Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa hình/đột biến gen CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 và CYP2D6 cytochrome ở người Kinh Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Vũ Phương Nhung

NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH/ĐỘT BIẾN GEN CYP2C9, CYP2C19,

CYP3A5 VÀ CYP2D6 CYTOCHROME P450

Ở NGƯỜ I KINH VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – Năm 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -----------------------------

Vũ Phương Nhung NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH/ĐỘT BIẾN GEN CYP2C9, CYP2C19,

CYP3A5 VÀ CYP2D6 CYTOCHROME P450

Ở NGƯỜI KINH Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. TS. Nguyễn Hải Hà

2. GS. TS. Nông Văn Hải

Hà Nội – Năm 2020

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi với sự hướng dẫn

khoa học của TS. Nguyễn Hải Hà và GS.TS. Nông Văn Hải. Những kết quả thu được

của luận án là mới, trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào

khác. Các kết quả công bố chung đã được cán bộ hướng dẫn và các đồng tác giả cho

phép sử dụng trong Luận án.

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Tác giả luận án

Vũ Phương Nhung

ii

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới GS.TS.

Nông Văn Hải-nguyên Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen, Chủ tịch hội đồng Khoa

học Viện Nghiên cứu hệ gen và TS. Nguyễn Hải Hà-Phó trưởng phòng Phân tích hệ

gen, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong

suốt quá trình học tập và nghiên cứu, tinh thần say mê và nghiêm khắc trong khoa

học cùng với sự hướng dẫn tận tình và khích lệ của các thầy là động lực lớn lao giúp

tôi không ngừng cố gắng và phấn đấu, vượt qua nhiều khó khăn để có thể hoàn thành

Luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Đăng Tôn-Trưởng phòng Phân tích hệ

gen cùng các đồng nghiệp công tác tại phòng Phân tích hệ gen đã luôn tạo điều kiện

thuận lợi, đồng hành và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm việc chuyên

môn tại Phòng. Bằng những tình cảm chân thành nhất, tôi xin trân trọng cảm ơn

những giúp đỡ quý báu đó.

Trong quá trình nghiên cứu và học tập, tôi đã nhận được những ý kiến đóng

góp quý báu của các nhà khoa học, các cán bộ nghiên cứu tại Viện nghiên cứu hệ

gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Những nhận xét và góp ý

chuyên môn sâu sắc trong các buổi báo cáo, hội thảo đã giúp tôi hoàn thiện tốt nhất

Luận án của mình.

Nhân dịp này, tôi cũng xin chân thành cảm ơn ban Giám đốc, tập thể cán bộ

Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam

đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại đây.

Sau cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè

đã luôn tin tưở ng và là nguồn động viên tinh thần lớn lao đối với tôi trong suốt quá

trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành Luận án.

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Tác giả luận án

Vũ Phương Nhung

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN ........................ vii

DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. ix

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ x

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................... 4

1.1. CYP450 và chuyển hóa thuốc trong gan ........................................................... 4

1.2. Đa dạng di truyền các gen mã hóa cho enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa

thuốc. ...................................................................................................................... 6

1.2.1. Gen CYP2C9 ................................................................................................. 7

1.2.2. Gen CYP2C19 ............................................................................................. 11

1.2.3. Gen CYP2D6 ............................................................................................... 14

1.2.4. Gen CYP3A5................................................................................................ 17

1.3. Ảnh hưởng của đa dạng di truyền các gen dược học đối với các ADR và sự khác

biệt trong đáp ứng thuốc ........................................................................................ 20

1.3.1. Khái quát về các ADR ................................................................................. 20

1.3.2. Một số trường hợp đa dạng di truyền các gen dược học gây nên khác biệt trong

đáp ứng thuốc ........................................................................................................ 22

1.4. Ứng dụng và triển vọng của di truyền dược học trong lâm sàng ...................... 29

1.5. Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền của các gen CYP450 ........ 32

1.5.1. Các phương pháp nghiên cứu SNP và indel ................................................. 32

1.5.2. Các phương pháp nghiên cứu CNV .............................................................. 34

1.6. Tình hình nghiên cứu đa hình di truyền một số gen CYP450 trên người Việt Nam

và phạm vi nghiên cứu của luận án ........................................................................ 37

1.6.1. Tình hình nghiên cứu đa hình di truyền của các gen CYP450 tại Việt Nam và

trên thế giới ........................................................................................................... 37

iv

1.6.2. Phạm vi nghiên cứu của luận án ................................................................... 39

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 40

2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 40

2.2. Các thiết bị, dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu ...................................... 40

2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 41

2.3.1 Tách chiết DNA tổng số ............................................................................... 41

2.3.2. Xác định nồng độ DNA tổng số ................................................................... 42

2.3.3. Phương pháp PCR Khuếch đại đặc hiệu các gen .......................................... 43

2.3.3.1. Thiết kế mồi .............................................................................................. 43

2.3.3.2. PCR đặc hiệu các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 ............. 45

2.3.4. Giải trình tự Sanger...................................................................................... 46

2.3.4.1. PCR giải trình tự ....................................................................................... 46

2.3.4.2. Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự ....................................................... 47

2.3.4.3. Biến tính sản phẩm PCR và điện di mao quản trên máy giải trình tự ......... 47

2.3.5. Phương pháp MLPA .................................................................................... 47

2.3.5.1. Thực hiện phản ứng MLPA....................................................................... 48

2.3.5.2. Điện di mao quản phân tách đoạn ............................................................. 49

2.3.5.3. Phân tích kết quả bằng phần mềm Coffalyzer ........................................... 49

2.3.6. Long range (LR) PCR .................................................................................. 50

2.3.7. Real-time PCR ............................................................................................. 51

2.3.8. Phân tích số liệu nghiên cứu ........................................................................ 52

2.3.8.1. Phân tích kết quả giải trình tự Sanger và đánh giá trạng thái cân bằng di truyền

Hardy-Weinberg của quần thể ............................................................................... 52

2.3.8.2. Phân tích thống kê .................................................................................... 52

2.3.9. Dự đoán chức năng in silico của các biến thể mới ........................................ 53

2.3.9.1. Dự đoán chức năng của các biến thể mới trong vùng mã hóa .................... 53

v

2.3.9.2. Dự đoán chức năng của các biến thể mới trong vùng không mã hóa ......... 53

2.3.9.3. Dự đoán chức năng của các biến thể mới trong vùng promoter ................. 54

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 55

3.1. Tách chiết DNA tổng số ................................................................................. 55

3.2. Khuếch đại đặc hiệu các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A5 và giải trình

tự ........................................................................................................................... 55

3.3. Phân tích đa hình/đột biến các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 ở

quần thể người Kinh Việt Nam .............................................................................. 59

3.3.1. Đa hình/đột biến của gen CYP2C9 ............................................................... 59

3.3.2. Đa hình/đột biến của gen CYP2C19 ............................................................. 65

3.3.3. Đa hình/đột biến của gen CYP2D6 ............................................................... 70

3.3.4. Đa hình/đột biến của gen CYP3A5 ............................................................... 83

3.4. Phân tích liên kết giữa các biến thể trên CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6 ....... 85

3.5. Dự đoán chức năng in silico của các biến thể mới tìm thấy trên CYP2C9,

CYP2C19 và CYP2D6 ........................................................................................... 87

3.6. So sánh tần số allele của các gen nghiên cứu giữa quần thể người Kinh Việt Nam

với các quần thể người khác trên thế giới............................................................... 90

3.6.1. So sánh tần số allele của gen CYP2C9 giữa quần thể người Kinh Việt Nam với

các quần thể người khác trên thế giới..................................................................... 90

3.6.2. So sánh tần số allele của gen CYP2C19 giữa quần thể người Kinh Việt Nam

với các quần thể người khác trên thế giới............................................................... 92

3.6.3. So sánh tần số allele của gen CYP2D6 giữa quần thể người Kinh Việt Nam với

các quần thể người khác trên thế giới..................................................................... 93

3.6.4. So sánh tần số allele của gen CYP3A5 giữa quần thể người Kinh Việt Nam với

các quần thể người khác trên thế giới..................................................................... 96

3.7. Thảo luận ........................................................................................................ 98

3.7.1. Sự phân bố của các SNP gây ảnh hưởng chức năng protein CYP2C9,

CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 ở các quần thể người trên thế giới ....................... 98

vi

3.7.2. Phân tích liên kết giữa các biến thể và ý nghĩa trong nghiên cứ u đa da ̣ng di truyền các gen CYP450........................................................................................ 102

3.7.3. Vai trò của các CNV và SV của các gen nghiên cứu trong đa dạng đáp ứng

thuốc cá nhân....................................................................................................... 103

3.7.4. Vai trò của các biến thể mới của CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6 đối với chức

năng của các protein tương ứng ........................................................................... 105

3.7.5. Ý nghĩa của việc sử dụng thông tin di truyền các gen CYP450 tham gia chuyển

hóa thuốc trong tối ưu hiệu quả dùng thuốc trên người Kinh Việt Nam ............... 107

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 112

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ..................................................... 114

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 115

PHỤ LỤC................................................................................................................ 1

vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN

Tên viết tắt Tên đầy đủ tiếng Anh

Nghĩa tiếng Việt dùng trong luận án

ADR Adverse drug reaction Phản ứng có hại của thuốc

CNV Copy number variant Biến thể số bản sao

CPIC

Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium Hiệp hội ứng dụng Di truyền dược học lâm sàng

CYP2C19 Cytochrome P450 2C19

CYP2C9 Cytochrome P450 2C9

CYP2D6 Cytochrome P450 2D6

CYP3A5 Cytochrome P450 3A5

CYP450 Cytochrome P450

DMSO Dimethyl sulfoxide

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTPs Deoxynucleotide triphosphates

EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid

EM Extensive metabolizer

Chuyển hóa thuốc bình thường

FDA U.S. Food and Drug Administration

Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ

FPR False positive rate Tỉ lệ dương tính giả

GWAS Genome-wide association study

Nghiên cứu tương quan toàn bộ hệ gen

HSF Human Splicing Finder

viii

Intermediate metabolizer IM

Chuyển hóa thuốc trung bình

Indel Insertion/deletion

Biến thể thêm/mất nucleotide

International normalized ratio INR

Chỉ số phản ánh thời gian hình thành cục máu đông

Linkage disequilibrium LD

Độ liên kết giữa các biến thể

LR-PCR Long range PCR

MLPA

Multiplex ligation dependent probe amplification Khuếch đại đa đầu dò phụ thuộc phản ứng ghép nối

Polymerase chain reaction PCR

PGRN

Pharmacogenomics Research Netwwork Mạng lưới nghiên cứu hệ gen dược học

PharmVar Pharmacogene Variation

Đa dạng di truyền các gen dược học

Poor metabolizer Chuyển hóa thuốc yếu PM

Single nucleotide polymorphism Đa hình đơn nucleotide SNP

Substrate recognition site Vị trí nhận biết cơ chất SRS

SSRI

Selective serotonin reuptake inhibitor Ức chế tái hấp thu serotonine

SV Structural variant Biến thể cấu trúc

TPMT Thiopurine S-methyltransferase

enzyme chuyển hóa các thuốc thiopurine

UM Ultra rapid metabolizer

Chuyển hóa thuốc cực nhanh

ix

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi sử dụng cho khuếch đại gen CYP2C9 ................... 43

Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi sử dụng cho khuếch đại gen CYP2C19 ................. 44

Bảng 2.3. Trình tự các mồi sử dụng cho khuếch đại gen CYP2D6 ......................... 44

Bảng 2.4. Trình tự các cặp mồi sử dụng cho khuếch đại gen CYP3A5 ................... 45

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR giải trình tự ................................................. 46

Bảng 2.6. Thông số điện di mao quản trên máy 3500............................................. 49

Bảng 2.7. Mối liên hệ giữa giá trị DQ và số bản sao của mẫu nghiên cứu .............. 50

Bảng 2.8. Trình tự các cặp mồi sử dụng cho real-time PCR ................................... 52

Bảng 3.1. Các biến thể của CYP2C9 trong quần thể người Kinh Việt Nam ............ 60

Bảng 3.2. Dữ liệu MLPA về CNV gen CYP2C9 của một số mẫu nghiên cứu ........ 62

Bảng 3.3. Tần số kiểu gen CYP2C9 trong quần thể người Kinh Việt Nam ............. 65

Bảng 3.4. Tần số các allele CYP2C9 trong quần thể người Kinh Việt Nam ........... 65

Bảng 3.5. Các biến thể của CYP2C19 trong quần thể người Kinh Việt Nam .......... 66

Bảng 3.6. Dữ liệu MLPA về CNV gen CYP2C19 của một số mẫu nghiên cứu ...... 68

Bảng 3.7. Tần số kiểu gen của CYP2C19 trong quần thể người Kinh Việt Nam .... 69

Bảng 3.8. Tần số các allele CYP2C19 trong quần thể người Kinh Việt Nam.......... 69

Bảng 3.9. Biến thể của CYP2D6 trong quần thể người Kinh Việt Nam xác định bằng

phương pháp giải trình tự ...................................................................................... 70

Bảng 3.10. Xác định kiểu gen của CYP2D6 ở người Kinh Việt Nam thông qua kết

hợp dữ liệu giải trình tự và MLPA ......................................................................... 78

Bảng 3.11. Tần số allele của CYP2D6 trong quần thể người Kinh Việt Nam ......... 80

Bảng 3.12. Tần số kiểu gen và tần số allele CYP3A5 trên người Kinh Việt Nam ... 84

Bảng 3.13. Dữ liệu MLPA về CNV gen CYP3A5 của một số mẫu nghiên cứu ....... 84

Bảng 3.14. So sánh tần số các biến thể CYP2C9 trong nghiên cứu này với các quần

thể khác trên thế giới ............................................................................................. 91

Bảng 3.15. So sánh tần số các biến thể CYP2C19 trong nghiên cứu này với các quần

thể khác trên thế giới ............................................................................................. 92

Bảng 3.16. So sánh tần số các allele của CYP2D6 có ảnh hưởng đến chức năng protein

ở quần thể người Kinh Việt Nam và các quần thể khác trên thế giới ...................... 94

Bảng 3.17. So sánh tần số allele CYP3A5*3 trong nghiên cứu này với các quần thể

khác trên thế giới ................................................................................................... 96

x

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc của CYP450 và các vị trí nhận biết cơ chất (SRS) . .................... 6

Hình 1.2. Đa dạng di truyền các gen CYP450 và vai trò trong chuyển hóa thuốc . ... 7

Hình 1.3. Các biến thể sai nghĩa và dịch khung của CYP2C9. ................................ 10

Hình 1.4. Phân bố một số biến thể trên gen CYP2C19 . ......................................... 12

Hình 1.5. Cấu trúc gen CYP2D6 và sự phân bố của một số biến thể . .................... 16

Hình 1.6. Phân bố của các biến thể trên gen CYP3A5. ........................................... 18

Hình 1.7. Ảnh hưởng của các ADR tới các cơ quan trong cơ thể. .......................... 21

Hình 1.8. Ứng dụng di truyền dược học trong xây dựng chiến lược sử dụng thuốc phù

hợp. ....................................................................................................................... 29

Hình 2.1. Sơ đồ chi tiết thực hiện nghiên cứu ........................................................ 41

Hình 3.1. Điện di đồ 9 mẫu DNA tổng số .............................................................. 55

Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP2C9 của 8 mẫu nghiên cứu .... 56

Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP2C19 của 8 mẫu nghiên cứu... 57

Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP2D6 của 5 mẫu nghiên cứu .... 58

Hình 3.5. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP3A5 của 8 mẫu nghiên cứu ..... 58

Hình 3.6. Các biến thể mới trong vùng intron và exon của CYP2C9 ...................... 61

Hình 3.7. Kết quả MLPA xác định mất toàn bộ 01 bản sao của gen CYP2C9. ....... 63

Hình 3.8. Kết quả Real-time PCR kiểm tra mất số bản sao của CYP2C9 ............... 64

Hình 3.9. Các biến thể mới trong vùng intron của CYP2C19. ................................ 67

Hình 3.10. Các biến thể mới trong vùng promoter CYP2D6 .................................. 72

Hình 3.11. Các biến thể mới trong intron và exon của CYP2D6 ............................. 73

Hình 3.12. Kết quả MLPA xác định số bản sao bình thường của gen CYP2D6 ...... 74

Hình 3.13. Kết quả MLPA xác định bất thường số bản sao (các exon 1,5,6) gen

CYP2D6. ............................................................................................................... 75

Hình 3.14. Kết quả MLPA xác định mất toàn bộ 01 bản sao của gen CYP2D6. ..... 75

Hình 3.15. LR-PCR kiểm tra allele CYP2D6*5. .................................................... 76

Hình 3.16. Các SV của CYP2D6 được xác định trên các mẫu người Kinh ............. 82

Hình 3.17. Kết quả giải trình tự của CYP3A5*3. .................................................... 83

Hình 3.18. Phân tích liên kết giữa các biến thể gen CYP2C9 ................................ 86

Hình 3.19. Phân tích liên kết giữa các biến thể gen CYP2C19 .............................. 86

Hình 3.20. Phân tích liên kết giữa các biến thể gen CYP2D6 ................................. 87

xi

Hình 3.21. Dự đoán chức năng của biến thể CYP2C9 42627C>A bằng Polyphen 2 (a)

và PROVEAN (b) .................................................................................................. 88

Hình 3.22. Tính bảo thủ của vị trí amino acid Proline 363 trên protein CYP2C9 ... 88

Hình 3.23. Dự đoán chức năng của các biến thể 3157G>T và 2988G>A thuộc

CYP2D6 ................................................................................................................ 90

Hình 3.24. Tính bảo thủ của vị trí amino acid Argine 329 trên protein CYP2D6 ... 90

1

MỞ ĐẦU

Các enzyme cytochrome P450 (CYP450) thuộc một họ protein-heme lớn,

những enzyme này có vai trò thiết yếu đối với các quá trình chuyển hóa hợp chất nội

sinh và ngoại sinh. Ở người, có 57 gen chức năng và 58 gen giả đã được báo cáo,

trong đó các CYP450 được phân loại thành 18 họ và 44 phân họ. Hầu hết các gen

trong nhóm này đều mang những chức năng sinh học trong chuyển hóa các chất nội

sinh như acid mật, eicosanoid và steroid. Tuy nhiên, khoảng 12 enzyme CYP450

thuộc các phân họ CYP1, CYP2 và CYP3 là tham gia chuyển hóa thuốc chính. Phần

lớn các loại thuốc được kê đơn trong lâm sàng được chuyển hóa bởi các enzyme

CYP450, ngoài ra cũng có rất nhiều loại thuốc chỉ được chuyển hóa bởi một CYP450

duy nhất. Có thể thấy, những yếu tố nội sinh và ngoại sinh gây ảnh hưởng đến hoạt

tính enzyme của CYP450 đóng vai trò rất quan trọng đến dược động học của các loại

thuốc được đưa vào cơ thể. Đối với một số các CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc

như CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6, các biến thể di truyền trong các gen mã hóa

cho protein có ảnh hưởng nhiều đến sự khác biệt trong hoạt tính của enzyme, trong

khi đó đối với những CYP450 khác (CYP1A2, CYP3A4) thì tỉ lệ này không đáng kể.

Các gen mã hóa cho các enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc có tính

đa hình rất cao. Sự đa dạng di truyền này được thể hiện ở những đa hình đơn

nucleotide (Single nucleotide polymorphism-SNP) xuất hiện với tần số hiếm (rare)

hoặc phổ biến (common), ngoài ra còn có các biến thể số bản sao (Copy number

variant-CNV) bao gồm các mất/lặp đoạn. Chức năng của biến thể được phân loại từ

không chức năng đến tăng cường chức năng, từ đó mà kiểu hình chuyển hóa được

chia thành các cấp độ: chuyển hóa thuốc yếu (Poor Metabolizer-PM), chuyển hóa

thuốc trung bình (Intermediate Metabolizer-IM), chuyển hóa thuốc bình thường

(Extensive Metabolizer-EM) và chuyển hóa thuốc cực nhanh (Ultrarapid Metaolizer-

UM). Những CYP450 tham gia vào chuyển hóa nhiều loại thuốc trên thị trường nhất

hiện nay là CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A4/5. Năm gen CYP450 nói trên

mã hóa cho các enzyme tham gia vào chuyển hóa 60-80% các loại thuốc thường được

kê đơn.

2

Tính cấp thiết của vấn đề nghiên cứu:

Sự khác nhau trong đáp ứng thuốc giữa các cá nhân là điều khó tránh khỏi

trong điều trị, trong đó có các phản ứng có hại của thuốc (Adverse drugs

reaction/ADR). Các ADR là một trong những nguyên nhân chính của các trường hợp

bệnh nhân phải nhập viện, một số có thể dẫn tới tử vong. Ingelman-Sunberg và cộng

sự đã ước tính ADR làm tiêu tốn khoảng 100 tỉ đô la Mỹ, đây cũng là nguyên nhân

dẫn tới 100.000 ca tử vong mỗi năm tại Mỹ. Khoảng 7% các ca nhập viện tại Anh và

Thụy Điển cũng có nguyên nhân từ các ADR. Từ năm 2009, Hiệp hội ứng dụng Di

truyền dược học lâm sàng (Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium-

CPIC) đã cung cấp các thông tin về việc xét nghiệm di truyền có thể được sử dụng

trong tối ưu hóa phác đồ sử dụng thuốc. Đối với một vài loại cặp gen-thuốc, CPIC

cũng đã đưa ra những chỉ dẫn về liều dùng cụ thể. Như đã trình bày ở trên, các gen

CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 là 4 trong số các gen CYP450 có tính đa

hình cao mà các dạng đa hình của chúng khiến cho bệnh nhân có khả năng chuyển

hóa từng loại thuốc cụ thể rất khác nhau, từ mạnh tới yếu. Cho tới nay, các hiểu biết

về đa dạng di truyền của nhóm gen CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc ở người Việt

Nam còn rất hạn chế. Ngày nay, vai trò của dược lý học di truyền liên quan đến

chuyển hóa thuốc và tương tác thuốc trong lâm sàng mang tính cấp bách và rất cần

đầu tư nghiên cứu. Hiểu biết về tính đa dạng di truyền của các gen tham gia chuyển

hóa thuốc ở người Việt Nam được coi là tiền đề để phát triển lĩnh vực này. Nghiên

cứu này tập trung vào việc phát hiện các allele đã biết cũng như xác định cả những

allele mới ở người Việt Nam. Do vậy, số liệu thu được từ nghiên cứu sẽ cung cấp

những thông tin khoa học về đa dạng di truyền của các gen CYP2C9, CYP2C19,

CYP2D6 và CYP3A5 trên người Việt Nam. Đây cũng là những tiền đề có ý nghĩa và

đóng góp một phần cho sự phát triển của lĩnh vực di truyền dược học và y học cá thể.

Mục tiêu nghiên cứu:

- Xây dựng cơ sở dữ liê ̣u về đa hình/đô ̣t biến củ a 04 gen CYP2C9, CYP2C19,

CYP2D6 và CYP3A5 ở ngườ i Kinh Viê ̣t Nam.

- Xác định kiểu gen và tần số các allele của 04 gen CYP2C9, CYP2C19,

CYP2D6 và CYP3A5 trên người Kinh ở Việt Nam đồ ng thờ i phân tích và dự đoán chứ c năng củ a các biến thể mớ i.

3

Cách tiếp cận nghiên cứu:

Đối tượng nghiên cứu là 136 người Kinh khỏe mạnh không có quan hệ huyết

thống. Nghiên cứu này sử dụng phương pháp giải trình tự Sanger nhằm xác định tất

cả các biến thể nằm trong vùng promoter cùng với tất cả 9 exon và vùng biên của 03

gen CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6. Đối với gen CYP3A5, phương pháp giải trình

tự Sanger cũng được áp dụng nhằm xác định các biến thể đã được công bố là có ảnh

hưởng đến hoạt tính của enzyme bao gồm: *3, *6, *8 và *9. Các CNV của các gen

nghiên cứu được xác định bằng phương pháp khuếch đại đa đầu dò phụ thuộc phản

ứng ghép nối (Multiplex ligation-dependent probe amplification-MLPA). Những

mẫu được xác định là có bất thường số bản sao được kiểm tra lại bằng phương pháp

Long range PCR hoặc real-time PCR. Các biến thể sau khi đã được xác định sẽ tiếp

tục được tổng hợp số liệu để tính toán tần số allele cũng như tần số kiểu gen trên tổng

số mẫu nghiên cứu đối với mỗi gen. Tiến hành so sánh về tần số và phân bố của các

allele của mỗi gen ở quần thể người Kinh Việt Nam so với các quần thể người khác.

Bên cạnh đó, những biến thể mới được tiến hành phân tích in silico nhằm dự đoán

ảnh hưởng của các biến thể này đến chức năng của protein tương ứng.

Những đóng góp mới của luận án:

Xác định được một số biến thể mới trong promoter và intron của các gen

CYP450, cụ thể: 5 biến thể mới trong in tron của CYP2C9, 3 biến thể mới trong intron

của CYP2C19, 3 biến thể mới trong promoter và 2 biến thể mới trong intron của

CYP2D6 và 3 biến thể mới thuộc vùng mã hóa của 2 gen CYP2C9 và CYP2D6. Đã

phân tích in silico cho thấy những biến thể này gây ảnh hưởng có hại đến chức năng

của protein.

Các biến thể CYP2D6*5, CYP2D6*10, CYP2D6*13 và CYP2D6*36-*10 đã

được xác định trên người Kinh ở Việt Nam là những biến thể làm giảm hoặc mất hoạt

tính của enzyme đã được xác định với tỉ lệ lần lượt là: 8,09%, 43,75%, 1,547% và

12,13%.

4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. CYP450 và chuyển hóa thuốc trong gan

Thuốc là những chế phẩm có chứa dược chất dùng với mục đích phòng-chữa

bệnh hay điều trị giảm nhẹ. Enzyme chuyển hóa thuốc được biết đến nhiều nhất là

các enzyme CYP450, đây là những enzyme tham gia vào các quá trình oxi hóa khử

và thủy phân. Mục tiêu chính của quá trình chuyển hóa thuốc đó là giúp đào thải

thuốc ra khỏi cơ thể. Ví dụ như các tiền chất (không có hoạt tính dược lý) sau khi

được hấp thụ vào cơ thể sẽ được chuyển đổi thành thuốc có hoạt tính. Mặt khác đa số

các loại thuốc sau khi chuyển hóa sẽ chuyển sang trạng thái kém hoạt động hơn. Quá

trình chuyển hóa thuốc xảy ra ở nhiều cơ quan trong cơ thể như gan, thành ruột, phổi,

thận và huyết tương. Trong số đó, gan là cơ quan chuyển hóa thuốc đầu tiên, đóng

vai trò như vị trí thải độc và loại thải các chất ngoại lai bằng cách biến đổi các hợp

chất tan trong lipid trở nên ưa nước hơn, quá trình này có sự tham gia của các enzyme.

Quá trình chuyển hóa thuốc tại gan trải qua 3 giai đoạn: pha I, pha II và pha

III. Trong đó pha I có sự tham gia của các enzyme CYP450, pha II được thực hiện

bởi các enzyme vận chuyển acid glucuronic của UDP (UDP-glucuronosyltransferase)

(chuyển hóa 40-70% các loại thuốc) và trong pha III thì các enzyme vận chuyển thuốc

(drug transporter) sẽ giúp đưa sản phẩm chuyển hóa thuốc tới mật.

Klingenberg lần đầu tiên phát hiện ra CYP450 vào năm 1954 trong nghiên cứu

về chuyển hóa hoocmon steroid, khi ông trích xuất một loại protein mới từ tế bào gan

[1]. Gần một thập kỷ sau, chức năng và tầm quan trọng của CYP450 đã được xác

định. Năm 1963, Estabrook và cộng sự đã mô tả vai trò của CYP450 như một chất

xúc tác trong quá trình tổng hợp hormone steroid và chuyển hóa thuốc. Cooper và

các đồng nghiệp sau đó đã xác nhận CYP450 là một enzyme chủ chốt liên quan đến

phản ứng hydroxyl hóa thuốc và steroid [2]. Nhiều protein CYP450 đã được phát hiện

rộng khắp cơ thể, chứng tỏ sự tham gia đáng kể vào hoạt hóa hóa học, khử hoạt tính

và gây ung thư [3].

Các enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc pha I là các protein biểu hiện

chủ yếu trên mạng lưới nội chất trơn và ti thể của các tế bào gan và biểu mô ruột non

(ngoài ra cũng còn ở một số cơ quan khác). Ở người, có 115 gen CYP450 bao gồm

5

cả các gen giả, được đặt tên bắt đầu từ CYP1A1 và kết thúc bởi CYP51P3. Các protein

được mã hóa bởi các CYP450 được phân loại dựa trên mức độ tương đồng về trình tự

của các amino acid thành các cấp độ từ họ (ví dụ: họ CYP1, CYP2…), phân họ (ví

dụ: phân họ CYP1A, CYP2B…) và từng enzyme riêng lẻ (ví dụ: enzyme CYP1A1,

CYP2D6…). Trong số các CYP450 biểu hiện trong gan thì CYP3A4 có mức độ biểu

hiện mạnh nhất (chiếm 22,1%), tiếp theo là 2 enzyme CYP2E1 (15,3%) và CYP2C9

(14,6%) tính trên tổng số protein trong gan. Các enzyme CYP450 tham gia xúc tác

cho nhiều loại phản ứng như: oxi hóa, oxi hóa sulpho (lưu huỳnh), hydroxyl hóa vòng

(nhân) thơm, hydroxy hóa hợp chất không vòng, khử (tách) nhóm N-alkyl, khử (tách)

nhóm O-alkyl (alkoxy).

Trong số các phản ứng này, phản ứng oxi hóa là phản ứng giúp thêm một

nguyên tử oxy vào phân tử thuốc, được biểu diễn bằng phương trình sau:

NADPH + H+ + O2 + RH → NADP+ + H2O + ROH

Về mặt cấu trúc, CYP450 là những protein có khoảng 400-500 amino acid và

chứa một nhóm heme với nguyên tử Fe ở trung tâm. Tất cả các CYP450 đều có chung

cấu trúc bảo thủ được tạo nên bởi bốn vòng xoắn D, L, I và E. Trong đó nhóm heme

nằm giữa vòng xoắn I và L. Mặc dù cấu trúc dạng gấp cuộn của CYP450 có tính bảo

thủ cao, vẫn có sự đa dạng trong cấu trúc của các họ CYP450 khác nhau từ đó cho

phép protein này kết hợp với các cơ chất với kích thước khác nhau và mức độ đặc

hiệu khác nhau. Một số CYP450 có tính đặc hiệu cao trong quá trình oxi hóa cơ chất,

trong khi đó CYP3A4 lại tham gia chuyển hóa hơn 50% các loại thuốc trên thị trường

hiện nay. Ở mức độ đơn giản nhất về mặt cấu hình nhận biết và kết hợp với cơ chất

thì có 6 vị trí nhận biết cơ chất (Substrate recognition site-SRS). Các vị trí này bao

gồm vùng xoắn B' (SRS1), một phần của các chuỗi xoắn F và G (SRS2 và SRS3),

một phần của chuỗi xoắn I (SRS4), vùng β2 của chuỗi xoắn K (SRS6) và cấu trúc

kẹp tóc β4 (SRS5) ở trung tâm hoạt động của CYP450 (Hình 1.1). Trên thực tế, các

SRS định trước tính đặc hiệu cơ chất của các CYP450 và những đột biến điểm xảy ra

tại các vị trí này do đó có thể ảnh hưởng đến độ đặc hiệu đối với cơ chất [4]. Các SRS

là những vùng cấu trúc linh hoạt, có thể di chuyển khi kết hợp với cơ chất và có khả

năng cảm ứng phù hợp với cơ chất, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho mối liên kết

enzyme-cơ chất và sau đó là phản ứng xúc tác [5].

6

CYP450 có cấu trúc gấp nếp bảo thủ và được thể hiện bởi các vòng xoắn (đánh dấu bằng các chữ cái in hoa). Các SRS được tô đậm tối màu.

Hình 1.1. Cấu trúc của CYP450 và các vị trí nhận biết cơ chất (SRS) [6].

1.2. Đa dạng di truyền các gen mã hóa cho enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa

thuốc.

Các gen chuyển hóa là một phần của hệ các gen dược học. Đây là những gen

đóng vai trò quan trọng trong biến đổi sinh học của thuốc, những thay đổi trong di

truyền của các gen này góp phần tạo nên sự khác biệt giữa các cá thể trong đáp ứng

thuốc [7]. Các gen liên quan đến chuyển hóa thuốc bao gồm gen mã hóa cho các

enzyme tham gia chuyển hóa thuốc pha I và pha II. Các enzyme chuyển hóa thuốc có

mức độ đa hình rất cao trong biểu hiện và hoạt tính của chúng.

Các CYP450 chính là nguồn gốc chính gây ra sự đa dạng trong dược động học

và dược lý học của thuốc. Các protein CYP450 biểu hiện mạnh nhất trong gan bao

gồm CYP3A4, CYP2C9, CYP2C19, CYP2C8, CYP2E1 và CYP1A2. Trong khi đó

các protein CYP2A6, CYP2D6, CYP2B6 và CYP3A5 biểu hiện ít hơn. Các CYP450

khác như CYP2J2, CYP1A1 và CYP1B1 biểu hiện chủ yếu ở ngoài gan. Các kiểu đa

7

hình di truyền khác nhau của các gen CYP450 sẽ quyết định về mặt chức năng và

kiểu hình chuyển hóa thuốc (PM, IM, EM và UM). Những CYP450 tham gia vào

chuyển hóa nhiều loại thuốc trên thị trường nhất hiện nay là CYP2C9, CYP2C19,

CYP2D6 và CYP3A4/5. Năm gen CYP450 nói trên mã hóa cho các enzyme tham gia

vào chuyển hóa 60-80% các loại thuốc thường được kê đơn. Trong số các protein

thuộc 18 họ CYP450, các protein có tính đa hình cao nhất là CYP2A6, CYP2B6,

CYP2C9, CYP2D6 và CYP2C19. Bên cạnh đó có một số protein CYP450 thuộc các

phân họ khác có tính đa hình thấp hơn như CYP1A1, CYP1A2, CYP2E1. Về chức

năng chuyển hóa thuốc, CYP3A4/5 tham gia chuyển hóa nhiều loại thuốc trên thị

trường nhất, tiếp theo là các enzyme CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 và CYP2E (Hình

1.2).

Phần tổng quan này trình bày khái quát về đa hình 04 gen mã hóa cho các

enzyme CYP450 chính tham gia chuyển hóa thuốc pha I bao gồm: CYP2C9,

CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5.

(a)Số lượng SNP trong một số gen CYP450. (b) Số lượng thuốc được chuyển hóa bởi các enzyme CYP450. Các số trong biểu đồ thể hiện số lượng SNP/thuốc được chuyển hóa.

Hình 1.2. Đa dạng di truyền các gen CYP450 và vai trò trong chuyển hóa thuốc [8].

1.2.1. Gen CYP2C9

Gen CYP2C9 nằm ở vai dài của nhiễm sắc thể số 10, mã hóa cho protein có

490 amino acid và có khối lượng phân tử là 55,6 kDa. Vùng gen chứa CYP2C9 cũng

8

bao gồm các gen mã hóa cho các enzyme CYP2C8, CYP2C18 và CYP2C19. Trong

số 4 gen này, CYP2C9 là gen biểu hiện mạnh nhất và tham gia nhiều nhất vào các

quá trình chuyển hóa thuốc. Trên thực tế, dữ liệu khối phổ cho thấy CYP2C9 chiếm

20% tổng số protein CYP450 trong gan. Ngoài gan, CYP2C9 cũng biểu hiện trong

đường tiêu hóa. Sau CYP3A4 và CYP2D6, CYP2C9 là enzym quan trọng nhất thuộc

họ cytochrome 450 tham gia vào các phản ứng oxi hóa và chuyển hóa khoảng 15%

các loại thuốc lưu hành bao gồm cả một số thuốc có chỉ số trị liệu hẹp [9]. Sự khác

biệt giữa các cá thể trong biểu hiện và hoạt tính của enzyme CYP2C9 có thể ảnh

hưởng tới hiệu quả sử dụng và sự an toàn khi dùng thuốc. Các phản ứng tương tác

thuốc xảy ra do sự ức chế hay kích hoạt CYP2C9 và đa hình di truyền của gen này là

nguyên nhân gây nên sự đa dạng trong hoạt tính của enzyme ở cấp độ in vivo [10,

11].

*Cơ chất đặc hiệu của CYP2C9

CYP2C9 tham gia vào quá trình oxi hóa của nhiều loại thuốc, đồng thời cũng

tham gia chuyển hóa nhiều hợp chất nội sinh trong cơ thể như acid linoleic, acid

arachidonic và các chất ngoại sinh không phải là thuốc khác (galangin, methiocarb,

pyrene, sulprofos). Phần lớn các cơ chất của CYP2C9 là các hợp chất ở dạng acid

yếu, tuy nhiên CYP2C9 cũng chuyển hóa dạng N-demethylation một số các loại thuốc

như amitriptyline, fluoxetins và zopiclone. S-flurbiprofen, S-wafarin, tolbutamide,

phenytoin, losartan và diclofenac đều là các cơ chất của CYP2C9. Trong đó,

Diclofenac và tolbutamide là các cơ chất thường xuyên được sử dụng trong các

nghiên cứu đánh giá kiểu hình hoạt tính của enzyme. Nói chung, các loại thuốc là cơ

chất chuyển hóa của CYP2C9 có thể phân làm các nhóm như thuốc chống đông máu,

thuốc hạ huyết áp, các thuốc kháng viêm không phải steroid và thuốc hạ đường huyết

dạng uống.

*Đa hình di truyền của CYP2C9 và sự phân bố giữa các quần thể trên thế giới

Allele CYP2C9*2 (3608C>T, p.Arg144Cys) và *3 (42614A>C, p.Ile359Leu)

là những allele được nghiên cứu nhiều nhất, đồng thời đây cũng là những allele được

nghiên cứu rộng rãi nhất tren nhiều quần thể người cho tới nay [12]. Đối với allele

CYP2C9*2 và *3, các kết quả nghiên cứu cho thấy những biến thể này làm giảm

chuyển hóa S-warfarin và tolbutamide in vitro. Đồng thời những bệnh nhân có mang

9

các biến thể này có liên quan chặt chẽ đến việc sử dụng warfarin với liều thấp hơn

liều thông thường và tăng nguy cơ chảy máu [13]. Một số allele khác ít phổ biến hơn

cũng đã được xác định, tuy nhiên ngày càng nhiều dữ liệu về các biến thể di truyền

của CYP2C9 trên thế giới nhờ các kĩ thuật hiện đang phát triển mạnh mẽ như giải

trình tự toàn bộ hệ gen và hệ gen biểu hiện. CYP2C9*3 là allele phổ biến của các

nước Nam Á và CYP2C9*2 rất hiếm khi xuất hiện ở các nước Đông Á. Trong khi các

biến thể gây sai nghĩa và dịch khung đọc mở có thiên hướng hiếm thì CYP2C9*9 là

allele phổ biến hơn so với *2 và *3 ở các quần thể châu Phi. Tương tự, CYP2C9*11

có tần số xuất hiện ở châu Phi cao gấp 10 lần so với châu Âu mặc dù *11 và *12 là

các allele phổ biến nhất ở châu Âu chỉ sau *2 và *3. Như đã nói, các nước khu vự

Đông Á có *3 là allele phổ biến nhất và hiếm khi xuất hiện *2 ở khu vực này. Trên

thực tế, CYP2C9*52 (33498C>G, p.Thr299Arg)-một biến thể hiếm gây sai nghĩa

cũng là biến thể ở khu vực Đông Á chỉ sau *3 [14]. Khu vực nam Ấn Độ xuất hiện

các allele *2, *3 và cả *14 (2%)-đây là allele rất hiếm khi xuất hiện ở các quần thể

khác trên thế giới. Trong một nghiên cứu trên 8 quần thể người khác nhau tại Mexico,

allele CYP2C9*2 xuất hiện ở 2 quẩn thể với tần số cao hơn so với khu vực Đông Á

và CYP2C9*3 xuất hiện ở 6 quần thể với tần số từ 3.7%-10.4% [15]. Kết quả này phù

hợp với tình trạng dân tộc có nguồn gốc pha trộn giữa châu Á và châu Âu của những

quần thể khu vực này.

Các biến thể gây dịch khung rất hiếm, trong đó allele CYP2C9*6 bị xóa 1

nucleotide ở exon 5 đã được công bố [16]. Biến thể này gây nên protein được tổng

hợp không hoàn chỉnh và không có hoạt tính, tần số xuất hiện của biến thể này tại

châu Phi là 1% và hiếm thấy hơn ở các quần thể người khác. Việc giải trình tự

CYP2C9 ở một số quần thể độc lập đã được tiến hành. Ví dụ, trong một nghiên cứu

ở những người Alaska bản địa và Ấn-Mỹ đã cho thấy CYP2C9*2 và *3 ở người Yupik

xuất hiện với tần số thấp hơp so với những chủng tộc người khác ở Alaska. Trong khi

đó ở khu vực Đông Á, CYP2C9*29 chiếm 2% ở tộc người Yupik, ngoài ra tộc người

này còn xuất hiện 2 biến thể mới là p.Met1Leu (6%) và p.Asn218Ile (4%) [17]. Với

việc thực hiện các nghiên cứu giải trình tự trên các quần thể người, các nhà khoa học

sẽ phát hiện được thêm các biến thể mới của CYP2C9.

Sự phân bố của một số biến thể sai nghĩa và dịch khung của CYP2C9 được

thể hiện chi tiết ở Hình 1.3.

10

Gen CYP2C9 mã hóa cho protein bao gồm 490 amino acid (khối lượng 55,6 kDa). Gen CYP2C9 bao gồ m 9 exon, nằm trên cụm gen bao gồm một số gen CYP450 thuộc nhiễm sắc thể số 10. Cơ sở dữ liệu về đa dạng di truyền các gen dược học (Pharmacogene variation- PharmVar) đã công bố 62 biến thể của CYP2C9. Trong số đó có các biến thể gây giảm (*2, *3), mất hoàn toàn hoạt tính của enzyme (*6, *15, *25) cùng với một số biến thể khác chưa rõ chức năng (như *13).

Hình 1.3. Các biến thể sai nghĩa và dịch khung của CYP2C9 [18].

Có một số các nghiên cứu về đa hình CYP2C9 ở vùng trình tự điều khiển của

gen này (khoảng 10.000 base ngược chiều với trình tự khởi đầu dịch mã). Tổng quát

lại, các nghiên cứu đã cho thấy các đa hình ở vùng mã hóa góp phần quan trong hơn

trong sự khác biệt về hoạt tính của enzyme nhưng cũng đã có những phát hiện thú vị

về các biến thể trong vùng trình tự không mã hóa.

Các biến thể trong vùng không mã hóa và ảnh hưởng của chúng tới chức năng

của protein được quan tâm nhiều nhất ở những cá thể mà không có đa hình nào được

tìm thấy ở vùng mã hóa. Biến thể -1188C>T (rs4918758) đã được báo cáo ở một vài

nghiên cứu trên người châu Âu, Bắc Mỹ và Nhật Bản. Mặc dù vậy, chưa có bằng

chứng nào cho thấy -1188C>T làm thay đổi quá trình phiên mã cũng như ảnh hưởng

tới liều dùng của wafarin [19]. Biến thể -2663delTG (rs71486745) nằm trong vùng

trình tự kết hợp với yếu tố phiên mã Nrf2 xuất hiện khá phổ biến ở những cá thể

không mang đa hình nào của CYP2C9 trong vùng mã hóa. Xa hơn về phía vùng 5’

của CYP2C9, biến thể -4302C>T (rs12251841) đã được tìm thấy ở người Mexico

nhưng lại không xuất hiện ở người Mĩ trắng không có nguồn gốc Latin [19]. Biến thể

11

này có liên quan tới sự giảm mức độ biểu hiện của gen. Một nghiên cứu xa hơn trên

những mẫu gan của các bệnh nhân được điều trị với warfarin cho thấy có nhiều kiểu

sắp xếp trình tự lặp lại ở vị trí -3979. Có 3 kiểu lặp lại được gọi tên dưới dạng ngắn,

vừa và dài đã được phát hiện. Kiểu lặp lại vừa là dạng biến thể phổ biến nhất, trong

khi đó nghiên cứu về cân bằng allele và gen báo cáo cho thấy dạng lặp lại ngắn có

liên quan tới sự giảm mức độ phiên mã của CYP2C9 trong gan. Hơn nữa, kiểu gen

đồng hợp tử với dạng lặp lại ngắn có liên quan tới cần giảm liều lượng warfarin, tuy

nhiên mức độ ảnh hưởng tới liều warfarin của biến thể dạng này không nhiều như

ảnh hưởng gây nên bởi CYP2C9*2 và *3 [20]. Một nghiên cứu về mối liên quan giữa

biến thể của CYP2C9 và liều lượng warfarin ở người Mỹ-Phi cho thấy một biến thể

trong intron 3 (rs7089580) có liên quan tới tăng liều dùng của warfarin. Biến thể này

nằm trong mối liên kết với một số biến thể khác trong intron và một trong các biến

thể này được cho là nằm trong vùng kết hợp với yếu tố phiên mã [21]. Một nghiên

cứu tương quan toàn bộ hệ gen (Genome-wide association study-GWAS) về liều

dùng warfarin ở người Mĩ-Phi đã cho thấy biến thể rs12777823 thuộc vùng điều khiển

của CYP2C9 có liên quan chặt chẽ đến liều lượng của thuốc này [22].

1.2.2. Gen CYP2C19

Protein CYP2C19 có khối lượng 55,92 kDa với 490 amino acid, protein này

được mã hóa bởi gen CYP2C19 dài 90,21 kb. Gen này bao gồm 9 exon, thuộc nhiễm

sắc thể số 10 tại vị trí 10q24.1. CYP2C19 biểu hiện trong gan với các bản phiên mã

dài 1901 bp, 2395 bp và 1417 bp. Enzyme này tham gia chuyển hóa nhiều loại thuốc,

trong đó có clopidogrel là thuốc sử dụng trong chống kết tập tiểu cầu. Những biến

thể di truyền của CYP2C19 lần đầu tiên được chú ý cách đây 46 năm. Kể từ thời điểm

đó, hơn 50 SNP đã được xác định với allele CYP2C19 kiểu dại được quy ước là *1.

Sự phân bố của một số biến thể CYP2C19 được thể hiện ở Hình 1.4.

12

Gen CYP2C19 gồm có 9 exon, nằm trên cụm gen bao gồm một số gen CYP450 thuộc nhiễm sắc thể số 10. Cơ sở dữ liệu PharmVar đến nay đã công bố 37 biến thể của CYP2C19, trong số đó một số biến thể đã biết chức năng như làm tăng cường (*17), giảm (*16, *26) hoặc mất hoàn toàn hoạt tính của enzyme (*2, *3, *7).

Hình 1.4. Phân bố một số biến thể trên gen CYP2C19 [18].

*Các biến thể gây giảm/mất chức năng enzyme CYP2C19

Các biến thể được nghiên cứu nhiều nhất từ trước đến nay là CYP2C19*2

(rs4244285) và *3 (rs4986893), cả 2 biến thể này đều có sự thay thế G bằng A.

CYP2C19*2 là biến thể tại vị trí nucleotide 681 trên cDNA, thuộc exon 5 gây ra sự

thay thế proline tại vị trí amino acid 227. CYP2C19*3 là biến thể tại nucleotide 636

trên cDNA thuộc exon 3 và gây nên sự thay thế tryptohan. Cả 2 biến thể đều tạo nên

hậu quả là hình thành protein CYP2C19 ngắn hơn bình thường, không có chức năng

và không có hoạt tính enzyme. Cụ thể, ảnh hưởng của các biến thể như CYP2C19*2,

*3 đến protein chức năng đã được đánh giá thông qua các nghiên cứu in vitro và in

vivo. Trong đó, các allele *2 và *3 làm giảm tỉ lệ chuyển hóa tiền chất proguanil thành

cycloguanil [23]. Những cá thể mang kiểu gen đồng hợp tử CYP2C19*2/*2 hoặc

CYP2C19*3/*3 sẽ có kiểu hình chuyển hóa yếu các cơ chất của CYP2C19 (ví dụ như

clopidogrel), điều này góp phần vào sự khác biệt trong đáp ứng thuốc giữa các cá thể.

Các biến thể khác cũng có liên quan đến mất chức năng enzyme CYP2C19 đó là *4

(1A>G), *5 (90033C>T), *6 (12478G>A), *7 (19294T>A) và *8 (12711T>C) nhưng

đây là những biến thể rất hiếm với tần số xuất hiện dưới 1% và cũng chưa được nghiên

cứu rộng rãi. Hoạt tính làm mất chức năng enzyme của các biến thể *5, *6, *7 khi

13

tham gia chuyển hóa thuốc S-mephenytoine cũng đã được chứng minh trong các

nghiên cứu in vitro trên đối tượng là người da trắng và người Nhật Bản [24, 25].

*Biến thể làm tăng cường chức năng enzyme CYP2C19

Một biến thể làm tăng cường chức năng CYP2C19 đã được phát hiện đó là

CYP2C19*17 (-806C>T, -3402C>T), biến thể này nằm ở vùng promoter của gen

CYP2C19. Biến thể trong vùng promoter thường được cho là làm thay đổi tương tác

với các yếu tố phiên mã, từ đó ảnh hưởng đến hiệu quả phiên mã của gen. Như vậy,

không chỉ những biến thể trong vùng mã hóa mà cả những biến thể trong vùng điều

khiển của gen cũng có thể gây ảnh hưởng lên biểu hiện của protein và từ đó tạo nên

sự khác biệt trong hoạt tính của enzyme. CYP2C19*17 liên quan tới hoạt tính chuyển

hóa mạnh của enzyme CYP2C19 thông qua tăng cường quá trình phiên mã của gen

này. Hoạt tính của CYP2C19 phụ thuộc vào mức độ biểu hiện của gen này trong gan,

điều này được quyết định bởi quá trình điều hòa phiên mã của gen. Bởi vậy mà hoạt

tính sinh học của clopidogrel cũng như những loại thuốc khác được chuyển hóa bởi

CYP2C19 sẽ tăng lên ở những cá thể mang allele CYP2C19*17. Kết quả là những

bệnh nhân mang allele CYP2C19*17 sẽ có nguy cơ cao bị chảy máu khi được điều

trị với clopidogrel. Trong một nghiên cứu các mẫu gan của những cá thể có kiểu gen

dị hợp tử CYP2C19*1/*17 và đồng hợp tử CYP2C19*17/*17, mức độ tổng hợp

mRNA gấp 1.8 và 2.9 lần trong mẫu gan từ các cá thể có kiểu gen đồng hợp tử dại

CYP2C19*1/*1 [26].

Phần lớn các biến thể của CYP2C19 là các SNP nằm trong vùng promoter và

exon (làm thay đổi trình tự amino acid) và intron. Một công bố mới đây năm 2019 đã

báo cáo về CNV của gen này, bao gồm hiện tượng mất hoàn toàn hoặc một phần

allele CYP2C19 [27].

*Sự phân bố các biến thể CYP2C19 ở các quần thể trên thế giới

Kiểu gen đồng hợp tử với allele CYP2C19*2 và *3 đã được báo cáo là chiếm

2% ở các quần thể người da trắng, 4% ở người châu Phi và 14% ở người Trung Quốc

[28]. Kiểu gen dị hợp tử CYP2C19*1/*2 chiếm 30% người da trắng, 40% ở người

Mỹ-Phi và gần 50% ở khu vực Đông Á [29-31]. Biến thể CYP2C19*3 kém phổ biến

hơn với số liệu được công bố là dưới 1% ở người da trắng và người Mỹ-Phi, 7-9% ở

14

người châu Á [32, 33]. CYP2C19*2 và *3 là những biến thể phổ biến nhất và chiếm

hơn 99% kiểu hình giảm chức năng protein CYP2C19 ở nhiều quần thể trên thế giới.

Đáng chú ý, kiểu hình giảm hoạt tính protein được xác định với tần số cao ở Vanuata

(70% *2 và 13% *3) và Papua New Guinea (40% *2 và 30* *3) [34, 35]. Biến thể

CYP2C19*17 cũng xuất hiện với tần số khác nhau ở các quần thể khác nhau, tần số

của biến thể này là dưới 5% ở người Trung Quốc và Nhật Bản [36, 37], trong khi đó

ở người châu Âu và châu Phi biến thể này xuất hiện với tần số gần 30% [38, 39].

1.2.3. Gen CYP2D6

Gen CYP2D6 nằm trên nhiễm sắc thể 22 tại vị trí 22q13.1 và có 9 exon, mã

hóa cho protein có khối lượng phân tử là 55,73 kDa. Trong số các gen CYP450 thì

CYP2D6 là gen có mức độ đa hình rất cao. CYP2D6 là enzyme quan trọng thuộc họ

CYP450, enzyme này tham gia chuyển hóa hơn 25% các loại thuốc đang lưu hành.

Trong số tất cả các enzyme CYP450 chuyển hóa thuốc, CYP2D6 là enzyme không

cảm ứng duy nhất và đóng vai trò lớn trong đa hình di truyền có liên quan đến các

đáp ứng thuốc khác nhau giữa các cá thể. Cũng như các CYP450 khác, các kiểu hình

chuyển hóa thuốc của CYP2D6 được phân làm 4 loại: PM, IM, EM và UM. Trong

đó, kiểu hình EM mang ít nhất 1 allele hoạt động, IM mang 2 allele giảm chức năng

hoặc 1 allele kém hoạt động kèm theo 1 allele không hoạt động, PM mang 2 allele

không hoạt động. Trong khi đó kiểu hình UM mang nhiều bản sao hoạt động của

CYP2D6. Số lượng bản sao của CYP2D6 có thể từ 2 đến 13 bản sao, sự hiện diện của

mỗi bản sao hoạt động sẽ làm tăng tốc độ chuyển hóa các cơ chất của enzyme này.

Sự phân bố của các allele CYP2D6 khác nhau giữa các quần thể trên thế giới, trong

đó PM chủ yếu phân bố ở châu Âu, UM chủ yếu phân bố ở Bắc Phi và Châu đại

dương và IM là kiểu hình phân bố nhiều ở các quần thể châu Á do tần số cao của

allele CYP2D6*10.

CYP2D6 tham gia chuyển hóa các cơ chất như thuốc chống trầm cảm

(amitriptyline, citalopram, clomipramine, desipramine, doxepin, fluvoxamine,

imipramine, maprotiline, mianserin, nortriptyline, fluoxetine, paroxetine), thuốc

chống co giật (hlorpromazine, clozapine, haloperidol, perphenazine, risperidone,

thioridazine, zuclopenthixol), thuốc chống loạn nhịp tim (flecainide, mexiletine,

propafenone), thuốc giảm đau (codeine, dihydrocodeine, morphine, tramadol), các

15

hóa chất chống ung thư (debrisoquine, gefitinib, sparteine, tamoxifen). Ảnh hưởng

của các đa hình CYP2D6 đến việc điều trị bằng các loại thuốc nói trên có liên quan

tới kiểu hình chuyển hóa thuốc mà đa hình đó quy định, đồng thời cũng phụ thuộc

vào việc thuốc đưa vào cơ thể có cần phải trải qua quá trình hoạt hóa để chuyển thành

dạng hoạt động hay không. Nếu như thuốc ban đầu đã ở dạng hoạt động thì kiểu hình

UM sẽ gặp phải tình trạng không đạt được hiệu quả điều trị, trong khi đó kiểu hình

IM và PM sẽ gặp phải phản ứng phụ của thuốc do nồng độ thuốc trong huyết thanh

cao hơn bình thường. Trong trường hợp thuốc ban đầu cần phải được chuyển sang

dạng hoạt hóa để đạt được hiệu quả điều trị thì IM và PM có thể không đạt được

lượng thuốc ở trạng thái hoạt hóa trong cơ thể để có thể đạt hiệu quả điều trị [40].

*Các đa hình của CYP2D6 và phân bố ở các quần thể trên thế giới

Trong số các gen CYP450, CYP2D6 là gen được nghiên cứu nhiều nhất về đa

hình di truyền. Bằng chứng đầu tiên về đa hình di truyền của gen này đến từ các

nghiên cứu về quần thể và gia đình từ những năm 1970, cho thấy sự thiếu hụt các

chất chuyển hóa debrisoquine 4-hydroxylation và sparteine N-oxidation xảy ra ở 5-

10% những người da trắng nguồn gốc châu Âu. Ở những quần thể người khác thì hiện

tượng này xảy ra với tỉ lệ thấp hơn. Những nghiên cứu về tương quan kiểu gen-kiểu

hình trên người da trắng khi sử dụng các loại thuốc là sparteine hoặc debrisoquine đã

chứng minh rất rõ về ảnh hưởng của đa dạng di truyền gen CYP2D6 đến chức năng

chuyển hóa thuốc của enzyme ở cấp độ in vivo [41].

Các đa hình của CYP2D6 có thể được phân loại theo ảnh hưởng lên chức

năng/hoạt tính của enzyme như: làm mất, làm giảm, không ảnh hưởng hoặc tăng

cường hoạt tính của CYP2D6. Trong số các biến thể của CYP2D6, các biến thể quan

trọng nhất có thể kể đến là CYP2D6*2, *4, *5, *10, *17 và *41. Các phân tích tương

quan kiểu gen-kiểu hình trên người da trắng khi sử dụng các tiền chất là

sparteine/debrisoquine đã có kết quả rõ rệt về ảnh hưởng của các đa hình CYP2D6

đến chức năng của enzyme này ở cấp độ in vivo [41, 42].

16

Sự phân bố của một số biến thể CYP2D6 được thể hiện ở Hình 1.5.

Gen CYP2D6 gồm có 9 exon, nằm trên nhiễm sắc thể số 22 và mã hóa cho protein có khối lượng 55,73 kDa. Cơ sở dữ liệu PharmVar đến nay đã công bố 139 biến thể của CYP2D6. Bên cạnh các SNP và các biến thể thêm/mất nucleotide (insertion/deletion-indel), CYP2D6 còn xuất hiện các CNV và các biến thể cấu trúc (Structural variant-SV).

Hình 1.5. Cấu trúc gen CYP2D6 và sự phân bố của một số biến thể [43].

CYP2D6*10 (100C>T) là allele phổ biến nhất ở người châu Á với tần số xuất

hiện là hơn 50%, có thể *10 cũng chính là allele phổ biến nhất trên thế giới của

CYP2D6. Biến thể này dẫn tới thay thế p.Pro34Ser, từ đó gây ảnh hưởng lên trình tự

PPGP-là một trình tự quan trọng giúp protein gấp cuộn, do vậy mà cấu trúc protein

được mã hóa sẽ không bền và cũng có ái lực thấp với các cơ chất. Ngược lại, tần số

allele CYP2D6*10 được xác định rất thấp ở người da trắng (chỉ khoảng 2%). Ở người

da đen, CYP2D6*17 (1023C>T) là allele chính được phát hiện vào năm 1996, biến

thể này cũng không được tìm thấy ở người da trắng. Biến thể này có 2 đột biến sai

nghĩa làm thay đổi cấu trúc của vị trí hoạt động của enzyme và dẫn tới thay đổi tính

đặc hiệu về cơ chất. Thông thường, hoạt tính của enzyme được mã hóa bởi

CYP2D6*17 kém hơn so với enzyme kiểu dại. Allele CYP2D6*41 chính là

CYP2D6*2 có mang thêm biến thể -1584G>C và có mức độ biểu hiện thấp hơn so

với CYP2D6*2. Đánh giá chức năng in vivo của *41 cho thấy khá rõ rệt là kiểu gen

đồng hợp tử *41/*41 có kiểu hình giống như chuyển hóa thuốc trung bình với 1 allele

CYP2D6 không hoạt động [44].

17

Trong số các gen CYP450, cùng với CYP2A6 thì CYP2D6 là gen đã có nhiều

báo cáo về các CNV cũng như SV. Về mặt cơ chế, hiện trượng trao đổi chéo không

cân giữa hai vùng có trình tự tương đồng với nhau dẫn tới các biến đổi về cấu trúc

của gen như: xóa gen hay lặp gen. Các biến thể tăng số bản sao của CYP2D6 đã được

phát hiện lần đầu tiên ở dạng CYP2D6*2x3. Về sau hiện tượng tăng số bản sao các

allele khác như CYP2D6*1, *4, *6, *10, *17, *29, *35, *43, *45 cũng đã được xác

định. Tần số xuất hiện của biến thể tăng số bản sao CYP2D6 ở người da trắng là 1-

5%, trong khi đó tần số này ở người Ả Rập và khu vực Đông Phi có thể lên đến 10-

50%.

1.2.4. Gen CYP3A5

Ở người, trong họ cytochrome P450 thì phân họ protein CYP3A đóng vai trò

lớn nhất trong quá trình chuyển hóa thuốc và các hợp chất hóa học ngoại sinh khác.

Các thành viên thuộc phân họ này là những enzyme được biểu hiện nhiều nhất trong

gan (chiếm khoảng 30% trên tổng số các CYP450), ruột non và thận. Trong số 4 gen

thuộc cụm gen CYP3A, 2 gen là CYP3A4 và CYP3A5 mã hóa cho các enzyme

CYP3A4 và CYP3A5 tham gia chuyển hóa thuốc nhiều nhất. Trong khi CYP3A4 có

các biến thể xuất hiện với tần số thấp và chức năng còn chưa được biết rõ, CYP3A5

biểu hiện với mức độ đa hình cao hơn ở những người trưởng thành và xuất hiện với

tần số khác nhau giữa các quần thể người. CYP3A5 là gen đầu tiên gần tâm động nhất

của cụm gen CYP3A, gen này nằm tại vị trí 7q22.1, gồm 13 exon mã hóa cho một

protein có khối lượng phân tử 52,5 kDa gồm 502 amino acid. Với nhân HEME và

phối tử kim loại sắt, protein CYP3A5 có hoạt tính monooxygenase và oxydoreductase

có vai trò tham gia các quá trình trao đổi chất steroid, trao đổi chất xenobiotic và quá

trình dị hóa oxy hóa thuốc. Sự biểu hiện của CYP3A5 và các protein CYP450 khác

ở gan và ống tiêu hóa được cho là nguyên nhân chính ảnh hưởng đến sinh chuyển hóa

của các loại thuốc đường uống. Biểu hiện của CYP3A5 chiếm khoảng 10% đến 30%

tổng số CYP3A ở gan. Đa dạng di truyền gen CYP3A5 được phân chia theo các biến

thể thuộc các vùng khác nhau của gen này và sự phân bố của các biến thể CYP3A5

được thể hiện ở Hình 1.6.

18

Gen CYP3A5 gồm có 13 exon, hiện nay có tổng số 10 allele của gen này được báo cáo trong cơ sở dữ liệu PharmVar. Theo quy ước thì allele CYP3A5*10 được xếp vào allele CYP3A5*3K.

Hình 1.6. Phân bố của các biến thể trên gen CYP3A5 [45].

*Các biến thể trong vùng mã hóa

CYP3A5*2: Biến thể di truyền đầu tiên của gen CYP3A5, CYP3A5*2, là một

đột biến thay thế nhầm nghĩa trong exon 11 (27289C> A) dẫn đến một sự thay đổi tại

vị trí amino acid 398 (p.Thr398Asn). Ảnh hưởng của SNP này vẫn chưa được làm rõ

trên cả mô hình in vivo và in vitro nhưng được cho là tạo ra một protein không chức

năng giống như các allele khác.

CYP3A5*4 và CYP3A5*6: CYP3A5*4 là một SNP xuất hiện trong exon 7 do

sự thay đổi nucleotide 14665A>G dẫn đến sự thay thế amino acid ở vị trí 200

(p.Gln200Arg) [46]. Trong khi đó CYP3A5*6 (14690G>A) cũng là một đột biến trên

exon 7, dẫn đến khi cắt nối pre-mRNA tạo ra sản phẩm mRNA bị thiếu exon 7 kéo

theo đó nó làm thay đổi khung đọc mở và tạo ra một protein không hoạt động chức

năng bị cắt ngắn ở amino acid 184 [47].

CYP3A5*7, CYP3A5*8, CYP3A5*9 và CYP3A5*10: CYP3A5*7 là đột biến

chèn nucleotide T ở exon 11 (27131-32insT). Hậu quả là gây ra một sự thay đổi khung

và kết thúc khung đọc mở của CYP3A5 tại codon 348, tạo ra một allele không hoạt

động. CYP3A5*8 (3699C>T) là SNP xuất hiện trên trong exon 2 dẫn đến thay đổi

codon 28 từ CGT (Arg) -> TGT (Cys). CYP3A5*9 cũng gây ra biến đổi amino acid

ở codon 337, từ GCA (Ala) -> ACA (Thr) là kết quả của đột biến 19386G>A ở exon

10 [48]. Trong khi đó một SNP quan trọng là CYP3A5*10 (29753T>C) trong exon

12, dẫn đến một thay thế amino acid tại vị trí 446 từ Phe (TTT) > Ser (TCT) trong

trình tự liên kết với HEME của CYP3A5 [48]. Với quy ước hiện nay, SNP này được

xếp vào allele CYP3A5*3K.

19

*Các biến thể trên intron

CYP3A5*3: Biến thể CYP3A5*3, 6986A>G (CYP3A5*3C) trong intron 3 là

biến thể phổ biến nhất và có chức năng quan trọng tìm thấy ở tất cả các quần thể đã

nghiên cứu. Biến thể này tạo nên vị trí cắt ẩn (cryptic splice site) ở intron 3, kết quả

là tạo nên cắt nối mRNA bất thường. Sản phẩm mRNA sau phân cắt của biến thế này

sẽ có đoạn chèn từ intron 3 và làm lệch khung đọc mở, dẫn tới hình thành mã kết thúc

sớm và protein được tạo ra không có hoạt tính. Những cá thể có kiểu gen đồng hợp

tử CYP3A5*3/*3 được coi như là không biểu hiện protein này (CYP3A5 non-

expressors). SNP này dẫn đến exon 3B có nguồn gốc từ intron 3 dài 131 bp được

chèn vào giữa exon 3 và exon 4 trong mRNA trưởng thành (SV1), tuy nhiên một một

lượng nhỏ mRNA bình thường cũng được tạo thành [47, 49]. SV1 gây ra sự thay đổi

khung và xuất hiện mã kết thúc sớm, do đó protein được mã hóa không có chức năng

do bị cắt ngắn từ amino acid 102. Sự thay đổi khung dịch này cũng dẫn đến sự xuất

hiện 2 exon mới là exon 4B trong SV2 và exon 5B và xóa đồng thời exon 6 trong SV-

3. Đặc biệt, SNP này gần như liên kết hoàn toàn với SNP 31611C>T (allele gồm 2

SNP này gọi là CYP3A5*3A). Biến thể 6986A >G cũng di truyền liên kết với SNP -

74C>T (CYP3A5*1C) nhưng SNP này được cho là không ảnh hưởng đến hoạt động

của CYP3A5 [45]. Ngoài ra SNP 6986A>G còn tương quan với một vài SNP khác

tạo lên các halotype của CYP3A5*3 được đánh dấu từ CYP3A5*3A đến CYP3A5*3L.

CYP3A5*5: đây là một đột biến thay thế nucleotide T>C ở vùng 5’ của intron

5 (12952T>C), ảnh hưởng tới trình tự nằm kề với vị trí cho 5’splicing donor site. Kết

quả dẫn đến bất thường trong cắt nối mRNA, làm dịch khung đọc mở và tạo nên một

peptide ngắn hoặc giảm số lượng của protein được mã hóa thông qua sự bất hoạt vị

trí 5’ donor site hoặc ức chế hoàn toàn quá trình cắt nối mRNA.

*Các biến thể không mã hóa tại các vùng không dịch mã

Các allele *1B (-86G>A), *1C (-74C>T) là các SNP xuất hiện trong vùng

5’UTR và allele *1D (31611C>T ) ở trong vùng 3’UTR của gen CYP3A5, được báo

cáo là không ảnh hưởng tới biểu hiện của gen vì chúng không nằm trong trình tự liên

kết với các yếu tố phiên mã. Nhưng điều thú vị là nhiều SNP đã được phát hiện trong

20

vùng 5’ không dịch mã có ảnh hưởng tới hoạt động của CYP3A5 lại nằm trong gen

giả AP1.

1.3. Ảnh hưởng của đa dạng di truyền các gen dược học đối với các ADR và sự

khác biệt trong đáp ứng thuốc

1.3.1. Khái quát về các ADR

Các ADR hiện nay đang là mối quan tâm lớn trong lâm sàng, đây cũng là một

trong những nguyên nhân chính gây nên tử vong ở các nước phương tây. ADR là một

đáp ứng với thuốc dưới dạng ngộc độc và ngoài ý muốn mặc dù dùng thuốc ở liều

thông thường phục vụ cho mục đích dự phòng, điều trị hay chẩn đoán cũng như điều

chỉnh chức năng sinh lý (Theo Tổ chức sức khỏe thế giới). Từ năm 1945-2018, theo

dữ liệu thu được từ PubMed đã có 140.879 công bố quốc tế về các phản ứng có hại

của thuốc và 28.0473 công bố về tương tác thuốc. Hàng năm có khoảng 197.000

người tử vong ở châu Âu có nguyên nhân do ADR [50].

ADR có thể là kết quả từ việc kê đơn thuốc không phù hợp với bệnh nhân, độc

tính có sẵn trong thuốc, độc tính trên từng loại tế bào cũng như mối tương tác giữa

các loại thuốc khi bệnh nhân được điều trị theo phác đồ kết hợp các loại thuốc khác

nhau do mắc cùng lúc một số rối loạn. Vấn đề về ADR trở nên đặc biệt quan trọng

trong trường hợp các bệnh mạn tính, khi mà bệnh nhân phải điều trị lâu dài hoặc trong

trường hợp bệnh nhân lớn tuổi và phải sử dụng nhiều loại thuốc mỗi ngày. Nghiên

cứu được thực hiện tại Ấn Độ đã cho thấy ảnh hưởng của ADR lên các cơ quan trong

cơ thể ở 160 người già (>65 tuổi) là các bệnh về tiêu hóa, còn ở 231 trẻ em (<12 tuổi)

là các vấn đề về da và hệ tiêu hóa [51]. Cụ thể, đối với người già trên 65 tuổi thì hệ

cơ quan bị ảnh hưởng nhiều nhất bởi các ADR là hệ tiêu hóa (33%), sau đó là hệ thần

kinh (16%), tiếp theo là da (13%). Trong khi đó ở trẻ em dưới 12 tuổi thì hệ cơ quan

bị ảnh hưởng chủ yếu bởi ADR là da (32%) và hệ tiêu hóa (25%) (Hình 1.7). Các

nhóm thuốc gây nên ADR ở người già vao gồm thuốc tim mạch (23,75%) và thuốc

dùng cho hệ thần kin trung ương (18,13%). Đối với trẻ em thì phần lớn các thuốc cho

thấy phản ứng ADR là thuốc kháng khuẩn (33,46%) và thuốc cho các bệnh về máu

(14,12%).

21

a) Người lớn tuổi (n=160, > 65 tuổi), b) trẻ em (n=231, <12 tuổi).

Hình 1.7. Ảnh hưởng của các ADR tới các cơ quan trong cơ thể [51].

Một số ví dụ điển hình về tác dụng có hại của thuốc ở người lớn tuổi có thể kể

đến như: biểu hiện té ngã liên quan tới dùng thuốc chống động kinh, chống trầm cảm

và thuốc hạ huyết áp, dùng nhiều thuốc cùng lúc gây nên hiện tượng mê sảng và tăng

tỉ lệ tử vong, nhiễm Clostridium difficile liên quan tới sử dụng nhiều loại kháng sinh

không phù hợp, tăng nguy cơ đột quỵ với bệnh nhân mất trí nhớ phải sử dụng thuốc

chống loạn thần, những vấn đề về tăng huyết áp, chảy máu và tim mạch nói chung có

liên quan tới các thuốc kháng viêm không phải steroid… Để giảm nhẹ các trường hợp

ADR, ngày càng có nhiều các thông tin về thuốc trong vòng hai thập kỉ gần đây, đặc

biệt là việc thiết kế phân tích các tương tác thuốc và hỗ trợ các bác sĩ trong việc quyết

định sử dụng thuốc có hiệu quả [52]. Tuy nhiên hiện nay mới chỉ có một vài nguồn

thông tin có sử dụng di truyền dược học như một công cụ hỗ trợ cho việc điều trị

22

thuốc trong lâm sàng [53, 54]. Hiện nay, sự phát triển nhanh chóng trong lĩnh vực di

truyền dược học đã cải thiện những hiểu biết về ADR đồng thời tăng tính chính xác

trong việc kê đơn thuốc và giảm thiểu những gánh nặng không cần thiết trong những

trường hợp chịu ảnh hưởng phụ của thuốc [55]. Di truyền dược học chiếm hơn 80%

trong các trường hợp biến động về tính hiệu quả và an toàn của thuốc. Hơn 400 gen

đã biết có ảnh hưởng đến hiệu quả và độ an toàn khi dùng thuốc và hơn 240 gen có

liên quan tới ADR [56]. Bên cạnh các chỉ dẫn về liều dùng, công tác quản lý thuốc

và những hướng dẫn y tế thường quy, việc kết hợp áp dụng di truyền dược học cũng

sẽ góp phần giảm thiểu các nguy cơ gặp phải khi bệnh nhân được chỉ định dùng thuốc

không phù hợp. Các quần thể người trên thế giới có sự không đồng nhất về mặt di

truyền, do đó mà công tác điều trị theo hướng cá thể hóa chính là yếu tố quyết định

để giảm thiểu các trường hợp ADR. Các rối loạn về tim mạch, ung thư và hệ thống

thần kinh trung ương chiếm khoảng 80% số ca bệnh và tử vong ở các nước phát triển.

Việc điều trị bằng thuốc chiếm 15-20% chi phí điều trị, như vậy có thể nói việc tiến

hành kiểm tra di truyền trước khi điều trị sẽ đem lại lợi ích rất lớn về mặt kinh tế,

nâng cao chất lượng cuộc sống cũng như tối ưu hóa quá trình điều trị [57, 58].

1.3.2. Một số trường hợp đa dạng di truyền các gen dược học gây nên khác biệt

trong đáp ứng thuốc

Bộ máy hoạt động của hệ gen dược học là sự kết hợp của nhiều gen mã hóa

cho các enzyme và protein là đích tác dụng của thuốc, ngoài ra còn có sự tham gia

của hệ di truyền ngoại gen tham gia vào quá trình điều hòa biểu hiện của gen. Các

gen có liên quan đến các đáp ứng thuốc thuộc 5 nhóm: (i) các gen gây bệnh, (ii) các

gen liên quan đến cơ chế hoạt hóa thuốc (enzyme, thụ thể, chất dẫn truyền tín hiệu),

(iii) các gen liên quan đến chuyển hóa thuốc (các enzyme chuyển hóa thuốc pha I và

pha II), (iv) các gen liên quan đến các kênh vận chuyển thuốc (ATPase, ATP binding

cassette transporters) và các chất mang, (v) các gen đa hiệu tham gia vào nhiều con

đường tín hiệu và nhiều phản ứng chuyển hóa [59, 60].

Trong số các cơ quan thì gan là vị trí đầu tiên tham gia vào các phản ứng

chuyển hóa sinh học của thuốc, ngoài ra còn có các cơ quan khác như thận, phổi,

đường tiêu hóa, cơ và da. Hầu hết các nghiên cứu về biến thể của hệ gen dược học

đều tập trung vào các enzyme chuyển hóa thuốc pha I, cụ thể là các gen CYP450.

23

* Ảnh hưởng của đa hình CYP2C9 trong lâm sàng

Warfarin là thuốc được sử dụng trong điều trị rối loạn đông máu phổ biến nhất

hiện nay. Mặc dù thuốc có hiệu quả cao trong điều trị bệnh, liều dùng của warfarin

thực sự là vấn đề đáng quan tâm bởi đây là loại thuốc có chỉ số điều trị hẹp và cần có

những liều dùng thích hợp đối với các bệnh nhân khác nhau. Những hậu quả gây ra

bởi sử dụng warfarin không đúng liều là một trong những phản ứng có hại của thuốc

được báo cáo thường xuyên nhất về Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ

(U.S. Food and Drug Administration-FDA). Đồng thời những biến chứng khi dùng

sai liều warfarin cũng là một trong những nguyên nhân thường thấy nhất khi bệnh

nhân tới phòng cấp cứu.

Việc kê liều lượng warfarin dựa chủ yếu vào kinh nghiệm lâm sàng của các

bác sĩ: trước tiên đưa ra một liều dùng khởi đầu, sau đó theo dõi chỉ số phản ánh thời

gian hình thành cục máu đông (International normalized ratio-INR) của bệnh nhân

hàng tuần và dựa vào đó để điều chỉnh liều thuốc cho phù hợp. Thông thường, liều

warfarin khởi đầu thường là 4-5 mg/ngày. Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, liều tấn

công được sử dụng ở những ngày điều trị đầu tiên, trong khi việc xác định liều phù

hợp mất khoảng vài tuần tới vài tháng, bệnh nhân sẽ rơi vào nguy cơ bị chảy máu cao

hoặc không đạt hiệu quả chống đông máu trong thời gian này. Những kết quả nghiên

cứu in vitro và in vivo cho thấy CYP2C9*2 và *3 giảm hoạt tính chuyển hóa S-

warfarin với tỉ lệ lần lượt khoảng 30-40% và 80-90% [61]. So với những bệnh nhân

có kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại CYP2C9*1/*1 thì người mang 1 hoặc 2 bản sao của

*2 hoặc *3 có nguy cơ cao không đông máu khi điều trị với warfarin, họ cần được sử

dụng liều warfarin thấp hơn để có thể đạt được hiệu quả điều trị, đồng thời cũng cần

thời gian dài hơn để đạt được chỉ số INR cân bằng.

Bên cạnh CYP2C9*2 và *3, một số biến thể khác như *5, *6, *8 và *11 cũng

có liên quan tới giảm hoạt tính enzyme CYP2C9, góp phần tạo nên nhu cầu dùng liều

warfarin khác nhau giữa các bệnh nhân. Những biến thể *5, *6, *8 và *11 này được

tìm thấy với tần số cao nhất ở người châu Phi. Hiện nay, hầu hết những xét nghiệm

cho CYP2C9 được công nhận bởi FDA chỉ quan tâm tới các biến thể *2 và *3, tuy

nhiên một số các phòng thí nghiệm lâm sàng đã lưu ý tới việc mở rộng số lượng biến

thể CYP2C9 cần sàng lọc trước khi bệnh nhân sử dụng thuốc. Như đã nói ở trên, trong

24

khi *2 và *3 là các allele phổ biến nhất ở các quần thể trên thế giới thì các quần thể

ở khu vực châu Phi lại xuất hiện tần số các allele *5, *6, *8 và *9 cao hơn. Bởi vậy

đây là những allele quan trọng cần lưu tâm trong việc điều trị với warfarin đối với

những bệnh nhân châu Phi. Nếu như sàng lọc không thấy xuất hiện các allele *5, *6,

*8 và *9 thì có thể tiến hành điều trị với liều warfarin thông thường trên những đối

tượng này.

Đối với phenytoin, CYP2C9 đóng vai trò chuyển hóa 90% loại thuốc này,

trong đó các allele CYP2C9*2 và *3 làm giảm hoạt tính enzyme trong phản ứng

chuyển hóa phenytoin. Bên cạnh đó, các allele *4 và *6 đã được báo cáo là xuất hiện

ở những bệnh nhân có phản ứng phụ khi điều trị với phenytoin [16, 62]. Các allele

khác như *5 (rs28371683, p.Asp360Glu), *8 (rs7900194, p.Arg150His) và *11

(rs28371685, p.Arg335Trp) có liên quan đến giảm chuyển hóa phenytoin ở người

châu Phi.

*Ảnh hưởng của đa hình CYP2C19 trong lâm sàng

Các biến thể của CYP2C19 có liên quan tới rối loạn kháng clopidogrel, đây là

tình trạng bệnh nhân phải sử dụng thuốc clopidogrel nhưng không đạt được hiệu quả

điều trị so với người không có mang đa hình của gen này. Những đa hình của

CYP2C19 có liên quan đến kháng clopidogrel đều làm giảm hoạt tính của CYP2C19

trong phản ứng chuyển hóa clopidogrel sang dạng hoạt động. Nếu như cơ thể có 2

bản sao kiểu dại của CYP2C19 (*1/*1) thì sẽ có khả năng chuyển hóa clopidogrel

bình thường. Như đã nói ở phần trên, 2 biến thể phổ biến nhất đã biết của CYP2C19

có liên quan đến kháng colopidogrel là *2 và *3, những người mang biến thể dạng

này sẽ có protein CYP2C19 không có khả năng hoạt hóa clopidogrel. Những cá thể

kháng colpidogrel được chia làm 2 nhóm: IM và PM. Người mang kiểu gen

CYP2C19*1/*2 hoặc CYP2C19*1/*3 sẽ có kiểu hình IM. Người mang kiểu gen

CYP2C19*2/*2 hoặc CYP2C19*3/*3 sẽ có kiểu hình PM. Do việc chuyển hóa

clopidogrel sang dạng hoạt động bị ức chế ở người kháng clopidogrel, thuốc này sẽ

không có khả năng gây ức chế lên thụ thể P2RY12. Do thiếu sự can thiệp của

clopidogrel, thụ thể P2RY12 sẽ tiếp tục kích thích sự kết tập của tiểu cầu và hình

thành nên các cục máu đông. Điều này rất nguy hiểm vì có thể dẫn đến đột quỵ, đau

tim hoặc huyết khối tĩnh mạch sâu đe dọa tính mạnh của người bệnh.

25

Đối với thuốc chống trầm cảm dạng ức chế tái hấp thu serotonine (Selective

serotonin reuptake inhibitors-SSRI), những bệnh nhân có 1 hoặc 2 bản sao mất chức

năng của CYP2C19 thường sẽ phải dùng liều cao hơn so với người có kiểu hình EM.

Đối với kiểu hình UM, vai trò của CYP2C19*17 đối với nồng độ thuốc trong huyết

tương vẫn còn chưa được làm rõ và cần có các nghiên cứu xa hơn.

Một số các loại thuốc khác cũng bị ảnh hưởng bởi những đa hình trong

CYP2C19 có thể kể đến như các thuốc ức chế bơm proton (sử dụng trong điều trị loét

dạ dày), thuốc chống trầm cảm (điều trị rối loạn tâm thần), thuốc hỗ trợ giấc ngủ,

thuốc chống co giật, thuốc chống lại sự nhân lên của retrovirus.

*Ảnh hưởng của đa hình CYP2D6 trong lâm sàng

Trong điều trị ung thư: Tamoxifen được chuyển hóa sang dạng hoạt động là

endoxifen bởi CYP2D6. Người ta thấy hiệu quả điều trị ở những bệnh nhân có kiểu

hình PM thấp hơn và do đó cần cân nhắc việc kiểm tra di truyền CYP2D6 trước khi

tiến hành điều trị. Khi sử dụng thuốc chống nôn đối kháng thụ thể 5-

hydroxytryptamine type3 tropisetron và ondasetron, tác dụng của thuốc này có tăng

lên và liên quan tới kiểu gen của CYP2D6. Ở những bệnh nhân có nhiều bản sao hoạt

động của CYP2D6 thì có nồng độ thuốc trong huyết tương thấp hơn và mức độ nôn

nặng hơn so với những người khác.

Trong điều trị các rối loạn tâm thần: Nghiên cứu của Kirch-heiner và cộng sự

cho thấy liều dùng của 50% các thuốc hướng thần phụ thuộc vào kiểu gen CYP2D6

của bệnh nhân [63]. Trong số 100 bệnh nhân mắc rối loạn tâm thần liên tục hơn 2

năm, người ta thấy số lượng các ca gặp phải phản ứng có hại của thuốc cao nhất ở

những bệnh nhân có kiểu hình PM và tiếp theo đó là IM [64]. Chi phí tiêu tốn cho

các bệnh nhân có kiểu hình PM hoặc UM mỗi năm tăng 4000-6000USD so với các

kiểu hình IM và EM. Bên cạnh đó thời gian điều trị cho những bệnh nhân có kiểu

hình PM cũng kéo dài hơn [64]. Nghiên cứu của Kirch-heiner cho thấy việc chuyển

hóa 50% các thuốc chống trầm cảm trong đó có imipramine, nortriptyline, maprotiline

phụ thuộc vào kiểu gen CYP2D6. Trong khi đó thuốc chống trầm cảm loại SSRI phụ

thuộc chính vào kiểu gen CYP2C19. Các dạng phản ứng phụ của thuốc cũng được

ghi nhận ở những người có kiểu hình PM. Ngoài ra, những trường hợp không đáp

ứng thuốc điều trị trầm cảm thường dẫn đến những tình huống nghiêm trọng và cũng

26

đã được báo cáo là có liên quan đến kiểu gen CYP2D6 của bệnh nhân [65]. Kiểu hình

UM thường chiếm tần số cao trong nhóm người bệnh không đáp ứng thuốc. Ở châu

Âu, khoảng 40-50 triệu người mang nhiều bản sao của CYP2D6 trên cùng 1 allele,

điều này có thể giải thích cho việc quần thể người châu Âu thường không có đáp ứng

với thuốc điều trị trầm cảm. Những nghiên cứu sâu hơn trong lĩnh vực đáp ứng với

thuốc điều trị trầm cảm có tầm quan trọng lớn lao trong tương lai.

Trong điều trị rối loạn tim mạch: Trong điều trị đau tức ngực, quá trình

hydroxyl hóa thuốc perhexiline được chuyển hóa chủ yếu bởi CYP2D6 và hoạt tính

của enzyme này trong chuyển hóa perhexiline ở người có kiểu hình EM cao gấp 100

lần so với người có kiểu hình PM [66]. Perhexiline ở một ngưỡng nào đó có thể gây

độc cho gan và thần kinh ngoại biên, do vậy mà việc xác định kiểu gen của CYP2D6

ở bệnh nhân điều trị sẽ hỗ trợ cho việc xác định liều dùng, từ đó sẽ giảm thiểu nguy

cơ ngộ độc thuốc do nồng độ thuốc không phù hợp [67]. Trong một nghiên cứu hồi

cứu, Wuttke và cộng sự [68] đã xác định được 24 bệnh nhân được điều trị với

metoprodol và bị gặp phải phản ứng phụ của thuốc này. Kết quả phân tích kiểu gen

cho thấy nhóm bệnh nhân này có tần số kiểu hình PM cao gấp 5 lần (38%) so với

quần thể bình thường.

Trong sử dụng thuốc giảm đau: Codein là một loại thuốc giảm đau được sử

dụng rộng rãi, đây cũng là loại thuốc được biết đến là nguyên nhân gây nên những

phản ứng ADR nghiêm trọng ở một số quần thể, đặc biệt là ở những trẻ sau khi phẫu

thuật cắt amidan. Codein được chuyển hóa bởi enzyme CYP2D6, do vậy mà những

cá thể có kiểu hình PM sẽ không đạt được hiệu quả giảm đau, khoảng 7% số dân da

trắng và 1%-3% chủng tộc khác gặp phải trường hợp này [69]. Ngược lại, kiểu hình

UM lại là nguy cơ gây ngộ độc thuốc giảm đau, trong đó các triệu chứng là suy giảm

hô hấp và tử vong. Ngoài ra thì quá trình chuyển hóa codein còn có sự tham gia của

enzyme UGT2B7 và các đa hình trong gen mã hóa cho enzyme này cũng đã được

báo cáo là có nguy cơ gây nên suy hô hấp.

27

*Ảnh hưởng của đa hình CYP3A5 trong lâm sàng

Những cá thể có kiểu gen CYP3A5*1/*1 hoặc CYP3A5*1/*3 có biểu hiện

CYP3A5 sẽ có tốc độ chuyển hóa các cơ chất của CYP3A5 nhanh hơn so với những

người có kiểu hình không biểu hiện CYP3A5 (ví dụ như CYP3A5*3/*3) [70]. Một

trong những loại thuốc quan trọng được chuyển hóa bởi CYP3A5 là tacrolimus, thuốc

này được sử dụng nhằm ức chế loại thải sau ghép tạng. Những người mang allele

CYP3A5*1 có tốc độ loại thải thuốc nhanh hơn với những người mang kiểu gen khác.

Trong những trường hợp lý tưởng, nồng độ của tacrolimus cần phải đạt đủ cao để

tránh tạng mới ghép bị đào thải do hệ miễn dịch của người nhận, nhưng cũng phải đủ

thấp để không gây độc với người bệnh. Liều lượng tacrolimus được kiểm soát hàng

ngày sau khi bệnh nhân được ghép tạng và được điều chỉnh liều cho phù hợp. Kiểu

gen CYP3A5*1/*3 đã được chứng minh là có liên quan tới tốc độ đào thải thuốc kháng

retrovirus nhanh hơn so với kiểu gen *3/*3. Ở những bệnh nhi mắc bệnh tăng lympho

bào B cấp tính và được điều trị với vincristine, những người có biểu hiện protein

CYP3A5 cho thấy ít bị ngộ độc thuốc điều trị hơn [71]. Một nghiên cứu gần đây trên

những bệnh nhân ung thư biểu mô thận được điều trị với sunitinib, CYP3A5*1 có liên

quan tới nguy cơ bị ngộ độc thuốc và cần phải giảm liều [72].

Nghiên cứu trên những người phụ nữ Nhật Bản có biểu hiện CYP3A5 cho thấy

họ có nguy cơ mắc ung thư vú cao hơn so với những người không biểu hiện protein

này [73]. Trong một nghiên cứu khác nhỏ hơn với 48 người Mĩ gốc Phi và 50 người

da trắng (là nữ), không tìm thấy mối liên hệ giữa việc dùng thuốc tamoxifen cũng

như những tác dụng phụ của thuốc này ở những người mang các allele như *1, *3 và

*6. Tuy nhiên có sự liên quan có ý nghĩa đã được chỉ ra ở những người có kích thước

khối u lớn và mang allele *6 (p<0,02) [74].

Bên cạnh 4 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 thì một số bằng

chứng cho thấy những kiểu gen CYP2B6 gây ra kiểu hình PM (đồng hợp tử hoặc dị

hợp tử kép đối với 2 allele *6 và/hoặc *8) có liên quan đến giảm lượng efavirenz

được chuyển hóa, đồng thời tăng nguy cơ ngộ độc thuốc này, đặc biệt là ngộ độc hệ

thần kinh trung ương và tổn thương gan [75] hoặc cũng có thể dẫn tới không đạt hiệu

quả điều trị. Trong khi điều trị với thuốc efavirenz, nồng độ yêu cầu ở mức kiểm soát

của thuốc này trong máu là 1-4 μg/mL, mặc dù vậy nồng độ dưới 1 μg/mL không hẳn

28

là thể hiện thất bại trong điều trị, ngược lại nếu trị số này vượt quá 4 μg/mL cũng

chưa khẳng định được chắc chắn sẽ gây độc đối với cơ thể. Chỉ dẫn của CPIC đã đưa

ra khuyến cáo về liều dùng efavirenz cụ thể đối với từng kiểu hình chuyển hóa thuốc

của CYP2B6. Những hướng dẫn về sử dụng liều thuốc efavirenz có liên quan đến

kiểu gen CYP2B6 (đặc biệt với sự có mặt của biến thể CYP2B6*6) đã được báo cáo

trong các nghiên cứu lâm sàng. Những người có kiểu hình EM sẽ có đáp ứng thuốc

tốt với liều tiêu chuẩn của efavirenz (600 mg/ngày). Đối với kiểu hình CYP2B6 IM

sẽ có nguy cơ gặp phải phản ứng có hại của thuốc cao gấp 1,3 lần so với kiểu hình

EM [76, 77], do vậy mà có khuyến cáo (ở mức độ trung bình) cần sử dụng thuốc với

liều thấp hơn là 400mg/ngày. Đối với những người mang kiểu hình CYP2B6 PM thì

nguy cơ gặp phải phản ứng có hại của thuốc cao hơn 2 kiểu hình EM và IM tới 4,8

lần [78]. Khuyến cáo (ở mức độ mạnh) về liều lượng thuốc khởi đầu từ 200-

400mg/ngày. Kiểu hình chuyển hóa thuốc UM dường như chỉ có ảnh hưởng ở mức

độ nhỏ trong chuyển hóa thuốc efavirenz, bởi vậy mà cho tới nay vẫn chưa có khuyến

cáo cụ thể về thay đổi liều thuốc đối với 2 kiểu hình nói trên. Ngoài ra, các biến thể

của CYP2B6 cũng được cân nhắc trong quá trình duy trì điều trị chứng nghiện thuốc

giảm đau nhóm opioid. Trên thực tế, liều dùng methadone trong điều trị chứng nghiện

thuốc giảm đau nhóm opioid cần phải giảm đáng kể ở những bệnh nhân mang kiểu

gen đồng hợp tử CYP2B6*6/*6 [79].

Bên cạnh các enzyme chuyển hóa thuốc pha I thì một ví dụ khác về đa hình

gen chuyển hóa thuốc pha II dẫn tới ngộ độc thuốc là enzyme chuyển hóa các thuốc

thiopurine (Thiopurine S-methyltransferase-TPMT). Sự thiếu hụt enzyme TPMT

đã được chỉ ra là có liên quan tới việc tăng lượng thioguanine gây độc với cơ thể.

Các phản ứng ADR khi sử dụng các loại thuốc thiopurine bao gồm ức chế tủy

xương sản sinh các tế bào hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu và tử vong. Vì vậy việc đáng

quan tâm là cần sàng lọc hoạt tính enzyme TPMT ở các bệnh nhân trước khi đưa

vào điều trị với các thuốc thiopurine, từ đó giảm thiểu được tỉ lệ ADR. Biến thể

phổ biến nhất của TPMT ở người da trắng là *3A (5%) và ở các quần thể châu Á

là *3C (2%) [80]. Thông thường, ở các quần thể có khoảng 0.3% số cá thể mang

enzyme TPMT giảm hoạt tính hoặc không có hoạt tính, thường là do cơ thể đồng

hợp tử với các allele TPMT*2, TPMT*3A hoặc TPMT*3C.

29

1.4. Ứng dụng và triển vọng của di truyền dược học trong lâm sàng

Trong các giai đoạn thử nghiệm thuốc lâm sàng, số liệu thu được của di

truyền dược học có thể áp dụng nhằm dự đoán đáp ứng thuốc cá nhân ở các cấp độ

như: đáp ứng thuốc tốt, nguy cơ ADR, không đạt hiệu quả điều trị (Hình 1.8).

a) Các thử nghiệm lâm sàng truyền thống áp dụng liều thuốc chung. b) Xét nghiệm các gen dược học giúp phân loại đối tượng sử dụng thuốc thành các cấp độ đáp ứng thuốc khác nhau, từ đó điều chỉnh liều thuốc và loại trừ các phản ứng ADR không mong muốn.

Hình 1.8. Ứng dụng di truyền dược học trong xây dựng chiến lược sử dụng thuốc phù hợp [81].

Trong tương lai, các nghiên cứu xa hơn về di truyền dược học cần phải tăng

cường sự hợp tác giữa các nhóm nghiên cứu trên toàn cầu. Nghiên cứu di truyền

dược học cần thực hiện thu thập mẫu và phân tích tạo nên các cơ sở dữ liệu nhằm

phục vụ cho quá trình phát triển thuốc.

Hiện nay, một số trung tâm y học hàn lâm đã thử nghiệm giúp cảnh báo và

phòng ngừa sử dụng dược học di truyền. Ví dụ như một nhóm các trung tâm thuộc

mạng lưới nghiên cứu hệ gen dược học (Pharmacogenomics Research Netwwork-

PGRN) đã hỗ trợ phát triển các hóa chất giải trình tự thế hệ mới, trong đó có 84 gen

30

dược học đã được giải trình tự toàn bộ các exon và vùng cắt nối. Điều này giúp cho

chúng ta có thể có được các thông tin của những biến thể mang chức năng đã biết

cũng như rất nhiều các biến thể khác chưa biết chức năng. Một trong những thách

thức mà lĩnh vực hệ gen dược học đang đối mặt đó là cần phải phát triển các phương

pháp thông lượng cao, qua đó có thể phân tích chức năng của số lượng lớn các biến

thể chưa rõ chức năng tìm được khi sử dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới

trên một lượng lớn các đối tượng bệnh nhân. Ví dụ như, nếu chúng ta chỉ tập hợp

2 gen thuộc họ CYP450 đã được nghiên cứu rộng rãi là CYP2C9 và CYP2C19, có

tới 60.000 mẫu DNA đã được giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện và được công

bố bởi viện Broad. Trong số đó có 235 biến thể sai nghĩa của CYP2C9 và 258 biến

thể sai nghĩa của CYP2C19 [82]. Con số này cho thấy chúng ta cần có những

phương pháp giúp sàng lọc nhanh chóng phân tích được chức năng của những

protein được mã hóa bởi các biến thể này, từ đó đánh giá được chúng có thể có ý

nghĩa về mặt lâm sàng hay không. Trên thực tế, việc thực hiện những cuộc thử

nghiệm lâm sàng làm sao cho hiệu quả nhất nhằm nghiên cứu chức năng của các

biến thể di truyền vẫn còn có nhiều tranh cãi. Trong những năm gần đây, công nghệ

phân tích hệ gen đã và đang phát triển nhanh chóng. Sử dụng công nghệ giải trình

tự toàn bộ hệ gen cho phép các nhà nghiên cứu có thể phát hiện các biến thể di

truyền hiếm, từ đó có thể giải thích được sự khác biệt giữa các cá thể cũng như xác

định được những con đường tín hiệu mới tham gia vào đáp ứng thuốc và các phản

ứng có hại của thuốc. Tuy nhiên, cần phải có số cỡ mẫu nghiên cứu đủ lớn để có

thể cho phép tìm thấy những biến thể hiếm có xu hướng gây nên các phản ứng có

hại của thuốc. Các mạng lưới của PGRN cùng với Hồ sơ y tế điện tử và hệ gen

(Electronic Medical Records and Genomics Network) đã bắt đầu tiến hành những

nghiên cứu thí điểm hướng đến sử dụng rộng rãi thông tin về hệ gen dược học trong

lâm sàng.

Trong những năm gần đây, rất nhiều các nghiên cứu GWAS về đáp ứng

thuốc đã được tiến hành. Trong những nghiên cứu này những đa hình dạng SNP

nằm trong khung đọc mở của gen đã được chỉ ra là có ảnh hưởng đến chức năng

của protein mà gen mã hóa. Bên cạnh đó thì những SNP khác đóng vai trò như “cú

hích” đã được xác định bằng GWAS và chúng nằm ngoài vùng mã hóa của gen.

31

Những SNPs dạng này đóng vai trò trong điều hòa biểu hiện gen thông qua điều

hòa quá trình phiên mã. Quá trình phiên mã của gen có thể bị ảnh hưởng trong

trường hợp một SNP có thể tạo ra/làm tắt vị trí bám của các yếu tố phiên mã, vị trí

này có thể nằm ngược chiều từ hàng trăm tới hàng ngàn bazơ so với mã mở đầu

của gen. Hiện nay đã có các cơ sở dữ liệu được sử dụng làm công cụ dự đoán xem

một SNP có thể tạo mới/làm tắt một vị trí bám của yếu tố phiên mã hay không. Giải

trình tự hệ gen mã hóa (exome) chỉ bao quát được 1,5% dữ liệu của toàn bộ hệ gen,

do đó trong tương lai chúng ta cần hướng đến mục tiêu xa hơn vùng gen mã hóa

nếu như muốn nắm bắt và ứng dụng được ý nghĩa của những biến thể di truyền

trong lâm sàng.

Một thử thách đáng chú ý trong các nghiên cứu về di truyền dược học đó là

làm sao kết hợp được các khoa học “omics” với nhau để hỗ trợ cho các quyết định

điều trị cho bệnh nhân sao cho phù hợp. Ngày nay, các nhà khoa học đã kết hợp

những dữ liệu về giải trình tự hệ gen và hệ gen biểu hiện (genomics và

transcriptomics) trong các nghiên cứu về ung thư nhằm đưa ra các giải pháp về

thuốc đích-điều trị đích. Trong lĩnh vực tâm thần học, các khoa học “omics” khác

nhau cũng đã được kết hợp. Cần phải nhấn mạnh rằng việc áp dụng chỉ riêng khoa

học về hệ gen trong các rối loạn tâm thần phần nào không đạt được kết quả như

mong đợi. Lí do là vì các biểu hiện bệnh-các triệu chứng trong tâm thần không đơn

giản có liên quan đến những con đường sinh học thông thường như ở các bệnh lý

khác. Để khắc phục yếu tố này, gần đây khoa học về hệ gen đã được kết hợp với

các dữ liệu trong khoa học về trao đổi chất (metabolomics) để xác định sản phẩm

trao đổi chất nào thực sự có liên quan đến các kiểu hình trong rối loạn tâm thần (ví

dụ như Hamilton D Scores cho các bệnh nhân rối loạn trầm cảm). Bên cạnh đó,

phân tích GWAS cũng được tiến hành để phát hiện các gen liên quan đến sự tích tụ

của các sản phẩm trao đổi chất và sau đó đánh giá chức năng của các gen/ các SNP

đã được xác định qua GWAS [83]. Những ví dụ nói trên đã cho chúng ta thấy trong

tương lai gần, các marker sinh học phục vụ trong đáp ứng thuốc rất có thể là kết

quả của sự kết hợp giữa nhiều khoa học omics khác nhau bao gồm hệ gen học, hệ

phiên mã và hệ trao đổi chất.

32

1.5. Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền của các gen CYP450

Các tổ chức điều phối như FDA ở Mỹ (FDA) và Cơ quan dược phẩm châu

Âu (European Medicines Agency) đã ghi nhận giá trị và ý nghĩa lâm sàng của hệ

gen dược học, đồng thời các chỉ dẫn về dữ liệu di truyền dược học được khyến cáo

đối với ngành công nghiệp dược khi đưa thuốc mới ra thị trường. Những kết quả trị

liệu khả quan đã được ghi nhận là có liên quan đến lựa chọn loại/liều lượng thuốc

điều trị tùy theo đặc điểm di truyền của bệnh nhân, cụ thể là trong các lĩnh vực như

ung thư, tim mạch, rối loạn tâm thần và giảm đau [84]. Có thể thấy việc kiểm tra

kiểu gen và phân tích các đa hình/đột biến các gen CYP450 là rất có ý nghĩa trong

việc đóng góp các dữ liệu về hệ gen dược học của người bệnh.

1.5.1. Các phương pháp nghiên cứu SNP và indel

Các phương pháp sinh học phân tử đã và đang được áp dụng rộng rãi trong

nghiên cứu đa dạng di truyền các gen CYP450 như: giải trình tự Sanger [85], khuếch

đại đặc hiệu và cắt bằng enzyme giới hạn (PCR-RFLP), SNP array nhằm phát hiện

các SNP và indel.

*Giải trình tự Sanger

Phương pháp này thực hiện dựa trên kỹ thuật “chain termination- kết thúc

chuỗi” bằng việc sử dụng các deoxy nucleotide đã bị chỉnh sửa làm mất nhóm

hydroxyl ở đầu 3’ của phân tử đường. Nhóm 3’-OH đóng vai trò cho phép gắn thêm

một nucleotide mới vào chuỗi. Khi một ddNTP được thêm vào chuỗi, vì không có

nhóm 3’-OH nên một nucleotide không được thêm vào, phản ứng tổng hợp sẽ dừng

lại. Enzyme polymerase xúc tác phản ứng gắn các dNTP vào mạch đơn của DNA

để kéo dài mạch ở vị trí 3’- OH và dừng lại nếu gắn các ddNTP vào chuỗi. Trong

một phản ứng chứa cả dNTP và ddNTP nên sau phản ứng tổng hợp, hình thành các

đoạn DNA có độ dài khác nhau do ddNTP gắn ngẫu nhiên làm dừng phản ứng. Kỹ

thuật giải trình tự DNA tự động sử dụng các ddNTP có đánh dấu huỳnh quang đã

giúp cho việc sắp xếp trình tự DNA trở nên nhanh chóng và hiệu quả hơn.

Hệ thống điện di mao quản được sử dụng để đọc trình tự DNA một cách tự động.

Cấu tạo của máy gồm các mao quản chứa gel polyacrylamide cho phép phân tích

nhiều mẫu trong một lần điện di. Hệ thống detector gồm các camera có chùm tia

33

laser đi qua nó để ghi nhận tín hiệu huỳnh quang một cách chính xác.

Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, khi có một vạch điện

di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng và được camera ghi nhận và

lưu lại thành một cường độ đỉnh sáng trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường

độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với nhau và phân tích thành

trình tự của đoạn DNA.

*SNP array

SNP array có ưu điểm là cho phép cùng lúc xác định được nhiều allele, do

đó mà tốc độ của thí nghiệm nhanh hơn, chính xác hơn và cũng dễ thao tác trong

phòng thí nghiệm. Sau đây là một số các kit thương mại đã được sử dụng để nghiên

cứu các SNP của các gen Cytochrome P450:

 AmpliChip CYP450 GeneChip

Bộ kit được phát triển bởi Roche Molecular Systems và Affymetric giành

cho các gen CYP2D6 và CYP2C19. Đây là công cụ đầu tiên sử dụng microarray

phục vụ cho lâm sàng và được cấp phép thương mại vào năm 2004, được công nhận

bởi FDA. Trong bộ kit này, có tất cả 15000 đầu dò oligonucleotide, cho phép kiểm

tra 20 allele của CYP2D6 bao gồm (*1, *2, *3, *4, *5, *6, *7, *8, *9, *10, *11,

*15, *17, *19, *20, *29, *35, *36, *40 và *41), 7 biến thể tăng số bản sao của

CYP2D6 (*1xN, *2xN, *4xN, *10xN, *17xN, *35xN và *41xN) và 3 allele của

CYP2C19 (*1, *2 và *3) [86]. Việc sàng lọc được thực hiện qua 5 bước: khuếch

đại DNA từ DNA tổng số đã tinh sạch, đánh dấu tất cả các sản phẩm đã được

khuếch đại, lai các sản phẩm khuếch đại này với một vi dãy (microarray) và nhuộm

các sản phẩm được lai trên vi dãy, scan vi dãy và đánh giá kiểu hình bằng các thuật

toán. Tuy nhiên bộ kit này không cho phép xác định số lượng bản sao chính xác

của CYP2D6.

 Kit phát hiện đột biến Luminex Taq-It (Luminex Taq-It Mutation

Detection Kit)

Bộ kit này được FDA công nhận và cho phép xác định các allele của

CYP2D6: *1, *2, *3, *4, *5, *6, *7, *8, *9, *10, *11, *15, *17, *29, *35, *36, *40

và *41, xN. Nhưng dữ liệu thu được từ bộ kit này không được kết nối với các thuật

34

toán dự đoán kiểu hình. Bộ kit này cũng xác định 7 allele của CYP2C19 (*2, *3,

*4, *5, *6, *7, *8) và 5 allele của CYP2C9 (*2, *3, *4, *5 và *6).

 iPLEX ADME

Có 3 panel được phát triển bởi Sequenome: PGx panel, CYP2C9/VKORC1

panel và CYP2C19 panel.

Panel iPLEX ADME PGx đồng thời phân tích 192 SNP của 36 gen trong đó

có: CYP1A, 2A6, 2B6, 2C19, 2C8/C9, 2D6, 2E1, 3A4/A5, cùng với các gen mã hóa

cho enzyme chuyển hóa thuốc pha II và các kênh vận chuyển thuốc. Quá trình phân

tích sử dụng hệ thống MassARRAY.

Panel iPLEX ADME CYP2C9/VKORC1 là một bộ xác định 36 SNP của

CYP2C9 và 9 SNP của VKORC1. Còn panel iPLEX ADME CYP2C19 phân tích

31 SNP của CYP2C19.

 Bộ xét nghiệm INFINITI CYP2C19 (INFINITI CYP2C19 Assay)

Bộ xét nghiệm này được đưa ra thị trường bởi Autogenomics, phản ứng PCR

được thực hiện bởi người làm thí nghiệm và các bước còn lại của quy trình thì được

tiến hành tự động bởi Autogenomics INFINITI Analyzer. Bộ kit này chỉ phát hiện

các allele của CYP2C19 là *2, *3, *17 và các kiểu gen tương ứng.

1.5.2. Các phương pháp nghiên cứu CNV

Mặc dù trên thực tế các SNP đã và đang được tập trung nghiên cứu nhiều

nhất, nhưng các các CNV vẫn được cho là có ảnh hưởng nhất định đến đáp ứng

thuốc khác nhau ở người. Các CNV là một trong những SV của gen bao gồm xóa

gen (deletion) và lặp gen (duplication, multiplication). Các gen CYP2D6 và

CYP2A6 là các gen mã hóa cho enzyme chuyển hóa thuốc pha I và đây cũng là

những gen được báo cáo có nhiều CNV nhất trong số các gen dược học. Đối với

hoạt tính của enzyme thì CNV của gen mã hóa cho enzyme đó có thể có 2 trường

hợp: toàn bộ khung đọc mở của gen bị xóa dẫn tới mất chức năng của gen mã hóa,

ngược lại nếu khung đọc mở của gen bị lặp lại sẽ dẫn tới tăng số lượng sản phẩm

phiên mã và dịch mã của gen, từ đó chức năng/hoạt tính của enzyme tương ứng

cũng tăng lên.

35

Ngày nay, các phương pháp được sử dụng phổ biến để nghiên cứu đa hình/đột biến

số bản sao của các gen CYP450 bao gồm: real-time PCR [87], phương pháp khuếch

đại đa đầu dò phụ thuộc vào ghép nối (Multiplex ligation-dependent probe

amplification-MLPA) [88, 89], phương pháp lai so sánh toàn bộ hệ gen

(Comparative Genomic Hybridization-CGH) [27], PCR kĩ thuật số [90].

*Real-time PCR

Real-time PCR là kĩ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị

được ngay sau mỗi chu kỳ nhiêt của phản ứng. Do đặc điểm này nên người làm thí

nghiệm realtime PCR không cần phải làm tiếp các thí nghiệm để đọc và phân tích

kết quả để xác định xem có sản phẩm khuếch đại đích hay không vì kết quả cuối

cùng của phản ứng khuếch đại cũng được hiển thị ngay sau khi hoàn tất toàn bộ các

chu kỳ khuếch đại. Đặc trưng của real-time PCR là phát hiện sản phẩm khuếch đại

trong quá trình chạy PCR khi sản phẩm PCR đích được nhân bản đủ số lượng làm

cho ống phản ứng phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích.

Nhờ đặc trưng này mà có thể xác định được số lượng bản sao của DNA đích ban

dầu dựa vào sự xuất hiện huỳnh quang của ống phản ứng, tức là chu kỳ ngưỡng

(Ct) của ống phản ứng lớn hay nhỏ. Đây là phương pháp nghiên cứu CNV của các

gen CYP450 đã được sử dụng rất rộng rãi và có tính chính xác cao. Có hai cách

định lượng số bản sao của DNA đích là định lượng tuyệt đối và định lượng tương

đối.

*Khuếch đại đa đầu dò phụ thuộc vào ghép nối (Multiplex ligation-

dependent probe amplification-MLPA)

MLPA là một loạt các phản ứng PCR cho phép khuếch đại nhiều trình vị trí

đích với việc chỉ sử dụng một cặp mồi duy nhất. Các kit MLPA bao gồm nhiều dầu

dò (probe) với mỗi đầu dò là một cặp oligonucleotide nhằm phát hiện một vị trí

DNA quan tâm. Mỗi oligo sẽ bắt cặp bổ sung với trình tự trên DNA đích, khi nào

cả 2 oligo của một đầu dò đã được lai với trình tự đích thì các oligo này sẽ được

gắn (ligate) với nhau và trở thành một đầu dò hoàn chỉnh. Một ưu điểm của việc

chia đầu dò thành 2 phần oligo đó là chỉ những oligo của một đầu dò sau khi được

gắn kết với nhau mới được khuếch đại bởi phản ứng PCR sau đó. Nếu như các đầu

36

dò không được chia ra theo cách này thì rất có thể các đầu dò sẽ được khuếch đại

mặc dù nó không thể lai với DNA đích, kết quả là sản phẩm khuếch đại sẽ không

phản ánh được số lượng trình tự đích ban đầu có trong mẫu nghiên cứu. Mỗi một

đầu dò có một chiều dài khác nhau, do đó tạo nên các sản phẩm khuếch đại với kích

thước khác nhau và được phân tách bằng điện di mao quản trên máy giải trình tự

tự động. Các mổi xuôi được sử dụng để khuếch đại các đầu dò đều được gắn huỳnh

quang, do đó mà mỗi một sản phẩm khuếch đại sau khi xuất hiện đều được phát

hiện bởi máy điện di mao quản. Bằng việc so sánh kích thước của các đỉnh tín hiệu

giữa mẫu nghiên cứu với mẫu tham chiếu (mẫu chuẩn có số bản sao bình thường),

các nhà nghiên cứu có thể định lượng tương đối về số lượng mỗi sản phẩm khuếch

đại. Tỉ lệ tương đối này chính là thước đo phản ánh số bản copy hiện diện trong

trình tự DNA đích đang quan tâm.

Những ưu điểm của phương pháp MLPA: đây là phương pháp cho phép

cùng lúc xác định được bất thường số bản copy của gần 60 vị trí DNA khác nhau

trong hệ gen. Phương pháp này khá dễ dàng trong thao tác ở nhiều phòng thí nghiệm

với quy trình không phức tạp, các thiết bị cần thiết chỉ bao gồm máy PCR thông

thường và một máy giải trình tự tự động. Kết quả là tối đa 96 mẫu có thể được thao

tác cùng một thời điểm và dữ liệu sẽ thu được trong vòng 24 giờ.

*Lai so sánh toàn bộ hệ gen (Comparative Genomic Hybridization-CGH)

CGH được sử dụng để phân tích số bản sao thực hiện theo phương pháp tế

bào học nhưng không phải thao tác nuôi cấy tế bào. Mục tiêu của kĩ thuật này là có

thể so sánh 2 hệ gen từ 2 mẫu khác nhau một cách nhanh chóng và hiệu quả, nhằm

đưa ra kết luận về sự khác biệt trên toàn bộ các nhiễm sắc thể hoặc một số vùng

nhiễm sắc thể nhất định. Về nguyên lý, các DNA trong 2 mẫu tế bào khác nhau

được đánh dấu huỳnh quang với những màu khác nhau, sau đó DNA được biến tính

thành các mạch đơn. Quá trình lai được thực hiện với tỉ lệ 1:1 tại kì giữa của phân

bào. Sử dụng kính hiển vi huỳnh quang và các phần mềm chuyên biệt trên máy

tính, các tín hiệu màu sắc khác nhau sẽ được so sánh dọc theo chiều dài mỗi nhiễm

sắc thể để tìm ra sự khác biệt giữa 2 mẫu. Nếu như một vùng nhiễm sắc thể của

mẫu thử cho tín hiệu với cường độ cao hơn so với mẫu chứng thì điều đó thể hiện

vùng đó có lượng vật chất di truyền nhiều hơn so với vùng tương ứng của mẫu

37

chứng và ngược lại. Nếu như không có sự khác biệt trong cường độ tín hiệu giữa

DNA (màu trung tính xuất hiện-thường là màu vàng nếu như đánh dấu 2 mẫu quan

tâm bằng màu đỏ và xanh lá cây) của 2 mẫu thì nghĩa là không có sự khác biệt về

số bản sao. CGH chỉ có thể xác định được sự bất thường nhiễm sắc thể dạng mất

cân bằng chứ không xác định được những bất thường nhiễm sắc thể dạng cân bằng-

tức là không làm thay đổi số bản sao như chuyển đoạn hay đảo đoạn nhiễm sắc thể.

Ngày nay, kĩ thuật CGH truyền thống đã được cải tiến thông qua kết hợp với kĩ

thuật vi dãy-gọi là Array CGH (aCGH).

1.6. Tình hình nghiên cứu đa hình di truyền một số gen CYP450 trên người

Việt Nam và phạm vi nghiên cứu của luận án

1.6.1. Tình hình nghiên cứu đa hình di truyền của các gen CYP450 tại Việt Nam

và trên thế giới

Ở Việt Nam, nghiên cứu đặc điểm di truyền của các gen liên quan đến bệnh

tật của con người đã bắt đầu được tiến hành trong những năm gần đây. Bệnh Viện

nhi Trung ương, Học viện Quân y, Trường Đại học Y Hà Nội và Viện Nghiên cứu

hệ gen đã bước đầu nghiên cứu ở mức độ phân tử đối với các gen gây bệnh di truyền

như phenylketonuria [91], tăng sản thượng thận bẩm sinh [92, 93], loạn dưỡng cơ

Duchenne [94, 95] và bệnh Down [96]. Một số gen thuộc họ cytochrome 450 như

CYP21, CYP11B1 và CYP11B2 liên quan đến quá trình chuyển hóa steroid ở người

đã và đang được PGS. TS. Nguyễn Huy Hoàng và các đồng nghiệp tiến hành nghiên

cứu trên các bệnh nhân rối loạn chuyển hóa và các thành viên gia đình của họ. Các

tác giả đã xác định được đột biến p.Tyr395X làm mất chức năng của gen CYP11B1

trên người bệnh [92]. Ngoài ra, cấu trúc 3D của enzyme CYP11B1 bị đột biến cũng

đã được phân tích trên đối tượng bệnh nhân tăng sản thượng thận [92]. Những

nghiên cứu liên quan tới enzyme CYP11B1 đã tiếp tục phát hiện những đột biến

mới trên gen CYP11B1 trên các đối tượng bệnh nhân mắc tăng sản thượng thận

bẩm sinh và thiếu hụt 11β-hydroxylase [97, 98]. Ba đột biến trên gen CYP21A2

gồm đột biến mất đoạn lớn, đột biến trượt khung 12 và đột biến mất nucleotide trên

exon 7 (1584delA) đã được tìm thấy trên bệnh nhân mắc tăng sản thượng thận bẩm

sinh [99]. Đối với nhóm gen CYP450 mã hóa cho các enzyme tham gia chuyển hóa

38

thuốc ở người, nhóm nghiên cứu thuộc Đại học Y Hà Nội và Bệnh viện K Trung

ương đã tập trung vào đa hình phổ biến của CYP2D6 là CYP2D6*10 [100]. Năm

2018, nhóm nghiên cứu thuộc Khoa Y dược-Đại học quốc gia Hà Nội bước đầu

nghiên cứu về mối liên quan giữa đa hình gen CYP2C19 tới hiện tượng kết tập tiểu

cầu trên bệnh nhân mắc hội chứng mạch vành cấp tính tại Việt Nam [101]. Cho đến

nay chưa có nghiên cứu nào về tần số và sự phân bố của toàn bộ allele trên các gen

mã hóa cho các enzyme tham gia chuyển hóa thuốc chính như CYP2C9, CYP2C19,

CYP2D6 và CYP3A5 cũng như các gen CYP450 khác trên đối tượng người Việt

Nam.

Các gen CYP450 ở người có tính đa hình rất cao, số liệu từ cơ sở dữ liệu

PharmVar thống kê tổng cộng có 61, 37, 139, 10 biến thể tương ứng với các gen

mã hóa cho các enzyme tham gia chuyển hóa thuốc chính là CYP2C9, CYP2C19,

CYP2D6 và CYP3A5. Bên cạnh đó, một số gen CYP450 khác có tính đa hình cao

như CYP2A6 có 45 biến thể, CYP3A4 có 34 biến thể (Theo PharmVar).Cho đến

nay mới chỉ có 06 công trình quốc tế công bố về kết quả điều tra tần số xuất hiện

của các allele đáng chú ý gây kiểu hình PM, IM và UM của các gen CYP2A6,

CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4 và CYP3A5 trên người Việt

Nam [102-107]. Các nghiên cứu này mới tập trung vào các đa hình đã biết gây ảnh

hưởng đến hoạt tính enzyme của các gen nói trên trên người Việt Nam. Cụ thể, các

nghiên cứu được thực hiện trước đây bởi các nhóm nghiên cứu tại Nhật Bản và Hàn

Quốc đã đánh giá tần số xuất hiện của các allele đã biết của CYP2C9 (*2, *3),

CYP2C19 (*2, *3, *17) trên người Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan và Việt Nam

[102, 104, 105]. Bên cạnh đó, sử dụng phương pháp pyrosequencing, Veiga và cộng

sự vào năm 2009 đã phân tích đa dạng di truyền một số gen CYP450 thuộc họ CYP2

(CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6) và CYP3 (CYP3A4, CYP3A5)

[103]. Năm 2010, Kim và cộng sự đã áp dụng multiplex single base extension và

phát hiện 12 đa SNP của CYP2D6 cùng với 1 biến thể nhân đôi số bản sao của gen

này trên 758 người Hàn Quốc, 89 người Trung Quốc và 122 người Việt Nam [107].

Năm 2013, Love và cộng sự đã xác định tần số của 8 allele CYP2D6 bằng phương

pháp Taqman genotyping trên 138 phụ nữ Philipin và 86 phụ nữ Việt Nam mắc ung

thư vú và điều trị bằng tamoxifen [106]. Tổng kết những nghiên cứu nói trên đã

39

công bố tần số 14 biến thể đã biết của CYP2D6, tuy nhiên chưa có thông tin về

nhiều biến thể khác đã được công bố cũng như những biến thể mới có thể tồn tại

trên toàn bộ gen CYP2D6 ở người Việt Nam.

1.6.2. Phạm vi nghiên cứu của luận án

Dân tộc Kinh là dân tộc chính với tỉ lệ chiếm 86.2% trên tổng dân số và được

coi là đại diện cho quần thể người Việt Nam. Người Kinh sống ở tất cả 63 tỉnh

thành trên đất nước Việt Nam nhưng tập trung nhiều nhất ở Thành phố Hồ Chí

Minh, Hà Nội, Thanh Hóa, Nghệ An, Đồng Nai và An Giang. Mục tiêu nghiên cứu

của luận án tập trung xây dựng một cơ sở dữ liệu về tần số allele của CYP2C9,

CYP2C19, và CYP2D6 của người Kinh Việt Nam bằng phương pháp giải trình tự

toàn bộ các exon cùng với vùng promoter của 3 gen nói trên. Bên cạnh đó, nghiên

cứu này cũng hướng tới phân tích sự phân bố của các allele với chức năng đã biết

của CYP3A5 bao gồm *3, *5, *6 và *8 ở người Kinh Việt Nam sử dụng phương

pháp giải trình tự trực tiếp vùng gen mang biến thể quan tâm. Ngoài ra, nghiên cứu

này cũng tiến hành phân tích các CNV của 4 gen nghiên cứu trên người Kinh. Vấn

đề đặt ra cho nghiên cứu này là phải xác định xem trong số các allele đã công bố,

có bao nhiêu allele có mặt ở người Việt Nam? Tần số các allele này xuất hiện như

thế nào? Liệu có tồn tại các allele mới chưa được công bố ở người Việt Nam hay

không và từ đó đưa ra dự đoán ảnh hưởng của các allele mới đối với hoạt tính của

enzyme tương ứng?

Ngày nay, di truyền dược học đóng vai trò quan trọng trong chuyển hóa

thuốc và tương tác thuốc trong lâm sàng, đây là lĩnh vực mang tính cấp bách và rất

cần đầu tư nghiên cứu. Những thông tin về tính đa dạng di truyền của các gen tham

gia chuyển hóa thuốc ở người Việt Nam được coi là tiền đề để phát triển lĩnh vực

này. Những dữ liệu thu được từ nghiên cứu rất có ý nghĩa trong việc bổ sung thông

tin về phản ứng khác nhau trong đáp ứng thuốc giữa các cá thể. Đồng thời đây cũng

là cơ sở quan trọng cho bước đầu hướng tới phát triển nền y học theo hướng cá thể

hóa.

40

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Một trăm ba mươi sáu người Kinh khỏe mạnh và không có quan hệ huyết thống

tuổi từ 18-35 tình nguyện tham gia vào nghiên cứu (55 nam, 81 nữ). Trong đó, 100

mẫu (40 nam, 60 nữ) được sử dụng để khảo sát đa hình/đột biến gen CYP2C9,

CYP2C19, CYP3A5 và 136 mẫu được dùng cho khảo sát đa hình/đột biến gen

CYP2D6. Cỡ mẫu đươ ̣c sử du ̣ng là cỡ mẫu thuâ ̣n tiê ̣n cho nghiên cứ u và đảm bảo dữ liê ̣u thu đươ ̣c có ý nghĩa thố ng kê. Các mẫu máu được thu từ các tình nguyện viên đến từ các địa bàn khác nhau tại Hà Nội. Nguồn gốc dân tộc của các đối tượng tham

gia nghiên cứu được kiểm tra dựa trên những thông tin thu được từ 3 thế hệ, với ít

nhất là 3 thế hệ liên tiếp đều là dân tộc Kinh. Tất cả các cá nhân tham gia nghiên cứu

đều đã khai báo về tình trạng sức khỏe cho thấy không có vấn đề bất thường. Trước

khi tiến hành thu mẫu máu, mục đích nghiên cứu đã được giải thích rõ ràng với các

tình nguyện viên. Nghiên cứu này đã được thông qua bởi hội đồng đạo đức trong y

học thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam,

Hà Nội, Việt Nam.

2.2. Các thiết bị, dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu

Các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu này thuộc Viện nghiên cứu

hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Các thiết bị sử dụng chính bao gồm: máy spindown (Wealtec, Mỹ), máy

vortex (Dragon, Trung Quốc), tủ đông-200C (Sanaky, Trung Quốc), cân kĩ thuật

(Ohaus, Mỹ), tủ mát có ngăn đông (Electrolux, Thụy Điển), máy ly tâm (Eppendorf,

Đức) và máy ly tâm lạnh đa năng (5810R-Đức); máy PCR Mastercycler pro S (Đức);

máy real-time PCR Light Cycle 96 (Roche, Thụy Sĩ), máy điện di (Bio-Rad); máy

soi gel và chụp ảnh tự động DigiDoc-It® Imaging System của Ultra-violet production

(Mỹ); máy cô quay chân không-SpeedVac (Eppendorf, Đức), máy đo quang phổ

(UV-Vis BioSpectrometer Basic, Đức); máy đo huỳnh quang Qubit 2.0 Fluorometer

(Thermo Fisher Scientific, Mỹ); máy giải trình tự gen ABI 3500 Genetic Analyzer

của (Thermo Fisher Scientific, Mỹ).

41

Các dụng cụ thí nghiệm được sử dụng bao gồm: ống chứa máu EDTA-K2

(Việt Nam), micropipette đơn kênh và đa kênh (Eppendorf, Đức), stepper pipette

(Eppendorf, Đức), combitips dùng cho stepper piptte (Eppendorf, Đức), ống

eppendorf đựng mẫu thể tích 1,5ml (Corning, Mỹ), ống ly tâm falcon thể tích 15ml-

50ml (Biologix, Mỹ), ống PCR 0,2ml (QSP), đĩa chạy PCR 96 giếng (Biologix-Mỹ),

đĩa chạy real-time PCR 96 giếng (Roche, Thụy Sĩ), đĩa giải trình tự 96 giếng (ABI-

Mỹ), đĩa tinh sạch sản phẩm PCR 96 giếng (Merck-Milipore, Mỹ).

2.3. Phương pháp nghiên cứu

Các bước thí nghiệm tổng thể được thể hiện trong Hình 2.1 dưới đây

Hình 2.1. Sơ đồ chi tiết thực hiện nghiên cứu

2.3.1 Tách chiết DNA tổng số

Mẫu máu ngoại vi (2 ml mỗi cá thể) được thu vào ống chứa máu EDTA K2 và

lưu giữ ở -200C cho đến khi sử dụng. Các mẫu sau khi tiếp nhận đã được mã hóa sau

42

đó tách chiết DNA tổng số bằng ExgeneTM Blood SV mini Kit (GeneAll, Hàn Quốc)

với quy trình như sau:

Chuẩn bị 20 μl Proteinase K (20 mg/ml) trong ống eppendorf 1,5 ml. Bổ sung

200 μl máu, sau đó bổ sung là 20μl RNase (20 mg/ml). Hỗn hợp được trộn đều bằng

voltex, spin nhanh và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Thêm 200 μl BL buffer vào

hỗn hợp và trộn đều, hỗn hợp được ủ ở 56oC trong 10 phút. Bổ sung 200 μl ethanol

100% và trộn đều hỗn hợp, spin nhẹ sau đó chuyển hỗn hợp lên cột tách chiết đặt

trong ống thu và ly tâm với tốc độ 8000 rpm trong 60 giây. Chuyển cột sang ống thu

mới, thêm 600 μl BW buffer và ly tâm ở 8000 rpm trong 60 giây. Tiếp tục chuyển

cột sang ống thu mới, bổ sung thêm 700 μl TW buffer và ly tâm 8000 rpm trong 60

giây. Sau đó đổ bỏ dịch trong ống thu, đặt lại cột vào ống thu và tiếp tục ly tâm 7000

rpm trong 2 phút để làm khô cột. Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Thêm

70 μl TE buffer ở đã ủ 56oC vào đáy cột, để cho đệm thấm đều và ủ ở nhiệt độ phòng

trong 3 phút. Tiếp tục ly tâm ở 10.000 rpm trong 1 phút để thu mẫu. DNA lúc này thu

được hòa tan trong TE buffer sau khi đi qua cột ở bước ly tâm cuối cùng.

DNA tổng số thu được đem kiểm tra bằng điện di trên Agrose 0,8% và đo nồng

độ, sau đó đem lưu trữ ở -20oC.

2.3.2. Xác định nồng độ DNA tổng số

DNA tổng số tách từ mẫu máu được kiểm tra bằng điện di và sau đó nồng độ

DNA mạch đôi được kiểm tra bằng bộ kit Qubit dsDNA HS Assay (Life

Technologies, Mỹ). Chuẩn bị dung dịch Qubit working bằng cách pha loãng thuốc

thử Qubit dsDNA HS Reagent trong Qubit dsDNA HS Buffer với tỉ lệ 1:200. Thể

tích dung dịch Qubit working được sử dụng cho các mẫu chuẩn là 190 μl và các

mẫu DNA tổng số là 198 μl, tổng thể tích của mỗi ống chứa mẫu chuẩn/DNA tổng

số đều là 200 μl. Các ống mẫu được trộn đều và ủ trong tối, nhiệt độ phòng 2 phút.

Nồng độ DNA tổng số được đo bởi máy Qubit 2.0 Fluorometer, cường độ phát

huỳnh quang từ chất màu sẽ tỉ lệ thuận với nồng độ của dsDNA. Từ đó, máy đo sẽ

tính toán nồng độ dsDNA dựa trên nồng độ của đường chuẩn được xây dựng bởi 2

mẫu chuẩn và số lần pha loãng của DNA tổng số.

43

2.3.3. Phương pháp PCR Khuếch đại đặc hiệu các gen

2.3.3.1. Thiết kế mồi

Trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và

CYP3A5 dùng trong nghiên cứu được thiết kế bằng phần mềm Primer 3 (v.0.4.0) dựa

trên trình tự gen tham chiếu của các gen nói trên được tham khảo tại cơ sở dữ liệu

NCBI. Thông số của các cặp mồi (số lượng nucleotide, tỉ lệ G và C, nhiệt độ nóng

chảy, khả năng tự bắt cặp, khả năng tạo cấu trúc kẹp tóc) được kiểm tra bằng phần

mềm IDT OligoAnalyzer Tool. Tính đặc hiệu của cặp mồi được kiểm tra bằng phần

mềm in silico PCR amplification. Cặp mồi thiết kế sau các bước kiểm tra như trên

được đặt tổng hợp nhân tạo bởi công ty PHUSA Biochem (Cần Thơ, Việt Nam).

Thông tin các cặp mồi đặc hiệu cho các đoạn gen của CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6

và CYP3A5 được trình bày trong các bảng 2.1-2.4.

Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi sử dụng cho khuếch đại gen CYP2C9

Vùng

Trình tự mồi

Kích thước lí thuyết (bp)

1165

Promoter và exon 1

F: 5'-ATAACAATTCCTGCCTTCAGGA-3' R: 5'-TGCTGACCAGATCCCACAATA-3'

794

Exon 2 và exon 3

F: 5'-GCAAGTATAATCATCATCATGTTTCTATT-3' R: 5'-CTCTCAGCTTCAAACCCCC-3'

Exon 4

440

F: 5'-ATGCATGCCGAACTCTTTTT-3' R: 5'-TCCCAGATATTCACCCCAAG-3'

Exon 5

537

F: 5'-AGGAGGTCTGAGTCTAGGAAATGA-3' R: 5'-AAAGTGCTTCTCAAGCATTACTGA-3'

Exon 6

483

F: 5'-TTTGGGCAAGTTGGTCTACA-3' R: 5'-CAGGCCAAGATATCCCATTG-3'

Exon 7

722

F: 5'-CACATTTGTGCATCTGTAACCA-3' R: 5'-GATTCAGTTCTTTCCAAACTAGCC-3' (*)

Exon 8

362

F: 5'-TGGAAATGGTACTGCCCTTC-3' R: 5'-TGCAGAGGAGGCACATGTAA-3'

Exon 9

1116

F: 5'-AGAATGTGAGGGTCCAGATCA-3' (*) R: 5'-GCAGAAAAGAAATGCCTTTGA-3' (*)

F: Forward Primer - Mồi xuôi R: Reverse Primer - Mồi ngược

*Trình tự mồi được tham khảo từ nghiên cứu của Jin T và cộng sự [108]

44

Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi sử dụng cho khuếch đại gen CYP2C19

Promoter

Trình tự mồi Vùng Kích thước lí thuyết (bp)

776

Exon 1

600

845

F: 5'-TCCTGCCTTCACGTGTTTTT-3' R: 5'-TTTCCAATCACTGGGAGAGG-3' F: 5'-TAGTGGGCCTAGGTGATTGG-3' R: 5'-CTGGAAAAGGCAACAAAAGC-3' F: 5'-TTTGAGCCTGTGTGACTGAA-3' R: 5'-TCTCAGCTTCAAACCCTGCT-3' (*)

Exon 2 và exon 3

Exon 4

619

F: 5'-ATGCATGCCAAACTCTTTTT-3' R: 5'-TATTCACCCCATGGCTGTCT-3'

Exon 5

541

F: 5'-CAATAAAAATTTCCCCATCAAGA-3' R: 5'-CCTTGACCTGTTAAACATCCGTA-3'

Exon 6

709

F: 5'-AGCCAAAGACAAAAACCACATC-3' R: 5'-GATTACAATCATGAGCCACTGC-3'

Exon 7

615

F: 5'-TGATGTTTGGATACCTTCATCAT-3' R: 5'-TGCACTTCTCTCACCCAGTG-3'

Exon 8

506

F: 5'-CTGCTCTTCTTTGGAATGGTG-3' R: 5'-GGAGAAAACACAGGCATTCAG-3'

Exon 9

1032

F: 5'-CACCCAACCACCCATCTATC-3' R: 5'-GATGACGGGTCAGAAGAAGC-3' (*)

F: Forward Primer - Mồi xuôi R: Reverse Primer - Mồi ngược

*Trình tự mồi được tham khảo từ nghiên cứu của Jin T và cộng sự [109] “”

Bảng 2.3. Trình tự các mồi sử dụng cho khuếch đại gen CYP2D6

Vùng Trình tự mồi

F: 5'-ATGTGGGCTGGGCTGGGAGCAGCC-3'

Kích thước lí thuyết (bp)

R: 5'-TCCCTAGTGCAGGTGGTTTC-3'

F: 5'-CAAGGTGGATGCACAAAGAG-3'

Promoter-Exon 2 2080

R: 5'-GAATCTCTGACGTGGATAGGA-3'

F: 5'-GGCCAAGGACTCTGTACCTCCTA-3'

Exon 3-Exon 4 801

R: 5'-CAGCAGGGAGGTGAAGAAGA-3'

F: 5'-CAGAATGTTGGAGGACCCAACA-3'

Exon 5-Exon 8 1889

R: 5'-TGCTCAGCCTCAACGTACCCCT-3'

Exon 8-Exon 9 853

F: Forward Primer - Mồi xuôi R: Reverse Primer - Mồi ngược

45

Bảng 2.4. Trình tự các cặp mồi sử dụng cho khuếch đại gen CYP3A5

Biến thể Trình tự mồi Kích thước lí thuyết (bp)

503

578

F: 5'-CTTGCAGCATTTAGTCCTTGTGAG-3' R: 5'-CTGATCACGTCGGGATCTGTGA-3' F: 5'-AGGTGAGTCTAACTCAGCTTG-3' (*) R: 5'-GACAGCTAAAGTGGTGAGGG-3' (*)

CYP3A5*3 (6986A>G, intron 3) CYP3A5*6 (14690G>A, exon 7)

476

F: 5'-CTTGACCATTCCAGTTCCTGA-3' (*) R: 5'-CTACAGGCATGGGCTACCATA-3' (*)

CYP3A5*8 (3699C>T, exon 2)

680

F: 5'-AGGATCATTCAAGGCACACAC-3' (*) R: 5'-ATG CTT CTGCCAGTAGCAAC-3'

CYP3A5*9 (19386G>A, exon 10)

F: Forward Primer - Mồi xuôi R: Reverse Primer - Mồi ngược

*: Trình tự mồi được tham khảo từ nghiên cứu của Hong và cộng sự năm 2004 [45].

2.3.3.2. PCR đặc hiệu các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5

Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế, vùng promoter cùng với tất cả

9 exon và các vùng biên của 2 gen CYP2C9 và CYP2C19 được khuếch đại theo quy

trình chuẩn. Phản ứng PCR được thực hiện với tổng thể tích là 25 μl bao gồm các

thành phần sau: 1 μl DNA tổng số (10ng), 2,5 μl DreamTaq Buffer, 2 μl dNTPs (2,5

μM mỗi loại dNTP) (Bioworld, Mỹ), 1 μl mỗi mồi (nồng độ 10 pmole/μl), 0,125 μl

Dream Taq Polymerase (Thermo Fisher Scientific, Mỹ), 1 μl DMSO (Bioworld, Mỹ)

và 16,375 μl nước khử ion (Life Technologies, Mỹ). Chu trình nhiệt được tiến hành

như sau: 95oC -5 phút, 40 chu kỳ (95oC-30 giây, 56-58oC-15 giây, 72oC-30-40 giây),

kéo dài ở 72oC trong 5 phút và giữ ở 4oC.

Đối với gen CYP2D6, sử dụng các cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế, vùng

promoter, tất cả 9 exon và vùng biên của gen CYP2D6 được khuếch đại theo quy trình

chuẩn. Phản ứng PCR được thực hiện với tổng thể tích là 25 μl bao gồm các thành

phần sau: 1 μl DNA tổng số (10 ng), 2,5 μl DreamTaq Buffer, 2 μl dNTPs (2,5 μM

mỗi loại dNTP) (Bioworld, Mỹ), 1 μl mỗi mồi (nồng độ 10 pmole/ μl), 0,125 μl

Dream Taq Polymerase (Thermo Fisher Scientific, Mỹ), 1 μl DMSO (Bioworld, Mỹ)

và 16,375 μl nước khử ion (Life Technologies, Mỹ). Chu trình nhiệt được tiến hành

như sau: 95oC -5 phút, 40 chu kỳ (95oC-15 giây, 58oC-30 giây, 72oC-40 giây đến 2

phút), kéo dài ở 72oC trong 5 phút và giữ ở 4oC. Đối với exon 5 và exon 8, chu trình

46

nhiệt được tiến hành như sau: 95oC -2 phút, 35 chu kỳ (95oC-30 giây, 59oC-30 giây,

72oC-2 phút), kéo dài ở 72oC trong 5 phút và giữ ở 4oC.

Đối với gen CYP3A5, phản ứng PCR được thực hiện với tổng thể tích cuối

cùng của mỗi phản ứng là 25 μl bao gồm: 1μl DNA tổng số (10 ng), 1μl mỗi mồi (10

pmole/ μl), 12,5 μl Taq 2X Mastermix (New England Biolab, Mỹ), 1 μl DMSO

(Bioworld, Mỹ), 8,5 μl nước khử ion (Life Technologies, Mỹ). Chu trình nhiệt: 95oC-

5 phút, 40 chu kỳ (95oC-15 giây – 56-59oC-15giây - 68oC-30 giây), 68oC-5 phút, giữ

ở 4oC.

Tất cả các sản phẩm sau khi PCR được tinh sạch bằng Multiscreen PCR 96

Filter Plate (Merck-Millipore, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.3.4. Giải trình tự Sanger

2.3.4.1. PCR giải trình tự

Khuôn dùng cho phản ứng PCR này là sản phẩm PCR đặc hiệu đã tinh sạch

như nêu ở trên. Thành phần chi tiết của phản ứng được chú thích trong Bảng 2.5.

Lượng DNA cho mỗi phản ứng được điều chỉnh tùy vào chất lượng tinh sạch DNA ở

bước trước. Phản ứng PCR giải trình tự có sử dụng huỳnh quang cho mỗi loại

nucleotide nên trong quá trình thao tác tránh tiếp xúc với ánh sáng mạnh. Phản ứng

được tiến hành trên đĩa PCR 96 giếng.

Chu trình nhiệt:

96oC/1 phút, 25 chu kỳ (96oC/10 giây - 50oC/5 giây - 60oC/4 phút), 4oC/∞

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR giải trình tự

Thành phần Thể tích (μl)

Sản phẩm PCR Mồi (1,7 pmole/µl) 4 1

BigDye Terminator Master Mix (2.5X) 4

BigDye Teminator 5X Sequencing Buffer (5X) 2

Nước khử ion 9

Tổng 20μl/ phản ứng

47

2.3.4.2. Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự

Sản phẩm PCR Sequencing sau phản ứng được tinh sạch thu lấy DNA theo

quy trình như sau: Các mẫu trong đĩa tinh sạch được trộn đều bằng voltex và sau đó

spin lắng mẫu. Thêm 2,5 μl EDTA 125mM vào mỗi giếng và gõ nhẹ cho dung dịch

trộn đều vào nhau. Bổ sung 60 μl ethanol 100% vào mỗi giếng, trộn đều bằng voltex

trong 5 giây sau khi đã dán kín mặt đĩa tinh sạch. Đĩa mẫu được ly tâm với tốc độ

4000 rpm trong 30 phút ở 4oC, lúc này DNA kết tủa bám vào đáy giếng. Bỏ băng

dính trên mặt đĩa và đổ bỏ dung dịch trong đĩa lên giấy thấm bằng cách úp ngược đĩa.

Bổ sung 60 μl ethanol 80% vào mỗi giếng và dán đĩa lại, không trộn cồn trong giếng

ở bước này. Ly tâm đĩa đựng mẫu với tốc độ 4000rpm ở 4oC trong 30 phút. Tiếp tục

đổ bỏ dung dịch trong đĩa bằng cách úp ngược, sau đó ly tâm nhanh đĩa mẫu để loại

bỏ hoàn toàn cồn trong các giếng mẫu. Làm khô đĩa mẫu bằng máy cô quay chân

không trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.

Lúc này sản phẩm tinh sạch có thể được giữ lạnh ở 4oC và tránh ánh sáng cho

tới khi biến tính và giải trình tự.

2.3.4.3. Biến tính sản phẩm PCR và điện di mao quản trên máy giải trình tự

Sản phẩm PCR giải trình tự đã tinh sạch được đem biến tính thành sợi đơn

trước khi cho lên máy đọc trình tự theo quy trình sau:

Bổ sung 6 μl HiDi vào mỗi giếng mẫu và spin nhẹ cho dung dịch lắng xuống

đáy tiếp xúc với phần tủa DNA. Đĩa mẫu được biến tính ở 98oC trong 2 phút trên máy

PCR. Sau khi kết thúc chu trình nhiệt, lấy đĩa ra khỏi máy PCR và làm lạnh trên đá

trong 5 phút. Lúc này sản phẩm tinh sạch đã sẵn sàng đưa vào máy giải trình tự. Trình

tự các đoạn DNA điện di mao quản và đọc tín hiệu huỳnh quang trên máy giải trình

tự ABI 3500 Genetic Analyzer. Tín hiệu được ghi tự động, phân tích và lưu trữ trên

máy tính.

2.3.5. Phương pháp MLPA

Để phát hiện các CNV của các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5,

phương pháp MLPA được tiến hành sử dụng bộ kit thương mại SALSA MLPA P128-

C1 Cytochrome P450 Probemix (MRC-Holland, Amsterdam, Hà Lan) theo hướng

dẫn của nhà sản xuất. Các đầu dò của bộ kit được thiết kế đặc hiệu cho việc lai và

48

khuếch đại một số exon của các gen CYP2C9 (5 đầu dò cho 4 exon:1, 7, 8, 9),

CYP2C19 (3 đầu dò cho 3 exon: 2, 6, 9), CYP2D6 (4 đầu dò cho 4 exon: 1, 5, 6, 9)

và CYP3A5 (3 đầu dò cho 3 exon: 2, 4, 10). Mỗi đầu dò là một cặp oligonucleotide

và mỗi oligo sẽ bắt cặp bổ sung với trình tự trên DNA đích, khi nào cả 2 oligo của

một đầu dò đã được lai với trình tự đích thì các oligo này sẽ được ghép nối (ligate)

với nhau và trở thành một đầu dò hoàn chỉnh. Mỗi một đầu dò có một chiều dài khác

nhau, do đó tạo phản ứng khuếch đại sử dụng mồi có đánh dấu huỳnh quang sẽ tạo

nên các sản phẩm với kích thước khác nhau và được phân tách bằng điện di mao quản

trên máy giải trình tự tự động, sử dụng ứng dụng phân tách đoạn.

2.3.5.1. Thực hiện phản ứng MLPA

Để chuẩn bị cho phản ứng MLPA, DNA tổng số được pha loãng về nồng độ

10ng/μl trong đệm TE. 50ng DNA tổng số với thể tích 5μl được sử dụng cho phản ứng

MLPA. Các bước phản ứng MLPA được tiến hành trong 2 ngày như sau:

*Ngày thứ nhất:

Thêm 5 μl DNA tổng số (50ng) vào mỗi ống PCR 0.2ml và thực hiện biến tính

trên máy PCR trong 5 phút ở 98oC, làm lạnh mẫu xuống 25oC và đưa mẫu ra khỏi

máy PCR. Trong bước tiếp theo, hỗn hợp phản ứng lai được chuẩn bị bao gồm các

thành phần sau: 1,5 μl MLPA buffer và 1,5 μl probemix. Hỗn hợp được trộn đều bằng

pipette hoặc vortex, sau đó thêm 3 μl hỗn hợp phản ứng lai vào mỗi mẫu DNA đã

biến tính trước đó tại nhiệt độ phòng. Tiếp tục chu trình nhiệt như sau: ủ trong 1phút

ở 95oC, sau đó ủ 16-20 giờ ở 60oC.

*Ngày thứ hai:

Chuẩn bị hỗn hợp cho mỗi phản ứng ghép nối bao gồm: 25 μl nước khử ion, 3

μl Ligase Buffer A, 3 μl Ligase Buffer B và 1 μl Ligase 65 enzyme. Sau khi lai các

mẫu DNA đã biến tính với hỗn hợp các đầu dò, hạ chu trình nhiệt xuống 54oC và giữ

đĩa phản ứng ở nhiệt độ này. Tiến hành thêm thêm 32 μl hỗn hợp ligase 65 vào mỗi

ống mẫu và trộn đều.

Chu trình nhiệt được tiếp tục như sau: ủ 15 phút ở 54oC (ghép nối hai phần

của mỗi cặp đầu dò), ủ 5 phút ở 98oC (bất hoạt enzyme ligase 65), dừng ở 200C. Lúc

này các ống mẫu có thể được lấy ra khỏi máy PCR.

49

Phản ứng PCR: Vortex Salsa PCR primer mix. Làm ấm Polymerase trong tay

10 giây để giảm độ nhớt. Chuẩn bị hỗn hợp cho mỗi phản ứng khuếch đại các đầu dò

đã ghép nối như sau: 7,5 μl nước khử ion, 2 μl Salsa PCR primer, 0,5 μl Salsa

polymerase. Thêm 10 μl hỗn hợp chứa polymerase vào mỗi ống mẫu và tiếp tục chu

trình nhiệt như sau: 35 chu kỳ x (95oC: 30 giây, 60oC: 30 giây, 72oC: 60 giây); 72oC:

10 phút; dừng ở 15oC. Sản phẩm PCR được lưu ở 4oC (1 tuần) hoặc -25oC (lưu giữ lâu

dài), bọc trong giấy bạc hoặc hộp tối và tránh ánh sáng.

2.3.5.2. Điện di mao quản phân tách đoạn

Trong bước này, 0,7 μl sản phẩm PCR được sử dụng để điện di mao quản nhằm phân

tách các phân đoạn đã được khuếch đại theo kích thước. Hỗn hợp được chuẩn bị trên

đĩa phản ứng như sau: 0,7 μl sản phẩm PCR, 0,2 μl GeneScan LIZ (GS500) và 9 μl

HiDi formamide. Sau đó, đĩa phản ứng được làm nóng ở 86oC trong 3 phút, tiếp tục

làm lạnh xuống 4oC trong 2 phút. Lúc này, hỗn hợp đã sẵn sàng cho điện di mao quản

với các thông số điện di được thiết lập như trong Bảng 2.6.

Bảng 2.6. Thông số điện di mao quản trên máy 3500

Thiết bị Mao quản Cài đặt

ABI-3500 8 mao quản Run module: Fragment analysis

50cm Injecttion voltage: 1.6kV

Injection time: 15sec

Run voltage: 15kV

Run time: 1800s Oven temperature: 60oC

Polymer: POP 7

Các thông số trên được cài đặt cho ứng dụng Fragment

2.3.5.3. Phân tích kết quả bằng phần mềm Coffalyzer

Sau khi chạy điện di mao quản trên máy ABI 3500, dữ liệu được phân tích

bằng phần mềm Coffalyzer. Phần mềm này được cung cấp tại trang chủ của hãng

MRC. Tín hiệu huỳnh quang được xác định bởi điện di mao quản không được sử

dụng để trực tiếp tính toán số bản sao, do tín hiệu huỳnh quang này còn bị ảnh hưởng

50

bởi nhiều biến số. Đầu tiên, giá trị tín hiệu huỳnh quang của mỗi đầu dò sẽ được

chuẩn hóa trong mỗi mẫu. Sau đó, các mẫu khác nhau sẽ được so sánh với nhau để

xác định mẫu nào có số bản sao thay đổi bất thường. Quá trình chuẩn hóa của MLPA

bao gồm 2 bước: chuẩn hóa trong 1 mẫu-intrasample normalization (so sánh các đỉnh

tín hiệu của các đầu dò khác nhau trong cùng một mẫu) và chuẩn hóa giữa các mẫu-

intersample normalization (so sánh các đỉnh tín hiệu của mỗi đầu dò tương ứng giữa

các mẫu khác nhau). Những cá thể có số bản sao bình thường (2 bản sao) thì giá trị tỉ

lệ nằm trong khoảng 0,8-1,2. Những cá thể chỉ có 1 bản sao thì giá trị tỉ lệ khoảng

0,65, ngược lại tỉ lệ này ở những cá thể có nhiều hơn 2 bản sao (3 hoặc 4 bản sao) sẽ

lớn hơn 1,3. Còn đối với những cá thể không mang bản sao nào của vùng gen quan

tâm, tỉ lệ này sẽ là 0. Tỉ lệ cuối cùng này còn được gọi là Dosage Quotient (DQ). Phần

mềm Coffalyzer sẽ tính toán giá trị DQ cho từng đầu dò và đưa ra kết quả cuối cùng

Bảng 2.7. Kết quả phân tích là đáng tin cậy khi độ lệch chuẩn (standard deviation)

của mỗi đầu dò của mẫu đối chứng nhỏ (<10%), các đầu dò cho tín hiệu đồng thời

tăng hoặc giảm tại các exon liền kề nhau (thể hiện mất/lặp đoạn nhiều exon liền nhau).

Ngược lại, kết quả phân tích không đáng tin cậy khi các đầu dò bổ sung với các exon

không liền kề cho tín hiệu tăng hoặc giảm.

Bảng 2.7. Mối liên hệ giữa giá trị DQ và số bản sao của mẫu nghiên cứu

Phân bố giá trị DQ Số bản sao Chú thích

DQ = 0 0 Mất đoạn đồng hợp tử

0,4 < DQ < 0,65 2=> 1 Mất đoạn dị hợp tử

0,8 < DQ < 1,2 2 Bình thường

1,3 < DQ < 1,65 2=> 3 Lặp đoạn dị hợp tử

1,75 < DQ < 2,15 2=> 4

Giá trị khác Kết quả không rõ ràng

2.3.6. Long range (LR) PCR

Cặp mồi sử dụng cho phản ứng LR-PCR được tham khảo từ nghiên cứu của

Hersberger và cộng sự [110]. Chi tiết về trình tự các cặp mồi được trình bày ở phụ

lục 5. Để xác định biến thể CYP2D6*5, phản ứng LR-PCR được thực hiện với tổng

51

thể tích là 25μl bao gồm các thành phần sau: 4 μl DNA tổng số (100ng), 10 μl Gotaq

Long Mastermix-2X (Promega, Wisconsin, Mỹ), 0,32 μl của mỗi mồi Dup và Dlow

(nồng độ mỗi mồi 10 pmole/μl), 0,64 μl mỗi mồi DPKup và DPKlow (nồng độ mỗi

mồi 10 pmole/μl), 4,08 μl nước khử ion. Chu trình nhiệt được tiến hành như sau:

94oC -2 phút, 35 chu kỳ (94oC-20 giây, 68oC-5 phút), kéo dài ở 72oC trong 10 phút

và giữ ở 4oC. Tất cả các sản phẩm LR-PCR sau đó được điện di kiểm tra trên gel

agarose 0,8%.

2.3.7. Real-time PCR

Số bản sao CYP2C9 của các mẫu được kiểm chứng lại bằng phương pháp real-

time PCR. Phản ứng real-time PCR được thực hiện sử dụng hóa chất Luna Universal

qPCR Master Mix (NEB). Các cặp mồi được thiết kế nhằm định lượng số bản sao

của exon 4 và exon 7 của CYP2C9 (Bảng 2.8). Sau khi kiểm tra tính đặc hiệu, các

mồi được đặt tổng hợp nhân tạo bởi công ty PHUSA Biochem (Cần Thơ, Việt Nam).

Gen RPPH1 được sử dụng làm gen tham chiếu, mẫu đối chứng được sử dụng là mẫu

mà trước đó được xác định là có số bản sao bình thường (2 bản sao CYP2C9) từ dữ

liệu MLPA. Phản ứng real-time PCR được thực hiện trên đĩa phản ứng với tổng thể

tích 10μl bao gồm các thành phần sau: 20 ng DNA tổng số (2 μl), 5μl Luna Universal

qPCR Mastermix-2X (NEB), 0,25 μl mỗi mồi (10 pmole/μl), 2,5 μl nước khử ion.

Đĩa phản ứng được đưa vào máy LightCycle 96 với bước biến tính ban đầu ở 95oC

trong 1phút, sau đó là 45 chu kỳ: biến tính ở 95oC trong 15 giây, kéo dài ở 60oC trong

30 giây. Số bản sao của mỗi exon sau đó được so sánh với gen tham chiếu thông qua

công thức: ΔΔCt = [Ct RPPH1(mẫu đối chứng)- Ct CYP2C9 exon 4/7 (mẫu đối

chứng)] - [Ct RPPH1 exon4/7(mẫu nghiên cứu)- Ct CYP2C9 exon 4/7(mẫu nghiên

cứu)]. Từ đó, số bản sao của mỗi exon được tính toán dựa trên giá trị 2-∆ΔCt như sau:

2 bản sao (0,8 < 2-∆ΔC t < 1,2), 1 bản sao (0,4 < 2-∆ΔC t <0,7) và 3 bản sao (1,3 < 2-∆ΔC t

<1,7).

52

Bảng 2.8. Trình tự các cặp mồi sử dụng cho real-time PCR

F: 5'-GAGGTGAGTTCCCAGAGAACG-3' (*)

RPPH1

134

R: 5'-TTCGCTGGCCGTGAGTCTGTTC-3' (*)

F: 5'-ATGCATGCCGAACTCTTTTT-3'

Exon 4

163

R: 5'-AGGATGAAAGTGGGATCACAG G-3'

CYP2C9

F: 5'-CACATTTGTGCATCTGTAACCA-3'

Exon 7

216

R: 5'-CCG GTT TCT GCCAATCACACG-3'

Gen Trình tự mồi Kích thước lí thuyết (bp)

*Trình tự mồi được tham khảo từ nghiên cứu của Ahani và cộng sự [111]

2.3.8. Phân tích số liệu nghiên cứu

2.3.8.1. Phân tích kết quả giải trình tự Sanger và đánh giá trạng thái cân bằng di

truyền Hardy-Weinberg của quần thể

Phần mềm Bioedit được sử dụng để phân tích các kết quả giải trình tự từ máy

giải trình tự tự động 3500. Các trình tự nucleotide của các mẫu nghiên cứu được so

sánh với trình tự tham chiếu bằng phần mềm BioEdit để xác định nucleotide tại vị trí

quan tâm. Vị trí và tên của các biến thể thuộc mỗi gen được đặt tên dựa trên trình tự

tham chiếu: CYP2C9 (NCBI reference sequence: NG_008385.1), CYP2C19 (NCBI

reference sequence: NG_008384.2), CYP2D6 (NCBI reference sequence:

NG_008376.4), CYP3A5 (NCBI reference sequence: NG_007938), và cơ sở dữ liệu

PharmVar. Những biến thể chưa được công bố trong cơ sở dữ liệu PharmVar sẽ được

tiến hành lọc trong cơ sở dữ liệu NCBI SNP (dbSNP) và 1000 Genomes

(http://www.internationalgenome.org) để xác định có phải là biến thể mới hay không.

Đánh giá độ liên kết giữa các biến thể (Linkage disequilibrium-LD) và trạng thái cân

bằng quần thể Hardy-Weinberg của mỗi biến thể được tiến hành thông qua phần mềm

HAPLOVIEW 4.2 [112].

2.3.8.2. Phân tích thống kê

Các thuật toán thống kê được thực hiện trên Microsoft Excel 2010. Kiểm định

khi bình phương (χ2) và Fisher exact được áp dụng để so sánh tần số allele CYP2C9,

53

CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 trong nghiên cứu này với các quần thể người khác

trên thế giới đã được công bố. Giá trị p<0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.

2.3.9. Dự đoán chức năng in silico của các biến thể mới

2.3.9.1. Dự đoán chức năng của các biến thể mới trong vùng mã hóa

Các công cụ online PROVEAN [113] và Polyphen-2 [114] được sử dụng để

đánh giá ảnh hưởng của những biến thể mới gây thay thế amino acid trong vùng mã

hóa của gen. Kết quả đầu ra của công cụ PROVEAN được phân làm 2 cấp độ như

sau: neutral-trung tính (score > -2,5) và deleterious-có hại (score ≤ -2,5). Đối với công

cụ Polyphen-2, đây là công cụ tự động giúp dự đoán những ảnh hưởng của thay đổi

amino acid tới sự bền và chức năng của protein được mã hóa. Kết quả đầu ra cũng

được phân làm 3 cấp độ dựa trên các ngưỡng tỉ lệ dương tính giả (false positive rate-

FPR-thresholds) được chuẩn hóa cho mỗi mô hình sử dụng (HumDiv và HumVar).

Các cấp độ ảnh hưởng bao gồm: benign (trung tính, không gây ảnh hưởng), possibly

damaging (less confident prediction-dự đoán ảnh hưởng chưa chắc chắn) và probably

damaging (more confident prediction-dự đoán ảnh hưởng với mức độ chắc chắn/tin

cậy cao hơn). Cụ thể, biến đổi đạt xác xuất với tỉ lệ dương tính giả ước lượng nhỏ

hơn FPR ngưỡng dưới được dự đoán là khả năng cao sẽ gây hại. Ngược lại, các biến

đổi đạt xác xuất với tỉ lệ dương tính giả nằm trong khoảng FPR ngưỡng dưới và

ngưỡng trên được dự đoán là có khả năng gây hại. Các biến đổi với tỉ lệ dương tính

giả ước lượng cao hơn FPR ngưỡng trên được dự đoán là trung tính. Nếu như dự đoán

không thể đưa ra do thiếu dữ liệu thì kết quả đầu ra sẽ được báo cáo là không rõ ràng.

2.3.9.2. Dự đoán chức năng của các biến thể mới trong vùng không mã hóa

Công cụ Human Splicing Finder (HSF) [115] được sử dụng để đánh giá khả

năng làm thay đổi mô hình cắt nối mRNA thông thường của những biến thể mới tìm

thấy trong vùng intron của các gen CYP2C9,CYP2C19 và CYP2D6. Hệ thống HSF

sử dụng kết hợp 12 thuật toán khác nhau nhằm phát hiện và đánh giá khả năng ảnh

hưởng của các đột biến mới lên mô hình cắt nối tại các vị trí tiếp nối giữa intron và

exon (acceptor-donor splice sites), trình tự nhánh (branching point) và các trình tự

đóng vai trò như tăng cường (Exonic splicing enhancer) hoặc ức chế (Exonic splicing

silencer) quá trình cắt nối. Những thuật toán được sử dụng trong HSF dựa trên các

54

ma trận vị trí (Position weight matrix), nguyên tắc nhiệt động lực tối đa (Maximum

entropy).

2.3.9.3. Dự đoán chức năng của các biến thể mới trong vùng promoter

Công cụ MATCH được sử dụng để dự đoán vai trò liên kết với các yếu tố

phiên mã của các biến thể mới nằm trong vùng promoter của CYP2D6. MATCH là

một chương trình dựa trên ma trận trọng số để dự đoán các vị trí liên kết với yếu tố

phiên mã trong chuỗi trình tự DNA [116]. Công cụ này sử dụng thư viện các ma trận

trọng lượng vị trí từ TRANSFAC® PUBLIC 6.0. TRANSFAC® cung cấp dữ liệu về

các yếu tố phiên mã ở các sinh vật nhân chuẩn cùng với vị trí gắn kết yếu tố phiên

mã đã được chứng minh bằng thực nghiệm. Ngoài ra các trình tự liên ứng và gen điều

hòa cũng có trong cơ sở dữ liệu này.

55

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số sau khi tách chiết từ máu ngoại vi được kiểm tra bằng điện di

trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di cho thấy hầu hết sản phẩm DNA tổng số sau

khi tách chiết có các dải băng rõ ràng và sáng tập trung ở khu vực có kích thước DNA

khoảng 20 kb trên bản gel. Như vậy sản phẩm DNA tổng số thu được không bị đứt

gãy và có độ tinh sạch cao, đảm bảo yêu cầu về chất lượng cho các bước sàng lọc gen

tiếp theo. Nồng độ DNA tổng số của các mẫu nghiên cứu thu được nằm trong khoảng

từ 19,4 đến 139,6 ng/µl.

Kết quả tách chiết DNA tổng số của một số mẫu được minh họa ở Hình 3.1 và

nồng độ DNA được thể hiện chi tiết ở phụ lục 1.

Hình 3.1. Điện di đồ 9 mẫu DNA tổng số

M: Thang DNA chuẩn. Các giếng 1-8: DNA tổng số của các mẫu nghiên cứu

3.2. Khuếch đại đặc hiệu các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A5 và giải

trình tự

Sử dụng các cặp mồi được thiết kế và tham khảo đã được trình bày chi tiết

trong phương pháp nghiên cứu, nghiên cứu này đã tiến hành khuếch đại các vùng gen

quan tâm của 4 gen nghiên cứu.

Chúng tôi đã tiến hành phản ứng PCR để khuếch đại đặc hiệu vùng promoter,

toàn bộ 9 exon và vùng biên của 2 gen CYP2C9 và CYP2C19 của 100 mẫu nghiên

cứu (40 nam, 60 nữ). Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agrose 1%.

56

Hình ảnh điện di cho thấy đã khuếch đại thành công trình tự đặc hiệu cho tất cả các

mẫu, kích thước băng điện di phù hợp với tính toán lý thuyết của CYP2C9 (Hình 3.2)

và CYP2C19 (Hình 3.3). Cụ thể, kích thước theo dự đoán lí thuyết của các đoạn gen

CYP2C9 là: Promoter-Exon 1 (1165 bp), Exon 2-Exon 3 (794 bp), Exon 4 (440 bp),

Exon 5 (537 bp), Exon 6 (483 bp), Exon 7 (722 bp), Exon 8 (362 bp) và Exon 9 (1116

bp). Đối với CYP2C19, kích thước dự đoán lí thuyết của các đoạn gen là: Promoter

(776 bp), Exon 1 (600 bp), Exon 2-3 (845 bp), Exon 4 (619 bp), Exon 5 (541 bp),

Exon 6 (709 bp), Exon 7 (615 bp), Exon 8 (506 bp) và Exon 9 (1032 bp). Các băng

điện di sáng, gọn và không có sản phẩm phụ, thể hiện độ đặc hiệu của phản ứng. Sản

phẩm PCR sau đó được tinh sạch theo quy trình để sử dụng cho các phản ứng giải

trình tự tiếp theo.

Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP2C9 của 8 mẫu nghiên cứu

M: Thang DNA chuẩn. Các giếng 1-8: Sản phẩm PCR các vùng promoter-exon 1 (a), exon 2-exon 3 (b), exon 4 (c), exon 5 (d), exon 6 (e), exon 7 (f), exon 8 (g) và exon 9 (h).

57

Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP2C19 của 8 mẫu nghiên cứu

M: Thang DNA chuẩn. Các giếng 1-8: Sản phẩm PCR các vùng promoter(a), exon 1 (b), exon 2-exon 3 (c), exon 4 (d), exon 5 (e), exon 6 (f), exon 7 (g) exon 8 (h) và exon 9 (i).

Đối với gen CYP2D6, phản ứng PCR được tiến hành để khuếch đại đặc hiệu

vùng promoter, toàn bộ 9 exon và vùng biên của gen CYP2D6 của136 mẫu nghiên

cứu (55 nam, 81 nữ). Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agrose 1%.

Hình ảnh điện di cho thấy chúng tôi đã khuếch đại thành công trình tự đặc hiệu cho

tất cả các mẫu, kích thước băng điện di phù hợp với tính toán lý thuyết (Hình 3.4).

Các kích thước sản phẩm PCR theo dự đoán lí thuyết lần lượt là: Promoter-Exon 2

(2080 bp), Exon 3-4 (801 bp), Exon 5-8 (1889 bp), Exon 8-9 (853 bp). Các băng điện

di đều không thể hiện có sản phẩm phụ, cho thấy phản ứng đã khuếch đại đặc hiệu

vùng gen quan tâm. Các sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch để sử dụng cho các

phản ứng giải trình tự tiếp theo.

58

Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP2D6 của 5 mẫu nghiên cứu

M: Thang DNA chuẩn. Các giếng 1-5: Sản phẩm PCR các vùng promoter-exon 2 (a), exon3-exon 4 (b), exon 5-exon 8 (c) và exon 8-exon 9 (d).

Đối với gen CYP3A5, phản ứng PCR được tiến hành để khuếch đại đặc hiệu

các vùng gen này mang các biến thể *3, *6, *8 và *9 của tổng số 100 mẫu nghiên cứu

(40 nam, 60 nữ). Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agrose 1%. Hình

ảnh điện di cho thấy đã khuếch đại thành công vùng gen mang các biến thể quan tâm

và đoạn khuếch đại là đặc hiệu cho tất cả các mẫu, kích thước băng điện di phù hợp

với tính toán lý thuyết: CYP3A5*3 (503 bp), CYP3A5*6 (578 bp), CYP3A5*8 (476

bp), CYP3A5*9 (680 bp). Một số hình ảnh điện di các mẫu đại diện được thể hiện ở

Hình 3.5. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch để sử dụng cho các phản ứng giải

trình tự tiếp theo.

M: Thang DNA chuẩn. Các giếng 1-8: Sản phẩm PCR các allele CYP3A5*3 (a), *6 (b), *8(c) và *9 (d).

Hình 3.5. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen CYP3A5 của 8 mẫu nghiên cứu

59

3.3. Phân tích đa hình/đột biến các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5

ở quần thể người Kinh Việt Nam

Với mục đích phân tích đa hình/đột biến của của các gen CYP2C9, CYP2C19

và CYP2D6, vùng promoter cùng tất cả 9 exon và vùng biên của mỗi gen được giải

trình tự trực tiếp. Đối với gen CYP3A5, các đoạn khuếch đại đặc hiệu chứa các allele

*3, *6, *8 và *9 cũng được giải trình tự trực tiếp. Các dữ liệu sau khi giải trình tự

được so sánh với trình tự tham chiếu của các gen tương ứng. Bên cạnh đó, CNV của

4 gen nói trên cũng được phân tích sử dụng phương pháp MLPA. Nghiên cứu này đã

tiến hành giải trình tự thành công các vùng gen quan tâm cũng như phân tích CNV

của các gen CYP2C9, CYP2C19 và CYP3A5 ở 100 mẫu. Đối với gen CYP2D6, đã

thực hiện giải trình tự và phân tích CNV gen này ở 136 mẫu người Kinh Việt Nam.

3.3.1. Đa hình/đột biến của gen CYP2C9

*Các biến thể của CYP2C9 được xác định bằng phương pháp giải trình tự

Đối với CYP2C9, có tổng số 14 biến thể đã được xác định trong 100 mẫu

nghiên cứu (Bảng 3.1). Tất cả các biến thể đều được khảo sát ở 100 mẫu, trừ biến thể

33622T>C chỉ xác định được ở1/99 mẫu. Trong số các biến thể này, có 7 biến thể đã

được công bố trên cơ sở dữ liệu PharmVar và 01 biến thể được công bố trong cơ sở

dữ liệu 1000 Genomes. Đáng chú ý, có 6 biến thể mới của CYP2C9 chưa được công

bố trên cả 3 cơ sở dữ liệu đa hình di truyền dược học, NCBI dbSNP và 1000 Genomes.

Những biến thể mới này bao gồm 4 thay đổi đơn nucleotide trong intron 2 (3415C>T),

intron 6 (33622T>C, 38658A>G) và intron 7 (42801A>G), 01 biến thể xóa nucleotide

trong intron 8 (47543delT) và một biến thể thay thế đơn nucleotide trong exon 7

(42627C>A) (Hình 3.6). Đồng thời, nghiên cứu này không phát hiện được biến thể

thêm nucleotide ở CYP2C9 trong tất cả 100 mẫu.

Phân tích bằng phần mềm Haploview cho thấy có 13/14 biến thể của CYP2C9

đạt cân bằng Hardy-Weinberg (HWpval>0,05), ngoại trừ biến thể 251T>C

(HWpval=0,0101) (Phụ lục 2).

60

Bảng 3.1. Các biến thể của CYP2C9 trong quần thể người Kinh Việt Nam

Vị trí

Allele

STT

Vùng gen

SNP ID GenBank

Thay đổi nucleotide

Ảnh hưởng

Tần số (%)

T>C

-

Intron 1 251

#

(1/100) 1

1

G>C

-

Exon 2 3235

Val76

(1/100) 1

2

T>C

rs9332120

#

(1/100) 1

3

3411

C>T

#

(1/100) 1

4

3415 Mới

Intron 2

Intron 3 9032

rs9332127

G>C

#

(6/100) 6

5

10311

rs9332129

A>G

#

(6/100) 6

6

Intron 4

10376

rs201512316

T>C

#

(1/100) 1

7

T>C

#

(1/99) 1,01

8

33622 Mới

Intron 6

A>G

#

(1/100) 1

9

38658 Mới

42614

rs1057910

A>C

*3

Ile359Leu (7/100) 7

10

Exon 7

C>A

11

42627 Mới

Pro363His (2/100) 2

42726

rs17847029

C>T

#

(6/100) 6

12

Intron 7

A>G

#

(1/100) 1

13

42801 Mới

14

delT

#

(1/100) 1

Intron 8 47543 Mới

# những biến đổi này không làm ảnh hưởng đến chức năng của protein.

Vị trí của mỗi SNP được xác định bằng trình tự tham chiếu của CYP2C9: NG-008385.1 trên cơ sở dữ liệu NCBI. Các nucleotide được đánh số bắt đầu từ base A (+1) của mã mở đầu ATG trên gen.

61

Các biến thể mới được xác định trong vùng từ intron 2 đến intron 8 của CYP2C9, bao gồm 5 biến thể mới trong intron và 1 biến thể mới trong exon 7. a) 3415C>T (intron 2), b) 33622T>C (intron 6), c) 38658A>G (intron 6), e) 42801A>G (intron 7), f) 47543delT (intron 8), và d) 42627C>A (exon 7). Vị trí nucleotide bị thay đổi được đánh dấu bằng mũi tên.

Hình 3.6. Các biến thể mới trong vùng intron và exon của CYP2C9

62

* Xác định CNV của CYP2C9 bằng MLPA

Khi tiến hành xác định các CNV của CYP2C9, có 3/100 mẫu nghiên cứu được

xác định là mất 1 bản sao của gen này. Cụ thể, bộ kit MLPA thiết kế 5 đầu dò đặc

hiệu cho các exon 1 (1 đầu dò), 7 (1 đầu dò), 8 (2 đầu dò) và 9 (1 đầu dò) của CYP2C9.

Kết quả tỉ lệ sau chuẩn hóa bằng phần mềm Coffalyzer của 5 đầu dò thuộc 3 mẫu

MVN 21, MVN 23, MVN 24 đều cho giá trị nằm trong khoảng từ 0,4-0,65 (Bảng

3.2). Những mẫu còn lại (97/100 mẫu) mang 2 bản sao CYP2C9 có kết quả tỉ lệ sau

chuẩn hóa của 5 đầu dò nằm trong khoảng 0,8-1,2. Số liệu về tỉ lệ của các đầu dò sau

chuẩn hóa của một số mẫu được thể hiện trong Bảng 3.2.

Kết quả MLPA được trình bày trong Hình 3.7 dưới dạng biểu đồ sóng và sự

phân bố của các giá trị tỉ lệ sau chuẩn hóa.

Bảng 3.2. Dữ liệu MLPA về CNV gen CYP2C9 của một số mẫu nghiên cứu

Vị trí đầu dò của kit MLPA và các tỉ lệ sau chuẩn hóa

Tên mẫu (Final ratio) Exon 8

Exon 8

Exon 1

Exon 7

Exon 9

(1)

(2)

0,98 0,87 0,99 1,06 1,05 FVN 01

0,96 0,97 0,98 1,01 1,11 FVN 02

0,96 1,23 1,1 1,01 FVN 79 1,15

0,96 0,98 1,09 1 1,04 FVN 90

0,39 0,57 0,45 0,42 0,67 MVN 21

0,52 0,57 0,55 0,5 0,64 MVN 23

0,59 0,65 0,62 0,61 0,69 MVN 24

63

a)

b)

a) Biểu đồ sóng, b) Phân bố các giá trị tỉ lệ sau chuẩn hóa. Mẫu MVN 23: mất toàn bộ 1 allele CYP2C9. Tỉ lệ số bản sao của các exon 1, 5, 8(1), 8(2) và 9 là 1:1:1:1. Vị trí các đầu dò trên CYP2C9 được thể hiện bằng các mũi tên màu đỏ.

Hình 3.7. Kết quả MLPA xác định mất toàn bộ 01 bản sao của gen CYP2C9.

64

Phương pháp real-time PCR sử dụng các mồi đặc hiệu cho exon 4 và exon 7 của

CYP2C9 được thực hiện nhằm kiểm tra lại hiện tượng mất bản sao CYP2C9 ở 2 trong

số 3 mẫu nói trên. Trong nghiên cứu này, mẫu đối chứng được sử dụng là các mẫu có

2 bản sao của CYP2C9 đã được xác định bằng phương pháp MLPA. Kết quả real-

time PCR thu được tương đồng 100% với dữ liệu của MLPA (Hình 3.8). Mặt khác,

hiện tượng tăng số bản sao và mất toàn bộ 2 allele của CYP2C9 không được xác định

trong tất cả 100 mẫu nghiên cứu.

CYP2C9 qPCR

1.5

1

t

C Δ Δ - 2

0.5

0

REF

MVN 23

MVN 21 Mẫu

Exon 4

Exon 7

Các mồi được thiết kế đặc hiệu cho exon 4 và exon 7 của CYP2C9. REF-mẫu đối chứng

có 2 bản sao CYP2C9, các mẫu MVN 21 và MVN 23 có 1 bản sao của CYP2C9.

Hình 3.8. Kết quả Real-time PCR kiểm tra mất số bản sao của CYP2C9

*Tần số kiểu gen và tần số allele của CYP2C9 ở quần thể người Kinh

Từ các số liệu thu được bằng giải trình tự và phân tích MLPA, đã xác định

được 3 kiểu gen của CYP2C9 trong 100 mẫu nghiên cứu. Trong đó, kiểu gen chiếm

tần số lớn nhất là đồng hợp tử kiểu dại CYP2C9*1/*1 (90%) có hoạt tính enzyme

bình thường. Hai kiểu gen ít phổ biến hơn là dị hợp tử CYP2C9*1/*3 (7%) có hoạt

tính enzyme giảm (chuyển hóa thuốc trung bình) và CYP2C9*1/Del (mất 1 allele) với

hoạt tính enzyme chưa rõ (Theo CPIC). Ngoài ra, nghiên cứu này không phát hiện

được kiểu gen đồng hợp tử CYP2C9*3/*3 cũng như kiểu gen đồng hợp tử mất toàn

65

bộ 2 allele (CYP2C9Del/Del) trong 100 mẫu nghiên cứu. Chi tiết các kiểu gen và tần

số tương ứng được thể hiện ở Bảng 3.3.

Từ đó, tổng số có 3 allele của CYP2C9 đã được xác định trong nghiên cứu này

là CYP2C9*1, CYP2C9*3 và CYP2C9Del. Trong đó, *1 là allele kiểu dại và chiếm

tỉ lệ cao nhất trong quần thể với 95%, *3 chiếm tỉ lệ thấp hơn với 3,5% và tỉ lệ thấp

nhất là Del với 1,5% (Bảng 3.4). Ngoài ra, không xác định được sự tồn tại của allele

CYP2C9*2 cũng như các allele khác đã được công bố của CYP2C9 trong 100 mẫu

nghiên cứu.

Bảng 3.3. Tần số kiểu gen CYP2C9 trong quần thể người Kinh Việt Nam

Kiểu gen Kiểu hình Tổng số (N=100) Tần số (%)

chuyển hóa thuốc

90 90 *1/*1

(Theo CPIC) EM IM 7 7 *1/*3

- 3 *1/Del 3

N: tổng số mẫu nghiên cứu

Bảng 3.4. Tần số các allele CYP2C9 trong quần thể người Kinh Việt Nam

Allele Tổng số (n=200) Tần số (%)

190 95 *1

7 3,5 *3

3 1,5 Del

N: tổng số mẫu nghiên cứu, n: tổng số allele trong quần thể

3.3.2. Đa hình/đột biến của gen CYP2C19

*Các biến thể của CYP2C9 được xác định bằng phương pháp giải trình tự

Đối với CYP2C19, đã xác định được tổng số 14 biến thể trong số 100 mẫu nghiên

cứu. Trong số đó, có 11 biến thể đã được công bố và 3 biến thể mới (Bảng 3.5). Các

biến thể đã được công bố của CYP2C19 bao gồm 2 biến thể trong promoter trong đó

1 biến thể đã được định danh là *17 (-806C>T), 4 biến thể trong intron và 5 biến thể

66

trong exon bao gồm 2 biến thể đã được định danh là *2 (19154G>A) và *3

(17948G>A). Các biến thể mới bao gồm 12637C>G (intron 2), 57637delG (intron 5)

và 90008C>T (intron 8). Các biến thể mới được thể hiện cụ thể trong Hình 3.9. Đây

là những biến thể nằm trong vùng không mã hóa, do đó có thể sẽ không gây ảnh

hưởng đến chức năng của chuỗi polypetptide được mã hóa bởi CYP2C19. Nghiên

cứu này cũng không phát hiện biến thể thêm nucleotide ở CYP2C19 trong 100 mẫu

người Kinh.

Bảng 3.5. Các biến thể của CYP2C19 trong quần thể người Kinh Việt Nam

STT Vùng

Allele

Tần số (%)

gen

Vị trí

SNP ID Genebank

Ảnh hưởng

1

-806

rs12248560 C>T

*17

#

(2/100) 2

Promoter

2

Thay đổi nucleotide đổi T>C

-98

rs4986894

#

(41/98) 41,83

3

C>G

#

(5/100) 5

12637 Mới

Intron 2

4

12662

rs12769205 A>G

(39/100) 39

#

5

Exon 4

17948

rs4986893 G>A

*3

Trp212X

(5/100) 5

6

Exon 5

19154

rs4244285 G>A

*2

(38/100) 38

Splicing defect

7

delG

#

(7/99) 7,07

57637 Mới

8

Intron 5

57678

rs28399511 T>G

#

(1/100) 0,01

9

57740

rs4417205 G>C

#

(41/100) 41

10

80160

rs3758580

C>T

Val330=

(44/100) 44

Exon 7

11

80161

rs3758581 A>G

Ile331Val

(100/100) 100

12

Intron 7

87106

rs4917623

T>C

#

(89/100) 89

13

Exon 8

87313

rs17886522 A>C

Gly417=

(7/100) 7

14

Intron 8

C>T

#

(1/100) 1

90008 Mới

#: những biến đổi này không làm ảnh hưởng đến chức năng của protein.

Vị trí của mỗi SNP được xác định bằng trình tự tham chiếu của CYP2C19: NG-008384.2 trên cơ sở dữ liệu NCBI. Các nucleotide được đánh số bắt đầu từ base A (+1) của mã mở đầu ATG trên gen.

67

Nghiên cứu này đã xác định được 03 biến thể mới trong vùng intron của CYP2C19: a) biến thể 2637C>G (intron 2), b) biến thể 57637delG (intron 5) và c) biến thể 90008C>T (intron 8-sử dụng mồi ngược cho giải trình tự). Các vị trí nucleotide bị biến đổi được đánh dấu bằng mũi tên.

Hình 3.9. Các biến thể mới trong vùng intron của CYP2C19.

68

* Xác định CNV của CYP2C19 bằng MLPA

Phân tích MLPA cho thấy không có bất thường số bản sao nào của CYP2C19

được xác định ở 100 mẫu nghiên cứu. Bộ kit MLPA thiết kế 03 đầu dò đặc hiệu cho

các exon của CYP2C19 bao gồm exon 2, 6 và 9. Tất cả các mẫu nghiên cứu đều cho

tỉ lệ của các đầu dò này sau chuẩn hóa nằm trong khoảng 0,8-1,2. Số liệu về tỉ lệ của

các đầu dò sau chuẩn hóa của một số mẫu đại diện được thể hiện trong Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Dữ liệu MLPA về CNV gen CYP2C19 của một số mẫu nghiên cứu

Vị trí đầu dò của kit MLPA và các tỉ lệ sau chuẩn hóa (Final ratio) Tên mẫu

Exon 2 Exon 6 Exon 9

FVN 10 1,01 1,01 1,01

FVN 20 1,15 0,97 0,75

FVN 26 1,19 1,08 0,8

FVN 38 0,95 1,1 0,95

FVN 40 0,98 0,96 1

*Tần số kiểu gen và tần số allele của CYP2C19 trong quần thể người Kinh

Chúng tôi cũng xác định được 6 kiểu gen của CYP2C19 trong các mẫu nghiên

cứu với tỉ lệ dao động từ 1% đến 58% (Bảng 3.7). Trong số đó, kiểu gen phổ biến

nhất là đồng hợp tử kiểu dại CYP2C19*1/*1 (58%) và dị hợp tử CYP2C19*1/*2

(32%). Kiểu gen dị hợp tử CYP2C19*2/*3 chiếm tỉ lệ thấp nhất với 1%. Các kiểu gen

khác bao gồm CYP2C19*1/*3, CYP2C19*2/*2 và CYP2C19*2/*17 lần lượt có tần

số 4%, 3% và 2%. Về hoạt tính, trong khi kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại có hoạt tính

enzyme bình thường thì các kiểu gen CYP2C19*1/*2, CYP2C19*1/*3 và

CYP2C19*2/*17 có hoạt tính enzyme giảm. Ngoài ra, các kiểu gen CYP2C19*2/*2

và CYP2C19*2/*3 có hoạt tính giảm mạnh hoặc không có hoạt tính (Theo CPIC).

69

Tổng số có 4 allele của CYP2C19 đã được tìm thấy trong số 100 mẫu nghiên cứu

bao gồm: CYP2C19*1, CYP2C19*2, CYP2C19*3 và CYP2C19*17. Allele kiểu dại

CYP2C19*1 chiếm tần số cao nhất với 76% trong số các mẫu nghiên cứu. Trong khi

đó, các allele còn lại là CYP2C19*2, CYP2C19*3 và CYP2C19*17 lần lượt chiếm tỉ

lệ 20,5%, 2,5% và 1% (Bảng 3.8).

Phân tích bằng phần mềm Haploview cho thấy tất cả 14 biến thể của CYP2C19

xác định được trong 100 mẫu nghiên cứu đều đạt trạng thái cân bằng Hardy-Weinberg

với giá trị Hwpval dao động từ 0,2769 đến 1 (Phụ lục 3).

Bảng 3.7. Tần số kiểu gen của CYP2C19 trong quần thể người Kinh Việt Nam

Kiểu gen Tổng số Tần số (%) (N=100) Kiểu hình chuyển hóa thuốc (Theo CPIC)

*1/*1 58 EM 58

*1/*2 32 IM 32

*1/*3 4 IM 4

*2/*2 3 PM 3

*2/*3 1 PM 1

*2/*17 2 IM 2

N: Tổng số mẫu nghiên cứu

Bảng 3.8. Tần số các allele CYP2C19 trong quần thể người Kinh Việt Nam

Allele Tổng số Tần số % (n=200)

*1 154 76

*2 41 20,5

*3 5 2,5

*17 2 1

n: tổng số allele trong quần thể

70

3.3.3. Đa hình/đột biến của gen CYP2D6

*Các biến thể của CYP2D6 xác định được bằng phương pháp giải trình tự

Sử dụng phương pháp giải trình tự, nghiên cứu này đã giải trình tự thành công

vùng promoter cùng với toàn bộ 9 exon và các vùng biên của gen CYP2D6 trên tổng

số 136 mẫu người Kinh Việt Nam. Với phương pháp này, chúng tôi đã xác định được

tống số 30 biến thể bao gồm các SNP và biến thể thêm nucleotide của CYP2D6. Các

biến thể này bao gồm 7 biến thể mới, ngoài ra 23 biến thể đã được công bố trên cơ sở

dữ liệu PharmVar (Bảng 3.9). Các biến thể mới bao gồm 3 biến thể trong vùng

promoter (-498C>A, -184A>T, -175A>T) (Hình 3.10), 2 biến thể trong intron 4 và 6

(2137G>C, 2988G>A) và 2 biến thể trong exon 7 và exon 8 (3157G>T, 3851G>A)

(Hình 3.11). Biến thể mất nucleotide của CYP2D6 không được tìm thấy ở cả 136 mẫu

nghiên cứu. Phân tích cân bằng di truyền quần thể bằng phần mềm Haploview cho

thấy có 24/30 biến thể được xác định là đạt trạng thái cân bằng di truyền

(Hwpval>0,05) và các biến thể còn lại không đạt trạng thái cân bằng di truyền

(Hwpval<0,05) bao gồm: 100C>T, 310G>T, 1039C>T, 3384A>C, 3790C>T và

4181G>C (Phụ lục 4).

Bảng 3.9. Biến thể của CYP2D6 trong quần thể người Kinh Việt Nam xác định bằng

phương pháp giải trình tự

SNP ID

Thay đổi

STT Vùng gen Vị trí

Ảnh hưởng Tần số (%)

Genbank

nucleotide

(-740)

rs28624811 C>T,

#

26/136 (19,1)

1

#

(-678)

rs28633410 G>A

32/136 (23,5)

2

#

Promoter

16/136 (11,7)

3

(-498) Mới

C>A

#

1/136 (0,7)

4

(-184) Mới

A>T

#

10/136 (7,3)

5

(-175) Mới

A>T

100

rs1065852

C>T

Pro34Ser

110/136 (80,8)

6

Exon 1

137-138 rs774671100 insT

47 frameshift 1/136 (0,7)

7

#

Intron 1

214

rs1080995 G>C

25/136 (18,4)

8

#

rs1080996

C>A

221

26/136 (19,1)

9

#

rs1080997

C>G

223

22/136 (16,2)

10

#

rs1080998

T>C

227

27/136 (19,9)

11

#

rs29001518 G>C

232

34/136 (25)

12

#

rs28695233 A>C

233

25/136 (18,4)

13

#

rs1081000 A>G

245

21/136 (15,4)

14

#

rs28371699 G>T

310

116/136 (85,3)

15

Exon 2

1039

rs1081003

C>T

#

114/136 (83,8)

16

1661

rs1058164 G>C

#

125/136 (91,9)

17

Exon 3

1759

rs5030865 G>A

Gly169Arg 2/136 (1,5)

18

#

Intron 3

1846

rs3892097 G>A

3/136 (2,2)

19

#

Intron 4

2097

rs2267447 A>G

115/136 ()

20

#

Intron 4

1/136 (0,7)

21

71

2137

Mới

G>C

2607

rs77913725 G>A

Glu278Lys 5/136 (3,7)

22

Exon 5

2611

rs1135828

T>A

Met279Lys 1/136 (0,7)

23

Exon 6

2851

rs16947

C>T

Arg269Cys 35/136 (25,7)

24

Intron 6

#

6/136 (4,4)

25

2988

Mới

G>A

Exon 7

26

3157

Mới

Arg329Leu 1/136 (0,7)

G>T

3384

rs1985842 A>C

#

66/136 (48,5)

27

Intron 7

3790

rs4987144

C>T

#

33/136 (24,2)

28

Exon 8

29

3851

Mới

G>A

Trp358X 2/136 (1,5)

Exon 9

4181

rs1135840 G>C

Ser486Thr 82/136 (60,3)

30

Vị trí của nucleotide được xác định dựa trên trình tự tham chiếu của CYP2D6 là NG_008376.4 trên NCBI. Số thứ tự của nucleotide được đánh số +1 bắt đầu từ base A trong mã mở đầu ATG.

#: những biến đổi này không làm ảnh hưởng đến chức năng của protein.

72

Hình 3.10. Các biến thể mới trong vùng promoter CYP2D6 Nghiên cứu này xác định được 03 biến thể mới trong vùng promoter (sử dụng mồi ngược cho giải trình tự): a) biến thể -175A>T, b) biến thể -184A>T, c) biến thể -498C>A. Các vị trí nucleotide bị biến đổi được đánh dấu bằng mũi tên. Các biến thể trên đều được xác định ở trạng thái dị hợp tử, riêng biến thể -498C>A được xác định cả ở trạng thái dị hợp tử và đồng hợp tử.

73

Nghiên cứu này xác định được 2 biến thể mới trong intron và 2 biến thể mới trong exon của CYP2D6: a) biến thể 2137G>C (intron 4), b) biến thể 2988G>A (intron 6), c) biến thể 3157G>T (exon 7), d) biến thể 3851G>A (exon 8- sử dụng mồi ngược cho giải trình tự). Các vị trí nucleotide bị biến đổi được đánh dấu bằng mũi tên. Các biến thể trên đều được xác định ở trạng thái dị hợp tử.

Hình 3.11. Các biến thể mới trong intron và exon của CYP2D6

74

*Xác định CNV của CYP2D6 bằng MLPA

Phương pháp MLPA được sử dụng để xác định CNV của CYP2D6 trên tổng

số 136 mẫu người Kinh Việt Nam. Kết quả phân tích sau quá trình chuẩn hóa được

hiển thị dưới dạng bảng số liệu và biểu đồ sóng (electropherogram). Các mẫu thể hiện

tăng hay giảm số bản sao ở các exon không liền kề nhau được loại bỏ ra khỏi các

phân tích tiếp theo và coi như có số bản sao bình thường (2 bản sao). Kết quả cho

thấy có 12 kiểu tập hợp số bản sao của 4 exon nói trên. Số liệu MLPA (giá trị tỉ lệ

sau chuẩn hóa) về CNV gen CYP2D6 của một số mẫu trong nghiên cứu được thể hiện

ở phụ lục 7. Một số kết quả MLPA của CYP2D6 của dưới dạng biểu đồ sóng được

trình bày trong các hình 3.12-3.14.

Mẫu FVN37: Mang số bản sao CYP2D6 bình thường. Tỉ lệ số bản sao của các exon 1, 5, 6 và 9 là 2:2:2:2. Vị trí các đầu dò trên CYP2D6 được thể hiện bởi các mũi tên màu đỏ.

Hình 3.12. Kết quả MLPA xác định số bản sao bình thường của gen CYP2D6

75

Mẫu FVN19: Tỉ lệ số bản sao của các exon 1, 5, 6 và 9 là 3:3:3:2. Vị trí các đầu dò trên CYP2D6 được thể hiện bởi các mũi tên màu đỏ.

Hình 3.13. Kết quả MLPA xác định bất thường số bản sao (các exon 1,5,6) gen CYP2D6.

Mẫu FVN 57: mất toàn bộ 1 allele CYP2D6. Tỉ lệ số bản sao của các exon 1, 5, 6 và 9 là 1:1:1:1. Vị trí các đầu dò trên CYP2D6 được thể hiện bởi các mũi tên màu đỏ.

Hình 3.14. Kết quả MLPA xác định mất toàn bộ 01 bản sao của gen CYP2D6.

76

Phân tích kết quả MLPA cho thấy có 21/136 mẫu nghiên cứu xuất hiện mất 1

allele CYP2D6 với tỉ lệ số bản sao của các exon 1:5:6:9 là 1:1:1:1. Kết quả tỉ lệ sau

chuẩn hóa bằng phần mềm Coffalyzer của 4 đầu dò của 21 mẫu này đều cho giá trị

nằm trong khoảng 0,4-0,65. Các mẫu mà kết quả MLPA cho thấy bị mất hoàn toàn 1

bản sao của CYP2D6 được kiểm tra lại ngẫu nhiên bằng phương pháp LR-PCR. Sơ

đồ vị trí các mồi sử dụng cho LR-PCR được thể hiện ở Hình 3.15a. Phân tích kết quả

cho thấy phù hợp 100% với dữ liệu thu được từ MLPA với các mẫu mất 1 allele

CYP2D6 đều xuất hiện 2 băng gồm: băng đặc hiệu cho allele đột biến với kích thước

3,2 kb và băng đặc hiệu cho allele nguyên vẹn là 5,1 kb. Trong khi đó, mẫu đối chứng

có 2 bản sao của gen này chỉ xuất hiện 1 băng có kích thước 5,1 kb (Hình 3.15b).

a)

b)

a) Sơ đồ vị trí các cặp mồi sử dụng cho LR-PCR tương ứng với các allele CYP2D6*1 và CYP2D6*5. Đột biến mất 1 allele CYP2D6 sẽ tạo sản phẩm là 2 đoạn có kích thước 3,2 kb- allele *5 (cặp mồi Dup và Dlow) và 5,1 kb-allele kiểu dại *1(cặp mồi DPKup và DPKlow). Các mẫu đồng hợp tử kiểu dại chỉ xuất hiện 1 sản phẩm có kích thước 5,1 kb [110]. b) Giếng 1: Thang DNA chuẩn, giếng 2-3: các mẫu đồng hợp tử kiểu dại CYP2D6*1/*1, giếng 4-5: các mẫu mất 1 bản sao CYP2D6 có kiểu gen dị hợp tử CYP2D6*1/*5.

Hình 3.15. LR-PCR kiểm tra allele CYP2D6*5.

77

Bên cạnh đó, nghiên cứu này không xác định được sự tồn tại của biến thể tăng

số bản sao của CYP2D6 trong số 136 mẫu (CYP2D6*nxN, N>2) cũng như hiện tượng

mất hoàn toàn 2 allele của CYP2D6 (giá trị DQ sau chuẩn hóa = 0).

*Tần số allele và kiểu gen của CYP2D6 trên người Kinh Việt Nam

Để xác định các kiểu gen của CYP2D6, dữ liệu thu được từ giải trình tự và

phân tích số bản sao bằng MLPA được kết hợp và đối chiếu để đưa ra kiểu gen cuối

cùng ở mỗi mẫu nghiên cứu. Bên cạnh việc sử dụng dữ liệu của các biến thể đã công

bố của CYP2D6 trên cơ sở dữ liệu PharmVar (bao gồm các biến thể dạng SNP, indel,

CNV và SV), nghiên cứu này còn cập nhật và tham khảo các kết quả từ công bố của

các nhóm nghiên cứu trên thế giới về một số SV khác của CYP2D6 để đối chiếu và

đưa ra kết luận về kiểu gen của các mẫu nghiên cứu.

Trong số 136 mẫu nghiên cứu, có 29 kiểu gen khác nhau đã được xác định với

tần số dao động từ 0,7% đến 22,8% (Bảng 3.10). Trong số đó, những kiểu gen chiếm

tần số nhiều nhất đó là CYP2D6*10/*10 (22,8%), tiếp theo là dị hợp tử

CYP2D6*1/*10 (15,4%) và CYP2D6*10/*36-*10 (11%). Các kiểu gen chiếm tần số

hơn 5% bao gồm *2/*10 (6,6%) và *1/*1 (5,9%). Ngoài kiểu gen đồng hợp tử kiểu

dại *1/*1 và các kiểu gen *10/*10, *36-*10/*36-*10, *60/*60 thì những kiểu gen

còn lại đều được xác định ở trạng thái dị hợp tử.

Có 14/29 kiểu gen đã được CPIC đưa ra kiểu hình chuyển hóa thuốc cụ thể là

EM, IM cho tới PM. Có thể thấy kiểu hình chiếm tần số cao nhất là IM (51,3%) mang

chủ yếu là allele CYP2D6*10 và thấp nhất là PM (1,4%) mang các allele đã được

chứng minh là không có chức năng như *5, *36 và *60. Ngoài ra, 15/29 kiểu gen còn

lại chưa xác định được kiểu hình theo CPIC. Kiểu hình chuyển hóa thuốc của mỗi

kiểu gen cũng được chú thích cụ thể trong Bảng 3.10.

78

Bảng 3.10. Xác định kiểu gen của CYP2D6 ở người Kinh Việt Nam thông qua kết hợp dữ liệu giải trình tự và MLPA

MLPA STT LR-PCR Kiểu gen GTT Kiểu hình (CPIC) Tần số (%) CN (E1) CN (E5) CN (E6) CN (E9)

*1/*1 2 2 2 2 - *1/*1 EM 5,9 1

*1/*2 2 2 2 2 - *1/*2 EM 4,4 2

*1/*10 2 2 2 2 - *1/*10 IM 15,4 3

*1/*86 2 2 2 2 - *1/*86 IM 0,7 4

*1/*14 2 2 2 2 - *1/*14 - 0,7 5

*2/*10 2 2 2 2 - *2/*10 - 6,6 6

*2/*65 2 2 2 2 - *2/*65 IM 2,2 7

*4/*10 2 2 2 2 - *4/*10 - 0,7 8

*60/*60 2 2 2 2 - *60/*60 PM 0,7 9

*10/*10 2 2 2 2 - *10/*10 IM 22,8 10

*10/*15 2 2 2 2 - *10/*15 IM 0,7 11

*10/*65 2 2 2 2 - *10/*65 IM 2,2 12

*1/*10 3 3 3 2 - *1/*36-*10 - 1,5 13

*10/*10 3 3 3 2 - *10/*36-*10 - 11,0 14

*10/*65 3 3 3 2 - *65/*36-*10 - 0,7 15

79

4 4 4 - 2 *36-*10/*36-*10 - 3,7 *10/*10 16

3 2 2 - 2 *2/*68-*4 - 0,7 *2/*10 17

2 2 2 - 3 *4/*13-*1 - 0,7 *1/*4 18

3 3 3 1 Mất 01 allele *5/*36-*36-*10 - 0,7 *10/*10 19

2 2 2 1 Mất 01 allele *5/*36-*10 - 3,7 *10/*10 20

1 2 2 - 2 *13/*10 IM 1,5 *10/*10 21

1 1 2 - 2 *10/*67 - 0,7 *2/*10 22

1 1 1 2 Mất 01 allele *5/*13-*2 - 1,5 *1/*2 23

1 1 1 2 Mất 01 allele *5/*13-*1 - 0,7 *1/*1 24

1 1 1 1 Mất 01 allele *1/*5 IM 2,9 *1/*1 25

1 1 1 1 Mất 01 allele *2/*5 - 0,7 *2/*2 26

1 1 1 1 Mất 01 allele *5/*10 IM 4,4 *10/*10 27

1 1 1 1 Mất 01 allele *5/*65 IM 0,7 *2/*10 28

1 1 1 0 Mất 01 allele *5/*36 PM 0,7 *10/*10 29

GTT: giải trình tự, CN: copy number, E1: exon 1, E5: exon 5, E6: exon 6, E9: exon 9.

80

Từ số liệu về kiểu gen của136 mẫu Kinh, đã xác định được 9 kiểu allele

CYP2D6 đã được báo cáo trong cơ sở dữ liệu PharmVar (75,37%), 8 biến thể SV (3

biến thể dạng hybrid, 5 biến thể dạng tandem arrangements) trên locus CYP2D6

(16,54%) và 01 biến thể CNV (mất 1 allele) của gen này (8,09%) Bảng 3.11. Trong

số 9 SV của CYP2D6 thì các biến thể *5, *13, *36, *13-*1, *13-*2, *36-*10, *36x2-

*10 và *68-*4 đã được báo cáo trong cơ sở dữ liệu PharmVar, còn biến thể dạng lai

*67 thì đã được công bố trong nghiên cứu của Gaedigk và cộng sự [117]. Tần số và

chức năng của các biến thể CYP2D6 được chú thích cụ thể trong Bảng 3.11.

Trong số 9 kiểu allele của CYP2D6, allele CYP2D6*10 (gây giảm chức năng

của enzyme) chiếm tỉ lệ cao nhất là 43,75%, trong khi đó các allele CYP2D6*1 và *2

(kiểu hình bình thường) lần lượt chiếm tỉ lệ là 18,75% và 7,35%. Ngoài ra, nghiên

cứu này cũng xác định được 5 allele không chức năng của CYP2D6 chiếm tỉ lệ từ

0,37% đến 8,09% (*4, *5, *14, *15 và *36). Bên cạnh đó, có 3 allele với chức năng

chưa rõ cũng được xác định đó là *60 (0,74%), *65 (2,94%) và *86 (0,37%). Trong

số những biến thể dạng tandem rearrangements, CYP2D6*36-*10 là biến thể chiếm

tỉ lệ lớn nhất (12,13%), đây là biến thể mà trong đó cấu trúc lai *36 nằm liền kề phía

trước *10. Các biến thể khác trong nhóm này có tỉ lệ dao động từ 0,37% đến 1,47%.

Các cấu trúc *13-*1 và *13-*2 có chức năng bình thường trong khi đó *36-*10 và

*36-*36-*10 có chức năng enzyme bị giảm. Các biến thể *13 và *68-*4 đều mã hóa

cho protein không chức năng. Không có cá thể nào trong 136 mẫu có kiểu gen đồng

hợp tử CYP2D6*5/*5 (mất hoàn toàn cả 2 allele CYP2D6).

Bảng 3.11. Tần số allele của CYP2D6 trong quần thể người Kinh Việt Nam

Loại biến thể/Allele STT Biến thể/Allele Tần số (%) Chức năng (Theo CPIC)

1 *1 18,75 Bình thường

2 *2 7,35 Bình thường

3 *4 0,74 Không SNP/indel

4 *10 43,75 Giảm

5 *14 0,37 Không

81

*15 6 0,37 Không

*60 7 0,74 Chưa biết

*65 8 2,94 Chưa biết

*86 9 0,37 Chưa biết

CNV *5 1 8,09 Không

*13 2 1,547 Không

Hybrid *36 3 0,37 Không

*67 4 0,37 Chưa biết

*13-*1 5 0,74 Bình thường Cấu trúc (SV)

*13-*2 6 0,74 Bình thường

7 *36-*36-*10 0,37 Giảm Tandem arrangements

8 *36-*10 12,13 Giảm

9 *68-*4 0,37 Không

Về mặt cấu trúc, các biến thể dạng hybrid là allele dạng lai giữa gen CYP2D6

và gen giả CYP2D7, trong đó dạng lai CYP2D6-2D7 (*36) với vùng 5’ có nguồn gốc

từ CYP2D6 và vùng 3’ có nguồn gốc từ CYP2D7. Ngược lại dạng lai CYP2D7-2D6

(*13 và *67) có vùng 5’ của gen lai bắt nguồn từ CYP2D7 và vùng 3’ có nguồn gốc

từ CYP2D6. Các biến thể dạng tandem arrangements bao gồm 2 hoặc nhiều hơn 2

bản sao của CYP2D6 nằm cạnh nhau trên cùng 1 allele và các bản sao này không

giống nhau. Thông thường các biến thể dạng này bao gồm một allele dạng lai nằm

liền kề với một biến thể dạng dạng SNP của gen này. Biến thể dạng này được phân

biệt với loại biến thể tăng số lượng bản sao của CYP2D6 (bao gồm nhiều hơn 2 bản

sao của CYP2D6 và các bản sao này giống hệt nhau, ví dụ CYP2D6*2x2). Chi tiết

của các biến thể SV của CYP2D6 trong nghiên cứu này được thể hiện trong Hình

3.16.

tiết về các SV của CYP2D6 được báo cáo

trong cơ sở dữ

#Thông

tin chi

82

Hình 3.16. Các SV của CYP2D6 được xác định trên các mẫu người Kinh a) Locus gen tham chiếu CYP2D6 (màu đỏ) và các gen giả CYP2D7 (màu xanh) và CYP2D8 (màu ghi). REP6 (màu tím) và REP7 (màu đen) là các trình tự lặp lại nằm xuôi chiều CYP2D6 và CYP2D7. b) Đột biến mất toàn bộ CYP2D6 (*5). c) Các cấu trúc lai của CYP2D6 bao gồm các dạng lai CYP2D6- 2D7 (vùng 5’ có nguồn gốc từ CYP2D6 và vùng 3’ có nguồn gốc từ CYP2D7) và CYP2D7-2D6 (vùng 5’ có nguồn gốc từ CYP2D7 và vùng 3’ có nguồn gốc từ CYP2D6). d) Biến thể về sắp xếp (tandem) của CYP2D6, biến thể dạng này bao gồm 2 hoặc nhiều hơn 2 bản sao của CYP2D6 nằm cạnh nhau trên cùng 1 allele và các bản sao này không giống nhau. Biến thể dạng này được phân biệt với loại biến thể tăng số lượng bản sao của CYP2D6 là duplication và multiplication. liệu PharmVar (https://www.pharmvar.org/gene/CYP2D6). ∆Chi tiết của các SV này được báo cáo trong nghiên cứu của Gaedik và cộng sự [117].

83

3.3.4. Đa hình/đột biến của gen CYP3A5

*Các biến thể của CYP3A5 được xác định bằng giải trình tự

Nghiên cứu này đã giải trình tự thành công các vùng gen CYP3A5 chứa các

biến thể *3, *6, *8 và *9 ở 100 mẫu người Kinh Việt Nam. Kết quả cho thấy không

xác định được sự tồn tại của CYP3A5*6, *8 và *9 trên các mẫu nghiên cứu. Đối với

biến thể CYP3A5*3, kết quả giải trình tự của 100 mẫu nghiên cứu xác định được sự

tồn tại của allele này ở trạng thái dị hợp tử *1/*3 và đồng hợp tử *3/*3 (Hình 3.17).

Cụ thể, có 90% số người trong nghiên cứu mang ít nhất một allele CYP3A5*3 (*1/*3

và *3/*3, n=90) trong khi đó chỉ 10% (n=10) số người mang kiểu gen đồng hợp tử

kiểu dại CYP3A5*1/*1. Trong số những người mang allele *3, 50% có kiểu gen dị

hợp tử với allele kiểu dại (n=45/90). Theo đó tần số allele kiểu dại CYP3A5*1 được

xác định là 32,5% còn tần số biến thể allele CYP3A5*3 (6986A>G) là 67,5%. Với tần

số kiểu gen và allele như vậy, quần thể nghiên cứu xấp xỉ đạt trạng thái cân bằng

Hardy-Weinberg (p=0,9677). Kết quả được hiển thị trong Bảng 3.12.

.

a)Đồng hợp tử kiểu dại CYP3A5 *1/*1 (AA), b) Dị hợp tử CYP3A5 *1/*3 (AG), c) Đồng hợp tử đột biến CYP3A5 *3/*3 (GG). Vị trí nucleotide bị biến đổi được đánh dấu bằng mũi tên.

Hình 3.17. Kết quả giải trình tự của CYP3A5*3.

84

Bảng 3.12. Tần số kiểu gen và tần số allele CYP3A5 trên người Kinh Việt Nam

Kiểu gen (N=100) Allele (n=200) Tần số *1/*1 *1/*3 *3/*3 *1 *3

10 45 45 65 135 Nghiên

cứu này (10%) (45%) (45%) (32,5%) (67,5%)

Hardy-

Weinberg 10,56% 43,88% 45,56%

p= 0,9677

N: Tổng số mẫu nghiên cứu. n: Tổng số allele của quần thể nghiên cứu.

*Xác định CNV của CYP3A5 bằng MLPA

Phân tích MLPA cho thấy không có CNV nào của CYP3A5 được xác định ở

tất cả 100 mẫu nghiên cứu. Bộ kit MLPA thiết kế 03 đầu dò đặc hiệu cho các exon

của CYP3A5 bao gồm exon 2, 4 và 10. Tất cả các mẫu nghiên cứu đều cho tỉ lệ của

các đầu dò này sau chuẩn hóa nằm trong khoảng 0,8-1,2. Số liệu về tỉ lệ của các đầu

dò sau chuẩn hóa của một số mẫu được thể hiện trong Bảng 3.13.

Bảng 3.13. Dữ liệu MLPA về CNV gen CYP3A5 của một số mẫu nghiên cứu

Tên Vị trí đầu dò của kit MLPA cho CYP3A5 và các tỉ lệ sau chuẩn hóa (Final ratio)

mẫu

Exon 2 Exon 4 Exon 10

FVN 44 0,83 0,84 0,9

FVN 50 1,02 0,96 0,98

FVN 58 0,97 0,93 0,93

FVN 64 0,92 1,17 0,88

FVN 66 1,11 0,91 1

85

3.4. Phân tích liên kết giữa các biến thể trên CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6

Phân tích LD được tiến hành nhằm xác định mối liên hệ giữa các SNP sử dụng

phần mềm Haploview 4.2 và giá trị D’. LD là mối liên kết không ngẫu nhiên giữa các

biến thể nằm ở những locus khác nhau trong một quần thể. Một kiểu gen đơn bội

(haplotype) là một nhóm các allele nằm trên cùng một nhiễm sắc thể có khả năng di

truyền cùng nhau. Các khối LD (LD block) thể hiện mối liên kết giữa các cặp biến thể.

Mức độ liên kết được thể hiện bằng màu sắc của các khối này như sau: màu đỏ thể hiện

khối có liên kết mạnh (giá trị LOD#2 và D’=1), màu đỏ nhạt/hồng đỏ thể hiện khối có

liên kết trung bình (giá trị LOD#2 và D’<1), màu xanh thể hiện khối có liên kết yếu (giá

trị LOD<2 và D’=1), màu trắng thể hiện không có liên kết (giá trị LOD<2 và D’<1).

Đối với các biến thể của CYP2C9, phân tích Haploview cho thấy có 2 block

thể hiện 2 nhóm liên kết. Block thứ nhất kéo dài 5kb từ 3235 (marker 3235G>C) đến

9032 (marker 9032G>C) và có giá trị LD trung bình. Block 2 lớn hơn kéo dài 32kb,

block này bao gồm 8 marker 10311A>G, 10376T>C, 33622T>C, 38658A>G,

42614A>C, 42627C>A, 42801A>G, 42726C>T (Hình 3.18). Những marker trong 2

block này không thể hiện độ liên kết chặt chẽ với giá trị LOD<2 và D’=1 (hiển thị

bằng màu xanh nhạt). Biến thể mới 42614A>C không nằm trong mối liên kết chặt

chẽ với một biến thể nào khác.

Đối với CYP2C19, nghiên cứu này đã xác định được 1 LD block từ những dữ

liệu giải trình tự của gen này. Block này kéo dài 87kb từ vị trí -98 trong vùng promoter

(marker -98T>C) đến 87106 ở intron 7 (marker 87106T>C). Một số marker trong

block này có độ liên kết chặt hoặc trung bình với LOD#2 và D’≤ 1 (hiển thị bằng màu

đỏ hoặc hồng đỏ) (Hình 3.19). Ngoài ra có 2 marker 80161A>G và 87106T>C không

liên kết với nhau (hiển thị màu trắng với LOD <2, D’<1). Biến thể mới 90008C>T

không nằm trong khối liên kết này. Trong khối liên kết duy nhất đã được xác định,

biến thể mới 12637C>G cũng không nằm trong mối liên kết chặt với các biến thể còn

lại.

Đối với CYP2D6, phân tích liên kết biến thể đã xác định được 1 LD block kéo

dài từ vị trí 214 ở intron 1 (marker 214G>C) đến vị trí 245 ở intron 1 (marker

245G>C). Các marker trong block này có mối liên kết chặt với LOD # 2 và D’=1

86

(Hình 3.20). Các biến thể trong block này đều đã được công bố là thuộc một haplotype

của allele kiểu dại CYP2D6*1 (CYP2D6*1.032) trên cơ sở dữ liệu PharmVar.

Phân tích liên kết giữa các biến thể gen CYP2C9 xác định 2 block liên kết không chặt chẽ có kích thước lần lượt là 5kb và 32kb, kéo dài từ vị trí biến thể 3235GC đến 42801A>G. Các giá trị hiển thị trong các ô vuông tương đương với D’x100.

Hình 3.18. Phân tích liên kết giữa các biến thể gen CYP2C9

Phân tích liên kết giữa các biến thể gen CYP2C19 chỉ xác định được 1 block có kích thước 87kb, kéo dài từ vị trí biến thể -98T>C đến 87106T>C. Các giá trị hiển thị trong các ô vuông tương đương với D’x100.

Hình 3.19. Phân tích liên kết giữa các biến thể gen CYP2C19

87

Phân tích liên kết giữa các biến thể gen CYP2D6 chỉ xác định được 1 block kéo dài từ vị trí biến thể 214G>C đến 245A>G. Các giá trị hiển thị trong các ô vuông tương đương với D’x100.

Hình 3.20. Phân tích liên kết giữa các biến thể gen CYP2D6

3.5. Dự đoán chức năng in silico của các biến thể mới tìm thấy trên CYP2C9,

CYP2C19 và CYP2D6

*Dự đoán chức năng của các biến thể mới thuộc CYP2C9

Đối với gen CYP2C9, để dự đoán khả năng ảnh hưởng của biến thể mới

42627C>A được phát hiện trong exon 7 của gen này, chúng tôi tiến hành đánh giá

chức năng của protein mã hóa bởi gen mang đột biến bằng 2 công cụ online Polyphen-

2 và PROVEAN. Kết quả cho thấy cả 2 mô hình HumDiv và HumVar của Polyphen-

2 đều đưa ra kết quả dự đoán chức năng của biến thể 42627C>A (p.Pro363His) có

khả năng gây hại đến protein được mã hóa với Score = 1 (Hình 3.21a). Tương tự, kết

quả dự đoán chức năng sử dụng công cụ PROVEAN cũng cho thấy sự kiện thay thế

proline bằng histidin tại vị trí 363 trên chuỗi polypeptide có khả năng gây hại đến

protein này với Score = -8.373 (Hình 3.21b). Như vậy, ảnh hưởng gây hại của biến

thể này đến chức năng của protein được mã hóa rất có thể sẽ dẫn tới thay đổi hoạt

tính của enzyme. Khi tiến hành so sánh trình tự amino acid trên các loài động vật có

88

xương sống, dữ liệu đưa ra cho thấy hai vị trí amino acid 363-Proline trên CYP2C9

có tính bảo thủ cao giữa các loài (Hình 3.22).

Đối với các biến thể mới nằm trong intron của CYP2C9, công cụ HSF được sử

dụng để đánh giá khả năng ảnh hưởng đến mô hình cắt nối tự nhiên của mRNA. Kết quả

cho thấy cả 5 biến thể mới trong intron của CYP2C9 đều không làm thay đổi mô hình

cắt nối tự nhiên của mRNA của gen này.

Hình 3.21. Dự đoán chức năng của biến thể CYP2C9 42627C>A bằng Polyphen

2 (a) và PROVEAN (b)

Vị trí amino acid Proline 363 trên CYP2C9 được đánh dấu với nét đứt màu đỏ.

Hình 3.22. Tính bảo thủ của vị trí amino acid Proline 363 trên protein CYP2C9

89

*Dự đoán chức năng của các biến thể mới thuộc CYP2C19

Đối với các biến thể mới của CYP2C19, dự đoán bằng HSF cho thấy cả 3 biến

thể mới trong intron của CYP2C19 đều không làm thay đổi mô hình cắt nối tự nhiên

của mRNA của gen này.

*Dự đoán chức năng của các biến thể mới thuộc CYP2D6

Tổng số 3 biến thể mới đã được xác định trong vùng promoter của CYP2D6

trong 136 mẫu nghiên cứu. Để đánh giá ảnh hưởng lên quá trình điều hòa phiên mã

của 3 biến thể mới này, công cụ MATCH được sử dụng để phân tích vùng trình tự

mang các biến thể -498C>A, -184A>T và -175A>T. Tuy nhiên, kết quả phân tích cho

thấy những biến thể này không nằm ở những vị trí kết hợp với các yếu tố phiên mã

trong promoter của CYP2D6.

Trong số 2 biến thể mới thuộc vùng mã hóa của CYP2D6, thay thế nucleotide

3851G>A (exon 8) tạo nên mã kết thúc sớm thay cho amino acid tryptophan ở vị trí

385 (p.Trp358X), sự kiện này tạo nên chuỗi polypeptide ngắn hơn bình thường và

enzyme bị giảm hoặc mất hoạt tính. Biến thể còn lại là 3157G>T (exon 7) làm thay

thế amino acid arginin thành leucine tại vị trí 329 (p.Arg329Leu). Phân tích bằng

Polyphen-2 cho thấy ở cả 2 mô hình HumDiv và HumVar đều dự đoán thay thế này

không gây ảnh hưởng đến chức năng của protein được mã hóa (Hình 3.23a). Ngược

lại, phân tích bằng PROVEAN lại cho thấy biến thể này có gây hại với score = -4.236

(Hình 3.23b). Khi tiến hành kiểm tra tính bảo thủ của amino acid Arginine tại vị trí 329

trên CYP2D6, dữ liệu cho thấy amino acid này có tính bảo thủ cao giữa các loài (Hình

3.24).

Đối với các biến thể mới trong intron 4 và 6 của CYP2D6, ảnh hưởng của chúng

đến mô hình cắt nối mRNA tự nhiên cũng được đánh giá bởi công cụ HSF. Kết quả cho

thấy biến thể 2988G>A (intron 6) có khả năng làm thay đổi mô hình cắt nối tự nhiên của

mRNA CYP2D6 do ảnh hưởng đến trình tự nhánh (branch points) (Hình 3.23c). Trong

khi đó, biến thể 2137G>C (intron 4) được dự đoán là không gây ảnh hưởng đến cắt nối

mRNA.

90

Hình 3.23. Dự đoán chức năng của các biến thể 3157G>T và 2988G>A thuộc

a) Dự đoán chức năng của biến thể 3157G>T bằng Polyphen-2, b) Dự đoán chức năng của biến thể 3157G>T bằng PROVEAN, c) Dự đoán ảnh hưởng tới phân cắt mRNA của biến thể 2988G>A trong intron 6.

CYP2D6

Vị trí Arginine 329 trên CYP2D6 được đánh dấu với nét đứt màu đỏ.

Hình 3.24. Tính bảo thủ của vị trí amino acid Argine 329 trên protein CYP2D6

3.6. So sánh tần số allele của các gen nghiên cứu giữa quần thể người Kinh Việt

Nam với các quần thể người khác trên thế giới

3.6.1. So sánh tần số allele của gen CYP2C9 giữa quần thể người Kinh Việt Nam

với các quần thể người khác trên thế giới

Tần số các allele của CYP2C9 (*2 và *3) trong quần thể người Kinh Việt Nam

được so sánh với các quần thể khác trên thế giới. Như đã trình bày ở phần trên, tần

số allele CYP2C9*2 trong 100 mẫu người Kinh là 0%, tỉ lệ này thấp hơn so với các

91

nghiên cứu trên khu vực châu Á (Ấn Độ, Iran và Thổ Nhĩ Kỳ) cũng như ở khu vực

châu Âu (Ý và Đan Mạch) và sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p<0,001). Ngược

lại, tần số CYP2C9*3 ở quần thể nghiên cứu có sự tương đồng khi so sánh với các

quần thể ở khu vực châu Á và người Mĩ-Phi. Tuy nhiên, tần số allele này ở quần thể

người Kinh Việt Nam có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với khu vực Nam Á

(p<0,05 khi so sánh với nghiên cứu trên người Indonesia) và Tây Á (p<0,001 khi so

sánh với nghiên cứu trên người Ấn Độ và Thổ Nhĩ Kỳ) cũng như khu vực Châu Âu

(p<0,001). Chúng tôi cũng không thấy có sự khác biệt về tần số các allele CYP2C9*2

và *3 trong quần thể nghiên cứu so với công bố năm 2005 trên đối tượng người Kinh

Việt Nam (Bảng 3.14).

Bảng 3.14. So sánh tần số các biến thể CYP2C9 trong nghiên cứu này với các quần

thể khác trên thế giới

Tần số allele CYP2C9 (%) Quần thể N TLTK *2 *3

Việt Nam (Kinh) 0 3,5 100 Nghiên cứu này

Việt Nam (Kinh) 0 2,2 157 [104]

Nhật Bản 0 2,7 1017 [118]

Hàn Quốc 0 4,4 1796 [119]

Trung Quốc (Hán) 0,14 2,94 2127 [14]

Malaysia 1,9 2,4 209 [120]

Indonesia 0 1,9a 206 [121]

Ấn Độ 4a 10c 291 [122]

Iran 12,8b 0c 200 [123]

Thổ Nhĩ Kỳ 10,6b 10c 499 [124]

Đan Mạch 12,1b 5,3a 276 [125]

Ý 12,5b 9,7c 360 [126]

Mỹ-Phi 2,8 2 120 [127]

N: Tổng số mẫu nghiên cứu, a: p<0,05, b: p<0,01, c: p<0,001

92

3.6.2. So sánh tần số allele của gen CYP2C19 giữa quần thể người Kinh Việt Nam

với các quần thể người khác trên thế giới

Tần số các allele CYP2C19 *2, *3 và *17 xác định được trong quần thể nghiên

cứu được so sánh với các quần thể khác trên thế giới. Đối với allele CYP2C19*2, tần

số allele này ở quần thể nghiên cứu cao hơn có ý nghĩa thống kê so với các quần thể

khác ở khu vực Tây Á [Thổ Nhĩ Kỳ (p<0,01), Iran (p<0,05)] và khu vực châu Âu [Hy

Lạp (p<0,01) và Ý (p<0,001)]. Trong khi đó tần số CYP2C19*3 trong quần thể nghiên

cứu thấp hơn Nhật Bản và Hàn Quốc nhưng cao hơn khu vực Nam Á, Tây Á [Ấn Độ

(p<0,001), Iran và Thổ Nhĩ Kỳ (p<0,01)] và Châu Âu [Đan Mạch và Hy Lạp (p<0,01),

Ý (p<0,001)]. Đối với allele CYP2C19*17, tần số allele này trong quần thể nghiên

cứu thấp hơn có ý nghĩa thống kê khi so sánh với khu vực châu Âu (Đức, Đan Mạch

và Hy Lạp) và người Mĩ-Phi (p<0,001). Khi so sánh tần số allele CYP2C19*17 trong

nghiên cứu này với các công bố thuộc các nước khu vực châu Á thì không thấy sự

khác biệt có ý nghĩa thống kê, trừ trường hợp của Iran (p<0,001) (Bảng 3.15).

Bảng 3.15. So sánh tần số các biến thể CYP2C19 trong nghiên cứu này với các quần

thể khác trên thế giới

Tần số allele CYP2C19 (%) Quần thể N TLTK *2 *3 *17

Nghiên cứu Việt Nam (Kinh) 20,5 2,5 1 100 này

Việt Nam (Kinh) 26,4 4,9 NA 165 [105]

Nhật Bản 27,6 11,9c NA 134 [128]

Hàn Quốc 28,4a 10,1c 1,5 271 [129]

Trung Quốc (Hán) 24,9 3,4 1,2 384 [130]

Malaysia 23 5 NA 142 [131]

Thái Lan 29a 3 NA 774 [132]

Ấn Độ 22 NDc NA 308 [133]

93

Thổ Nhĩ Kỳ 0,4b NA 404 [134] 12,1b

Iran NDb 21,6c 180 [135] 13,1a

Đan Mạch NA 20,1c 276 [125] 15

Đức NDb 25,5c 237 [136] 15,2

Hy Lạp NDb 19,61c 283 [137] 13,07b

Ý NDc NA 360 [126] 11,1c

Mỹ-Phi 0,4b 18,2c 500 [138] 19,4

ND: Không phát hiện được, NA: chưa kiểm chứng, N: Tổng số mẫu nghiên cứu, a:

p<0,05, b: p<0,01, c: p<0,001.

3.6.3. So sánh tần số allele của gen CYP2D6 giữa quần thể người Kinh Việt Nam

với các quần thể người khác trên thế giới

Các biến thể có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme CYP2D6 được tìm thấy

trong 136 mẫu người Kinh được tiến hành so sánh tần số với các quần thể thuộc các

khu vực địa lý khác nhau trên thế giới (Bảng 3.16). Trong số những allele không chức

năng thì CYP2D6*4 có tần số thấp hơn các quần thể ở khu vực châu Âu và châu Phi

(p<0,0001). Trong khu vực châu Á, allele CYP2D6*5 có tần số tương đương giữa các

nước trừ Thái Lan (p<0,05). Tần số của các allele khác không có hoạt tính enzyme

(*13, *14 và *15) không thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các quần thể trên thế

giới bao gồm cả quần thể trong nghiên cứu này. Trong số các biến thể gây giảm hoạt

tính enzyme thì CYP2D6*10 trong nghiên cứu này có tần số cao hơn hẳn so với khu

vực châu Âu và châu Phi (p<0,001) cũng như các khu vực khác trên thế giới. Đối với

allele CYP2D6*36, tần số xác định trong nghiên cứu này thấp hơn so với quần thể

người Thái Lan (p<0,0001) nhưng lại tương đương với người Hán ở Trung Quốc,

Nam Phi và Papua Niu-Ghine.

94

Bảng 3.16. So sánh tần số các allele của CYP2D6 có ảnh hưởng đến chức năng protein ở quần thể người Kinh Việt Nam và các quần

thể khác trên thế giới

Tần số allele (%) TLTK

Quần thể N Khu vực *4 *5 *10 *13 *14 *15 *36 *36-*10 *36x2-*10

Việt Nam (Kinh) 136 0,74 8,09 43,75 1,547 0,37 0,37 0,37 12,13 0,37 Nghiên cứu này

Việt Nam 74 1,4 8,0 43,5 - - - - - - [103]

0,4b 6,0 0,9 0,0 0,6 1954 - 42,9 - - [139]

Châu Á Trung Quốc (Hán) Nhật Bản 1017 - - - 42,7 - - - - - [118]

Hàn Quốc 448 0,8b 6,2 - 44,1 0,5 - - - - [140]

Thái Lan 288 0,7 4,3a - 44,6 1,0 - 16,4d - - [141]

Ấn Độ 881 9,3 - - - - - - - - [142]

- Hungary 431 18,1d 2,4c - - - - - - [143]

Ý 218 17,7d 0,0d - - - - - - - [144]

Châu Âu Macedonia 184 18,7d 9,1d 2,7c - - - - - - [145]

Hy Lạp 283 17,8d - - - - - - - - [146]

95

Đan Mạch 244 19,7d 5,3 1,6c 0.0 - - - - - [147]

Séc 223 22,9d 3,1b - - - - - - - [148]

Mĩ 264 10,0d 1,7 - 2,8c 0.0 - - - - [149]

Brazin 1020 9,4d 4,6d - 2,1c - - - - - [150]

Canada 90 8,6d - - 2,3c - - - - - [151] Châu Mĩ

Chile 321 12,0d - - - - - - - - [152]

Mexico 154 10,4d 0,0d 0,6c - - - - - - [153]

39 1,3a 2,6 - 0,0 - - - - - [154]

Châu Đại Dương 88 3,0a 0,0c - 0,0 0,0 0,0 0,0 - - [155] Châu Đại Dương Papua Niu Ghine

Mĩ Phi 251 6,6b 3,6c - 5,4 0,0 0,0 - - - [156]

Nam Phi 100 5,1c 0,0 8,7 3,1c 0,0 0,0 0,0 - - [157] Châu Phi

Zimbabue 114 4,0a - - 2,0b - - - - - [158]

Iran 100 12,5d 3,0a 9,0c - - - - - - [159]

Trung Đông A rập Xê út 192 - - - - 0,3 - - - - [160]

N: Tổng số mẫu nghiên cứu, a: p<0,05, b: p<0,01, c: p<0,001, d: p<0,0001

96

3.6.4. So sánh tần số allele của gen CYP3A5 giữa quần thể người Kinh Việt Nam

với các quần thể người khác trên thế giới

Khi so sánh với các quần thể khác trên thế giới, tần số biến thể CYP3A5*3 ở

quần thể người Kinh Việt Nam trong nghiên cứu của chúng tôi (67,5%) thấp hơn so

với các quần thể người da trắng (92%, p<0,0001) và cao hơn so với các quần thể

người da đen (19%, p<0,0001). Trong khu vực châu Á, tỷ lệ này không khác biệt

nhiều với tần số allele CYP3A5*3 trung bình của người Nam Á (65%, p>0,05) và

Đông Á (72%, p>0,05) nhưng lại thấp hơn rõ rệt so với khu vực Tây Á (90,5%,

p<0,0001) và người da trắng (92%, p< 0,0001) (Bảng 3.17). Tỉ lệ CYP3A5*3 trong

nghiên cứu này cũng không khác biệt nhiều so với trung bình của các quốc gia Đông

Nam Á (64%, p>0,05). Kết quả trên hoàn toàn phù hợp với một nghiên cứu trước đó

công bố về tần số CYP3A5*3 trên người Việt Nam của Veiga và cộng sự [103]

(66,67%, p>0,05).

Bảng 3.17. So sánh tần số allele CYP3A5*3 trong nghiên cứu này với các quần thể

khác trên thế giới

TLTK Khu vực N Tần số CYP3A5 *3 (%)

67,5 100 Việt Nam Nghiên cứu này

Trung Quốc 451 70 [161]

Nhật Bản 265 74 [162] Đông Á

Hàn Quốc 104 74 [163]

Tổng 820 72

p> 0,05

Ấn Độ 544 64 [164]

Nepan Nam Á 200 70 [165]

Tổng 65 744

p > 0,05

97

150 65 Thái Lan [166]

101 61 Malaysia [167]

Campuchia 124 64,5 [168] Đông Nam Á

72 67 Việt Nam [103]

64 Tổng 447

p> 0,05

92 Thổ Nhĩ Kỳ 115 [169]

83 Tây Á 112 Iran [170]

327 Tổng 90,5

p< 0,0001

27 146 Mỹ-Phi [171]

16 179 Nigeria [172]

21 Da đen 288 Gambian [173]

14,5 320 Nam Phi [174]

19 Tổng 933

p< 0,0001

91 834 Mỹ [175]

93 Da trắng 1210 Âu [176]

92 Tổng 2044

p< 0,0001

N: Tổng số mẫu nghiên cứu

98

3.7. Thảo luận

3.7.1. Sự phân bố của các SNP gây ảnh hưởng chức năng protein CYP2C9,

CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 ở các quần thể người trên thế giới

Như đã đề cập ở phần tổng quan, CYP2C9 và CYP2C19 là các gen thuộc phân

họ CYP2C có tính đa hình cao. Nghiên cứu về đa dạng di truyền của 2 gen nói trên

đã được tiến hành ở nhiều quần thể trên thế giới bao gồm các quần thể ở khu vực

châu Á và người da trắng [14, 109, 118, 125, 177, 178]. Năm 2005, Lee và cộng sự

đã khảo sát tần số của các allele CYP2C9*2 và *3 ở 157 người Kinh Việt Nam [104].

Bên cạnh đó, vào năm 2007, nhóm nghiên cứu của Lee và cộng sự cũng đã tiến hành

khảo sát đa hình CYP2C19 trên người Hàn Quốc và người Kinh Việt Nam. Tuy nhiên

các tác giả mới chỉ tập trung vào các allele đã được nghiên cứu phổ biến là

CYP2C19*2 và *3 [105]. Bên cạnh đó, một số nhóm nghiên cứu trên thế giới cũng

đã khảo sát đa hình của một số các allele đã biết của CYP2D6 và CYP3A5 trên đối

tượng người Việt Nam, sử dụng các phương pháp như pyrosequencing, multiplex

single base extension Taqman genotyping [103, 106, 107]. Nghiên cứu này lần đầu

tiên khảo sát tất cả các biến thể thuộc vùng promoter và 9 exon của các gen CYP2C9,

CYP2C19 (100 mẫu người Kinh Việt Nam) và CYP2D6 (136 mẫu người Kinh Việt

Nam). Phương pháp giải trình tự trực tiếp tất cả các vùng gen quan tâm được sử dụng

để thu được cơ sở dữ liệu các biến thể của 3 gen nói trên. Đối với gen CYP3A5, các

allele *3, *6, *8 và *9 cũng được xác định ở 100 mẫu người Kinh bằng phương pháp

giải trình tự Sanger.

*Gen CYP2C9

Đối với CYP2C9, trong số 100 mẫu người Kinh thì allele kiểu dại CYP2C9*1

chiếm tỉ lệ 95%, CYP2C9*3 chiếm 3.5% và CYP2C9Del chỉ chiếm 1,5%. Trong khi

đó, allele CYP2C9*2 không được tìm thấy trong các mẫu nghiên cứu. Kết quả thu

được của đề tài là tương đồng với những nghiên cứu trước đây trên các quần thể người

châu Á, trong đó CYP2C9*3 là được công bố là allele phổ biến nhất ở các quần thể

khu vực này [104]. Bên cạnh đó, chúng tôi cũng tiến hành so sánh tần số các allele

CYP2C9*1, *2 và *3 trên quần thể nghiên cứu với các quần thể khác trên thế giới.

Tần số của CYP2C9*3 trong 100 mẫu nghiên cứu thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê so với các nghiên cứu trên các quần thể thuộc khu vực Nam Á, Tây Á và

99

Châu Âu. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu về allele này cho thấy sự tương đồng với

các công bố ở những quần thể thuộc các khu vực còn lại của châu Á. Trong 100 mẫu

nghiên cứu, không có mẫu nào mang allele CYP2C9*2 và tần số của allele này thấp

hơn so với khu vực Nam Á, Tây Á [122, 123] và châu Âu [125, 126], kết quả này có

ý nghĩa thống kê. Tuy nhiên, sự vắng mặt của CYP2C9*2 trong các mẫu nghiên cứu

cũng tương đồng với các báo cáo trước đây ở Đông và Đông Nam Á, trừ nghiên cứu

trên người Trung Quốc [119, 121, 125]. Về mặt địa lý, Việt Nam có đường biên giới

với Trung Quốc, nhưng nghiên cứu trên người Trung Quốc đã báo cáo CYP2C9*2

với tần số xuất hiện là 0,14% trong khi nghiên cứu của chúng tôi lại không tìm thấy

allele này [14]. Sự khác biệt này có thể là do Dai và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu

trên cỡ mẫu lớn hơn. Bên cạnh đó, sự khác biệt trong phân bố của các allele

CYP2C9*2 và *3 ở khu vực châu Á có thể được giải thích bởi sự phân bố về vi ̣ trí đi ̣a lý củ a các quần thể ngườ i Châu Á . Ví dụ Thổ Nhĩ Kỳ là quốc gia trải dài từ Đông Âu sang Tây Á, có đường biên giới với Hy Lạp và Bungari. Bên cạnh đó, quần thể người

Iran cũng có khả năng bị pha trộn về mặt di truyền do dân tộc này đã trải qua lịch sử

bị xâm chiếm cũng như các cuộc di cư trong quá khứ. Ngoài ra, Ấn Độ cũng là đất

nước đa văn hóa và có nguồn gốc chủng tộc đa dạng. Mô ̣t giả thuyết đươ ̣c đưa ra và o năm 2001 cho rằ ng CYP2C9*2 là biến thể xuất hiê ̣n sau khi có sự phân cắ t củ a các chủ ng tô ̣c ngườ i da trắ ng và ngườ i phương đông [179]. Nghiên cứu này cho thấy sự

vắng mặt của CYP2C9*2 trên người Kinh Việt Nam, kết quả này tương tự với báo

cáo trên 157 người Kinh vào năm 2005 [104].

*Gen CYP2C19

Đối với CYP2C19, nghiên cứu này đã xác định được tần số của các allele

CYP2C19*1, *2, *3 và *17 lần lượt là 76%, 20,5%, 2,5% và 1%. Các allele hiếm

khác của CYP2C19 không được tìm thấy trong 100 mẫu nghiên cứu. Như kết quả

nghiên cứu đã chỉ ra, sau allele kiểu dại thì allele CYP2C19*2 là allele phổ biến nhất

với tần số xuất hiện cao nhất trong quần thể nghiên cứu, điều này cũng tương tự như

những báo cáo trước đây về đa hình CYP2C19 ở người Kinh Việt Nam và các quần

thể khác thuộc châu Á [105, 177]. Khi so sánh với các quần thể khác trên thế giới,

không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa tần số CYP2C19*2 của người Kinh Việt Nam

trong nghiên cứu này với các quần thể khác trừ khu vực Tây Á và châu Âu (Hy Lạp

100

và Ý). Kết quả như vậy là phù hợp với những nghiên cứu trước đây đã báo cáo

CYP2C19*2 là allele phổ biến ở tất cả các khu vực địa lý trên thế giới. Tuy nhiên các

báo cáo đều cho thấy allele này xuất hiện với tần số cao hơn ở các quần thể khu vực

châu Á [154]. Đối với CYP2C19*3, tần số của allele này trong quần thể nghiên cứu

cao hơn có ý nghĩa thống kê so với số liệu công bố ở khu vực Nam Á, Đông Á và

châu Âu. Kết quả này một lần nữa khẳng định tính tính đặc trưng về sự phổ biến allele

CYP2C19*3 ở khu vực châu Á, trong khi đó allele này rất hiếm thấy ở các quần thể

khu vực châu Âu. Kết quả so sánh cũng cho thấy giữa khu vực Đông Á (Nhật Bản,

Hàn Quốc) và Đông Nam Á (Việt Nam, Malysia và Thái Lan) cũng có sự đa dạng về

tần số allele CYP2C19*3. Tài liệu năm 2009 công bố bởi Sistonen và cộng sự đã báo

cáo rằng tần số của CYP2C19*3 tăng dần từ Tây Á đến Đông Nam Á và đạt mức cao

nhất tại khu vực Đông Á [154]. Có thể thấy allele CYP2C19*3 là allele quan trọng

cần lưu ý khi sử dụng các thuốc chuyển hóa bởi CYP2C19 ở khu vực Đông và Đông

Nam Á [177]. Số liệu thu được trong nghiên cứu này cũng một lần nữa cho thấy

CYP2C19*2 là allele phổ biến ở khắp các quần thể trên thế giới trong khi CYP2C19*3

lại phân bố chủ yếu ở châu Á. Điều này hoàn toàn phù hợp với giải thiết của Scordo

và cộng sự vào năm 2004 cho rằng CYP2C19*2 là biến thể xuất hiện trước,

CYP2C19*3 là biến thể phát sinh sau khi đã có sự phân cắt của các chủng tộc người

da đen, người phương đông và người da trắng [126]. Đối với allele CYP2C19*17, tần

số xuất hiện ở 100 mẫu nghiên cứu là 1%, tỉ lệ này thấp hơn có ý nghĩa thống kê so

với số liệu nghiên cứu trên các quần thể ở châu Âu và Mĩ-Phi nhưng tương tự với khu

vực châu Á [129, 180]. Tổng hợp các số liệu nghiên cứu trên thế giới cho thấy tần số

của CYP2C19*17 giảm dần từ các quần thể khu vực châu Âu đến châu Á, chứng tỏ

đây là allele rất hiếm ở các quần thể châu Á. Với tần số thấp như vậy, CYP2C19*17

có mức độ ảnh hưởng đến chuyển hóa các loại thuốc không nhiều trong những quần

thể người ở khu vực châu Á.

*Gen CYP2D6

Tần số allele CYP2D6*10 trong quần thể người Kinh ở nghiên cứu này không

có sự khác biệt với công bố trước đây trên người Kinh [103] cũng như các quần thể

khác trong khu vực châu Á [118, 139, 153]. Phân tích thống kê cho thấy tần số

CYP2D6*10 ở quần thể người Kinh trong nghiên cứu này cao hơn có ý nghĩa thống

101

kê so với các khu vực khác trên thế giới trừ các nước châu Á [143, 150, 156, 159,

181]. Như vậy nghiên cứu này một lần nữa khẳng định các quần thể khu vực châu Á

có đặc trưng bởi tần số cao của allele CYP2D6*10 so với các khu vực khác trên thế

giới. Ngược lại, các quần thể khu vực châu Âu, châu Phi và Trung Đông lại có tần số

allele CYP2D6*4 cao hơn có ý nghĩa thống kê so với tần số của allele này trong quần

thể nghiên cứu [143, 145, 152, 159]. Những báo cáo trước đây cũng cho thấy xu thế

giảm dần tần số của allele CYP2D6*4 từ khu vực châu Âu sang châu Á [154]. Trên

thực tế, allele CYP2D6*4 là biến thể đặc trưng của gen này ở các quần thể khu vực

châu Âu. Những số liệu thu được về tần số các allele CYP2D6 cũng giải thích phần

nào sự xuất hiện phổ biến của kiểu hình chuyển hóa thuốc IM ở người châu Á nói

chung và người Kinh Việt Nam nói riêng. Ngược lại, tần số rất thấp của CYP2D6*4

cũng đã lí giải cho kiểu hình chuyển hóa thuốc PM hiếm khi xuất hiện ở người châu

Á so với các quần thể người châu Âu. CYP2D6*14 được xác định với tần số rất thấp

là 0,37% ở 136 mẫu nghiên cứu, đồng thời kết quả này cũng tương đồng với các công

bố trên người Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan. Đây là biến thể được phát hiện lần

đầu tiên trên người Trung Quốc, và cho đến nay thì ngoài khu vực châu Á, allele này

cũng chưa được xác định ở quần thể người khác.

*Gen CYP3A5

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung xác định tần số của các biến thể gây

ảnh hưởng đến chức năng của enzyme CYP3A5 đã được công bố trước đó là *3, *6,

*8 và *9. Kết quả cho thấy trong 100 mẫu nghiên cứu chỉ tồn tại 2 allele CYP3A5*1

(32,5%) và CYP3A5*3 (67,5%). Có thể thấy sự khác biệt trong phân bố của biến thể

CYP3A5*3 giữa các vùng khác nhau ở Châu Á và trên thế giới có thể được giải thích

bằng nguyên nhân lịch sử. Ví dụ như Thổ Nhĩ Kỳ là quốc gia có lãnh thổ nằm cả ở

Châu Âu và Tây Á, có đường biên với Hy Lạp và Bungari. Iran cũng là một đất nước

đa sắc tộc trải qua các cuộc tấn công và xâm chiếm của Nga và Anh trong lịch sử, do

đó dân số của họ có thể mang bộ gen với nhiều nguồn gốc chủng tốc khác nhau. Bên

cạnh đó, áp lực chọn lọc khác nhau ở mỗi khu vực địa lý lên mỗi biến thể di truyền

cũng có thể là nguyên nhân dẫn tới sự đa dạng trong phân bố của các biến thể này.

Cụ thể, allele CYP3A5*3 là allele xuất hiện với tần số rất cao ở các quần thể người

da trắng và khu vực Tây Á (80-98%), giảm dần ở khu vực Châu Á (61-74%) và thấp

102

nhất ở người da đen như Mỹ-Phi, Nam Phi, Nigeria (14,5-27%) (số liệu từ các công

bố đã được tổng hợp tại Bảng 3.17). Các enzyme CYP3A tham gia chuyển hóa

cortisol thành 6-β-hydroxycortisol và có liên quan đến quá trình đào thải Natri ở thận.

Hơn nữa, sự chuyển hóa cortisol thành 6-β-hydroxycortisol bởi CYP3A5 ở thận đã

được giả thiết rằng có thể đóng vai trò trong tình trạng cao huyết áp liên quan đến

nồng độ muối trong máu ở người. Trong đó, tình trạng cao huyết áp ở những người

có kiểu gen CYP3A5*1/*1 được xác định là cao hơn so với những người có kiểu gen

CYP3A5*3/*3 [182]. Thompson và cộng sự vào năm 2004 đã đưa ra giả thuyết rằng:

môi trường sống ở vùng xích đạo nóng ẩm với lượng muối không dồi dào là yếu tố

chọn lọc tự nhiên khiến cho allele CYP3A5*1 trở nên ưu thế hơn ở những quần thể

người khu vực này nhằm giữ lại lượng muối cho cơ thể. Ngược lại những quần thể

người ở khu vực xa xích đạo với nhiệt độ thấp hơn và nguồn cung cấp muối dồi dào

hơn thì allele CYP3A5*3 lại chiếm ưu thế hơn [183].

3.7.2. Phân tích liên kết giữa cá c biến thể và ý nghĩa trong nghiên cứ u đa da ̣ng di truyền cá c gen CYP450

Đánh giá tra ̣ng cân bằ ng di truyền ở 100 mẫu nghiên cứ u đố i vớ i gen CYP2C19 cho thấy tất cả 14 biến thể củ a gen này đều ở tra ̣ng thái cân bằ ng di truyền, bao gồ m cả 3 biến thể mớ i trong intron. Gen CYP3A5 xác đi ̣nh đươ ̣c biến thể duy nhất là *3 trong 100 mẫu và cũng có cấu trú c di truyền cân bằ ng. Đố i vớ i 2 gen cò n la ̣i có 1/14 biến thể củ a CYP2C9 và 11/30 biến thể củ a CYP2D6 không đa ̣t tra ̣ng thái cân bằ ng di truyền trong quần thể nghiên cứ u. Đồ ng thờ i, những biến thể không đa ̣t tra ̣ng thái cân bằ ng di truyền cũng bi ̣ loa ̣i bỏ khỏ i phân tích liên kết các biến thể. Căn cứ vào lí thuyết củ a đi ̣nh luâ ̣t cân bằ ng Hardy-Weinberg, có thể kể đến mô ̣t số yếu tố gây mấ t cân bằ ng di truyền như: kích thướ c quần thể chưa đủ lớ n để khảo sát đố i vớ i các biến thể này, có áp lực nhất đi ̣nh củ a cho ̣n lo ̣c tự nhiên tác đô ̣ng lên các biến thể này khác so vớ i các biến thể cò n la ̣i trong quần thể.

Xuất phát từ ý nghĩa củ a phân tích liên kết biến thể đó là xác đi ̣nh mố i liên kết không ngẫu nhiên (mất cân bằ ng liên kết) củ a các biến thể thuô ̣c các locus khác nhau củ a mô ̣t gen. Như vâ ̣y nếu xác đi ̣nh đươ ̣c mố i liên kết giữa mô ̣t số biến thể thì có thể suy ra đươ ̣c các biến thể nằ m trong khố i liên kết chă ̣t đó sẽ có xu hướ ng di truyền cù ng nhau qua nhiều thế hê ̣. Trong pha ̣m vi nghiên cứ u đa hình di truyền củ a các gen

103

CYP450, sự xuất hiê ̣n biến thể mớ i mà đươ ̣c dự đoán gây ảnh hưở ng tiêu cực đến chứ c năng củ a protein sẽ có nhiều ý nghĩa nếu phát hiê ̣n đươ ̣c biến thể đó nằ m trong mố i liên kết chă ̣t vớ i mô ̣t biến thể khác-không gây ha ̣i đã biết. Điều này có ý nghĩa trong viê ̣c phát hiê ̣n allele thực sự là nguyên nhân gây nên thay đổ i hoa ̣t tính củ a enzyme đươ ̣c mã hó a. Phân tích liên kết 14 biến thể củ a CYP2C9 có 2 block đươ ̣c xác đi ̣nh lần lươ ̣t có kích thướ c là 5 kb và 32 kb bao gồ m cả 14 biến thể nó i trên. Tuy nhiên các SNP trong cả 2 block này đều liên kết vớ i nhau không chă ̣t chẽ. Đố i vớ i

gen CYP2C19 và CYP2D6 thì chỉ xác đi ̣nh đươ ̣c 1 khố i liên kết duy nhất lần lươ ̣t có kích thướ c là 87 kb và khoảng 31 bp. Các biến thể mớ i củ a hai gen này đều không nằ m trong mố i liên kết chă ̣t vớ i mô ̣t SNP nào khác. Đồ ng thờ i khố i liên kết chă ̣t duy

nhất củ a CYP2D6 cũng bao gồ m các SNP đã đươ ̣c báo cáo là thuô ̣c cù ng 1 haplotype

allele kiểu dại CYP2D6*1 (CYP2D6*1.032) trên cơ sở dữ liệu PharmVar.

3.7.3. Vai trò của các CNV và SV của các gen nghiên cứu trong đa dạng đáp ứng

thuốc cá nhân.

Trong số 4 gen nghiên cứu, các SNP là những biến thể di truyền được nghiên

cứu sâu rộng nhất của những gen này, tuy nhiên gần đây các nhà khoa học cũng đã

tập trung vào sự ảnh hưởng của các CNV đến khác biệt trong đáp ứng thuốc cá nhân.

Các nghiên cứu trên một số quần thể người khác nhau đã cho thấy một số gen CYP450

tham gia chuyển hóa thuốc có xuất hiện các CNV như CYP2A6, và CYP2D6 và các

CNV này có liên quan đến sự biến động trong hoạt tính của các enzyme tương ứng

[184]. Trong nghiên cứu này, phương pháp MLPA được sử dụng để phân tích CNV

của các gen CYP2C9 (100 mẫu), CYP2C19 (100 mẫu), CYP2D6 (136 mẫu) và

CYP3A5 (100 mẫu). Trong số các gen này, chỉ có 2 gen CYP2C9 và CYP2D6 xuất

hiện các CNV. Đặc biệt khi kết hợp với dữ liệu giải trình tự, nghiên cứu này đã xác

định được một số SV của CYP2D6.

Đối với gen CYP2C9, nghiên cứu này lần đầu tiên xác định được sự có mặt

của biến thể mang 1 bản sao gen này trên người Kinh Việt Nam (3/100 mẫu). Nghiên

cứu mới đây nhất vào năm 2019 về SV của cụm gen CYP2C đã công bố tần số của

biến thể mang 1 bản sao của CYP2C9 là 0,003% và biến thể có 3 bản sao CYP2C9 là

0,012% trên tổng số 99.695 mẫu nghiên cứu [27]. Cũng trong năm này, một nghiên

cứu khác trên quần thể người Columbia cũng đã báo cáo tần số xuất hiện của biến thể

104

mang 1 bản sao CYP2C9 là 0,4% và biến thể mang 3 bản sao của gen này là 0,4%

[89]. Như vậy có thể thấy các CNV của CYP2C9 là rất hiếm ở các quần thể người

trên thế giới.

Đối với gen CYP2D6, đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam và trên thế giới

kết hợp phương pháp giải trình tự và MLPA để xác định tất cả các biến thể của gen

này ở quần thể người Kinh Việt Nam. Với phương pháp này, chúng tôi không những

có thể phát hiện được những biến thể (đã công bố và chưa công bố) nằm trong vùng

promoter, 9 exon và vùng lân cận mà còn có thể xác định được những đa hình về mặt

cấu trúc của CYP2D6. Trong nghiên cứu này, kết quả giải trình tự cho thấy hơn 50%

(40/76) kiểu gen CYP2D6 có mang allele *10 đã được xác định lại là kiểu gen có

chứa cấu trúc lai (*13, *36 và *67) và tandem arragements (*36-*10, *36-*36-*10

và *68-*4) sau khi tiếp tục phân tích số bản sao bằng phương pháp MLPA. Hơn nữa,

có 22/136 cá thể mang các allele *5, *13-*1 và *13-*2, đây là những allele chỉ có thể

xác định được sau khi phân tích kết quả MLPA kết hợp với giải trình tự. Như vậy,

phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu này nhằm phân tích đa dạng di truyền

gen CYP2D6 đã góp phần làm rõ hơn sự tồn tại của các biến thể di truyền của gen

này trong người Kinh Việt Nam. Đặc biệt, CYP2D6*5 là biến thể dẫn đến mất hoạt

tính enzyme này, việc xác định biến thể này trong quần thể bằng phương pháp xác

định số bản sao của gen là rất quan trọng nhằm đưa ra kết luận về kiểu gen và kiểu

hình chuyển hóa thuốc của mỗi cá nhân. Mặc dù tần số allele CYP2D6*36 trong

nghiên cứu này thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với báo cáo trước đây ở người Thái

Lan [141], không có sự khác biệt thực sự về tần số allele CYP2D6*36 ở nghiên cứu

này với các báo cáo trên người Hán Trung Quốc, người Papua Niu Ghine và Nam Phi

[139, 155, 157]. Với tần số xuất hiện là 0,37%, nghiên cứu của chúng tôi cũng tương

đồng với các báo cáo trước đây cho thấy CYP2D6*36 là allele không phổ biến ở các

quần thể khu vực châu Á cũng như nhiều khu vực khác trên thế giới [139, 147, 155-

157].

Theo kết quả phân tích của nghiên cứu này, số lượng của allele CYP2D6*10

đã được báo cáo trong các nghiên cứu trước đây trên thực tế cũng có thể bao gồm các

biến thể dạng cấu trúc của gen này. Hiện nay, những phương pháp được sử dụng để

xác định số bản sao của gen bao gồm các phương pháp truyền thống (Longdistance

105

và Multiplex PCR, Real-time PCR), các phương pháp lai microarray (array

comperative genomic hybridization, Roche Amplichip CYP450 System, Affymetrix

DMET plus microarray). Tuy nhiên những phương pháp nói trên có đặc điểm hạn chế

chung là khó có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn, khả năng lặp lại không cao và

cũng rất tốn kém. Phương pháp MLPA đã được sử dụng phổ biến và có ưu điểm là

cùng lúc phân tích được lượng mẫu lớn, giá thành giảm so với các phương pháp nói

trên đồng thời có độ chính xác cao. MLPA hiện là phương pháp được sử dụng rộng

rãi trong xét nghiệm di truyền của nhiều loại bệnh di truyền ở người [185].

Trong số 4 gen nghiên cứu, bên cạnh CYP2D6 thì cơ sở dữ liệu PharmVar đã

cập nhật thêm biến thể CNV dạng mất toàn bộ (*36) và một phần (*37) gen CYP2C19

vào năm 2019 [27] . Mặc dù vậy, nghiên cứu này không xác định được sự tồn tại của

2 allele nói trên cũng như biến thể tăng số bản sao của gen này trong 100 mẫu người

Kinh. Tương tự, không có CNV nào của CYP3A5 được xác định trong 100 mẫu người

Kinh. Cho tới nay, mới chỉ có một nghiên cứu trên 123 người Columbia khỏe mạnh

đã báo cáo có 0,4% mẫu nghiên cứu mang 3 bản sao của CYP3A5 và không có mẫu

nào xuất hiện biến thể mất số bản sao của gen này [89]. Như vậy, tổng hợp kết quả

phân tích CNV của 4 gen CYP450 trong nghiên cứu này cho thấy CYP2D6 là gen có

số lượng CNV xuất hiện nhiều nhất trong quần thể người Kinh Việt Nam. Bởi vậy,

khi tiến hành nghiên cứu về đa dạng di truyền của CYP2D6, bên cạnh các biến thể

dạng SNP hay indel thì nên cân nhắc sử dụng các phương pháp phù hợp để không bỏ

sót các CNV của gen này. Từ các kết quả nghiên cứu thì có thể thấy, các CNV của

các gen dược học mã hóa cho 3 enzyme CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 đóng vai trò

không đáng kể trong những khác biệt đáp ứng thuốc được chuyển hóa bởi các enzyme

này.

3.7.4. Vai trò của các biến thể mới của CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6 đối với

chức năng của các protein tương ứng

Biến thể mới phát hiện trong exon 7 (42627C>A) của CYP2C9 là đột biến sai

nghĩa làm thay đổi amino acid tại vị trí 363 (p.Pro363His). Kết quả dự đoán chức

năng bằng các phần mềm chuyên dụng như Polyphen-2 và PROVEAN đều cho thấy

sự thay đổi amino acid này gây hại đến protein tương ứng. Bởi vậy, chức năng của

biến thể 42627C>A trên CYP2C9 cần được phân tích trong các nghiên cứu sâu hơn

106

có sử dụng các mô hình biểu hiện phù hợp. Ngoài ra, khi tiến hành so sánh trình tự

amino acid ở các loài động vật có xương sống (Genome.ucsc.edu) cho thấy amino

acid proline tại vị trí 363 là một trình tự bảo thủ giữa các loài nói trên. Điều này chứng

tỏ proline 363 có thể đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc của protein CYP2C9.

Ngoài biến thể mới nói trên, nghiên cứu này xác định được 5 biến thể mới khác trong

intron bao gồm: intron 2 (3145C>T), intron 6 (33622T>C, 38658A>G), intron 7

(42801A>G) và intron 8 (47543delT). Tuy nhiên phân tích bằng HSF cho thấy chúng

không có ảnh hưởng đến quá trình cắt nối tự nhiên của mRNA CYP2C9. Như vậy,

chức năng của các biến thể mới trong intron đối với protein CYP2C9 hiện chưa được

làm rõ.

Ba biến thể mới được xác định trong intron của CYP2C19 là 12637C>G,

57637delG và 90008C>T. Các biến thể này lần lượt nằm ở các vùng: 48bp ngược

dòng với exon 3, 154bp ngược dòng với exon 6 và 20bp ngược dòng với exon 9. Do

các biến thể nằm trong intron sẽ không có ảnh hưởng đến protein được mã hóa nên

khả năng ảnh hưởng đến mô hình cắt nối mRNA tự nhiên của các biến thể này được

đánh giá bằng công cụ HSF. Tuy nhiên, các kết quả cho thấy cả 3 biến thể mới nói

trên đều không gây ảnh hưởng tiêu cực đến quá trình cắt nối mRNA. Có thể thấy

những biến thể này không nằm trong các vùng trình tự đóng vai trò như acceptor site,

donor site hoặc trình tự nhánh của mRNA, do vậy mà những biến thể này không tham

gia vào quá trình cắt nối mRNA của CYP2C19.

Sử dụng phương pháp giải trình tự trực tiếp, nghiên cứu này đã phát hiện được

7 biến thể mới dạng đơn nucleotide của CYP2D6. Trong số 5 biến thể nằm trong vùng

không mã hóa, phân tích chức năng in silico cho thấy chỉ có biến thể 2988G>A (intron

6) có khả năng ảnh hưởng đến khả năng cắt nối tự nhiên của mRNA do biến đổi này

có ảnh hưởng không tốt đến trình tự nhánh trên DNA. Cả 2 biến thể mới nằm trong

vùng mã hóa đều có thể ảnh hưởng đến chức năng của protein tương ứng. Cụ thể là

biến thể 3851G>A (p.Trp358X) trong exon 8 sẽ tạo mã kết thúc sớm và sản phẩm

protein được tạo ra ngắn hơn bình thường, biến thể 3157G>T (p.Arg329Leu) trong

exon 7 qua phân tích bằng PROVEAN cho thấy có khả năng gây hại cho protein

tương ứng. Thực tế, sản phẩm protein ngắn được mã hóa bởi allele mang biến thể

3851G>A sẽ không có hoạt tính enzyme. Đồng thời, ảnh hưởng của biến đổi

107

3157G>T cần phải được đánh giá sâu hơn bằng các phân tích chức năng của protein

đột biến, qua đó mà kiểu hình chuyển hóa thuốc của protein đột biến sẽ được xác định

trên mô hình in vitro hoặc in vivo. Dựa trên hoạt tính của protein đột biến, chúng ta

có thể xác định được chức năng của enzyme bị tăng/giảm hay không bị ảnh hưởng.

Cho tới thời điểm hiện tại, theo thông tin thu được từ cá thể mang biến đổi 3157G>T

và 2 cá thể khác mang biến đổi 3851G>A thì họ không có vấn đề gì về sức khỏe.

3.7.5. Ý nghĩa của việc sử dụng thông tin di truyền các gen CYP450 tham gia

chuyển hóa thuốc trong tối ưu hiệu quả dùng thuốc trên người Kinh Việt Nam

Sự đa dạng trong phân bố các allele của các gen CYP450 ở các quần thể thuộc

các khu vực địa lý khác nhau trên thế giới có thể đóng góp vào quá trình tối ưu hiệu

quả sử dụng thuốc trong lâm sàng. Tại Việt Nam, Trung tâm DI & ADR quốc gia là

đơn vị đầu ngành về thông tin thuốc và theo dõi phản ứng có hại của thuốc ở tuyến

Trung ương. Nhiệm vụ của đơn vị này là cung cấp các thông tin trong lĩnh vực thông

tin thuốc cũng như cảnh giác dược tới các cấp quản lý, các cán bộ y tế và cộng đồng.

Trong thời gian từ tháng 11/2019 đến hết tháng 01/2020, Trung tâm DI & ADR Quốc

gia và Trung tâm DI & ADR khu vực TP. Hồ Chí Minh đã tiếp nhận tổng số 3989

báo cáo ADR (tăng 25,5% so với cùng thời điểm năm 2019). Trong số đó có hơn

3000 báo cáo đến từ các cơ sở khám chữa bệnh và 403 báo cáo ADR xảy ra trên lãnh

thổ Việt Nam từ các đơn vị sản xuất và kinh doanh dược phẩm. Trong đó TP. Hồ Chí

Minh và Hà Nội là 2 tỉnh thành có số lượng báo cáo ADR cao nhất cả nước. Trong

các điểm tin về cảnh giác dược hàng năm của trung tâm (được cập nhật 4 lần mỗi

năm) có những cảnh giác về liều dùng cũng như các phản ứng ADR có thể gặp phải

đối với một số loại thuốc. Mặc dù vậy, những cảnh giác này chủ yếu đưa ra những

khuyến cáo đối với cán bộ y tế về các phản ứng không mong muốn và một số trường

hợp chống chỉ định trong khi vai trò của thông tin về đa hình các gen chuyển hóa

thuốc có thể gây ảnh hưởng đến đáp ứng thuốc cá nhân vẫn còn bỏ ngỏ. Trong các

dữ liệu của CPIC cũng đã đưa ra 23 hướng dẫn sử dụng thuốc có liên quan đến một

số gen dược học, trong đó bao gồm các gen CYP450 (https://cpicpgx.org/guidelines/).

Cụ thể, số lượng chỉ dẫn sử dụng thuốc nhiều nhất liên quan đến CYP2D6 (6 chỉ dẫn),

kế tiếp là CYP2C19 (4 chỉ dẫn), CYP2C9 (2 chỉ dẫn) và CYP3A5 (1 chỉ dẫn). Ngoài

ra, các nghiên cứu về các cặp gen-thuốc vẫn tiếp tục được tiến hành đối với CYP2C19

108

trong sử dụng các loại thuốc ức chế bơm proton (PPIs: bao gồm esomeprazole,

omeprazole), CYP2C9 đối với các thuốc kháng viêm-giảm đau không phải steroid

(celecoxib, flurbiprofen, diclofenac). Một số loại thuốc được đề cập đến trong phần

thảo luận này đều nằm trong cấp độ A của CPIC, là cấp độ cao nhất thể hiện tầm quan

trọng của thông tin di truyền khi áp dụng phác đồ sử dụng thuốc (liên quan đến liều

lượng sử dụng, đổi loại thuốc) cho người bệnh.

Đối với gen CYP2C9, nghiên cứu này không phát hiện biến thể CYP2C9*2

trong 100 mẫu nghiên cứu, tuy nhiên cần làm rõ sự tồn tại của allele nói trên trong

các nghiên cứu sau này với quy mô mẫu lớn hơn. Ngoài ra, allele CYP2C9*3 là biến

thể duy nhất được tìm thấy trong các mẫu nghiên cứu, như vậy allele này là yếu tố

chính gây nên giảm hoạt tính enzyme ở người Kinh Việt Nam. Cụ thể, kiểu gen dị

hợp tử CYP2C9*1/*3 (7%) có kiểu hình IM. Hiệp hội CPIC đã có những chỉ dẫn cụ

thể về liều dùng của một số loại thuốc như warfarin hay phenytoin tương ứng đối với

mỗi kiểu hình chuyển hóa thuốc. Trong đó, warfarin là thuốc chống đông máu, giúp

ngăn ngừa các cơn nhồi máu cơ tim và sự hình thành huyết khối tĩnh mạch/động

mạch. Phenytoin là thuốc giúp ngăn chặn và kiểm soát cơn động kinh bằng cách giảm

sự lan truyền điện trong ổ động kinh. Cụ thể, kiểu hình IM sẽ cần lưu ý chỉ sử dụng

65% liều warfarin hay giảm 25% liều phenytoin so với liều thông thường [186,

187].Từ đó, có thể thấy việc sàng lọc di truyền liên quan đến allele CYP2C9*3 cần

được lưu ý trước khi tiến hành kê đơn thuốc cũng như quyết định liều thuốc sẽ sử

dụng cho bệnh nhân Việt Nam đối với các loại thuốc được chuyển hóa bởi enzyme

này. Mặt khác, như đã trình bày ở những phần trước, có 3/100 mẫu nghiên cứu được

xác định là mất 1 bản sao của CYP2C9. Mặc dù kiểu hình chuyển hóa thuốc trong

trường hợp này còn chưa rõ, nhưng việc mất hoàn toàn 1 allele CYP2C9 có thể gây

ảnh hưởng đến chức năng của enzyme do chỉ còn 1 allele hoạt động. Bên cạnh đó,

nghiên cứu trước đó của Botton và cộng sự cũng cho rằng tuy tần số xuất hiện của

các biến thể dạng mất/tăng cường số bản sao của CYP2C9 là rất thấp, nhưng rất có

thể gây ảnh hưởng đến kiểu hình chuyển hóa thuốc lâm sàng của mỗi cá nhân [27].

Bởi vậy, bên cạnh allele CYP2C9*3 thì việc sử dụng thuốc ở người Kinh cũng nên

lưu ý đến một số cá nhân trong quần thể chỉ mang 1 allele CYP2C9 như trên.

109

Đối với gen CYP2C19, có một số báo cáo về mối liên quan giữa hiệu ứng phụ

của thuốc và đa hình của gen này ở các bệnh nhân được điều trị với thuốc ngăn ngừa

nhồi máu cơ tim/đột quỵ (Clopidogrel) cũng như thuốc chống trầm cảm loại SSRI.

Những người mang allele CYP2C19*2 và *3 khi sử dụng Clopidogrel sẽ có nguy cơ

cao hơn bị nhồi máu cơ tim, đột quỵ do thiếu máu cục bộ so với những người không

mang các allele này [188, 189]. Đối với những bệnh nhân mắc chứng rối loạn cảm

xúc và rối loạn lo âu phải điều trị bằng thuốc SSRI, dường như những người gặp phải

phản ứng phụ khi sử dụng thuốc có mối tương quan giữa kiểu hình và kiểu gen [190].

Như vậy, CYP2C19*2 là allele phổ biến nhất sau allele kiểu dại được tìm thấy trong

100 mẫu nghiên cứu và có thể nói đây là yếu tố chính làm giảm hoạt tính enzyme

CYP2C19 ở người Kinh Việt Nam. Tuy rằng CYP2C19*3 có tần số thấp hơn (chỉ

2,5%), nhưng như phần thảo luận trước đã bàn đến, đây là biến thể đặc thù ở người

châu Á bao gồm cả người Kinh Việt Nam. Dựa vào dữ liệu trên, những chuyên gia

chăm sóc sức khỏe và các bác sĩ ở Việt Nam nên lưu tâm đến biến thể *2 cũng như

*3 trong đáp ứng thuốc ở những bệnh nhân người Kinh khi điều trị bằng các thuốc

được chuyển hóa bởi CYP2C19. Riêng đối với clopidogrel, hiệp hội CPIC đã có

khuyến cáo đối với những bệnh nhân sử dụng clopidogrel mà có kiểu hình chuyển

hóa thuốc dạng IM và PM nên chuyển sang loại thuốc chống kết tập tiểu cầu khác

[191]. Trong nghiên cứu này, 38% số mẫu có kiểu hình chuyển hóa thuốc trung bình

(*1/*2, *1/*3, *2/*17) và 4% số mẫu có xuất hiện kiểu hình PM (*2/*2, *2/*3), có

thể thấy đối với người Kinh Việt Nam thì nên có sự cân nhắc khi sử dụng clopidogrel

do có nguy cơ gặp phải thất bại trong điều trị.

Đối với gen CYP2D6, như kết quả của nghiên cứu cho thấy CYP2D6*5,

CYP2D6*10, CYP2D6*13 và CYP2D6*36-*10 là những biến thể đáng chú ý trong

quần thể người Kinh Việt Nam và gây kiểu hình giảm/mất hoạt tính của enzyme

CYP2D6. Do đó các bác sĩ và chuyên gia chăm sóc sức khỏe cần lưu tâm đến đa hình

di truyền của CYP2D6, đặc biệt là các allele nói trên trong quá trình kê đơn thuốc

điều trị cho người Kinh Việt Nam. Codeine là một loại thuốc giảm đau loại II thuộc

nhóm opioid được sử dụng để điều trị các cơn đau từ nhẹ đến vừa phải. Thuốc có thời

gian tác dụng tương đối dài với liệu lực khoảng bằng 1/5 so với morphine (thuốc giảm

đau loại III dùng để điều trị các cơn đau nghiêm trọng). Trong số các bản tin cảnh

giác dược đã được công bố của Trung tâm DI & ADR Quốc gia, duy nhất codeine là

110

loại thuốc được thông báo là chống chỉ định trong trường hợp bệnh nhân mang kiểu

hình chuyển hóa thuốc UM ở tất cả các lứa tuổi và phụ nữ đang cho con bú. Hiệp hội

CPIC đã đưa ra những chỉ dẫn cụ thể về cách áp dụng liều lượng các loại thuốc như

codeine đối với từng kiểu hình chuyển hóa thuốc của enzyme CYP2D6. Trong đó

kiểu hình PM có nguy cơ không đạt hiệu quả giảm đau khi sử dụng liều thông thường,

và cần cân nhắc sử dụng loại thuốc giảm đau khác [192]. Ngược lại, những cá thể có

kiểu hình UM cũng nên chuyển loại thuốc giảm đau khác ngoài codeine, do codeine

được chuyển hóa nhanh và tạo nên nồng độ morphine quá lớn trong máu, gây nên

tình trạng ngộ độc cho bệnh nhân. Trong nghiên cứu này, không có cá thể nào được

xác định là mang nhiều hơn 2 bản sao của CYP2D6. Tuy nhiên, ảnh hưởng của kiểu

hình UM trong chuyển hóa thuốc vẫn nên được quan tâm trong các nghiên cứu cơ

bản cũng như lâm sàng tại Việt Nam. Với tần số kiểu hình PM (1,4%) và UM (0%)

thì có thể thấy người Kinh Việt Nam nên dùng codeine với liều thông thường mà

không cần cân nhắc đến loại thuốc giảm đau khác. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng kiểu

hình IM (53,5%) có tần số xuất hiện lớn nhất trong 136 mẫu nghiên cứu, kiểu hình

này cũng làm giảm tốc độ chuyển hóa codeine thành morphine. Bởi vậy đối với người

Kinh Việt Nam, các bác sĩ trong quá trình sử dụng liều codeine tiêu chuẩn mà nhận

thấy không đạt hiệu quả giảm đau thì cũng nên đưa ra phương án đổi sang loại thuốc

giảm đau khác cho người bệnh. Trên thực tế, CPIC đưa ra chỉ dẫn cho kiểu hình IM

khi sử dụng codein mà không có đáp ứng thuốc là cần thay thế codeine bằng morphine

hoặc các thuốc giảm đau không opioid. Ngoài ra, các thuốc chống trầm cảm ba vòng

cũng nằm trong khuyến cáo của CPIC về liều dùng dựa trên cơ sở kiểu hình chuyển

hóa thuốc của mỗi bệnh nhân. Đây là các loại thuốc được sử dụng trong điều trị trầm

cảm và rối loạn ám ảnh cưỡng chế. Theo như hướng dẫn, kiểu hình chuyển hóa thuốc

PM và UM của CYP2D6 nên tránh sử dụng các thuốc chống trầm cảm ba vòng do

không đạt hiệu quả sử dụng thuốc hoặc gặp phải các phản ứng phụ không mong muốn.

Trong trường hợp cần phải sử dụng loại thuốc này, kiểu hình PM nên tăng liều và

kiểu hình UM nên giảm 50% liều so với liều thông thường [193]. Đặc biệt, kiểu hình

IM cũng nên cân nhắc giảm 25% liều so với liều chuẩn để tránh trường hợp lượng

thuốc hoạt hóa trong huyết tương có nồng độ cao sẽ tăng khả năng gặp phải các phản

ứng phụ. Với kiểu hình IM chiếm hơn 50% số mẫu nghiên cứu, thì đây là vấn đề đáng

111

lưu ý trong trường hợp những bệnh nhân người Kinh Việt Nam điều trị với thuốc

chống trầm cảm ba vòng.

Đối với gen CYP3A5, đa dạng di truyền của gen này có ảnh hưởng đến chuyển

hóa thuốc tacrolimus. Đây là một loại thuốc ức chế hệ miễn dịch có chỉ số trị liệu

hẹp, hiện nay đang được sử dụng rộng rãi cho các bệnh nhân sau ghép tạng (thận,

tim) và ghép tế bào gốc máu.Trong gan, tacrolimus được chuyển hóa bởi các enzyme

CYP3A4 và CYP3A5.Trong điều trị, việc quyết định liều dùng tacrolimus khá phức

tạp bởi sự khác biệt về dược động học giữa các bệnh nhân có thể dẫn tới các trường

hợp: liều điều trị thấp dẫn tới tạng ghép bị loại thải, liều điều trị cao quá mức dẫn tới

nguy cơ ngộ độc thuốc (cao huyết áp, ngộ độc thần kinh, ngộ độc thận, tăng đường

máu). Tacrolimus-CYP3A5 cũng là cặp gen thuốc được CPIC đưa ra hướng dẫn căn

bản trong việc áp dụng liều lượng sao cho phù hợp với kiểu hình chuyển hóa thuốc

của từng cá nhân [194]. Cụ thể, bệnh nhân mang kiểu gen CYP3A5*1/*1 (kiểu hình

EM) và CYP3A5*1/*3 (kiểu hình IM) cần sử dụng liều tacrolimus cao hơn 1,5-2 lần

so với liều chuẩn. Trong khi đó các bệnh nhân mang kiểu gen CYP3A5*3/*3 (kiểu

hình PM) có thể sử dụng liều tacrolimus theo như khuyến cáo thông thường. Với 50%

số cá thể nghiên cứu mang biến thể *3 có kiểu gen dị hợp tử CYP3A5*1/*3 là kiểu

gen cần có sự điều chỉnh trong liều lượng thuốc tacrolimus, có thể thấy đây là tỉ lệ

đáng lưu ý trong quần thể người Việt Nam.

112

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

1.Đã xây dựng được cơ sở dữ liệu đa hình di truyền cho các gen CYP2C9,

CYP2C19, CYP3A5 (100 mẫu) và CYP2D6 (136 mẫu) ở người Kinh sử dụng phương

pháp giải trình tự gen trực tiếp và phân tích số bản sao bằng MLPA.

2.Đã xác định được thành phần kiểu gen, tần số allele và các biến thể mới của

4 gen: 3 kiểu gen, 3 allele và 6 biến thể mới của gen CYP2C9; 6 kiểu gen, 4 allele và

3 biến thể mới của gen CYP2C19; 29 kiểu gen, 18 allele và 7 biến thể mới của gen

CYP2D6; 3 kiểu gen và 2 allele của gen CYP3A5. Chi tiết cu ̣ thể như sau:

- Gen CYP2C9: Kiểu gen *1/*1, *1/*3, *1/Del có tỉ lệ lần lượt là 90%, 7% và

3%. Tần số của các allele được xác định là *1 (95%), *3(3,5%) và Del (1,5%). Sáu

biến thể mới gồm 5 trong intron và 1 trong exon của CYP2C9. Biến thể 42627 C>A

(p.Pro363His) thuộc exon 7được dự đoán in silico là gây ảnh hưởng có hại đến chức

năng của protein.

- Gen CYP2C19: Tỉ lệ kiểu gen là *1/*1 (58%), *1/*2 (32%), *1/*3 (4%),

*2/*2 (3%), *2/*3 (1%) và *2/*17 (2%). Ngoài ra, tần số của các allele xác định được

lần lượt là: *1 (76%), *2 (20,5%), *3 (2,5%) và *17 (1%).

- Gen CYP2D6: Tần số của 29 kiểu gen được xác định là 0,7%-22,8% và tần

số của các allele xác định được là 0,37%-43,75%. Trong số các biến thể cấu trúc,

không phát hiện thấy cá thể nào có kiểu gen mất cả 2 allele CYP2D6 và/hoặc mang

nhiều hơn 2 bản sao của gen này. Bảy biến thể mới bao gồ m 3 trong promoter, 2 trong

intron và 2 trong exon. Biến thể 3157G>T (p.Arg329Leu) thuộc exon 7 được dự đoán

in silico là gây ảnh hưởng có hại đến chức năng của protein. Ngoài ra, biến thể

3851G>A (p.Trp358X) thuộc exon 8 làm xuất hiện mã kết thúc sớm.

- Gen CYP3A5: Các kiểu gen *1/*1, *1/*3 và *3/*3 có tỉ lệ lần lượt là 10%,

45% và 45%. Tần số của các allele *1 và *3 lần lượt là 32,5% và 67,5%.

113

Kiến nghị

Từ những kết quả đạt được, chúng tôi xin đưa ra kiến nghị như sau:

1. Nên cân nhắc sàng lọc đối với các biến thể di truyền đã biết gây ảnh hưởng

tới hoạt tính enzyme thuộc các gen: CYP2C9 (*3), CYP2C19 (*2, *3, *17), CYP2D6

(*5, *10, *13, *36-*10) và CYP3A5 (*3). Với tầm quan trọng của đa hình di truyền

các gen CYP450 trong đáp ứng thuốc cá nhân, cần tiến hành những nghiên cứu đánh

giá mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình đáp ứng thuốc trên người Việt Nam.

114

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

* Tên bài báo 01: Polymorphic analysis of CYP2C9 gene in Vietnamese population

Tạp chí: Molecular Biology Reports (45(5):893-900. doi: 10.1007/s11033-018-4235-

3. Epub 2018 Jul 5)

Tác giả: Nhung Phuong Vu, Thuong Thi Huyen Ma, Ngoc Thi Bich Tran, Hue Thi

Thu Huynh, Ton Dang Nguyen, Duong Thuy Nguyen, Hai Van Nong, Ming Ta

Michael Lee, Ha Hai Nguyen.

* Tên bài báo 02: Single nucleotide and structural variants of CYP2D6 gene in Kinh Vietnamese population

Tạp chí: Medicine (98(22): e15891. doi: 10.1097/MD.0000000000015891. Epub

2019 May 31)

Tác giả: Ha Hai Nguyen, Thuong Thi Huyen Ma, Nhung Phuong Vu, Quynh Bach

Thi Nhu, Thang Hong Vu, Ton Dang Nguyen, Hai Van Nong.

* Tên bài báo 03: CYP2C19 genetic polymorphism in the Vietnamese population

Tạp chí: Annals of Human Biology (46(6):491-497. doi:

10.1080/03014460.2019.1687750. Epub 2019 Nov25)

Tác giả: Nhung Phuong Vu, Hoa Thi Thanh Nguyen, Ngoc Thi Bich Tran, Ton Dang

Nguyen, Hue Thi Thu Huynh, Xuan Thi Nguyen, Duong Thuy Nguyen, Hai Van

Nong, Ha Hai Nguyen.

* Tên bài báo 04: Nghiên cứu đa hình gen CYP3A5 ở người Kinh Việt Nam.

Tạp chí Sinh học 2020, 42(1): 111-123

Tác giả: Vũ Phương Nhung, Nguyễn Đăng Tôn, Nguyễn Hải Hà

*Tên bài báo 05: Đa dạng di truyền một số gen dược học

Tạp chí Công nghệ sinh học 2020, 18(3): 393-416

Tác giả: Vũ Phương Nhung, Nguyễn Đăng Tôn, Nông Văn Hải, Nguyễn Hải Hà.

115

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. M. Klingenberg, Pigments of rat liver microsomes, Arch. Biochem. Biophys.,

1958, 75(2), 376-386.

2. D.Y. Cooper, S. Levin, S. Narasimhulu, and O. Rosenthal, Photochemical

Action Spectrum of the Terminal Oxidase of Mixed Function Oxidase Systems,

Science, 1965, 147(3656), 400-402.

3. R.W. Estabrook, A passion for P450s (rememberances of the early history of

research on cytochrome P450), Drug Metab. Dispos., 2003, 31(12), 1461-

1473.

4. O. Gotoh, Substrate recognition sites in cytochrome P450 family 2 (CYP2)

proteins inferred from comparative analyses of amino acid and coding

nucleotide sequences, J. Biol. Chem., 1992, 267(1), 83-90.

5. O. Pylypenko and I. Schlichting, Structural aspects of ligand binding to and

electron transfer in bacterial and fungal P450s, Annu. Rev. Biochem., 2004,

73, 991-1018.

6. I.G. Denisov, T.M. Makris, S.G. Sligar, and I. Schlichting, Structure and

chemistry of cytochrome P450, Chem. Rev., 2005, 105(6), 2253-2277.

7. R. Cacabelos, C. Torrellas, O. Teijido, and J.C. Carril, Pharmacogenetic

considerations in the treatment of Alzheimer's disease, Pharmacogenomics,

2016, 17(9), 1041-1074.

8. S.C. Preissner, M.F. Hoffmann, R. Preissner, M. Dunkel, A. Gewiess, and S.

Preissner, Polymorphic cytochrome P450 enzymes (CYPs) and their role in

personalized therapy, PLoS One, 2013, 8(12), e82562.

9. A. Isvoran, M. Louet, D.L. Vladoiu, D. Craciun, M.A. Loriot, B.O.

Villoutreix, and M.A. Miteva, Pharmacogenomics of the cytochrome P450 2C

family: impacts of amino acid variations on drug metabolism, Drug Discov.

Today, 2017, 22(2), 366-376.

10. S.F. Zhou, Z.W. Zhou, L.P. Yang, and J.P. Cai, Substrates, inducers,

inhibitors and structure-activity relationships of human Cytochrome P450

2C9 and implications in drug development, Curr. Med. Chem., 2009, 16(27),

3480-3675.

116

S.F. Zhou, Z.W. Zhou, and M. Huang, Polymorphisms of human cytochrome 11.

P450 2C9 and the functional relevance, Toxicology, 2010, 278(2), 165-188.

12. Y. Zhou, M. Ingelman-Sundberg, and V.M. Lauschke, Worldwide

Distribution of Cytochrome P450 Alleles: A Meta-analysis of Population-

scale Sequencing Projects, Clin. Pharmacol. Ther., 2017, 102(4), 688-700.

13. G.P. Aithal, C.P. Day, P.J. Kesteven, and A.K. Daly, Association of

polymorphisms in the cytochrome P450 CYP2C9 with warfarin dose

requirement and risk of bleeding complications, Lancet, 1999, 353(9154),

717-719.

14. D.P. Dai, R.A. Xu, L.M. Hu, S.H. Wang, P.W. Geng, J.F. Yang, L.P. Yang,

J.C. Qian, Z.S. Wang, G.H. Zhu, X.H. Zhang, R.S. Ge, G.X. Hu, and J.P. Cai,

CYP2C9 polymorphism analysis in Han Chinese populations: building the

largest allele frequency database, Pharmacogenomics J., 2014, 14(1), 85-92.

15. M. Sosa-Macias, B.P. Lazalde-Ramos, C. Galaviz-Hernandez, H. Rangel-

Villalobos, J. Salazar-Flores, V.M. Martinez-Sevilla, M.L. Martinez-Fierro, P.

Dorado, M.L. Wong, J. Licinio, and L.L. A, Influence of admixture

components on CYP2C9*2 allele frequency in eight indigenous populations

from Northwest Mexico, Pharmacogenomics J., 2013, 13(6), 567-572.

16. R.S. Kidd, T.B. Curry, S. Gallagher, T. Edeki, J. Blaisdell, and J.A. Goldstein,

Identification of a null allele of CYP2C9 in an African-American exhibiting

toxicity to phenytoin, Pharmacogenetics, 2001, 11(9), 803-808.

17. A.E. Fohner, R. Robinson, J. Yracheta, D.A. Dillard, B. Schilling, B. Khan, S.

Hopkins, B. Boyer, J. Black, H. Wiener, H.K. Tiwari, A. Gordon, D.

Nickerson, J.M. Tsai, F.M. Farin, T.A. Thornton, A.E. Rettie, and K.E.

Thummel, Variation in genes controlling warfarin disposition and response

in American Indian and Alaska Native people: CYP2C9, VKORC1, CYP4F2,

CYP4F11, GGCX, Pharmacogenet. Genomics, 2015, 25(7), 343-353.

18. S.J. Lee, S.S. Lee, and J.G. Shin, Pharmacogenetics of Cytochrome P450, in

Pharmacogenomics: An Introduction and Clinical Perspective, S.B.J. Joseph,

Editor. 2016, McGraw-Hill Education: New York, United State.

117

19. M.A. Kramer, A.E. Rettie, M.J. Rieder, E.T. Cabacungan, and R.N. Hines,

Novel CYP2C9 promoter variants and assessment of their impact on gene

expression, Mol. Pharmacol., 2008, 73(6), 1751-1760.

20. D. Wang, X. Sun, Y. Gong, B.E. Gawronski, T.Y. Langaee, M.H. Shahin, S.I.

Khalifa, and J.A. Johnson, CYP2C9 promoter variable number tandem repeat

polymorphism regulates mRNA expression in human livers, Drug Metab.

Dispos., 2012, 40(5), 884-891.

21. M.A. Perera, E. Gamazon, L.H. Cavallari, S.R. Patel, S. Poindexter, R.A.

Kittles, D. Nicolae, and N.J. Cox, The missing association: sequencing-based

discovery of novel SNPs in VKORC1 and CYP2C9 that affect warfarin dose in

African Americans, Clin. Pharmacol. Ther., 2011, 89(3), 408-415.

22. L.H. Cavallari, D. Vaynshteyn, K.M. Freeman, D. Wang, M.A. Perera, H.

Takahashi, K. Drozda, S.R. Patel, and H. Jeong, CYP2C9 promoter region

single-nucleotide polymorphisms linked to the R150H polymorphism are

functional suggesting their role in CYP2C9*8-mediated effects,

Pharmacogenet. Genomics, 2013, 23(4), 228-231.

23. C.R. Satyanarayana, A. Devendran, M. Jayaraman, J. Mannu, P.P. Mathur,

S.D. Gopal, K. Rajagopal, and A. Chandrasekaran, Influence of the genetic

polymorphisms in the 5' flanking and exonic regions of CYP2C19 on proguanil

oxidation, Drug Metab. Pharmacokinet., 2009, 24(6), 537-548.

24. S.M. de Morais, G.R. Wilkinson, J. Blaisdell, K. Nakamura, U.A. Meyer, and

J.A. Goldstein, The major genetic defect responsible for the polymorphism of

S-mephenytoin metabolism in humans, J. Biol. Chem., 1994, 269(22), 15419-

15422.

25. G.C. Ibeanu, J. Blaisdell, B.I. Ghanayem, C. Beyeler, S. Benhamou, C.

Bouchardy, G.R. Wilkinson, P. Dayer, A.K. Daly, and J.A. Goldstein, An

additional defective allele, CYP2C19*5, contributes to the S-mephenytoin

poor metabolizer phenotype in Caucasians, Pharmacogenetics, 1998, 8(2),

129-135.

26. J.C. Sanford, Y. Guo, W. Sadee, and D. Wang, Regulatory polymorphisms in

CYP2C19 affecting hepatic expression, Drug Metabol. Drug Interact., 2013,

28(1), 23-30.

118

27. M.R. Botton, X. Lu, G. Zhao, E. Repnikova, Y. Seki, A. Gaedigk, E.E. Schadt,

L. Edelmann, and S.A. Scott, Structural variation at the CYP2C locus:

Characterization of deletion and duplication alleles, Hum. Mutat., 2019,

40(11), e37-e51.

28. Z. Desta, X. Zhao, J.G. Shin, and D.A. Flockhart, Clinical significance of the

cytochrome P450 2C19 genetic polymorphism, Clin. Pharmacokinet., 2002,

41(12), 913-958.

29. J.S. Hulot, J.P. Collet, J. Silvain, A. Pena, A. Bellemain-Appaix, O.

Barthelemy, G. Cayla, F. Beygui, and G. Montalescot, Cardiovascular risk in

clopidogrel-treated patients according to cytochrome P450 2C19*2 loss-of-

function allele or proton pump inhibitor coadministration: a systematic meta-

analysis, J. Am. Coll. Cardiol., 2010, 56(2), 134-143.

30. J. Miao, R. Liu, and Z. Li, Cytochrome P-450 polymorphisms and response to

clopidogrel, N. Engl. J. Med., 2009, 360(21), 2250-2251.

31. T. Simon, C. Verstuyft, M. Mary-Krause, L. Quteineh, E. Drouet, N.

Meneveau, P.G. Steg, J. Ferrieres, N. Danchin, and L. Becquemont, Genetic

determinants of response to clopidogrel and cardiovascular events, N. Engl.

J. Med., 2009, 360(4), 363-375.

32. A.M. Amin, L. Sheau Chin, D. Azri Mohamed Noor, M.A. Sk Abdul Kader,

Y. Kah Hay, and B. Ibrahim, The personalization of clopidogrel antiplatelet

therapy: The role of integrative pharmacogenetics and

pharmacometabolomics, Cardiol. Res. Pract., 2017, 2017, 8062796.

33. N.L. Pereira, J.B. Geske, M. Mayr, S.H. Shah, and C.S. Rihal,

Pharmacogenetics of Clopidogrel: An Unresolved Issue, Circ. Cardiovasc.

Genet., 2016, 9(2), 185-188.

34. N.A. Helsby and K.E. Burns, Molecular mechanisms of genetic variation and

transcriptional regulation of CYP2C19, Front Genet, 2012, 3, 206.

35. H.L. Hsu, K.J. Woad, D.G. Woodfield, and N.A. Helsby, A high incidence of

polymorphic CYP2C19 variants in archival blood samples from Papua New

Guinea, Hum. Genomics, 2008, 3(1), 17-23.

36. S.P. Myrand, K. Sekiguchi, M.Z. Man, X. Lin, R.Y. Tzeng, C.H. Teng, B.

Hee, M. Garrett, H. Kikkawa, C.Y. Lin, S.M. Eddy, J. Dostalik, J. Mount, J.

119

Azuma, Y. Fujio, I.J. Jang, S.G. Shin, M.R. Bleavins, J.A. Williams, J.D.

Paulauskis, and K.D. Wilner, Pharmacokinetics/genotype associations for

major cytochrome P450 enzymes in native and first- and third-generation

Japanese populations: comparison with Korean, Chinese, and Caucasian

populations, Clin. Pharmacol. Ther., 2008, 84(3), 347-361.

37. T. Jin, X. Zhang, T. Geng, X. Shi, L. Wang, D. Yuan, and L. Kang, Genotype

phenotype analysis of CYP2C19 in the Tibetan population and its potential

clinical implications in drug therapy, Mol Med Rep, 2016, 13(3), 2117-2123.

38. V.O. Barysheva and G.G. Ketova, Pharmacogenetic testing in population of

South Ural, Int. J. Risk Saf. Med., 2015, 27 Suppl 1, S25-26.

39. T.M. Dodgen, B.I. Drogemoller, G.E. Wright, L. Warnich, F.E. Steffens, A.D.

Cromarty, M. Alessandrini, and M.S. Pepper, Evaluation of predictive

CYP2C19 genotyping assays relative to measured phenotype in a South

African cohort, Pharmacogenomics, 2015, 16(12), 1343-1354.

40. R. Weinshilboum, Inheritance and drug response, N. Engl. J. Med., 2003,

348(6), 529-537.

41. E.U. Griese, U.M. Zanger, U. Brudermanns, A. Gaedigk, G. Mikus, K.

Morike, T. Stuven, and M. Eichelbaum, Assessment of the predictive power of

genotypes for the in-vivo catalytic function of CYP2D6 in a German

population, Pharmacogenetics, 1998, 8(1), 15-26.

42. C. Sachse, J. Brockmoller, S. Bauer, and I. Roots, Cytochrome P450 2D6

variants in a Caucasian population: allele frequencies and phenotypic

consequences, Am. J. Hum. Genet., 1997, 60(2), 284-295.

43. Y. Yang, M.R. Botton, E.R. Scott, and S.A. Scott, Sequencing the CYP2D6

gene: from variant allele discovery to clinical pharmacogenetic testing,

Pharmacogenomics, 2017, 18(7), 673-685.

44. U.M. Zanger, S. Raimundo, and M. Eichelbaum, Cytochrome P450 2D6:

overview and update on pharmacology, genetics, biochemistry, Naunyn

Schmiedebergs Arch. Pharmacol., 2004, 369(1), 23-37.

45. H.G. Xie, A.J. Wood, R.B. Kim, C.M. Stein, and G.R. Wilkinson, Genetic

variability in CYP3A5 and its possible consequences, Pharmacogenomics,

2004, 5(3), 243-272.

120

F.C. Chou, S.J. Tzeng, and J.D. Huang, Genetic polymorphism of cytochrome 46.

P450 3A5 in Chinese, Drug Metab. Dispos., 2001, 29(9), 1205-1209.

47. P. Kuehl, J. Zhang, Y. Lin, J. Lamba, M. Assem, J. Schuetz, P.B. Watkins, A.

Daly, S.A. Wrighton, S.D. Hall, P. Maurel, M. Relling, C. Brimer, K. Yasuda,

R. Venkataramanan, S. Strom, K. Thummel, M.S. Boguski, and E. Schuetz,

Sequence diversity in CYP3A promoters and characterization of the genetic

basis of polymorphic CYP3A5 expression, Nat. Genet., 2001, 27(4), 383-391.

48. S.J. Lee, K. Usmani, B. Chanas, B. Ghanayem, T. Xi, E. Hodgson, H.

Mohrenweiser, and J. Goldstein, Genetic findings and functional studies of

human CYP3A5 single nucleotide polymorphisms in different ethnic groups,

Pharmacogenet. Genomics, 2003, 13(8), 461-472.

49. Y.S. Lin, A.L. Dowling, S.D. Quigley, F.M. Farin, J. Zhang, J. Lamba, E.G.

Schuetz, and K.E. Thummel, Co-regulation of CYP3A4 and CYP3A5 and

contribution to hepatic and intestinal midazolam metabolism, Mol.

Pharmacol., 2002, 62(1), 162-172.

50. M.A. Hadi, C.F. Neoh, R.M. Zin, M.E. Elrggal, and E. Cheema,

Pharmacovigilance: pharmacists' perspective on spontaneous adverse drug

reaction reporting, Integr Pharm Res Pract, 2017, 6, 91-98.

51. S. Amin, S. Shah, M. Desai, A. Shah, and K.M. Maheriya, An analysis of

adverse drug reactions in extremes of age group at tertiary care teaching

hospital, Perspect. Clin. Res., 2018, 9(2), 70-75.

52. A. Shoshi, U. Muller, A. Shoshi, V. Ogultarhan, and R. Hofestadt, KALIS - An

eHealth system for biomedical risk analysis of drugs, Stud. Health Technol.

Inform., 2017, 236, 128-135.

53. Wolter Kluwer Clinical Drug Information. 2018; Available from:

https://www.wolterskluwercdi.com/lexicomp-online.

54. Y. Hwang, M. Oh, G. Jang, T. Lee, C. Park, J. Ahn, and Y. Yoon, Identifying

the common genetic networks of ADR (adverse drug reaction) clusters and

developing an ADR classification model, Mol. Biosyst., 2017, 13(9), 1788-

1796.

121

S.L. Collins, D.F. Carr, and M. Pirmohamed, Advances 55. in the

Pharmacogenomics of Adverse Drug Reactions, Drug Saf., 2016, 39(1), 15-

27.

56. Z.W. Zhou, X.W. Chen, K.B. Sneed, Y.X. Yang, X. Zhang, Z.X. He, K. Chow,

T. Yang, W. Duan, and S.F. Zhou, Clinical association between

pharmacogenomics and adverse drug reactions, Drugs, 2015, 75(6), 589-631.

57. O. Osanlou, M. Pirmohamed, and A.K. Daly, Pharmacogenetics of Adverse

Drug Reactions, Adv. Pharmacol., 2018, 83, 155-190.

58. K.K. Reynolds, D.L. Pierce, F. Weitendorf, and M.W. Linder, Avoidable drug-

gene conflicts and polypharmacy interactions in patients participating in a

personalized medicine program, Per. Med., 2017, 14(3), 221-233.

59. R. Cacabelos, C. Torrellas, and I. Carrera, Opportunities in

pharmacogenomics for the treatment of Alzheimer's disease, Future Neurol.,

2015, 10(3), 229-252.

60. R. Cacabelos and C. Torrellas, Epigenetics of aging and Alzheimer's disease:

implications for pharmacogenomics and drug response, Int. J. Mol. Sci., 2015,

16(12), 30483-30543.

61. C.R. Lee, J.A. Goldstein, and J.A. Pieper, Cytochrome P450 2C9

polymorphisms: a comprehensive review of the in-vitro and human data,

Pharmacogenetics, 2002, 12(3), 251-263.

62. J. Imai, I. Ieiri, K. Mamiya, S. Miyahara, H. Furuumi, E. Nanba, M. Yamane,

Y. Fukumaki, H. Ninomiya, N. Tashiro, K. Otsubo, and S. Higuchi,

Polymorphism of the cytochrome P450 (CYP) 2C9 gene in Japanese epileptic

patients: genetic analysis of the CYP2C9 locus, Pharmacogenetics, 2000,

10(1), 85-89.

63. J. Kirchheiner, K. Nickchen, M. Bauer, M.L. Wong, J. Licinio, I. Roots, and

J. Brockmoller, Pharmacogenetics of antidepressants and antipsychotics: the

contribution of allelic variations to the phenotype of drug response, Mol.

Psychiatry, 2004, 9(5), 442-473.

64. W.H. Chou, F.X. Yan, J. de Leon, J. Barnhill, T. Rogers, M. Cronin, M. Pho,

V. Xiao, T.B. Ryder, W.W. Liu, C. Teiling, and P.J. Wedlund, Extension of a

pilot study: impact from the cytochrome P450 2D6 polymorphism on outcome

122

and costs associated with severe mental illness, J. Clin. Psychopharmacol.,

2000, 20(2), 246-251.

65. C. Kawanishi, S. Lundgren, H. Agren, and L. Bertilsson, Increased incidence

of CYP2D6 gene duplication in patients with persistent mood disorders:

ultrarapid metabolism of antidepressants as a cause of nonresponse. A pilot

study, Eur. J. Clin. Pharmacol., 2004, 59(11), 803-807.

66. L.B. Sorensen, R.N. Sorensen, J.O. Miners, A.A. Somogyi, N. Grgurinovich,

and D.J. Birkett, Polymorphic hydroxylation of perhexiline in vitro, Br. J. Clin.

Pharmacol., 2003, 55(6), 635-638.

67. M.L. Barclay, S.M. Sawyers, E.J. Begg, M. Zhang, R.L. Roberts, M.A.

Kennedy, and J.M. Elliott, Correlation of CYP2D6 genotype with perhexiline

phenotypic metabolizer status, Pharmacogenetics, 2003, 13(10), 627-632.

68. H. Wuttke, T. Rau, R. Heide, K. Bergmann, M. Bohm, J. Weil, D. Werner,

and T. Eschenhagen, Increased frequency of cytochrome P450 2D6 poor

metabolizers among patients with metoprolol-associated adverse effects, Clin.

Pharmacol. Ther., 2002, 72(4), 429-437.

69. M.T. Susce, E. Murray-Carmichael, and J. de Leon, Response to hydrocodone,

codeine and oxycodone in a CYP2D6 poor metabolizer, Prog.

Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry, 2006, 30(7), 1356-1358.

70. C. Passey, A.K. Birnbaum, R.C. Brundage, W.S. Oetting, A.K. Israni, and

P.A. Jacobson, Dosing equation for tacrolimus using genetic variants and

clinical factors, Br. J. Clin. Pharmacol., 2011, 72(6), 948-957.

71. A. Egbelakin, M.J. Ferguson, E.A. MacGill, A.S. Lehmann, A.R. Topletz,

S.K. Quinney, L. Li, K.C. McCammack, S.D. Hall, and J.L. Renbarger,

Increased risk of vincristine neurotoxicity associated with low CYP3A5

expression genotype in children with acute lymphoblastic leukemia, Pediatr.

Blood Cancer, 2011, 56(3), 361-367.

72. J. Garcia-Donas, E. Esteban, L.J. Leandro-Garcia, D.E. Castellano, A.

Gonzalez del Alba, M.A. Climent, J.A. Arranz, E. Gallardo, J. Puente, J.

Bellmunt, B. Mellado, E. Martinez, F. Moreno, A. Font, M. Robledo, and C.

Rodriguez-Antona, Single nucleotide polymorphism associations with

response and toxic effects in patients with advanced renal-cell carcinoma

123

treated with first-line sunitinib: a multicentre, observational, prospective

study, Lancet Oncol., 2011, 12(12), 1143-1150.

73. N. Shimada, M. Iwasaki, Y. Kasuga, S. Yokoyama, H. Onuma, H. Nishimura,

R. Kusama, G.S. Hamada, I.N. Nishimoto, H. Iyeyasu, J. Motola, Jr., F.M.

Laginha, N. Kurahashi, and S. Tsugane, Genetic polymorphisms in estrogen

metabolism and breast cancer risk in case-control studies in Japanese,

Japanese Brazilians and non-Japanese Brazilians, J. Hum. Genet., 2009,

54(4), 209-215.

74. A.N. Tucker, K.A. Tkaczuk, L.M. Lewis, D. Tomic, C.K. Lim, and J.A. Flaws,

Polymorphisms in cytochrome P4503A5 (CYP3A5) may be associated with

race and tumor characteristics, but not metabolism and side effects of

tamoxifen in breast cancer patients, Cancer Lett., 2005, 217(1), 61-72.

75. G. Yimer, W. Amogne, A. Habtewold, E. Makonnen, N. Ueda, A. Suda, A.

Worku, W.E. Haefeli, J. Burhenne, G. Aderaye, L. Lindquist, and E. Aklillu,

High plasma efavirenz level and CYP2B6*6 are associated with efavirenz-

based HAART-induced liver injury in the treatment of naive HIV patients from

Ethiopia: a prospective cohort study, Pharmacogenomics J., 2012, 12(6), 499-

506.

76. M. Rotger, S. Colombo, H. Furrer, G. Bleiber, T. Buclin, B.L. Lee, O. Keiser,

J. Biollaz, L. Decosterd, A. Telenti, and H.I.V.C.S. Swiss, Influence of

CYP2B6 polymorphism on plasma and intracellular concentrations and

toxicity of efavirenz and nevirapine in HIV-infected patients, Pharmacogenet.

Genomics, 2005, 15(1), 1-5.

77. J.D. Robarge, I.F. Metzger, J. Lu, N. Thong, T.C. Skaar, Z. Desta, and R.R.

Bies, Population pharmacokinetic modeling to estimate the contributions of

genetic and nongenetic factors to efavirenz disposition, Antimicrob. Agents

Chemother., 2017, 61(1).

78. P. Leger, S. Chirwa, M. Turner, D.M. Richardson, P. Baker, M. Leonard, H.

Erdem, L. Olson, and D.W. Haas, Pharmacogenetics of efavirenz

discontinuation for reported central nervous system symptoms appears to

differ by race, Pharmacogenet. Genomics, 2016, 26(10), 473-480.

124

79. O. Levran, E. Peles, S. Hamon, M. Randesi, M. Adelson, and M.J. Kreek,

CYP2B6 SNPs are associated with methadone dose required for effective

treatment of opioid addiction, Addict. Biol., 2013, 18(4), 709-716.

80. P. Katara and H. Kuntal, TPMT Polymorphism: when shield becomes

weakness, Interdiscip Sci, 2016, 8(2), 150-155.

81. R.B. Leon-Cachon, J.A. Ascacio-Martinez, M. Gomez-Silva, E. Pineyro-

Garza, J.G. Gonzalez-Gonzalez, G. Pogue, L. Simon-Buela, and H.A. Barrera-

Saldana, Application of genomic technologies in clinical pharmacology

research, Rev. Invest. Clin., 2015, 67(4), 212-218.

82. J.N. Ingle, M. Liu, D.L. Wickerham, D.J. Schaid, L. Wang, T. Mushiroda, M.

Kubo, J.P. Costantino, V.G. Vogel, S. Paik, M.P. Goetz, M.M. Ames, G.D.

Jenkins, A. Batzler, E.E. Carlson, D.A. Flockhart, N. Wolmark, Y. Nakamura,

and R.M. Weinshilboum, Selective estrogen receptor modulators and

pharmacogenomic variation in ZNF423 regulation of BRCA1 expression:

individualized breast cancer prevention, Cancer Discov., 2013, 3(7), 812-825.

83. M. Gupta, D. Neavin, D. Liu, J. Biernacka, D. Hall-Flavin, W.V. Bobo, M.A.

Frye, M. Skime, G.D. Jenkins, A. Batzler, K. Kalari, W. Matson, S.S. Bhasin,

H. Zhu, T. Mushiroda, Y. Nakamura, M. Kubo, L. Wang, R. Kaddurah-Daouk,

and R.M. Weinshilboum, TSPAN5, ERICH3 and selective serotonin reuptake

inhibitors in major depressive disorder: pharmacometabolomics-informed

pharmacogenomics, Mol. Psychiatry, 2016, 21(12), 1717-1725.

84. A.N. Freedman, L.B. Sansbury, W.D. Figg, A.L. Potosky, S.R. Weiss Smith,

M.J. Khoury, S.A. Nelson, R.M. Weinshilboum, M.J. Ratain, H.L. McLeod,

R.S. Epstein, G.S. Ginsburg, R.L. Schilsky, G. Liu, D.A. Flockhart, C.M.

Ulrich, R.L. Davis, L.J. Lesko, I. Zineh, G. Randhawa, C.B. Ambrosone, M.V.

Relling, N. Rothman, H. Xie, M.R. Spitz, R. Ballard-Barbash, J.H. Doroshow,

and L.M. Minasian, Cancer pharmacogenomics and pharmacoepidemiology:

setting a research agenda to accelerate translation, J. Natl. Cancer Inst., 2010,

102(22), 1698-1705.

85. Z. Zhong, J. Hou, B. Li, Q. Zhang, S. Liu, C. Li, Z. Liu, M. Yang, W. Zhong,

and P. Zhao, Analysis of CYP2C19 Genetic Polymorphism in a Large Ethnic

Hakka Population in Southern China, Med. Sci. Monit., 2017, 23, 6186-6192.

125

J. de Leon, M.J. Arranz, and G. Ruano, Pharmacogenetic testing in 86.

psychiatry: a review of features and clinical realities, Clin. Lab. Med., 2008,

28(4), 599-617.

87. L.L. Goh, C.W. Lim, W.C. Sim, L.X. Toh, and K.P. Leong, Analysis of genetic

variation in CYP450 genes for clinical implementation, PLoS One, 2017,

12(1), e0169233.

88. S. Martis, H. Mei, R. Vijzelaar, L. Edelmann, R.J. Desnick, and S.A. Scott,

Multi-ethnic cytochrome-P450 copy number profiling: novel

pharmacogenetic alleles and mechanism of copy number variation formation,

Pharmacogenomics J., 2013, 13(6), 558-566.

89. B. Ramirez, M.J. Nino-Orrego, D. Cardenas, K.E. Ariza, K. Quintero, N.C.

Contreras Bravo, C. Tamayo-Agudelo, M.A. Gonzalez, P. Laissue, and D.J.

Fonseca Mendoza, Copy number variation profiling in pharmacogenetics

CYP-450 and GST genes in Colombian population, BMC Med. Genomics,

2019, 12(1), 110.

90. A. Gaedigk, A. Turner, R.E. Everts, S.A. Scott, P. Aggarwal, U. Broeckel,

G.A. McMillin, R. Melis, E.C. Boone, V.M. Pratt, and L.V. Kalman,

Characterization of reference materials for genetic testing of CYP2D6 alleles:

a GeT-RM collaborative project, J. Mol. Diagn., 2019, 21(6), 1034-1052.

91. Nguyễn Thị Hoàn, Vũ Chí Dũng, and Bùi Phương Thảo, Hai ca

phenylketouria đầu tiên ở Việt Nam được phát hiện tại bệnh viện Nhi trung

ương, Tạp chí nghiên cứu Y học, 2006, 44(4), 29-32.

92. Nguyễn Thu Hiền and Nguyễn Huy Hoàng, Phân tích cấu trúc 3D của một số

đột biến trên gen CYP11b1 được tìm thấy ở bệnh nhân tăng sản thượng thận

bẩm sinh tại Việt Nam, in Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2013. 2013:

Hà Nội. p. 87-91.

93. Trần Kiêm Hảo, Nguyễn Thị Hoàn, Nguyễn Thu Nhạn, Nguyễn Thị Phượng,

Vũ Chí Dũng, and Bùi Phương Thảo, Đặc điểm lâm sàng và xét nghiệm của

bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh ở trẻ gái, Tạp chí nghiên cứu Y học,

2005, 35(2), 99-104.

94. Nguyễn Thị Phương Mai, Vũ Chí Dũng, Hoàng Thị Thanh Mộc, and Ngô

Diễm Ngọc, Áp dụng kỹ thuật Multiplex PCR thay thế PCR cổ điển trong

126

phân tích gene dystrophin ở các bệnh nhân loạn dưỡng cơ Dunchenne, in Hội

nghị khoa học nhi khoa Việt-Úc lần V. 2007. p. 380-387.

95. Ngô Thị Phượng and Vũ Chí Dũng, Kết quả bước đầu phát hiện đột biến gen

gây bệnh loạn dưỡng cơ Dunchenne ở Việt Nam, Nhi khoa, 2002, Số đặc biệt

chào mừng 100 năm trường đại học Y Hà Nội và hội nghị nhi khoa toàn quốc

2002, 521-526.

96. Hoàng Văn Lương, Trần Văn Khoa, Nguyễn Duy Bắc, and Hồ Hữu Thọ,

Nghiên cứu chẩn đoán hội chứng Down bằng các locus trình tự lặp ngắn

(STR), Tạp chí Y học Việt Nam, 2009, 364(1), 42-48.

97. T.P.M. Nguyen, T.H. Nguyen, D.N. Ngo, C.D. Vu, T.K.L. Nguyen, V.H.

Nong, and H.H. Nguyen, A novel homozygous mutation IVS6+5G>T in

CYP11B1 gene in a Vietnamese patient with 11β-hydroxylase deficiency,

Gene, 2015, 565(2), 291-294.

98. Nguyen Thi Phuong Mai, Nguyen Thu Hien, Ngo Diem Ngoc, Vu Chi Dung,

Nguyen Thi Kim Lien, Nong Van Hai, and Nguyen Huy Hoang, A novel

homozygous mutation IVS6+5G>T in CYP11B1 gene in a Vietnamese patient

with 11beta-hydroxylase deficiency, Gene, 2015, 565(2), 291-294.

99. Lê Bắc Việt, Nguyễn Thị Phương Mai, and Nguyễn Huy Hoàng, Phát hiện 3

đột biến trên gen CYP21 ở bệnh nhân Việt Nam có hiện tượng tăng sản thượng

thận bẩm sinh, Tạp chí Sinh học, 2013, 35(2), 248-254.

100. Lê Hồng Công, Trần Huy Thịnh, Phạm Lê Anh Tuấn, Trần Vân Khánh, Phạm

Ngọc Minh, Ngô Thanh Tùng, and Tạ Thành Văn, Tính đa hình G4268C của

gen CYP2D6 trên bệnh nhân ung thư phổi, Tạp chí Y học, 2016, 100(2).

101. N.T. Vu, T.T.M. Nguyen, H.H. Trinh, L.H. Nguyen, T.L.H. Duong, T.H.N.

Pham, D.L. Dinh, and T.T. Vu, The effects of CYP2C19 genotype and other

factors on platelet aggregation in Vietnamese patients with acute coronary

syndrome, Academia Journal of Scientific Research, 2018, 6(4), 1.

102. S. Yamada, M. Onda, S. Kato, N. Matsuda, T. Matsuhisa, N. Yamada, M.

Miki, and N. Matsukura, Genetic differences in CYP2C19 single nucleotide

polymorphisms among four Asian populations, J. Gastroenterol., 2001, 36(10),

669-672.

127

103. M.I. Veiga, S. Asimus, P.E. Ferreira, J.P. Martins, I. Cavaco, V. Ribeiro, T.N.

Hai, M.G. Petzold, A. Bjorkman, M. Ashton, and J.P. Gil, Pharmacogenomics

of CYP2A6, CYP2B6, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4, CYP3A5 and MDR1 in

Vietnam, Eur. J. Clin. Pharmacol., 2009, 65(4), 355-363.

104. S.S. Lee, K.M. Kim, H. Thi-Le, S.S. Yea, I.J. Cha, and J.G. Shin, Genetic

polymorphism of CYP2C9 in a Vietnamese Kinh population, Ther. Drug

Monit., 2005, 27(2), 208-210.

105. S.S. Lee, S.J. Lee, J. Gwak, H.J. Jung, T.H. Le, I.S. Song, E.Y. Kim, and J.G.

Shin, Comparisons of CYP2C19 genetic polymorphisms between Korean and

Vietnamese populations, Ther. Drug Monit., 2007, 29(4), 455-459.

106. R.R. Love, Z. Desta, D. Flockhart, T. Skaar, E.T. Ogburn, A. Ramamoorthy,

G.B. Uy, A.V. Laudico, N. Van Dinh, H. Quang le, T. Van To, G.S. Young,

E. Hade, and D. Jarjoura, CYP2D6 genotypes, endoxifen levels, and disease

recurrence in 224 Filipino and Vietnamese women receiving adjuvant

tamoxifen for operable breast cancer, Springerplus, 2013, 2(1), 52.

107. E.Y. Kim, S.S. Lee, H.J. Jung, H.E. Jung, C.W. Yeo, J.H. Shon, and J.G. Shin,

Robust CYP2D6 genotype assay including copy number variation using

multiplex single-base extension for Asian populations, Clin. Chim. Acta, 2010,

411(23-24), 2043-2048.

108. T. Jin, X. Xun, S. Du, T. Geng, H. Wang, T. Feng, C. Chen, D. Yuan, and L.

Kang, Genetic polymorphisms analysis of drug-metabolizing enzyme CYP2C9

in the Uyghur population, Xenobiotica, 2016, 46(8), 709-714.

109. T. Jin, M. Zhang, H. Yang, T. Geng, N. Zhang, T. Feng, Y. Ma, D. Yuan, and

L. Kang, Genetic polymorphisms of the drug-metabolizing enzyme CYP2C19

in the Uyghur population in northwest China, Xenobiotica, 2016, 46(7), 634-

640.

110. M. Hersberger, J. Marti-Jaun, K. Rentsch, and E. Hanseler, Rapid detection of

the CYP2D6*3, CYP2D6*4, and CYP2D6*6 alleles by tetra-primer PCR and

of the CYP2D6*5 allele by multiplex long PCR, Clin. Chem., 2000, 46(8 Pt 1),

1072-1077.

111. A. Ahani, M.T. Akbari, K. Saliminejad, B. Behnam, M.M. Akhondi, P.

Vosoogh, F. Ghassemi, M. Naseripour, G. Bahoush, and H.R. Khorshid,

128

Screening for large rearrangements of the RB1 gene in Iranian patients with

retinoblastoma using multiplex ligation-dependent probe amplification, Mol.

Vis., 2013, 19, 454-462.

112. J.C. Barrett, B. Fry, J. Maller, and M.J. Daly, Haploview: analysis and

visualization of LD and haplotype maps, Bioinformatics, 2005, 21(2), 263-

265.

113. Y. Choi and A.P. Chan, PROVEAN web server: a tool to predict the functional

effect of amino acid substitutions and indels, Bioinformatics, 2015, 31(16),

2745-2747.

114. I. Adzhubei, D.M. Jordan, and S.R. Sunyaev, Predicting functional effect of

human missense mutations using PolyPhen-2, Curr Protoc Hum Genet, 2013,

Chapter 7, Unit7 20.

115. F.O. Desmet, D. Hamroun, M. Lalande, G. Collod-Beroud, M. Claustres, and

C. Beroud, Human Splicing Finder: an online bioinformatics tool to predict

splicing signals, Nucleic Acids Res., 2009, 37(9), e67.

116. A.E. Kel, E. Gossling, I. Reuter, E. Cheremushkin, O.V. Kel-Margoulis, and

E. Wingender, MATCH: A tool for searching transcription factor binding sites

in DNA sequences, Nucleic Acids Res., 2003, 31(13), 3576-3579.

117. A. Gaedigk, L.K. Jaime, J.S. Bertino, Jr., A. Berard, V.M. Pratt, L.D.

Bradfordand, and J.S. Leeder, Identification of Novel CYP2D7-2D6 Hybrids:

Non-Functional and Functional Variants, Front. Pharmacol., 2010, 1, 121.

118. T. Ota, Y. Kamada, M. Hayashida, K. Iwao-Koizumi, S. Murata, and K.

Kinoshita, Combination analysis in genetic polymorphisms of drug-

metabolizing enzymes CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 and CYP3A5

in the Japanese population, Int. J. Med. Sci., 2015, 12(1), 78-82.

119. J.W. Bae, C.I. Choi, M.J. Kim, D.H. Oh, S.K. Keum, J.I. Park, B.H. Kim, H.K.

Bang, S.G. Oh, B.S. Kang, H.J. Park, H.D. Kim, J.H. Ha, H.J. Shin, Y.H. Kim,

H.S. Na, M.W. Chung, C.G. Jang, and S.Y. Lee, Frequency of CYP2C9 alleles

in Koreans and their effects on losartan pharmacokinetics, Acta Pharmacol.

Sin., 2011, 32(10), 1303-1308.

120. Ngow HA, Wan Khairina WM, Teh LK, Lee WL, Harun R, Ismail R, and

Salleh MZ, CYP2C9 polymorphism: prevalence in healthy and warfarin-

129

treated Malay and Chinese in Malaysia, Singapore Med. J., 2009, 50(5), 490-

493.

121. T. Rusdiana, T. Araki, T. Nakamura, A. Subarnas, and K. Yamamoto,

Responsiveness to low-dose warfarin associated with genetic variants of

VKORC1, CYP2C9, CYP2C19, and CYP4F2 in an Indonesian population,

Eur. J. Clin. Pharmacol., 2013, 69(3), 395-405.

122. R. Nahar, R. Deb, R. Saxena, R.D. Puri, and I.C. Verma, Variability in

CYP2C9 allele frequency: a pilot study of its predicted impact on warfarin

response among healthy South and North Indians, Pharmacol. Rep., 2013,

65(1), 187-194.

123. N. Zand, N. Tajik, A.S. Moghaddam, and I. Milanian, Genetic polymorphisms

of cytochrome P450 enzymes 2C9 and 2C19 in a healthy Iranian population,

Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 2007, 34(1-2), 102-105.

124. Sükrü AA, Brockmöller J, Bauer S, Sachse C, Güzelbey P, Öngen Z, Nacak

M, and Roots I, Frequency of cytochrome P450 CYP2C9 variants in a Turkish

population and functional relevance for phenytoin, Br J Clin Pharmaco, 1999,

48(3), 409-415.

125. R.S. Pedersen, C. Brasch-Andersen, S.C. Sim, T.K. Bergmann, J. Halling,

M.S. Petersen, P. Weihe, H. Edvardsen, V.N. Kristensen, K. Brosen, and M.

Ingelman-Sundberg, Linkage disequilibrium between the CYP2C19*17 allele

and wildtype CYP2C8 and CYP2C9 alleles: identification of CYP2C

haplotypes in healthy Nordic populations, Eur. J. Clin. Pharmacol., 2010,

66(12), 1199-1205.

126. M.G. Scordo, A.P. Caputi, C. D'Arrigo, G. Fava, and E. Spina, Allele and

genotype frequencies of CYP2C9, CYP2C19 and CYP2D6 in an Italian

population, Pharmacol. Res., 2004, 50(2), 195-200.

127. Scott SA, Khasawneh R, Peter I, Kornreich R, and Desnick RJ, Combined

CYP2C9, VKORC1 and CYP4F2 frequencies among racial and ethnic groups,

Pharmacogenomics, 2010, 11(6), 781-791.

128. U.H. Fukushima, Y. Saito, K. Maekawa, S. Ozawa, R. Hasegawa, H. Kajio,

N. Kuzuya, K. Yasuda, M. Kawamoto, N. Kamatani, K. Suzuki, T. Yanagawa,

M. Tohkin, and J.I. Sawada, Genetic variations and haplotypes of CYP2C19

130

in a Japanese population, Drug Metab. Pharmacokinet., 2005, 20(4), 300-

307.

129. K.A. Kim, W.K. Song, K.R. Kim, and J.Y. Park, Assessment of CYP2C19

genetic polymorphisms in a Korean population using a simultaneous multiplex

pyrosequencing method to simultaneously detect the CYP2C19*2,

CYP2C19*3, and CYP2C19*17 alleles, J. Clin. Pharm. Ther., 2010, 35(6),

697-703.

130. C. Lingling, Q. Shengying, X. Jing, T. Jimin, Y. Lun, S. Wen, Z. Xinzhi, D.

Jing, H. Guang, F. Guoyin, H. Lin, and X. Qinghe, Genetic polymorphism

analysis of CYP2C19 in Chinese Han populations from different geographic

areas of mainland China, Pharmacogenomics, 2008, 9(6), 691-702.

131. Y.S. Yang, L.P. Wong, T.C. Lee, A.M. Mustafa, Z. Mohamed, and C. Lang

Chim, Genetic polymorphism of cytochrome P450 2C19 in healthy Malaysian

subjects, Br. J. Clin. Pharmacol., 2004, 58(3), 332-335.

132. W. Tassaneeyakul, W. Mahatthanatrakul, K. Niwatananun, K. Na-Bangchang,

A. Tawalee, N. Krikreangsak, U. Cykleng, and W. Tassaneeyakul, CYP2C19

genetic polymorphism in Thai, Burmese and Karen populations, Drug Metab.

Pharmacokinet., 2006, 21(4), 286-290.

133. S. Gulati, A. Yadav, N. Kumar, Kanupriya, G. Kumar, N. Aggarwal, and R.

Gupta, Frequency distribution of high risk alleles of CYP2C19, CYP2E1,

CYP3A4 genes in Haryana population, Environ. Toxicol. Pharmacol., 2014,

37(3), 1186-1193.

134. A.S. Aynacioglu, S. Christoph, B. Atilla, K. Selim, N. Muradiye, S. Thomas,

O.K. S, R. Ivar, and B. Jürgen, Low frequency of defective alleles of

cytochrome P450 enzymes 2C19 and 2D6 in the Turkish population, Clin.

Pharmacol. Ther., 1999, 66(2), 185-192.

135. M. Payan, N. Tajik, M.R. Rouini, and M.H. Ghahremani, Genotype and allele

frequency of CYP2C19*17 in a healthy Iranian population, Med. J. Islam.

Repub. Iran, 2015, 29, 269-269.

136. G. Tobias, S. Elke, D. Juergen, W. Stefan, B. Verena, B. Christian, Z.

Christine, M. Klaus, G. Meinrad, and S. Matthias, CYP2C19 and nongenetic

131

factors predict poor responsiveness to clopidogrel loading dose after coronary

stent implantation, Pharmacogenomics, 2008, 9(9), 1251-1259.

137. G. Ragia, K.I. Arvanitidis, A. Tavridou, and V.G. Manolopoulos, Need for

reassessment of reported CYP2C19 allele frequencies in various populations

in view of CYP2C19*17 discovery: the case of Greece, Pharmacogenomics,

2009, 10(1), 43-49.

138. S. Martis, I. Peter, J. Hulot, R. Kornreich, R.J. Desnick, and S.A. Scott, Multi-

ethnic distribution of clinically relevant CYP2C genotypes and haplotypes,

Pharmacogenomics J., 2013, 13(4), 369-377.

139. J.C. Qian, X.M. Xu, G.X. Hu, D.P. Dai, R.A. Xu, L.M. Hu, F.H. Li, X.H.

Zhang, J.F. Yang, and J.P. Cai, Genetic variations of human CYP2D6 in the

Chinese Han population, Pharmacogenomics, 2013, 14(14), 1731-1743.

140. M. Man, M. Farmen, C. Dumaual, C.H. Teng, B. Moser, S. Irie, G.J. Noh, R.

Njau, S. Close, S. Wise, and R. Hockett, Genetic variation in metabolizing

enzyme and transporter genes: comprehensive assessment in 3 major East

Asian subpopulations with comparison to Caucasians and Africans, J. Clin.

Pharmacol., 2010, 50(8), 929-940.

141. P. Suwannasri, W. Thongnoppakhun, P. Pramyothin, A. Assawamakin, and C.

Limwongse, Combination of multiplex PCR and DHPLC-based strategy for

CYP2D6 genotyping scheme in Thais, Clin. Biochem., 2011, 44(13), 1144-

1152.

142. S. Buch, A. Kotekar, D. Kawle, and R. Bhisey, Polymorphisms at CYP and

GST gene loci. Prevalence in the Indian population, Eur. J. Clin. Pharmacol.,

2001, 57(6-7), 553-555.

143. A. Weber, R. Szalai, C. Sipeky, L. Magyari, M. Melegh, L. Jaromi, P. Matyas,

B. Duga, E. Kovesdi, K. Hadzsiev, and B. Melegh, Increased prevalence of

functional minor allele variants of drug metabolizing CYP2B6 and CYP2D6

genes in Roma population samples, Pharmacol. Rep., 2015, 67(3), 460-464.

144. C. De Luca, M.G. Scordo, E. Cesareo, S. Pastore, S. Mariani, G. Maiani, A.

Stancato, B. Loreti, G. Valacchi, C. Lubrano, D. Raskovic, L. De Padova, G.

Genovesi, and L.G. Korkina, Biological definition of multiple chemical

sensitivity from redox state and cytokine profiling and not from

132

polymorphisms of xenobiotic-metabolizing enzymes, Toxicol. Appl.

Pharmacol., 2010, 248(3), 285-292.

145. A. Kapedanovska Nestorovska, K. Jakovski, Z. Naumovska, M. Hiljadnikova

Bajro, Z. Sterjev, A. Eftimov, N. Matevska Geskovska, L. Suturkova, K.

Dimitrovski, N. Labacevski, and A.J. Dimovski, Distribution of the most

common genetic variants associated with a variable drug response in the

population of the Republic of Macedonia, Balkan J. Med. Genet., 2014, 17(2),

5-14.

146. K. Arvanitidis, G. Ragia, M. Iordanidou, S. Kyriaki, A. Xanthi, A. Tavridou,

and V.G. Manolopoulos, Genetic polymorphisms of drug-metabolizing

enzymes CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 and CYP3A5 in the Greek population,

Fundam. Clin. Pharmacol., 2007, 21(4), 419-426.

147. J.O. Rasmussen, M. Christensen, J.M. Svendsen, O. Skausig, E.L. Hansen,

and K.A. Nielsen, CYP2D6 gene test in psychiatric patients and healthy

volunteers, Scand. J. Clin. Lab. Invest., 2006, 66(2), 129-136.

148. H. Buzkova, K. Pechandova, O. Slanar, and F. Perlik, Frequency of single

nucleotide polymorphisms of CYP2D6 in the Czech population, Cell Biochem.

Funct., 2008, 26(1), 76-81.

149. H.R. Luo, A. Gaedigk, V. Aloumanis, and Y.J. Wan, Identification of CYP2D6

impaired functional alleles in Mexican Americans, Eur. J. Clin. Pharmacol.,

2005, 61(11), 797-802.

150. D.C. Friedrich, J.P. Genro, V.A. Sortica, G. Suarez-Kurtz, M.E. de Moraes,

S.D. Pena, A.K. dos Santos, M.A. Romano-Silva, and M.H. Hutz, Distribution

of CYP2D6 alleles and phenotypes in the Brazilian population, PLoS One,

2014, 9(10), e110691.

151. M. Jurima-Romet, B.C. Foster, W.L. Casley, A. Rode, P. Vloshinsky, H.S.

Huang, and S. Geertsen, CYP2D6-related oxidation polymorphism in a

Canadian Inuit population, Can. J. Physiol. Pharmacol., 1997, 75(3), 165-

172.

152. N. Varela, L.A. Quinones, J. Stojanova, J. Garay, D. Caceres, S. Cespedes, J.

Sasso, and C. Miranda, Characterization of the CYP2D6 drug metabolizing

133

phenotypes of the Chilean mestizo population through polymorphism

analyses, Pharmacol. Res., 2015, 101, 124-129.

153. S. Yi, H. An, H. Lee, S. Lee, I. Ieiri, Y. Lee, J.Y. Cho, T. Hirota, M. Fukae,

K. Yoshida, S. Nagatsuka, M. Kimura, S. Irie, Y. Sugiyama, D.W. Shin, K.S.

Lim, J.Y. Chung, K.S. Yu, and I.J. Jang, Korean, Japanese, and Chinese

populations featured similar genes encoding drug-metabolizing enzymes and

transporters: a DMET Plus microarray assessment, Pharmacogenet.

Genomics, 2014, 24(10), 477-485.

154. J. Sistonen, S. Fuselli, J.U. Palo, N. Chauhan, H. Padh, and A. Sajantila,

Pharmacogenetic variation at CYP2C9, CYP2C19, and CYP2D6 at global

and microgeographic scales, Pharmacogenet. Genomics, 2009, 19(2), 170-

179.

155. N. von Ahsen, M. Tzvetkov, H.A. Karunajeewa, S. Gomorrai, A. Ura, J.

Brockmoller, T.M. Davis, I. Mueller, K.F. Ilett, and M. Oellerich, CYP2D6

and CYP2C19 in Papua New Guinea: High frequency of previously

uncharacterized CYP2D6 alleles and heterozygote excess, Int. J. Mol.

Epidemiol. Genet., 2010, 1(4), 310-319.

156. A. Gaedigk, L.D. Bradford, K.A. Marcucci, and J.S. Leeder, Unique CYP2D6

activity distribution and genotype-phenotype discordance in black Americans,

Clin. Pharmacol. Ther., 2002, 72(1), 76-89.

157. T.M. Dodgen, J.L.C. De, A. van Schalkwyk, F.E. Steffens, A. Gaedigk, A.D.

Cromarty, M. Alessandrini, and M.S. Pepper, Pharmacogenetic comparison

of CYP2D6 predictive and measured phenotypes in a South African cohort,

Pharmacogenomics J., 2017, 17(4), 393.

158. C. Dandara, C.M. Masimirembwa, A. Magimba, J. Sayi, S. Kaaya, D.K.

Sommers, J.R. Snyman, and J.A. Hasler, Genetic polymorphism of CYP2D6

and CYP2C19 in east- and southern African populations including psychiatric

patients, Eur. J. Clin. Pharmacol., 2001, 57(1), 11-17.

159. S.M. Hashemi-Soteh, F. Sarzare, F. Merat, E. Salehifar, and M.R. Shiran,

Frequencies of three CYP2D6 nonfunctional alleles (CYP2D6*3, *4, and *6)

within an Iranian population (Mazandaran), Genet. Test. Mol. Biomarkers,

2011, 15(11), 821-825.

134

160. M.S. Al-Dosari, F.I. Al-Jenoobi, K.M. Alkharfy, A.M. Alghamdi, K.M.

Bagulb, M.K. Parvez, A.M. Al-Mohizea, S. Al-Muhsen, and R. Halwani, High

prevalence of CYP2D6*41 (G2988A) allele in Saudi Arabians, Environ.

Toxicol. Pharmacol., 2013, 36(3), 1063-1067.

161. C.H. Liu, K. Peck, J.D. Huang, M.S. Lin, C.H. Wang, W.P. Hsu, H.W. Wang,

H.L. Lee, and M.L. Lai, Screening CYP3A single nucleotide polymorphisms

in a Han Chinese population with a genotyping chip, Pharmacogenomics,

2005, 6(7), 731-747.

162. M. Hiratsuka, Y. Takekuma, N. Endo, K. Narahara, S. Ismail Hamdy, Y.

Kishikawa, M. Matsuura, Y. Agatsuma, T. Inoue, and M. Mizugaki, Allele and

genotype frequencies of CYP2B6 and CYP3A5 in the Japanese population,

Eur. J. Clin. Pharmacol., 2002, 58(6), 417-421.

163. Y.J. Lim, E.Y. Cha, H.E. Jung, J.L. Ghim, S.J. Lee, E.Y. Kim, and J.G. Shin,

Genetic polymorphisms of CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4, and

CYP3A5 in Vietnamese-Koreans, Transl Clin Pharmacol, 2014, 22(2), 70-77.

164. D. Krishnakumar, U. Gurusamy, K. Dhandapani, A. Surendiran, R. Baghel, R.

Kukreti, R. Gangadhar, U. Prayaga, S. Manjunath, and C. Adithan, Genetic

polymorphisms of drug‐metabolizing phase I enzymes CYP2E1, CYP2A6 and

CYP3A5 in South Indian population, Fundam. Clin. Pharmacol., 2012, 26(2),

295-306.

165. R. Hassan, S. Sadia Ameen, A. Al Maruf, A. Nandini, H. Tabin, M. Ahmed,

M. Islam, M. Shahdaat Bin Sayeed, and A. Hasnat, Genotype-phenotype

variability in human CYP3A locus in Nepalese people residing in Bangladesh,

Int. J. Clin. Pharmacol. Ther., 2013, 51(3), 207-214.

166. K. Veerakikosol, P. Chariyavilaskul, N. Townamchai, and S.

Wittayalertpanya, Association of CYP3A5 and POR polymorphisms with the

maintenance tacrolimus dosage requirement in Thai recipients of kidney

transplants, Asian Biomedicine, 2016, 10(5), 483-490.

167. R. Ankathil, A.A. Zian, Z.M. Nizam, H. Azlan, and A.A. Baba, P0223

CYP3A4∗ 18 and CYP3A5∗ 3 gene polymorphisms and imatinib resistance in

Malaysian patients with chronic myeloid leukaemia, Eur. J. Cancer, 2014, 50,

e71-e72.

135

168. E.M.S. Hodel, C. Csajka, F. Ariey, M. Guidi, A.M. Kabanywanyi, S. Duong,

L.A. Decosterd, P. Olliaro, H.-P. Beck, and B. Genton, Effect of single

nucleotide polymorphisms in cytochrome P450 isoenzyme and N-

acetyltransferase 2 genes on the metabolism of artemisinin-based combination

therapies in malaria patients from Cambodia and Tanzania, Antimicrob.

Agents Chemother., 2013, 57(2), 950-958.

169. H. Kayilioğlu, U. Kocak, D. Kan, E. F. Percin, E. Sal, F. Tekkeşin, M. Isik, N.

Oner, B. Belen, E. Keskin, A. Okur, M. Albayrak, Z. Kaya, F. Pinarli, I.

Yenicesu, C. Karadeniz, A. Oguz, and T. Gursel, Association of CYP3A5

expression and vincristine neurotoxicity in pediatric malignancies in Turkish

population, J. Pediatr. Hematol. Oncol., 2017, 39(6), 458-462.

170. N. Azarpira, S. Namazi, A. Khalili, and M. Tabesh, The investigation of allele

and genotype frequencies of CYP3A5 (1*/3*) and P2Y12 (T744C) in Iran,

Mol. Biol. Rep., 2010, 38(8), 4873-4877.

171. V. Bhatnagar, P.E. Garcia, T.D. O'Connor, V. Brophy, J. Alcaraz, E. Richard,

G. Bakris, P.J. Middleton, K. Norris, J. Wright, L. Hiremath, G. Contreras,

J.L. Appel, and M. Lipkowitz, CYP3A4 and CYP3A5 polymorphisms and

blood pressure response to amlodipine among African-American men and

women with early hypertensive renal disease, Am. J. Nephrol., 2009, 31(2),

95-103.

172. A. Adehin, O. Bolaji, and M. Kennedy, Polymorphisms in CYP2C8 and

CYP3A5 genes in the Nigerian population, Drug Metab. Pharmacokinet.,

2016, 32(3), 189-191.

173. L. Wojnowski, P. Turner, B. Pedersen, E. Hustert, J. Brockmöller, M. Mendy,

C.H. Whittle, G. Kirk, and P.C. Wild, Increased levels of aflatoxin-albumin

adducts are associated with CYP3A5 polymorphisms in The Gambia, West

Africa, Pharmacogenet. Genomics, 2004, 14(10), 691-700.

174. C. Dandara, R. Ballo, and M. Parker, CYP3A5 genotypes and risk of

esophageal cancer in two South African populations, Cancer Lett., 2005,

225(2), 275-282.

136

175. J.S. Plummer, V.D. Conti, L.P. Paris, A. Curran, G. Casey, and S.J. Witte,

CYP3A4 and CYP3A5 genotypes, haplotypes, and risk of prostate cancer,

Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 2003, 12(9), 928-932.

176. H. Dally, H. Bartsch, B. Jäger, L. Edler, P. Schmezer, B. Spiegelhalder, H.

Dienemann, P. Drings, K. Kayser, V. Schulz, and A. Risch, Genotype

relationships in the CYP3A locus in Caucasians, Cancer Lett., 2004, 207(1),

95-99.

177. K. Kurose, E. Sugiyama, and Y. Saito, Population differences in major

functional polymorphisms of pharmacokinetics/pharmacodynamics-related

genes in Eastern Asians and Europeans: implications in the clinical trials for

novel drug development, Drug Metab. Pharmacokinet., 2012, 27(1), 9-54.

178. G.Y. Ang, C.Y. Yu, V. Subramaniam, M.I. Abdul Khalid, T.A. Tuan Abdu

Aziz, R. Johari James, A. Ahmad, T. Abdul Rahman, F. Mohd Nor, A.I.

Ismail, K. Md Isa, H. Salleh, L.K. Teh, and M.Z. Salleh, Detection of

CYP2C19 genetic variants in Malaysian Orang Asli from massively parallel

sequencing data, PLoS One, 2016, 11(10), e0164169.

179. M.G. Scordo, E. Aklillu, U. Yasar, M.L. Dahl, E. Spina, and M. Ingelman-

Sundberg, Genetic polymorphism of cytochrome P450 2C9 in a Caucasian

and a black African population, Br. J. Clin. Pharmacol., 2001, 52(4), 447-

450.

180. L. Chen, S. Qin, J. Xie, J. Tang, L. Yang, W. Shen, X. Zhao, J. Du, G. He, G.

Feng, L. He, and Q. Xing, Genetic polymorphism analysis of CYP2C19 in

Chinese Han populations from different geographic areas of mainland China,

Pharmacogenomics, 2008, 9(6), 691-702.

181. J. Sistonen, A. Sajantila, O. Lao, J. Corander, G. Barbujani, and S. Fuselli,

CYP2D6 worldwide genetic variation shows high frequency of altered activity

variants and no continental structure, Pharmacogenet. Genomics, 2007, 17(2),

93-101.

182. R.C. Givens, Y.S. Lin, A.L. Dowling, K.E. Thummel, J.K. Lamba, E.G.

Schuetz, P.W. Stewart, and P.B. Watkins, CYP3A5 genotype predicts renal

CYP3A activity and blood pressure in healthy adults, J Appl Physiol (1985),

2003, 95(3), 1297-1300.

137

183. E.E. Thompson, H. Kuttab-Boulos, D. Witonsky, L. Yang, B.A. Roe, and A.

Di Rienzo, CYP3A variation and the evolution of salt-sensitivity variants, Am.

J. Hum. Genet., 2004, 75(6), 1059-1069.

184. I. Johansson and M. Ingelman-Sundberg, CNVs of human genes and their

implication in pharmacogenetics, Cytogenet. Genome Res., 2008, 123(1-4),

195-204.

185. L. Stuppia, I. Antonucci, G. Palka, and V. Gatta, Use of the MLPA assay in

the molecular diagnosis of gene copy number alterations in human genetic

diseases, Int. J. Mol. Sci., 2012, 13(3), 3245-3276.

186. K.E. Caudle, A.E. Rettie, M. Whirl-Carrillo, L.H. Smith, S. Mintzer, M.T.

Lee, T.E. Klein, J.T. Callaghan, and C. Clinical Pharmacogenetics

Implementation, Clinical pharmacogenetics implementation consortium

guidelines for CYP2C9 and HLA-B genotypes and phenytoin dosing, Clin.

Pharmacol. Ther., 2014, 96(5), 542-548.

187. L. Dean, Warfarin therapy and VKORC1 and CYP genotype, in Medical

Genetics Summaries, V.M. Pratt, et al., Editors. 2012: Bethesda (MD).

188. B. Jin, H.C. Ni, W. Shen, J. Li, H.M. Shi, and Y. Li, Cytochrome P450 2C19

polymorphism is associated with poor clinical outcomes in coronary artery

disease patients treated with clopidogrel, Mol. Biol. Rep., 2011, 38(3), 1697-

1702.

189. L. Mao, C. Jian, L. Changzhi, H. Dan, H. Suihua, T. Wenyi, and W. Wei,

Cytochrome CYP2C19 polymorphism and risk of adverse clinical events in

clopidogrel-treated patients: a meta-analysis based on 23,035 subjects, Arch.

Cardiovasc. Dis., 2013, 106(10), 517-527.

190. O.Q. Yin, Y.K. Wing, Y. Cheung, Z.J. Wang, S.L. Lam, H.F. Chiu, and M.S.

Chow, Phenotype-genotype relationship and clinical effects of citalopram in

Chinese patients, J. Clin. Psychopharmacol., 2006, 26(4), 367-372.

191. S.A. Scott, K. Sangkuhl, C.M. Stein, J.S. Hulot, J.L. Mega, D.M. Roden, T.E.

Klein, M.S. Sabatine, J.A. Johnson, A.R. Shuldiner, and C. Clinical

Pharmacogenetics Implementation, Clinical Pharmacogenetics

Implementation Consortium guidelines for CYP2C19 genotype and

138

clopidogrel therapy: 2013 update, Clin. Pharmacol. Ther., 2013, 94(3), 317-

323.

192. K.R. Crews, A. Gaedigk, H.M. Dunnenberger, J.S. Leeder, T.E. Klein, K.E.

Caudle, C.E. Haidar, D.D. Shen, J.T. Callaghan, S. Sadhasivam, C.A. Prows,

E.D. Kharasch, T.C. Skaar, and C. Clinical Pharmacogenetics

Implementation, Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium

guidelines for cytochrome P450 2D6 genotype and codeine therapy: 2014

update, Clin. Pharmacol. Ther., 2014, 95(4), 376-382.

193. J.K. Hicks, K. Sangkuhl, J.J. Swen, V.L. Ellingrod, D.J. Muller, K. Shimoda,

J.R. Bishop, E.D. Kharasch, T.C. Skaar, A. Gaedigk, H.M. Dunnenberger,

T.E. Klein, K.E. Caudle, and J.C. Stingl, Clinical pharmacogenetics

implementation consortium guideline (CPIC) for CYP2D6 and CYP2C19

genotypes and dosing of tricyclic antidepressants: 2016 update, Clin.

Pharmacol. Ther., 2017, 102(1), 37-44.

194. K.A. Birdwell, B. Decker, J.M. Barbarino, J.F. Peterson, C.M. Stein, W.

Sadee, D. Wang, A.A. Vinks, Y. He, J.J. Swen, J.S. Leeder, R. van Schaik,

K.E. Thummel, T.E. Klein, K.E. Caudle, and I.A. MacPhee, Clinical

Pharmacogenetics Implementation Consortium (CPIC) Guidelines for

CYP3A5 Genotype and Tacrolimus Dosing, Clin. Pharmacol. Ther., 2015,

98(1), 19-24.

PHỤ LỤC

Mục lục phụ lục

Phụ lục 1: Danh sách mẫu sử dụng trong nghiên cứu và nồng độ DNA tổng số

Phụ lục 2: Đánh giá trạng thái cân bằng quần thể của các biến thể trên CYP2C9

Phụ lục 3. Đánh giá trạng thái cân bằng quần thể của các biến thể trên CYP2C19

Phụ lục 4. Đánh giá trạng thái cân bằng quần thể của các biến thể trên CYP2D6

Phụ lục 5. Trình tự mồi sử dụng cho phản ứng LR-PCR

Phụ lục 6. Trình tự mồi sử dụng cho phản ứng giải trình tự Sanger

Phụ lục 7. Dữ liệu MLPA về CNV gen CYP2D6 của một số mẫu trong nghiên cứu

Phụ lục 8. Tổng hợp số liệu về kiểu gen và kiểu hình chuyển hóa thuốc của các

gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 trên các mẫu nghiên cứu

Phụ lục 1: Danh sách mẫu sử dụng trong nghiên cứu và nồng độ DNA tổng số

STT Mã mẫu

Dân tộc

Tình trạng sức khỏe Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường

Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh

Giới tính Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ

FVN01 FVN02 FVN03 FVN04 FVN05 FVN06 FVN07 FVN08 FVN09 FVN10 FVN11 FVN12 FVN13 FVN14 FVN15 FVN16 FVN17 FVN18 FVN19 FVN20 FVN21 FVN22 FVN23 FVN24 FVN25 FVN26 FVN27 FVN28 FVN29 FVN30 FVN31 FVN32 FVN33 FVN34 FVN35 FVN36 FVN37

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37

Nồng độ DNA tổng số (ng/μl) 49,6 62,3 49,4 49,3 39,5 32,4 52 35,7 38,7 40,9 29,8 30,7 35,5 67,1 34,5 46,1 24 25,4 42,1 38,6 64 38,5 53,3 54,1 49,4 24,2 28,9 42,5 37,7 36,4 35,8 63,4 22,7 57 27,5 34,2 40,5

26,7 22 23,8 27,6 28,5 23,2 38,5 35,9 40,5 51,2 50,7 51,2 53,6 58,6 96,8 118,3 80,9 69,7 64,7

45 29,3 61,9 89,9 77,5 62,8 58,2 65,6 54,3 52,8 70,9 42,4 40,2 68,8 51,1 60 139,6 43,8 43,5 58,1 54,9

Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường

Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ

38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77

Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh

FVN38 FVN39 FVN40 FVN41 FVN42 FVN43 FVN44 FVN45 FVN46 FVN47 FVN48 FVN49 FVN50 FVN51 FVN52 FVN53 FVN54 FVN55 FVN56 FVN75 FVN77 FVN78 FVN79 FVN80 FVN82 FVN83 FVN84 FVN85 FVN86 FVN87 FVN89 FVN90 FVN91 FVN92 FVN93 FVN95 FVN96 FVN97 FVN98 FVN99

76,8 87,6 114,2

Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường

Nữ Nữ Nữ Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam

Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh

55,7 25,4 38,3 42,2 39,3 19,4 53,4 42,6 33,6 29,7 53,8 68,6 21,7 123,1 94,8 106,5 44,7 40 57,8 106,7 55,6 88,5 60,1 113,9 111,6 92,2 83 73,1 152,9 44,5 94,9 74,7 26,6 26,1 92,6 51,2 129,5

FVN111 78 FVN112 79 FVN113 80 FVN114 81 MVN01 82 MVN03 83 MVN 04 84 MVN 05 85 MVN 06 86 MVN 7 87 MVN 8 88 MVN 9 89 MVN 10 90 MVN 11 91 MVN 12 92 MVN 13 93 MVN 14 94 MVN 15 95 MVN 16 96 MVN 17 97 MVN 18 98 99 MVN 19 100 MVN 20 101 MVN 21 102 MVN 22 103 MVN 23 104 MVN 24 105 MVN 25 106 MVN 26 107 MVN 27 108 MVN 28 109 MVN 29 110 MVN 30 111 MVN 31 112 MVN 32 113 MVN 33 114 MVN 34 115 MVN 35 116 MVN 36 117 MVN 37

44,1 36,6 27,7 84,3 116,6 115,2 90 86,7 29,8 31,7 25,5 40,7 30 35 43,8 53,6 58,1

32,6 40,8

Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường

Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nam

Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh Kinh

118 MVN 38 119 MVN 39 120 MVN 40 121 MVN 41 122 MVN 42 123 MVN 43 124 MVN 44 125 MVN 45 126 MVN 46 127 MVN 47 128 MVN 48 129 MVN 49 130 MVN 50 131 MVN 51 132 MVN 52 133 MVN 53 134 MVN 54 135 MVN 55 136 MVN 56

Phụ lục 2. Đánh giá trạng thái cân bằng quần thể của các biến thể trên CYP2C9

STT Name Position ObsHET PredHET HWpval

1 251T>C 251 0 0,02 0,0101

2 3235G>C 3235 0,01 0,01 1

3 3411T>C 3411 0,01 0,01 1

4 3415C>T 3415 0,01 0,01 1

5 9032G>C 9032 0,05 0,049 1

6 10311A>G 10311 0,06 0,058 1

7 10376T>C 10376 0,01 0,01 1

8 33622T>C 33622 0,01 0,01 1

9 38658A>G 38658 0,01 0,01 1

10 42614A>C 42614 0,07 0,068 1

11 42627C>A 42627 0,02 0,02 1

12 42726C>T 42726 0,06 0,058 1

13 42801A>G 42801 0,01 0,01 1

14 47543delT 47543 0 0 1

Phụ lục 3. Đánh giá trạng thái cân bằng quần thể của các biến thể trên CYP2C19

STT Name Position ObsHET PredHET HWpval

(-)806C>T -806 0,02 0,02 1 1

(-)98T>C -98 0,398 0,354 0,3679 2

12637C>G 12637 0,01 0,01 1 3

12662A>G 12662 0,326 0,3161 0,37 4

17948G>A 17948 0,061 0,059 1 5

19154G>A 19154 0,35 0,326 0,727 6

57637delG 57637 0 0 1 7

57678T>G 57678 0,01 0,01 1 8

57740C>G 57740 0,394 0,351 0,3839 9

80160C>T 80160 0,36 0,2769 0,41 10

80161A>G 80161 0,058 0,06 1 11

87106T>C 87160 0,439 0,9749 0,43 12

87313A>C 87313 0,068 0,07 1 13

90008C>T 90008 0,01 0,01 1 14

Phụ lục 4. Đánh giá trạng thái cân bằng quần thể của các biến thể trên CYP2D6

STT Name Position ObsHET PredHET HWpval

0,178 -740 1 (-740) C>T 0,8467 0,186

0,193 -678 2 (-678) G>A 0,1204 0,231

0,096 -498 3 (-498) C>A 0,034 0,131

0,007 -184 4 (-184) A>T 1 0,007

0,074 -175 5 (-175) A>T 1 0,071

0,311 100 6 100C>T 0,449 7.00E-04

0 137 7 137insT 0 0

0,17 214 8 214G>C 0,18 0,7685

0,176 221 9 221C>A 0,8386 0,185

0,147 223 10 223C>G 0,5393 0,161

0,176 227 11 227T>C 0,4066 0,196

0,206 232 12 232G>C 0,085 0,251

0,147 233 13 233A>C 0,0221 0,196

0,14 245 14 245A>G 0,4715 0,155

0,132 310 15 310G>T 0,327 3,98E-10

0,221 1039 16 1039C>T 0,409 3,43E-07

0,301 1661 17 1661G>C 0,1787 0,348

0,015 1759 18 1759G>A 1 0,015

0,022 1846 19 1846G>A 1 0,022

0,353 2097 20 2097A>G 0,0275 0,443

0,007 2137 21 2137G>C 1 0,007

0,022 2607 22 2607G>A 0,05 0,0029

0,007 2611 23 2611T>A 1 0,007

24 2851C>T 0,213 2851 0,256 0,1084

25 2988G>A 0,044 2988 0,043 1

26 3157G>T 0,007 3157 0,007 1

27 3384A>C 0,14 3384 0,486 1,40E-17

28 3790C>T 0,051 3790 0,34 1,33E-20

29 3851G>A 0,015 3851 0,015 1

30 4181G>C 0,082 4181 0,49 1,92E-24

Phụ lục 5. Trình tự mồi sử dụng cho phản ứng LR-PCR

(Tham khảo từ Hersberger và cộng sự, 2000)

Tên mồi Vị trí Trình tự mồi Vị trí

Dup 43 5'-CACACCGGGCACCTGTACTCCTCA-3' 66

Dlow 7846 5'-CAGGCATGAGCTAAGGCACCCAGAC-3' 7822

DPKup -259 5'-GTTATCCCAGAAGGCTTTGCAGGCTTCA-3' -232

Vị trí của các mồi được đánh số dựa trên trình tự tham chiếu của gen CYP2D6 (GenBank Accession No. M33388). Riêng mồi Dup nằm ở vùng nối giữa 2 gen CYP2D7 và CYP2D6 (GenBank Accession No. X90926).

DPKlow 4844 5'-GCCGACTGAGCCCTGGGAGGTAGGTA-3' 4819

Phụ lục 6. Trình tự mồi sử dụng cho phản ứng giải trình tự Sanger

Gen Vùng gen Trình tự mồi

Promoter 5'-AGGGGGTTTAATGGTAAAGGTGT-3' Exon 1 5'-TGCTGACCAGATCCCACAATA-3'

5'-GCAAGTATAATCATCATCATGGTTTCTATT-3' Exon 2

Exon 3 5'-CTCTCAGCTTCAAACCCCC-3'

Exon 4 5'-ATGCATGCCGAACTCTTTTT-3' CYP2C9 Exon 5 5'-CAATAAAAATTTCCCCATCAAGA-3'

Exon 6 5'-TTTGGGCAAGTTGGTCTACA-3'

Exon 7 5'-CACATTTGTGCATCTGTAACCA-3'

Exon 8 5'-TGGAAATGGTACTGCCCTTC-3'

Exon 9 5'-CCCATCCACCCATCTATCTC-3'

Promoter 5'-TCCTGCCTTCACGTGTTTTT-3' Exon 1 5'-TAGTGGGCCTAGGTGATTGG-3'

Exon 2

CYP2C19 Exon 3 5'-AGTCAGGCTTAGTAAATGGA-3' 5'-ATCTCCCTCCTAGTTTCGT-3'

Exon 4 5'-ATGCATGCCAAACTCTTTTT-3'

Exon 5 5'-CAATAAAAATTTCCCCATCAAGA-3'

Exon 6 5'-AGCCAAAGACAAAAACCACATC-3'

Exon 7 5'-TGATGTTTGGATACCTTCATCAT-3'

Exon 8 5'-CTGCTCTTCTTTGGAATGGTG-3'

Exon 9 5'-GATGACGGGTCAGAAGAAGC-3'

Exon 2

Exon 3

Exon 4 CYP2D6 Exon 5

Promoter 5'-CCAGTGCTTCTAGCCCCATA-3' 5'-ACTGGCAGCACAGTCAACAC-3' Exon 1 5'-CTCCTTCCACCTGCTCACTC-3' 5'-CAAGGTGGATGCACAAAGAG-3' 5'-AAGAAGTCGCTGGAGCAGTG-3' 5'-GGCCAAGGACTCTGTACCTCCTA-3' 5'-GGCAGAGATGGAGGTGA-3' Exon 6

Exon 7 5'-CGTGAGCCCATCTGGGAAA-3'

Exon 8 5'-CAGCAGGGAGGTGAAGAAGA-3'

Exon 9

*3 *6 5'-TGCTCAGCCTCAACGTACCCCT-3' 5'-CTTGCAGCATTTAGTCCTTGTGAG-3' 5'-GACAGCTAAAGTGGTGAGGG-3' CYP3A5 *8 5'-CTTGACCATTCCAGTTCCTGA-3'

*9 5'-ATG CTT CTGCCAGTAGCAAC-3'

Phụ lục 7. Dữ liệu MLPA về CNV gen CYP2D6 của một số mẫu trong nghiên cứu

Vị trí đầu dò của kit MLPA cho CYP2D6 và các tỉ lệ sau chuẩn hóa (Final ratio) Tên mẫu

Exon 1 Exon 5 Exon 6 Exon 9

1,65 1,59 1,65 1,07 FVN19

0,95 0,81 1 1,01 FVN22

1,01 0,86 0,93 0,99 FVN23

1,63 1,35 1,58 0,91 FVN30

0,74 0,73 0,7 1,39 FVN50

0,38 0,41 0,36 0,49 FVN69

1,56 1,58 1,54 1,02 FVN74

0,62 0,57 0,94 0,77 FVN76

0,77 0,71 0,72 1,41 FVN86

1,47 1,45 1,49 0,56 FVN87

0,43 0,46 0,46 0,64 FVN92

1,37 1,47 1,57 0,53 FVN94

1,96 1,85 1,94 0,96 MVN 03

0,58 0,48 0,55 0,63 MVN 09

0,67 0,61 0,6 0 MVN 26

1,83 1,76 1,69 1,07 MVN 37

1,03 0,97 1,05 1 MVN 41

Các vị trí đầu dò đánh dấu màu vàng: tăng số bản sao CYP2D6

Các vị trí đầu dò dánh dấu màu xanh: mất số bản sao của CYP2D6

1 1 0,99 1,07 MVN 42

Phụ lục 8. Tổng hợp số liệu về kiểu gen và kiểu hình chuyển hóa thuốc của các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 trên các mẫu

nghiên cứu

CYP2C9

CYP2C19

CYP2D6

CYP3A5

STT Mã mẫu

Kiểu gen

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

FVN01 FVN02 FVN03 FVN04 FVN05 FVN06 FVN07 FVN08 FVN09 FVN10 FVN11 FVN12 FVN13 FVN14 FVN15 FVN16 FVN17 FVN18 FVN19 FVN20 FVN21

Kiểu gen *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*3 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1

Kiểu hình EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM IM EM EM EM EM EM EM EM EM

Kiểu gen *1/*3 *1/*1 *1/*1 *1/*2 *1/*2 *1/*2 *1/*2 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*3 *1/*1 *1/*1 *1/*3 *1/*1 *1/*2 *1/*2 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*2

Kiểu hình IM EM EM IM IM IM IM EM EM EM IM EM EM IM EM IM IM EM EM EM IM

*10/*15 *10/*10 *60/*60 *1/*10 *5/*10 *10/*10 *5/*36-*10 *10/*10 *2/*10 *1/*1 *10/*36-*10 *2/*10 *10/*36-*10 *1/*10 *10/*10 *2/*68-*4 *10/*10 *10/*10 *10/*36-*10 *5/*36-*10 *1/*2

Kiểu hình IM IM PM IM IM IM ND IM ND EM ND ND ND IM IM ND IM IM ND ND EM

Kiểu gen *1/*3 *1/*3 *1/*3 *1/*3 *3/*3 *1/*3 *3/*3 *1/*3 *3/*3 *1/*3 *3/*3 *3/*3 *3/*3 *1/*3 *1/*3 *1/*1 *1/*3 *1/*3 *3/*3 *3/*3 *1/*3

Kiểu hình IM IM IM IM PM IM PM IM PM IM PM PM PM IM IM EM IM IM PM PM IM

22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48

FVN22 FVN23 FVN24 FVN25 FVN26 FVN27 FVN28 FVN29 FVN30 FVN31 FVN32 FVN33 FVN34 FVN35 FVN36 FVN37 FVN38 FVN39 FVN40 FVN41 FVN42 FVN43 FVN44 FVN45 FVN46 FVN47 FVN48

*1/*3 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*3 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1

IM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM IM EM EM EM EM EM EM EM EM EM

*1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*2 *1/*3 *1/*1 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*1 *1/*2 *2/*2 *1/*1 *1/*1 *2/*2 *1/*1 *1/*1 *1/*1

EM IM EM IM IM EM EM IM EM IM EM IM EM EM IM EM IM EM EM IM PM EM EM PM EM EM EM

*10/*10 *1/*2 *10/*10 *2/*65 *10/*36-*10 *1/*10 *1/*2 *1/*10 *1/*36-*10 *13/*10 *5/*10 *5/*36-*10 *1/*5 *1/*10 *10/*36-*10 *2/*10 *36-*10/*36-*10 *1/*36-*10 *2/*10 *10/*10 *10/*10 *4/*10 *10/*10 *10/*10 *1/*1 *2/*10 *10/*10

IM EM IM IM ND IM EM IM ND IM IM ND IM IM ND ND ND ND ND IM IM ND IM IM EM ND IM

*3/*3 *3/*3 *3/*3 *3/*3 *3/*3 *1/*1 *3/*3 *3/*3 *3/*3 *3/*3 *1/*1 *1/*3 *3/*3 *1/*1 *3/*3 *3/*3 *1/*3 *3/*3 *1/*3 *1/*3 *1/*1 *3/*3 *3/*3 *1/*3 *3/*3 *1/*3 *1/*3

PM PM PM PM PM EM PM PM PM PM EM IM PM EM PM PM IM PM IM IM EM PM PM IM PM IM IM

49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

FVN49 FVN50 FVN51 FVN52 FVN53 FVN54 FVN55 FVN56 FVN111 FVN112 FVN113 FVN114 MVN 01 MVN 03 MVN 04 MVN 05 MVN 06 MVN 7 MVN 8 MVN 9 MVN 10 MVN 11 MVN 12 MVN 13 MVN 14 MVN 15 MVN 16

*1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1

EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM

*1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *2/*17 *1/*2 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*2 *1/*2 *1/*1 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*1 *1/*2 *1/*2

EM EM EM EM IM EM EM EM IM IM EM EM EM EM EM EM IM EM IM IM EM EM IM EM EM IM IM

*1/*5 *1/*10 *1/*10 *1/*10 *1/*1 *1/*10 *1/*1 *10/*10 *1/*10 *10/*10 *10/*10 *1/*2 *5/*10 *36-*10/*36-*10 *10/*10 *1/*10 *10/*65 *10/*10 *5/*10 *5/*10 *5/*10 *10/*36-*10 *10/*36-*10 *10/*10 *36-*10/*36-*10 *10/*36-*10 *1/*5

IM IM IM EM IM EM IM IM IM IM EM IM ND IM IM IM IM IM IM IM ND ND IM ND ND IM

*1/*1 *1/*3 *1/*3 *1/*1 *1/*3 *3/*3 *3/*3 *1/*3 *1/*3 *1/*3 *1/*3 *3/*3 *1/*3 *1/*3 *1/*3 *3/*3 *1/*3 *3/*3 *1/*1 *1/*3 *3/*3 *1/*3 *3/*3 *3/*3 *3/*3 *1/*3 *3/*3

EM IM IM EM IM PM PM IM IM IM IM PM IM IM IM PM IM PM EM IM PM IM PM PM PM IM PM

76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102

MVN 17 MVN 18 MVN 19 MVN 20 MVN 21 MVN 22 MVN 23 MVN 24 MVN 25 MVN 26 MVN 27 MVN 28 MVN 29 MVN 30 MVN 31 MVN 32 MVN 33 MVN 34 MVN 35 MVN 36 MVN 37 MVN 39 MVN 41 MVN 42 MVN 43 FVN75 FVN77

*1/*3 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/Del *1/*3 *1/Del *1/Del *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*3 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*1 - -

IM EM EM EM ND IM ND ND EM EM EM EM EM EM IM EM EM EM EM EM EM EM EM EM EM - -

*1/*1 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*1 *1/*1 *1/*2 *1/*1 *1/*2 *1/*2 *1/*2 *1/*1 *1/*1 *2/*2 *2/*17 *1/*1 *2/*3 *1/*2 *1/*2 *1/*1 - -

EM EM IM EM EM IM EM IM EM EM EM IM EM IM IM IM EM EM PM IM EM PM IM IM EM - -

*5/*13-*2 *10/*67 *65/*36-*10 *5/*36-*10 *36-*10/*36-*10 *1/*10 *1/*2 *10/*36-*10 *1/*1 *5/*36 *10/*10 *10/*65 *2/*10 *1/*10 *1/*5 *5/*13-*1 *5/*65 *2/*10 *1/*10 *10/*10 *10/*36-*10 *10/*36-*10 *1/*10 *1/*14 *10/*10 *1/*10 *2/*65

ND ND ND ND ND IM EM ND EM PM IM IM ND IM IM ND IM ND IM IM ND ND IM ND IM IM IM

*3/*3 *1/*3 *3/*3 *1/*3 *3/*3 *1/*3 *1/*3 *1/*3 *3/*3 *1/*3 *1/*1 *1/*3 *1/*3 *1/*3 *3/*3 *1/*1 *1/*3 *1/*3 *3/*3 *3/*3 *3/*3 *1/*1 *3/*3 *3/*3 *3/*3 - -

PM IM PM IM PM IM IM IM PM IM EM IM IM IM PM EM IM IM PM PM PM EM PM PM PM - -

103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129

FVN78 FVN79 FVN80 FVN82 FVN83 FVN84 FVN85 FVN86 FVN87 FVN89 FVN90 FVN91 FVN92 FVN93 FVN95 FVN96 FVN97 FVN98 FVN99 MVN 38 MVN 40 MVN 44 MVN 45 MVN 46 MVN 47 MVN 48 MVN 49

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

*1/*10 *1/*1 *2/*65 *10/*36-*10 *1/*10 *1/*10 *10/*36-*10 *4/*13-*1 *5/*36-*36-*10 *1/*10 *2/*10 *5/*13-*2 *2/*5 *10/*36-*10 *13/*10 *1/*2 *10/*36-*10 *10/*10 *5/*36-*10 *10/*10 *10/*10 *10/*65 *10/*10 *1/*1 *10/*10 *1/*1 *2/*10

IM EM IM ND IM IM ND ND ND IM ND ND ND ND IM EM ND IM ND IM IM IM IM EM IM EM ND

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

130 131 132 133 134 135 136

- - - - - - -

*10/*10 *1/*86 *1/*10 *10/*10 *10/*10 *36-*10/*36-*10 *10/*10

IM IM IM IM IM ND IM

- - - - - - -

- - - - - - -

- - - - - - -

MVN 50 MVN 51 MVN 52 MVN 53 MVN 54 MVN 55 MVN 56

- - - - - - -

- - - - - - -

Chú thích: EM: Chuyển hóa thuốc bình thường

IM: Chuyển hóa thuốc trung bình

PM: Chuyển hóa thuốc yếu

ND: Chưa biết