Mục tiêu của đề tài nghiên cứu nhằm phân tích một số đặc điểm sinh học và xác định được các điều kiện thích hợp cho việc nhân giống (bằng hình thức giâm hom thân, nuôi cấy mô) loài Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai và Lâm Đồng, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam.
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Luận án là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với
một số cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành, các hội nghị trong nước và
quốc tế với sự đồng ý sử dụng số liệu của các đồng tác giả.
Những kết quả còn lại trong luận án chưa được tác giả nào công bố trong bất
kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày tháng năm 2021
Nghiên cứu sinh
Lê Thị Lan Anh
ii
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất của mình đến GS. TS. Nguyễn Đức Thành và TS. Lê Thị Bích Thủy, phòng Di truyền Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, những người thầy đã tận tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi, hướng dẫn khoa học và định hướng nghiên cứu cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy, Cô tại Viện Công nghệ sinh học đã giảng dạy, cung cấp kiến thức mới để tôi hoàn thành các học phần và các chuyên đề trong chương trình đào tạo. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành các nội dung trong chương trình đào tạo.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Ngô Văn Vụ - Hiệu trưởng trường Cao Đẳng Sư Phạm Hà Tây, các thầy cô trong Ban giám hiệu nhà trường, các thầy cô trong các Khoa, Phòng, Ban nơi tôi công tác đã tạo mọi điều kiện tốt nhất, hỗ trợ và giúp đỡ tôi hoàn thành nhiệm vụ chuyên môn tại trường trong suốt thời gian tôi đi học. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ phòng Di truyền Tế bào Thực vật, Viện Công Nghệ sinh học, tập thể các cán bộ thuộc Vườn Quốc gia Hoàng Liên và Viện Sinh học Tây Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, hỗ trợ, giúp đỡ và chia sẻ kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào tạo ở Viện Công nghệ sinh học và Chuyên viên Nguyễn Thị Minh Tâm ở Học viện Khoa học và Công nghệ đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành các hồ sơ trong quá trình học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ về tài chính và điều kiện làm việc trong khuôn khổ đề tài Quỹ gen - Bộ Khoa học và Công nghệ: “Khai thác và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trev.) tại Sapa và Đà Lạt”. Cuối cùng, với tất cả lòng biết ơn tôi xin gửi đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn tin tưởng, thông cảm, quan tâm, hỗ trợ và động viên tôi trong suốt thời gian qua để tôi có thể hoàn thành tốt nhiệm vụ học tập và công tác chuyên môn. Tôi xin trân trọng cảm ơn!
Lê Thị Lan Anh
iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii
MỤC LỤC ................................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ............................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... ix
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài .................................................................................... 1
2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài .................................................... 2
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2
2.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Những đóng góp mới của đề tài ........................................................................ 3
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .......................................................................... 3
4.1. Ý nghĩa khoa học ........................................................................................... 3
4.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................... 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 5
1.1. Đặc điểm loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) .............................. 5
1.1.1. Phân loại ..................................................................................................... 5
1.1.2. Đặc điểm hình thái học của Thạch tùng răng cưa ...................................... 6
1.1.3. Đặc điểm sinh thái, sinh học của Thạch tùng răng cưa .............................. 7
1.1.4. Đặc điểm sinh sản ..................................................................................... 10
1.1.5. Đặc điểm hóa sinh .................................................................................... 11
1.1.6. Các nghiên cứu về đa dạng di truyền loài Thạch tùng răng cưa .............. 14
1.2. Huperzine A, hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cưa ................ 15
1.2.1. Các nguồn tự nhiên có chứa HupA .......................................................... 15
1.2.2. Thành phần, cấu tạo và tính chất vật lý, hóa học của HupA .................... 18
1.2.3. Các nghiên cứu về tách chiết và xác định hàm lượng HupA ................... 20
1.2.4. Vai trò của HupA trong y học ................................................................... 22
1.2.5. Dược động học của HupA ........................................................................ 23
1.3. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa trên thế giới và ở
Việt Nam ........................................................................................................ 25
iv
1.3.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa trên thế giới ...... 25
1.3.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam ....... 30
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 31
2.1. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................... 31
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 31
2.1.2. Hóa chất và thiết bị ................................................................................... 32
2.1.3. Môi trường nuôi cấy ................................................................................. 33
2.1.4. Thời gian và địa điểm thí nghiệm ............................................................. 33
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 34
2.2.1. Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh học của nguồn gen loài Thạch tùng
răng cưa ................................................................................................................. 34
2.2.2. Phương pháp nhân giống Thạch tùng răng cưa ........................................ 39
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................. 46
3.1. Đánh giá đặc điểm sinh học của nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ... 46
3.1.1. Đánh giá đặc điểm hình thái của cây Thạch tùng răng cưa ...................... 46
3.1.2. Đánh giá đặc điểm vi phẫu Thạch tùng răng cưa ..................................... 49
3.1.3. Đánh giá đặc điểm sinh thái học của Thạch tùng răng cưa ...................... 51
3.1.4. Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của Thạch tùng răng cưa bằng chỉ thị
phân tử RAPD ....................................................................................................... 53
3.1.5. Xác định hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai
và Lâm Đồng. ....................................................................................................... 59
3.2. Nhân giống Thạch tùng răng cưa ................................................................ 68
3.2.1. Nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng giâm hom thân ......... 68
3.2.2. Nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng nuôi cấy mô ............. 88
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 107
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ .................................................. 109
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 110
PHỤ LỤC
v
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Tiếng Anh Tiếng Việt
Acetylcholine Axetylcholin ACh
Acetylcholinesterase Enzym acetylcholinesteraza AChE
Alzheimer’s disease Bệnh Alzheimer AD
Amplified fragment length Đa hình chiều dài của đoạn AFLP
polymorphism được khuếch đại.
6-benzyladenin 6-benzyladenin BA
Butyrylcholinesterase Enzym butyrylcholinesteraza BuChE
Xetyltrimethyl amoniumbromit Cetyltrimethyl CTAB
amoniumbromide
Xytochrom P450 Cytochrome P450 CYP
Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic DNA
Deoxyribonucleoside Deoxyribonucleosit triphosphat dNTP
triphosphate
Ethylene diamin tetra acetate Ethylene diamin tetra axetat EDTA
High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
chromatography
HupA Huperzine A Huperzin A
H. serrata Huperzia serrata Thạch tùng răng cưa
β-indole acetic acid Axit β-indole acetic IAA
Indole-3-butyric acid Axit indole-3-butyric IBA
The half maximal inhibitory Nồng độ ức chế tối đa một nửa IC50
concentration
Kilobase Kilo bazơ Kb
LC-MS Liquid chromatography-mass Sắc ký lỏng khối phổ
spectrometry
MS Murashige and Skoog medium Môi trường Murashige và
Skoog
NAA Naphthaleneacetic acid Axit naphthaleneacetic
vi
Chữ viết tắt
Tiếng Anh Tiếng Việt
OD Optical density Mật độ quang
PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymeraza
Phy Physostigmine Physostigmin
RAPD Random amplified Đa hình phân đoạn DNA được
polymorphic DNA nhân bản ngẫu nhiên
Rf Rentention factor Hệ số di chuyển
RNase Ribonuclease Enzim ribonucleaza
SD Standard deviation Độ lệch tiêu chuẩn
TE Tris EDTA Tris EDTA
THA Tetrahydroaminoacridine Tetrahydroaminoacridin
TLC Thin layer chromatography Sắc ký bản mỏng
UPLC - MS Ultra performance liquid Sắc ký lỏng siêu áp ghép đầu
chromatography - mass dò khối phổ
Spectrometry
UPLC-PDA Ultra performance liquid Sắc ký lỏng siêu áp với đầu dò
chromatography- photodiode PDA
array
UPLC-Q/TOF/ Ultra performance liquid Sắc ký lỏng siêu áp/ phương
MS chromatography/ quadrupole pháp quang phổi khối thời gian
time of flight/ mass chạy tứ cực
spectrometry
UV Ultra violet Tia tử ngoại
vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Địa điểm lấy mẫu sử dụng trong nghiên cứu……………………… …32
Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của 16 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu... …36
Bảng 2.3. Các môi trường nuôi cấy mô sẹo…………………………………… …43
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái cây Thạch tùng răng cưa thu ở Lâm Đồng và
Lào Cai…………………………………………………………….. …46
Bảng 3.2. Tổng hợp kết quả phân tích 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với 16
mồi RAPD………………………………………………………….. …55
Bảng 3.3. Hệ số tương đồng di truyền của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa………. …56
Bảng 3.4. Kết quả xác định hàm lượng HupA từ toàn bộ cây của 8 mẫu
Thạch tùng răng cưa thu hái vào tháng 9 (mùa thu).………............. …64
Bảng 3.5. Hàm lượng HupA của rễ, thân và lá Thạch tùng răng cưa…………. …66
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của chiều dài hom thân đến sự sinh trưởng của cây
con Thạch tùng răng cưa tại Lâm Đồng và Lào Cai sau 4 tháng
giâm hom…………………………………………………………… …69
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các loại giá thể đến sự sinh trưởng của cây con
Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng giâm tại Lâm Đồng và Lào Cai…. …71
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển của
cây con Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng giâm hom thân tại Lâm
Đồng……………………………………………………………….. …74
Bảng 3.9. Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển của cây
con Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng giâm hom thân tại Lào Cai…. …76
Bảng 3.10. So sánh hiệu quả của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát
triển của hom thân Thạch tùng răng cưa ở hai vùng nghiên cứu…… ....78
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của độ sâu hom thân giâm đến sinh trưởng cây con
Thạch tùng răng cưa tại Lâm Đồng và Lào Cai sau 4 tháng………. …80
Bảng 3.12. So sánh hiệu quả giâm hom thân Thạch tùng răng cưa tại Lào Cai
và Lâm Đồng sau 4 tháng…………………………………........... …..81
Bảng 3.13. Sự sinh trưởng của cây con sau 2 tháng bón phân tại Lâm Đồng…. …83
Bảng 3.14. Sự tăng trưởng của cây con trong bầu ươm ở các thời gian khác
nhau…………………………………………………………………. …84
viii
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của thời gian ra ngôi đến sinh trưởng cây con
Thạch tùng răng cưa………………………………………………. …..85
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của các chất khử trùng đến mẫu Thạch tùng răng cưa
sau 30 ngày nuôi cấy………………………………………………. …89
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến nuôi cấy chồi Thạch
tùng răng cưa sau 60 ngày nuôi cấy………………………………… …91
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của BA đến tạo cụm chồi gốc Thạch tùng răng cưa sau
120 ngày nuôi cấy………………………………………………….. …93
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của Kinetin đến tạo cụm chồi gốc Thạch tùng răng
cưa sau 120 ngày nuôi cấy………………………………………… …94
Bảng 3.20. So sánh hiệu quả của BA và kinetin đến tạo cụm chồi Thạch tùng
răng cưa sau 120 ngày nuôi cấy…………………………………….. …95
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của IBA đến sự ra rễ của chồi Thạch tùng răng cưa sau
60 ngày nuôi cấy……………………………………………………. …96
Bảng 3.22. Ảnh hưởng của α - NAA đến sự ra rễ của chồi Thạch tùng răng
cưa sau 60 ngày nuôi cấy.………………………………………….. …97
Bảng 3.23. So sánh hiệu qủa của α - NAA và IBA đến sự phát triển rễ sau
60 ngày nuôi cấy………………………………………………….. …97
Bảng 3.24. Kết quả nuôi cấy mô sẹo Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng……….. ..100
Bảng 3.25. Tạo đa chồi mô sẹo Thạch tùng răng cưa trên môi trường
¼ MS + 1 mg/l kinetin sau 4 tháng……………………………....... ..102
ix
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cây Thạch tùng răng cưa H. serrata……………………………….. …..6
Hình 1.2. Sự phân bố của Thạch tùng răng cưa trên thế giới…………………. …..7
Hình 1.3. Sự phân bố của Thạch tùng răng cưa tại Việt Nam………………… …..8
Hình 1.4. Hình thái của cây mầm ở các độ tuổi khác nhau…………………… …10
Hình 1.5. Đại diện cho 4 nhóm hợp chất chính của lycopodium alkaloid thu
từ loài Thạch tùng răng cưa………………………………………… …12
Hình 1.6. Các hợp chất khác từ loài Thạch tùng răng cưa……………………. …13
Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của hai hợp chất HSE-1 (a) và HSE-2 (b)………. …13
Hình 1.8. Con đường sinh tổng hợp của HupA.................................................. …..18
Hình 1.9. Các đồng phân quang học của HupA………………………………. …18
Hình 1.10. Cấu trúc tương tự của HupA và acetylcholine (ACh)……………… …19
Hình 1.11. Cấu trúc phân tử HupA……...……………………………………… …19
Hình 1.12. Các tương tác chính giữa AchE và phân tử HupA …………………. …20
Hình 2.1. Bản đồ 5 vị trí lấy mẫu ở Lào Cai………………………………….. …31
Hình 2.2. Bản đồ 5 vị trí lấy mẫu ở Lâm Đồng………………………………. …31
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát………………………………….. …34
Hình 3.1. Hình thái cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng ….………… …47
Hình 3.2. Một số hình thái cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai……….... …47
Hình 3.3. Cây Thạch tùng răng cưa trong rừng tại Lâm Đồng………………… …48
Hình 3.4. Đế mầm trên cây Thạch tùng răng cưa mẹ…………………………... …49
Hình 3.5. Vi phẫu thân Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai…………………. …50
Hình 3.6. Vi phẫu thân Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng……………… …50
Hình 3.7. Vi phẫu lá Thạch tùng răng cưa…………………………………… …51
Hình 3.8. Thạch tùng răng cưa trên bờ suối tại Nam Ban, Lâm Đồng................. …51
Hình 3.9. Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với
mồi OPC5.………………………………………………………….. …54
Hình 3.10. Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với
mồi OPC13………………………………………………………….. …54
Hình 3.11. Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với
mồi OPB13……………………………………............................… …54
Hình 3.12. Sơ đồ quan hệ di truyền của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa..………… …56
Hình 3.13. Hình ảnh chạy TLC HupA từ 8 mẫu Thạch tùng răng cưa…………. …60
Hình 3.14. Hình ảnh chạy TLC HupA từ Thạch tùng răng cưa thu tại DL1….... …61
x
Hình 3.15. Hình ảnh chạy TLC HupA từ Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai.. …62
Hình 3.16. Sắc ký đồ HPLC (UV 310 nm) phát hiện HupA trong dịch chiết
lá Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai…………………………….. …62
Hình 3.17. Sắc kí đồ HPLC (UV 310 nm) phát hiện HupA trong dịch chiết
lá cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng…………………….. …63
Hình 3.18. Phổ ESI - MS Positive và peak ion phân tử 243,0………………… …63
Hình 3.19. Cây con Thạch tùng răng cưa trong vườn ươm……………………. …81
Hình 3.20. Cây Thạch tùng răng cưa ngoài vườn ươm tại Lâm Đồng…………. …85
Hình 3.21. Sơ đồ một số khâu cơ bản trong quy trình nhân giống Thạch tùng
răng cưa bằng giâm hom thân…………………………………….. …86
Hình 3.22. Mẫu Thạch tùng răng cưa sau 30 ngày nuôi cấy in vitro trên môi
trường MS …………………………………………………………. …90
Hình 3.23. Chồi Thạch tùng răng cưa nuôi cấy trên môi trường ¼ MS………... …92
Hình 3.24. Cụm chồi Thạch tùng răng cưa nuôi cấy trên môi trường ¼ MS có
bổ sung 1 mg/l kinetin………………………………………………. …95
Hình 3.25. Thạch tùng răng cưa sau 60 ngày nuôi cấy trong môi trường
1/4 MS có bổ sung 1 mg/l IBA……………………………………... …98
Hình 3.26. Cây Thạch tùng răng cưa sau 120 ngày nuôi cấy trong nhà kính…. …98
Hình 3.27. Nuôi cấy mô sẹo đỉnh chồi Thạch tùng răng cưa trên môi trường
¼ MS + 0,015 mg/l IBA + 0,3 mg/l kinetin + 3 mg/l glutamin…….. ..101
Hình 3.28. Đa chồi hình thành từ mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy trên môi
trường ¼ MS……………………………………………………….. ..101
Hình 3.29. Cụm chồi Thạch tùng răng cưa được hình thành từ mô sẹo sau 4
tháng nuôi cấy……........................................................................... ..103
Hình 3.30. Cây Thạch tùng răng cưa in vitro nuôi cấy trên môi trường 1/4 MS
+ 1 mg/l IBA………………………………………………………. ..103
Hình 3.31. Sắc ký đồ HPLC (UV 310 nm) phát hiện HupA trong dịch chiết
toàn bộ cây Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô năm 2019................... ..105
1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hiện nay, trước những tác động lớn của biến đổi khí hậu, dịch bệnh và sự
khai thác quá mức của con người, vấn đề nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn
gen các loài cây trồng nói chung, trong đó có các loại cây dược liệu đang là vấn đề
được khoa học và xã hội quan tâm.
Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) là loại cây dược liệu quý, thuộc
danh sách "đỏ" trong Chương trình Nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen quý
hiếm về cây thuốc. Hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cưa là huperzine A
(HupA) có tác dụng trong việc chữa trị các bệnh về trí nhớ, đặc biệt là bệnh
Alzheimer ở người già [1]. Với kết quả nghiên cứu và phát hiện về tác dụng tuyệt
vời của HupA dựa trên kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học phương tây đã cho
thấy triển vọng phát triển các loại thuốc chữa bệnh Alzheimer từ loài cây này [2].
Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, số lượng người có vấn đề về suy giảm trí
nhớ nói chung và người mắc bệnh Alzheimer nói riêng đang ngày một tăng cao, nhu
cầu về thuốc thảo dược có chứa hoạt chất HupA vì thế không ngừng tăng, đây có
thể là nguyên nhân chính dẫn đến việc khai thác quá mức làm suy giảm nghiêm
trọng nguồn gen loài cây dược liệu quý này trong tự nhiên. Do đó, trên thế giới đã
có rất nhiều công trình nghiên cứu về nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng hình
thức giâm hom thân và nuôi cấy mô nhằm bảo tồn và phát triển nguồn gen loài cây
này.
Các nghiên cứu cho thấy, loài Thạch tùng răng cưa sinh trưởng tốt trong rừng
với đất mùn ẩm ướt, độ cao 350 - 1700 m, lượng mưa trên 1500 mm/ năm, độ ẩm
trên 78% [3, 4]... Ở nước ta, Thạch tùng răng cưa đã được tìm thấy trên các vùng
cao tại một số khu vực như Lào Cai, Lâm Đồng, Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Nghệ An,
Tây Nguyên, Quảng Trị…[5]. Trong đó, Lâm Đồng và Lào Cai là hai khu vực có
điều kiện khí hậu và môi trường sống thích hợp hơn cho sự phát triển của loài
Thạch tùng răng cưa so với các khu vực khác trong cả nước. Tuy nhiên, Thạch tùng
răng cưa có đặc tính sinh trưởng chậm, khả năng sinh sản kém, mức khai thác
nguồn cây trồng tự nhiên quá lớn đã làm mất dần nguồn gen quý này ở nước ta, dẫn
đến loài Thạch tùng răng cưa không đáp ứng được nhu cầu về nguồn nguyên liệu
2
cho sản xuất dược phẩm. Do vậy, để chủ động nguồn dược liệu cho chiết xuất hoạt
chất HupA dùng làm thuốc, việc nghiên cứu một số đặc điểm sinh học để lựa chọn
giống cây có khả năng sinh tổng hợp HupA cao, từ đó tìm ra các phương pháp để tái
sinh và nhân giống nhằm bảo tồn và phát triển nguồn gen loài cây này là vô cùng
cần thiết. Hơn nữa, Việt Nam cũng chưa có công trình nghiên cứu nào thành công
về nhân giống loài Thạch tùng răng cưa với quy mô lớn. Xuất phát từ thực tế và
nhận định trên, chúng tôi lựa chọn hai vùng Lâm Đồng và Lào Cai để thực hiện đề
tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và nhân giống loài Thạch tùng răng
cưa (Huperzia serrata (Thunb. Ex Murray) Trevis) thu tại Lào Cai và Lâm
Đồng”.
2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Phân tích một số đặc điểm sinh học và xác định được các điều kiện thích hợp
cho việc nhân giống (bằng hình thức giâm hom thân, nuôi cấy mô) loài Thạch tùng
răng cưa thu tại Lào Cai và Lâm Đồng, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen
loài Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam.
2.2. Nội dung nghiên cứu
1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh thái học và tính đa hình
DNA của loài Thạch tùng răng cưa.
i. Đặc điểm hình thái, giải phẫu của loài Thạch tùng răng cưa.
ii. Đặc điểm sinh thái học của loài Thạch tùng răng cưa.
iii. Tính đa hình DNA của loài Thạch tùng răng cưa.
2. Xác định hàm lượng huperzine A trong cây Thạch tùng răng cưa ngoài tự
nhiên thu thập tại Lào Cai và Lâm Đồng.
3. Nghiên cứu nhân giống loài Thạch tùng răng cưa.
i. Nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng hình thức giâm hom thân.
ii. Nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng hình thức nuôi cấy mô.
4. Xác định hàm lượng huperzine A trong cây Thạch tùng răng cưa nuôi cấy
3
mô.
3. Những đóng góp mới của đề tài
Luận án là nghiên cứu mới có hệ thống khi kết hợp cùng lúc phương pháp
phân tích về hình thái, giải phẫu thực vật và sinh học phân tử để đánh giá mức độ đa
dạng nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ở hai vùng Lào Cai và Lâm Đồng.
Xác định được hàm lượng HupA trong 8 mẫu nguồn gen loài Thạch tùng
răng cưa thu tại Lào Cai và Lâm Đồng, trong đó, các mẫu Thạch tùng răng cưa thu
tại Lâm Đồng có hàm lượng HupA (90,23 µg/g) cao hơn so với các mẫu thu tại Lào
Cai (76,28 µg/g); hàm lượng HupA ở lá cao hơn thân và rễ; lá Thạch tùng răng cưa
thu hái vào mùa thu (tháng 9) có hàm lượng HupA (92,50 µg/g) cao hơn thu hái vào
mùa xuân (tháng 3) (75,10 µg/g).
Đã xác định được một số khâu cơ bản làm cơ sở cho việc xây dựng quy trình
nhân giống loài Thạch tùng răng cưa bằng phương pháp giâm hom thân (tại Lào Cai
và Lâm Đồng) với tỉ lệ cây hồi xanh sau ra ngôi đạt 97,78% và phương pháp nuôi
cấy mô với tỉ lệ sống sót trên giá thể đạt 97%; đồng thời, xác định được hàm lượng
HupA trong cây nuôi cấy mô đạt 300 µg/ g khối lượng khô.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả của luận án cung cấp các thông tin khoa học về đặc điểm hình thái,
tính đa dạng về hệ gen, hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa ở hai vùng
Lào Cai và Lâm Đồng.
Cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu về ứng dụng công nghệ tế bào
thực vật trong nhân giống, mở ra triển vọng đáp ứng nguồn cây giống đồng đều và
chất lượng cho phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu về đặc điểm sinh học có ý nghĩa định hướng cho công
tác bảo tồn và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam.
Xác định được thời điểm thu hoạch và bộ phận thu hái Thạch tùng răng cưa
để nhận được hàm lượng HupA cao nhất phục vụ cho y học; đồng thời, giảm thiểu
4
được việc khai thác dẫn đến mất dần nguồn gen Thạch tùng răng cưa trong tự nhiên.
Thành công trong phương pháp nhân giống sẽ góp phần bảo tồn và phát triển
nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa tại các vùng có khả năng trồng ở Việt Nam,
cung cấp nguyên liệu có hoạt chất HupA cao phục vụ cho việc sản xuất thuốc điều
trị các bệnh rối loạn về trí nhớ.
5
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata)
1.1.1. Phân loại
Thạch tùng răng cưa tên khoa học là Huperzia serrata (Thunb. Ex Murray)
Trevis, (trước đây gọi là Lycopodium serratum Trevis, Huperziaceae), thuộc bộ
Lycopodiales, họ Lycopodiaceae, chi Huperzia. Chi Huperzia có khoảng 500 loài
trên toàn thế giới [6, 7].
Ở Việt Nam, họ Lycopodiaceae có 3 chi là Huperzia, Lycopodium và
Lycopodiella với tổng số 14 loài. Trong đó, chi Huperzia là chi lớn nhất với 10
loài gồm Huperzia cancellata (Spring) Trevis., H. carinata (Poir.) Trevis, H.
chinense (Christ) Ching, H. hamitolnii (Spring) Trevis, H. subdisticha Mak, H.
obovalofolia (Bon.), H. plegmaria (L.) Roth., H. salvinoides (Herter) Alston., H.
serrata (Thunb.) Trevis và H. squarrosa (Forst.) Trevis [8, 9, 10]. Đây là những
loài được đánh giá có tiềm năng sử dụng trong điều trị nhiều bệnh như Alzheimer,
Parkinson, đau, sưng tấy, phát ban, tâm thần phân liệt và bệnh nhược cơ ở các nước
Đông Á [5].
Theo Nguyễn Thọ Biên (2017), họ Lycopodiaceae ở Việt Nam gồm 12 loài
có tác dụng chữa bệnh, trong đó có 11 loài được phát hiện ở tỉnh Lâm Đồng: Thạch
tùng (thông đá, thăng kim thảo - Lycopodium clavatum L.); Thạch tùng nhiều bông
(Huperzia chinense (H. Chirst) Ching); Thạch tùng phi lao (Lycopodium
casuarinoides Spring); Thạch tùng răng cưa (H. serrata (Thunb.) Trevis); Thạch
tùng thân gập (Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis); Thạch tùng xoan ngược
(Huperzia abovalifolia (Bon); Thông đất (Lycopodiella cernua (L.) Pic. Serm);
Thông đất dẹp (Lycopodium complanatum L.); Thông đất Haminton (Huperzia
hamilltonii (Spreng.) Trevis); Thông đất râu (Huperzia plegmaria (L.) Rothm);
Thông đất song (Huperzia carinata (Desv. Ex Poir.) Trevis [11]; Thạch tùng Ford
(Huperzia fordii (Backer) R. D. Dixit) chỉ gặp ở vùng núi thấp của Hà Nội (Ba Vì)
[12]. Bốn trong số 12 loài trên đã được đưa vào danh mục cây thuốc Việt Nam
(2016) gồm: Thạch tùng Ford, Thạch tùng nhiều bông, Thạch tùng phi lao, Thạch
tùng răng cưa [12].
6
Thạch tùng răng cưa (Hình 1.1) thuộc loài thân cỏ mọc ở đất, thân cao 15 cm
- 40 cm, thân đơn hay lưỡng phân 1 - 2 lần, hình trụ, đường kính khoảng 2 mm. Lá
hình bầu dục, mũi mác, dài 15 mm, rộng 3 mm, phiến lá tương đối mỏng, nổi rõ gân
giữa, mép lá có răng cưa, rễ dạng chùm [13]. Ngoài ra, theo nghiên cứu của Phạm
Hoàng Hộ (2006), cây Thạch tùng răng cưa thu ở Sa Pa và Đà Lạt có đặc điểm là:
thân đứng, cao 8 cm - 20 cm, lá thon hẹp, kích thước 2 – 3 cm x 0,40 cm, tương đối
mỏng, gân rõ giữa, bìa có răng không đều. Bào tử nang ở nách lá không khác lá
thường, hình thận, màu vàng tươi [14]. Sự phát triển của túi bào tử từ lúc bắt đầu
đến khi trưởng thành mất gần 1 năm. Cấu trúc của thành túi bào tử trưởng thành bao
gồm một lớp biểu bì, ở giữa là hai lớp tế bào và một lớp mô dưỡng chất gọi là
tapetum. Do đó, túi bào tử của loài Thạch tùng răng cưa thuộc loại túi bào tử dày
(eusporangium) [15]. Bào tử được phát tán ra khi túi bào tử trưởng thành. Mầm tập
trung nhiều ở phần trên của cây và những mầm này có thể phát triển thành cây mới
sau khi rơi xuống đất. Tuy nhiên, Thạch tùng răng cưa ít khi được nhân giống bằng
mầm [16].
Bào tử
Thân Lá
Hình 1.1. Cây Thạch tùng răng cưa H. serrata [17].
Nghiên cứu đặc điểm hình thái của cây Thạch tùng răng cưa ở khu bảo tồn
thiên nhiên Bắc Hướng Hóa - Quảng Trị cho thấy cây trưởng thành là những cây có
khả năng sản sinh bào tử nang có màu vàng tươi, hình thận với kích thước 0,8 mm
mọc ở nách lá. Ngược lại, cây tái sinh thường chưa sản sinh bào tử nang, chiều cao
và đường kính nhỏ hơn cây trưởng thành, với chiều cao 3,54 cm, đường kính 0,75
7
mm. Đối với cây trưởng thành có dạng cây thân thảo đứng có chiều cao trung bình
11,89 cm - 14,25 cm, đường kính thân trung bình 1,80 mm. Lá có hình dạng lưỡi
mác, chiều dài 1,84 cm - 2,57 cm, chiều rộng 0,37 cm - 0,41 cm, gân giữa nổi rõ,
mép lá có răng cưa không đều với số lá trung bình 79,80 lá/ cây [18].
1.1.3. Đặc điểm sinh thái, sinh học của Thạch tùng răng cưa
Thạch tùng răng cưa phân bố trên toàn thế giới nhưng tập trung nhiều nhất ở
khu vực ôn đới phía đông, phía nam đến vùng nhiệt đới Đông Nam của Châu Á,
cũng như Châu Đại Dương và Trung Mỹ (Hình 1.2) [19]. Chúng sống bì sinh ở
những cành cây, hốc cây hoặc bề mặt đá, phát triển tốt trong rừng hoặc trong khe
núi với đất mùn ẩm ướt, ở độ cao 350 m - 1700 m, lượng mưa trên 1500 mm, độ ẩm
tương đối cao 78%, hàm lượng nước trong đất 10% - 30%, pH đất 4,57 - 5,31, độ
dẫn đất 0,06 - 0,85 cm/ cm, và hàm lượng chất hữu cơ 6,18% - 9,75% [3, 4].
Hình 1.2. Sự phân bố của Thạch tùng răng cưa trên thế giới [20].
Theo nghiên cứu của Kaur và cộng sự (2016), Thạch tùng răng cưa chủ yếu
được tìm thấy ở Ấn Độ, Trung Quốc, Nepal, Myanmar, Sri Lanka, Nhật Bản, Hàn
Quốc, Việt Nam, Indonesia, Fiji, Samoa, Mexico, Mỹ, Thái Lan, bán đảo Malaysia,
Nga, Đài Loan, Úc và Cuba. Ấn Độ phát hiện được 21 loài thuộc chi Huperzia.
Trong đó, 6 loài bao gồm Huperzia cancellta (Spring) Trevis., H. carinata (Desv.)
Trevis., H. quasipolytrichoides (Hayata) Ching (H. cryptomerina sensu Dixit), H.
nummulariifolia (Blume) Jermy, H. phyllantha (Hook & Arn) Holub và H.
vernicosa (Hook & Grev.) Trevis bị đe dọa nghiêm trọng và bốn loài là H. ceylanica
(Spring) Trevis., H. nilagirica (Spring) Dixit., H. selago (Linn) Bernh. Ex Schrenk
& Mart subsp arctica (Grossh ex. Tolm.) A. Love & D. Love (H. dixitiana P.
Mondal & S. R. Ghosh) và H. phlemaria (Linn) Rothm. (Phlegmariurus Plegmaria
8
(Linn.) Sen & Sen) xuất hiện với tỉ lệ hiếm. Thạch tùng răng cưa chủ yếu được tìm
thấy ở vùng cận nhiệt đới đến rừng ôn đới ở độ cao 900 m - 3500 m khu vực Đông
Bắc của Ấn Độ như West Bengal (Darjeeling), Meghalaya, Manipur và đồi Nilgiri
của Tamilnadu [21].
Ở Trung Quốc, Thạch tùng răng cưa chủ yếu xuất hiện trong rừng lá rộng
thường xanh, tập trung nhiều ở các khu vực từ vùng phía Nam đến sông Dương Tử;
nơi đây, lượng mưa hàng năm trên 1000 mm và chúng thường sinh trưởng trong các
môi trường được che bóng, ẩm ướt và đất mùn axit, ở độ cao dao động từ 300 đến
2700 m [4].
Ở nước ta, cây Thạch tùng răng cưa thường bì sinh ở những cành cây, hốc
cây hoặc bề mặt đá. Cây thường phân bố ở độ cao trên 1000 m so với mực nước
biển. Cây phát triển tốt trong môi trường bóng mờ, ẩm ướt và rất ẩm ướt, đất có
nguồn chất hữu cơ phong phú, độ mùn cao, điều này làm hạn chế môi trường sống
của chúng ở các vùng có độ cao cao hơn tại Việt Nam [22]. Chúng phân bố rải rác
tại các vùng cao như Lâm Đồng, Lào Cai, Nghệ An, Cao Bằng, Quảng Trị, Quảng
Nam - Đà Nẵng, Khánh Hòa, Tam Đảo [5, 8] (Hình 1.3).
Hình 1.3. Sự phân bố của Thạch tùng răng cưa tại Việt Nam [20].
Từ Bắc vào Nam, bốn quần thể bản địa của loài này phân bố tại các khu bảo
tồn thiên nhiên đã được xác định ở Việt Nam bao gồm Vườn Quốc gia Hoàng Liên
(tỉnh Lào Cai), Vườn Quốc gia Bạch Mã (tỉnh Thừa Thiên Huế), Khu bảo tồn Quốc
9
gia Ngọc Linh (giữa Tỉnh Quảng Nam và Kon Tum) và Vườn Quốc gia Bidoup (tỉnh
Lâm Đồng). Trong năm 2013 và 2016, nghiên cứu định danh tại hiện trường đã xác
định được 100 - 300 cá thể còn lại ở mỗi khu vực nghiên cứu. Kết quả ghi nhận này
cho thấy, kích thước của quần thể và sự tái sinh khan hiếm của loài cây Thạch tùng
răng cưa trở thành một mối đe dọa lớn đối với sự tồn tại của loài, thông qua sự suy
giảm đa dạng di truyền [22].
Bên cạnh đó, tại khu bảo tồn thiên nhiên Bắc Hướng Hóa (Quảng Trị), Trần
Mạnh Đạt và cộng sự (2019) đã nghiên cứu và xác định loài Thạch tùng răng cưa tại
đây phân bố ở đai cao từ 1.400 m - 1.500 m so với mặt nước biển, chủ yếu ở vị trí
sườn dốc và địa hình ven khe suối, tập trung nhất ở vị trí ven khe suối (78,09%) ở
vùng Pa Thiên với độ dốc dưới 30o và những vị trí sườn dốc cũng thấy sự xuất hiện
phân bố của loài nhưng ít hơn chỉ đạt 21,91% với độ dốc địa hình lớn hơn 30o, chưa
bắt gặp cá thể nào phân bố ở đỉnh núi. Ngoài ra, cây phân bố tập trung ở những khu
vực có độ ẩm cao trong rừng, thường phân bố theo các đám nhỏ tại những điểm
bằng phẳng cục bộ trong rừng do bị giới hạn bởi có đá chắn, bạt chắn ven suối, cạnh
các tảng đá, bờ suối với tỷ lệ đá nổi từ 10% đến 20%. Vùng phân bố tập trung được
ghi nhận ở khu vực động Pa Thiên, núi Voi Mẹp (xã Hướng Sơn) và La Rường (xã
Hướng Linh) của Khu bảo tồn thiên nhiên Bắc Hướng Hóa. Mật độ trung bình 98
cây/ km, tần số bắt gặp 5 - 20 cây/ km của tuyến điều tra. Trạng thái rừng có cây
Thạch tùng răng cưa phân bố đều thuộc trạng thái rừng giàu, nguyên sinh ít bị tác
động với độ tàn che cao 0,70 - 0,80 [18].
Các nghiên cứu cho thấy, cây Thạch tùng răng cưa có chứa nhiều loài nấm
nội sinh [23, 24, 25]. Các loại nấm nội sinh này thường không gây ra triệu chứng rõ
ràng về bệnh; ngược lại, chúng kích thích sự tăng trưởng của thực vật và tăng cường
khả năng sống sót của vật chủ đối với nấm gây bệnh [23]. Một số nấm nội sinh
được phát hiện như một nguồn thuốc chữa bệnh như chủng nấm Botryosphaeria sp.
P483 [26], Aspergillus versicolor [27], hoặc chứa các hợp chất mới như chủng B14
thuộc loài nấm Penicillium oxalicum có chứa hợp chất pentapeptit mới [28], chủng
Penicillium chrysogenum MT-12 có chứa axit 3,5-dimethylorsellinic bắt nguồn từ
nhóm hợp chất meroterpenoid [29], bốn hợp chất steroid mới là neocyclocitrinol
E-G (1-3) và 3β-hydroxy-5,9-epoxy-(22E, 24R)-ergosta-7,22-dien-6-one được phát
10
hiện trong chủng nấm Chaetonium sp. M453 [30]. Điều này cho thấy, loài Thạch
tùng răng cưa có chứa nhiều chủng nấm nội sinh khác nhau và đây là một nguồn tài
nguyên phong phú cho việc khảo sát các sản phẩm tự nhiên mới.
1.1.4. Đặc điểm sinh sản
Loài Thạch tùng răng cưa có sự kết hợp cả hình thức sinh sản hữu tính (bằng
bào tử) và sinh sản vô tính (bằng mầm).
Cây trưởng thành tạo ra các lá mới, túi bào tử từ tháng 2 đến tháng 3, và
thường túi bào tử mở để giải phóng bào tử vào tháng 12 và tháng 1 năm sau [19].
Quá trình phát triển của bào tử và túi bào tử kéo dài hơn 1 năm. Sự phát triển của túi
bào tử được xác định gồm sáu giai đoạn: (1) bắt đầu từ tế bào biểu bì và hình thành
các tế bào sinh bào tử, (2) tế bào sinh bào tử nguyên sinh, (3) tế bào sinh bào tử thứ
cấp, (4) tế bào bào tử mẹ, (5) giai đoạn bốn bào tử (tetrad) và (6) trưởng thành [15].
Các thể giao tử và thể bào tử của Thạch tùng răng cưa thường phát triển chậm trong
môi trường sống có độ ẩm tương đối cao và cần nguồn chất hữu cơ phong phú nên
khó khăn trong việc nhân giống [31]. Không chỉ vậy, sau khi bào tử nảy mầm, cây
con phải mất 15 - 20 năm để phát triển đạt chiều cao 10 - 30 cm. Cho đến nay, trên
thế giới chưa có công trình nào thành công với phương pháp nảy mầm bào tử trong
phòng thí nghiệm [17, 32].
Hình 1.4. Hình thái của cây mầm ở các độ tuổi khác nhau [19].
Trong tự nhiên, sinh sản sinh dưỡng bằng mầm đóng vai trò quan trọng đối
với việc phát tán và tái sinh loài Thạch tùng răng cưa [19]. Nghiên cứu cho thấy cây
Thạch tùng răng cưa trưởng thành tạo ra mầm từ tháng 2 đến tháng 3, sau đó mầm
rơi xuống đất trong khoảng thời gian từ tháng 8 đến tháng 10. Các mầm dễ dàng
11
phát triển thành cây con trên môi trường đất rừng sinh thái. Sau 3 hoặc 4 ngày, mầm
đã xuất hiện các rễ rất ngắn (< 0,10 mm). Sau 7 ngày, cây con phát triển một hoặc
hai lá ban đầu. Sau 120 ngày, các lá hình thành răng cưa (Hình 1.4) [19]. Nghiên
cứu cũng chỉ ra rằng cây Thạch tùng răng cưa lâu năm với trên ba lớp mầm (cây
trên 3 năm tuổi, mỗi lớp mầm tương ứng với 1 năm tuổi) thì khả năng tạo mầm trở
lên mạnh mẽ hơn, trung bình tạo ra hơn 20 mầm mỗi năm [19]. Tuy nhiên, trên thực
tế, Thạch tùng răng cưa ít khi được nhân giống bằng mầm [16]. Điều này cho thấy
mầm của loài Thạch tùng răng cưa thường được phát triển thành cây con trong môi
trường tự nhiên với tỉ lệ sống sót cao. Đây là một trong những hình thức sinh sản
giúp duy trì và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa trong điều kiện tự
nhiên.
1.1.5. Đặc điểm hóa sinh
Thế giới đã có nhiều nghiên cứu liên quan đến việc xác định thành phần hoá
học và tác dụng bảo vệ thần kinh của các hợp chất phân lập được từ cây Thạch tùng
răng cưa [33, 34]. Hầu hết các nghiên cứu đều chỉ ra rằng lycopodium alkaloid là
thành phần hoá học chính trong cây và có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh [35].
Cao chiết giàu alkaloit từ Thạch tùng răng cưa thu tại Nhật Bản có khả năng ức chế
enzyme AchE với giá trị IC50 là 5,96 µg/ ml [33]. Tại Việt Nam, Nguyễn Duy Tài và
cộng sự (2013) đã nghiên cứu tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ của cao chiết cồn
từ loài Thạch tùng răng cưa thuộc họ Lycopodiaceae trên chuột nhắt trắng. Kết quả
cho thấy cao chiết cồn của Thạch tùng răng (liều 0,53 g/ kg) giúp cải thiện tình
trạng suy giảm trí nhớ trên chuột thực nghiệm. LD50 của cao Thạch tùng răng cưa là
5,33 g/ kg [36]. Cao chiết toàn phần, các phân đoạn cao chiết và cao chiết alkaloit
được phân lập từ cây Thạch tùng răng cưa thu tại Việt Nam đều có tác dụng ức chế
enzyme AchE. Trong đó, cao chiết giàu alkaloit thể hiện tác dụng ức chế enzyme
AchE và BuchE mạnh hơn hẳn so với các cao chiết toàn phần và các phân đoạn cao
chiết với giá trị IC50 lần lượt là 14,08 µg/ml và 88,11 µg/ml [37].
Sử dụng phương pháp UPLC - MS, Wu và cộng sự (2018) đã xác định được
một trăm mười tám hợp chất lycopodium alkaloid trong các mô khác nhau của loài
Thạch tùng răng cưa [38]. Một số hợp chất lycopodium alkaloid với cấu trúc hóa
học đa dạng được phân lập từ cây Thạch tùng răng cưa vẫn đang được các nhà khoa
12
học nghiên cứu để xây dựng nên cấu trúc các hợp chất alkaloid mới. Đa số các
lycopodium alkaloid là các chất hòa tan trong chất béo và chúng được phân thành
bốn loại cấu trúc chính (Hình 1.5). Bốn loại cấu trúc chính bao gồm các nhóm:
fawcettimine, lycodine, lycopodine và một tập hợp các hợp chất hỗn hợp
(miscellaneous) [1].
Hình 1.5. Đại diện cho 4 nhóm hợp chất chính của lycopodium alkaloid thu từ loài
Thạch tùng răng cưa [1].
Hầu hết các hợp chất alkaloid có khả năng ức chế enzyme
acetylcholinesterase (AchE) thuộc về lớp lycodine (B) gồm có: HupA,
6-β-hydroxyhuperzine A, huperzine B (HupB), N-methylhuperzine B và
huperzinine [39, 40]. Bằng kỹ thuật UPLC-PDA và UPLC-Q/TOF-MS, Zhao và
cộng sự (2015) đã xác định nhanh 3 hợp chất có mặt trong cây Thạch tùng răng cưa
là HupA, HupB và HupC [41]. Đối với vấn đề ức chế AchE thì HupA là hợp chất
quan trọng có khả năng ức chế mạnh nhất [33, 40]. Nghiên cứu khác đã chứng minh
một vài lycopodium alkaloid thuộc nhóm fawcettimine cũng có khả năng ức chế
AchE như huperzine P và huperzine R nhưng khả năng ức chế của chúng thấp hơn
HupA [42]. Ngược lại, 11-α-hydroperoxyphlegmariurine B,
7-hydroperoxyphlegmariurine B và phlegmariurine B cũng thuộc nhóm
fawcettimine lại không có khả năng ức chế hoạt động của enzyme AchE [43]. Một
hợp chất lycopodium alkaloid khác là 12-deoxyhuperzine O thuộc nhóm lycopodine
cũng được tìm thấy trong cây Thạch tùng răng cưa, đây là một chất đối kháng của
13
thụ thể N-methyl-D-aspartate (NMDA) [44].
Ngoài các hợp chất lycopodium alkaloid đã được khảo sát rộng rãi, cây
Thạch tùng răng cưa còn chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học tự nhiên khác như
nhóm triterpene: Serrat-14-en-3β,21α,29-triol [45];
Flavon:5,5’-dihydroxy-2’,4’-dimethoxyflavone-7-О-β-D-(6’’-O-Z-p-coumaroyl)-gl
ucopyranoside [46], và axit phenolic [43, 47].
Hình 1.6. Các hợp chất khác từ loài Thạch tùng răng cưa [1].
A. Serrat-14-en-3β,21α,29-triol; B. 5,5’-dihydroxy-2’,4’-
dimethoxyflavone-7-О-β-D-(6’’-O-Z-p-coumaroyl)-glucopyranoside.
Năm 2019, Lê Đình Mạnh và cộng sự đã nghiên cứu phân lập được hai hợp
chất terpenoid từ phân đoạn dịch chiết ethyl acetat của cây Thạch tùng răng cưa
bằng phương pháp sắc ký cột và sắc kí lớp mỏng. Hai hợp chất phân lập được có tên
là 3β, 21β, 29-trihydroxyserrat-14-en-24-oic axit-3β-yl-(7’-hydroxycinnamat)
(HSE-1); 16-oxo-3α-hydroxyserrat-14-en-21β-ol (HSE-2) (Hình 1.7). Trong đó, lần
đầu tiên hợp chất 3β, 21β, 29-trihydroxyserrat-14-en-24-oic
axit-3β-yl-(7’-hydroxycinnamat) được phân lập từ cây Thạch tùng răng cưa [48].
Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của hai hợp chất HSE-1 (a) và HSE-2 (b) [48].
14
Huang và cộng sự (2010) đã sử dụng chỉ thị AFLP để nghiên cứu mức độ
biểu hiện và mô hình biến dị di truyền trong và giữa các quần thể tự nhiên của loài
Thạch tùng răng cưa. Nghiên cứu đã sử dụng 7 tổ hợp mồi để khuyếch đại 615 băng,
trong đó có 532 băng là đa hình (86,50%). Điều này cho thấy ở mức độ loài có sự
đa dạng di truyền lớn. Phân tích AMOVA cho thấy mười quần thể có mức độ đa
dạng di truyền thấp. UPGMA cluster của tất cả các mẫu này cho thấy các cá thể từ
quần thể giống nhau không tập trung lại thành một nhóm riêng biệt. Thử nghiệm
Mantel test cho thấy không có sự tương quan đáng kể giữa khoảng cách di truyền và
khoảng cách địa lý (r = 0,28; P = 0,89). Do vậy, sự phát tán gen không bị hạn chế về
mặt địa lý. Các yếu tố có thể ảnh hưởng đến di truyền của loài Thạch tùng răng cưa
bao gồm: sự tăng trưởng của dòng vô tính, hiệu quả của chọn lọc và lai xa, cũng
như hiệu quả phát tán bào tử của gió [49].
Sự đa dạng di truyền và cấu trúc di truyền của 7 quần thể và 112 cá thể của
loài Thạch tùng răng cưa thu tại dãy núi Wuyi ở Trung Quốc đã được phân tích
bằng kỹ thuật AFLP. Tổng cộng 675 phân đoạn được khuếch đại, trong đó có 555
phân đoạn đa hình. Số alen quan sát được (Na) và số alen hiệu quả (Ne) lần lượt là
1,63 và 1,49. Giá trị trung bình của chỉ số đa dạng di truyền Nei (He) và chỉ số đa
dạng di truyền Shannon (I) lần lượt là 0,27 và 0,39. Các quần thể Tainning và
Jianning nằm ở giữa dãy núi Wuyi có mức độ đa dạng cao nhất, trong khi quần thể
Guangze phân bố ở phần phía bắc của dãy núi có độ đa dạng thấp nhất. Tổng đa
dạng di truyền (Ht) là 0,33 và sự đa dạng gen của quần thể (Hs) là 0,27. Hệ số khác
biệt gen giữa các quần thể trong loài (GST) là 0,17, cho thấy biến dị trong quần thể
là nguyên nhân chính tạo nên sự đa dạng di truyền của loài Thạch tùng răng cưa ở
dãy núi Wuyi [50].
Kỹ thuật SSR (kỹ thuật chuỗi lặp lại đơn giản) đã được sử dụng để nghiên
cứu sự đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể của 177 cá thể loài Thạch tùng răng
cưa ở Trung Quốc. Kết quả nghiên cứu cho thấy có 20 cặp mồi đã được khuếch đại
thành công bằng kỹ thuật PCR. Trong số 20 cặp mồi này, có 10 cặp mồi biểu hiện
tính đơn hình (không được nghiên cứu thêm) và 10 cặp mồi đa hình được sử dụng
để đánh giá thông tin đa hình về năm quần thể loài Thạch tùng răng cưa, xác định
15
tổng số 72 alen. Hệ số thông tin di truyền (PIC) đối với các mồi SSR dao động từ
0,31 đến 0,73, trung bình là 0,57. Mức độ dị hợp tử mong đợi của đa dạng di truyền
nằm trong khoảng 0,06 đến 0,79 và mức độ dị hợp tử quan sát được dao động từ
0,00 đến 1,00. Tám markers SSR có mức độ dị hợp tử trên 0,50, điều này cho thấy
loài Thạch tùng răng cưa có mức độ đa hình cao [51].
Sự đa dạng di truyền và sự biến đổi của bốn quần thể loài Thạch tùng răng
cưa phân bố ở Việt Nam đã được phân tích dựa trên dữ liệu dấu vân tay DNA thu
được từ các kỹ thuật ISSR và ScoT riêng rẽ và kết hợp với nhau. Cả hai chỉ thị
ISSR và ScoT đều cho thấy sự đa dạng di truyền của Thạch tùng răng cưa ở Việt
Nam là tương đối cao ở cả cấp quần thể và cấp độ loài, trừ quần thể Hoàng Liên.
Các chỉ số đa dạng di truyền của quần thể Hoàng Liên là chỉ số đa dạng gen Nei’s
(He) = 0,1436, chỉ số Shannon (I) = 0,2161, tỷ lệ các băng đa hình (PPB) = 45,45%;
của quần thể Bạch Mã là He = 0,21, I = 0,33, PPB = 71,97%; của quần thể Ngọc
Linh với He = 0,20, I = 0,31, PPB = 74,24%; của quần thể Bidoup là He = 0,19, I =
0,30, PPB = 74,24% và ở cấp loài tại Việt Nam là He = 0,23, I = 0,36, PPB = 100%.
Sự khác biệt di truyền cao với giá trị GST = 0,19 và số lượng cá thể di cư được ước
tính thông qua dòng chảy gen là Nm = 2,16 cá thể trên mỗi thế hệ trong các quần thể.
Kết quả phân tích phương sai phân tử (AMOVA) cho thấy tổng số biến thể nằm
giữa và trong quần thể tương ứng là 28% và 72% [22].
1.2. Huperzine A, hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cưa
Huperzine A (HupA) là hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cưa
(Huperzia serrata), có hiệu quả trong việc cải thiện các dấu hiệu suy giảm nhận
thức và được sử dụng để điều trị bệnh Alheizmer ở người già [52] (Hình 1.8). HupA
được các nhà khoa học Trung Quốc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1948. Sau đó,
HupA được các nhà khoa học phương tây phân lập, tinh sạch, sử dụng vào năm
1986 [53] và ngày càng được sử dụng rộng rãi trong sản xuất dược liệu và thuốc
trên toàn thế giới.
1.2.1. Các nguồn tự nhiên có chứa HupA
HupA là một lycopodium alkaloit có nguồn gốc từ loài Thạch tùng răng cưa
ở Trung Quốc [54]. Các nghiên cứu cho thấy HupA có thể được tổng hợp hóa học
[55, 56] nhưng hỗn hợp racemic ít có hiệu quả trong việc ức chế enzyme AChE so
16
với HupA tự nhiên có nguồn gốc chiết xuất từ thực vật [56]. Do đó, HupA thương
mại vẫn chủ yếu được chiết xuất từ toàn bộ lá của loài Thạch tùng răng cưa, dẫn đến
việc thu mua quá mức và sự suy giảm mạnh mẽ quần thể loài Thạch tùng răng cưa
trong tự nhiên trên khắp Trung Quốc [31].
Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng
răng cưa ít hơn 0,02% khối lượng tươi [57, 58] và 0,0047 - 0,025% khối lượng khô
[59]. Hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa thu tại Trung Quốc đạt từ
80,20 - 182,60 µg/g khối lượng khô [60]. Thạch tùng răng cưa sinh trưởng ở các
khu rừng ẩm ướt có chứa hàm lượng HupA cao hơn đáng kể so với sinh trưởng ở
các môi trường có độ ẩm thấp hơn. Thêm vào đó, hàm lượng HupA thay đổi đáng
kể theo mùa, với hàm lượng HupA cao nhất thu được vào giữa mùa thu và thấp nhất
vào đầu mùa xuân. Hơn nữa, hàm lượng HupA còn mang tính đặc hiệu mô, mô lá
non có chứa hàm lượng HupA cao nhất, tiếp đến là thân cây, sau đó đến lá già và
thấp nhất ở rễ [17, 60]. Nghiên cứu khác về cây Thạch tùng răng cưa thu tại thành
phố Yamagata, Nhật Bản đã xác định hàm lượng HupA ở loài cây này chiếm 0,5%
khối lượng tươi [33]. Như vậy, hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa phụ
thuộc vào vùng phân bố, độ ẩm môi trường sống, thay đổi theo mùa, mang tính đặc
hiệu mô, phụ thuộc vào quá trình thu hái và phương pháp tách chiết [59, 60]. Việc
tích luỹ HupA mang tính đặc hiệu mô cho thấy phương pháp nuôi cấy mô các loài
thực vật trong chi Huperzia đóng vai trò quan trọng đối với việc sản xuất HupA
[61].
Mặc dù, HupA có nguồn gốc từ loài Thạch tùng răng cưa nhưng hợp chất này
còn được tìm thấy ở nhiều loài khác có mối quan hệ gần gũi với loài Thạch tùng
răng cưa thuộc họ Huperziaceae như loài H. selago có chứa hàm lượng HupA từ
0,04 đến 0,16% khối lượng tươi [62]. Mặc dù, một số loài trong họ Huperziaceae có
chứa hàm lượng HupA cao hơn loài Thạch tùng răng cưa như loài H. carinata (Desv.
Ex Poir.) Trevis [= Phlegmariurus carinatus (Devs. Poir.) Ching] (hàm lượng HupA
từ lá là 560 µg /g khối lượng khô [60]), loài H. selago (L.) Bernhardi ex Schrank &
C.F.P. Martius (hàm lượng HupA là 1270 µg/g khối lượng khô [63], loài H. carinata
(chứa hàm lượng HupA là 1030 µg/g khối lượng khô [2], loài H. elmeri (hàm lượng
HupA là 1012 µg/g khối lượng khô [61]) và loài H. aqualupiana (hàm lượng 204
17
µg/g khối lượng khô [61]) nhưng ít được quan tâm như loài Thạch tùng răng cưa vì
những loài trên khó tìm và ngày càng khan hiếm hơn so với loài Thạch tùng răng
cưa [64]. Ngoài ra, HupA còn được tìm thấy ở nhiều loài thực vật khác nhau thuộc
họ Lycopodiaceae và Selaginella. Tuy nhiên, HupA chỉ được phân lập từ các loài
thuộc chi Huperzia Bernhardi [2, 60].
Các loài thực vật trong họ Huperziacae sinh trưởng chậm và hàm lượng
HupA được thu nhận từ nguồn tự nhiên bị hạn chế. Hàm lượng HupA rất thấp trong
thực vật thô nên việc phát triển nguồn sản xuất HupA rất được quan tâm. Phương
pháp nuôi cấy in vitro loài Phlegmariurus squarrosus, một thành viên của họ
Huperziaceae, đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy mẫu mô được nuôi cấy in vitro
đã sản sinh ra hàm lượng HupA (675,69 µg/g khối lượng khô) cao hơn so với hàm
lượng HupA được tổng hợp từ cây trồng tự nhiên (378,83 µg/g khối lượng khô) và
đây là một nguồn sản xuất HupA tuyệt vời [32].
Cytochrome P450 liên quan đến quá trình biến đổi oxy hoá của các hợp chất
trung gian [65]. Hai mươi gen cytochrome P450 của loài Thạch tùng răng cưa mã
hóa cho sinh tổng hợp lycopodium alkaloid (tập trung ở lá nhiều hơn ở rễ cây) đã
được tìm thấy dựa trên việc so sánh dữ liệu trình tự 454-ESTs của Thạch tùng răng
cưa và P. carinatus và phân tích Real-time PCR. Bốn chuỗi phiên mã giả định (PUT)
CYP450 (Hs01891, Hs04010, Hs13557 và Hs00093) là các PUT chính tham gia
vào quá trình sinh tổng hợp alkaloid lycopodium. Khoảng 115 PUT của loài Thạch
tùng răng cưa và 98 PUT của loài P. carinatus liên quan đến quá trình sinh tổng hợp
các triterpenoid, alkaloid và flavones/ flavonoid [47].
Nghiên cứu về các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp HupA trong cây
Thạch tùng răng cưa cho thấy, quá trình sinh tổng hợp các tiền chất của HupA chỉ
có 3 loại enzyme tham gia là lysine decarboxylase (LDC) [66, 67], đồng amin
oxidase (CAO), và polyketide polysetase type III (PKS) (Hình 1.8) [68].
Ngoài ra, HupA còn được tìm thấy trong các loài nấm nội sinh trong cây
Thạch tùng răng cưa như là Colletotrichum gloeosporioides ES026 với sản lượng
trong quá trình lên men là 1 µg/g khối lượng khô [69], gen CAO có liên quan đến
quá trình sinh tổng hợp HupA ở chủng nấm ES026 [70], phát hiện hợp chất HupA
và HupB trong dịch chiết nấm Colletotrichum gloeosporioides [71], loài
18
Paecilomyces tenuis YS - 13 [72] (sản lượng HupA trong quá trình lên men là 21,0
µg/l [72]), loài Penicillium sp. LDL4.4 (sản lượng HupA là 1380 µg/l (168,90 µg/g
khối lượng khô)) và còn nhiều loài nấm khác nữa [25].
Hình 1.8. Con đường sinh tổng hợp của HupA [7].
1.2.2. Thành phần, cấu tạo và tính chất vật lý, hóa học của HupA
HupA [(-) - HupA và (+) - HupA], ký hiệu hóa học là
(1R,9S,13E)-1-amino-13-ethylidene-11-methyl-4-azatricyclo [7.3.1.02,7] trideca -
2(7),3,10-trien-5- one, là một sesquiterpene lycopodium alkaloid không bão hòa liên
quan đến các quinolizidine [1, 73]. Về mặt cấu trúc, HupA là một phân tử khá độc
đáo do bộ khung liên kết chặt chẽ chứa một nhóm ethylidene và một nhân thơm
pyridone hợp nhất với một hệ thống mạch vòng mang nhóm amin (Hình 1.9).
Hình 1.9. Các đồng phân quang học của HupA [1].
Công thức cấu tạo của HupA là C15H18N20 (khối lượng phân tử 242,14), nhiệt
độ nóng chảy 230oC. HupA là một chất có hoạt tính quang học và tồn tại trong tự
19
nhiên với 2 dạng đồng phân quang học là (-)-HupA (L-HupA) hoạt động mạnh hơn
dạng (+)-HupA (D-HupA). HupA là chất rất ổn định, với hình dạng kết tinh trắng,
tan trong dung dịch axit và chloroform. Cấu trúc hóa học của HupA không bị thay
đổi khi bảo quản lâu dài ở 24oC với enzyme AChE hoặc butyrylcholinesterase
(BuchE), hoặc sau 96 giờ ủ với axit HCl 0,1N hoặc NaOH, cho thấy việc mở vòng
pyridone là không thể xảy ra. Những dữ liệu này chứng minh cho sự ổn định cao
của HupA [1].
Hình 1.10. Cấu trúc tương tự của HupA và acetylcholine (ACh) [1].
Nghiên cứu cho thấy HupA có cấu trúc cơ bản giống ACh (Hình 1.10) [1].
Trên thực tế, một sự tương đồng hợp lý về mặt cấu trúc được tìm thấy giữa nhóm
nitơ, oxy và cacbonyl của ACh, với nitơ - amin, nitơ và cacbonyl tương ứng của
HupA. Nguyên tử nitơ - amin của HupA nằm xa nhóm cacbonyl của vòng pyridine,
trong khi nguyên tử nitơ bậc bốn trong phân tử ACh là từ nhóm este cacbonyl, do
đó, thành phần 5-aminomethyl-2(1H)-pridone của HupA được công nhận là nhóm
chức mang lại tính dược phẩm của nó [74]. Sự có mặt đồng thời của các nhóm
amine, vòng pyridone, gốc ethylidene exocyclic, cầu ba cacbon với liên kết đôi của
nó, và nhóm metyl của cầu nối thẳng là điều kiện cần thiết với phân tử HupA để nó
giữ được hiệu quả ức chế cao đối với enzyme AChE (Hình 1.11). Như vậy, việc loại
bỏ hoặc thay thế một trong những đặc điểm cấu trúc này sẽ làm giảm đáng kể hoạt
tính ức chế của HupA đối với enzyme AChE [1].
Hình 1.11. Cấu trúc phân tử HupA. (1) nhóm amin, (2) vòng α-pyridone; (3) gốc
ethylydene exocyclic; (4) cầu ba cacbon và liên kết đôi; và (5) nhóm metyl [1].
20
Cấu hình không gian vững chắc của phân tử HupA quyết định tính hoạt động
của nó. Nghiên cứu cho thấy phân tử (-) - HupA (hằng số ức chế là 300 nM) có hiệu
quả ức chế enzyme AChE mạnh hơn 38 lần so với dạng đồng phân (+) - HupA
(hằng số ức chế là 8 nM) [75, 76]. Kết quả thử nghiệm trên chuột cho thấy cơ chế
hoạt động sinh học của (±) - HupA và (-) - HupA là giống nhau [77, 78]. Tuy nhiên,
s tương ứng là 3 x l0-7 M và l0-7 M) vì
hỗn hợp racemic tổng hợp (±) - HupA có hiệu quả ức chế enzyme AChE thấp hơn 3
lần so với (-) - HupA trong ống nghiệm (IC50
trong thành phần của hỗn hợp racemic thì dạng đồng phân (+) - HupA được chứng
minh là có hiệu lực thấp hơn đáng kể (IC50= 7 x 10-6 M). Do đó, hỗn hợp racemic có
hoạt tính sinh học yếu hơn các sản phẩm tự nhiên, có thể do sự hiện diện của đồng
phân quang học (+) - HupA [77, 78, 79]. Các nghiên cứu về cấu trúc sinh học cho
thấy HupA trực tiếp liên kết với các vị trí hoạt động trong enzyme AChE, ngăn chặn
sự tiếp cận của cơ chất nội tại (Hình 1.12) [1].
Hình 1.12. Các tương tác chính giữa AchE và phân tử HupA [1].
HupA có hoạt tính ức chế AchE mạnh hơn các chất ức chế cholinesterase
khác, với ái lực ức chế enzyme AchE cao gấp 900 lần so với ức chế enzyme BuChE
được tìm thấy bên ngoài hệ thần kinh trung ương [54].
1.2.3. Các nghiên cứu về tách chiết và xác định hàm lượng HupA
Sử dụng kỹ thuật HPLC-UV, Szypula và cộng sự (2005) đã xác định được
21
hàm lượng HupA cao nhất (3330 µg/g khối lượng khô) trong các mầm của cây phát
triển từ phôi soma. Sản lượng HupA trong cây thạch tùng răng cưa thu được trong
môi trường sống tự nhiên dao động từ 540 µg/g khối lượng khô (chồi thu hoạch vào
mùa xuân) đến 1270 µg/g khối lượng khô (chồi thu hoạch vào mùa thu) [64].
Sự thay đổi hàm lượng HupA ở cả giữa và trong quần thể tự nhiên của loài
Thạch tùng răng cưa đã được xác định bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao
(HPLC) [49]. Kết quả cho thấy, hàm lượng HupA khác nhau đáng kể bởi vị trí địa lý
và thay đổi theo kinh độ. Điều này cho thấy, hàm lượng HupA là kết quả sự tương
tác giữa gen và môi trường và được kiểm soát chủ yếu bởi yếu tố di truyền [49].
Phương pháp sắc kí lỏng siêu hiệu năng - khối phổ (UPLC - MS) đã được sử
dụng để xác định hàm lượng HupA có trong 11 loài Huperzia. Kết quả cho thấy,
hàm lượng HupA cao nhất được tìm thấy ở loài Huperzia pinifolia [80]. Sự tích luỹ
các lycopodium alkaloit khác được theo dõi bằng phân tích Q-IMS-TOFMS [80].
Zhang và cộng sự (2013) đã tách chiết được HupA từ loài Thạch tùng răng
cưa bằng methanol/ nước/ axit formic (10/90/0,2; v/v/v). Sau đó, mẫu tách chiết
được xác định hàm lượng HupA bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao
(HPLC). Việc tách chiết được thực hiện trên cột Xcharge C18 (150 mm x 4,6 mm,
5µm), dung dịch rửa giải là nước (có chứa 0,10% (v/v) axir trifluoroacetic) và
acetonnitrile (chứa 0,09% (v/v) axit trifluoroacetic) là pha động. Kết quả tách nhanh
chóng đạt được sau 10 phút, tốc độ dòng chảy là 2 ml/ phút, UV 310 nm. Theo các
điều kiện tối ưu, đường tuyến tính tốt thu được trong khoảng 2,12 - 106 mg/ l với hệ
số tương quan R2 khoảng 0,9999. Giá trị thu hồi trung bình khoảng 102,34% với độ
lệch chuẩn tương đối (RSD) 0,46%. Kết quả chứng minh rằng phương pháp định
tính và định lượng HupA bằng HPLC là phương pháp đơn giản, nhanh chóng và
chính xác với khả năng thu hồi tốt và có thể sử dụng để đánh giá chất lượng của loài
Thạch tùng răng cưa [81].
Nguyễn Ngọc Chương và cộng sự (2016) đã nghiên cứu thiết lập chất chuẩn
và định lượng HupA trong một số loài Thạch tùng ở Việt Nam. Nghiên cứu đã thiết
lập được chất chuẩn HupA với độ tinh khiết 99,13% để làm chất đối chiếu trong
kiểm nghiệm đánh giá chất lượng các dược liệu. Quy trình định tính và định lượng
bằng phương pháp HPLC được xây dựng và thẩm định đạt yêu cầu để ứng dụng xác
22
định hàm lượng HupA trong 10 loài thuộc họ Thạch tùng ở Việt Nam. Nghiên cứu
đã xác định được hàm lượng của HupA trong cây Thạch tùng răng cưa thu tại Kon
Tum, Tây Nguyên là 181,64 µg/g [82].
Nguyễn Thị Minh Thành và cộng sự (2020) đã phát hiện trong 58 chủng nấm
được tìm thấy từ rễ của loài Thạch tùng răng cưa thu hái tại tỉnh Lào Cai, trong đó
chủng nấm Fusarium sp. Rsp5.2 có khả năng sản xuất HupA. Sử dụng kỹ thuật
HPLC, nghiên cứu của Nguyễn Minh Thành đã xác định được hàm lượng HupA
được sản xuất bởi chủng nấm này đạt 19,45 µg/g khối lượng khô của nấm [83].
1.2.4. Vai trò của HupA trong y học
HupA được xem là điều kiện để điều trị bệnh Alzheimer, dạng phổ biến nhất
của bệnh sa sút trí tuệ [84].
1.2.4.1. Bệnh Alzheimer
Alzheimer (AD) là một bệnh thoái hóa thần kinh ảnh hưởng đến người cao
tuổi và gần như chưa có liệu pháp điều trị hiệu quả [85, 86]. AD được công nhận là
một trong những bệnh thoái hóa thần kinh phức tạp nhất và là một vấn đề lớn của xã
hội. Càng ngày số người mắc AD trên thế giới càng tăng. Năm 2015, ước tính có
26,6 triệu bệnh nhân mắc AD được báo cáo trên toàn thế giới [87]. Đến năm 2018,
số lượng người bị mắc bệnh mất trí nhớ và alzheimer là 50 triệu người. Con số này
được dự đoán sẽ tăng lên 152 triệu vào năm 2050 [88].
Về mặt bệnh lý, Alzheimer được đặc trưng bởi sự tích tụ quá nhiều các β -
amyloid peptide ở ngoại bào, ở dạng mảng xơ vữa và đám rối thần kinh nội bào [19,
89]. Ngoài ra, nó còn ảnh hưởng đến quá trình dẫn truyền thần kinh trong não [90].
Ở những người mắc bệnh Alzheimer diễn ra sự suy giảm chức năng nghiêm trọng
của các tế bào dẫn truyền thần kinh cholinergic, dẫn đến mất trí nhớ hoặc suy giảm
nhận thức, nguyên nhân là do sự suy giảm nồng độ của Ach trong não [91].
1.2.4.2. Đặc tính chữa bệnh Alzheimer của HupA
HupA có khả năng xuyên qua hàng rào mạch máu não và tác động trực tiếp
lên não bộ với liều lượng rất thấp tính bằng microgram. Trên thực tế, HupA ức chế
việc sản sinh ra AChE, một enzyme tạo ra sự suy thoái của ACh. Khi enzyme
AChE bị thiếu hụt hoặc chỉ có với hàm lượng rất thấp thì hàm lượng AChE trong
23
não tăng lên, giúp cho trí nhớ và các chức năng nhận thức được cải thiện. Kết quả
nghiên cứu cũng cho biết việc vô hiệu hóa enzyme AChE được biết đến nhiều nhất
với vai trò làm giảm hợp chất canabinoid trong não bộ, sẽ giúp ngăn ngừa sự sản
sinh và tích tụ của mảng beta amyloid, nguyên nhân chính dẫn tới bệnh Alzheimer.
Hạn chế enzyme AChE cũng làm giảm sự sưng tấy và thoái hóa neuron thần kinh,
đồng thời làm tăng tính dẻo dai của não bộ, khả năng học hỏi và trí nhớ [1, 84, 89,
90].
Ở các vùng não khác nhau, HupA biểu hiện hoạt tính ức chế enzyme AchE
với nồng độ thấp hơn các chất ức chế khác [54]. Hơn nữa, HupA có thời gian hoạt
động dài hơn và xâm nhập vào hàng rào mạch máu não tốt, ít phản ứng phụ hơn so
với tetrahydroaminoacridine, physostigmine, galantamine, donepezil, tacrine….
Đồng thời, HupA được chứng minh là không có độc tính đối với người và động vật
[84]. Với các đặc tính ưu việt trên, HupA có tác dụng điều trị chính đối với bệnh sa
sút trí tuệ do thiếu acetylcholine, bao gồm bệnh Alzheimer, chứng sa sút trí tuệ
mạch máu não, bệnh nhược cơ (myasthenia gravis), nhiễm độc organophosphate và
tâm thần phân liệt, tính chống viêm, chống ức chế và chống co giật. Ngoài ra, HupA
cũng là một chất đối kháng thụ thể N-methyl-D-aspartate của não. Do đó, HupA
được dùng để chữa cho các đối tượng bị bệnh động kinh [91, 92].
Ngoài HupA, berry anthocyanin, trans-resveratrol, Ginkgo biloba, Bacopa
monniera, Centella asiatica, ginseng, vitamin B12, axit alpha lipoic, vinpocetine,
tocotrienols và dầu cọ palm, selenium, black pepper (hồ tiêu đen), acetylcholine và
axit gamma aminobutyric cũng có hiệu quả trong việc tăng cường chức năng của
não bộ và thể lực [93, 94, 95, 96, 97, 98].
1.2.5. Dược động học của HupA
Các nghiên cứu tiền lâm sàng về cơ chế hoạt động của HupA cho thấy đây là
một chất ức chế mạnh đối với enzyme acetylcholinesterase (AChE). Hiệu lực của
nó cạnh tranh với chất ức chế AChE cổ điển, physostigmine (Phy) [99, 100]. Các
nghiên cứu về độc tính học của HupA được thực hiện trong khoảng 6 tháng trên chó
và chuột cho thấy HupA không thể hiện độc tính đối với gan của chó và thỏ hoặc
bất kỳ phản ứng phụ nào khác như buồn nôn, nôn mửa, rối loạn đường tiêu hóa,
trầm cảm... thường xảy ra sau khi điều trị bằng Phy [101, 102]. Về hành vi, HupA
24
đã cho thấy tác dụng cải thiện trí nhớ và học tập ở chuột đồng [103, 104], chuột
nhắt và sóc khỉ [104, 105]; Vì vậy, HupA là một chất tăng cường nhận thức hiệu quả
ở một số loài động vật khác nhau [78].
Dược động học của HupA không chỉ được nghiên cứu ở các loài động vật
khác nhau mà còn được nghiên cứu trên những người tình nguyện khỏe mạnh [106,
107]. Ở chuột, sau khi tiêm tĩnh mạch (iv) hoặc qua đường uống (po) dung dịch [3H]
HupA thì nồng độ enzyme AChE trong máu giảm như một biên dạng hai pha và tác
dụng sinh học là khá cao (96,90%) [106, 108, 109]. Hơn thế nữa, HupA được phân
tán chủ yếu vào thận và gan, lá lách, phổi, tim và một lượng nhỏ cho não [108]. Tuy
nhiên, sau khi tiêm tĩnh mạch HupA vào chuột, hình ảnh phóng xạ cho thấy các hợp
chất này có mặt ở tất cả các khu vực của não bộ, nhưng nó đặc biệt tập trung ở vỏ
não trước, vân não, vùng hồi hải mã và vùng nhân não [78]. Nghiên cứu cho thấy
mức độ liên kết của HupA với các protein huyết tương chỉ có khoảng 17% [108].
Mặt khác, phần lớn hợp chất này được bài tiết vào nước tiểu trong 24h, còn 2,40%
thu được trong phân. Tuy nhiên, điều đáng lưu ý là trong những con chuột mang
thai có mặt một lượng nhỏ phóng xạ trong bào thai sau khi tiêm [3H] HupA vào tĩnh
mạch [108].
Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng - khối phổ (LC - MS/MS), Wang và cộng
sự (2004) đã xây dựng đường cong nồng độ HupA theo thời gian ở huyết tương của
chó sau khi tiêm bắp (im) với cùng một công thức (10 µg/ kg/ 15 ngày). Nồng độ
cao nhất (Cmax) đạt được sau 48h tiêm là 0,36 ng/ ml; Nồng độ HupA giảm còn một
nửa sau 54,8h và vùng dưới đường cong về nồng độ - thời gian (AUC) là 92,6 ng h/
ml [110].
Qian và cộng sự (1995) đã nghiên cứu dược động học của HupA trên sáu
người tình nguyện Trung Quốc theo đường uống với 1 liều duy nhất có chứa 0,99
mg (viên nén). Các giá trị Cmax và thời gian để đạt Cmax (Tmax) lần lượt là 8,40 µg/ l
và 79,6 phút sau khi dùng thuốc. Nồng độ HupA thải ra ngoài một nửa sau 288,5
phút, liều lượng cho phép dùng mỗi ngày ở người là hai hoặc ba lần. Như vậy,
HupA được hấp thu nhanh ở đường tiêu hóa, nhanh chóng phân tán vào cơ thể và bị
đào thải ra ngoài với tốc độ từ từ [111]. Đặc tính dược động học của HupA cũng
được thử nghiệm trên mười hai người tình nguyện khỏe mạnh (nam và nữ, độ tuổi
25
từ 20 đến 25) với một liều duy nhất 0,40 mg (viên nén). Trong nghiên cứu của
Ferreira và cộng sự (2016), mức định lượng của HupA đã được tìm thấy trong huyết
tương sau 5-10 phút dùng thuốc và các kết quả tổng thể cho thấy đặc tính dược
động học của HupA phù hợp với mô hình hai pha với giai đoạn phân phối nhanh,
sau đó là giai đoạn loại bỏ chậm [1].
Như vậy, các nghiên cứu về dược độc học HupA ở cả trên cơ thể người và cơ
thể động vật cho thấy HupA có khả năng sinh khả dụng cao, hấp thu nhanh và phân
bố rộng, ít tác dụng phụ. Điều này cho thấy, HupA là một trong những hợp chất có
giá trị lớn trong điều trị bệnh Alzheimer và các bệnh liên quan đến suy giảm trí nhớ
khác.
1.3. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa trên thế giới và ở
Việt Nam
1.3.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa trên thế giới
1.3.1.1. Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô
Các mẫu cấy Thạch tùng răng cưa được khử trùng bằng cách sử dụng H2O2,
C2H5OH, HgCl2 và các dung dịch có chứa thành phần kháng sinh cùng với các
phương pháp xử lý bằng nước nóng để loại bỏ các vi sinh vật nội sinh trong cây.
Kết quả cho thấy, phương pháp thích hợp để khử trùng bề mặt và loại bỏ các vi sinh
vật nội sinh trong thân cây là ngâm các mẫu cấy trong nước nóng (47°C) trong 1 giờ,
tiếp theo là bằng dung dịch C2H5OH 70% trong 30 giây và sau đó bằng HgCl2
0,10% trong 7 phút. Phương pháp thích hợp để khử trùng bề mặt đối với các túi bào
tử và chồi đỉnh là ngâm các mẫu cấy trong C2H5OH 70% trong 30 giây, tiếp theo là
HgCl2 0,10% trong 4 phút. Sử dụng các chất khử trùng cùng với xử lý nước nóng có
thể làm giảm đáng kể tỷ lệ nhiễm của mẫu cấy. Các túi bào tử và chồi đỉnh hầu như
không chứa vi sinh vật nội sinh là các mẫu cấy tuyệt vời cho nuôi cấy mô thực vật
[112].
Yang và cộng sự (2008) đã sử dụng chồi đỉnh dài khoảng 1,0 cm đến 1,5 cm
của cây Thạch tùng răng cưa làm mẫu cấy. Các mẫu cấy được tiến hành khử trùng
bề mặt bằng phương pháp khử trùng đơn hoặc khử trùng kép; khử trùng bên trong
bằng chất kháng sinh và dung dịch malachite green để loại bỏ các vi khuẩn, nấm nội
26
sinh và ngoại sinh; tiếp theo chuyển sang môi trường MS, 1/2 MS và 1/4 MS để
nuôi cấy. Kết quả cho thấy phương pháp khử trùng thích hợp là sử dụng dung dịch
C2H5OH 70% trong 40 giây, tiếp theo là HgCl2 0,1% trong 8 phút và sau đó là H2O2
70% trong 10 phút, và tỷ lệ vô trùng đạt được là 63%. Các mẫu cấy đã khử trùng
được nuôi cấy trên môi trường có chứa 0,50 mg/l malachite green, kháng sinh 100
mg/l AAS trong 4 tuần và đạt được 52% các mẫu cấy vô trùng. Môi trường thích
hợp để các mẫu cấy sinh trưởng và ra rễ chứa các thành phần khoáng của môi
trường 1/4 MS, các thành phần hữu cơ của môi trường 1/2 MS, 2% đường sucrose
và 4,50 g/l agar [46].
Trong nghiên cứu của Zhou và cộng sự (2009), thân và đỉnh chồi được sử dụng
làm mẫu cấy để tạo mô sẹo. Các mẫu cấy này được nuôi trong bốn môi trường nuôi
cấy: (1) 1/2 MS + 0,05 μmol/l IBA + 1,4 µmol/l KT + 2 mg/l pirydoxin; (2) MS + 0,05
µmol/l IBA + 1,4 µmol/l KT + 2 mg/l pirydoxin; (3) 1/2 MS + 2 mg/l pirydoxine; (4)
MS + 2 mg/l pirydoxine. Kết quả cho thấy môi trường thích hợp để tạo ra mô sẹo là
MS + 0,05 μmol/l IBA + 1,4 μmol/l KT + 2 mg/l pirydoxine. Trong quá trình nuôi cấy
mô, sự nhiễm nấm rất nguy hiểm, do đó, việc khử trùng bề mặt rất quan trọng. Có hai
phương pháp khử trùng bề mặt. Phương pháp thứ 1, đỉnh chồi được ngâm trong dung
dịch ethanol 70% (C2H5OH) 1 phút, 5% sodium hypochlorite (NaOCl) 1 phút và 7%
hydrogen peroxide (H2O2) 10 phút. Phương pháp thứ hai là ngâm trong HgCl2 trong 3
phút. Kết quả cho thấy, phương pháp thích hợp nhất để khử trùng bề mặt các mẫu cấy
là phương pháp thứ hai [113].
Nghiên cứu nuôi cấy in vitro thể bào tử và phôi của loài Huperzia cùng với
phân tích lý hóa để xác định hàm lượng HupA đã được thực hiện. Kết quả nghiên
cứu cho thấy, mẫu cấy sinh trưởng mạnh nhất ở môi trường 1/2 MS. Sau 3 tháng,
các tế bào mô sẹo phát triển từ mô phân sinh đỉnh nuôi cấy chuyển thành phôi sinh
dưỡng (phôi soma) [64].
Nuôi cấy mô 11 loài thực vật thuộc chi Huperzia đã được nghiên cứu. Kết
quả cho thấy 11 loài trong chi Huperzia đã được nuôi cấy in vitro thành công [80].
Nghiên cứu nuôi cấy mô loài H. selago cho thấy môi trường ½ MS thích hợp cho
quá trình hình thành mô sẹo và phát triển thành cây của loài H. selago [64].
Năm 2015, Ma và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu phương pháp khử trùng
27
bề mặt và khử trùng vi khuẩn nội sinh trong chồi đỉnh của cây Thạch tùng răng cưa.
Kết quả cho thấy sau khi khử trùng bề mặt, khử trùng kết hợp 0,50 mg/l malachite
green với 100 mg/l AAS có thể đạt được hiệu quả tốt trong việc khử trùng mẫu cấy.
Sau khi khử trùng, các mẫu cấy vẫn chứa một loại nấm nội sinh, nhưng có thể nuôi
cấy cộng sinh với nấm nội sinh này. Các tác giả đã thu nhận được chồi của loài
Thạch tùng răng cưa, những chồi này dễ dàng phân chia từ thân, có tốc độ ra rễ cao.
Tốc độ ra rễ đạt 90% sau 30 ngày nuôi cấy [114].
Xu và cộng sự (2018) đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường
nuôi cấy khác nhau đến đặc điểm hình thái tế bào, DNA, sự tăng sinh khối và hàm
lượng HupA trong nuôi cấy in vitro loài Thạch tùng răng cưa. Các tác giả đã chỉ ra
rằng trong các môi trường nuôi cấy khác nhau gồm môi tường Sh, W và Shx thì
Thạch tùng răng cưa đã biệt hóa thành dạng tản, dạng sợi nấm (Rhizomorph) và
dạng rêu tương ứng. Các tế bào đơn phát triển thành các cụm và phân chia tạo thành
mô. Các rễ và rễ giả đã phát triển trên bề mặt dạng sợi nấm và bề mặt tế bào dạng
rêu. Sự tăng sinh khối của dạng tản là 1,79 ± 31%, của dạng sợi nấm tăng 833 ±
27% và của dạng rêu tăng 1,96 ± 52% và hàm lượng HupA tương ứng là 71,7 ±
1,54 µg/l, 20,1 ± 0,82 µg/l và 0 µg/l với sai khác có ý nghĩa thống kê (P < 0,01%).
Dạng tản phát triển chậm hơn so với dạng rêu nhưng hàm lượng HupA của dạng tản
là cao nhất, trong khi đó dạng rêu sinh trưởng nhanh nhất nhưng không sản xuất
HupA. Nghiên cứu trên cho thấy môi trường nuôi cấy khác nhau có thể tạo ra các
kiểu hình khác nhau đối với cùng kiểu gen của loài Thạch tùng răng cưa, với các
thay đổi về tỉ lệ sinh trưởng và hàm lượng HupA. Dạng tản là dạng tốt nhất đối với
việc sản xuất HupA [115].
1.3.1.2. Nhân giống vô tính bằng giâm hom thân
Wang và cộng sự (2008) đã thiết lập và tối ưu hóa hệ thống nuôi cấy đối với
loài Thạch tùng răng cưa hoang dại, thông qua việc đánh giá ảnh hưởng của các yếu
tố môi trường đến sự tăng trưởng của cây. Thạch tùng răng cưa được trồng trong
điều kiện tự nhiên, trạng thái tăng trưởng của Thạch tùng răng cưa theo các yếu tố
khác nhau như: cường độ ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm tương đối (RH), mức phân
bón… đã được nghiên cứu và phân tích. Kết quả cho thấy, Thạch tùng răng cưa phát
triển tốt trong môi trường nhiệt độ dao động 18,9 - 26,3°C, độ ẩm tương đối trong
28
phạm vi 81% - 90% và cường độ ánh sáng trong khoảng từ 1330 - 3000 lx [116].
Zeng và cộng sự (2008) đã nghiên cứu điều kiện nhân giống loài Thạch tùng
răng cưa trong môi trường sinh thái học và khả năng nảy mầm của chúng, đồng thời,
nghiên cứu vai trò của chất điều hòa sinh trưởng (GA3) đối với sự phát triển của
Thạch tùng răng cưa. Kết quả cho thấy: (1) Phương pháp nhân giống bằng giâm
hoặc chiết hom thân, các cây con có thể phát triển rễ bất định; (2) Đỉnh chồi không
thể xuất hiện trở lại nếu chúng đã bị cắt đi; (3) GA3 có tác động không đáng kể đến
sự tăng trưởng của loài Thạch tùng răng cưa; (4) Trong 2 năm, cây phát triển từ
mầm có thể dài thêm khoảng 6 cm; (5) Trong đất có chứa kiềm, hầu hết các cây sẽ
khô héo; (6) Giâm hom thân, chiết hom thân và nhân giống bằng mầm là phương
pháp tốt để nhân giống loài Thạch tùng răng cưa, đặc biệt là trong môi trường sống
của cây [117].
Dựa trên các vườn ươm họ Huperziaceae, thí nghiệm giâm hom thân loài
Thạch tùng răng cưa đã được Zhang và cộng sự (2009) tiến hành trong rừng sinh
thái gốc. Kết quả cho thấy, môi trường thích hợp để giâm hom thân loài Thạch tùng
răng cưa là đất rừng sinh thái. Mùa khác nhau (mùa xuân hoặc mùa thu) không ảnh
hưởng nhiều đến hiệu quả của thí nghiệm giâm hom thân trong môi trường sống ban
đầu. Sử dụng chất điều hoà sinh trưởng IBA cho hiệu quả tốt nhất ở nồng độ 2×10-3
ppm IBA. Chỉ số giâm hom thân chồi đỉnh là tốt hơn đáng kể so với các nhóm giâm
hom thân khác. Những kết quả này rất hữu ích cho nhân giống vô tính loài Thạch
tùng răng cưa [118].
Qin và cộng sự (2010) đã nghiên cứu và phát triển phương pháp giâm hom
thân đối với loài Thạch tùng răng cưa bằng hệ thống kỹ thuật NFT thông qua việc
lựa chọn các mẫu cấy, so sánh các công thức hoocmon và phương pháp xử lý, lựa
chọn nồng độ chất dinh dưỡng được cung cấp, chế độ nuôi cấy, cải thiện cấu trúc và
chức năng của vườn ươm NFT. Kết quả cho thấy điều kiện thích hợp cho giâm hom
thân loài Thạch tùng răng cưa là sử dụng hom thân chồi đỉnh + ngâm IBA 1000
mg/l trong 30 phút + chất dinh dưỡng vô cơ của môi trường 1/8 MS + 98 ngày nuôi
cấy NFT. Tỉ lệ ra rễ đạt 98% và tỉ lệ sống đạt 93% - 98% [119].
Sử dụng các cây Thạch tùng răng có chiều cao 10 - 15 cm làm nguyên liệu
và tiến hành nuôi trồng trên 4 loại giá thể là giá thể rong rêu, giá thể đất xói mòn,
29
giá thể hỗn hợp đất xói mòn/ đất vườn và đất cát, sau 3 tháng nuôi trồng, kết quả
cho thấy một lượng lớn các cây con đã bị héo. Tuy nhiên, tỷ lệ sống sót của Thạch
tùng răng cưa cao nhất (90%) trong giá thể rong rêu, (53,30%) trong môi trường đất
xói mòn, (40%) trong giá thể đá vermiculit/ perlit, (30%) trong giá thể cát, (20%)
trong giá thể đất xói mòn/ đất vườn và thấp nhất (13%) trong môi trường đất vườn
thí nghiệm. Do đó, giá thể thích hợp cho nhân giống Thạch tùng răng cưa là giá thể
rong rêu [16].
Quá trình nhân giống loài Thạch tùng răng cưa bằng phương pháp giâm hom
thân và mầm được tiến hành tại trang trại rừng thuộc vùng Yantuozhai, Gaowangjie,
huyện Guzhang, địa khu Xiangxi, tỉnh Hồ Nam, Trung Quốc. Nghiên cứu cho thấy,
3 yếu tố được nghiên cứu để xác định ảnh hưởng đến quá trình tạo rễ của hom thân
là chiều dài hom thân, nồng độ NAA và thời gian xử lý NAA. Kết quả cho thấy,
trong môi trường đất rừng sinh thái, sử dụng hom thân có chiều dài 6 cm, ngâm 5
phút trong NAA 20 mg/l là thích hợp nhất cho việc nhân giống hom thân. Sau 60
ngày giâm, hom thân xuất hiện rễ bất định, tỷ lệ sống lên đến 90%. Sự tăng trưởng
của hom thân tăng rõ rệt sau 210 ngày nuôi trồng [120].
1.3.1.3. Nhân giống bằng bào tử
Maridass và cộng sự (2011) đã nghiên cứu về sự phát triển của túi bào tử,
bào tử nảy mầm, giai đoạn đầu của thể giao tử và tái sinh của H. hilliana (Spring)
trong điều kiện tự nhiên của vùng Kodaiyar, miền Nam Ấn Độ. Kết quả quan sát túi
bào tử trưởng thành dưới kính hiển vi của H. hilliana cho thấy bào tử nảy mầm
trong vòng một tháng. Sự nảy mầm của bào tử và các giai đoạn phát triển của thể
giao tử được quan sát ở điều kiện tự nhiên. Giai đoạn đầu của thể giao tử tăng
trưởng mạnh mẽ. Chu kì sống của H. hilliana trong điều kiện tự nhiên ngắn, trong
vòng 6 tháng (từ tháng 2/ 2011 đến tháng 7/ 2011) và bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi
trường [121].
Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, bào tử của các loài thuộc chi
Huperzia phải mất 2 - 5 năm để phát triển thành thể bào tử [122]. Loài Thạch tùng
răng cưa phát triển chậm hơn, thường đòi hỏi 15 - 20 năm sinh trưởng từ khi bào tử
nảy mầm đến lúc cây trưởng thành đạt chiều cao từ 10 - 30 cm [31, 32, 47]. Cho
đến nay, thế giới chưa thiết lập được phương pháp nảy mầm bào tử ở môi trường đất
30
hoặc môi trường nuôi cấy vô trùng.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về nhân giống vô tính loài Thạch tùng răng cưa
còn rất ít và bố trí chưa bài bản, quy mô nhỏ. Thạch tùng răng cưa là đối tượng mới
trong nghiên cứu nuôi cấy mô ở nước ta. Hiện nay, tại Việt Nam, Phan Xuân Bình
Minh và cộng sự (2018) đã tiến hành nghiên cứu về nuôi cấy mô loài Thạch tùng răng
cưa nhưng mới chỉ dừng lại ở mức độ đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm
đến tỉ lệ sống, chết của mẫu cấy Thạch tùng răng cưa mà chưa đi sâu nghiên cứu, phân
tích sự sinh trưởng, phát triển của cây con nuôi cấy mô [123]. Hơn nữa, nghiên cứu
này mới chỉ dừng lại ở mức độ nghiên cứu, lưu giữ cây trong phòng thí nghiệm và
cũng chưa xác định được sự có mặt của hợp chất HupA trong cây Thạch tùng răng cưa
nuôi cấy mô. Trong khuôn khổ nghiên cứu của đề tài, chúng tôi đã tiến hành các thí
nghiệm về khử trùng mẫu cấy, khả năng nhân chồi, đánh giá chất lượng chồi và tiến
hành nghiên cứu sự ra rễ của chồi Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô; xác định hàm
lượng HupA trong cây con Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô. Tiếp theo, nghiên cứu
đã tiến hành khảo sát khả năng ra cây của cây con nuôi cấy mô trên giá thể thích hợp
tại các vùng nghiên cứu. Đây là một số bước quan trọng tạo cơ sở cho việc xây dựng
quy trình nhân giống và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa với quy mô
lớn.
Chính vì vậy, xuất phát từ giá trị sử dụng làm thuốc chữa các bệnh liên quan
đến giảm trí nhớ và sự suy giảm nhanh chóng của loài Thạch tùng răng cưa trong tự
nhiên, việc nghiên cứu phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa Huperzia
serrata là hết sức cần thiết. Trong đó, hai vấn đề chính phải thực hiện là bảo tồn và
nghiên cứu phát triển nguồn gen. Trong công tác bảo tồn nguồn gen, ngoài đánh giá
đặc điểm hình thái và hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học của loài thì việc
phân tích đa dạng di truyền và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài thực vật
là những thông tin quan trọng cho chiến lược bảo tồn và phát triển các giống cây
trồng. Đồng thời, những thông tin này cũng hữu ích cho việc mô tả nguồn gen và
phân loại thực vật.
31
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng: Cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb. Ex Murray)
Trevis) được lựa chọn theo phương pháp của Nông Văn Duy và cộng sự [124]. Các
mẫu Thạch tùng răng cưa thu tại các địa điểm khác nhau được Vườn Quốc gia
Hoàng Liên và Viện Sinh học Tây Nguyên cung cấp. Các mẫu nghiên cứu được xác
định tên khoa học bởi TS. Nông Văn Duy.
Địa điểm lấy mẫu cụ thể tại 5 vùng thuộc Lào Cai và 3 vùng thuộc Lâm
Đồng như trong hình 2.1, hình 2.2 và bảng 2.1.
Hình 2.1. Bản đồ 5 vị trí lấy mẫu ở Lào Cai
Hình 2.2. Bản đồ 3 vị trí lấy mẫu ở Lâm Đồng
32
Bảng 2.1. Địa điểm lấy mẫu sử dụng trong nghiên cứu.
Tọa độ lấy mẫu
Thời gian lấy mẫu Tuổi mẫu Kinh độ Vĩ độ
1
STT Địa điểm Tên mẫu sử dụng trong nghiên cứu SP1, SP1A
7h sáng 5/12/2015 3- 5 năm 104o02'19'' Đông 22o13'12'' Bắc
2
SP2, SP2A
SP3, SP3A 8h sáng 5/12/2015 9h sáng 5/12/2015
Nậm Cang, Sa Pa, Lào Cai Bản Hồ, Sa Pa, Lào Cai 3 Tả Van, Sa Pa, Lào Cai
4 Lao Chải,
SP4, SP4A 7h sáng 6/12/2015
5
SP5, SP5A 9h sáng 6/12/2015
6
DL1, DL1A 7h sáng 13/12/2015 3- 5 năm 3- 5 năm 3- 5 năm 3- 5 năm 3- 5 năm 104o53'21'' Đông 103o52'58'' Đông 103o51'44'' Đông 103o50'44'' Đông 108o31'47'' Đông 22o11'38'' Bắc 22o14'56'' Bắc 22o17'12'' Bắc 22o23'39'' Bắc 12o08'06'' Bắc
Sa Pa, Lào Cai Tả Phìn, Sa Pa, Lào Cai Bidoup- Núi Bà, Lạc Dương, Lâm Đồng 7 Lạc Xuân,
DL2, DL2A 8h sáng 14/12/2015 3- 5 năm 108o36'01'' Đông 11o46'56'' Bắc
Đơn Dương, Lâm Đồng
DL3, DL3A 9h sáng 15/12/2015 3-5 năm 108o16'35'' Đông 11o49'56'' Bắc
8 Nam Ban, Lâm Hà, Lâm Đồng
Chú ý: kí hiệu các mẫu SP1A SP5A và DL1A DL3A là các mẫu sử dụng trong thí
nghiệm chạy HPLC toàn bộ cây.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất
Hóa chất tách chiết DNA tổng số: Nitơ lỏng, đệm CTAB (H2O, Tris - HCl
33
1M pH 8, EDTA 0,5 M pH 8, NaCl 5M, mecaptoethanol 14 M, CTAB), đệm TE,
RNase (10 µg/ml), isopropanol lạnh, phenol, chloroform, isoamylalcohol (25:24:1),
cồn tuyệt đối, cồn 70%.
Hóa chất PCR: H2O khử ion, mồi, PCR master mix, DNA mẫu.
Hóa chất chạy sắc ký bản mỏng: Chloroform, isopropanol, acetone, ammonia,
ethyl acetate, 1 - butanol, acetic axit, H2O, KMnO4.
Hóa chất chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Acetonitrile, amino axetat,
axit axetic và nước cất loại dùng cho phân tích và chạy HPLC.
Hóa chất sử dụng cho nhân giống: α - NAA, IBA, IAA, BA, kinetin,
pyridoxine, glutamin HgCl2, Javen, C2H5OH, oxy già, axit clohydric, axit citric,
myo - inositol, thiamin, axit nicotinic.
Các hóa chất dùng trong nghiên cứu được mua chủ yếu từ các hãng uy tín như
Merck (Đức), Sigma (Mỹ), Himedia (Ấn Độ)…
2.1.2.2. Thiết bị
Các thiết bị dùng trong sinh học phân tử: máy điện di gel agarose MSmidi
(Cleaver Scientific, Mỹ), máy PCR PTC - 100 (MJ Research Inc, Mỹ). Máy ly tâm
thường và lạnh, máy chụp gel agarose CLS Mcrodoc (Cleaver Scientificc, Mỹ), cân
phân tích, tủ lạnh thường và tủ lạnh sâu, máy đo quang phổ UV - 1601 (UV - Visble
Spectrophotometer, Shimadzu), máy Voltex, bể ổn nhiệt, nồi khử trùng, lò vi sóng,
các loại pipetman và ống Eppendorf các loại.
Thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật: box cấy vô trùng, bình nuôi
cấy, máy đo pH… cùng các trang thiết bị khác của phòng Di truyền Tế bào Thực vật,
Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.3. Môi trường nuôi cấy
Môi trường cơ bản MS (Phụ lục 1.1), môi trường WPM (Phụ lục 1.2) và môi
trường Gamborg B5 (Phụ lục 1.3) đã được thử nghiệm trong quá trình nuôi cấy mô
loài Thạch tùng răng cưa.
2.1.4. Thời gian và địa điểm thí nghiệm
Thời gian: từ tháng 12/2015 đến 11/ 2019.
Địa điểm: Phòng Di truyền Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Vườn Quốc gia Hoàng Liên - Sa Pa
(Lào Cai); Viện nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên - Đà Lạt (Lâm Đồng).
34
Các thí nghiệm tiến hành được bố trí theo sơ đồ tóm tắt sau:
Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu
Đánh giá đa dạng di truyền 1. Đánh giá đặc điểm sinh học của nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa
Xác định hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa
Nhân giống vô tính bằng hình thức giâm hom thân
2. Nhân giống Thạch tùng răng cưa
Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát.
2.2.1. Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh học của nguồn gen loài Thạch tùng
răng cưa
2.2.1.1. Phương pháp đánh giá đặc điểm thực vật học
a. Phương pháp kế thừa
Thu thập các tài liệu nghiên cứu, các công trình nghiên cứu, báo cáo tài
nguyên thực vật về sự phân bố, sinh học, sinh thái học và tri thức sử dụng của người
dân bản địa có liên quan đến loài Thạch tùng răng cưa.
b. Phương pháp thu mẫu:
Thành phần loài được xác định nhanh ngoài thực địa về tên địa phương, tên
phổ thông, tên khoa học và thu hái, mẫu có đủ thân, lá, cơ quan sinh sản để tra cứu
định danh trong phòng thí nghiệm [125].
c. Phương pháp nội nghiệp:
Sử dụng phương pháp so sánh hình thái để xác định thành phần loài thực vật
[18, 19, 124].
35
d. Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái:
Mô tả hình thái (quan sát, chụp ảnh cây tại thực địa, phân tích, chụp ảnh cơ
quan sinh sản, giám định tên khoa học của cây) [124].
f. Phương pháp đo kích thước:
Dùng thước Panme, thước kẹp chuyên dụng để đo đường kính, chiều dài,
chiều rộng của thân cây, lá cây.
g. Phương pháp vi phẫu:
Mẫu thân và lá Thạch tùng răng cưa được tiến hành vi phẫu theo phương
pháp đã được mô tả bởi Nguyễn Quang Hiệu và cộng sự (2017) [5].
2.2.1.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền
a. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số được tách từ các mẫu lá non theo phương pháp của Saghai
Maroof và cộng sự (1984) có cải tiến [126]. DNA tổng số được tách theo các bước
sau: Nghiền mẫu lá trong nitơ lỏng. Bổ sung 0,6 ml CTAB vào 20 mg bột đã nghiền.
Ủ các ống trong bể ổn nhiệt (65°C/ 60 phút). Bổ sung 0,6 ml dung dịch chloroform/
isoamyl alcohol (24:1), ly tâm 12.000 vòng/ phút/ 15 phút ở nhiệt độ phòng. Thu
dịch pha trên, bổ sung isopropanol lạnh theo tỉ lệ 1:1. Để mẫu ở tủ -20°C qua đêm.
Ly tâm 12.000 vòng/ phút/ 15 phút, thu tủa. Thêm 0,6 ml EtOH 70% lạnh và ly tâm
12.000 vòng/ phút/ 15 phút, thu tủa. Để khô và hòa tan tủa bằng 100 µl TE (10 mM
Tris-HCl, 1 M EDTA, pH 8,0), ủ ở 65°C/ 60 phút. Bổ sung 4 µl RNase (10 mg/ ml),
ủ hỗn hợp ở 37°C/ 60 phút. Bổ sung hỗn hợp phenol/ chloroform/ isoamyl alcohol
(25:24:1) theo tỉ lệ 1:1, ly tâm 12.000 vòng/ phút/ 10 phút. Thu dịch pha trên, bổ
sung 0,5 ml dung dịch chloroform/ isoamyl alcohol (24:1), ly tâm 12.000 vòng/
phút/ 10 phút. Thu dịch pha trên, bổ sung EtOH 100% lạnh theo tỉ lệ 2 EtOH: 1 mẫu,
thêm 15 μl NaCl 5M, ly tâm 12.000 vòng/ phút/ 10 phút. Thu tủa và rửa tủa bằng
cồn 70% lạnh, bổ sung TE và giữ mẫu ở - 20°C.
Kiểm tra sản phẩm DNA đã tách chiết bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
Gel agarose được nhuộm trong ethidium bromide và chụp ảnh dưới ánh sáng tử
ngoại ở bước sóng 254 - 260 nm trên máy chụp ảnh gel CLS - Microdoc (Cleaver
36
Scientific Ltd, Mỹ). DNA tổng số sau khi tách chiết sẽ xác định hàm lượng và độ
tinh sạch bằng quang phổ hấp phụ OD ở bước sóng 260 nm và 280 nm trên máy
quang phổ kế 8452 A Hewlett Parkard. Nồng độ DNA được tính theo công thức sau:
Nồng độ DNA (µg/ µl) = OD260 x 50 x hệ số pha loãng
DNA sau khi được xác định hàm lượng và độ tinh sạch được pha loãng về
nồng độ 25 ng/ µl để chuẩn bị cho các thí nghiệm tiếp theo.
b. Phương pháp PCR với các mồi RAPD
Mười sáu (16) mồi ngẫu nhiên sử dụng trong phản ứng RAPD được tổng hợp
bởi hãng Operon, Mỹ (Bảng 2.2.)
Phản ứng PCR - RAPD
Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của 16 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu
STT STT
Tên Trình tự nucleotide mồi (5’-3’) OPB1 GTTTCGCTCC OPB4 GGACTGGAGT GTCCACACGG OPB8 OPB11 GTAGACCCGT OPB13 TTCCCCCGCT OPB15 GGAGGGTGTT OPB18 CCACAGCAGT OPB20 GGACCCTTAC Tên mồi 9 OPC1 10 OPC5 OPC6 11 12 OPC10 13 OPC12 14 OPC13 15 OPC17 16 OPC19 Trình tự nucleotide (5’-3’) TTCGAGCCAG GATGACCGCC GAACGGACTC TGTCTGGGTG TGTCATCCCC AAGCCTCGTC TTCCCCCCAG GTTGCCAGCC 1 2 3 4 5 6 7 8
Phản ứng PCR được thực hiện theo phương pháp của Williams và cộng sự
(1990) [127]. Thể tích cuối cùng là 25 μl dung dịch chứa: đệm PCR 10X (50 mM
KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2 và 0,001% (w/ v) gelatin), 50 ng
DNA khuôn, 0,25 mM dNTPs (Thermo Scientific), 0,025 mM mồi và 1U Taq
polymerase. Hỗn hợp phản ứng được khuếch đại bằng máy PTC-100 (MJ Research
Inc., USA). Phản ứng được thực hiện theo chương trình 94°C ở giai đoạn khởi đầu,
35 chu kỳ lặp lại theo 3 bước chính: biến tính DNA ở 94°C trong vòng 1 phút, gắn
mồi 1 phút ở 37°C và kéo dài chuỗi ở 72°C trong 2 phút và kết thúc bằng giai đoạn
kéo dài chuỗi ở 72°C trong vòng 5 phút. Khi hoàn thành xong phản ứng PCR, các
mẫu được giữ ở 4°C để phân tích. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%,
37
nhuộm ethidium bromide và chụp ảnh trên máy soi gel.
c. Phân tích số liệu đa dạng di truyền
Các băng DNA được ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng
trên bản điện di ở các mẫu nghiên cứu theo DNA thang chuẩn (DNA marker). Nếu
một băng DNA (có kích thước cụ thể) xuất hiện ở mẫu i nhưng không xuất hiện ở
mẫu j hoặc đồng thời xuất hiện ở cả i và j nhưng không xuất hiện ở các mẫu khác
thì băng DNA này gọi là băng đa hình. Ngược lại, nếu băng DNA nào xuất hiện ở
tất cả các mẫu nghiên cứu thì gọi là băng đơn hình. Các băng được mã hóa bằng số
tự nhiên 0 và 1. Nếu mẫu nào có băng thì ký hiệu là 1, còn không có thì ký hiệu là 0.
Các số liệu nhị phân này được đưa vào xử lý theo chương trình NTSYSpc 2.0 để
tính ma trận tương đồng giữa các đôi mẫu [128].
Ngoài ra, để đánh giá hiệu quả sử dụng mồi, các nhà khoa học còn đưa ra
một thông số khác là hàm lượng thông tin tính đa hình PIC (Polymorphic
Information Content) hay hệ số đa hình di truyền cho mỗi locus (i). Hệ số đa hình di
truyền (PIC) được tính theo công thức [129]:
PIC = 1 - Σ Pi
Pi: tần số xuất hiện của alen thứ i.
2.2.1.3. Xác định hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa
Phương pháp thu mẫu: Cây Thạch tùng răng cưa có độ tuổi từ 3 - 5 tuổi,
được thu hái tại rừng ở Lào Cai và Lâm Đồng. Sau đó, sấy mẫu ở 50°C cho đến khô
và bảo quản ở nhiệt độ 25 - 26°C.
Cây Thạch tùng răng cưa in vitro được nuôi cấy sau thời gian 3 năm (từ năm
2016 – 2019) được sử dụng làm nguyên liệu để xác định hàm lượng HupA.
Phương pháp tách chiết HupA:
HupA được tách chiết theo phương pháp của Ma và cộng sự (2005) có cải
tiến cụ thể như sau: Nghiền mẫu bằng nitrogen lỏng. Cứ 1 g bột bổ sung 30 ml HCl
0,5% (chiết qua đêm). Tiếp theo, siêu âm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Lọc hỗn
hợp sau khi siêu âm bằng giấy lọc và thêm ammonia vào phần dung dịch lọc được
cho đến pH 9,0. Chiết bằng chloroform 2 lần với tỉ lệ 1:1, thu pha dưới. Loại
38
chloroform bằng máy cô quay chân không. Hòa tan cặn với 3 ml methanol, lưu giữ
ở 4°C [60].
a. Định tính hàm lượng HupA bằng phương pháp sắc kí bản mỏng (TLC)
Phương pháp chạy sắc ký bản mỏng (TLC - Thin Layer Chromatography)
được thực hiện theo phương pháp của Ma và cộng sự (2005) [60]:
Pha HupA chuẩn với methanol ở nồng độ 1 mg/ 100 ml (giữ ở 4°C). Dịch
chiết HupA được chạy với các hệ dung môi khác nhau như: chloroform :
isopropanol : acetone : ammonia (4 : 1,5 : 4 : 0,15); chloroform : isopropanol : ethyl
acetate : ammonia (4 : 1,5 : 4 : 0,1); 1-butanol : isopropanol : acetic acid (7,5 : 2: 4)
hoặc 1-butanol : isopropanol : H2O (10 : 5 : 4).
Chấm 1 µl mẫu HupA chuẩn và 10 µl các dung dịch chiết ở trên lên bản
silicagel (bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn Silicagel 60 F254). Các mẫu chấm cách
nhau 7 mm, sấy khô rồi chạy ở các hệ dung môi khác nhau. Làm khô bản silicagel
bằng máy sấy, sau đó phun KMnO4 0,3% lên bản silicagel, HupA xuất hiện có màu
vàng nhạt (vết đốm).
b. Xác định hàm lượng HupA bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao
(HPLC)
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - High-Performance Liquid
Chromatography) [45]:
Mẫu chất chuẩn HupA được pha trong dung môi MeOH thành nồng độ 1
mg/ml, sau đó pha loãng thành dãy các nồng độ khác nhau (0,03 mg/ml, 0,06 mg/ml,
0,13 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,5 mg/ml và 1 mg/ml HupA) để thiết lập đường chuẩn
định lượng.
Các mẫu Thạch tùng răng cưa được cân để xác định khối lượng, sau đó được
chiết trong MeOH với thể tích xác định, dịch chiết được lọc qua màng lọc trước khi
bơm vào hệ thống LC/ MS. Các dung dịch chất chuẩn và mẫu phân tích đều được
lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi bơm vào hệ thống LC/ MS. Lượng mẫu bơm
vào 1 µl, tốc độ dòng là 0,7 ml/ phút, bước sóng UV định lượng 310 nm. Hệ thống
LC/ MS được kết nối với phần mềm Agilent OpenLAB Control Panel. Khí nitơ
được bơm với tốc độ dòng 5,0 l/ phút, áp suất đầu phun đạt 60 psi, nhiệt độ làm khô
39
đạt 250°C. Chế độ bắn mảnh phổ khối lựa chọn ESI ở mode postive với peak ion
phân tử được lựa chọn 243,0 [M+H]+ của HupA. Pha động sử dụng hệ dung môi:
acetonitrile (ACN)/ H2O (20 mM ammonium acetate, pH=4,0) với gradient nồng độ
được thiết lập như sau: Tại thời gian 0 phút, 15 phút và 20 phút thì gradient nồng
độ % ACN/ % H2O được sử dụng lần lượt là 10%/ 90% và 100%/ 0%.
Tín hiệu của HupA được phát hiện dựa vào sự trùng thời gian lưu Rt giữa
detector MS và số khối MS so với chất chuẩn. Đường chuẩn định lượng được xây
dựng bằng phần mềm Chemostation dựa trên diện tích peak UV tại thời gian lưu.
Đường chuẩn định lượng có dạng y = ax + b được xây dựng dựa trên mối quan hệ
giữa diện tích peak UV được chọn (y) và nồng độ tương ứng của chất chuẩn (x).
Hàm lượng HupA trong mẫu Thạch tùng răng cưa được tính theo công thức:
(µg/ g) = (Co x Vdd x f x 1000)/ m
CHupA
Trong đó: Co: Hàm lượng HupA có trong dịch chiết Co tính theo đường chuẩn
(mg/ml). Vdd: Thể tích dịch chiết thu được (ml). f: hệ số pha loãng. m: khối lượng
mẫu thử (g).
2.2.2. Phương pháp nhân giống Thạch tùng răng cưa
2.2.2.1. Phương pháp nhân giống vô tính bằng hình thức giâm hom thân
a. Nguyên liệu
Cây Thạch tùng răng cưa sinh trưởng tốt, không sâu bệnh, kích thước đồng
đều nhau, đã phân nhánh, được thu trong rừng Bidoup, Núi Bà, Lạc Dương, Lâm
Đồng (DL1) và Nậm Cang, Sapa, Lào Cai (SP1) (thời vụ tháng 3/ 2015 và tháng 9/
2015).
Giá thể: phối trộn giữa đất rừng, phân chuồng hoai mục, trấu hun và phân
trùn quế đảm bảo độ ẩm khoảng 85%.
b. Phương pháp
Thu và xử lý mẫu vật: Mẫu được thu vào những ngày có nắng, khô ráo và lấy
vào buổi sáng từ 7 giờ đến 9 giờ. Sử dụng phương pháp so sánh hình thái: dựa vào
các đặc điểm hình thái mẫu vật đã thu thập, tiến hành so sánh định loại với các mô
tả theo tác giả Nông Văn Duy và cs, 2015 [124]. Đầu dưới cắt vát để tăng diện tích
40
tiếp xúc với đất giúp cây mau mọc rễ.
Vườn ươm được thiết kế ngay tại rừng. Sau khi chuẩn bị xong, hom thân sẽ
được xử lý với IBA và NAA với các nồng độ và thời gian khác nhau. Sau khi xử lí
xong, hom thân được cắm ngay vào giá thể giâm [130].
Các thí nghiệm được bố trí theo phương pháp khối ngẫu nhiên đầy đủ, 3 lần
nhắc lại. Mỗi công thức giâm 120 hom thân/ lần nhắc lại trong bầu giâm kích thước
8 cm x 10 cm.
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chiều dài hom thân (từ 4 cm đến
10 cm) đến tỉ lệ hồi xanh, ra rễ và ra lá mới.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể giâm đến tỉ lệ hồi xanh, ra
rễ, ra lá mới, thí nghiệm gồm 4 công thức với các thành phần: đất rừng: phân
chuồng hoai mục : trấu hun : phân trùn quế: CT1 tỷ lệ: 3:1:0:0; CT2 tỷ lệ: 3:1:1:0;
CT3 tỷ lệ: 3:1:1:1; CT4 tỷ lệ: 3:0:1:1.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng α - NAA,
IBA, IAA đến sinh trưởng hom thân giâm Thạch tùng răng cưa.
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng α -NAA đến
khả năng ra rễ và tạo lá mới của hom thân. Thí nghiệm gồm 5 công thức: Không xử
lý (nhúng nước lã), xử lý 500 ppm, xử lý 1500 ppm, xử lý 2500 ppm và 3500 ppm.
Tất cả các công thức xử lý bằng cách nhúng sốc hom thân trong thời gian 4 - 6 giây.
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng α - NAA đến
khả năng ra rễ và tạo lá mới của hom thân. Thí nghiệm gồm 5 công thức: Không xử
lý (ngâm nước lã), xử lý 10 ppm; xử lý 20 ppm, xử lý 30 ppm và 40 ppm. Tất cả các
công thức xử lý bằng cách ngâm hom thân trong thời gian 5 phút.
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng IAA đến khả
năng ra rễ và tạo lá mới của hom thân. Thí nghiệm gồm 5 công thức: Không xử lý
(ngâm nước lã), xử lý 50 ppm; xử lý 70 ppm, xử lý 90 ppm và 120 ppm. Tất cả các
công thức xử lý bằng cách ngâm hom thân trong thời gian 30 phút.
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng IBA đến khả
năng ra rễ và tạo lá mới của hom thân. Thí nghiệm gồm 5 công thức: Không xử lý
41
ngâm nước lã), xử lý 500 ppm; xử lý 1000 ppm, xử lý 2000 ppm và 3000 ppm. Tất
cả các công thức xử lý bằng cách ngâm hom thân trong thời gian 30 phút.
Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ nảy mầm (%); tỷ lệ ra rễ (%); tỉ lệ ra lá mới (%);
số lá mới; số rễ. Mỗi thí nghiệm được theo dõi trong 4 tháng kể từ ngày bắt đầu đưa
hom thân vào giá thể [130].
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ bón phân đến sinh trưởng
cây con Thạch tùng răng cưa.
Hom thân Thạch tùng răng cưa được xử lý và giâm trong các điều kiện thích
hợp nhất đã được nghiên cứu ở 3 thí nghiệm trên. Sau 3 tháng giâm hom thân,
chúng tôi sử dụng các loại phân để bón thúc cho cây con. Thí nghiệm được thiết kế
gồm 5 công thức bón phân: Đối chứng (không bón phân), phân vi sinh Sông Gianh,
phân chuồng (phân bò), phân NPK 3 màu và phân xanh. Các chỉ tiêu được theo dõi:
tỉ lệ cây sống (%), đường kính thân và chiều cao cây con sau 2 tháng bón phân.
Thí nghiệm 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ra ngôi cây con: ra ngôi 4
tháng sau giâm; ra ngôi 5 tháng sau giâm; ra ngôi 6 tháng sau giâm; ra ngôi 7 tháng
sau giâm, ra ngôi 8 tháng sau giâm hom thân đến tỉ lệ cây con héo, chết và tỷ lệ cây
con hồi xanh.
Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft excel 2013 và IRRISTAT
version 5.0 (phương pháp kiểm định LSD, P < 0,05).
Tỉ lệ hom thân hồi xanh (%) = Số hom thân hồi xanh/ ∑ số hom thân giâm
Tỉ lệ ra rễ (%) = Số hom thân ra rễ/ ∑ số hom thân giâm.
Tỉ lệ cây có lá mới = Số hom thân ra lá mới/ ∑ số hom thân giâm.
2.2.2.2. Phương pháp nhân giống vô tính bằng hình thức nuôi cấy mô
a. Vật liệu
Nguyên liệu thực vật được sử dụng là thân của cây Thạch tùng răng cưa
được thu thập ở Bidoup-Núi Bà, Lạc Dương, Lâm Đồng. Các mẫu thực vật được
xác định theo mô tả của tác giả Nông Văn Duy và cộng sự (2015) [124].
Môi trường cơ bản MS [131]; 1/2 MS: 1/2 thành phần khoáng của môi
trường MS, vitamin giữ nguyên theo môi trường MS; 1/4 MS: 1/4 thành phần
42
khoáng của MS, 1/2 vitamin của MS; 1/6 MS: 1/6 thành phần khoáng của MS, 1/4
vitamin của MS, môi trường WPM [132] và môi trường Gamborg B5 [133] đã được
thử nghiệm. Chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA, IBA, kinetin và BA. Các
thành phần khác: đường sucrose (20 g/l), agar (8 g/l).
Điều kiện nuôi cấy: các thí nghiệm được đặt trong phòng nuôi ở nhiệt độ 22
± 2oC, chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang trắng với cường độ ánh sáng 22,20 μmol/
m2/ s, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ ngày.
b. Phương pháp nghiên cứu
i. Nghiên cứu kỹ thuật khử trùng mẫu nuôi cấy
Đoạn chồi đỉnh 2 - 3 cm của cây Thạch tùng răng cưa khỏe mạnh được chọn
làm nguyên liệu cho quá trình khử trùng mẫu. Đầu tiên, mẫu được rửa dưới vòi
nước sạch, lắc trong nước xà phòng pha loãng 3 - 5 phút, rửa sạch xà phòng dưới
vòi nước chảy. Sau đó, mẫu được chuyển vào tủ cấy vô trùng, mẫu được làm sạch
trong EtOH 70% trong 30 giây, rửa lại với nước cất 3 - 5 lần, xử lý bằng HgCl2 0,05
- 0,15% trong thời gian từ 3 đến 7 phút, rửa lại nước cất 3 - 5 lần, lắc bằng NaClO
20% trong 7 phút, rửa lại nước cất 3 - 5 lần, ngâm mẫu cấy trong nước cất 1 tiếng,
cấy chuyển vào môi trường MS. Đánh giá khả năng khử trùng mẫu sau 30 ngày
nuôi cấy qua các chỉ tiêu: tỉ lệ mẫu vô trùng và tỉ lệ mẫu bật chồi. Sử dụng công
thức cho hiệu quả khử trùng tốt nhất ở thí nghiệm này để tiến hành khử trùng mẫu
cho các thí nghiệm tiếp theo.
Mỗi thí nghiệm được tiến hành với 120 mẫu và lặp lại 3 lần.
ii. Phương pháp nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng nuôi cấy chồi đỉnh
Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy khác nhau đến tỉ lệ sống của chồi
Thạch tùng răng cưa
Chồi Thạch tùng răng cưa in vitro được cấy chuyển vào các môi trường
khoáng MS, 1/2 MS, 1/4 MS, 1/6 MS, WPM, B5 có bổ sung 20 g/l đường, 8 g/l agar,
pH 5,7 -5,8, không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng để tìm ra môi trường thích
hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của chồi Thạch tùng răng cưa với các chỉ tiêu
theo dõi sau 60 ngày nuôi cấy: chiều cao chồi, đặc điểm chồi, số lá và kích thước lá.
Mỗi thí nghiệm được tiến hành với 120 mẫu và lặp lại 3 lần.
43
Nghiên cứu khả năng tạo chồi của cây Thạch tùng răng cưa
Chồi Thạch tùng răng cưa được cấy chuyển vào môi trường khoáng thích
hợp (đã xác định ở trên) có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng BA, kinetin nồng
độ 0,1 - 1,5 mg/l. Theo dõi khả năng hình thành, phát triển của chồi sau 120 ngày
nuôi cấy.
Mỗi thí nghiệm được tiến hành với 120 mẫu và lặp lại 3 lần.
Nghiên cứu khả năng tạo rễ cho chồi Thạch tùng răng cưa in vitro
Các chồi in vitro có chiều dài từ 2 - 3 cm thu được từ các thí nghiệm trên,
được tách riêng lẻ và cấy lên môi trường thích hợp có bổ sung riêng lẻ NAA, IBA
với nồng độ từ 0,1- 1,5 mg/l để theo dõi khả năng hình thành và phát triển rễ của
chồi in vitro sau 60 ngày nuôi cấy.
Mỗi thí nghiệm được tiến hành với 115 mẫu và lặp lại 3 lần.
iii. Phương pháp nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng nuôi cấy mô sẹo
Bảng 2.3. Các môi trường nuôi cấy mô sẹo
Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l)
Môi trường MS Kinetin 0,30 Vitamin Piridoxine 2 Axit amin Glutamin - IBA 0,01
0,01 0,01 - - - 0,01 0,01 0,01 - - - 0,015 0,015 0,015 0,015 0,015 ½ MS ¼ MS MS ½ MS ¼ MS MS ½ MS ¼ MS MS ½ MS ¼ MS MS ½ MS ¼ MS MS ½ MS 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 - - - - - - - 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 0,30 0,30 - - - 0,30 0,30 0,30 - - - 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30
0,015 - 3 0,30
¼ MS
Sử dụng đỉnh chồi (1 - 2 mm) của cây Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô để
44
tiến hành nuôi cấy tạo mô sẹo trên các môi trường MS khác nhau (MS, ½ MS và ¼
MS) bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng, vitamin và axit amin ở các nồng độ
khác nhau (Bảng 2.3).
Mỗi thí nghiệm được tiến hành với 30 mẫu và lặp lại 3 lần.
iii. Phương pháp xử lí số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft excel 2013 và IRRISTAT
version 5.0 (phương pháp kiểm định LSD, P < 0,05).
iv. Một số khâu cơ bản trong quy trình đưa cây trong ống nghiệm ra ngoài
vườn ươm
a. Giai đoạn tái sinh rễ để tạo cây con hoàn chỉnh
Các cụm chồi được tách thành các cụm chồi nhỏ 2 - 5 chồi/ cụm và cấy chuyển
sang môi trường ra rễ.
Khi cây con có chiều cao 4 - 6 cm, có 3 - 5 rễ, chiều dài rễ đạt 2 - 3 cm và rễ có
màu vàng nhạt thì kết thúc nuôi cây trong ống nghiệm.
b. Giai đoạn chuẩn bị vườn ươm cây, chuẩn bị đất, làm bầu
Đất vườn ươm, làm bầu phải tơi xốp, giầu dinh dưỡng, không mang mầm
mống của sâu bệnh. Sử dụng giá thể CT2 trong thí nghiệm trên gồm đất rừng : phân
chuồng hoai mục : trấu hun tỉ lệ 3 : 1 : 1 làm giá thể ươm cây.
Nếu trồng trong bầu thì sử dụng túi bầu kích thước khoảng 8 x 12 cm, độ sâu
hom thân giâm xuống đất 3,5 cm.
Công thức tính: khối lượng đất = (số bầu) x (thể tích bầu) x 1,3
c. Giai đoạn ra cây từ ống nghiệm
Dùng panh để lấy các cây Thạch tùng răng cưa trong ống nghiệm ra, rửa sạch
bộ rễ, rửa sạch thạch bám vào rễ, không được làm thương tổn đến bộ rễ.
Cắt bỏ 1/4 – 1/3 chiều dài lá để tránh thoát hơi nước giai đoạn mới trồng, tỉa bỏ
lá già, tách cây chỉ để mỗi cây 1 - 3 chồi, chú ý khi tách không làm rụng rễ, gẫy cây.
d. Giai đoạn trồng và chăm sóc cây con
Cấy cây Thạch tùng răng cưa vào luống đã chuẩn bị với mật độ 100 cây/ m2,
45
hoặc trồng trực tiếp vào bầu, sau khi cấy phun nước đủ ẩm cho luống cây.
Khi giâm xong, phun thuốc trừ nấm, vi khuẩn: Kasuran hoặc Kasai, sau 02
ngày phun nhắc lại.
Chế độ chăm sóc sau khi cấy: Trong 10 ngày đầu thường xuyên phun ẩm cho
cây 6-8 lần/ ngày và huấn luyện ra môi trường tự nhiên bằng cách che phủ nilong
luống cây, che sáng cho luống cây bằng lưới che râm với độ che sáng 80%. Sau 15
ngày bỏ dần lưới che râm để tỉ lệ che sáng 50%, giảm dần số lần tưới nước trong một
ngày và tăng lượng nước tưới trong một lần. Sau 3 tháng, tháo lưới che râm, bón thúc
cho cây con bằng phân chuồng (phân bò) với liều lượng 500 kg/ 1 ha.
Phân tích số liệu: các giá trị trung bình và sai số chuẩn tính toán theo phần
mềm Microsoft excel 2013.
Tỉ lệ mẫu vô trùng (%) = số mẫu cấy vô trùng / ∑ số mẫu cấy
Tỉ lệ mẫu bật chồi (%) = Số mẫu bật chồi / ∑ số mẫu vô trùng.
Tỉ lệ chồi ra rễ = Số chồi ra rễ/ ∑ số chồi cấy.
Tỉ lệ tạo mô sẹo = Số mẫu tạo mô sẹo / ∑ số mẫu cấy.
46
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Đánh giá đặc điểm sinh học của nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa
3.1.1. Đánh giá đặc điểm hình thái của cây Thạch tùng răng cưa
Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái cây Thạch tùng răng cưa tại Lâm
Đồng và Lào Cai cho thấy cây trưởng thành (đã có bào tử) có dạng cây thân thảo
đứng, nằm hoặc thõng xuống đất, phân nhánh theo lối rẽ đôi (Hình 3.1, Hình 3.2).
Tại Lâm Đồng, kết quả cho thấy cây có chiều cao 11,70 - 40 cm, trung bình 29,05
cm (SD = 8,45) với đường kính thân 0,14 - 0,28 cm, trung bình 0,23 cm (SD = 0,04),
lá hình bầu dục, mũi mác, dài 1,35 - 3,35 cm, rộng 0,25 - 0,44 cm, phiến lá tương
đối mỏng, nổi rõ gân giữa, mép lá có răng cưa không đều, với số lá trung bình
122,95 lá/ 1 cây (SD = 20,45). Cây Thạch tùng răng thu tại Lào Cai có chiều cao từ
10,57 cm đến 40,03 cm, trung bình 28,74 cm (SD = 9,01) với đường kính thân từ
0,12 cm đến 0,31 cm, trung bình 0,23 cm (SD = 0,04), lá hình bầu dục, mũi mác,
mép lá có răng cưa, nổi rõ gân giữa, chiều dài 0,44 cm - 4,67 cm (trung bình 2,12
cm), chiều rộng 0,10 - 3 cm (trung bình 0,32 cm), với số lá từ 65 đến 149 lá/ 1 cây,
trung bình 119,10 lá/ 1 cây (SD = 22,92) (Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái cây Thạch tùng răng cưa thu ở Lâm Đồng và Lào Cai.
Giá trị
Số lá (lá)
Địa điểm thu mẫu Lâm Đồng
Đường kính thân (cm) 0,28 0,15 0,23 ± 0,04 0,31 0,12 151 77 122,95 ± 20,45 149 65
Lào Cai
Lớn nhất Nhỏ nhất Trung bình SD Lớn nhất Nhỏ nhất Trung bình SD Chiều cao cây (cm) 39,97 11,90 29,05 ± 8,45 40,03 10,57 28,74 ± 9,01 0,23 ± 0,04 119,10 ± 22,92 Chiều dài lá (cm) 3,01 1,38 2,20 ± 0,48 4,67 0,44 2,12 ± 0,63 Chiều rộng lá (cm) 0,43 0,26 0,36 ± 0,04 3 0,10 0,32 ± 0,17
Kết quả bảng 3.1 cho thấy tại hai vùng Lào Cai và Lâm Đồng đa số các cây
Thạch tùng răng cưa có sự tương đồng về mặt hình thái, tuy nhiên, một số cây có sự
sai khác. Thậm chí ngay trong từng vùng nghiên cứu thì hình thái và các đặc điểm
47
hình thái của một số cây cũng khác nhau (Bảng 3.1 và Hình 3.2). Điều này có thể
giải thích là do môi trường sống và điều kiện khí hậu ở các vùng khác nhau, do đó
loài Thạch tùng răng cưa có sự biến đổi về mặt hình thái giúp chúng thích nghi với
điều kiện môi trường sống đa dạng. Đây được xem là hiện tượng đa hình của loài,
hiện tượng này rất phổ biến trong tự nhiên và góp phần tạo nên sự đa dạng sinh học
của loài.
Hình 3.1. Hình thái cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng
Hình 3.2. Một số hình thái cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai
Như vậy, cây Thạch tùng răng cưa trưởng thành (cây đã có túi bào tử) có
chiều cao trung bình khoảng 28 cm đến 29 cm, thân có dạng tròn, đường kính thân
trung bình 0,23 cm, chiều dài lá trung bình 2 cm, chiều rộng lá trung bình 0,32 cm,
48
mép lá có răng cưa. Bào tử có hình thận, màu vàng tươi, mọc ở nách lá, lá bào tử
giống lá thường, rễ dạng chùm (Hình 3.1, hình 3.2). Kết quả nghiên cứu của chúng
tôi phù hợp với kết luận về hình thái của loài Thạch tùng răng cưa trong nghiên cứu
của Võ Văn Chi & Trần Hợp (1999) và Phạm Hoàng Hộ (2003, 2006) [12, 14, 134].
Bên cạnh đó, một số cây Thạch tùng răng cưa có sự biến đổi về mặt hình thái giúp
cây thích nghi tốt hơn với các điều kiện môi trường sống khác nhau.
Kết quả nghiên cứu tại thực địa cho thấy cây Thạch tùng răng cưa mang túi
bào tử đã hé mở vào khoảng tháng 11 và tháng 12 dương lịch (Hình 3.1). Xung
quanh cây Thạch tùng răng cưa trưởng thành có thể phát hiện thấy từng cụm cây
con mọc thành từng nhóm nhỏ trong rừng (Hình 3.3). Các cây này chủ yếu được tạo
thành nhờ sinh sản bằng mầm. Mặt khác, một số cây con hoặc một nhóm nhỏ không
có cây trưởng thành bên cạnh, mọc rải rác tại một số nơi như hốc đá, ven suối, trên
gốc cây mục… Đây có thể là các cây con được hình thành nhờ bào tử phát tán.
Cây Thạch tùng răng cưa trưởng thành
Cây con Thạch tùng răng cưa Hình 3.3. Cây Thạch tùng răng cưa trong rừng tại Lâm Đồng.
Nhận định trên dựa trên một số căn cứ như sau: thứ nhất, bào tử của loài
Thạch tùng răng cưa phát triển rất chậm, kể từ khi bào tử nảy mầm phát triển qua
giai đoạn giao tử thể, cuối cùng đạt được đến giai đoạn bào tử thể trưởng thành phải
mất ít nhất 15 năm nên trong tự nhiên khả năng tái sinh của bào tử để tạo thành cây
con cần thời gian tương đối dài [32]. Thứ hai, cây Thạch tùng răng cưa trên 3 năm
tuổi khả năng tạo mầm sẽ trở nên mạnh mẽ, mầm được hình thành vào khoảng
tháng 2 và tháng 3, sau đó tách khỏi cây mẹ và rơi xuống đất vào khoảng tháng 8
đến tháng 10. Các mầm này dễ phát triển thành cây trên môi trường đất rừng sinh
49
thái, sau 120 ngày cây con đã đạt kích thước 2 cm [19]. Thứ ba, trên cây Thạch tùng
răng cưa mẹ bên cạnh các cây con còn sót lại phần đế mầm sau khi mầm đã rơi
xuống đất (Hình 3.4).
Đế mầm
Hình 3.4. Đế mầm trên cây Thạch tùng răng cưa mẹ.
Cây sinh trưởng chậm nên chiều cao trung bình của cây trong 1 năm chỉ đạt
trung bình 5,25 ± 2,25 cm (biến động 3 cm - 7,50 cm). Trong thử nghiệm sơ bộ về
khả năng phát triển thành cây con trực tiếp vào đất, chúng tôi nhận thấy tỷ lệ sống
của cây đạt tới 92%.
3.1.2. Đánh giá đặc điểm vi phẫu Thạch tùng răng cưa
Thông thường, mỗi cơ quan của thực vật có một cấu trúc bên trong điển
hình. Do đó, việc phân tích cấu trúc của các bào quan trong cơ thể thực vật tạo cơ
sở cho việc xác định các loại dược liệu khác nhau. Cấu tạo vi phẫu của các cơ quan
thực vật là một đặc điểm quan trọng trong kiểm nghiệm dược liệu. Chính vì vậy,
bên cạnh việc tìm hiểu về đặc điểm hình thái của loài Thạch tùng răng cưa, chúng
tôi tiến hành nghiên cứu đặc điểm vi phẫu thân và lá của cây Thạch tùng răng cưa
nhằm xác định đúng đối tượng nghiên cứu.
Kết quả vi phẫu thân Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai và Lâm Đồng đều
cho thấy thân cây có dạng hình tròn, ngoài cùng phủ cutin, tiếp đến là lớp biểu bì
với thành tế bào uốn lượn có chức năng bảo vệ cây. Phía dưới biểu bì là lớp mô
cứng, gồm nhiều tế bào hình bầu dục xếp xít nhau tạo thành 4 - 5 lớp tế bào. Số
lượng lớp mô cứng và biểu bì tương đối mỏng phù hợp với đặc điểm tự nhiên của
loài Thạch tùng răng cưa là loài thân thảo, thân tương đối mềm. Tiếp đến là lớp mô
mềm, với các tế bào dạng hình tròn, kích thước to nhỏ khác nhau, sắp xếp lộn xộn
50
tạo thành nhiều lớp tế bào, đây là lớp dày nhất trong thân cây, trong lớp mô mềm
xuất hiện một vài mạch gỗ nhỏ. Ở trung tâm của thân cây là bó libe - gỗ, có dạng
hình tròn, đường kính của bó libe - gỗ bằng khoảng 1/ 10 đường kính thân cây. Nhìn
trên ảnh vi phẫu, hình dạng của bó libe - gỗ giống như một bánh xe. Với vành xe là
2 - 3 lớp tế bào mô mềm thành hóa gỗ, trục xe là các tế bào gỗ dạng hình trứng sắp
xếp liên tục tạo thành một vòng tròn. Nan xe do các tế bào gỗ, kích thước to nhỏ
khác nhau, sắp xếp tạo thành dạng hình tam giác (đặc hoặc rỗng) có đỉnh quay vào
phía trong vòng tròn, đỉnh có thể liên kết hoặc không liên kết với vòng tròn. Các bó
libe bao quanh tế bào gỗ (Hình 3.5 và Hình 3.6).
Hình 3.5. Vi phẫu thân Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai.
Hình 3.6. Vi phẫu thân Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng.
Kết quả vi phẫu lá Thạch tùng răng cưa cho thấy gân lá có biểu bì trên và
biểu bì dưới hơi lồi, bên ngoài lớp biểu bì có phủ cutin. Phía trong là các tế bào mô
mềm có dạng hình trứng kích thước không đồng đều. Bó gỗ nằm ở trung tâm, với
lớp vòng tròn bên ngoài do các tế bào mô mềm thành hóa gỗ tạo nên. Không quan
51
sát thấy các mạch gỗ nằm rải rác trong mô mềm (Hình 3.7).
A B
Hình 3.7. Vi phẫu lá Thạch tùng răng cưa. A: Thu tại Lào Cai, B: Thu tại Lâm Đồng
Kết quả vi phẫu thân và lá Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai và Lâm Đồng
phù hợp với kết quả vi phẫu thân và lá Thạch tùng răng cưa do Nguyễn Quang Hiệu
và cộng sự nghiên cứu tại Tam Đảo (Vĩnh Phúc) năm 2017. Điều đó cho thấy, loài
Thạch tùng răng cưa thu được ở các khu vực khác nhau tại nước ta có đặc điểm
tương đồng về giải phẫu [5].
3.1.3. Đánh giá đặc điểm sinh thái học của Thạch tùng răng cưa
Kết quả khảo sát cho thấy, loài Thạch tùng răng cưa có khu phân bố khá hẹp,
mọc tập trung trong rừng tự nhiên ở độ cao trên 900 m so với mặt nước biển, ven
các con suối, nơi đất ẩm. Cây thường mọc xen lẫn với các loài cây khác trên các
tảng đá ẩm ướt, nơi thường gặp nhất là giữa các lớp lá rụng, hoai mục (Hình 3.8).
Cây Thạch tùng răng cưa
Hình 3.8. Thạch tùng răng cưa trên bờ suối tại Nam Ban, Lâm Hà, Lâm Đồng.
Tại Lào Cai, nghiên cứu khảo sát tại 5 vùng: Nậm Cang, Bản Hồ, Tả Van,
Lao Chải, Tả Phìn. Mỗi vùng chúng tôi tiến hành điều tra tại 3 địa điểm với phạm vi
25 m2, các tuyến điều tra đi qua các dạng địa hình và sinh cảnh khác nhau. Kết quả
52
nghiên cứu cho thấy, tại 5 vùng nghiên cứu, Thạch tùng răng cưa đều phân bố tại
các vùng núi cao từ 1500 m đến 1800 m so với mặt nước biển.
Đai khí hậu nơi Thạch tùng răng cưa phân bố phổ biến tương ứng với đai khí
hậu á nhiệt đới gió mùa trên núi cao. Nền nhiệt cao vào mùa hè, thấp vào mùa đông,
biên độ dao động ngày đêm của nhiệt độ lớn. Nhiệt độ trung bình hàng năm là
12,6°C, lượng mưa hàng năm 1400 - 2800 mm, chế độ ẩm 80 - 90%. Tuy nhiên, khu
vực này có sương muối xuất hiện từ tháng 11 đến tháng 2, sương mù xuất hiện từ
tháng 10 đến tháng 3, mưa đá xảy ra nhiều nhất vào tháng 2, tháng 3 và tháng 4, có
khoảng 70 - 100 ngày giông, băng tuyết xuất hiện tại vùng núi cao vào mùa đông.
Băng tuyết cùng với sương muối có ảnh hưởng đến sự phát triển của loài Thạch
tùng răng cưa [135]. Hệ sinh thái rừng hỗn giao giữa lá rộng thường xanh với cây lá
kim. Hệ thực vật gồm các loài như Pơ mu, thông vàng, dâu tằm, sim, các loài thuộc họ
Dẻ, họ Re, Họ Ngũ Gia bì, Ô rô, Đỗ Quyên ... Hệ động vật gồm các loài trong họ Cu
li, họ Khỉ, họ Chồn, họ Mèo, các loài thuộc họ gặm nhấm, họ Sóc, họ Chim... Kiểu
thảm thực vật nguyên sinh trong khu vực Lào Cai điển hình về độ đa dạng sinh học
cao [136].
Tại Lâm Đồng, tiến hành khảo sát tại 3 vùng: Bidoup - Núi Bà, Lạc Dương;
Lạc Xuân, Đơn Dương; Nam Ban, Lâm Hà, kết quả nghiên cứu cho thấy Thạch
tùng răng cưa đều phân bố tại các vùng núi cao từ 900 m đến 2300 m so với mặt
nước biển.
Lâm Đồng nằm trong khu vực chịu ảnh hưởng của khí hậu nhiệt đới gió mùa
biến thiên theo độ cao. Nhiệt độ thay đổi rõ rệt giữa các khu vực, càng lên cao nhiệt
độ càng giảm. Nhiệt độ trung bình năm của tỉnh dao động 18 - 25°C. Lượng mưa
trung bình khoảng 1.750 - 3.150 mm/ năm. Độ ẩm tương đối trung bình cả năm 85 -
87%, các tháng mùa mưa độ ẩm 84 - 91%, các tháng mùa khô độ ẩm 69 - 82%. Giờ
nắng trung bình cả năm 1.890 - 2.500 giờ. Tốc độ gió trung bình là 2,10 m/s và tốc
độ gió cực đại được ghi ở Đà Lạt là 23 m/s. Ít có bão lớn. Các hiện tượng thời tiết
khác: sương mù, sương muối thường xảy ra vào tháng 1, 2, mưa dông xảy ra tháng
4, 5, mưa đá xảy ra tháng 4, 5, 6 [11].
Yếu tố khí hậu góp phần hình thành nên một thảm thực vật đa dạng ở Lâm
Đồng với các kiểu hình rừng khác nhau như: rừng lá kim, rừng thường xanh, rừng hỗn
53
giao và trảng cỏ cây bụi [11, 137]... Hệ thực vật bao gồm các loài thuộc họ Thông đất,
Các loại nấm nổi tiếng như nấm hương nâu, hương trắng, mộc nhĩ, hoa đá, nấm mối,
nấm sữa, nấm hột gà, nhiều cây họ Sồi, Dẻ xuất hiện chủ yếu trong rừng hỗn giao.
Trong kiểu rừng hỗn giao thường xanh còn có nhiều loài gỗ quý như Trắc bách diệp
núi, Hoàng đàn, Bách tùng, Thanh tùng. Phía Bắc và Đông Bắc Đà Lạt, trên núi Lang
Biang, Bi Doup có những loài cây rất to như Chò sót, Chò nước, Pơ mu, cùng với
nhiều cây gỗ quý như Thông nàng, Thông tràm, Thông 5 lá, một số cây dược liệu như
kinh giới, Đơn buốt, Đại bi, Nam sâm, Ngưu tất nam, Thu hải đường dại... là những
loài mọc ở khắp nơi, có trữ lượng lớn. Bên cạnh đó, cũng có một số loài cây thuốc rất
dễ tìm ở Lâm Đồng như Lông cu li, Bổ cốt toái, Hoàng liên ô rô [11, 137]... Hệ động
vật gồm rất nhiều loài như nai, hươu, hoẵng, hổ báo, mèo rừng, dơi, chuột, sóc, ếch,
nhái, các loài gà rừng, gà lôi, đa đa, trăn, khỉ, gấu, kỳ đà, tắc kè, bìm bịp, các loài
rắn…[137].
3.1.4. Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của Thạch tùng răng cưa bằng chỉ thị
phân tử RAPD
Sử dụng các chỉ thị phân tử để đánh giá mức độ đa dạng di truyền của loài
Thạch tùng răng cưa sẽ góp phần cung cấp dữ liệu cần thiết cho việc thu thập, phân
loại và bảo tồn nguồn gen. Bên cạnh đó, thông tin về mối quan hệ di truyền giữa các
mẫu Thạch tùng răng cưa là cơ sở cho việc chọn tạo giống. Chính vì vậy, sau khi
nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu của loài Thạch tùng răng cưa, chúng tôi
tiến hành đánh giá sự đa dạng di truyền của các mẫu Thạch tùng răng cưa thu tại hai
vùng Lào Cai và Lâm Đồng bằng chỉ thị RAPD. Khảo sát thực tế tại các khu vực
nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy sự phân bố của Thạch tùng răng cưa chỉ tập trung ở
một số khu vực gồm 5 địa điểm tại Lào Cai (Nậm Cang, Sa Pa; Bản Hồ, Sa Pa; Tả
Van, Sa Pa; Lao Chải, Sa Pa và Tả Phìn, Sa Pa) và 3 địa điểm tại Lâm Đồng
(Bidoup - Núi Bà, Lạc Dương; Lạc Xuân, Đơn Dương và Nam Ban, Lâm Hà).
Chính vì vậy, trong khuôn khổ đề tài và thời gian nghiên cứu, chúng tôi sử dụng 5
mẫu thu tại Lào Cai và 3 mẫu thu tại Lâm Đồng để bước đầu đánh giá sơ bộ về sự
đa dạng di truyền của nguồn gen Thạch tùng răng cưa.
3.1.4.1. Kết quả chạy PCR – RAPD
Trong nghiên cứu này, các sản phẩm PCR - RAPD được phân tích bởi 16
54
mồi RAPD với 8 mẫu Thạch tùng răng cưa. Sản phẩm PCR-RAPD phân tích với 16
3000 bp
1000 bp
250 bp
mồi ngẫu nhiên được điện di trên gel agarose 1% để phân tích đa hình.
Hình 3.9. Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi
OPC5 (7 băng, 4 đa hình). Chú thích: M: marker 1 kb (Fermentas); 1 - 3: Mẫu DL1
3000 bp
1000 bp
250 bp
Hình 3.10. Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi
- mẫu DL3; 4 - 8: Mẫu SP1 - mẫu SP5.
OPC13 (3 băng, 2 đa hình). Chú thích: M: marker 1 kb (Fermentas); 1 - 3: Mẫu
3000 bp
1000 bp
250 bp
DL1 – mẫu DL3; 4 - 8: Mẫu SP1 – mẫu SP5.
Hình 3.11. Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi
OPB13 (1 băng, 0 đa hình). Chú thích: M: marker 1 kb (Fermentas); 1 - 3: Mẫu
DL1 – mẫu DL3; 4 - 8: Mẫu SP1 – mẫu SP5.
55
Phân tích ảnh điện di qua việc nhị phân hóa sự xuất hiện các đoạn DNA và
xử lý thống kê được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Tổng hợp kết quả phân tích 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với 16 mồi
RAPD
STT Mồi
Tỷ lệ phân đoạn đa hình (%) 83,33 87,50 50 50 0 33,33 33,33 100 80 57,14 75 50 33,33 66,67 75 75
Tổng số phân đoạn 6 8 4 8 1 6 3 2 5 7 4 2 3 3 4 4 70 4,38 Số phân đoạn đa hình 5 7 2 4 0 2 1 2 4 4 3 1 1 2 3 3 44 2,75 62,86 Hệ số PIC 0,82 0,84 0,74 0,86 0 0,83 0,59 0,66 0,73 0,82 0,71 0,53 0,62 0,60 0,71 0,72 10,78 0,67 OPB1 1 OPB4 2 OPB8 3 OPB11 4 OPB13 5 OPB15 6 OPB18 7 OPB20 8 OPC1 9 OPC5 10 11 OPC6 12 OPC10 13 OPC12 14 OPC13 15 OPC17 16 OPC19 Tổng Trung bình
Kết quả điện di các sản phẩm RAPD-PCR cho thấy, trong số 16 mồi nghiên
cứu thì 15 mồi đa hình (chiếm tỉ lệ 93,75%) và 1 mồi đơn hình (OPB13) (chiếm tỉ lệ
6,25%). Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân
đoạn DNA khi so sánh giữa các mẫu với nhau trong cùng 1 mồi. Số lượng các phân
đoạn được khuếch đại của mỗi mồi thay đổi từ 1 (mồi OPB13) đến 8 (mồi OPB4 và
OPB11). Tổng cộng có 70 phân đoạn được khuếch đại, trung bình là 4,40 phân
đoạn/ mồi. Trong đó, số phân đoạn đa hình là 44 (chiếm 62,86% tổng số phân đoạn),
số phân đoạn đơn hình là 26 (chiếm 37,14%). Ngoài mồi OPB13 không có đa hình,
các mồi còn lại tỷ lệ phân đoạn đa hình nằm trong khoảng từ 33,33% (3 mồi OPB15,
OPB18 và OPC12) đến 100% (mồi OPB20). Hệ số đa dạng của mồi OPC10 có giá
trị PIC thấp nhất (0,53) và mồi OPB11 có giá trị PIC lớn nhất (0,86), hệ số đa dạng
trung bình của các mồi đạt 0,67. Qua đây có thể thấy rằng, các mồi cho đa hình ở
56
loài Thạch tùng răng cưa thu tại 8 địa điểm là tương đối cao, vì vậy các mồi này có
ý nghĩa trong việc đánh giá đa dạng di truyền của các mẫu nghiên cứu.
3.1.4.2. Mối quan hệ di truyền và đa dạng di truyền của các mẫu Thạch tùng răng
cưa nghiên cứu
Dựa trên số liệu thu được từ phân tích 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với 16 mồi
RAPD, số liệu tiếp tục được xử lý bằng phần mềm NTSYSpc version 2.0 để tính hệ
số tương đồng di truyền và xây dựng sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền
giữa các mẫu, kết quả được trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.12.
DL1
DL2
DL3
SP1
SP2
SP3
SP4
SP5
1.0000000
DL1
0.8405797
1.0000000
DL2
0.8115942
1.0000000
DL3
Bảng 3.3. Hệ số tương đồng di truyền của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa
0.5507246
0.5652174
0.5942029 1.0000000
SP1
0.5362319
SP2
0.5362319 0.9420290 1.0000000
0.5942029
0.5797101
0.5797101 0.8695652 0.8405797
1.0000000
SP3
0.5652174
0.5507246
0.5797101 0.8695652 0.8695652
0.9130435 1.0000000
SP4
0.6666667
0.6521739
0.6521739 0.8260870 0.7971014
0.8115942 0.8115942 1.0000000
SP5
Hình 3.12. Sơ đồ quan hệ di truyền của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa.
Bảng 3.3 cho thấy hệ số tương đồng di truyền từng cặp của 8 mẫu Thạch
tùng răng cưa nghiên cứu dao động khá lớn từ 0,52 đến 0,94. Trong đó, cặp mẫu
DL2 (Lạc Xuân, Đơn Dương, Lâm Đồng) và DL3 (Nam Ban, Lâm Hà, Lâm Đồng),
SP1 (Nậm Cang, Sa Pa, Lào Cai) và SP2 (Bản Hồ, Sa Pa, Lào Cai) có quan hệ di
57
truyền gần nhất với hệ số tương đồng di truyền là 0,94 (khác biệt di truyền thấp nhất
0,06). Cặp mẫu DL1 (Bidoup, Núi Bà, Lạc Dương, Lâm Đồng) và SP2 (Bản Hồ, Sa
Pa, Lào Cai) có quan hệ di truyền xa nhất vì sai khác di truyền lớn nhất là 0,48 (hệ số
tương đồng di truyền 0,52).
Kết quả phân tích cho thấy 8 mẫu Thạch tùng răng cưa được chia làm 2 nhóm
chính: Nhóm I gồm các mẫu Thạch tùng răng cưa được thu ở Lâm Đồng (DL1, DL2,
DL3) với hệ số tương đồng di truyền nằm trong khoảng 0,81 đến 0,94. Trong nhóm I,
mẫu DL2 và DL3 có mối quan hệ di truyền rất chặt với hệ số tương đồng di truyền cao
nhất 0,94 và sự sai khác về mặt di truyền rất thấp 0,06. Mức độ sai khác di truyền tại
3 khu vực tỉnh Lâm Đồng dao động từ 0,06 đến 0,19. Nhóm II, gồm 5 mẫu Thạch
tùng răng cưa được thu tại Lào Cai (SP1, SP2, SP3, SP4 và SP5) với hệ số tương đồng
di truyền dao động từ 0,80 đến 0,94. Trong nhóm II, mẫu SP1 và SP2 có hệ số tương
đồng di truyền đạt 0,94 cho thấy hai mẫu này có quan hệ họ hàng rất gần nhau, có thể
bắt nguồn từ một tổ tiên chung. Mẫu SP3 và SP4 có quan hệ gần về mặt di truyền với
hệ số tương đồng di truyền 0,91. Mẫu SP5 có quan hệ di truyền xa nhất so với 4 mẫu
còn lại được thu ở Lào Cai với hệ số tương đồng di truyền từ 0,80 đến 0,83. Mức độ
sai khác di truyền tại 5 khu vực tỉnh Lào Cai dao động trong khoảng 0,06 (cặp SP1 và
SP2) đến 0,20 (Cặp SP2 và SP5). Như vậy, xét về mặt địa lý, những mẫu được thu từ
những vùng cùng địa giới hành chính (cùng tỉnh) thì xu hướng tương đồng về mặt
di truyền cao hơn rõ rệt so với các cặp mẫu ngoài tỉnh. Kết quả phân tích bước đầu
cho thấy, mức độ sai khác về mặt di truyền giữa các cặp mẫu thu ở 5 địa điểm
nghiên cứu thuộc cùng tỉnh Lào Cai hoặc 3 địa điểm nghiên cứu trong cùng tỉnh
Lâm Đồng là gần tương đương nhau (dao động từ khoảng 0,06 đến trên dưới 0,20),
cho thấy chúng có mối quan hệ di truyền rất gần, thậm chí có thể cùng chung một
xuất xứ. Sự khác biệt về mặt di truyền đều tăng lên rõ rệt khi so sánh các cặp mẫu
bất kì thu ở hai tỉnh khác nhau là Lào Cai và Lâm Đồng, với mức độ sai khác về
mặt di truyền dao động giữa các cặp mẫu từ 0,33 (mẫu DL1 và SP5 có hệ số tương
đồng về mặt di truyền là 0,67) đến 0,48 (mẫu DL1 và SP2 có hệ số tương đồng về
mặt di truyền là 0,52). Điều đó cho thấy, các mẫu Thạch tùng răng cưa thu ở 5 địa
điểm nghiên cứu thuộc khu vực Sa Pa, Lào Cai và 3 địa điểm nghiên cứu thuộc khu
vực tỉnh Lâm Đồng có quan hệ họ hàng khá xa nhau. Các phân tích trên cho thấy
loài Thạch tùng răng cưa phân bố tại hai vùng Lào Cai và Lâm Đồng ở Việt Nam có
58
sự đa dạng di truyền ở mức khá cao. Sự khác nhau về mặt di truyền có thể bắt
nguồn từ nguồn gốc cũng như hướng tiến hóa khác nhau tạo nên mức độ đa dạng di
truyền. Các mẫu Thạch tùng răng cưa ở hai khu vực địa lý có một số tiến hóa khác
nhau để thích ứng với môi trường xung quanh. Với nhiều biến đổi hơn, một số cá
thể trong quần thể sẽ sở hữu những biến dị alen phù hợp với môi trường. Những cá
thể đó sẽ có cơ hội sống sót cao hơn. Nhận định trên phù hợp với kết luận của
Huang và cộng sự năm 2010, trong nghiên cứu các tác giả đã chỉ ra rằng một số yếu
tố có thể ảnh hưởng đến sự đa dạng di truyền của Thạch tùng răng cưa như sự sinh
trưởng của các dòng vô tính, ảnh hưởng của chọn lọc tự nhiên và lai xa và sự sinh
sản hữu tính bằng cách phát tán bào tử [49]. Điều này được xem như một lý do cho
sự đa dạng loài.
Mặc dù xét về mặt tổng thể các mẫu thu thập ở hai tỉnh Lào Cai và Lâm
Đồng, sự đa dạng di truyền của loài Thạch tùng răng cưa là khá cao nhưng trong
phạm vi thuộc cùng một tỉnh sự đa dạng di truyền giữa các mẫu giảm đi rõ rệt, thậm
chí rất thấp (với sai khác di truyền thấp nhất là 0,06 ở các cặp mẫu SP1 và SP2,
DL2 và DL3). Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy yếu tố địa lý có tương quan đến sự
khác biệt về mặt di truyền. Cụ thể, các mẫu có vị trí phân bố địa lý càng gần, mức
độ tương đồng có xu hướng càng lớn, tức là mức độ sai khác về mặt di truyền càng
nhỏ, các mẫu đó có sự đa dạng di truyền càng thấp và ngược lại. Điều này cho thấy
các quần thể có hệ số đa dạng di truyền thấp nhiều khả năng chúng có nguồn gốc
chung và xuất phát từ những quần thể tự nhiên có kích thước tương đối nhỏ. Đây là
một trong những điểm cần lưu ý trong công tác bảo tồn, bởi vì nếu những quần thể
nhỏ như vậy bị khai thác liên tục sẽ làm mất đi hoàn toàn một số vốn gen của quần
thể. Nhận định này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thị Ái Minh và cộng sự
(2019). Về mặt địa lý, ở Việt Nam, mức độ đa dạng di truyền của loài Thạch tùng
răng cưa có xu hướng tăng từ Bắc vào Nam. Sự đa dạng di truyền của loài Thạch
tùng răng cưa tại Việt Nam là tương đối cao ở cả cấp độ quần thể và cấp độ loài, trừ
quần thể Hoàng Liên. Quần thể này có hệ số đa dạng di truyền thấp và có nguy cơ
tuyệt chủng cao hơn các quần thể khác ở miền Nam nếu chúng bị khai thác liên tục
[22].
Từ các kết quả nghiên cứu và nhận định trên cho thấy, chúng ta cần có kế
59
hoạch bảo tồn và khai thác loài Thạch tùng răng cưa một cách khoa học. Tại các
vùng nghiên cứu tại Lào Cai và Lâm Đồng nên có kế hoạch bảo tồn tại chỗ nhằm
duy trì và khôi phục quần thể loài Thạch tùng răng cưa trong môi trường tự nhiên.
Đồng thời, với các quần thể có mối quan hệ di truyền khá xa nhau có thể sử dụng
làm nguyên liệu cho quá trình nhân giống loài Thạch tùng răng cưa nhằm duy trì sự
đa dạng di truyền của quần thể. Kết quả nghiên cứu này có ý nghĩa trong việc bảo
tồn và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ở hai vùng Lào Cai và Lâm
Đồng.
3.1.5. Xác định hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai
và Lâm Đồng.
Đặc tính chữa bệnh của Thạch tùng răng cưa là do các hợp chất lycopodium
alkaloid có trong cây, trong đó hoạt chất chính tạo nên đặc tính chữa bệnh của
Thạch tùng răng cưa là HupA. Do đó, việc xác định sự có mặt và hàm lượng của
HupA trong cây là một nhiệm vụ quan trọng trong việc bảo tồn và phát triển nguồn
gen loài Thạch tùng răng cưa làm nguồn dược liệu. Chính vì vậy, sau khi tiến hành
nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và đánh giá sự đa dạng di truyền của 8
mẫu Thạch tùng răng cưa nhằm xác định đúng cây dược liệu nghiên cứu, chúng tôi
tiến hành xác định hoạt chất và hàm lượng HupA bằng kỹ thuật TLC và HPLC để
xác định sự có mặt của HupA trong các mẫu nghiên cứu, đồng thời tìm ra mẫu cây
có chứa hàm lượng HupA cao nhất phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.5.1. Xác định hoạt chất HupA bằng phương pháp sắc ký bản mỏng.
Trước tiên, để đánh giá sơ bộ hàm lượng HupA trong 8 mẫu Thạch tùng răng
cưa thu thập ở Lào Cai và Lâm Đồng, chúng tôi tiến hành phân tích toàn bộ cây
(bao gồm đỉnh chồi, bào tử, lá, thân và rễ) của các mẫu nghiên cứu.
Mẫu Thạch tùng răng cưa sau khi thu về được làm khô ở 50°C rồi chiết
HupA bằng các phương pháp tách chiết đã trình bày ở phần vật liệu và phương pháp.
Dịch chiết được chạy sắc ký bản mỏng với các hệ dung môi khác nhau cùng với
chất chuẩn. Kết quả chạy thử các hệ dung môi cho thấy, phương pháp chiết với hệ
dung môi chloroform - isopropanol - ethyl acetate - ammonia (4 - 1,5 - 4 - 0,1) cho
khả năng phân tách của các chất trên bản TLC rõ ràng và phù hợp nhất.
60
Kết quả chạy sắc ký bản mỏng dịch chiết của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với
hệ dung môi chloroform - isopropanol - ethyl acetate - ammonia (4 - 1,5 - 4 - 0,1)
được thể hiện trên hình 3.13.
A B
Hình 3.13. Hình ảnh chạy TLC HupA từ 8 mẫu Thạch tùng răng cưa. CC: chất
chuẩn; A. 1 -5 : Mẫu SP1A - mẫu SP5A; B. 6 - 8: Mẫu DL1A - mẫu DL3A. Mũi tên
chỉ vị trí vạch HupA.
Kết quả chạy TLC ở hình 3.13 cho thấy đối với dịch chiết của cả 2 mẫu
SP2A và SP3A đều không thấy xuất hiện vạch đốm vàng tương đương với vạch của
chất chuẩn. Đối với dịch chiết của mẫu DL2A xuất hiện vạch đốm có màu vàng (Rf
= 0,62) trùng với mẫu chất chuẩn nhưng rất mờ. Trong khi đó 4 mẫu SP1A, SP5A,
DL1A và DL3A xuất hiện vạch đậm hơn và tương đương với chất chuẩn (Rf = 0,62).
Nhận định sơ bộ ban đầu, các mẫu SP1A, SP4A và SP5A có hàm lượng HupA cao
hơn so với các mẫu SP2A và SP3A; các mẫu DL1A và DL3A có chứa hàm lượng
HupA cao hơn mẫu DL2A.
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng hàm lượng HupA phụ thuộc vào mùa, vùng sinh
sống, quá trình thu hái và phương pháp tách chiết [138]. Bên cạnh đó, hàm lượng
HupA còn mang tính đặc hiệu mô. Trong cây Thạch tùng răng cưa, phần đỉnh chồi
có chứa hàm lượng HupA cao nhất, tiếp đến là lá và thân cây [64]. Hơn nữa, trong
khuôn khổ nghiên cứu của đề tài, phần chồi đỉnh sẽ được sử dụng cho mục đích
nhân giống loài Thạch tùng răng cưa. Chính vì vậy, để tiết kiệm nguồn nguyên liệu
khai thác từ tự nhiên sử dụng cho mục đích nghiên cứu, trong thí nghiệm tiếp theo,
chúng tôi tiến hành xác định hoạt chất HupA ở hai mùa khác nhau là mùa xuân
61
(tháng 3) và mùa thu (tháng 9) với từng bộ phận của cây là rễ, thân và lá. Kết quả
nghiên cứu được thể hiện ở hình 3.14.
A B
Hình 3.14. Hình ảnh chạy TLC HupA từ Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng.
A. Mẫu mùa xuân (tháng 3). B. Mẫu mùa thu (tháng 9). 1: HupA chuẩn, 2: dịch
chiết từ lá, 3: dịch chiết từ thân, 4: dịch chiết từ rễ. Mũi tên chỉ vị trí vạch HupA.
Kết quả chạy sắc kí (hình 3.14) cho thấy dịch chiết từ rễ của mẫu thu tại Lâm
Đồng ở cả 2 mùa là mùa thu (tháng 9) và mùa xuân (tháng 3) đều không xuất hiện
vạch đốm vàng. Điều này cho thấy hàm lượng HupA ở rễ của Thạch tùng răng cưa
rất ít. Đối với dịch chiết lá và thân của các mẫu thu tại Lâm Đồng ở cả 2 mùa đều
thấy xuất hiện vạch đốm vàng tương đương với vạch của chất chuẩn (Rf = 0,62),
trong đó dịch chiết từ lá có màu đậm hơn so với dịch chiết từ thân. Tuy nhiên, bên
cạnh vạch đốm vàng tương đương với chất chuẩn, các dịch chiết thân và lá ở cả hai
mùa đều còn những vệt đốm dài và một số băng vạch ở vị trí khác, điều này cho
thấy dịch chiết vẫn còn lẫn tạp chất.
Đối với các mẫu Thạch tùng răng cưa mùa thu và mùa xuân thu tại Lào Cai,
chúng tôi sử dụng chạy TLC đối với mẫu lá và thân. Kết quả hình 3.15 cho thấy,
dịch chiết lá của các mẫu mùa thu và mùa xuân đều xuất hiện vạch đốm vàng tương
đương với chất chuẩn (Rf = 0,62). Đối với dịch chiết thân thì vạch đốm vàng xuất
hiện rất mờ (dịch chiết từ thân mùa thu) hoặc không xuất hiện vạch (dịch chiết thân
mùa xuân), điều này cho thấy hàm lượng HupA trong dịch chiết thân ít hơn so với
dịch chiết từ lá.
62
Hình 3.15. Hình ảnh chạy TLC HupA từ Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai. CC:
HupA chuẩn, 1: dịch chiết từ lá mùa thu, 2: dịch chiết từ thân mùa thu, 3: dịch chiết
từ thân mùa xuân, 4: dịch chiết từ lá mùa xuân. Mũi tên chỉ vị trí vạch HupA.
Qua đây, chúng tôi nhận định sơ bộ hàm lượng HupA được tổng hợp từ lá
của Thạch tùng răng cưa cao hơn so với thân và rễ; đồng thời, các mẫu thu hái vào
mùa thu (tháng 9) có hàm lượng HupA cao hơn các mẫu thu hái vào mùa xuân
(tháng 3). Điều này phù hợp với nhận định của Ma và cộng sự năm 2005 về hàm
lượng HupA thu được cao nhất vào mùa thu [60]. Tuy nhiên, chúng tôi cần tiến
hành các thí nghiệm tiếp theo để đưa ra được kết luận chính xác hơn.
3.1.5.2. Xác định hàm lượng HupA bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Để khẳng định sự có mặt và hàm lượng HupA trong các mẫu nghiên cứu một
cách chính xác, khoa học, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng HupA bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với 8 mẫu Thạch tùng răng cưa và
các bộ phận (lá, thân và rễ) của cây thu hái vào mùa thu và mùa xuân ở hai vùng
Lào Cai và Lâm Đồng.
a. Phân tích tín hiệu trên hệ thống LC
Hình 3.16. Sắc ký đồ HPLC (UV 310 nm) phát hiện HupA trong dịch chiết lá
Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai. (A). Chất chuẩn HupA, (B). Mẫu lá mùa thu
(tháng 9), (C). Mẫu lá mùa xuân (tháng 3).
63
Hình 3.17. Sắc kí đồ HPLC (UV 310 nm) phát hiện HupA trong dịch chiết lá cây
Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng. A. Chất chuẩn HupA, B. Mẫu lá mùa xuân
(tháng 3), C. Mẫu lá mùa thu (tháng 9).
Hình 3.18. Phổ ESI - MS Positive và peak ion phân tử 243,0.
b. Dựng đường chuẩn định lượng
Đường chuẩn định lượng được tính toán xây dựng bằng phần mềm
Chemstation dựa trên diện tích peak UV 310 tại thời gian lưu 11,40 - 11,70 min.
Đường chuẩn định lượng thu được có phương trình y = 5534,34x + 41,28 (y là diện
tích peak UV được chọn và x là nồng độ chất chuẩn tương ứng), với hệ số tương
quan R2 = 0,99992. Hệ số tương quan R2 = 0,99992 cho thấy phương trình đường
chuẩn có độ tuyến tính cao.
c. Xác định hàm lượng HupA từ toàn bộ cây của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa
Kết quả xác định hàm lượng HupA từ toàn bộ cây của 8 mẫu Thạch tùng
răng cưa thu ở Lào Cai và Lâm Đồng được thể hiện ở bảng 3.4.
64
Bảng 3.4. Kết quả xác định hàm lượng HupA từ toàn bộ cây của 8 mẫu
Thạch tùng răng cưa thu hái vào tháng 9 (mùa thu).
Mẫu phân tích Hàm lượng HupA (µg/g)
DL1A 90,23a ± 0,03
DL2A 80,61c ± 0,004
DL3A 85,42b ± 0,06
SP1A 76,28d ± 0,01
SP2A 65,58g ± 0,02
SP3A 59,62h ± 0,01
SP4A 71,91e ± 0,01
SP5A 69,43f ± 0,01
5% LSD 0,05
Chú ý: Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau, sai khác có ý nghĩa thống kê
qua kiểm định LSD với P < 0,05
Kết quả bảng 3.4 cho thấy, đối với các mẫu thu tại Lâm Đồng hàm lượng
HupA cao nhất thu được ở mẫu DL1A (Bidoup – Núi Bà, Đơn Dương, Lâm Đồng)
với hàm lượng HupA đạt 90,23 µg/g và thấp nhất ở mẫu DL2A (Lạc Xuân, Đơn
Dương, Lâm Đồng) với hàm lượng HupA đạt 80,61 µg/g. Đối với dịch chiết ở các
mẫu thu tại Lào Cai, kết quả cho thấy hàm lượng HupA cao nhất (76,28 µg/g) thu
được ở mẫu SP1A (Nậm Cang, Sa Pa, Lào Cai) và thấp nhất (59,62 µg/g) ở mẫu
SP3A (Tả Van, Sa Pa, Lào Cai). Đồng thời, so sánh hàm lượng HupA ở các mẫu
Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng và Lào Cai cho thấy hàm lượng HupA ở các
mẫu thu tại Lâm Đồng cao hơn so với các mẫu thu tại Lào Cai ở mức sai khác có ý
nghĩa thống kê. Sự sai khác này được giải thích là do điều kiện khí hậu và lượng
mưa ở hai vùng này khác nhau, trong đó, điều kiện khí hậu ở Lâm Đồng với nhiệt
độ trung bình năm dao động 18 - 25°C, lượng mưa trung bình khoảng 1.750 - 3.150
mm/ năm, độ ẩm tương đối trung bình cả năm 85 - 87%, các tháng mùa mưa độ ẩm
84 - 91% [13] thuận lợi hơn cho sự phát triển của loài Thạch tùng răng cưa và sự
tích lũy hàm lượng HupA, đặc biệt là trong các tháng mùa mưa (từ tháng 5 đến
tháng 11), lượng mưa nhiều làm tăng độ ẩm của môi trường. Nhận định này phù
hợp với nghiên cứu của Ma và cộng sự (2005), loài Thạch tùng răng cưa mọc ở
65
rừng ẩm ướt cho hàm lượng HupA cao hơn đáng kể so với phát triển trong môi
trường có độ ẩm thấp [60].
Hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa đã được xác định ở nhiều
nước trên thế giới. Tại Trung Quốc, hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng
cưa dao động từ 80,16 đến 182,55 µg/g khối lượng khô [60]. Tại Philippines, hàm
lượng HupA được xác định từ loài H. elmeri (Herter) Holub đạt 608 µg/g khối
lượng khô [61]. Trong nghiên cứu của Goodger và cộng sự (2008), hàm lượng
HupA cao nhất được xác định ở loài H. carinata thu tại Australia là 1030 µg/g khối
lượng khô [2]. Ở Việt Nam, Nguyễn Ngọc Chương và cộng sự (2016) đã xác định
được hàm lượng HupA của loài Thạch tùng răng cưa thu ở Kontum, Tây Nguyên là
181,64 µg/g khối lượng khô [82]. Nghiên cứu của chúng tôi đã xác định được hàm
lượng HupA cao nhất tại Lâm Đồng là 90,23 µg/g khối lượng khô. Điều này cho
thấy, hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa phụ thuộc chủ yếu vào điều
kiện sinh thái (đất, nước, khí hậu), giống, tuổi cây, bộ phận của cây và công nghệ
tách chiết. Nhận định của chúng tôi phù hợp với kết luận của Ha và cộng sự (2011)
về hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng phụ thuộc vào mùa, vùng sinh sống,
quá trình thu hái và phương pháp tách chiết [59].
Ngoài việc xác định hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa, vấn đề
tiếp theo cần nghiên cứu là thu hoạch bộ phận nào của cây và vào thời điểm nào
trong năm để thu được hàm lượng HupA cao nhất. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục đánh
giá hàm lượng HupA bằng phương pháp HPLC với từng bộ phận của cây và vào hai
thời điểm thường thu hoạch Thạch tùng răng cưa là mùa xuân và mùa thu (tương
ứng với mùa khô và mùa mưa ở Lâm Đồng). Cụ thể, trong nghiên cứu này, chúng
tôi tiến hành đánh giá hàm lượng HupA thu hái vào tháng 3 và tháng 9 năm 2015 ở
cả hai vùng Lào Cai và Lâm Đồng.
d. Kết quả xác định hàm lượng HupA từ các bộ phận và thời điểm thu hái Thạch
tùng răng cưa khác nhau năm 2015.
Các mẫu Thạch tùng răng cưa sau khi chạy định tính bằng sắc kí lớp mỏng ở
trên tiếp tục được phân tích bằng kỹ thuật HPLC để đánh giá chính xác hàm lượng
HupA có trong từng bộ phận của cây (rễ, thân và lá). Kết quả nghiên cứu được thể
hiện ở bảng 3.5.
66
Bảng 3.5. Hàm lượng HupA của rễ, thân và lá Thạch tùng răng cưa
Hàm lượng HupA (µg/g mẫu khô)
Tên mẫu DL1
DL2
DL3
SP1
SP2
SP3
SP4
SP5 Tháng 3 năm 2015 Thân 47,70 ± 0,01 42,30 ± 0,01 44,70 ± 0,01 39,50 ± 0,01 34,70 ± 0,01 35,10 ± 0,01 37,30 ± 0,01 35,20 ± 0,01 Lá 75,40 ± 0,02 73,20 ± 0,02 73,50 ± 0,01 72,30 ± 0,01 61,50 ± 0,02 59,80 ± 0,02 70,60 ± 0,02 69,50 ± 0,01 Rễ 17,20 ± 0,01 15,40 ± 0,01 16,10 ± 0,01 15,30 ± 0,01 14,80 ± 0,01 13,10 ± 0,01 15,20 ± 0,01 14,90 ± 0,01 Tháng 9 năm 2015 Thân 48,70 ± 0,01 45,20 ± 0,01 47,80 ± 0,01 44,60 ± 0,01 38,20 ± 0,01 38,10 ± 0,01 40,60 ± 0,01 39,50 ± 0,01 Rễ 18,20 ± 0,01 17,30 ± 0,01 17,80 ± 0,01 16,80 ± 0,01 15,70 ± 0,01 16,10 ± 0,01 16,30 ± 0,004 16,60 ± 0,004 Lá 92,50 ± 0,02 83,50 ± 0,02 90,20 ± 0,02 78,40 ± 0,02 66,10 ± 0,02 62,40 ± 0,02 73,50 ± 0,02 70,70 ± 0,01
Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ rễ, thân và lá Thạch tùng răng cưa
thu hái vào tháng 9 đều có hàm lượng HupA cao hơn so với dịch chiết từ rễ, thân và
lá thu hái vào tháng 3 tương ứng. Xét về hàm lượng HupA được tổng hợp từ các bộ
phận khác nhau của cây (rễ, thân và lá) thì hàm lượng HupA được tổng hợp từ lá
cao nhất (92,50 µg/ g khối lượng khô). Hàm lượng HupA tích lũy trong lá cây cao
nhất, tiếp theo là thân cây và thấp nhất ở rễ cây. Điều này cho thấy để thu nhận hoạt
chất HupA phục vụ cho y học nên thu hoạch lá và phần thân trên của cây, nên giữ
lại phần rễ cây và phần thân ở gốc cây Thạch tùng răng cưa. Việc giữ lại phần gốc
thân và rễ nhằm mục đích giúp cây có thể tái sinh các bộ phận phía trên và tiếp tục
phát triển. Phương pháp thu hoạch như vậy sẽ khắc phục được việc suy giảm một
lượng lớn cây Thạch tùng răng cưa. Điều này rất có ý nghĩa trong việc vừa khai thác
giá trị thương mại của loài Thạch tùng răng cưa vừa góp phần bảo tồn nguồn gen
loài cây này trong tự nhiên.
Đối với các mẫu lá thu hái tại Lào Cai, hàm lượng HupA trong lá thu hái vào
tháng 9 và tháng 3 có sự chênh nhau tương đối nhỏ. Cụ thể, hàm lượng HupA trong
các mẫu SP1 và SP2 ở hai thời điểm thu hái chênh lệch nhau 6,10 µg/g và 4,50 µg/g
khối lượng khô (tương ứng là 78,40 µg/g; 66,10 µg/g đối với mẫu lá thu hái vào
tháng 9 và 72,30 µg/g; 61,50 µg/g đối với mẫu lá thu hái vào tháng 3); các mẫu lá
67
SP5, SP3 và SP4 có hàm lượng HupA từ mẫu lá thu hái vào tháng 9 và tháng 3
chênh lệch nhau ít hơn, dao động từ 1,20 µg/g đến 2,60 µg/g.
Đối với các mẫu lá thu hái tại Lâm Đồng, hàm lượng HupA thu được cao
hơn so với ở Lào Cai, sự chênh lệch hàm lượng HupA thu hái vào tháng 9 và tháng
3 khá rõ ràng. Cụ thể, hàm lượng HupA cao nhất thu được từ mẫu lá DL1 vào tháng
9 là 92,50 µg/g còn hàm lượng HupA thu được từ mẫu lá DL1 thu hái vào tháng 3 là
75,40 µg/g. Như vậy, hàm lượng HupA trong mẫu lá Thạch tùng răng cưa thu hái
vào tháng 9 cao hơn so với mẫu thu hái vào tháng 3 là 17,10 µg/g khối lượng khô.
Sự chênh lệch về hàm lượng HupA giữa mẫu lá DL2, DL3 thu hái vào tháng 9 và
tháng 3 là 10,30 µg/g (83,50 µg/g và 73,20 µg/g tương ứng) và 16,70 µg/g khối
lượng khô (90,20 µg/g và 73,50 µg/g tương ứng).
Kết quả trên cho thấy hàm lượng HupA phụ thuộc vào mùa trong năm. Ở
Lâm Đồng vào các tháng mùa mưa (đặc biệt là từ tháng 7 đến tháng 9 tương ứng
với mùa thu ở Lào Cai), lượng mưa nhiều hơn và độ ẩm không khí cao hơn so với
các tháng mùa khô (đặc biệt là từ tháng 1 đến tháng 3, tương ứng với mùa xuân ở
Lào Cai) sẽ thúc đẩy cây Thạch tùng răng cưa tổng hợp HupA nhiều hơn. Điều đó
cho thấy lượng mưa có ảnh hưởng đến sự tổng hợp và tích lũy hàm lượng HupA
trong cây Thạch tùng răng cưa ở các vùng nghiên cứu. Kết quả này phù hợp với kết
luận trong nghiên cứu của Ma và cộng sự (2005) là loài Thạch tùng răng cưa mọc ở
rừng ẩm ướt cho hàm lượng HupA cao hơn đáng kể so với phát triển trong môi
trường có độ ẩm thấp; đồng thời, hàm lượng HupA thay đổi rõ rệt ở các thời điểm
khác nhau trong năm, giảm dần khi bắt đầu vào mùa đông và tăng dần vào mùa hè,
với hàm lượng cao nhất vào giữa mùa thu và thấp nhất vào đầu mùa xuân [59, 138].
Như vậy, kết quả xác định hàm lượng HupA bằng phương pháp HPLC cho
thấy hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa thay đổi theo mùa, mùa thu (ở
Lào Cai, tương ứng với mùa mưa ở Lâm Đồng) cho hàm lượng HupA cao hơn so
với mùa xuân (ở Lào Cai, tương ứng với mùa khô ở Lâm Đồng); đồng thời, sự tích
luỹ HupA ở các mô lá cao hơn so với thân và rễ. Khi khai thác Thạch tùng răng cưa
làm dược liệu để tách chiết HupA nên thu hoạch lá và phần thân trên của cây thay vì
thu hoạch toàn bộ cây. Kết quả này có ý nghĩa đối với việc lựa chọn bộ phận và thời
điểm thu hái Thạch tùng răng cưa để tách chiết và thu được hợp chất HupA cao nhất,
68
đồng thời sử dụng làm nguyên liệu phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Nhân giống Thạch tùng răng cưa
Hiện nay, nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam và trên thế giới
đang bị khai thác quá mức, làm suy giảm nhanh chóng số lượng loài cây này trong
tự nhiên, dẫn đến nguy cơ bị tận diệt rất cao nếu không có chính sách bảo tồn phù
hợp. Do đó, nghiên cứu nhân giống loài Thạch tùng răng cưa là bước tiếp theo cần
tiến hành nhằm góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen quý hiếm này ở hai vùng
Lào Cai và Lâm Đồng nói riêng cũng như ở Việt Nam nói chung. Trong quá trình
nghiên cứu, chúng tôi cũng đã tìm hiểu và tiến hành nhân giống loài Thạch tùng
răng cưa bằng hình thức nuôi cấy bào tử. Tuy nhiên, do đặc tính sinh trưởng của
loài Thạch tùng răng cưa rất chậm, bào tử của loài này từ khi nảy mầm phát triển
qua giai đoạn giao tử thể, cuối cùng đạt đến giai đoạn thể bào tử trưởng thành phải
mất 15 năm đến 20 năm [19, 68, 118]. Hơn nữa, trên thế giới cũng chưa có công
trình nào nảy mầm được bào tử của loài Thạch tùng răng cưa trong điều kiện tự
nhiên cũng như trong phòng thí nghiệm. Chính vì vậy, trong khuôn khổ đề tài luận
án, chúng tôi tập trung vào hai hình thức nhân giống chính là nhân giống bằng giâm
hom thân và nhân giống bằng nuôi cấy mô.
3.2.1. Nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng giâm hom thân
Kết quả nghiên cứu về đánh giá đa dạng di truyền cho thấy các mẫu DL1
(Bidoup - Núi Bà) ở Lâm Đồng và các mẫu SP1 (Nậm Cang - Sa Pa), SP2 (Bản Hồ
- Sa Pa) ở Lào Cai có mối quan hệ di truyền xa nhất. Hơn nữa, khi xác định hàm
lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa thu hái tại 2 vùng Lâm Đồng và Lào
Cai (năm 2015) cho thấy tại Lâm Đồng hàm lượng HupA ở mẫu DL1A (90,23 µg/ g)
thu tại vùng Bidoup – Núi Bà, Lạc Dương cao hơn các mẫu DL2A và DL3A; tại
Lào Cai thì hàm lượng HupA ở mẫu SP1A thu tại vùng Nậm Cang, Sa Pa (76,28 µg/
g) cao hơn các mẫu còn lại thu ở các vùng khác của Lào Cai. Do đó, trong nghiên
cứu này, chúng tôi lựa chọn các mẫu thu tại vùng Bidoup - Núi Bà, Lạc Dương,
Lâm Đồng (kí hiệu mẫu DL1) và các mẫu thu tại vùng Nậm Cang, Sa Pa, Lào Cai
(kí hiệu mẫu SP1) làm đối tượng nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa ở hai
vùng Lâm Đồng và Lào Cai.
Để xây dựng quy trình nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng phương pháp
69
giâm hom thân, trước hết, nghiên cứu phải tìm được các điều kiện thích hợp cho
việc nhân giống nhằm tạo hiệu quả nhân giống cao nhất. Chúng tôi đã tiến hành các
thí nghiệm về khảo sát ảnh hưởng của chiều dài hom thân, giá thể giâm, chất điều
hòa sinh trưởng, độ sâu hom giâm, chế độ bón phân và thời điểm ra cây đến khả
năng sinh trưởng và phát triển của cây con Thạch tùng răng cưa.
3.2.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của chiều dài hom thân
Sau 2 tháng tiến hành thí nghiệm giâm hom thân tại hai địa điểm Lâm Đồng
và Lào Cai, kết quả cho thấy đa số cây con Thạch tùng răng cưa từ hom thân giâm
sinh trưởng tốt. Tuy nhiên để thấy rõ được sự khác biệt giữa hom thân giâm với cây
con đã thích ứng và phát triển chỉ có thể quan sát sau 4 tháng. Tỷ lệ hom thân giâm
hồi xanh tương đối cao chứng tỏ sức sống của hom thân giâm Thạch tùng răng cưa
tốt, dễ sống và khỏe (Bảng 3.6). Sự sống sót và phát triển của hom thân giâm có thể
được thúc đẩy bởi các chất điều hòa sinh trưởng tác động vào quá trình ra rễ, nhưng
trước tiên, hom thân giâm phát triển phụ thuộc rất nhiều vào chiều dài được sử dụng
trong thí nghiệm giâm hom.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của chiều dài hom thân đến sự sinh trưởng của cây con
Thạch tùng răng cưa tại Lâm Đồng và Lào Cai sau 4 tháng giâm hom.
Chỉ tiêu theo dõi
Chiều dài hom thân
Địa điểm Lâm Đồng
Lào Cai
4 cm 5 cm 6 cm 7 cm 8 cm 9 cm 10 cm 5% LSD 4 cm 5 cm 6 cm 7 cm 8 cm 9 cm 10 cm 5% LSD Tỷ lệ hom giâm hồi xanh (%) 81,39e 84,17d 88,33ab 88,33ab 90,28a 86,11cd 88,06bc 1,972 74,72c 78,06b 86,39a 88,33a 86,94a 87,22a 86,67a 2,28 Tỷ lệ cây ra rễ (%) 12,27d 19,16c 26,42a 22,33bc 22,47bc 22,89b 21,15c 3,316 10,04e 17,79d 23,47a 21,39c 22,36b 21,98bc 21,47c 0,80 Tỷ lệ cây có lá mới (%) 38,25d 46,20c 78,29a 71,39b 72,63b 78,11a 76,35ab 5,239 32,74d 47,71c 68,49a 65,41b 67,73ab 65,29b 67,64ab 2,55
Chú ý: Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau sai khác có ý nghĩa thống kê qua
kiểm định LSD với P < 0,05.
70
Bảng 3.6 cho thấy sử dụng các hom thân Thạch tùng răng cưa có độ dài 4 cm
và 5 cm cho tỉ lệ hom giâm hồi xanh, tỉ lệ cây con ra rễ và tỉ lệ cây con có lá mới
thấp hơn hẳn các chiều dài hom thân khác ở mức sai khác có ý nghĩa 95%. Hom
thân có chiều dài 8 cm được sử dụng giâm hom ở Lâm Đồng và chiều dài hom thân
7 cm được sử dụng ở Lào Cai cho tỉ lệ cây con hồi xanh cao nhất (90,28% và
88,33% tương ứng), nhưng tỉ lệ cây con hồi xanh này sai khác không có ý nghĩa
thống kê so với khi sử dụng chiều dài hom thân 6 cm. Bên cạnh đó, sử dụng hom
thân có chiều dài 6 cm thì tỉ lệ cây con ra rễ (26,42% ở Lâm Đồng; 23,47% ở Lào
Cai) và tỉ lệ cây con có lá mới (78,29% ở Lâm Đồng; 68,49% ở Lào Cai) đạt giá trị
cao nhất so với các chiều dài hom thân còn lại ở mức sai khác có ý nghĩa thống kê.
Như vậy, sử dụng hom thân có chiều dài 6 cm cho hiệu quả tốt nhất đối với
nhân giống vô tính loài Thạch tùng răng cưa bằng hình thức giâm hom ở cả hai
vùng Lâm Đồng và Lào Cai. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Long và cộng
sự (2014) trong nghiên cứu nhân giống loài Thạch tùng răng cưa bằng phương pháp
giâm hom thực hiện tại trang trại rừng của vùng Yantuozhai, Gaowangjie, huyện
Guzhang, địa khu Xiangxi, tỉnh Hồ Nam, Trung Quốc, nhóm tác giả đã đưa ra kết
luận sử dụng hom thân có chiều dài 6 cm cho hiệu quả nhân giống tốt nhất [117].
Do đó, chúng tôi lựa chọn hom thân có chiều dài 6 cm cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể giâm
Theo Ninh Thị Phíp (2013), giá thể giâm cành có ảnh hưởng lớn đến hiệu
quả nhân giống cây trồng bằng cành giâm như giữ cho cành giâm luôn ở tư thế cố
định, là nguồn cung cấp nước và dinh dưỡng cho cành giâm; cho phép không khí
xâm nhập vào phần gốc của cành giâm. Một giá thể được xem là lý tưởng nếu giá
thể đó đủ độ xốp, thoáng khí, giữ và thoát nước tốt, sạch sâu bệnh và cỏ dại [139].
Các nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2009), Long và cộng sự (2014) đã chỉ ra
rằng môi trường thích hợp nhất để giâm hom thân loài Thạch tùng răng cưa là môi
trường đất rừng sinh thái [118, 120]. Chính vì vậy, trong thí nghiệm tiếp theo, chúng
tôi lựa chọn giá thể chính để tiến hành giâm hom thân là đất rừng sinh thái có bổ
sung phân chuồng hoai mục, trấu hun và phân trùn quế theo các tỉ lệ khác nhau để
tìm ra giá thể giâm hom tốt nhất. Đồng thời, dựa trên cơ sở kết quả của thí nghiệm
trước, chúng tôi sử dụng chiều dài hom thân 6 cm giâm trong 5 công thức giá thể
71
ĐC, CT1, CT2, CT3 và CT4 để tiến hành thí nghiệm giâm hom thân, kết quả thể
hiện ở bảng 3.7. Hiện tượng phát sinh rễ và ra lá mới xuất hiện ở cả 05 công thức.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các loại giá thể đến sự sinh trưởng của cây con Thạch
tùng răng cưa sau 4 tháng giâm tại Lâm Đồng và Lào Cai.
Các chỉ tiêu Tỷ lệ cây ra rễ (%) Tỷ lệ cây có lá mới (%) Địa điểm nghiên cứu Loại giá thể
Lâm Đồng
Lào Cai
Tỷ lệ hom giâm hồi xanh (%) 88,06a 87,22a 87,22a 86,11a 88,33a 3,94 86,39b 87,5b 88,89a 89,72a 86,94b 1,18 26,18b 24,21b 30,33a 14,22c 22,33b 4,11 23,47c 25,71b 29,07a 24,77b 24,92b 1,55 78,22b 68,19c 85,42 a 61,38c 63,84c 7,13 68,49cd 69,85c 83,44a 70,90b 67,41d 2,19 ĐC (đất rừng) CT1 CT2 CT3 CT4 5% LSD ĐC (đất rừng) CT1 CT2 CT3 CT4 5% LSD
Chú ý: Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau sai khác có ý nghĩa thống kê qua kiểm định LSD với P < 0,05.
(CT1: 3 đất rừng : 1 phân chuồng hoai mục; CT2: 3 đất rừng : 1 phân chuồng hoai mục : 1 trấu hun; CT3: 3 đất rừng : 1 phân chuồng hoai mục: 1 trấu hun : 1 phân trùn quế; CT4: 3 đất rừng : 1 trấu hun : 1 phân trùn quế)
Kết quả nghiên cứu tại Lâm Đồng cho thấy, tỷ lệ hom thân hồi xanh ở cả 5
công thức giá thể ít có sự khác biệt, tuy nhiên, tỷ lệ cây con ra rễ và tỉ lệ cây con ra
lá mới ở công thức CT2 cho giá trị cao nhất (30,33 % và 85,42%), cao hơn so với tỉ
lệ ra rễ và ra lá mới ở các giá thể khác với mức sai khác có ý nghĩa thống kê 95%
(Bảng 3.7). Tại Lào Cai, các chỉ tiêu sinh trưởng của hom thân Thạch tùng răng cưa
trong các giá thể có bổ sung phân chuồng hoai mục cao hơn so với giá thể đối
chứng. Điều này cho thấy việc tăng tỉ lệ tơi xốp và chất dinh dưỡng cho giá thể sẽ
giúp làm tăng khả năng sinh trưởng của hom thân Thạch tùng răng cưa. Tỉ lệ hồi
xanh ở giá thể CT2 (88,89%) và giá thể CT3 (89,72%) cao hơn các giá thể khác.
Mặc dù tỉ lệ hồi xanh ở giá thể CT3 (89,72%) cao hơn so với giá thể CT2 (88,89%)
nhưng sự sai khác này không có ý nghĩa thống kê. Hơn nữa, tỉ lệ cây con ra rễ
(29,07%) và tỉ lệ cây con có lá mới (83,44%) ở giá thể CT2 cao hơn hẳn so với các
giá thể giâm hom khác ở mức sai khác có ý nghĩa thống kê.
72
Ở cả hai vùng Lâm Đồng và Lào Cai, kết quả nghiên cứu đều cho thấy việc
sử dụng giá thể CT2 là tốt nhất đối với giâm hom thân loài Thạch tùng răng cưa.
Thêm vào đó, tỉ lệ cây con ra rễ tỉ lệ thuận với tỷ lệ cây con hình thành lá mới, có
thể thấy hai quá trình này có mối quan hệ tác động qua lại lẫn nhau. Cụ thể, khi cây
con có nhiều lá mới sẽ tác động đến việc thu hút chất dinh dưỡng giúp tăng cường
khả năng tạo rễ. Đồng thời, khi rễ xuất hiện nhiều, cây sẽ hấp thụ được nhiều chất
dinh dưỡng giúp hom thân sinh trưởng tốt hơn và lá sẽ xuất hiện nhiều hơn. Từ các
kết quả trên, chúng tôi nhận định giá thể CT2 (đất rừng: phân chuồng hoai mục: trấu
hun với tỉ lệ 3: 1: 1) là giá thể thích hợp đối với giâm hom thân loài Thạch tùng răng
cưa. Kết quả này cho thấy một điểm khác trong việc sử dụng giá thể giâm hom thân
loài Thạch tùng răng cưa so với nghiên cứu của Trung Quốc, cụ thể, nghiên cứu của
Bao và cộng sự (2012) đã chỉ ra rằng giá thể thích hợp nhất cho việc giâm hom thân
loài Thạch tùng răng cưa là giá thể rong rêu với tỉ lệ hom giâm sống sót lên tới 90%
[16]. Điều này có thể giải thích là do điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng của Việt Nam
và Trung Quốc khác nhau nên môi trường sống của hom thân Thạch tùng răng cưa
có sự sai khác. Do đó, tại Lâm Đồng và Lào Cai, giá thể CT2 sẽ được sử dụng cho
các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng
Sau khi giâm hom thân Thạch tùng răng cưa 4 tháng, kết quả cho thấy chiều
dài hom thân là 6 cm và được giâm trong giá thể CT2 (đất rừng, phân chuồng hoai
mục, trấu hun, phân trùn quế tỷ lệ 3:1:1:0) thì khả năng ra rễ và phát triển lá mới là
cao nhất so với các công thức còn lại. Tuy nhiên, tỉ lệ ra rễ và ra lá mới cũng chỉ đạt
cao nhất là 30,35% và 85,34% (tại Lâm Đồng); 29,07% và 83,44% (tại Lào Cai), tỷ
lệ ra rễ này so với các loại cây khác là tương đối thấp. Do đó, để nâng cao khả năng
ra rễ thì việc xử lý chất điều hòa sinh trưởng là biện pháp thường được sử dụng
trước khi giâm hom. Việc sử dụng auxin (IAA, IBA và α-NAA) để kích thích hom
giâm hình thành rễ sẽ nâng cao được tỷ lệ hình thành cây. Đối với loại cây thân thảo,
gỗ mềm xử lý ở nồng độ < 1000 ppm, trong khi đó cây thân gỗ nửa cứng xử lý ở
nồng độ 2000 - 3000 ppm cho hiệu quả cao [139]. Bên cạnh đó, Abu - Zahra (2013)
cho rằng có thể xử lý IAA, NAA với nồng độ cao (lên tới 6000 ppm) trong thời gian
ngắn hoặc nồng độ thấp trong thời gian dài (lên tới 12h) đều có thể có hiệu quả đối
73
với từng loại cây [140]. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát bước đầu đối với các chất
điều hòa sinh trưởng IAA, α - NAA, IBA và nhận thấy nếu để thời gian xử lý α -
NAA lâu hơn 1 giờ, hom thân Thạch tùng răng cưa dễ bị ủng và chết sau vài ngày.
Chính vì thế, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng α - NAA với nồng độ cao lên
đến 3500 ppm trong thời gian ngắn 4 - 6 giây và nồng độ thấp α - NAA dưới 40
ppm trong thời gian 5 phút (tương tự phương pháp của Long và cộng sự (2014)).
Đối với IAA xử lý trong thời gian ngắn, nồng độ cao thì hom thân có nhiều lá héo
hơn, vì thế, chúng tôi lựa chọn xử lý IAA với dải nồng độ thấp 0 - 120 ppm trong
thời gian 30 phút. Đối với IBA, chúng tôi sử dụng ở nồng độ cao lên đến 3000 ppm
trong thời gian 30 phút (tương tự nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2009); Qin và
cộng sự (2010)) để nghiên cứu tác động của chất điều hoà sinh trưởng đến sự phát
triển của hom thân Thạch tùng răng cưa.
a. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển
của hom thân Thạch tùng răng cưa tại Lâm Đồng.
Sau khi khảo sát sơ bộ về ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng α –
NAA, IAA và IBA đến sự sinh trưởng của hom thân Thạch tùng răng cưa, trong thí
nghiệm này, chúng tôi sử dụng α - NAA ở hai dải nồng độ khác nhau, nồng độ cao
với thời gian ngắn 4 - 6 giây và nồng độ thấp với thời gian 5 phút; IAA với nồng độ
từ 0 - 120 ppm trong thời gian 30 phút và IBA nồng độ cao từ 500 ppm - 3000 ppm
trong thời gian 30 phút. Sau 4 tháng giâm hom và theo dõi, kết quả sinh trưởng của
hom thân Thạch tùng răng cưa được thể hiện ở bảng 3.8.
Kết quả ở bảng 3.8 cho thấy khi hom thân được xử lý với α - NAA ở nồng độ
2500 ppm thì cây con có tỉ lệ ra rễ (88,89%), số rễ (2,84 rễ) và số lá mới (2,78 lá)
đạt giá trị cao nhất so với hom thân được xử lý với α - NAA ở các nồng độ 0 ppm;
500 ppm; 1500 ppm; 3500 ppm ở mức sai khác có ý nghĩa thống kê. Điều này cho
thấy sự ra rễ và ra lá mới của hom thân tăng tỉ lệ thuận với sự gia tăng nồng độ xử
lý chất điều hòa sinh trưởng α - NAA từ 0 đến 2500 ppm, nhưng khi tăng nồng độ
xử lý α - NAA lên quá 2500 ppm thì tỉ lệ cây ra rễ, số rễ và số lá của hom thân
không tăng nữa. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Poornima và cs
(2012), cành giâm hương thảo được xử lý ở nồng độ 3.000 ppm α - NAA cho tỷ lệ
cành giâm ra rễ là 76,20% [141]. Kết quả của nghiên cứu này cũng phù hợp với kết
74
quả nghiên cứu của Abu - Zahra và cs (2013) là tăng nồng độ xử lý α - NAA thì tỷ
lệ cành giâm hương thảo ra rễ càng tăng [140]. Đồng thời, kết quả cũng cho thấy
mối quan hệ tỉ lệ thuận giữa sự hình thành lá mới và rễ mới, khi có nhiều lá mới tác
động đến việc thu hút dinh dưỡng tạo khả năng ra rễ nhiều hơn và ngược lại.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến sự phát triển của cây
con Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng giâm hom thân tại Lâm Đồng
Số rễ Số lá mới Chất điều hòa sinh trưởng
α – NAA (xử lý 4 – 6 giây)
5% LSD
α – NAA (Xử lý 5 phút)
5% LSD
IAA (Xử lý 30 phút)
5% LSD
IBA (Xử lý 30 phút)
5% LSD Nồng độ (ppm) 0 (ngâm nước ) 500 1500 2500 3500 0 (ngâm nước) 10 20 30 40 0 (ngâm nước) 50 70 90 120 0 (ngâm nước ) 500 1000 2000 3000 Tỉ lệ cây ra rễ (%) 32,22e 53,33d 73,33c 88,89a 81,11b 6,62 32,22e 56,67d 80,00a 71,11a 64,44b 5,55 31,11d 42,22c 64,44b 83,33a 70,00b 7,25 33,44e 61,11d 87,78a 75,56b 67,78c 6,33 1,42c ± 0,05 1,44c ± 0,06 2,11b ± 0,06 2,84a ± 0,08 2,22b ± 0,05 0,12 1.38e ± 0,09 1,67d ± 0,07 2,04a ± 0,06 1,94b ± 0,07 1,86c ± 0,06 0,06 1,38d ± 0,09 1,61c ± 0,08 1,48d ± 0,07 2,02a ± 0,06 1,86b ± 0,06 0,12 1,38d ± 0,05 1,47d ± 0,07 2,83a ± 0,09 2,17b ± 0,07 1,92c ± 0,06 0,14 1,57c ± 0,07 2,43b ± 0,07 2,74a ± 0,08 2,78a ± 0,06 2,42b ± 0,07 0,09 1.58e ± 0,07 2,02c ± 0,08 2,36a ± 0,07 2,30b ± 0,07 2,18d ± 0.08 0,07 1,59c ± 0,07 2,15ab ± 0,08 2,12ab ± 0,08 2,43a ± 0,06 2,32a ± 0,07 0,12 1,59d ± 0,08 1,69d ± 0,08 2,72a ± 0,07 2,47b ± 0,06 2,11c ± 0,08 0,15
Chú ý: Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau sai khác có ý nghĩa thống kê qua kiểm định LSD với P < 0,05.
Khi xử lý hom thân Thạch tùng răng cưa bằng chất điều hòa sinh trưởng α -
NAA ở nồng độ thấp từ 0 đến 40 ppm trong thời gian 5 phút, kết quả cho thấy việc
xử lý bằng α - NAA nồng độ thấp có hiệu quả cao hơn đối với sự ra rễ và tạo lá mới
của hom thân Thạch tùng răng cưa so với đối chứng (Bảng 3.8). Trong đó, hiệu quả
tác động đến sự tạo rễ và lá mới đạt giá trị cao nhất khi sử dụng α - NAA ở nồng độ
20 ppm với tỉ lệ cây ra rễ đạt 80%, số rễ đạt 2,04 rễ và số lá mới bằng 2,36 lá, cao
75
hơn so với các nồng độ α - NAA còn lại ở mức sai khác có ý nghĩa thống kê. Kết
quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Long và cộng sự (2014) đã công bố khi
xử lý hom thân Thạch tùng răng cưa dài 6 cm bằng chất điều hòa sinh trưởng α -
NAA 20 ppm trong thời gian 5 phút cho tỉ lệ sống lên đến 90% và hom thân ra rễ
chỉ sau 6 tháng nuôi trồng [117].
Nghiên cứu cho thấy chất điều hòa sinh trưởng IAA có tác động đến sự sinh
trưởng, tạo rễ và ra lá mới của hom thân Thạch tùng răng cưa. Đồng thời, tỉ lệ cây
ra rễ, số rễ và số lá mới tăng tỉ lệ thuận với sự tăng nồng độ IAA từ 0 đến 90 ppm và
đạt giá trị cao nhất tại nồng độ 90 ppm (83,33%, 2,02 rễ và 2,43 lá mới) nhưng lại
giảm dần khi tăng nồng độ IAA lên đến 120 ppm (giảm còn 70%, 1,86 rễ và 2,32 lá
mới). Do đó, chúng tôi nhận thấy xử lý chất điều hòa sinh trưởng IAA nồng độ 90
ppm là tốt hơn các nồng độ IAA khác trong việc kích thích sự sinh trưởng của cây
con Thạch tùng răng cưa.
IBA là một trong những chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin được sử
dụng nhiều trong nhân giống cây trồng để kích thích sự tạo rễ. Trong thí nghiệm
giâm hom thân Thạch tùng răng cưa, chúng tôi sử dụng IBA ở dải nồng độ cao lên
đến 3000 ppm, kết quả cho thấy các chất điều hòa sinh trưởng có ảnh hưởng đến sự
tạo rễ và ra lá mới của hom thân (Bảng 3.8). Hom thân khi được xử lý ở nồng độ
IBA tăng từ 0 đến 1000 ppm thì khả năng tạo rễ, số rễ và phát sinh lá mới của hom
thân tăng lên tương ứng và đạt giá trị cao nhất (87,78%, 2,83 rễ và 2,72 lá) ở nồng
độ xử lý 1000 ppm. Tuy nhiên, khi sử dụng nồng độ IBA lớn hơn 1000 ppm thì các
chỉ tiêu về tỉ lệ hom thân tạo rễ, số rễ và số lá mới của hom thân giảm dần đi và số
rễ giảm nhanh khi tăng nồng độ IBA lên đến 3000 ppm. Kết quả này phù hợp với
công bố của Qin và cộng sự (2010) khi nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa
bằng hình thức giâm hom thân, các tác giả đã xử lý hom thân của loài Thạch tùng
răng cưa bằng chất điều hòa sinh trưởng IBA 1000 ppm trong thời gian 30 phút và
nhận được tỉ lệ hom thân sống sót và ra rễ lên đến 98% [116]. Tuy nhiên, kết quả
này có sự sai khác với nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2009) về nồng độ IBA
được sử dụng, các tác giả đã chỉ ra rằng nồng độ IBA 2000 ppm cho hiệu quả tốt
nhất với thí nghiệm giâm hom thân loài Thạch tùng răng cưa [118]. Sự sai khác này
có thể giải thích là do điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng của Việt Nam và Trung Quốc
76
khác nhau ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của chất điều hòa sinh trưởng IBA
trong việc kích thích sự phát triển của hom thân Thạch tùng răng cưa.
b. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển của hom
thân Thạch tùng răng cưa tại Lào Cai.
Song song với việc nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng
đến sự phát triển của cây con Thạch tùng răng cưa ở Lâm Đồng, chúng tôi cũng tiến
hành nghiên cứu này ở Lào Cai. Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển của cây con
Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng giâm hom thân tại Lào Cai.
Nồng độ (ppm) Tỉ lệ cây ra rễ Số rễ Số lá
Chất điều hòa sinh trưởng α-NAA (Xử lý 4 – 6 giây) 5% LSD α-NAA (Xử lý 5 phút)
5% LSD IAA (Xử lý 30 phút)
5% LSD IBA (Xử lý 30 phút)
5% LSD 0 (ngâm nước) 500 1500 2500 3500 0 (ngâm nước) 10 20 30 40 0 (ngâm nước) 50 70 90 120 0 (ngâm nước) 500 1000 2000 3000 1,39 ± 0,09e 1,66 ± 0,07d 1,83 ± 0,08c 2,36 ± 0,06a 1,99 ± 0,06b 0,10 1,37 ± 0,09d 1,69 ± 0,07c 1,97 ± 0,06a 1,91 ± 0,07ab 1,8 ± 0,09b 0,12 1,38 ± 0,05d 1,58 ± 0,07c 1,48 ± 0,05c 1,98 ± 0,07a 1,82 ± 0,06b 0,14 1,36 ± 0,09c 1,42 ± 0,07c 2,38 ± 0,06a 2,07 ± 0,06b 1,97 ± 0,07b 0,11 1,57 ± 0,07e 1,97 ± 0,08d 2,12 ± 0,09c 2,59 ± 0,06a 2,34 ± 0,08b 0,06 1,58 ± 0,07c 2,04 ± 0,08c 2,33 ± 0,07a 2,29 ± 0,08a 2,19 ± 0,08b 0,09 1,57 ± 0,07d 1,96 ± 0,08c 1,92 ± 0,09c 2,38 ± 0,06a 2,14 ± 0,08b 0,05 1,58 ± 0,08e 1,64 ± 0,08d 2,61 ± 0,06a 2,43 ± 0,07b 2,18 ± 0,09c 0,09 (%) 31,11d 57,78c 70,00b 83,33a 61,11c 5,61 30,00d 57,78c 80,00a 67,78b 62,22c 4,99 32,22e 51,11d 71,11b 81,11a 63,33c 7,34 31,11d 57,78c 84,44a 67,78b 62,22bc 7,98
Chú ý: Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau sai khác có ý nghĩa thống kê qua
kiểm định LSD với P < 0,05.
Kết quả nghiên cứu tại Lào Cai cho thấy Thạch tùng răng cưa là cây dễ dàng
sinh trưởng trong môi trường đất rừng, nên ở công thức không xử lý chất điều hòa
77
sinh trưởng cũng cho kết quả ra rễ và tạo lá mới. Tuy nhiên, khi sử dụng chất điều
hòa sinh trưởng thì tỉ lệ cây ra rễ, số rễ và số lá mới tăng lên ở mức sai khác có ý
nghĩa thống kê.
Đối với thí nghiệm xử lý bằng α - NAA nồng độ cao, thời gian 4 - 6 giây, kết
quả cho thấy tỉ lệ cây ra rễ, số rễ và số lá mới đạt giá trị cao nhất khi sử dụng
α-NAA ở nồng độ cao 2500 ppm (với tỉ lệ cây ra rễ đạt 83,33%, số rễ trung bình
2,36 rễ và số lá 2,59 lá). Trong khi đó, đối với lô thí nghiệm xử lý bằng α-NAA
nồng độ thấp với thời gian 5 phút cho hiệu quả kích thích tạo rễ và tạo lá mới cao
nhất (tỉ lệ cây ra rễ đạt 80%, 1,97 rễ và 2,33 lá) ở nồng độ 20 ppm.
Khi xử lý với IBA ở nồng độ 1000 ppm, hom thân giâm có tỉ lệ ra rễ đạt
84,44%, số rễ 2,38 và số lá 2,61 cao hơn so với các nồng độ IBA khác ở mức sai
khác có ý nghĩa thống kê 95%. Khi tăng nồng độ lên đến 2000 ppm thì tỉ lệ cây ra rễ
(67,78%), số rễ (2,07) và số lá (2,43) lại giảm đi. Như vậy, đối với lô sử dụng IBA
thì xử lý hom thân bằng IBA 1000 ppm trong vòng 30 phút trước khi giâm là phù
hợp nhất.
Thí nghiệm xử lý hom thân Thạch tùng răng cưa bằng IAA cho thấy khả
năng sinh trưởng của cây con Thạch tùng răng cưa tăng lên đáng kể so với lô thí
nghiệm không xử lý chất điều hòa sinh trưởng. Đặc biệt, khi xử lý với IAA ở nồng
độ 90 ppm trong thời gian 30 phút thì tỉ lệ cây ra rễ (81,11%), số rễ (1,98) và số lá
mới (2,38) đạt giá trị cao nhất so với các nồng độ IAA còn lại.
iiii. So sánh ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng α - NAA, IAA và IBA
Sau khi khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng α - NAA, IAA
và IBA đến sự sinh trưởng của hom thân Thạch tùng răng cưa ở cả hai địa điểm
nghiên cứu là Lâm Đồng và Lào Cai, nghiên cứu đã xác định được nồng độ và thời
gian xử lý tốt nhất của từng chất điều hòa sinh trưởng. Cụ thể, α - NAA sử dụng ở
nồng độ cao 2500 ppm xử lý trong thời gian 4 - 6 giây hoặc sử dụng ở nồng độ thấp
20 ppm trong vòng 5 phút; IAA xử lý ở nồng độ 90 ppm trong vòng 30 phút và IBA
được sử dụng ở nồng độ 1000 ppm trong thời gian 30 phút. Tiếp theo, nhằm lựa
chọn chất điều hòa sinh trưởng thích hợp nhất (trong số các chất điều hoà sinh
trưởng đã được xác định ở trên) đối với nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng hình
thức giâm hom thân, chúng tôi tiến hành thí nghiệm so sánh ảnh hưởng của các chất
78
điều hoà sinh trưởng trên đến sự phát triển của hom thân Thạch tùng răng cưa. Sau
4 tháng giâm hom thân, kết quả so sánh được thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. So sánh hiệu quả của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát
triển của hom thân Thạch tùng răng cưa ở hai vùng nghiên cứu.
Số rễ Số lá mới
Thời gian xử lý
Lâm Đồng
2,86a ± 0,07 2,80a ± 0,08 2,07b ± 0,10 2,33b ± 0,10 2,04b ± 0,09 2,44b ± 0,11 2,81a ± 0,10 2,73a ± 0,10
5 phút 30 phút 30 phút 0,13 0,07
Lào Cai
Chất điều hòa sinh trưởng α - NAA α - NAA IAA IBA 5% LSD α - NAA α - NAA IAA IBA 5% LSD Nồng độ (ppm) 2500 20 90 1000 2500 20 90 1000 Tỉ lệ cây ra rễ (%) 4 - 6 giây 87,78a 81,11b 83,33a 88,89a 6,56 4 - 6 giây 84,44a 81,11b 82,22b 85,56a 2,22 5 phút 30 phút 30 phút 2,38a ± 0,07 2,58a ± 0,06 1,96b ± 0,07 2,35b ± 0,07 1,97b ± 0,07 2,37b ± 0,06 2,64a ± 0,06 2,38a ± 0,06 0,07 0,03
Chú ý: Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau sai khác có ý nghĩa thống kê qua kiểm định LSD với P < 0,05.
Tại Lâm Đồng, kết quả nghiên cứu cho thấy sử dụng α - NAA ở nồng độ cao
2500 ppm trong thời gian 4 - 6 giây hoặc IBA 1000 ppm trong thời gian 30 phút cho
hiệu quả kích thích sự tạo rễ và tạo lá của hom thân Thạch tùng răng cưa cao nhất
so với hai chất điều hòa sinh trưởng còn lại (tỉ lệ ra rễ 87,78%, 2,86 rễ và 2,80 lá
mới đối với α - NAA; tỉ lệ ra rễ 88,89%, 2,81 rễ và 2,73 lá mới đối với IBA). Đồng
thời, hiệu quả kích thích tạo lá và tạo rễ của α - NAA 2500 ppm và IBA 1000 ppm
sai khác không có ý nghĩa thống kê (Bảng 3.10). Do đó, chúng tôi đưa ra kết luận sử
dụng α - NAA 2500 ppm (4 - 6 giây) hoặc IBA 1000 ppm (30 phút) để xử lý hom
thân trước khi trồng là thích hợp nhất đối với nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng
hình thức giâm hom thân tại Lâm Đồng.
Kết quả nghiên cứu tại Lào Cai cho thấy sử dụng α - NAA ở nồng độ 2500
ppm (xử lý trong 4 - 6 giây) hoặc IBA nồng độ 1000 ppm (xử lý trong 30 phút) có
hiệu quả tác động như nhau và là hai chất tốt nhất trong số các chất điều hòa sinh
trưởng sử dụng để kích thích sự tạo rễ (tỉ lệ ra rễ 84,44% và 85,56%; số rễ 2,38 rễ
và 2,58 rễ) và tạo lá mới (2,38 và 2,64 lá mới) đối với giâm hom thân Thạch tùng
răng cưa tại Lào Cai. Kết quả nghiên cứu này hoàn toàn tương đồng với kết quả
nghiên cứu tại Lâm Đồng. Do đó, chúng tôi đưa ra kết luận trong nghiên cứu giâm
79
hom thân Thạch tùng răng cưa tại Lâm Đồng và Lào Cai cần xử lý hom thân bằng α
- NAA nồng độ 2500 ppm trong thời gian 4 - 6 giây hoặc IBA 1000 ppm trong vòng
30 phút trước khi trồng để kích thích sự phát triển của cây con Thạch tùng răng cưa.
Các nghiên cứu trước đây của Zhang và cộng sự (2009), Qin và cộng sự
(2010) đã chỉ ra rằng IBA là chất điều hòa sinh trưởng có hiệu quả nhất trong giâm
hom thân Thạch tùng răng cưa. Ngoài ra, nghiên cứu của Long và cộng sự (2014)
đã cho thấy sử dụng α - NAA nồng độ thấp (20 ppm, thời gian xử lý 5 phút) là thích
hợp nhất cho nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng hình thức giâm hom thân [118,
119, 120]. Do đó, việc lựa chọn chất điều hòa sinh trưởng α - NAA nồng độ 2500
ppm (thời gian xử lý 4 - 6 giây) trong nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng hình
thức giâm hom thân là một điểm khác so với các nghiên cứu trước đây trên thế giới.
Kết quả nghiên cứu này là một điểm mới trong nhân giống Thạch tùng răng cưa
bằng hình thức giâm hom thân tại Việt Nam, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn
gen quý này ở nước ta.
3.2.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ sâu hom thân giâm
Trong quá trình nghiên cứu nhân giống bằng giâm hom thân Thạch tùng răng
cưa, chúng tôi cũng nhận thấy bên cạnh việc sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thì
độ sâu hom thân giâm xuống đất cũng có ảnh hưởng đến sinh trưởng cây con Thạch
tùng răng cưa. Vì vậy, chúng tôi sử dụng hom thân dài 6 cm, xử lý bằng cách nhúng
sốc với α - NAA 2500 ppm (4 - 6 giây), giâm trên giá thể CT2 với độ sâu hom thân
giâm là 2 cm, 2,50 cm, 3 cm, 3,50 cm và 4 cm. Sau 4 tháng nghiên cứu, kết quả
nhân giống tại hai vùng Lâm Đồng và Lào Cai được thể hiện ở bảng 3.11.
Kết quả nghiên cứu tại Lâm Đồng cho thấy, độ sâu hom thân khi giâm xuống
giá thể từ 3 cm trở lên thì hom thân có tỷ lệ ra rễ nhiều hơn so với độ sâu hom thân
khi giâm xuống là 2 cm và 2,50 cm. Ở độ sâu hom thân khi giâm xuống giá thể là
3,50 cm thì tỉ lệ cây ra lá mới (91,11%) cao hơn hẳn so với độ sâu hom thân giâm 3
cm (85,56%). Thêm vào đó, mặc dù, độ sâu hom thân giâm xuống giá thể là 3,50
cm và 4 cm cho tỉ lệ cây con ra lá mới sai khác nhau không có ý nghĩa thống kê
nhưng tỉ lệ ra rễ ở độ sâu hom thân giâm 3,50 cm (90%) lại cao hơn so với độ sâu
hom thân giâm 4 cm (85,56%) ở mức sai số có ý nghĩa (Bảng 3.11). Vì vậy, để tăng
hiệu quả ra rễ nhằm thúc đẩy cây con sinh trưởng, đồng thời tiết kiệm nguyên liệu
80
sử dụng, chúng tôi lựa chọn độ sâu hom thân giâm xuống đất là 3,50 cm.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của độ sâu hom thân giâm đến sinh trưởng cây con Thạch
tùng răng cưa tại Lâm Đồng và Lào Cai sau 4 tháng.
Lâm Đồng (Hom thân dài 6 cm, xử lý α – NAA 2500 ppm (4-6 giây) hoặc IBA 1000 ppm (30 phút), giâm trên giá thể CT2
Lào Cai (Hom thân dài 6 cm, xử lý α – NAA 2500 ppm (4-6 giây) hoặc IBA 1000 ppm (30 phút), giâm trên giá thể CT2
Độ sâu hom thân giâm (cm) 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 5% LSD 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 5% LSD Tỉ lệ cây ra rễ (%) 65,56e 71,11d 78,89c 90,00a 85,56b 3,53 62,22d 67,78c 75,56b 86,67a 77,78b 4,13 Tỉ lệ cây con có lá mới (%) 82,22bc 81,11c 85,56bc 91,11a 88,89ab 5,06 81,11c 80,00c 83,33bc 90,00a 87,78ab 6,43
Chú ý: Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau sai khác có ý nghĩa thống kê qua kiểm định LSD với P < 0,05.
Kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của độ sâu hom thân giâm xuống giá thể
đến sinh trưởng của cây con Thạch tùng răng cưa tại Lào Cai cũng cho kết quả
tương tự như tại Lâm Đồng. Nghiên cứu cho thấy sự sinh trưởng của hom thân
Thạch tùng răng cưa tốt nhất khi sử dụng độ sâu hom thân giâm xuống giá thể là
3,50 cm với số cây con tạo rễ đạt 86,67% và số cây con có lá mới đạt 90% sau 4
tháng nuôi trồng (Bảng 3.11).
Từ các kết quả trên, chúng tôi đưa ra các điều kiện thích hợp cho quá trình
nhân giống cây Thạch tùng răng cưa bằng hình thức giâm hom thân như sau: Sử
dụng hom thân có chiều dài 6 cm, cắt vát đầu dưới. Sau đó, hom thân được xử lý
bằng cách nhúng sốc vào dung dịch chất điều hòa sinh trưởng α - NAA 2500 ppm
trong thời gian 4 - 6 giây hoặc ngâm trong dung dịch IBA 1000 ppm trong thời gian
30 phút. Hom thân sau khi được xử lý với chất điều hòa sinh trưởng được giâm vào
bầu đất với giá thể CT2 (hỗn hợp giá thể đất rừng trộn phân chuồng hoai mục và
trấu hun với tỉ lệ 3:1:1), khi đưa vào bầu, giâm hom thân xuống độ sâu 3,50 cm so
với gốc hom thân. Bầu ươm cây con Thạch tùng răng cưa được chăm sóc và theo
dõi tại vườn ươm đều cho thấy khả năng sinh trưởng của cây con tốt (Hình 3.19).
81
Hình 3.19. Cây con Thạch tùng răng cưa trong vườn ươm.
Kết quả so sánh hiệu quả giâm hom thân cây Thạch tùng răng cưa với các
yếu tố khảo sát (chiều dài hom thân, giá thể giâm hom thân, chất điều hòa sinh
trưởng và độ sâu hom thân giâm) tại hai vùng Lào Cai và Lâm Đồng được thể hiện
ở bảng 3.12.
Bảng 3.12. So sánh hiệu quả giâm hom thân Thạch tùng răng cưa tại Lào Cai và
Lâm Đồng sau 4 tháng.
Các chỉ tiêu Lào Cai
Chiều dài hom thân (6 cm) (Giá thể đất rừng) Tỉ lệ hồi xanh (%) Tỉ lệ cây ra rễ (%)
Tỉ lệ hồi xanh (%) Tỉ lệ cây ra rễ (%)
Tỉ lệ cây ra rễ (%) Số rễ P (T<=t) 0,02 0,01 0,001 0,43 0,61 0,40 0,07 0,003
Giá thể giâm hom thân (CT2) (Chiều dài hom giâm 6cm) Chất điều hòa sinh trưởng (2500 ppm α – NAA) (Chiều dài hom thân 6 cm, giá thể CT2) Số lá mới 0,002
Lâm Đồng 86,39b 88,33a 26,42a 23,47b 78,29a Tỉ lệ cây có lá mới (%) 68,49b 87,22a 88,89a 30,33a 29,07a 85,42a Tỉ lệ cây có lá mới (%) 83,44a 88,89a 83,33b 2,84a 2,36b ± 0,08 ± 0,06 2,78a 2,59b ± 0,06 ± 0,06 87,78a 84,44a Tỉ lệ cây ra rễ (%) 0,25
Số rễ 0,001
Chất điều hòa sinh trưởng 1000 ppm IBA (Chiều dài hom thân 6 cm, giá thể CT2) Số lá mới 0,06
2,83a 2,38b ± 0,09 ± 0,09 2,72a 2,61a ± 0,06 ± 0,07 86,67a 90,00a 0,16 Tỉ lệ cây ra rễ (%)
Chú ý: Trong cùng một hàng, các chữ cái khác nhau, sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong T - test.
90,00a 91,11a 0,64 Tỉ lệ cây có lá mới (%) Độ sâu hom giâm (3,5 cm) ((Chiều dài hom thân 6 cm, giá thể CT2, xử lý α - NAA 2500 ppm)
Số liệu thống kê ở bảng 3.12 cho thấy với cùng yếu tố thí nghiệm thích hợp
82
nhất cho nhân giống Thạch tùng răng cưa là: chiều dài hom thân 6 cm, giá thể giâm
CT2 (3 đất rừng : 1 phân chuồng hoai mục : 1 trấu hun), xử lý chất điều hòa sinh
trưởng α - NAA 2500 ppm (4 - 6 giây) hoặc IBA 1000 ppm (30 phút) thì các chỉ tiêu
sinh trưởng của cây con Thạch tùng răng cưa tại Lâm Đồng phần lớn đều cao hơn
so với ở Lào Cai. Điều này có thể giải thích là do các yếu tố sinh thái ở Lâm Đồng
thuận lợi hơn so với ở Lào Cai. Cụ thể, Lâm Đồng nằm trong khu vực chịu ảnh
hưởng của khí hậu nhiệt đới gió mùa biến thiên theo độ cao. Nhiệt độ trung bình
năm của tỉnh giao động 18 - 25°C. Lượng mưa trung bình 1.750 - 3.150 mm/ năm.
Độ ẩm tương đối trung bình cả năm 85 - 87%, các tháng mùa mưa độ ẩm 84 - 91%,
các tháng mùa khô độ ẩm 69 - 82%. Giờ nắng trung bình cả năm 1.890 - 2.500 giờ
[8]. Trong khi đó, số liệu từ năm 1977 đến 2010 do viện khoa học khí tượng thủy
văn cung cấp về khí hậu tại khu vực Hoàng Liên Sơn (Lào Cai) cho thấy, nền nhiệt
cao vào mùa hè, thấp vào mùa đông, biên độ dao động ngày đêm của nhiệt độ lớn.
Nhiệt độ trung bình hàng năm là 12,6°C, lượng mưa trung bình hàng năm 1400 -
2800 mm, chế độ ẩm trung bình 80 - 90%. Bên cạnh đó, tại khu vực này có sương
muối xuất hiện từ tháng 11 đến tháng 2, sương mù xuất hiện từ tháng 10 đến tháng
3, mưa đá xảy ra nhiều nhất vào tháng 2, tháng 3 và tháng 4, có khoảng 70 - 100
ngày giông, băng tuyết xuất hiện tại vùng núi cao vào mùa đông. Băng tuyết cùng
với sương muối có tác hại nghiêm trọng đối với cây trồng, đây được xem là những
yếu tố bất lợi cho loài Thạch tùng răng cưa phát triển [135].
Theo nghiên cứu của Wang và cộng sự (2008), Thạch tùng răng cưa phát
triển tốt trong điều kiện môi trường như sau: nhiệt độ dao động từ 18,9°C đến
26,3°C, độ ẩm tương đối trong phạm vi 81% - 90% và cường độ chiếu sáng trong
khoảng từ 1330 - 3000 lx [113]. Như vậy, điều kiện khí hậu ở Lâm Đồng thích hợp
cho sự phát triển của Thạch tùng răng cưa hơn so với ở Lào Cai. Do đó, nhân giống
Thạch tùng răng cưa bằng hình thức giâm hom thân tại Lâm Đồng cho kết quả cây
con sinh trưởng và phát triển tốt hơn so với nhân giống tại Lào Cai là hoàn toàn phù
hợp. Để bảo tồn và phát triển nguồn gen Thạch tùng răng cưa ở nước ta, cần xây
dựng mô hình nhân giống ở cả hai vùng Lâm Đồng và Lào Cai, tuy nhiên, các điều
kiện nhân giống thuận lợi hơn tại Lâm Đồng là một trong những điểm đáng lưu ý
đối với việc lựa chọn địa điểm quy hoạch và xây dựng mô hình nhân giống Thạch
tùng răng cưa với quy mô lớn ở Việt Nam.
83
3.2.1.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ bón phân
Sau 3 tháng giâm hom thân Thạch tùng răng cưa với những điều kiện thích
hợp nhất như đã khảo sát ở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu chế độ bón phân
cho cây con. Theo dõi sự phát triển của cây con sau 2 tháng bón phân tại Lâm Đồng,
kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.13.
Bảng 3.13. Sự sinh trưởng của cây con sau 2 tháng bón phân tại Lâm Đồng.
Công thức Liều lượng Tỉ lệ cây sống (%)
91,67c Đường kính thân (cm) 0,17e Chiều cao cây con (cm) 3,47c
200 kg/ 1 ha 95,83ab 0,20b 3,75b
Thời gian bón Sáng sớm, 3 tháng sau giâm hom
Đối chứng (không bón) Phân vi sinh Sông Gianh Phân chuồng (phân bò) Phân NPK 3 màu Phân xanh 5% LSD 500 kg/ 1 ha 200 kg/ 1 ha 500 kg/ 1 ha 98,61a 92,78bc 92,22bc 3,76 0,22a 0,19c 0,18d 0,01 3,88a 3,75b 3,73b 0,06
Chú ý: Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau sai khác có ý nghĩa thống kê qua kiểm định LSD với P < 0,05.
Kết quả bảng 3.13 cho thấy nếu không sử dụng phân bón, cây Thạch tùng
răng cưa phát triển rất chậm, chiều cao cây con sau 5 tháng theo dõi chỉ tăng
khoảng 1 cm so với lúc bắt đầu giâm (2,50 cm). Khi sử dụng phân bón để bón thúc
cho cây con, chúng tôi quan sát thấy ở tất cả các lô thí nghiệm sử dụng phân bón, sự
sinh trưởng của cây con tốt hơn hẳn so với lô đối chứng (bảng 3.13). Điều này cho
thấy, trong quá trình nuôi trồng và chăm sóc Thạch tùng răng cưa việc cung cấp
chất dinh dưỡng đóng vai trò quan trọng đối với sự phát triển của cây con. Đặc biệt,
khi bón phân chuồng (phân bò) thì tỉ lệ sống sót của cây con lên đến 98,61% với
đường kính thân (0,22 cm) và chiều cao cây con (3,88 cm) đạt giá trị cao nhất so
với các loại phân bón còn lại ở mức sai khác có ý nghĩa thống kê 95%. Điều đó cho
thấy, việc bón phân chuồng (phân bò) có tác dụng thúc đẩy sự sống sót và phát triển
của cây con Thạch tùng răng cưa. Chính vì thế, trong nghiên cứu về nhân giống loài
Thạch tùng răng cưa, phân chuồng (phân bò) được sử dụng để bón thúc cho cây con
sau 3 tháng giâm hom thân.
Sau khi giâm hom thân với các điều kiện thích hợp nhất như đã khảo sát ở
trên và bón thúc cho cây con bằng phân chuồng (phân bò), chúng tôi theo dõi sự
84
tăng trưởng của cây con Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng, 5 tháng, 6 tháng, 7 tháng,
8 tháng giâm hom thân (Bảng 3.14).
Bảng 3.14. Sự tăng trưởng của cây con trong bầu ươm ở các thời gian khác nhau.
Đường kính thân (cm) Số lá mới trên cây
Chiều cao cây con (cm) Lớn nhất 3,85 Nhỏ nhất 2,65 Lớn nhất 0,23 Nhỏ nhất 0,17 con (lá) Lớn nhất 3 Nhỏ nhất 2 Thời gian sau giâm hom 4 tháng
4,04 3,70 0,25 0,19 6 3 5 tháng Trung bình 2,50e ± 0,50 4,17d ± 0,85 6 3,90 0,25 0,19 8 5 6 tháng
6,40 4,20 0,25 0,19 9 6 7 tháng
6,80 4,35 0,26 0,20 11 7 8 tháng
Trung bình 3,73e ± 0,01 3,88d ± 0,08 4,96c ± 0,60 5,17b ± 0,63 5,39a ± 0,67 0,02 Trung bình 0,20c ± 0,01 0,22b ± 0,02 0,23a ± 0,02 0,23a ± 0,02 0,23a ± 0,02 0,001 6,22c ± 0,86 7,42b ± 0,79 8,73a ± 0,91 0,05
5% LSD Chú ý: Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau sai khác có ý nghĩa thống kê qua kiểm định LSD với P < 0,05.
Kết quả nghiên cứu sự sinh trưởng của cây con bầu ươm sau giâm hom 4
tháng đến 8 tháng cho thấy chiều cao và đường kính thân của cây con Thạch tùng
răng cưa sinh trưởng rất chậm, sau 8 tháng giâm hom thân, cây con đạt giá trị cao
nhất là 6,80 cm, với chiều cao trung bình là 5,39 cm; như vậy, so với chiều cao lúc
bắt đầu giâm (2,50 cm) thì sau 8 tháng chiều cao cây con tăng trung bình 2,89 cm
tính từ mặt bầu ươm. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Zeng và cộng sự
(2008), trong nghiên cứu các tác giả đã chỉ ra rằng Thạch tùng răng cưa phát triển
chiều cao rất chậm, trong 2 năm cây phát triển từ mầm chỉ tăng thêm khoảng 6 cm
[114]. Đối với sự hình thành lá mới, sau khi giâm hom thân khoảng 4 tháng, kết quả
cho thấy mỗi tháng cây Thạch tùng răng cưa đều có sự hình thành thêm từ 2 - 3 lá
mới (Bảng 3.14).
3.2.1.6. Nghiên cứu thời điểm ra cây đối với loài Thạch tùng răng cưa
Sau một thời gian nghiên cứu và theo dõi cây con bầu ươm, chúng tôi tiến
hành nghiên cứu thời gian ra ngôi cây con sau 4 tháng, 5 tháng, 6 tháng, 7 tháng và
8 tháng giâm hom thân nhằm tìm ra thời gian chuyển cây ra vườn giống đạt giá trị
cao nhất. Kết quả nghiên cứu sau 1 tháng chuyển cây từ bầu ươm ở các tháng khác
nhau ra vườn giống được thể hiện ở bảng 3.15.
85
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của thời gian ra ngôi đến sinh trưởng cây con Thạch tùng răng cưa.
Thời gian ra ngôi Tỷ lệ cây con héo và chết (%) Tỉ lệ cây con hồi xanh (%) 4 tháng sau giâm 5 tháng sau giâm 6 tháng sau giâm 7 tháng sau giâm 8 tháng sau giâm 5% LSD 73,33a 81,11b 97,78c 87,78d 76,67e 2,81 26,67a 18,89b 2,22c 12,22d 23,33e 2,81
Chú ý: Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau sai khác có ý nghĩa thống kê qua kiểm định LSD với P < 0,05.
Chúng tôi nhận thấy, khi ra cây ở thời điểm 4 tháng hoặc sau 8 tháng giâm
hom thân thì tỉ lệ cây con chết nhiều nhất, lên đến 26,67% và 23,33% tương ứng;
đồng thời, tỉ lệ cây con hồi xanh thấp nhất so với các thời điểm ra cây khác. Điều
này có thể giải thích do ở thời điểm ra cây sau 4 tháng giâm hom thân, cây con mới
chỉ đạt chiều cao khoảng 2,65 - 3,85 cm và đường kính thân dao động 0,17 - 0,23
cm, cây còn non và yếu nên khi chuyển ra ngoài vườn ươm thì sức chống chịu của
cây với khí hậu bên ngoài kém và khả năng phát triển thấp; bên cạnh đó, nếu ra cây
ở thời điểm muộn sau 7, 8 tháng giâm hom thì cây con vườn ươm đã già, do đó khi
chuyển sang một môi trường sống mới thì khả năng thích ứng của cây con gặp khó
khăn. Mặt khác, theo kết quả bảng 3.15 thì ở thời điểm ra cây sau 6 tháng giâm hom,
tỉ lệ cây con chết thấp nhất (2,22%) và tỉ lệ hồi xanh đạt giá trị cao nhất (97,78%) so
với các thời điểm ra cây khác ở mức sai khác có ý nghĩa thống kê. Hơn nữa, thời
điểm ra cây sau 6 tháng giâm hom thì cây con đã đạt chiều cao 4 - 6 cm; đường kính
thân 0,19 - 0,25 cm, đã có thêm 5 - 8 lá mới, cây con khỏe mạnh nên khả năng thích
ứng khi chuyển ra vườn ươm cao. Do đó, chúng tôi lựa chọn thời điểm ra ngôi cây
con Thạch tùng răng cưa là 6 tháng sau giâm hom thân.
Hình 3.20. Cây Thạch tùng răng cưa ngoài vườn ươm tại Lâm Đồng.
86
Từ các kết quả nghiên cứu nhân giống cây Thạch tùng răng cưa bằng giâm
hom thân, chúng tôi đưa ra 1 số khâu cơ bản trong quy trình nhân giống như hình
3.21.
1. Thu thập nguồn vật liệu
2. Đánh giá nguồn vật liệu bằng phương pháp quan sát hình thái, vi phẫu và hóa sinh học.
3. Tách hom thân từ các cây giống gốc đã chọn lọc và xử lý làm vật liệu cho nhân giống
4. Đưa hom thân vào bầu đất
5. Chăm sóc cây con
6. Kiểm tra cây con trước khi xuất vườn
Hình 3.21. Sơ đồ một số khâu cơ bản trong quy trình nhân giống Thạch tùng răng
cưa bằng giâm hom thân.
Bước 1. Thu thập nguồn vật liệu:
Cây Thạch tùng răng cưa được thu vào buổi sáng tại rừng ở vùng Lâm Đồng
(độ cao 900 - 2300 m) và Lào Cai (độ cao 1500 - 1800m ). Chọn các cây khỏe mạnh,
kích thước đồng đều, không bị sâu bệnh, cây đã phân nhánh. Mẫu cây có đủ thân, lá,
rễ được bảo quản trong túi ni lông, bên ngoài túi ghi rõ thời gian lấy mẫu, người lấy
mẫu, địa điểm lấy mẫu.
Bước 2. Đánh giá nguồn vật liệu: Đánh giá tính đúng giống của cây Thạch
tùng răng cưa sử dụng các phương pháp sau:
Phương pháp so sánh hình thái đặc điểm hình thái của cây Thạch tùng răng
cưa đã được mô tả bởi Võ Văn chi (2012) và Nông Văn Duy (2016).
Phương pháp vi phẫu: vi phẫu thân Thạch tùng răng cưa cho thấy thân cây có
87
dạng tròn, từ ngoài vào trong gồm các lớp: Lớp cutin ở ngoài cùng, tiếp đến là lớp
biểu bì, lớp mô cứng, lớp mô mềm và bó libe - gỗ ở trung tâm. Vi phẫu lá Thạch
tùng răng cưa cho thấy lá có biểu bì trên và dưới hơi lồi, từ ngoài vào trong gồm các
lớp: Lớp ngoài phủ cutin, tiếp đến là lớp biểu bì, lớp mô mềm và ở giữa là bó gỗ.
Phương pháp hoá sinh: Hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cưa là
HupA được xác định hàm lượng bằng phương pháp HPLC.
Bước 3. Tách hom thân từ các cây giống gốc đã chọn lọc và xử lý để làm
vật liệu cho nhân giống
Các hom thân được cắt có chiều dài 6 cm, cắt vát đầu dưới. Sau đó, hom thân
được xử lý bằng cách nhúng sốc vào dung dịch α - NAA nồng độ 2500 ppm trong
thời gian 4 - 6 giây hoặc ngâm trong IBA 1000 ppm trong thời gian 30 phút.
Bước 4. Đưa hom thân vào bầu đất
Chọn bầu ươm có kích thước 8 x 10 cm hoặc 8 x 12 cm. Giá thể ươm gồm
hỗn hợp: đất rừng + phân chuồng hoai mục + trấu hun tỉ lệ: 3:1:1. Trước khi trồng,
cần làm đất trước 1 tháng như phơi nắng để diệt trừ mầm bệnh, trừ dế, giun…
Sau khi xử lý hom giâm như ở bước 3, giâm ngay hom thân Thạch tùng răng
cưa vào bầu đất, độ sâu hom thân giâm xuống đất 3,50 cm. Sau đó, phun nước đủ
ẩm cho bầu cây. Sau khi giâm xong, phun thuốc trừ nấm, vi khuẩn bằng thuốc như
Kasuran hoặc Kasai.
Bước 5. Chăm sóc cây con
Trong 10 ngày đầu tiên thường xuyên phun ẩm cho cây 6 - 8 lần/ ngày và
huấn luyện ra môi trường tự nhiên bằng cách che phủ ni lông, che sáng cho bầu cây
bằng lưới che râm với độ che sáng 100%. Nếu về mùa mưa rào phải làm mái che
mưa. Sau 15 ngày bỏ dần lưới che râm để tỉ lệ che sáng 80%, giảm dần số lần tưới
nước trong một ngày và tăng lượng nước tưới trong một lần. Sau 3 tháng, tháo dần
lưới che râm, bón thúc cho cây con bằng phân chuồng (phân bò) với liều lượng 500
kg/ 1 ha.
Trong quá trình giâm, cây có thể xuất hiện một số bệnh gây thối cây. Sử
dụng thuốc Daconil 75 WP sản xuất tại Nhật Bản để phòng trừ một số bệnh ở cây
88
con.
Bước 6. Kiểm tra cây con trước khi xuất vườn
Sau thời gian giâm hom thân 6 tháng, cây con Thạch tùng răng cưa có chiều
cao từ 4 - 6 cm (tính từ mặt bầu đến ngọn cây), đường kính thân cách gốc 1 cm đạt
khoảng 0,19 - 0,25 cm, số lá mới trên chồi 5 - 8 lá, cây con sinh trưởng khỏe, không
mang mầm mống sâu, bệnh hại, không bị xây xát, gãy thân, dị hình sẽ đạt tiêu
chuẩn xuất vườn.
Như vậy, các điều kiện thích hợp cho nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng
hình thức giâm hom thân là sử dụng hom thân dài 6 cm, xử lý bằng dung dịch α -
NAA nồng độ 2500 ppm (4 - 6 giây) hoặc dung dịch IBA 1000 ppm (30 phút), giâm
vào giá thể chứa hỗn hợp: đất rừng : phân chuồng hoai mục : trấu hun với tỉ lệ 3:1:1,
độ sâu hom thân giâm xuống 3,5 cm. Sử dụng phân chuồng (phân bò) để bón thúc
cho cây con sau 3 tháng giâm hom thân với liều lượng 500 kg/1 ha. Cây con ra ngôi
sau 6 tháng giâm hom.
3.2.2. Nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng nuôi cấy mô
Nuôi cấy mô giúp nhân giống cây trồng với số lượng lớn, đảm bảo tính đồng
đều về mặt di truyền. Bên cạnh đó, giá trị về mặt y học và thương mại của cây
Thạch tùng răng cưa là nhờ hoạt chất HupA có tác dụng đối với việc điều trị các
bệnh liên quan đến trí nhớ. Chính vì vậy, nghiên cứu nhân giống bằng hình thức
nuôi cấy mô không những giúp bảo tồn và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng
răng cưa mà còn nhằm mục đích thu nhận được nhiều hoạt chất HupA phục vụ cho
y học. Các kết quả nghiên cứu trước cho thấy các mẫu DL1 (Bidoup, Núi Bà) có
chứa hàm lượng HupA cao hơn các mẫu nghiên cứu khác. Do đó, trong nghiên cứu
này, chúng tôi sử dụng mẫu DL1 làm nguyên liệu để tiến hành nhân giống vô tính
loài Thạch tùng răng cưa bằng phương pháp nuôi cấy mô. Sau đó, phương pháp
nuôi cấy mô này sẽ được mở rộng đối với nhân giống loài Thạch tùng răng cưa thu
ở các vùng khác nhau tại Lào Cai và Lâm Đồng.
Để xây dựng phương pháp nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng nuôi cấy
mô, đầu tiên phải đưa được cây vào nuôi cấy in vitro. Vì cây Thạch tùng răng cưa
sinh trưởng trên đất ẩm, lại có rất nhiều nấm nội sinh nên việc đưa cây vào nuôi cấy
89
in vitro gặp nhiều khó khăn. Thực tế, chúng tôi mất gần 2 năm để tìm ra được điều
kiện thích hợp cho việc khử trùng mẫu cấy; sau đó, nghiên cứu điều kiện tốt nhất
cho việc nhân chồi và tạo rễ.
3.2.2.1. Nhân giống in vitro Thạch tùng răng cưa bằng phương pháp nuôi cấy chồi
đỉnh
a. Ảnh hưởng của các chất khử trùng đến mẫu cấy
Mẫu Thạch tùng răng cưa được khử trùng theo các bước mô tả trong phần
vật liệu và phương pháp (mục 2.2.2.2). Để tìm ra phương pháp khử trùng thích hợp
nhất, chúng tôi sử dụng nồng độ HgCl2 từ 0,05% đến 0,15% ở các thời gian khác
nhau (3, 5 và 7 phút) để khử trùng mẫu cấy. Sau khi khử trùng, mẫu Thạch tùng
răng cưa được nuôi cấy trên môi trường MS. Kết quả thí nghiệm sau 30 ngày theo
dõi được trình bày ở bảng 3.16.
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của các chất khử trùng đến mẫu Thạch tùng răng cưa
sau 30 ngày nuôi cấy.
HgCl2 Nồng độ (%) Thời gian (phút)
C2H5OH 70 % 30 giây
NaClO 20% 7 phút
0,05 0,05 0,05 0,10 0,10 0,10 0,15 0,15 0,15 Tỉ lệ mẫu vô trùng (%) 4,44h 5,28g 8,89f 8,06f 13,61e 13,89d 16,39c 17,22b 25,56a 0,73 Tỉ lệ mẫu bật chồi (%) 66,22a 47,62b 40,30bc 48,52b 46,08b 31,99cd 27,11de 22,62de 18,46e 9,81 3 5 7 3 5 7 3 5 7
5% LSD Chú ý: Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau sai khác có ý nghĩa thống kê qua kiểm định LSD với P < 0,05.
Kết quả cho thấy ở các công thức thí nghiệm đã có sự khác biệt rõ rệt về tỉ lệ
mẫu vô trùng và tỉ lệ mẫu bật chồi. Khi tăng thời gian khử trùng từ 3 phút lên 5 phút
rồi đến 7 phút ở cả 3 nồng độ HgCl2 0,05%, 0,10% và 0,15% thì tỉ lệ mẫu sạch bệnh
tăng dần từ 4,44% (HgCl2 0,05%/ 3 phút) đến 25,56% (HgCl2 0,15%/ 7 phút) nhưng
tỉ lệ mẫu bật chồi lại giảm từ 66,22% xuống còn 18,46%. Điều này được giải thích
là do khi tăng nồng độ HgCl2 từ 0,05% lên 0,15% trong thời gian dài hơn đã làm
90
tăng hoạt tính diệt nấm và diệt khuẩn của HgCl2, dẫn tới mẫu sạch nấm, sạch khuẩn
nhiều hơn. Tuy nhiên, thời gian khử trùng kéo dài làm cho mẫu Thạch tùng răng cưa
bị ngộ độc chất khử trùng dẫn đến tỉ lệ mẫu bật chồi thấp. Do đó, nghiên cứu cho
thấy việc sử dụng chất khử trùng HgCl2 với thời gian dài sẽ ảnh hưởng không tốt
đến khả năng bật chồi của Thạch tùng răng cưa.
Hình 3.22. Mẫu Thạch tùng răng cưa sau 30 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trường
MS.
Với nồng độ HgCl2 0,05% xử lý trong thời gian 3 phút cho tỉ lệ mẫu sạch
thấp nhất chỉ đạt 4,44% nhưng tỉ lệ tạo chồi cao nhất đạt 66,22%. Trong khi đó, ở
nồng độ HgCl2 0,15% xử lý trong thời gian 7 phút cho tỉ lệ mẫu sạch bệnh cao nhất
đạt đến 25,56%, nhưng khả năng bật chồi của mẫu kém chỉ đạt 18,46%. Khi sử
dụng nồng độ HgCl2 0,10% trong 5 phút cho tỉ lệ mẫu sạch bệnh 13,61% và tỉ lệ
mẫu tạo chồi 46,08% là tương đối tốt so với các công thức thí nghiệm còn lại ở mức
sai khác có ý nghĩa thống kê. Như vậy, trong nghiên cứu này, sử dụng HgCl2 0,10%
trong 5 phút là thích hợp nhất cho việc khử trùng mẫu cấy Thạch tùng răng cưa.
Việc sử dụng HgCl2 trong quá trình khử trùng mẫu cấy Thạch tùng răng cưa đã
được các nhà khoa học khác trên thế giới sử dụng và cho thấy hiệu quả cao. Theo
nghiên cứu của Li và cộng sự (2009), phương pháp thích hợp để khử trùng bề mặt
đối với các túi bào tử và chồi đỉnh Thạch tùng răng cưa là ngâm các mẫu cấy bằng
C2H5OH 70% trong 30 giây, tiếp theo là HgCl2 0,10% trong 4 phút [112]. Yang và
cộng sự (2008) đã khử trùng chồi đỉnh Thạch tùng răng cưa bằng dung dịch
C2H5OH 70% trong 40 giây, HgCl2 0,10% trong 8 phút và sau đó là H2O2 70%
trong 10 phút cho kết quả tốt nhất [53]. Ngoài ra, Zhou và cộng sự (2009) lấy thân
và chồi đỉnh Thạch tùng răng cưa ngâm HgCl2 0,10% trong 3 phút cũng cho hiệu
quả khử trùng tốt nhất [113]. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn khử trùng mẫu Thạch tùng
răng cưa bằng dung dịch C2H5OH 70% trong thời gian 30 giây, HgCl2 0,10% trong
91
5 phút và cuối cùng bằng dung dịch NaClO 20% trong 7 phút. Các mẫu Thạch tùng
răng cưa vô trùng được chuyển vào nuôi cấy trên môi trường nền MS. Sau 30 ngày
nuôi cấy, các mẫu cấy cho tỉ lệ bật chồi cao, thân xanh, lá phát triển tốt (Hình 3.22).
b. Ảnh hưởng của các môi trường khoáng đến nuôi cấy Thạch tùng răng cưa
Chồi Thạch tùng răng cưa in vitro được đem thử nghiệm trên 6 môi trường
nuôi cấy khác nhau gồm: MS, 1/2 MS, 1/4 MS, 1/6 MS, WPM, B5 có bổ sung 20
g/l đường, 8 g/l agar, pH 5,7- 5,8, không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật,
nhằm xác định môi trường khoáng cơ bản thích hợp với sự sinh trưởng, phát triển
đối với cây Thạch tùng răng cưa.
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến nuôi cấy chồi Thạch tùng răng
cưa sau 60 ngày nuôi cấy.
Kích thước lá Đặc điểm chồi
Môi trường nuôi cấy Số lá (lá) Chiều cao chồi (cm) Dài (cm) Rộng (cm)
0,75c 0,86b 0,94a 0,73d 0,20c 0,23b 0,24a 0,19d Phát triển chậm và nhiều chồi dị dạng, thân và lá có màu xanh vàng, lá quăn. phát triển ở mức trung bình, thân xanh, lá xanh. Phát triển tốt, thân mập và khỏe, lá xanh đậm Phát triển chậm, nhiều chồi dị dạng, thân và lá có màu xanh vàng, lá quăn.
MS 1/2MS 1/4MS 1/6MS WPM 1,70d 1,94b 2,19a 1,78c 1,54f
B5 1,57e 4,67b 6,33a 7,33a 5,00b 2,33c 0,64f 0,18d Không phát triển, lá vàng và chết. 2,67c 0,69e 0,18d Không phát triển, lá vàng và chết.
5% LSD 0,01 1,03 0,01 0,01
Chú ý: Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau sai khác có ý nghĩa thống kê qua kiểm định LSD với P < 0,05.
Sau 60 ngày nuôi cấy trên các môi trường khác nhau, kết quả cho thấy trên 2
môi trường WPM và B5 chồi không phát triển cả về chiều cao và kích thước lá.
Trong khi đó, trên môi trường MS, 1/2 MS, 1/4 MS, 1/6 MS, chồi cây Thạch tùng
răng cưa có sự sinh trưởng và phát triển được thể hiện qua các chỉ tiêu: chiều cao
chồi, số lá, kích thước lá, đặc điểm chồi. Trong đó, môi trường thích hợp nhất cho
sự phát triển Thạch tùng răng cưa là môi trường ¼ MS với các đặc điểm sinh trưởng
92
của chồi cao hơn hẳn các môi trường khác ở mức sai khác có ý nghĩa thống kê như:
chiều cao chồi (2,19 cm), số lá (7,33 lá), kích thước lá (dài 0,94 cm, rộng 0,24 cm),
chất lượng chồi tốt, mập, lá xanh đậm, trung bình 30 ngày chồi Thạch tùng răng cưa
xuất hiện từ 3 đến 4 lá mới, chiều cao trung bình mỗi tháng tăng từ 3 mm đến 4 mm
(Bảng 3.17). Vì vậy, môi trường 1/4 MS được lựa chọn làm môi trường cơ bản cho
nghiên cứu nhân nhanh chồi in vitro cây Thạch tùng răng cưa (Hình 3.23). Môi
trường ¼ MS cũng được Yang và cộng sự (2008) sử dụng để nuôi cấy chồi đỉnh loài
Thạch tùng răng cưa và chỉ ra đây là môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và tạo
rễ của mẫu cấy [46]. Do đó, chúng tôi lựa chọn môi trường 1/4 MS cho các nghiên
cứu tiếp theo.
B. A.
Hình 3.23. Chồi Thạch tùng răng cưa nuôi cấy trên môi trường ¼ MS.
A. Sau 60 ngày nuôi cấy, B. Sau 90 ngày nuôi cấy.
c. Ảnh hưởng của BA hoặc kinetin đến tạo cụm chồi Thạch tùng răng cưa
Theo nghiên cứu của Zhou và cộng sự (2009), các chất điều hòa sinh trưởng
như BA, kinetin, BAP, IBA… có hiệu quả đến sự tạo chồi và tạo rễ của Thạch tùng
răng cưa [113]. Vì vậy, sau khi tìm được môi trường thích hợp (1/4 MS) để nhân
chồi Thạch tùng răng cưa, chúng tôi tiến hành đánh giá ảnh hưởng của chất điều hòa
sinh trưởng BA và kinetin đến hệ số nhân chồi của Thạch tùng răng cưa.
Chồi Thạch tùng răng cưa được nuôi cấy trên môi trường 1/4 MS có bổ sung
BA hoặc kinetin với nồng độ khác nhau (0; 0,1; 0,5; 1 và 1,5 mg/l) để xác định nồng
độ thích hợp cho nhân nhanh chồi Thạch tùng răng cưa. Sau 120 ngày nuôi cấy trên
môi trường ¼ MS có bổ sung BA hoặc kinetin nồng độ từ 0,1 - 1,5 mg/l (bảng 3.18
và 3.19).
93
Kết quả cho thấy, trên môi trường không bổ sung BA hoặc kinetin, mẫu
Thạch tùng răng cưa vẫn tạo cụm chồi nhưng chậm, số lượng chồi ít, sự phát triển
của chồi kém thông qua các chỉ tiêu như số mẫu tạo cụm chồi (36,33), số chồi phát
sinh (3,34 chồi), chiều cao chồi (0,91 cm) (Bảng 3.18 và 3.19).
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của BA đến tạo cụm chồi gốc Thạch tùng răng cưa sau 120
ngày nuôi cấy.
Chất Số chồi Chiều Nồng Số mẫu Đặc điểm cụm chồi và chồi điều hòa phát cao độ tạo cụm sinh sinh/mẫu chồi (mg/l) chồi trưởng cấy (cm)
Tạo cụm chồi chậm, chồi ít, Đối 0 36,33d 3,34d 0,91e thân lá xanh, phát triển chứng chậm.
Tạo cụm chồi trung bình,
BA 0,1 41,33c 4,06c 1,21d chồi ít, thân lá xanh, phát
triển chậm.
Tạo cụm chồi nhanh, chồi
BA 0,5 75,67b 5,65a 1,60a nhiều, thân lá xanh đậm,
phát triển tốt.
Tạo cụm chồi nhanh, chồi
BA 1,0 76,67ab 5,20b 1,58b nhiều, thân lá nhỏ, thân
mảnh.
Tạo cụm chồi nhanh, chồi
BA 1,5 77,67a 5,12b 1,44c nhiều, thân lá nhỏ, thân
mảnh.
5% LSD 1,03 0,10 0,02
Chú ý: Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau sai khác có ý nghĩa thống kê qua kiểm định LSD với P < 0,05.
Khi bổ sung riêng lẻ chất điều hòa sinh trưởng BA hoặc kinetin ở nồng độ
0,1 mg/l thì các chỉ tiêu phát triển của chồi tăng hơn so với đối chứng nhưng không
nhiều, tiếp tục tăng nồng độ BA hoặc kinetin lên 0,5 mg/l thì các chỉ tiêu phát triển
của chồi tăng lên vượt trội, đặc biệt là đối với chất điều hoà sinh trưởng BA với số
mẫu tạo cụm chồi đạt 75,67 và số chồi/ mẫu đạt 5,65 chồi, chiều cao chồi 1,60 cm,
lá có màu xanh đậm, thân vươn cao. Khi tiếp tục tăng nồng độ BA lên 1 mg/l, mặc
94
dù tỉ lệ mẫu tạo cụm chồi vẫn tăng nhưng các chỉ tiêu về số chồi phát sinh/ mẫu cấy
(5,20), chiều cao chồi (1,58) đều giảm đi và thấp hơn ở mức sai khác có ý nghĩa
thống kê so với khi sử dụng BA ở nồng độ 0,5 mg/l, đồng thời thân lá nhỏ và mảnh.
Do đó, sử dụng chất điều hòa sinh trưởng BA ở nồng độ 0,5 mg/l cho tỉ lệ số lượng
chồi/ mẫu, chiều cao chồi và chất lượng chồi tốt nhất và sai khác có ý nghĩa thống
kê so với các nồng độ BA còn lại (bảng 3.18).
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của kinetin đến tạo cụm chồi gốc Thạch tùng răng cưa sau
120 ngày nuôi cấy.
Đặc điểm cụm chồi và chồi
Nồng độ (mg/l) Số mẫu tạo cụm chồi Chiều cao chồi (cm) Chất điều hòa sinh trưởng
0 Số chồi phát sinh/mẫu cấy 3,34e 36,33e 0,91e Đối chứng
39,33d 3,54d Kinetin 0,1 1,21d
55,67c 4,91c Kinetin 0,5 1,37c
77,33b 6,02a 1,61a thân Kinetin 1,0
79,67a 5,78b 1,52b Kinetin 1,5
Tạo cụm chồi chậm, chồi ít, thân lá xanh, phát triển chậm. Tạo cụm chồi chậm, chồi ít, thân lá xanh, phát triển chậm. trung Tạo cụm chồi bình, chồi ít, thân lá xanh, phát triển chậm. Tạo cụm chồi nhanh, chồi nhiều, lá xanh đậm, phát triển tốt. Tạo cụm chồi nhanh, chồi nhiều, thân lá xanh. 5% LSD 1,46 0,06 0,02
Chú ý: Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau sai khác có ý nghĩa thống kê qua kiểm định LSD với P < 0,05.
Với chất điều hòa sinh trưởng kinetin, khi nồng độ kinetin tăng lên 1 mg/l thì
các chỉ tiêu sinh trưởng của chồi vẫn tiếp tục tăng với số mẫu tạo cụm chồi đạt
77,33 mẫu, số chồi/ mẫu đạt 6,02 chồi, chiều cao chồi 1,61 cm, thân lá có màu xanh
đậm và phát triển tốt. Tiếp tục tăng nồng độ kinetin lên 1,5 mg/l thì các chỉ tiêu số
chồi/ mẫu, chiều cao chồi, chất lượng chồi đều có xu hướng giảm đi, chồi có xu
hướng tạo cụm chồi nhỏ, thân lá nhỏ. Vì vậy, kinetin được sử dụng ở nồng độ 1
mg/l sẽ cho hiệu quả tạo chồi Thạch tùng răng cưa tốt hơn so với các nồng độ
95
kinetin khác (Bảng 3.19).
Sau khi đã xác định được nồng độ BA 0,5 mg/l và kinetin 1 mg/l là thích hợp
cho tạo chồi Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô, chúng tôi tiến hành thí nghiệm so
sánh hiệu quả tác động của hai chất điều hòa sinh trưởng trên đến khả năng tạo cụm
chồi của mẫu cấy nhằm tìm ra chất điều hòa sinh trưởng thích hợp nhất đối với nhân
chồi Thạch tùng răng cưa. Sau 120 ngày nuôi cấy, kết quả được thể hiện ở bảng
3.20.
Bảng 3.20. So sánh hiệu quả của BA và kinetin đến tạo cụm chồi Thạch tùng răng
cưa sau 120 ngày nuôi cấy.
Chiều cao chồi Nồng độ (mg/l) Số mẫu tạo cụm chồi Số chồi phát sinh/ mẫu cấy
Chất điều hòa trưởng BA Kinetin P (T<=t) 0,5 1,0 76,33a 77,67a 0,15 5,61a 6,02b 0,001 1,58a 1,62a 0,06
B.
Chú ý: Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau, sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong T – test.
A.
Hình 3.24. Cụm chồi Thạch tùng răng cưa nuôi cấy trên môi trường ¼ MS có
bổ sung 1 mg/l kinetin. A: Cụm chồi Thạch tùng răng cưa sau 90 ngày nuôi cấy. B:
Cụm chồi Thạch tùng răng cưa sau 120 ngày nuôi cấy.
Kết quả nghiên cứu cho thấy chỉ tiêu về số mẫu tạo cụm chồi và chiều cao
chồi khi sử dụng chất điều hòa sinh trưởng BA (lần lượt 76,33 và 1,58) và kinetin
(77,67 và 1,62) sai khác không có ý nghĩa thống kê nhưng số chồi/ mẫu khi sử dụng
kinetin (6,02) cao hơn so với khi sử dụng BA (5,61) ở mức sai khác có ý nghĩa
thống kê 95% (Bảng 3.20). Do đó, chúng tôi lựa chọn môi trường nhân nhanh chồi
96
in vitro là 1/4 MS có bổ sung kinetin 1 mg/l (Hình 3.24).
d. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự ra rễ của chồi Thạch
tùng răng cưa
Sự hình thành rễ từ các chồi nuôi cấy là giai đoạn quan trọng trong nhân
giống cây trồng in vitro, quyết định đến thành công của giai đoạn ngoài vườn ươm.
Các chất kích thích ra rễ được sử dụng trong giai đoạn này chủ yếu là các chất điều
hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin.
Trong thí nghiệm này, để xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho tạo rễ,
chồi Thạch tùng răng cưa có kích thước hơn 2 cm được tách và nuôi cấy trên môi
trường 1/4 MS có bổ sung IBA, NAA riêng lẻ với các nồng độ: 0; 0,1; 0,5; 1 và 1,5
mg/l nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự ra rễ của
chồi Thạch tùng răng cưa. Sau 60 ngày nuôi cấy, các chỉ tiêu được đánh giá gồm: tỉ
lệ chồi ra rễ, số rễ, chiều dài rễ, chất lượng rễ. Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở
bảng 3.21 và bảng 3.22.
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của IBA đến sự ra rễ của chồi Thạch tùng răng cưa
sau 60 ngày nuôi cấy.
Chất lượng rễ
Chất điều hòa sinh trưởng Đối chứng IBA IBA IBA IBA 5% LSD Nồng độ (mg/l) 0 0,1 0,5 1,0 1,5 Tỉ lệ chồi ra rễ (%) 0 0 13,62c 24,93b 25,80a 0,73 Số rễ/ chồi (rễ) 0 0 1,31c 2,33b 2,64a 0,02 Chiều dài rễ trung bình (cm) 0 0 0,83c 1,17a 0,91b 0,01 Không ra rễ Không ra rễ Rễ ngắn, thân rễ nhỏ Rễ dài, thân rễ to Rễ dài trung bình, thân rễ nhỏ
Chú ý: Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau sai khác có ý nghĩa thống kê qua kiểm định LSD với P < 0,05.
Kết quả thí nghiệm cho thấy ở công thức đối chứng hoặc sử dụng IBA nồng
độ 0,1 mg/l đều không quan sát thấy rễ xuất hiện. Trong khi đó, ở nồng độ IBA từ
0,5 mg/l đến 1 mg/l thì cây nuôi cấy mô có sự xuất hiện rễ. Đặc biệt, ở nồng độ IBA
1 mg/l thì tỉ lệ chồi tạo rễ đạt 24,92%, số rễ/ chồi đạt 2,33 chồi, chiều dài rễ 1,17 cm,
thân rễ to, khỏe. Tiếp tục tăng nồng độ IBA từ 1,0 mg/l lên 1,5 mg/l mặc dù tỉ lệ
chồi tạo rễ, số rễ/ chồi vẫn tăng tương ứng là 25,80 % và 2,64 rễ nhưng chiều dài rễ
lại giảm xuống 0,91 cm và rễ nhỏ. Do đó, chúng tôi nhận định nồng độ IBA 1,0
97
mg/l là phù hợp hơn đối với sự sinh trưởng của Thạch tùng răng cưa (Bảng 3.21).
Hiệu quả tác động của α - NAA cũng tương tự IBA (Bảng 3.22). Mặc dù, ở
nồng độ NAA 1,5 mg/l cho tỉ lệ tạo rễ cao hơn (20,58%) và số lượng rễ nhiều hơn
(2,08 rễ) so với NAA ở nồng độ 1,0 mg/l (tỉ lệ tạo rễ là 19,42 và số lượng rễ/ chồi là
1,82 rễ) nhưng chiều dài rễ lại ngắn hơn và nhỏ hơn ở mức sai số có ý nghĩa thống
kê. Cho nên, chúng tôi nhận thấy việc sử dụng NAA 1,0 mg/l sẽ có hiệu quả tốt hơn
cho quá trình phát triển rễ.
Bảng 3.22. Ảnh hưởng của α - NAA đến sự ra rễ của chồi Thạch tùng răng
cưa sau 60 ngày nuôi cấy.
Chất lượng rễ
Chất điều hòa sinh trưởng Đối chứng α - NAA Nồng độ (mg/l) 0 0,1 Tỉ lệ chồi ra rễ (%) 0 0 Số rễ/ chồi (rễ) 0 0 Chiều dài rễ trung bình (cm) 0 0
α - NAA 0,5 8,99c 1,19c 0,86c
α - NAA 1,0 19,42b 1,82b 1,12a
α - NAA 5% LSD 1,5 20,58a 0,79 2,08a 0,04 0,81b 0,01 Không ra rễ không ra rễ Rễ dài trung bình, thân rễ nhỏ Rễ tương đối dài, thân rễ trung bình Rễ ngắn, thân rễ nhỏ
Chú ý: Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau sai khác có ý nghĩa thống kê qua kiểm định LSD với P < 0,05.
Sau khi xác định được nồng độ IBA (1,0 mg/l) và α - NAA (1,0 mg/l) thích
hợp nhất cho tạo rễ Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô, chúng tôi tiến hành thí
nghiệm nghiên cứu hai chất điều hoà sinh trưởng trên với nhau. Kết quả thí nghiệm
được thể hiện ở bảng 3.23.
Bảng 3.23. So sánh hiệu qủa của α - NAA và IBA đến sự phát triển rễ sau 60 ngày
nuôi cấy.
Chất kích điều hòa trưởng IBA α – NAA P(T<=t) Nồng độ (mg/l) 1,0 1,0 Tỉ lệ chồi ra rễ (%) 24,64a 20,00b 0,001 Số rễ/ chồi (rễ) 2,34a 1,83b 0,00 Chiều dài rễ trung bình (cm) 1,17a 1,13a 0,15
Chú ý: Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau, sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong T – test.
Kết quả cho thấy khi so sánh hiệu quả của hai chất điều hòa sinh trưởng là
98
IBA 1 mg/l và α - NAA 1mg/l, mặc dù chiều dài rễ của cây con Thạch tùng răng cưa
sai khác không có ý nghĩa thống kê nhưng các chỉ tiêu về sự phát triển của rễ như tỉ
lệ chồi ra rễ, số rễ/ chồi khi sử dụng IBA (24,64% và 2,34 rễ) đều cao hơn ở mức sai
khác có ý nghĩa thống kê so với khi sử dụng α - NAA (20% và 1,83 rễ) (Bảng 3.23).
Vì vậy, chúng tôi lựa chọn nồng độ IBA 1 mg/l để kích thích sự hình thành rễ của
chồi Thạch tùng răng cưa (Hình 3.25).
Hình 3.25. Thạch tùng răng cưa sau 60 ngày nuôi cấy trong môi trường 1/4 MS có
bổ sung 1 mg/l IBA.
Từ các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi lựa chọn các điều kiện thích hợp
cho nhân giống Thạch tùng răng cưa in vitro bằng hình thức nuôi cấy chồi đỉnh như
sau: 1. Khử trùng Thạch tùng răng cưa bằng 70% C2H5OH trong 30 giây, lắc trong
HgCl2 0,1% trong vòng 5 phút, lắc trong NaClO 20% trong 7 phút. 2. Nhân nhanh
chồi Thạch tùng răng cưa bằng môi trường 1/4 MS có bổ sung 1 mg/l kinetin. 3.
Chồi được tạo rễ trên môi trường 1/4 MS có bổ sung 1mg/l IBA. Với các điều kiện
nhân giống như trên, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy in vitro thành công loài Thạch
tùng răng cưa bằng phương pháp nuôi cấy chồi đỉnh.
Hình 3.26. Cây Thạch tùng răng cưa sau 120 ngày nuôi cấy trong nhà kính.
99
Các cây con Thạch tùng răng cưa có chiều cao chồi từ 4 - 6 cm đã được đưa
lên Lâm Đồng để khảo sát khả năng ra cây. Cây Thạch tùng răng cưa in vitro được
cấy vào trong giá thể chứa đất rừng: phân chuồng hoai mục: trấu hun tỉ lệ 3:1:1 (đã
được khảo sát ở trên). Vườn ươm được thiết kế trong nhà kính. Trong điều kiện này,
chồi Thạch tùng răng cưa dễ dàng phát triển và khỏe mạnh, tỉ lệ sống sót đạt 97%
(Hình 3.26).
3.2.2.2. Nhân giống in vitro loài Thạch tùng răng cưa bằng nuôi cấy mô sẹo
a. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự hình thành mô sẹo
Nghiên cứu về đa dạng di truyền cho thấy, mẫu Thạch tùng răng cưa thu tại
Bidoup, Núi Bà, Lạc Dương (Lâm Đồng) và Nậm Cang, Sa Pa (Lào Cai) có mối
quan hệ di truyền khá xa nhau. Đồng thời tại Lào Cai, hàm lượng HupA cao nhất
được xác định ở các mẫu thu tại Nậm Cang, Sa Pa. Hơn nữa, để tránh việc sử dụng
một lượng lớn mẫu Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng, trong nghiên cứu này,
chúng tôi sử dụng đỉnh chồi (1 - 2 mm) của cây Thạch tùng răng cưa thu tại Nậm
Cang, Sa Pa, Lào Cai để tiến hành nghiên cứu nuôi cấy mô loài cây này bằng
phương pháp nuôi cấy mô sẹo. Các mẫu cấy được khử trùng bằng 70% C2H5OH
trong 30 giây, lắc trong HgCl2 0,1% trong vòng 5 phút, sau đó xử lý bằng NaClO
20% trong 7 phút (theo thí nghiệm khử trùng ở trên). Các mẫu vô trùng được nuôi
cấy tạo mô sẹo trên các môi trường khác nhau.
Trong nghiên cứu nuôi cấy mô loài Thạch tùng răng cưa, Zhou và cộng sự
(2009) đã sử dụng 4 loại môi trường nuôi cấy là: 1/2 MS + 0,01 mg/l IBA + 0,30
mg/l kinetin và 2 mg/l pirydoxine; MS + 0,01 mg/l IBA + 0,30 mg/l kinetin và 2
mg/l pirydoxine; 1/2 MS + 2 mg/l pirydoxine; MS + 2 mg/l pirydoxine. Trong đó,
môi trường thích hợp nhất để tạo mô sẹo là môi trường MS + 0,01 mg/l IBA + 0,30
mg/l kinetin và 2 mg/l pirydoxine [113]. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã
tiến hành thử nghiệm tạo mô sẹo với 4 công thức thí nghiệm theo như nghiên cứu
của Zhou và cộng sự, đồng thời tiến hành thêm các thí nghiệm với môi trường 1/4
MS (môi trường thích hợp nhất để nuôi cấy mô loài Thạch tùng răng cưa bằng
phương pháp nuôi cấy chồi đỉnh đã được trình bày ở trên) có bổ sung các chất điều
hòa sinh trưởng và vitamin như công thức thí nghiệm của Zhou và cộng sự. Tuy
nhiên, kết quả nuôi cấy cho thấy mô sẹo không được hình thành ở tất cả các công
100
thức thí nghiệm. Để kích thích quá trình phân chia và sinh trưởng của tế bào, chúng
tôi bổ sung thêm 3 mg/l glutamine vào các môi trường đã thử nghiệm trên nhưng
kết quả vẫn không thấy tạo mô sẹo ở các mẫu nghiên cứu. Bên cạnh đó, nghiên cứu
của Szypula và cộng sự (2013) tiến hành tạo mô sẹo ở loài Huperzia selago đã chỉ
ra rằng môi trường Moore (Mr) có bổ sung IBA (0,015 mg/l) và kinetin (0,3 mg/l) là
môi trường tạo mô sẹo thích hợp với loài Huperzia selago [142]. Tuy nhiên, đối với
loài Thạch tùng răng cưa, chúng tôi không sử dụng môi trường Mr mà sử dụng môi
trường ¼ MS, đồng thời bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ như
trong thí nghiệm của Szypula và cộng sự (2013). Sau 4 tháng nuôi cấy, kết quả được
thể hiện ở bảng 3.24.
Bảng 3.24. Kết quả nuôi cấy mô sẹo Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng.
Vitamin
Môi trường Axit amin Tỉ lệ tạo mô sẹo (%)
Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) Số mẫu cấy
IBA Kinetin Piridoxine Glutamin 0,01 0,30 2 - MS Số mẫu tạo mô sẹo 0 30 0
0,01 ½ MS 0,01 ¼ MS - MS - ½ MS - ¼ MS 0,01 MS 0,01 ½ MS 0,01 ¼ MS - MS - ½ MS - ¼ MS MS 0,015 ½ MS 0,015 ¼ MS 0,015 MS 0,015 ½ MS 0,015 0,30 0,30 - - - 0,30 0,30 0,30 - - - 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 - - 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 - - - - - 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
¼ MS 0,015 0,30 - 30 3
22,67
75,56 ± 1,92 Mô sẹo màu trắng đục, sau đó chuyển dần sang màu xanh
101
Kết quả bảng 3.24 cho thấy khi tăng hàm lượng IBA từ 0,01 mg/l lên 0,015
mg/l trong môi trường ¼ MS không bổ sung pirydoxin, đồng thời bổ sung 0,3 mg/l
kinetin và 3 mg/l glutamin đã quan sát thấy xuất hiện mô sẹo màu trắng đục với tỉ lệ
75,56%, sau đó, các mô sẹo chuyển dần sang màu xanh (Bảng 3.24 và Hình 3.27).
Hình 3.27. Mô sẹo đỉnh chồi Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng nuôi cấy.
Do đó, chúng tôi lựa chọn môi trường ¼ MS + 0,015 mg/l IBA + 0,30 mg/l
kinetin + 3 mg/l glutamin để tiến hành nuôi cấy mô sẹo loài Thạch tùng răng cưa
[142].
b. Tái sinh chồi từ mô sẹo được cảm ứng trên môi trường ¼ MS
Sau khi nuôi cấy tạo mô sẹo thành công trên môi trường ¼ MS + 0,015 mg/l
IBA + 0,30 mg/l kinetin + 3 mg/l glutamine, chúng tôi tiến hành chuyển mô sẹo
sang môi trường cảm ứng tạo chồi đã được nghiên cứu trong thí nghiệm nhân giống
loài Thạch tùng răng cưa bằng phương pháp nuôi cấy chồi đỉnh (môi trường 1/4 MS
có bổ sung kinetin 1 mg/l). Kết quả được thể hiện trên hình 3.28.
Hình 3.28. Đa chồi hình thành từ mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường ¼
MS.
102
Kết quả nghiên cứu cho thấy sau 30 ngày cấy chuyển mô sẹo sang môi
trường 1/4 MS có bổ sung 1 mg/l kinetin thì các khối mô sẹo đều tạo đa chồi. Theo
dõi sự phát triển của chồi sau 4 tháng cấy chuyển, kết quả được thể hiện ở bảng
3.25.
Bảng 3.25. Tạo đa chồi mô sẹo Thạch tùng răng cưa trên môi trưởng ¼ MS +
1 mg/l kinetin sau 4 tháng.
Lô thí Số mô Tỉ lệ Số lượng Chiều Chồi Chồi Chất
nghiệm sẹo cấy tạo chồi/ mô cao chồi thấp cao lượng
chuyển đa sẹo nhất nhất chồi
chồi
1 23 100% 22,22 1,62 1 2,40 Chồi
nhiều,
thân xanh 22 23 22,67 100% 100% 100% 0,90 1 2,40 2,40 đậm, phát 2 3 Trung bình 22,73 22,43 22,46 ± 0,26 1,61 1,64 1,62 ± 0,02
triển tốt
Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau 4 tháng cấy chuyển, tất cả các mô sẹo đều
tạo đa chồi, trung bình đạt 22,46 chồi/ mô sẹo, chồi có chiều cao từ 0,90 cm đến
2,40 cm, trung bình cao 1,62 cm. Thân chồi xanh đậm, mập mạp, phát triển tốt
(Hình 3.29). Điều này cho thấy mô sẹo có khả năng tạo chồi cao trên môi trường ¼
MS có bổ sung 1 mg/l kinetin. So với phương pháp tạo đa chồi Thạch tùng răng cưa
từ nuôi cấy chồi đỉnh (với tỉ lệ tạo đa chồi 77,33% và số lượng chồi 6,02 chồi) thì
phương pháp tạo đa chồi từ nuôi cấy mô sẹo cho hiệu quả tốt hơn với tỉ lệ tạo đa
chồi cao đạt 100% và số lượng chồi nhiều hơn gấp khoảng 3,5 lần (22,46 chồi) sau
4 tháng nuôi cấy. Mặt dù, phương pháp nuôi cấy mô sẹo có khả năng tạo ra các biến
dị di truyền. Tuy nhiên, đối với loài Thạch tùng răng cưa ở hai vùng Lào Cai và
Lâm Đồng có hệ số đa dạng di truyền trong từng vùng ở mức thấp thì sự xuất hiện
các biến dị di truyền sẽ giúp tăng vốn gen của quần thể, góp phần tạo nên sự đa
dạng của loài Thạch tùng răng cưa trong tự nhiên. Hơn thế nữa, nuôi cấy mô sẹo chỉ
sử dụng đỉnh chồi có kích thước rất nhỏ 1 - 2 mm, giúp tiết kiệm nguồn nguyên liệu
cho nhân giống cây trồng, hệ số nhân chồi của phương pháp nuôi cấy mô sẹo cao,
đạt trung bình 22,46 chồi/ mô sẹo. Đây là một điểm quan trọng trong các nghiên
103
cứu về nhân giống cây dược liệu quý, vừa phải khai thác để nghiên cứu, phát triển
nguồn gen vừa phải đảm bảo không làm suy giảm số lượng loài cây trồng trong tự
nhiên. Điều này cho thấy rằng, phương pháp nuôi cấy mô sẹo sẽ mở ra một triển
vọng trong việc phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa với quy mô lớn.
Hình 3.29. Cụm chồi Thạch tùng răng cưa được hình thành từ mô sẹo sau 4
tháng nuôi cấy.
c. Tạo rễ cho chồi Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô sẹo
Sau 4 tháng nuôi cấy mô sẹo trên môi trường tạo đa chồi, các chồi có chiều
cao khoảng 2 cm được tách ra khỏi cụm chồi và cấy chuyển sang môi trường ¼ MS
có bổ sung 1 mg/l IBA để cảm ứng tạo rễ (đây là môi trường tạo rễ đã được nghiên
cứu là tốt nhất cho nuôi cấy chồi đỉnh loài Thạch tùng răng cưa). Sau 2 tháng cấy
chuyển, chúng tôi đã quan sát được sự hình thành rễ từ chồi Thạch tùng răng cưa
(Hình 3.30).
Rễ
Hình 3.30. Cây Thạch tùng răng cưa in vitro nuôi cấy trên môi trường 1/4
MS + 1 mg/l IBA.
Từ các nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng phương pháp nuôi
104
cấy mô, chúng tôi có một số nhận xét như sau:
1. Khả năng tái sinh chồi trực tiếp từ chồi đỉnh của loài Thạch tùng răng cưa
đã được nghiên cứu thành công: (1) Môi trường thích hợp nhất cho tái sinh chồi
trực tiếp từ chồi đỉnh là môi trường ¼ MS; (2) Môi trường nhân nhanh chồi là môi
trường 1/4 MS có bổ sung 1 mg/l kinetin; (3) Chồi được tạo rễ trên môi trường 1/4
MS có bổ sung 1mg/l IBA.
2. Khả năng tái sinh chồi thông qua nuôi cấy mô sẹo đã được nghiên cứu
thành công. Môi trường phù hợp cho tạo mô sẹo đỉnh chồi loài Thạch tùng răng cưa
là môi trường ¼ MS + 0,015 mg/l IBA + 0,30 mg/l kinetin + 3 mg/l glutamin. Các
môi trường nhân nhanh chồi và tạo rễ chính là môi trường sử dụng cho tái sinh chồi
trực tiếp từ chồi đỉnh. Phương pháp tái sinh chồi thông qua nuôi cấy mô sẹo cho
hiệu quả tốt hơn so với phương pháp tái sinh chồi trực tiếp từ chồi đỉnh với tỉ lệ tạo
đa chồi đạt 100% và hệ số nhân chồi cao gấp khoảng 3 lần. Đây là một phương
pháp nhân giống có triển vọng giúp nhân nhanh nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa
với quy mô lớn.
3. Nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng hình thức nuôi cấy mô có ý nghĩa
bảo tồn loài Thạch tùng răng cưa tốt hơn so với phương pháp giâm hom thân. Vì
loài Thạch tùng răng cưa tăng trưởng rất chậm, mỗi năm cây chỉ cao thêm khoảng 3
cm [7], mặt khác mỗi hom thân giâm sử dụng trong phương pháp giâm hom thân
dài 6 cm. Do đó, phương pháp giâm hom thân sẽ phải sử dụng một nguồn nguyên
liệu tương đối lớn trong tự nhiên. Điều này sẽ gây khó khăn trong việc nhân giống
loài Thạch tùng răng cưa với quy mô lớn. Trong khi đó, phương pháp nuôi cấy mô
giúp tiết kiệm nguyên liệu sử dụng, đồng thời khả năng tạo đa chồi cao trong thời
gian ngắn sẽ giúp khắc phục phần nào khó khăn trong việc nhân giống bằng hình
thức giâm hom thân. Do đó, Việc nghiên cứu thành công phương pháp nhân giống
Thạch tùng răng cưa bằng hình thức nuôi cấy mô có giá trị lớn đối với việc bảo tồn
và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ở Lào Cai và Lâm Đồng nói riêng
cũng như ở Việt Nam nói chung.
3.2.2.3. Xác định hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô
bằng phương pháp HPLC
Hoạt chất chính tạo nên tính dược liệu quý của Thạch tùng răng cưa là
HupA, chính vì vậy, nếu chỉ bảo tồn được nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa mà
105
không giữ được hoạt chất quý trong cây thì sẽ không có ý nghĩa về mặt thực tiễn.
Do đó, sau khi nhân giống thành công loài Thạch tùng răng cưa bằng phương pháp
nuôi cấy mô, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng HupA trong cây bằng phương
pháp HPLC, từ đó đánh giá được hiệu quả của quá trình nhân giống loài Thạch tùng
răng cưa đối với việc thu nhận hoạt chất HupA.
a. Phân tích tín hiệu trên hệ thống LC
A HupA
HupA B
Hình 3.31. Sắc ký đồ HPLC (UV 310 nm) phát hiện HupA trong dịch chiết toàn bộ
cây Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô năm 2019. (A). Chất chuẩn HupA, (B). Mẫu
Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô.
b. Xác định hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô
Kết quả chạy HPLC đã xác định được hàm lượng HupA trong cây Thạch
tùng răng cưa nuôi cấy mô là 300 µg/g khối lượng khô (bản kết quả thử nghiệm do
Trung tâm tiên tiến về Hóa sinh hữu cơ - viện Hóa sinh biển cung cấp (phụ lục 4)).
Như vậy, hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô thu được là
tương đối cao và cao hơn so với cây ngoài tự nhiên, đây sẽ là một nguồn vật liệu
tiềm năng cho việc thu nhận hoạt chất HupA. Một số nghiên cứu định lượng HupA
trong cây nuôi cấy mô ở một số loài thuộc chi Huperzia cũng đã thông báo kết quả
về hàm lượng HupA trong cây nuôi cấy mô cao hơn trong cây tự nhiên. Szypula và
cộng sự (2005) khi nghiên cứu về nguồn sản xuất HupA từ loài Huperzia selago (1
thành viên của họ Lycopodicaceae) nuôi cấy mô đã chỉ ra rằng loài Huperzia selago
được nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô chứa hàm lượng HupA (3330 µg/g
khối lượng khô) cao gấp 2,5 lần so với cây ngoài tự nhiên (1270 µg/g khối lượng
khô) [64]. Ma và Gang (2008) đã công bố loài Phegmariurus squarrosus (một thành
106
viên của họ Huperziaceae) được nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô đã sản
xuất hàm lượng HupA cao, thậm chí cao hơn so với các cây trồng tự nhiên [32].
Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng HupA có thể được tổng hợp hoá học
nhưng hỗn hợp này có hiệu quả thấp hơn khi ức chế enzyme AchE so với HupA tự
nhiên được chiết xuất từ thực vật [56]. Do đó, nguồn cung cấp HupA thương mại
vẫn chủ yếu được chiết xuất từ thực vật. Hơn nữa, cây Thạch tùng răng cưa ngoài tự
nhiên sinh trưởng rất chậm, phải mất rất nhiều năm mới phát triển thành cây trưởng
thành [3, 32, 47]. Do đó, việc khai thác Thạch tùng răng cưa ngoài tự nhiên để thu
nhận hoạt chất HupA sẽ bị hạn chế do thiếu nguồn nguyên liệu trong tự nhiên, đồng
thời làm tăng nguy cơ khai thác dẫn đến cạn kiệt nguồn gen. Vì vậy, việc nhân
giống thành công loài Thạch tùng răng cưa bằng phương pháp nuôi cấy mô và đảm
bảo được sự tổng hợp hoạt chất HupA trong cây sẽ góp phần bảo tồn và nâng cao
giá trị thương mại của loài cây này đối với việc sản xuất và thu nhận hoạt chất
HupA phục vụ trong đời sống và y học.
Từ các kết quả về nhân giống in vitro Thạch tùng răng cưa bằng phương
pháp nuôi cấy chồi đỉnh có thể rút ra: các mẫu cấy Thạch tùng răng cưa được khử
trùng bằng 70% C2H5OH (30 giây), 0,10% HgCl2 (5 phút) và 20% NaClO (7 phút)
là phù hợp. Môi trường cơ bản thích hợp cho nuôi cấy chồi đỉnh là môi trường ¼
MS, cho nuôi cấy mô sẹo đỉnh chồi là môi trường 1/4 MS + 0,015 mg/l IBA + 0,30
mg/l kinetin + 3 mg/l glutamin. Môi trường để nhân nhanh chồi Thạch tùng răng
cưa và tạo rễ tương ứng là môi trường ¼ MS có bổ sung 1 mg/l kinetin và môi
trường ¼ MS có bổ sung 1 mg/l IBA. Cây Thạch tùng răng cưa nhân giống bằng
nuôi cấy mô vẫn giữ được hoạt chất HupA với hàm lượng cao.
107
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai và Lâm Đồng phân bố ở độ cao trên
900 m so với mực nước biển. Chúng có đặc điểm tương đồng về hình thái và
giải phẫu, một số có sự biến đổi về hình thái để thích nghi với điều kiện môi
trường sống. Các mẫu Thạch tùng răng cưa trong từng vùng nghiên cứu có
độ đa dạng di truyền thấp với hệ số sai khác di truyền từ 0,06 đến 0,20. Các
mẫu Thạch tùng răng cưa phân bố tại hai khu vực Lào Cai và Lâm Đồng đã
hình thành nhóm riêng, hệ số đa dạng di truyền giữa hai nhóm cao hơn các
mẫu trong cùng một nhóm (dao động từ 0,33 đến 0,48). Kết quả này có ý
nghĩa định hướng cho việc bảo tồn và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng
răng cưa.
2. Hàm lượng HupA ở các mẫu Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng cao hơn
các mẫu thu tại Lào Cai; hàm lượng HupA ở lá cao hơn so với thân và rễ;
Thạch tùng răng cưa thu hái vào mùa thu có hàm lượng HupA cao hơn so với
thu hái vào mùa xuân. Kết quả này có ý nghĩa trong việc lựa chọn bộ phận và
thời điểm thu hái cây Thạch tùng răng cưa để tách chiết và thu nhận hợp chất
HupA cao nhất.
3. Đã xác định được một số khâu cơ bản làm cơ sở cho việc xây dựng quy trình
nhân giống loài Thạch tùng răng cưa bằng hình thức giâm hom thân và nuôi
cấy mô.
Một số yêu cầu về vật liệu và phương thức giâm hom thân đã được
xác định bao gồm: hom thân dài 6 cm được xử lý bằng α - NAA 2500 ppm (4
- 6 giây) hoặc IBA 1000 ppm (30 phút). Hom thân được giâm sâu 3,5 cm vào
giá thể chứa đất rừng, phân chuồng hoai mục, trấu hun với tỉ lệ 3:1:1. Tỷ lệ
cây con sống sót sau ra ngôi đạt 97,78%.
Đã xác định được môi trường thích hợp cho nuôi cấy chồi đỉnh là môi
trường ¼ MS; môi trường tạo mô sẹo đỉnh chồi là môi trường 1/4 MS +
0,015 mg/l IBA + 0,3 mg/l kinetin + 3 mg/l glutamin; môi trường nhân nhanh
chồi là ¼ MS có bổ sung 1 mg/l kinetin; môi trường tạo rễ là ¼ MS có bổ
108
sung 1 mg/l IBA. Phương pháp nuôi cấy mô sẹo cho hệ số nhân chồi (22,46
chồi) cao gấp 3,5 lần so với phương pháp nuôi cấy chồi đỉnh (6,02 chồi). Tỉ
lệ cây sống sót trên giá thể đạt 97%. Cây Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô
có chứa hoạt chất HupA cao với hàm lượng Hup A cao nhất được xác định là
300 µg/ g khối lượng khô.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu nhân giống loài Thạch tùng răng cưa bằng hình thức
nuôi cấy bào tử vì đây là một trong những hình thức sinh sản hữu tính giúp
cải thiện vốn gen và tăng mức độ di truyền của quần thể.
2. Tiếp tục nghiên cứu phương pháp nuôi cấy mô sẹo có khả năng sinh phôi và
mô phôi soma loài Thạch tùng răng cưa để nhân giống nguồn gen Thạch tùng
răng cưa với quy mô lớn.
3. Xây dựng quy trình trồng, chăm sóc và thu hoạch Thạch tùng răng cưa tại
Lào Cai và Lâm Đồng với quy mô lớn.
109
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ
1. Vũ Thị Ngọc, Phạm Thị Hạnh, Lê Thị Lan Anh, Nguyễn Tiến Đạt, Lê Thị Bích
Thủy, Định tính và định lượng Huperzine A trong cây Thạch tùng răng cưa
(Huperzia serrata) ở Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng, Tạp chí công nghệ sinh học, 2016,
14 (3), 473-478.
2. Lê Thị Lan Anh, Nguyễn Thị Thanh Hằng, Bùi Tuấn Anh, Hồ Thị Hương, Ngô
Thị Thùy Linh, Lê Thị Bích Thủy, Nguyễn Đức Thành, Nghiên cứu kỹ thuật nhân
giống loài Thạch tùng răng cưa Huperzia serrata bằng phương pháp giâm cành,
Hội thảo khoa học công nghệ sinh học toàn quốc, Nhà xuất bản Khoa học tự
nhiên và công nghệ, 2018, 1411-1416.
3. Ho Thi Huong, Ngo Thi Thuy Linh, Le Thi Lan Anh, Le Thi Bich Thuy,
Evaluation of the genetic diversity of Huperzia serrata by RADP markers,
Academia Journal of Biology, 2018, 40 (4), 85-90.
4. Le Thi Lan Anh, Bui Tuan Anh, Giang Xuan Sang, Ton That Huu Dat, Ho Thi
Huong, Nguyen Duc Thanh, Le Thi Bich Thuy, A study on vegetative
propagation of Huperzia serrata by cuttings in Sa Pa, Lao Cai, Academia
Journal of Biology, 2019, 41 (3), 107-113.
5. Le Thi Lan Anh, Ho Thi Huong, Ngo Thi Thuy Linh, Ton That Huu Dat, Le Thi
Bich Thuy, Nguyen Duc Thanh, Tissue culture of Huperzia serrata by shoot tip
culture technique, CASEAN-6-proceedings, 2019, ISBN 978-604-931-088-5, pp.
197-202.
110
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. A. Ferreira, M. Rodrigues, A. Fortuna, A. Falcao, G. Alves G, Huperzine A
from Huperzia serrata: a review of its sources, chemistry, pharmacology and
toxicology, Phytochemistry reviews, 2016, 15 (1), 51-85.
2. J.Q.D. Goodger, A.L Whincup, A.R. Field, J.A.M. Holtum, I.E. Woodrow,
Variation in huperzine A and B in Australasian Huperzia species, Biochemical
systematic and ecology, 2008, 36 (8), 612-618.
3. P. Li, C. Huang, S. Guo, Y. Zhong, An investigation on the habitats of Huperzia
serrata populations in Zhejiang and adjacent area, Journal of tropical and
Subtropical Botany, 2005, 3 (3), 211 - 216.
4. H. Wu, P. Zhuang, Z. Feng, C. Zhang, C. Jin, Resource investigation and
assessent of Huperzia serrata, Journal of Nature Resources, 2005, 01.
5. Nguyễn Quang Hiệu, Nguyễn Thanh Tùng, Vũ Thu Thủy, Nguyễn Viết Thân,
Nghiên cứu đặc điểm thực vật của hai loài Huperzia, Họ thông đất
(Lycopodiaceae). Tạp chí Dược học, 2017, 57 (492), 36 - 40.
6. T. E. Almeida, A community‐derived classification for extant lycophytes and
ferns, Journal of Systematics and Evolution, 2016, 54, 563-603.
7. M. Yang, W. You, S. Wu, Z. Fan Z, B. Xu, M. Zhu, X. Li, Y. Xiao, Global
transcriptome analysis of Huperzia serrata and identification of critical genes
involved in the biosynthesis of Huperzine A. BMC Genomics, 2017, 18 (1),
245 - 256. DOI: 10.1186/s12864-017-3615-8.
8. Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học Hà Nội (Bộ mới),
2012, tập 2, 565, 813.
9. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, Tp. Hồ Chí Minh: NXB Trẻ, 1999, tập 1,
22, 24, 26.
10. Phan Kế Lộc, Danh lục các loài thực vật Việt Nam, NXB Nông nghiệp Hà Nội,
tập 1, 2001, 951-953.
11. Nguyễn Thọ Biên, Danh mục tài nguyên dược liệu tỉnh Lâm Đồng. NXB Y
học Hà Nội, 2017, 214-215.
12. Viện dược liệu. Danh mục cây thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật,
2016, 875-876.
13. Võ Văn Chi, Trần Hợp, Cây cỏ có ích ở Việt Nam. NXB Giáo dục, 1999, Tập
111
1, 54 -59.
14. Phạm Hoàng Hộ, Cây có vị thuốc ở Việt Nam. Nhà xuất bản trẻ, 2006, 9.
15. H. Long, J. Li, Y. Y. Li, D. Y. Xie, Q.Z. Peng, L. Li, Ontogenetic
characterization of sporangium and spore of Huperia serrata: an anti-aging
disease fern, Botanical studies, 2016, 57-36, DOI
10.1186/s40529-016-0151-9.
16. R. Bao, P. Yin, J. Dai, B. Guo, Y. Wei, Effects of different media on the
transplantation of Huperzia serrata (Thunb.) Trev, African Journal of
Agricultural Research, 2012, 7 (20), 3045-3048.
17. Q.Z. Peng, H. Long, C. Du, J. Li, D.Y. Xie, RNA-seq of aboveground
sporophyte’s transcriptome of Huperzia serrata and transcriptional
understanding of early steps associated with huperzine biosynthesis in forest,
Current Plant Biology, 2020, 24, 1-11,
http://doi.org/10.1016/j.cpb.2020.100159.
18. Trần Mạnh Đạt, Nguyễn Tân Hiếu, Hiện trạng phân bố và đặc điểm hình thái
của cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis.) ở khu bảo
tồn thiên nhiên Bắc Hướng Hóa, Quảng Trị, Tạp chí Khoa học và Công nghệ
Nông nghiệp, 2019, 3 (1), 1025 - 1032.
19. D. L. Wang, Y. D. Qi, J. D. Feng and J. H. Wei, An Efficient Regeneration
Pattern via Gemmae for Huperzia serrata (Thunb. ex Murray) Trev. in Hainan
Province, China, American Fern Journal, 2011, 101 (3), 182-192.
20. http://www.discoverlife.org/mp/20m?kind=Huperzia+serrata.
21. K. Jaswinder, S. Rajmeet, S. Gurinder, K. Harpreet, K. Jasvir, K. Manpreet, S.
Parminder, K. Jaspreet, A Systematic Review on Huperzia serrata,
International Journal of Pharmacognosy and Phytochemical Research, 2016, 8
(8), 1250-1255.
22. Nguyen Thi Ai Minh, Tien Tran Van, Hoang Viet Hau, Le Ngoc Trieu, Chinh
Vu Tien, Tran Thai Vinh & Duy Nong Van, Genetic diversity and variation of
Huperzia serrata (Thunb. ex Murray) Trevis. population in Vietnam revealed
2019, 33 (1), 1525-1534, DOI: 10.1080/13102818.2019.1671896.
by ISSR and SCoT markers, Biotechnology & Biotechnological Equipment,
23. X.Y. Chen, C. Sui, HJ. Wei, B.C. Gan, D.L. Wang, D.L. Feng, Isolation of
112
endophytic fungi from Huperzia serrata grown in Guangxi Province, China.
Journal of Medicinal Plant Research, 2013, 7 (36), 2638-2644.
24. Y. Wang, Z. Lai, X. X. Li, R. M. Yan, Z. B. Zhang, H. L. Yang, D. Zhu,
Isolation, diversity and acetylcholinesterase inhibitory activity of the
culturable endophytic fungi harboured in Huperzia serrata from Jinggang
Mountain, China, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2016,
32(2):20. DOI: 10.1007/s11274-015-1966-3.
25. T.T.M. Le, A.T.H. Hoang, T.T.B. Le, T.T.B. Vo, D.V. Quyen, H.H. Chu,
Isolation of endophytic fungi and screening of Huperzine A-producing fungus
from Huperzia serrata in Vietnam, Scientific reports, 2019, 9, 16152.
https://doi.org/10.1038/s41598-019-52481-2.
26. Y.M. Chen, Y.H. Yang, X.N. Li, C. Zou, P. J. Zhao, Diterpenoids from the
endophytic fungus Botryosphaeria sp. P483 of the Chinese herbal medicine
Huperzia serrata, Molecules, 2015, 20 (9): 16924-16932.
27. T.T. Ma, W.G. Shan, Y.M. Ying, L.F. Ma, W.H. Liu, Z.J. Zhan, Xanthones
with α – glucosidase inhibitory activities from Aspergillus versicolor, a fungal
endohyte of Huperzia serrata, Helvetica Chimica Acta, 2015, 98 (1), 148-152.
28. Z.Q. Xiong, Y.Y. Yang, Q.X. Liu, C.C. Sun, Y. Jin, Y. Wang, Endophytes in
the plant Huperzia serrata: fungal diversity and discovery of a new
pentapeptide, Archives of Microbiology, 2015, 197 (3), 411-418.
29. B. Qi, X. Liu, T. Mo, Z. Zhu, J. Li, J. Wang, X. Shi, K. Zeng, X. Wang, P. Tu,
I. Abe, S. Shi, 3,5-Dimethylorsellinic acid derived meroterpenoids from
penicillium chrysogenum MT - 12, an endophytic Fungus isolated from
Huperzia serrata, Journal of Nature products, 2017, 80(10), 2699-2707.
30. F.X. Yu, Z. Li, Y. Chen, Y.H Yang, G.H. Li, P.J. Zhao, Four new steroids
from the endophytic fungus Chaetomium sp. M453 derived of Chinese herbal
medicine Huperzia serrata, Fitoterapia, 2017, 117, 41-46.
31. X. Ma, C. Tan, D. Zhu, D.R. Gang DR, A survey of potential Huperzine A
natural resources in China: the Huperziaceae, Journal of ethanopharmacol,
2006, 104 (1-2), 54-67.
32. X. Ma, D.R. Gang, In vitro production of Huperzine A, a promising drug
candidate for Alzheimer’s disease, Phytochemistry, 2008, 69 (10), 2022-2028.
113
33. T. Ohba, Y. Yoshino, M. Ishisaka, N. Abe, K. Tsuruma, M. Shimazawa, M.
Oyama, T. Tabira, H. Hara, Japanese Huperzia serrata extract and the
constituent, huperzine A, ameliorate the scopolamine-induced cognitive
impairment in mice, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2015,
79(11), 1838-1844. DOI: 10.1080/09168451.2015.1052773.
34. J.Y. Park, H. Kim et al., Ethanol Extract of Lycopodium serratum Thunb.
Atteenuates Lipopolysaccharide-Induced C6 Glioma Cells Migration va
Matrix Metalloproteinase-9 Expression, Chinese Journal of Integrative
Medicine, 2018, 24(11), 860-966.
35. M. Maridass, G. Raju, Investigation of phytochemical and antimicrobial
activity of Huperzia species, Pharmacologyonline, 2009, 3, 688-692.
36. Nguyễn Duy Tài, Nguyễn Ngọc Chương, Nguyễn Thị Sơn, Trần Công Luận,
Nghiên cứu tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ của các cao chiết cồn từ hai
loài Thạch tùng thuộc họ Lycopodiaceae trên chuột nhắt trắng, Tạp chí Y học
TP. Hồ Chí Minh, 2013, 17(phụ bản số 1), 243-248.
37. Nguyễn Thu Hoài, Nguyễn Thuỳ Dương, Bùi Thanh Tùng, Đào Thị Vui,
Đặng Kim Thu, So sánh tác dụng ức chế Enzyme Acetylcholinesterase và
Butyrylcholinesterase của cao chiết toàn phần và các phân đoạn chiết với cao
chiết giàu alcaloid của Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.)
Trevis.), VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences,
2020, 36(1), 1-10.
38. S. Wu, Z. Fan, Y. Xiao, Comprehensive relative quantitative metabolomics
analysis of lycopodium alkaloids in different tissues of Huperzia serrata,
Synthetic and systems Biotechnology, 2018, 3 (1), 44-45.
39. Q. Wu, Y. Gu, Quantification of Huperzine A in Huperzia serrata by
HPLC-UV and identification of the major constituents in its alkaloid extracts
by HPLC-DAD-MS-MS, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,
2006, 40 (4), 993-998.
40. T.Y. Wu, C.P. Chen, T.R. Jinn, Traditional Chinese medicines and
Alzheimer’s disease, Taiwan journal of obstetrics of gynecology, 2011, 50 (2),
131-135.
41. X. Zhao, D. Wang, H. Luo, M. Yang, Simultaneous determination of three
114
alkaloids in Huperzia serrata by UPLC-PDA và UPLC-Q/TOF-MS,
Analytical Methods, 2015, 7 (5), 1770-1776
42. C.H. Tan, G.F. Chen, X.Q. Ma, et al., Huperzine R, a novel 15-carbon
Lycopodium alkaloid from Huperzia serrata, Journal of natural products,
2002, 65, 1021-1022.
43. Y.M. Ying, X.S. Liu, C.P. Tong, W.G. Shan, Lycopodium alkaloids from
Huperzia serrata, Helvetica Chimica Acta, 2014, 97 (10), 1433-1439.
44. Y.F. Yang, S.J. Qu, K. Xiao, S.H. Jiang, J.J. Tan, C.H Tan, Lycopodium
alkaloids from Huperzia serrata, Journal of Asian natural products research,
2010, 12 (11), 1005-1009.
45. H. Zhou, Y.S. Li, X.T. Tong, H.Q. Liu, A.H. Jiang, D.Y. Zhu, Serratane-type
triterpenoids from Huperzia serrata, Nature product research, 2004, 18 (5),
453-459.
46. Y.B. Yang, X.Q. Yang, Y.Q. Xu, et al., A new flavone glycoside from
Huperzia serrata, Chinese Journal of Natural Medicines, 2008, 6 (6), 408-410.
47. H. Luo, Y. Li, C. Sun, Q. Wu, J. Song, Y. Sun, A. Steinmetz, S. Chen S,
Comparison of 454-ESTs from Huperzia serrata and Phlegmariurus carinatus
reveals putative genes involved in Lycopodium alkaloid biosynthesis and
developmental regulation, BMC Plant Biology, 2010, 10 (1), 209 - 225.
48. Lê Đình Mạnh, Nguyễn Văn Thư, Trịnh Nam Trung, Nguyễn Duy Bắc, Phạm
Đức Thịnh, Nghiên cứu phân lập hai hợp chất terpenoid từ phân đoạn dịch
chiết ethyl acetat của cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.)
Trevis), Tạp chí Y – Dược học quân sự, 2019, 8, 3-8.
49. J. Huang, C. He, Population structure and genetic diversity of Huperzia
serrata (Huperziaceae) based on amplified fragment length polymorphism
(AFLP) markers, Biochemical Systematics and Ecology, 2010, 38 (6), 1137-
1147.
50. J. Zhang, Y. Song, Y. Zhu, H. Zhang, AFLP Analysis of Genetic Diversity and
Population Structure of Huperzia serrata (Thunb. Ex Murray) Trev. var.
longipetiolata (spring) H. M. Chang, Chinese Journal of Applied and
Environmental Biology, 2011, 17(1), 18-23.
51. B. Guo, J.Y. Ren, M.N. He, K. Yao, T.S. Wang, L.Q. Wang, X. Liu, W. He, Y.P.
115
Fu, D.L. Wang, Y.H. Wei, Development of polymorphic simple sequence
repeat markers in Huperzia serrata (Lycopodiaceae), Applications in Plant
Science, 2019, 7(7):e11273, 1-4.
52. S.J. Tsai, Huperzine-A, a versatile herb, for the treatment of Alzheimer’s
disease, Journal of the Chinese medical Association, 2019, 82(10), 750-751.
Doi: 10.1097/JCMA.0000000000000151.
53. J.S. Liu, C.M. Yu, Y.Z. Zhou, Y.Y. Han, F.W. Wu, B.F. Qi, Y.L. Zhu YL,
Study on the chemistry of Huperzine A and Huperzine B, Acta shimica sinina,
1986, 44 (10), 1035-1040.
54. M. Bialer, S.I. Johannessen, R. H. Levy, E. Perucca, T. Tomson, H.S. White,
Progress report on new antiepileptic drugs: A summary of the Twelfh Eliat
Conference (EILAT XII), Epilepsy Research, 2015, 111, 85-141.
55. A.P. Kozikowski, F. Yamada, X.C. Tang, I. Hanin, Synthesis and biological
evaluation of ± Z-Huperzine A, Tetrahedron Letters, 1990, 31 (43),
6159-6162.
56. R. Ding, J.G. Fu, G.Q. Xu et al., Divergent total synthesis of the Lycopodium
Chemistry, 2014, 79(1), 240-250.
alkaloids Huperzine A, Huperzine B and Huperzine U, The Journal of Organic
57. M. Bialer, S.I. Johannessen, H.J. Kupferberg et al., Progress report on new
antiepileptic drugs: a summary of the eighth Eilat conference (EILAT VIII),
Epilepsy Research, 2007, 73, 1-52.
58. M. Bialer, S.I. Johannessen, R.H. Levy et al., Progress report on new
antiepileptic drugs: a summary of the ninth Eilat conference (EILAT X),
Epilepsy Research, 2010, 92, 89-124.
59. G.T. Ha, R.K. Wong, Y. Zhang, Huperzine A as potential treatment of
Alzheimer’s disease: an assessment on chemistry, pharmacology, and clinical
studies, Chemistry biodiversity, 2011, 8 (7), 1189-1204.
60. X. Ma, C. Tan, D. Zhu, D.R. Gang DR, Is there a better source of Huperzine
A than Huperzia serrata? Huperzine A content of huperziaceae species in
China, Journal of Agricultural food chemistry, 2005, 53 (5), 1393-1398.
61. W.H. Lim, J.Q.D. Goodger, A.R. Field, J.A.M. Hotum, I.E. Woodrow,
Huperzine alkaloids from Australasian and Southeast Asian Huperzia,
116
Pharaceutical Biology, 2010, 48 (9), 1073-1078. DOI:
10.3109/13880209.2010.485619.
62. W.J. Szypuła, A.K. Kiss, A. Pietrosiuk, et al., Determination of huperzine A in
Huperzia selago plants from wild population and obtained in in vitro culture
by high-performance liquid chromatography using a chaotropic mobile phase,
Acta Chromatographica, 2011, 23, 339-352.
63. A. Borloz, A. Marston, K. Hostettmann, The determination of Huperzine A in
European Lycopodiaceae species by HPLC-UV-MS, Phytochemistry analysis:
an international journal of plant chemical and biochemical techniques, 2006,
17 (5), 332-336.
64. W. Szypula, A. Pietrosiuk, P. Suchocki, O. Olszowska, M. Furmanowa, O.
Kazimierska, Somatic embryogenesis and in vitro culture of Huperzia segola
shoot as a potential source of Huperzine A, Plant science, 2005, 68 (6),
1443-1452.
65. X.Q. Ma, D.R. Gang, The lycopodium alkaloids, Nature Product Reports,
2004, 21 (21), 752-772.
66. S. Bunsupa, k. Hanada, A. Maruyama, K. Aoyagi, K. Komatsu, H. Ueno, M.
Yamashita, R. Sasaki, A. Oikawa, K. Saito, M. Yamazaki, Molecular
evolution and functional characterization of a bifunctional decarboxylase
involved in lycopodium alkaloid biosynthesis, Plant Physiology, 2016, 171 (4),
2432–2444.
67. B.F. Xu, L. Lei, X.C. Zhu, Y. Zhou, Y. Xiao, Identification and
characterization of L-lysine decarboxylase from Huperzia serrata and its role
in the metabolic pathway of Lycopolium alkaloid, Phytochemistry, 2017,136,
23-30.
68. J. Wang, X. Wang, X. Liu, J. Li, X. Shi, Y. Song, K. Zeng, L. Zhang, P. Tu, S.
Shi, Synthesis of unnatural 2-substituted quinolones and 1, 3-diketones by a
member of type III polyketide synthases from Huperzia serrata, Organic
Letter, 2016, 18 (15), 3550-3553.
69. S. Shu, X. Zhao, W. Wang, G. Zhang, A. Cosoveanu, Youngjoon (2014),
Identification of a novel endophytic fungus from Huperzia serrata which
produces Huperzine A, World journal of microbiology and Biotechnology,
117
2014, 30 (12), 3101-3109.
70. G. Zhang, W. Wang, X. Zhang, Q. Xia, X. Zhao, Y. Ahn Y, N. Ahmed, A.
Cosoveanu, M. Wang, J. Wang, S. Shu, De Novo RNA sequencing and
transcriptome analysis of Colletotrichum gloeosporioides ES026 reveal genes
related to biosynthesis of Huperzine A, Plos one, 2015, 10(3), e0120809. DOI:
10.1371/journal.pone.0120809.
71. L.Q. Hu, X.C Kang, P.Y. Shen, T. Chen, J. Zang, D.B. Liu, Detection of
Huperzine A and Huperzine B in fermention broth of endophytic fungus
Colletrichum gloesporioides from Huperzia serrata by HPLC, Chinese Journal
of Biotechnology, 2018, 34 (5), 777-784.
72. S. Su, M. Yang, Huperzine A production by Paecilomyces tenuis YS-13, an
endophytic fungus isolated from Huperzia serrata, Natural product research,
2015, 29 (11), 1035-1041.
73. D. Bagchi, M. Bagchi, A. Swaroop, H. Moriyama, Huperzia A and
shankhapushpi in brain health, Phytopharmaceuticals for Brain health, 2017,
chapter 6. DOI: 10.1201/9781315152998.
74. D.L. Bai, X.C. Tang, X.C. He, Huperzine A, a potential therapeutic agent for
treatment of Alzheimer’s disease, Current medicinal chemistry, 2000, 7 (3),
355-374.
75. A. Saxena, B.P. Doctor, N. Qian, I.M. Kovach, A.P. Kozikowski, Y.P. Pang,
D.C. Vellom, Z. Radic, D. Quinn, P. Taylor, Identification of amino acid
residue involved in the binding of Huperzine A to cholinesterases, Protein
science, 1994, 3 (10), 1770-1778.
76. B.H. Coleman, R.H. Ratcliffe, S.A. Oguntayo, X. Shi, B.P. Doctor, R.K.
Gordon, M.P. Nambiar, [+]-Huperzine A treatment protects against
N-methyl-D-aspartate-induced seizure/ status epilepticus in rats.
Chemico-Biological interactions, 2008, 175 (1-3), 387-395.
77. I. Hanin, X.C. Tang, G.L. Kindel, A.P. Kozikowski, Natural and synthetic
Huperzine A: Effect on cholinergic function in vitro and in vivo. Annals of the
New York academy of sciences, 1993, 695 (1), 304-306.
78. X.C. Tang, G.H. Kindel, A.P. Kozikowski, I. Hanin, Comparison of the effects
of natural and synthetic Huperzine-A on rat brain cholinergic function in vitro
118
and in vivo, Journal of Ethnopharmacology, 1994, 44 (3), 147-155.
79. C.Y. Wang, W. Zheng, T. Wang, J.W. Xie, S.L. Wang, W.P. Teng, B.L. Zhao,
W.P. Teng, Z.Y. Wang, Huperzine A activates Wnt/ β-catenin signaling and
enhances the nonamyloidogenic pathway in an Alzheimer transgenic mouse
model, Neuropsychopharmacology, 2011, 36 (5), 1073-1089.
80. K. Ishiuchi, J.J. Park, R. Long, D.G. Gang, Production of Huperzine A and
other Lycopodium alkaloids in Huperzia species grown under controlled
conditions and in vitro, Phytochemistry, 2013, 91, 208-219.
81. J. Zhang, J. Wei, H. Zhong, Z. Guo, H. Zhang, Detarmination of Huperzin A
in the extract of Huperzia serrata by high performance liqid chromatography,
Chinese Journal of Chromatogaraphy , 2013, 31(1), 79-82, Doi:
10.3724/sp.j.1123.2012.08038.
82. Nguyễn Ngọc Chương, Trần Mạnh Hùng, Trần Thị Kim Dung, Trần Công
Luận, Thiết lập chất chuẩn và định lượng Huperzine A trong một số loài họ
Thạch tùng ở Việt Nam, Tạp chí khoa học và công nghệ, 2016, 54(2C),
417-424.
83. Thanh Thi Minh Le, Anh Thi Hong Hoang, Nhue Phuong Nguyen, Thuy Thi
Bich Le, Ha Thi Thu Trinh, Thuy Thi Bich Vo, Dong Van Quyen, A novel
huperzine A-producing endophytic fungus Fusarium sp. Rsp5.2 isolated from
Huperzia serrata, Biotechnology Letters, 2020, 42, 987-995.
http://doi.org/10.1007/s10529-020-02836-x.
84. S.H. Xing, C.X. Zhu, R. Zhang, L. An, Huperzine A in the treatment of
Alzheimer’s disease and vascular dementia: A meta - analysis, Evidence-
based Complementary and Alternative Medicine, 2014, Article ID 363985.
http://dx.doi.org/10.1155/2014/363985.
85. H.M. Hugel, Brain food for AD – free ageing: focus on herb medicines,
natural compounds as therapeutic agents for amyloidogenic diseases,
Advances in Experimental Medicine Biology, 2015, 863, 95 – 116.
86. Y.P. Ng, T.C.T. Or, N.Y. Ip, Plant alkaloids as drug leads for Alzheimer’s
disease, Neurochemistry international, 2015, 89, 260-270.
87. R. Venkatesan, E. Ji, S.Y. Kim, Phytochemicals that regulate
neurodegenerative disease by targeting neurotrophins: A comprehensive
119
review, BioMedicine Research International, 2015, 1, 1-22, Article ID 814068
http://dx.doi.org/10.1155/2015/814068.
88. D.S. Picanco, P.F. Ozela et al., Alzheimer's disease: A review from the
pathophysiology to diagnosis, new perspectives for pharmacological treatment,
Current medicinal chemistry, 2018, 25(26), 3141 - 3159,
https://doi.org/10.2174/0929867323666161213101126.
89. A. Kumar, A. Singh, Ekavali, A review on Alzheimer’s disease
pathophysiology and its management: an update, Pharmacological reports,
2015, 67 (2), 195 – 203.
90. D.J. Selkoe, Cell biology of the amyloid beta-protein precursor and the
mechanism of Alzheimer’s disease, Annual review of cell biology, 1994, 10
(1), 373 - 403.
91. D. Yu, D.K. Thakor, I. Han, A.E. Ropper, H. Haragopal, R.L. Sidman, R.
Zafonte, S.C. Schater, Y.D. Teng, Alleviation of chronic pain following rat
spinal cord compression injury with multimodal actions of Huperzine A.
Proceeding of the national academy of sciences, 2013, 110 (8), E746-E755.
92. U. Damar, R. Gersner, J. Johntone, S. Schacter, A. Rotenberg, Huperzine A as
a neuroprotective and antiepileptic drug: A review of preclinical research,
Expert Review of Neurotherapeutics, 2016, 16 (6), 671-680. Doi:
10.1080/14737175.2016.1175303.
93. V. Bobade, S.L. Bodhankar, U. Aswar, M. Vishwaraman, P. Thakurdesai,
Prophylactic effects of asiaticoside-based standardized extract of Centella
asiatica (L.) urban leaves on experimental migraine: Involvement of
5HT1A/1B receptors, Chinese Journal Natural Medicines, 2015, 13 (4),
274-282.
94. T.G. Polotow, S.C. Poppe, C.V. Vardaris, D. Ganini, M. Guariroba, R. Mattei,
E. Hatanaka, M.F. Martins, E.F. Bondan, M.P. Barros, Redox status and neuro
inflammation indexes in cerebellum and motor cortex of Wistar rats
supplemented with natural sources of omega-3 fatty acids and astaxanthin:
Fish oil, krill oil, and algal biomass, Marine Drugs, 2015, 13 (10), 6117 - 6137.
95. K.E. Rajan, J. Preethi, H.K. Singh, Molecular and functional characterization
of Bacopa monniera: A retrospective review, Evidence - Based Complementary
120
and Alternative Medicine, 2015, 945217. Doi: 10.1155/2015/945217.
96. A.K. Shetty, A. Bates, Potential of GABA-ergic cell therapy for schizophrenia,
neu-ropathic pain, and Alzheimer’s and Parkinson’s diseases, Brain Research,
2016, 1638 (Pt A), 74-87. Doi: 10.1016/j.brainres.2015.09.019.
97. L. Subedee, R.N. Suresh, J. Mk, K. Hi, S. Am, P. Vh, Preventive role of Indian
black pepper in animal models of Alzheimer’s diseases, Journal of Clinical and
Diagnostic Research, 2015, 9 (4): FF01–4. doi: 10.7860
/JCDR/2015/8953.5767.
98. L. Zhang, L. Yang, Anti-inflammatory effects of vinpocetine in atherosclerosis
and ischemic stroke: A review of the literature, Molecules, 2014, 20 (1),
335-347.
99. Y.E. Wang, D.X. Yue, X.C. Tang, Anti-cholinesterase activity of Huperzine A,
Acta Pharmacologica Sinica, 1986, 7 (2), 110-113.
100. X.F. Yan, W.H. Lu, WJ. Lou, X.C. Tang, Effects of Huperzine A and B on
skeletal muscle and electroencephalogram, Acta Pharmacologica Sinica,
1987, 8 (2), 117-123.
101. S.L. Zhang, Therapeutic effects of Huperzine A on the aged human with
memory impatient, New Drugs Clin remed, 1986, 5, 260-262.
102. R.E. Becker, P. Moriearty, L. Unni L, The second generation of cholinesterase
inhibitors: clinical and pharmacological effects, Cholinergic Basis for
Alzheimer Therapy, 1991, 263-296.
103. X.C. Tang, Y.F. Han, X.P. Chen, X.D. Zhu, Effects of Huperzine A on
learning and the retrieval process of discrimination performance in rats, Acta
Pharmacologica Sinica, 1986, 7 (6), 507-511.
104. G.P. Vincent, L. Rumennik, R. Cumin, J. Martin, J. Sepinwall (1987), The
effects of Huperzine A, an acetylcholinesterase inhibitor, on the enhancement
of memory in mice, rats and monkeys, Neuroscience Abstracts, 1987, 13, 844.
105. X.D. Zhu, X.C. Tang, Improvement of impaired memory in mice by huperzine
A and huperzine B, Acta Pharmacologica Sinica, 1988, 9(6), 492-497.
106. Tang, Y.F. Han, Pharmacological profile of Huperzine A, a novel
acetylcholinesterase inhibitor from Chinese herb, CNS Drug review, 1999, 5
(3), 281-300.
121
107. J.T. Little, S. Walsh, P.S. Aisen PS, An update on Huperzine A as a treatment
for Alzheimer’s disease, Expert opinion on investigational drugs, 2008, 17 (2),
209-215.
108. Y.E. Wang, J. Feng, W.H. Lu, X.C. Tang, Pharmacokinetics of Huperzine A
in rats and mice, Acta Pharmacologica Sinica, 1988, 9(3), 193-196.
109. G. Wang, S. Zhang, H. Zhan, Effect of Huperzine A on cerebral cholinesterase
and acetylcholine in elderly patients during recovery from general anesthesia,
Journal of southern medical university, 2006, 26 (11), 1660-1662.
110. Y. Wang, D. Chu, J. Gu, J.P. Fawcett, Y. Wu, W. Liu, Liquid
chromatographic tandem mass spectrometric method for the quantitation of
Huperzine A in dog plasma, Journal of chromatography B, 2004, 803 (2),
375-378.
111. B.C. Qian, M. Wang, Z.F. Zhou, K. Chen, R.R. Zhou, G.S. Chen,
Pharmacokinetics of tablet huperzine A in six volunteers, Acta
pharmacologica sinica, 1995, 16 (5), 396-398.
112. G. Li, J. Li, Y.Y. Li, Y.J. Tang, H. Wei, Sterilization of explants and
elimination of endophytes in Huperzia serrata, Journal of Jishou University
(Natural Sciences Edition), 2009, 30 (4), 100 - 103.
113. Y. Zhou, X. Liu, K.G. Li, Z.G. Wang, X. Geng, S.P. Hu, Tissue culture
of Huperzia serrata, Journal of Jishou University Natural Sciences Edition,
2009, 30 (2), 90-93.
114. Y.Z. Ma, J.H. Liu, H. Xu, F. Liu, In vitro cultural of Huperzia serrata, Plant
physiology Journal, 2015, 51 (4), 465-470.
115. X.Z. Xu, Y. Tu, Z.D. Ji, M. Chen, X.F. Cai, P. Yang, In vitro cultured
morphological changes in Huperzia serrata and accumulation of Huperzine A,
Chinese Bulletin of Botany, 2015, 50 (6), 733-738.
116. Z.A. Wang, J.Z. Xu, X.P. Yu, S.J. Shen, Effect of environmental factors on
growth of Huperzia serrata, Europe PMC, 2008, 33(15), 1814-1816.
117. H.Y. Zeng, W.B. Zhang, Studies on the Propagations of Medicinal Fern
Huperzia serrata, Journal of Huaihua University, 2008, 03.
118. J.C. Zhang, H.Y. Zhang, Z.L. Ye, X.H. Ye, M. Zhu, Preliminary report of
Huperzia serrata nursery constructing and original habitat cutting, Journal of
122
Sanming University, 2009, 02.
119. D.J. Qin, Y.K. Yang, J.Q. Xiang, F.Z. Zeng, Y.J. Li, H.Q. Yin, Y.C. Zou, J.
Ma, Study on cutting seedling NFT culture technique of Huperzia
serrata (Thunb.) Trev, Journal of Hubei University for Nationalities - Natural
Science edition, 2010, 28 (1), 18-21.
120. H. Long, Q. Li, L. Li, L.H. Huang, Study on cutting and gemmae propagation
of Huperzia serrata, Article in Chinese Zhong Yao Cai, 2014, 37 (7),
1115-1121.
121. M. Maridass, G. Raju, R. Mahesh, K. Muthuchelian, K. Dharmar, A. Chelliah
A, Ex situ convervation of endemic fern allies, Huperzia hilliana (Spring) RD
Dixit, International journal of applied bioresearch, 2011, 2, 1-6.
122. D.P. Whittier and H. Storchova, The gametophyte of Huperzia selago in
culture, American Fern Journal, 2007, 97 (3), 149-154.
123. Xuan Binh Minh Phan, Thi Kim Trang Do, Thi Hien Nguyen, Phuong Lan
Nguyen, Bao Tram Tran (2019), Effect of mineral mixture on the in vitro
propagation of Huperzia serrata Thunb, Vietnam Journal of science and
technology, 2019, 61 (5), 31 - 36.
124. Nông Văn Duy, Tình hình nghiên cứu Thạch tùng răng cưa tại Việt Nam, Nhà
xuất bản Tây Nguyên., 2015, 7-12.
125. Nguyễn Nghĩa Thìn, Các phương pháp nghiên cứu thực vật, NXB Đại học
Quốc gia Hà Nội, 2008.
126. M.A. Saghai-Maroof, K.M. Soliman, R.A. Jorgensen, R.W. Allard,
Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: mendelian
inheritance, chromosomal location, and population dynamics, Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America, 1984, 81
(24), 8014-8018.
127. J.G. William, A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalski, S.V. Tingey, DNA
polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers,
Nucleic Acids Research, 1990, 18 (22), 6531–6535.
128. F.I. Rohlf, Programa NTSYS-pc: numerical taxonomy and multivariate
analysis system: version 2.1, The American Statistician, 2000, 83.
129. B.S. Weir, Genetic data analysis II: Method for discrete population genetic
123
data, Sinauer associates, Inc. Sunderland, MA., 1996, 376.
130. Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, Chất điều hòa sinh trưởng đối với
cây trồng, NXB Nông Nghiệp, 1993, 11-17.
131. T. Murashige and F. Skoog, A revised medium for rapid growth and bio
assays with tobacco tissue cultures, Physiologia Plantarum, 1962, 15,
473-479.
132. G. Lloyd, B. McCown, Commercially – feasible micropropagation of
mountain laurel, Kalmiaa latifolia, by use of shoot-tip culture, Combined
Proceedings, International Plant Propagators’ Society, 1980, 30, 421-427.
133. O. L. Gamborg, R. A. Miller and K. Ojima, Nutrient requirements of
suspension cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research, 1986,
50 (1), 151-158.
134. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam. Nhà xuất bản trẻ, 2003, quyển 1, 24.
135. Trần Anh Tuấn, Trương Ngọc Kiểm, Đánh giá tiềm năng tài nguyên khí hậu
khu vực Hoàng Liên Sơn (thuộc tỉnh Lào Cai) phục vụ quy hoạch phát triển
cây Tam thất (Panax pseudo-ginseng Wall), Tạp chí Khoa học ĐHQGHN:
Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ, 2017, 33(22S), 288-294.
136. Nguyễn Thị Thu Hà, Đa dạng sinh học ở vườn Quốc gia Hoàng Liên với phát
triển du lịch sinh thái ở Tây Bắc Việt Nam, Tạp chí Khoa học và Công nghệ,
2017, 172 (12/1): 103 -108.
137. Báo cáo cuối cùng “Khảo sát cơ sở về đa dạng sinh học cho dự án quản lý tài
nguyên thiên nhiên bền vững (hợp phần 3)”, Cơ quan hợp tác Quốc tế Nhật
Bản (JICA)/ Dự án quản lý bền vững tài nguyên thiên nhiên (SNRM), 2017,
Viện sinh thái học miền Nam.
138. D. Bai, Development of Huperzine A and B for treatment of Alzheimer’s
disease, Pure Applied Chemistry, 2007, 79 (4), 469-479.
139. Ninh Thị Phíp, Một số biện pháp kỹ thuật tăng khả năng nhân giống của cây
Đinh lăng lá nhỏ, Polyscias fruticose (L.) harms, Tạp chí Khoa học và Phát
triển, 2013, 11 (2), 168 - 173.
140. T.R. Abu-Zahra, A.N. Al-Shadaideh, s.m. Abubaker, I.M. Qrunfleh, Influence
of auxin concentrations on different ornamental plant rooting, International
Journal of Botany, 2013, 9(2), 96-99.
124
141. K.S. Poornima, M. Chandregowda, T.N. Pushpa, D. Srikantaprasad, Studies
on effect of growth regulators on rooting of two rosemary types and estimation
of biochemical changes associated with rooting, Medicine Crop Research,
2012, 43 (1, 2, 3), 245 - 248.
142. W. Szypula, P. Mistrzak, O. Olszowska O, A new and fast method to obtain in
vitro cultures of Huperzia selago (Huperziaceae) sporophytes, a club moss
which is a source of Huperzine A, Acta Societatis Botanicorum Poloniae,
2013, 82 (4), 313-320.
Phụ lục 1
Môi trường nuôi cấy
1.1. Thành phần môi trường MS (Murashige & skoog, 1962)
STT Thành phần Hàm lượng (mg/l) Hàm lượng (µM)
1 332,02 2,99 CaCl2 Các
nguyên 2 170,00 1,25 KH2PO4
tố đa 3 1900,00 18,79 KNO3
lượng 4 180,54 1,50 MgSO4
5 1650,00 20,61 NH4NO3
6 0,025 0,11 CoCl2.6H2O
7 0,025 0,10 CuSO4.5H2O
FeNaEDTA 8 36,70 100,00
Các 9 6,20 100,27 H3BO3
nguyên KI 10 0,83 5,00
tố vi 11 16,90 100,00 MnSO4.H2O
lượng 12 0,25 1,03 Na2MoO4.2H2O
13 8,60 29,91 ZnSO4.7H2O
Glycin 14 2,00 26,64
Myo-inositol 100,00 15 554,94
Các Axit nicotinic 16 0,50 4,06
vitamin Pyridoxine HCl 17 0,50 2,43
Thiamin HCl 18 0,10 0,30
1.2. Môi trường Woody Plant medium (WPM) (Lloyd & McCown, 1980)
STT Thành phần Hàm lượng (mg/l) µM
1 72,50 0,65
Các 2 471,26 2,35 nguyên 3 170,00 CaCl2 Ca(NO3)2 .4H2O KH2PO4 tố đa 4 1,25 5,68 990,00 K2SO4 lượng 5 1,50 180,54 MgSO4
6 400,00 5,00 NH4NO3
7 0,25 1,00 CuSO4.5H2O
Các 8 FeNaEDTA 36,70 100,00
nguyên 9 6,20 100,27 H3BO3
tố vi 10 22,30 131,94 MnSO4.H2O
lượng 11 0,25 1,03 Na2MoO4.2H2O
12 8,60 29,91 ZnSO4.7H2O
13 Glycine 2,00 26,64
14 myo-Inositol 100,00 554,94
Các 15 Nicotinic acid 0,50 4,06
vitamin 16 Pyridoxine HCl 0,50 2,43
17 Thiamine HCl 1,00 2,96
1.3. Môi trường Gamborg B5
STT Thành phần Hàm lượng (mg/l) µM
1 113,23 1,02 CaCl2 Các
nguyên 2 2500,00 24,73 KNO3
tố đa 3 121,56 1,01 MgSO4 lượng
4 130,44 1,09 NaH2PO4
5 134,00 1,01 (NH4)2SO4
6 0,025 0,11 CoCl2.6H2O
Các 7 0,025 0,10 CuSO4.5H2O
nguyên FeNaEDTA 8 36,70 100,00
tố vi 9 3,00 48,52 H3BO3 lượng
KI 10 0,75 4,52
11 10,00 59,16 MnSO4.H2O
12 0,25 1,03 Na2MoO4.2H2O
13 2,00 6,96 ZnSO4.7H2O
14 myo-Inositol 100,00 554,94
Các 15 Nicotinic acid 1,00 8,12
vitamin 16 Pyridoxine HCl 1,00 4,86
17 Thiamine HCl 10,00 29,65
Phụ lục 2
Kết quả chạy RAPD-PCR
1. Kết quả tách ADN tổng số
Kết quả điện di tách chiết ADN tổng số từ 8 mẫu Thạch tùng răng cưa.
1: Mẫu SP1; 2: Mẫu SP2; 3: Mẫu SP3; 4: Mẫu SP4; 5: Mẫu SP5; 6: Mẫu DL1; 7: Mẫu DL2; 8: Mẫu DL3. M: Marker 1kb. 2. Kết quả đo nồng độ ADN ở bước sóng OD260 nm /OD280 nm
Thứ tự mẫu OD260nm 0,0097 0,009 0,0087 0,0093 0,0103 0,0101 0,0107 0,0109 OD280nm OD260/ OD280 Nồng độ ADN (ng/µl) 0,0051 0,0046 0,0048 0,0049 0,0056 0,0053 0,0055 0,006 1,90 1,96 1,81 1,90 1,84 1,91 1,95 1,82 97 90 87 93 103 101 107 109 SP1 SP2 SP3 SP4 SP5 DL1 DL2 DL3
3. Các sản phẩm RAPD-PCR
3.1. Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPB20
Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPB20
(2 băng, 2 đa hình).
3.2. Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPB15
Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPB15 (6
băng, 2 đa hình).
3.3. Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPC19
Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPC19 (4
băng, 3 đa hình).
Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPB18 (3
3.4. Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPB18
băng, 1 đa hình).
Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPC10 (2
3.5. Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPC10
băng, 1 đa hình).
Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPC13 (3 băng, 2 đa hình).
3.6. Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPC13
3.7. Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPB13
Sản phẩm PCR của ADN genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPB13 (1 băng, không đa hình).
3.8. Sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPC1
Sản phẩm PCR của ADN genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPC1 (5
băng, 4 đa hình).
(Chú thích đối với tất cả các sản phẩm RAPD-PCR: M: marker 1 kb (Fermentas);
1-3: Mẫu DL1- DL3; 4 - 8: Mẫu SP1 - SP5.
Phụ lục 3
Một số hình ảnh nghiên cứu và nhân giống cây Thạch tùng răng cưa
1. Hình ảnh cây Thạch tùng răng cưa ngoài tự nhiên
Hình ảnh cây Thạch tùng răng cưa thu hái tại Đà Lạt
A B C
Hình ảnh lá (A) và bào tử (B, C) của Thạch tùng răng cưa
Cây Thạch tùng răng cưa ngoài tự nhiên bị cắt mất phần thân phía trên.
Ảnh đi thực địa trong rừng tại Lâm Đồng của nhóm nghiên cứu
A
Đo hình thái Thạch tùng răng cưa ngoài tự nhiên tại Lào Cai (A, B) và Lâm Đồng (C).
2. Một số hình ảnh cây Thạch tùng răng cưa trong quá trình nghiên cứu tại
phòng thí nghiệm
A B.
Một số hình ảnh đo đạc cây trong phòng thí nghiệm
C. D
Một số hình ảnh đo đạc cây trong phòng thí nghiệm
Một số hình ảnh lá và đo lá Thạch tùng răng cưa
Mẫu bào tử thu tại Lào Cai đang được đưa vào khử trùng.
3. Một số hình ảnh về nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng hình
thức giâm hom thân
Hom thân Thạch tùng răng cưa được lựa chọn trong thí nghiệm về ảnh hưởng của
chiều cao hom thân đến sinh trưởng cây con.
Xử lý hom thân TTRC với chất điều hòa sinh trưởng α-NAA nồng độ cao
Xử lý hom thân TTRC với chất điều hòa sinh trưởng IBA
Xử lý hom thân với chất điều hòa sinh trưởng α - NAA nồng độ thấp
Xử lý hom thân với chất điều hòa sinh trưởng IAA nồng độ thấp
Giâm hom thân Thạch tùng răng cưa tại Lào Cai (hom thân dài 6 cm, sử dụng chất
điều hòa sinh trưởng IBA 1000 ppm (30 phút), giâm trên giá thể CT2, độ sâu hom
thân giâm xuống đất 3,5 cm).
Giâm hom thân Thạch tùng răng cưa tại Lâm Đồng (hom thân dài 6 cm, sử dụng
chất điều hòa sinh trưởng IBA 1000 ppm (30 phút), giâm trên giá thể CT2, độ sâu
hom thân giâm xuống đất 3,5 cm)
Một số hom thân giâm Thạch tùng răng cưa được thử nghiệm xuất vườn ươm sau 6
tháng giâm hom thân tại Lâm Đồng
Vườn ươm Thạch tùng răng cưa tại Lâm Đồng
Vườn ươm Thạch tùng răng cưa tại Lào Cai
4. Một số hình ảnh về nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng hình
thức nuôi cấy mô
Hình ảnh cây Thạch tùng răng cưa bắt đầu nuôi cấy mô.
Hình ảnh Thạch tùng răng cưa tạo đa chồi
Mô sẹo chuyển từ mầu trắng đục sang màu xanh xám và xuất hiện đa chồi
Hình ảnh đa chồi của cây Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô năm 2020
Cây Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô năm 2020
Phụ lục 4
Một số hình ảnh về TLC và HPLC
1. Hình ảnh về chạy sắc kí bản mỏng
Hình ảnh chạy TLC HupA từ Thạch tùng răng cưa thu tại SP1A.
1. HupA chuẩn, 2. Mẫu mùa xuân, 3. Mẫu mùa thu.
2. Đường chuẩn định lượng HupA
3. Một số hình ảnh về sắc kí đồ định lượng HupA từ 8 mẫu Thạch tùng răng
cưa từ 8 điểm lấy mẫu tại Lào Cai và Lâm Đồng.
A
Sắc kí đồ định lượng HupA từ 8 mẫu Thạch tùng răng cưa từ 8 điểm lấy mẫu
vò mùa thu. Ghi chú: A: Mẫu chất chuẩn, B - F: Mẫu SP1A - Mẫu SP5A, G - I:
Mẫu DL1A- Mẫu DL3A.
Sắc ký đồ định lượng HupA trong lá Thạch tùng răng cưa ở DL3A năm 2016.
A. Mẫu thu hái vào mùa thu, B. Mẫu thu hái vào mùa xuân
A
HupA
B
HupA
C
HupA
D
HupA
Sắc ký đồ định lượng HupA trong lá Thạch tùng răng cưa ở Lào Cai
năm 2017.
A. Huperzine A, B –D: mẫu SP1A – SP3A.
A HupA
B
HupA
C
HupA
D
HupA
Sắc ký đồ định lượng HupA trong lá Thạch tùng răng cưa ở Lào Cai năm 2016.
A. Huperzine A, B –D: mẫu SP1A – SP3A.
