ngày … tháng … năm 2022 Nghiên cứu sinh

Nguyễn Nam Dương

STT

Ký hiệu chữ viết tắt

Chữ viết đầy đủ

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

) × 100

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Đặc điểm

P. nicotianae

P. palmivora

P. citrophthora

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN

LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Có thể bạn quan tâm

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Cơ sở lý luận và thực tiễn kiểm sát việc giải quyết các vụ án kinh doanh, thương mại về tranh chấp hợp đồng tín dụng theo thủ tục giám đốc thẩm của Viện kiểm sát nhân dân ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Cơ sở lý luận và thực tiễn kiểm sát việc giải quyết các vụ án kinh doanh, thương mại về tranh chấp hợp đồng tín dụng theo thủ tục giám đốc thẩm của Viện kiểm sát nhân dân ở Việt Nam

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Chất lượng công chức quản lý nhà nước về kinh tế cấp huyện ở thành phố Hà Nội

Luận án Tiến sĩ: Chất lượng công chức quản lý nhà nước về kinh tế cấp huyện ở thành phố Hà Nội

Luận án Tiến sĩ: Xây dựng đội ngũ giảng viên trẻ theo tư tưởng Hồ Chí Minh ở các trường sĩ quan quân đội hiện nay

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Xây dựng đội ngũ giảng viên trẻ theo tư tưởng Hồ Chí Minh ở các trường sĩ quan quân đội hiện nay

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Các điều kiện thúc đẩy sự ra đời tiền kỹ thuật số (CBDC) của Ngân hàng Nhà nước Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Các điều kiện thúc đẩy sự ra đời tiền kỹ thuật số (CBDC) của Ngân hàng Nhà nước Việt Nam

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Xây dựng lối sống cho sinh viên các trường đại học ở Đồng bằng sông Cửu Long hiện nay theo tư tưởng Hồ Chí Minh

Luận án Tiến sĩ: Xây dựng lối sống cho sinh viên các trường đại học ở Đồng bằng sông Cửu Long hiện nay theo tư tưởng Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Hoàn thiện pháp luật về quyền thành lập tổ chức của người lao động tại doanh nghiệp ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Hoàn thiện pháp luật về quyền thành lập tổ chức của người lao động tại doanh nghiệp ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và kết quả điều trị ở bệnh nhân tổn thương mạn tính động mạch đùi - khoeo bằng phương pháp can thiệp nội mạch qua da

Luận án Tiến sĩ: Biến đổi sinh kế của người Sán Dìu huyện Sơn Dương, tỉnh Tuyên Quang

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hình ảnh cộng hưởng từ sức căng khuếch tán, tưới máu thận ghép và mối quan hệ với lâm sàng và siêu âm Doppler

Luận án Tiến sĩ: Phát triển suy luận và thái độ thống kê cho sinh viên sư phạm toán qua dạy học thống kê

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu lựa chọn dung dịch lôi cuốn sử dụng trong công nghệ màng thẩm thấu chuyển tiếp để xử lý nước nhiễm mặn thành nước sinh hoạt

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phương pháp nâng cao độ chính xác phát hiện và nhận dạng tiếng Việt trong ảnh căn cước công dân và ảnh ngoại cảnh

Luận án Tiến sĩ: Biến đổi của hát Xoan tại các làng Xoan gốc tỉnh Phú Thọ (qua nghiên cứu trường hợp làng Xoan Phù Đức và An Thái)

Luận án Tiến sĩ: Bồi dưỡng năng lực thực hành cho học sinh qua sử dụng thí nghiệm tự tạo trong dạy học chương “Từ trường” Vật lí 12 trung học phổ thông CHDCND Lào

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae