Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu quy trình công nghệ tạo chế phẩm CoQ10 từ Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp để sản xuất thực phẩm chức năng

LỜI CAM ĐOAN

Luận án này là sản phẩm khoa học thuộc đề tài.“Nghiên cứu quy trình công nghệ tạo

chế phẩm CoQ10 từ Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp để sản xuất thực phẩm chức

năng” mã số ĐT.07.14/CNSHCB của Bộ Công thương.

Là người tham gia trực tiếp các nội dung thuộc đề tài được trình bày trong luận án

này, tôi xin cam đoan những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực và

chưa từng được các tác giả khác công bố trong các công trình nghiên cứu nào và đã được

chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào luận án này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

GVHD 1 GVHD 2 Nghiên cứu sinh

GS.TS. Đặng Thị Thu PGS.TS. Trƣơng Quốc Phong Nguyễn Việt Phƣơng

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới GS.TS Đặng Thị Thu,

nguyên Phó viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, PGS.TS

Trương Quốc Phong, Trưởng phòng Proteomic - Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công

nghệ Sinh học – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi

trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cám ơn tới PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm, Trưởng bộ môn Vi

Sinh – Hóa sinh và Sinh học Phân tử cùng các thầy giáo, cán bộ bộ môn Vi sinh – Hóa sinh

và Sinh học Phân tử, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường

Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, dạy bảo và động viên tôi trong quá trình

học tập và nghiên cứu.

Tôi cũng xin chân thành cám ơn tới Ban giám hiệu Trường Cao đẳng Công nghiệp

Thực Phẩm đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi về thời gian và vật chất để tôi hoàn thành Luận án

này.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng kính yêu và biết ơn tới gia đình, bố mẹ, vợ, con và các

anh chị em, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi học tập và nghiên cứu

tại Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội.

MỤC LỤC

Lời cam đoan Lời cảm ơn MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................................... 3 1.1. CẤU TẠO COENZYME Q10 ..................................................................................... 3 1.2. NGUỒN THU COENZYME Q10 ............................................................................... 4 1.2.1. Tổng hợp hóa học .................................................................................................... 4 1.2.2. Coenzyme Q10 từ động vật, thực vật ...................................................................... 6 1.2.3. Coenzyme Q10 từ vi sinh vật .................................................................................. 6 1.3. CON ĐƢỜNG TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ VI SINH VẬT ....................... 7 1.4. LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ A. TUMEFACIENS ........ 10 1.4.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nồng độ cacbon ................................................ 10 1.4.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ và nồng độ nitơ .......................................................... 11 1.4.3. Ảnh hưởng của nguồn khoáng ............................................................................... 12 1.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ ........................................................................................ 12 1.4.5. Ảnh hưởng của pH ................................................................................................. 13 1.4.6. Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan ..................................................................... 13 1.5. KỸ THUẬT LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 ........................... 14 1.5.1. Lên men gián đoạn ................................................................................................ 14 1.5.2. Lên men gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng (Fed – batch) .................................... 14 1.6. TÁCH CHIẾT VÀ ĐẶC TÍNH COENZYME Q10 ................................................ 15 1.6.1. Tách chiết Coenzyme Q10 .................................................................................... 15 1.6.2. Tinh sạch Coenzyme Q10...................................................................................... 17 1.6.3. Đặc tính của Coenzyme Q10 ................................................................................. 18 1.7. CẢI BIẾN CHỦNG VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 ......... 21 1.7.1. Đột biến chủng ...................................................................................................... 21 1.7.2. Chủng tái tổ hợp .................................................................................................... 21 1.8. VAI TRÕ VÀ ỨNG DỤNG CỦA COENZYME Q10 ............................................. 29 1.8.1. Vai trò của Coenzyme Q10 ................................................................................... 29 1.8.2. Ứng dụng của Coenzyme Q10 .............................................................................. 31 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 35 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ .................................................................. 35 2.1.1. Chủng vi sinh vật và plasmid ................................................................................ 35 2.1.2. Hóa chất ................................................................................................................. 35 2.1.3. Thiết bị sử dụng ..................................................................................................... 36 2.1.4. Môi trường và các dung dịch sử dụng ................................................................... 37 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................. 38 2.2.1. Phương pháp vi sinh .............................................................................................. 38 2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử .............................................................................. 39 2.2.3. Phương pháp hóa lý, hóa sinh ................................................................................ 46 2.2.4. Phương pháp toán học ........................................................................................... 52 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 55 3.1. PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN A. TUMEFACIENS SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 ............................................................................................................. 55 3.1.1. Phân lập, tuyển chọn chủng sinh tổng hợp Coenzyme Q10 .................................. 55 3.1.2. Định tên chủng A. tumefaciens TT4 ...................................................................... 59 3.2. NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN A. TUMEFACIENS SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 ...................................................................................................................................... 61

3.2.1. Tách dòng gen dps và dxs từ A. tumefaciens TT4 ................................................. 61 3.2.2. Tạo cấu trúc biểu hiện mang gen dps và dxs ......................................................... 66 3.3. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ A. TUMEFACIENSTÁI TỔ HỢP............................................. 73 3.3.1. Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng hợp CoQ10 .... 74 3.3.2. Ảnh hưởng của pH đầu môi trường ....................................................................... 78 3.3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống .................................................................................... 78 3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy .......................................................................... 79 3.3.5. Ảnh hưởng của thời gian ....................................................................................... 80 3.4. TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ A. TUMEFACIENS ............................................................................................................ 81 3.4.1. Chọn miền khảo sát ............................................................................................... 81 3.4.2. Thiết lập mô hình ................................................................................................... 82 3.4.3. Tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp Coenzyme Q10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp 84 3.5. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH COENZYME Q10 TỪ CHỦNG A. TUMEFACIENSTÁI TỔ HỢP ............................................................. 85 3.5.1. Đánh giá các phương pháp phá vỡ tế bào .............................................................. 85 3.5.2. Xác định điều kiện xử lý tế bào bằng ethanol ....................................................... 86 3.5.3. Nghiên cứu tinh sạch Coenzyme Q10 ................................................................... 88 3.5.4. Quy trình thu nhận Coenzyme Q10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp .......................... 93 3.6. KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH HÓA LÝ CỦA COENZYME Q10 ................................. 95 3.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ bền của Coenzyme Q10 ....................................... 95 3.6.2. Ảnh hưởng của pH tới độ bền của Coenzyme Q10 ............................................... 96 3.6.3. Ảnh hưởng của ánh sáng tới độ bền của Coenzyme Q10 ...................................... 97 3.7. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA COENZYME Q10 .......... 98 3.7.1. Hoạt tính chống oxy hóa của Coenzyme Q10 ....................................................... 98 3.7.2. Khả năng ức chế tế bào ung thư của Coenzyme Q10 ........................................... 99 3.8. ỨNG DỤNG CỦA COENZYME Q10 TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG DƢỚI DẠNG VIÊN NANG .................................................................. 101 3.8.1. Nghiên cứu tạo phức hợp Coenzyme Q10 với β-Cyclodextrin ........................... 101 3.8.2. Khảo sát một số đặc tính phức CoQ10- β- Cyclodextrin .................................... 102 3.8.3. Xây dựng quy trình điều chế viên nang cứng chứa Coenzyme Q10 ................... 105 3.8.4. Phân tích, đánh giá viên nang chứa Coenzyme Q10 ........................................... 107 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 113 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ......................... 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 115 PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 124

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT

Kí hiệu Tên

Ampicilline Amp

Adenosine triphosphate ATP

Cặp base Bp

Colony forming unit Cfu

Coenzyme Q CoQ

Coenzyme Q10 CoQ10

CoQ10H2 Coenzyme Q10 quinol

Corn steep Liquor CSL

Corn steep Powder CSP

Dissolved oxygen DO

Deoxyribonucleic acid DNA

Decaprenyl diphosphate synthase DPS

1- deoxy-D- xylulose 5- phosphate synthase DXS

DMAPP Dimethylallyl diphosphate

Ethidium bromide EtBr

Farnesyl phosphate FPP

High-performance liquid chromatography HPLC

Isopentenyl diphosphate IPP

Kannamycine Kan

Killo Dalton kDa

Luria-Bertani LB

2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate MEP

Mevalonate MVA

Mật độ quang (độ hấp thụ) OD

Phản ứng chuỗi polymerase PCR

p-hudroxybenzoic acid Phba

Thể tích/khối lượng v/w

Thể tích/thể tích v/v

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1 1. Các trạng thái khác nhau của CoQ10 .................................................................... 3 Hình 1 2. Vị trí của CoQ10 trong lớp kép lipid .................................................................... 4 Hình 1.3. Quá trình tổng hợp hợp chất trung gian quan trọng: để tổng hợp CoQ10 ............. 5 Hình 1.4. Con đường trao đổi chất tổng hợp CoQ10 ............................................................ 7 Hình 1.5. Cấu tạo của β – cyclodextrin ............................................................................... 19 Hình 1.6. Chuỗi vận chuyển điện tử .................................................................................... 30 Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế plasmid biểu hiện mang gene dps…………………………….…43 Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế plasmid biểu hiện mang gene dxs ................................................ 44 Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế plasmid biểu hiện mang đồng thời hai gene dps và dxs ................ 45 Hình 2.4. Phản ứng giữa ethyl cyanoacetate và CoQ10 ...................................................... 48 Hình 2.5. Phương trình phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất chống oxy hóa ......... 50 Hình 3.1. Hình ảnh nhuộm Gram một số chủng phân lập (TT4, ML5), chủng chuẩn A. tumefaciens ứng EHA và AA2.......……………………………………………………….55 Hình 3.2. Khả năng sinh 3-ketolactose của các chủng lựa chọn. A: Màu của khuẩn lạc khi mới thêm thuốc thử Benedict. B: Màu của khuẩn lạc khi thêm thuốc thử Benedict sau 75 phút ...................................................................................................................................... 56 Hình 3.3. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và sản phẩm cắt DNA bằng enzyme hạn chế cho gene dps (B). Đường chạy 1-12 (A), sản phẩm PCR gene dps từ DNA tổng số chủng TT1, TT2.1, TT2.2, TT3, TT4, ML1-ML7, tương ứng. Đường chạy 1-8 (B), sản phẩm PCR trước và sau khi cắt bằng PstI của 4 chủng TT1, TT2-1, TT2-2, TT4, tương ứng. M, thang DNA chuẩn 100 bp (Fermentas) .......................................................................................... 58 Hình 3 4. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và sản phẩm cắt DNA bằng enzyme hạn chế cho gene dxs (B). Đường chạy 1-12 (A), sản phẩm PCR gene dxs từ DNA tổng số chủng TT1, TT2.1, TT2.2, TT3, TT4, ML1-ML7, tương ứng. Đường chạy 1-8 (B), sản phẩm PCR trước và sau khi cắt bằng NdeI của 4 chủng TT1, TT2-1, TT2-2, TT4, tương ứng. M, thang DNA chuẩn 100 bp (Fermentas) ................................................................................ 58 Hình 3.5. Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 các chủng A. tumefaciens phân lập ................ 59 Hình 3.6. Phổ điện di DNA tổng số tách chiết từ A. tumefaciens TT4 ............................... 61 Hình 3.7. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) và dxs (B) từ DNA tổng số của A. tumefaciensTT4. M, thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scientific, Mỹ) ................ 62 Hình 3. 8. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) và dxs (B) từ DNA plasmid của các dòng tái tổ hợp. C3, C6 là khuôn DNA plasmid tách chiết từ clone số 3 và số 6. TT4 là khuôn DNA tổng số tách chiết từ chủng A. tumefaciens TT4. Đường chạy M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) ........................................................... 63 Hình 3. 9. Phổ điện di sản phẩm cắt DNA plasmid bằng các enzyme hạn chế đối với dòng số 3 mang gen dps (A) và dòng 6 mang gen dxs (B). Đường chạy 1, 3 là DNA plasmid chưa cắt; đường chạy 2, 4 là DNA plamid được cắt bằng cặp enzyme SacI/BamHI và BamHI/SalI tương ứng với clone 3 và 6. Đường chạy M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) .................................................................................................... 63 Hình 3.10. Trình tự nucleotide và axit amin suy diễn của gen dps được tách dòng ........... 64 Hình 3.11. Trình tự nucleotide và axit amin suy diễn của gen dxs được tách dòng ........... 66 Hình 3. 12. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và cắt enzyme hạn chế (B) của các dòng được lựa chọn đối với gen dps. Đường chạy 1-8 tương ứng với 8 dòng được lựa chọn. ĐC là sản phâm PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen. Đường chạy (+) là sản phẩm PCR từ khuôn gốc. Đường chay (-) là sản phẩm cắt plasmid đối chứng. M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) ........................................................... 67 Hình 3.13. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và cắt enzyme hạn chế (B) của các dòng được lựa chọn đối với gen dxs. Đường chạy 1-2 tương ứng với 2 dòng được lựa chọn. ĐC là sản

phâm PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen. M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) ..................................................................... 68 Hình 3.14. Phổ điện di sản phẩm PCR từ khuôn plasmid của 10 dòng sử dụng cặp mồi DpsF/R (A) và sản phẩm cắt enzyme hạn chế (B). Đường chạy 1-10, sản phẩm PCR từ khuôn plasmid của 10 dòng tương ứng; mẫu đối chứng sử dụng khuôn pCAM-dxs (ĐC); RE/9, dòng số 9 được xử lý bởi SacI/BamHI thang DNA chuẩn 100 bp (M1) và 1kb (M2) ............................................................................................................................................. 69 Hình 3.15. Phổ sắc ký HPLC của CoQ10 chuẩn (A) .......................................................... 70 Hình 3.16. Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các chủng A. tumefaciens tái tổ hợp. Chủng tái tổ hợp chứa vector tái tổ hợp mang đơn gen pCAM-pds và pCAM-dxs và đồng thời hai gen pCAM-dps-dxs. Chủng đối chứng mang vector pCAMBIA1301 ................... 71 Hình 3.17. Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các dòng A. tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc pCAM-dps-dxs ...................................................................................................... 72 Hình 3.18. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) và dxs (B), sản phẩm cắt enzyme hạn chế SacI/BamHI từ DNA plasmid của A. tumefaciens DPSX12 .................... 73 Hình 3.19. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens .......................................................................................................................... 74 Hình 3.20. Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp .......................................................................................................... 75 Hình 3. 21. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens .......................................................................................................................... 76 Hình 3. 22. Ảnh hưởng của nồng độ cao ngô đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp .......................................................................................................... 77 Hình 3. 23. Ảnh hưởng của pH đầu đến khả năng tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp ....................................................................................................................................... 78 Hình 3.24. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens .......................................................................................................................... 79 Hình 3.25. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp .......................................................................................................... 80 Hình 3. 26. Ảnh hưởng của thời gian đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens ............................................................................................................................................. 81 Hình 3.27. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng CoQ10 ............................................................ 84 Hình 3.28. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu nuôi cấy chủng A. tumefacienstái tổ hợp ..... 84 Hình 3.29. Các phương pháp xử lý phá vỡ tế bào tách thu CoQ10 ..................................... 85 Hình 3.30. Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/sinh khối đến hàm lượng CoQ10 tách chiết từ ... 86 Hình 3.31. Ảnh hưởng của thời gian đồng hóa đến hàm lượng CoQ10 tách chiết từ A. tumefaciens tái tổ hợp .......................................................................................................... 87 Hình 3.32. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng CoQ10 tách chiết từ A. tumefaciens tái tổ hợp ................................................................................................................................... 88 Hình 3.33. Phổ sắc ký HPLC của CoQ10 chuẩn (A) và dịch chiết từ A. tumefaciens tái tổ hợp (B) ................................................................................................................................. 89 Hình 3.34. So sánh độ sạch của dịch chiết CoQ10 và CoQ10 chuẩn. L1 dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn, S dịch CoQ10 chuẩn ........................................................................ 90 Hình 3.35. Phổ hấp thụ dịch chiết CoQ10 theo số lần chiết khác nhau .............................. 91 Hình 3.36. So sánh độ sạch của dịch tinh sạch CoQ10 và CoQ10 chuẩn. L1 dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn sau 1 lần chiết, L3, dịch chiết CoQ10 sau 3 lần chiết, S dịch CoQ10 chuẩn ....................................................................................................................... 92 Hình 3.37. So sánh độ sạch của dịch tinh sạch CoQ10 và CoQ10 chuẩn. L3, dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn sau 3 lần chiết; E1, dịch CoQ10 sau khi tinh sạch bằng sắc ký cột silica gel; S, dịch CoQ10 chuẩn ..................................................................................... 93

Hình 3.38. Quy trình thu nhận CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp................................. 94 Hình 3.39. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của CoQ10 tách chiết từ tế bào A. tumefaciens .......................................................................................................................... 96 Hình 3.40. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của CoQ10 tách chiết từ tế bào A. tumefaciens ............................................................................................................................................. 97 Hình 3.41. Ảnh hưởng của ánh sáng đến độ bền của CoQ10 tách chiết từ tế bào A. tumefaciens .......................................................................................................................... 97 Hình 3.42. Khả năng chống oxi hóa của CoQ10 ................................................................. 98 Hình 3.43. Phản ứng của CoQ10 các nồng độ khác nhau với DPPH (T-mẫu trắng) .......... 99 Hình 3.44. Ảnh hưởng của CoQ10 lên dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hep-2C (A), FL (B) và tế bào thận thỏ bình thường RK13 (C). Một số hình ảnh tế bào đại diện ở nồng độ 0, 20 và 80 µM CoQ10 ............................................................................................................... 100 Hình 3.45. Hiệu suất thu hồi CoQ10 theo tỷ lệ phối trộn giữa CoQ10 với β-cyclodextrin ........................................................................................................................................... 102 Hình 3.46. Khả năng hòa tan của các phức β-CDQ10 trong nước. CoQ10 tạo phức với Cyclodextrin theo các tỷ lệ khác nhau ............................................................................... 103 Hình 3.47. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của CoQ10 trong phức β- CDQ10 ......... 104 Hình 3.48. Ảnh hưởng của ánh sáng đến độ bền của CoQ10 trong phức β- CDQ10 ....... 105 Hình 3.49. Quy trình công nghệ sản xuất viên nang thực phẩm chức năng chứa CoQ10 . 106 Hình 3.50. Viên nang thực phẩm chức năng bổ sung chứa CoQ10 .................................. 107

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Các gen mã hóa cho các enzyme xúc tác tới quá trình tổng hợp CoQ10 .............. 9 Bảng 1.2. Chủng chủ và hệ biểu hiện vi khuẩn được dùng để sinh tổng hợp CoQ10 ......... 26 Bảng 2.1. Các plasmid sử dụng……………………………………………………………35 Bảng 2.2. Máy và thiết bị .................................................................................................... 36 Bảng 2.3. Chương trình thực hiện phản ứng PCR nhân gen dps ......................................... 40 Bảng 2.4. Chương trình thực hiện phản ứng PCR nhân gen dxs ......................................... 40 Bảng 2.5. Các biến số và khoảng chạy của chúng ............................................................... 52 Bảng 2.6. Ma trận thực nghiệm ........................................................................................... 53 Bảng 3.1. Đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng phân lập…………………………….57 Bảng 3.2. Mã số trình tự một số chủng A. tumfaciens trên ngân hàng gen ........................ 60 Bảng 3.3. Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hàm lượng CoQ10 thu được . 82 Bảng 3.4. Phân tích phương sai ANOVA của mô hình ....................................................... 83 Bảng 3 5. Khả năng hòa tan của các phức β-CDQ10 trong nước. .................................... 102 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của pH đến độ hòa tan của phức β-CDQ10 ................................... 103 Bảng 3.7. Kết quả kiểm nghiệm độ đồng đều về khối lượng ............................................ 107 Bảng 3.8. Kết quả đo độ rã ................................................................................................ 108 Bảng 3.9. Kết quả định lượng CoQ10 trong viên nang ..................................................... 109 Bảng 3.10. Kết quả phân tích viên nang thực phẩm chức năng CoQ10 ............................ 110 Bảng 3.11. Bảng theo dõi trọng lượng chuột………………………………….................110

MỞ ĐẦU

Ubiquinone-10 hay Coenzyme Q10 (CoQ10), là một trong những coenzyme tham gia

vào chuỗi vận chuyển điện tử bám màng ở cả prokaryote và eukaryote, được cấu tạo bởi

vòng benzoquinone và chuỗi isoprenoid kị nước. CoQ10 có vai trò quan trọng trong việc

sản xuất ra ATP - nguồn năng lượng sinh học của cơ thể. Do có tính chất chống oxy hóa

mạnh, trung hòa các gốc tự do nên CoQ10 ngày càng được sử dụng nhiều làm nguồn thực

phẩm chức năng, giúp cải thiện sức khỏe và được đưa vào các mỹ phẩm làm đẹp như một

chất chống oxy hóa, chống lão hóa để giúp cơ thể trẻ hóa; ứng dụng trong y tế nhằm ngăn

ngừa ung thư, điều trị nhiều bệnh về tim mạch, tiểu đường, Parkinson, tăng hệ thống miễn

dịch, giảm huyết áp...[5, 71, 72, 74].

Với nhiều ứng dụng có lợi như vậy nên nhu cầu về CoQ10 ngày một tăng lên. Để đáp

ứng nhu cầu đó đã có nhiều giải pháp được đưa ra như tổng hợp hóa học, bán tổng hợp và

công nghệ sinh học. Do CoQ10 có cấu trúc phức tạp nên hiện nay CoQ10 được sản xuất

chủ yếu bằng con đường lên men nhờ vi khuẩn như Agrobacterium tumefaciens,

Escherichia. coli, Sporobolomyces salmonicolor, Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus

denitrificans...[34, 36, 43, 54, 67, 91, 102].

Để nâng cao hiệu quả sản xuất CoQ10, từ năm 1993 nhiều nghiên cứu trên thế giới đã

tập trung vào tối ưu hóa quá trình lên men chủng tự nhiên hoặc cải biến chủng. Việc cải

biến chủng được thực hiện bằng cách gây đột biến ngẫu nhiên hoặc tạo chủng tái tổ hợp.

Mặc dù các chủng đột biến có khả năng tổng hợp CoQ10 cao hơn so với chủng gốc, tuy

nhiên hàm lượng CoQ10 từ các chủng này vẫn chưa được như mong đợi.

Hiện nay nhiều nghiên cứu đã và đang tập trung vào việc tạo chủng E. coli tái tổ hợp

mang gen mã hóa một số enzyme quan trọng của con đường sinh tổng hợp CoQ10 như dxs

và dps, song khả năng tổng hợp CoQ10 còn thấp so với các chủng đột biến. Ngoài ra, các

chủng E. coli tái tổ hợp không chỉ tổng hợp CoQ10 mà còn tổng hợp cả CoQ8 và CoQ9.

Đây là điều bất lợi cho việc tách tinh sạch thu CoQ10 đặc biệt là khi sản xuất ở quy mô

công nghiệp.

A. tumefaciens là một trong những vi khuẩn đang được sử dụng để sản xuất CoQ10

hiện nay do chúng có nhiều ưu điểm như có hàm lượng CoQ10 tương đối cao so với các vi

sinh vật khác, chỉ tổng hợp CoQ10, môi trường nuôi đơn giản, rẻ tiền, phù hợp sản xuất ở

quy mô công nghiệp [16, 33, 34, 101]. Chiến lược sử dụng chính vi khuẩn A. tumefaciens

làm chủng chủ để cải biến gen tạo chủng tái tổ hợp có khả năng tổng hợp CoQ10 tăng lên

1

là một giải pháp khả thi và đã bước đầu thành công bởi nhóm nghiên cứu tại Hàn Quốc

năm 2008 [16]. Ở Việt Nam hiện nay các nghiên cứu về hướng này mới chỉ là các nghiên

cứu về phân lập các chủng nấm men có khả năng sinh tổng hợp CoQ10 [2, 4].

Xuất phát từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành nghiên

cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận Coenzyme Q10 từ chủng A. tumefaciens tái tổ hợp”

 Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu tạo chủng A. tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp Coenzyme Q10.

- Nghiên cứu quy trình công nghệ thu nhận Coenzyme Q10.

- Ứng dụng Coenzyme Q10 vào sản xuất một số sản phẩm thực phẩm chức năng.

 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập, tuyển chọn chủng A. tumefaciens sinh tổng hợp Coenzyme Q10.

- Nghiên cứu tạo chủng A. tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp CoenzymeQ10.

- Nghiên cứu thu nhận Coenzyme Q10 và xác định đặc tính của Coenzyme Q10 từ

chủng A. tumefaciens tái tổ hợp.

 Khảo sát khả năng ứng dụng của Coenzyme Q10 trong sản xuất sản phẩm thực

phẩm chức năng dưới dạng viên nang.

 Những đóng góp mới của luận án

- Đã phân lập và tuyển chọn được chủng A. tumefaciens TT4 sinh tổng hợp CoQ10 cao.

- Đã tách dòng và giải trình tự được 2 gen dps và dxs mã hóa cho 2 enzyme chìa khóa

của con đường sinh tổng hợp CoQ10 từ chủng A. tumefaciens TT4 phân lập ở VN và

tạo được chủng A. tumefaciens tái tổ hợp mang 2 gen trên cho năng suất sinh tổng

hợp CoQ10 cao.

- Bước đầu ứng dụng Coenzyme Q10 trong sản xuất sản phẩm thực phẩm chức năng

dưới dạng viên nang.

2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. CẤU TẠO COENZYME Q10

Coenzyme Q10 (2,3-dimethoxy-5-methyl-6-multiprenyl-1,4-benzoquinone) còn gọi là

(ubiquinone, ubidecarenone, CoQ10) lần đầu tiên được phân lập từ tim bò bởi Frederick

Crane (USA) năm 1957 [21]. CoQ10 là một hợp chất kị nước, tan trong chất béo và các

dung môi phân cực, có những tính chất tương tự như vitamin [60, 63].

Cấu trúc hóa học của coenzyme Q10 bao gồm một vòng quinone liên kết với chuỗi

mạch bên isoprene. Coenzyme Q10 có công thức phân tử C59H90O4, khối lượng mol:

863.34 g/ mol [63].

Coenzyme Q có thể tồn tại dưới 3 trạng thái: dạng khử ubiquinol (CoQH2), dạng trung

gian (CoQH •), và dạng ôxi hóa ubiquinone (CoQ) [24, 63].

Hình 1 1. Các trạng thái khác nhau của CoQ10

CoQ10 được xác định chủ yếu nằm ở lớp màng trong ty thể của sinh vật nhân

chuẩn và màng plasma của sinh vật nhân sơ. CoQ10H2 là một phân tử rất kỵ nước nằm ở

giữa lớp phospholipid kép.

3

Coenzyme Q10 có cấu trúc một đầu quinone, nó có thể chuyển giao điện tử và đuôi là

một chuỗi isoprenoid dài bên trong màng ti thể hay màng tế bào chất của các sinh vật hô

hấp hiếu khí. Đuôi này giúp cho các phân tử CoQ10 có thể khuếch tán dễ dàng trong lớp

màng lipid [63].

Hình 1 2. Vị trí của CoQ10 trong lớp kép lipid [63]

1.2. NGUỒN THU COENZYME Q10

CoQ10 được sản xuất từ ba phương pháp: lên men (tổng hợp sinh học), tổng hợp hóa

học hoặc tách chiết từ mô động vật, thực vật.

1.2.1. Tổng hợp hóa học

CoQ10 có thể tổng hợp theo một số con đường bán tổng hợp [51, 80, 100]. Trong số

đó sử dụng solanesol cho quá trình tổng hợp chuỗi mạch nhánh isoprene liên kết với dẫn

xuất quinone là phương pháp đầy tiềm năng. Solanesol có thể dễ dàng thu được bằng cách

chiết xuất từ lá thuốc lá hoặc khoai tây. Tuy nhiên, việc sản xuất theo phương pháp này ở

quy mô công nghiệp vẫn còn bị hạn chế bởi việc thiếu một phương pháp hiệu quả cho việc

tổng hợp các dẫn xuất quinone, là chìa khóa trung gian của CoQ10. Do đó, phương pháp

tổng hợp các dẫn xuất quinone một cách hiệu quả là rất cấp thiết.

Terao và Fujita đã chứng minh một quy trình hiệu quả để tổng hợp dẫn xuất quinone.

[30, 88]. Tuy nhiên quy trình tổng hợp phải trải qua nhiều bước phức tạp và tốn kém. Vì

vậy, quá trình tổng hợp CoQ10 vẫn được cải tiến để ứng dụng trọng sản xuất công nghiệp.

Min và cộng sự (2003) đã đề xuất một phương pháp hiệu quả hơn cho quá trình tổng hợp

các chất trung gian quan trọng tổng hợp CoQ10 qua một loạt các phản ứng alkyl hóa

Friedel-Crafts bằng cách gắn thêm các mạch (–R) bất kì vào các vòng thơm [61]. Tuy

nhiên, thời gian phản ứng dài và hiệu suất thấp. Một số phương pháp mới để tổng hợp

4

CoQ10 như chloromethyl mạch vòng CoQo với các ion, tuy nhiên những phương pháp này

vẫn không áp dụng được trong quy mô công nghiệp [13, 51, 76].

Mu và cộng sự (2011) đã tiến hành tổng hợp CoQ10 bằng phương pháp hóa học một

cách đơn giản và hiệu quả thông qua hợp chất (2'E) -1- (3-methyl-4-p-toluenesulfonyl-2-

butene)-6-methyl-2 ,3,4,5-tetramethoxybenzene là tiền thân của vòng quinone. Hợp chất

này là chất trung gian quan trọng để tổng hợp CoQ10 thông qua một phản ứng ghép đôi

với các bromide solanesyl. CoQ10 được tổng hợp bắt đầu từ toluenesulfonyl p- (TsCl)

với isoprene để có được (2E)-1-p-toluenesulfonyl-2-methyl-4-hydroxy-2-butene bằng cách

kết hợp phương pháp este hóa và thủy phân. Tiếp theo với việc bổ sung 2,3,4,5-

tetramethoxytoluene (TeMT), đã kết hợp 2 thành phần thành (2‟E)-1-(3-methyl-4-p-

toluenesulfonyl-2-butene)-6-methyl-2,3,4,5 tetramethoxybenzene. Hợp chất này là chìa

khóa quan trọng để tổng hợp CoQ10 thông qua một phản ứng ghép đôi với các bromide

solanesyl [64].

Hình 1.3. Quá trình tổng hợp hợp chất trung gian quan trọng: để tổng hợp CoQ10 [64]

(1): (2E)-1-p-Toluenesulfonyl-2-methyl-4-chloride-2-butene; (2): (2E)-1-p-Toluenesulfonyl-2-

methyl-4-acetoxy-2-butene; (3): (2E)-1-p-Toluenesulfonyl-2-methyl-4-hydroxy-2-butene; (4): (2'E)

-1- (3-methyl-4-p-toluenesulfonyl-2-butene)-6-methyl-2 ,3,4,5-tetramethoxybenzene.

(a): isoprene, copper (I) chloride (CuCl), triethylamine hydrochloride (Et3N·HCl), 90°C, 75.9%;

(b): NaOAc, glacial acetic acid, 120°C, 90.7%; (c): MeOH, 20% Na2CO3, 0°C, 68.8%; (d):

2,3,4,5-tetramethoxytoluene (TeMT), 1,2-dichloroethane, boron trifluoride etherate (BF3·OEt2),

80°C, 58.8%.

5

1.2.2. Coenzyme Q10 từ động vật, thực vật

CoQ10 hiện diện trong tự nhiên với số lượng nhỏ trong nhiều loại thực phẩm, nhưng

mức độ đặc biệt cao trong các loại nội tạng như tim, gan, thận, cũng như thịt bò, dầu đậu

nành. CoQ10 lần đầu tiên được phân lập từ tim bò bởi Frederick Crane (USA) năm 1957.

Một số loài có chất béo như cá thu, cá trích là những nguồn tài nguyên có chứa hàm

lượng dầu và CoQ10 cao trong mô cơ của chúng [24, 63, 81, 85]. Hàm lượng CoQ10

trong thịt là 8 - 200 μg/g, gia cầm 17 - 21 μg/g, cá 4 - 64 μg/g [24]. Ngoài ra CoQ10 cũng

có trong trái cây, cây thuốc lá và rau nhưng với hàm lượng nhỏ [60, 95]. Mặc dù có thể thu

nhận CoQ10 từ động vật và thực vật tuy nhiên nồng độ CoQ10 trong tế bào rất thấp không

thể chiết tách ở quy mô công nghiệp do hiệu suất thấp và chi phí cao. Đây là lí do chính

khiến cho các nghiên cứu về CoQ10 từ động vật và thực vật bị hạn chế.

1.2.3. Coenzyme Q10 từ vi sinh vật

1.2.3.1. Coenzyme Q10 từ nấm men và nấm mốc

Một số loại nấm men đã được nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp coenzyme Q10,

một số giống có hàm lượng CoQ10 cao như Cyptococcus,Trichosporon, Dexomyces,

Rhdoporium. Một số chủng vi sinh vật khác có sinh tổng hợp CoQ10 nhưng với hàm lượng

thấp hơn như Bullera, Candida, Rhodoturola, Sporobolomyces, Utilago [2, 4].

Schizosaccharomyces pombe cũng là một hệ thống phổ biến để sản xuất protein và CoQ10

[15]. Saccharomyces cerevisiae cũng đã được nghiên cứu tối ưu quá trình sản xuất CoQ10

[66]. Trong một số loài nấm mốc như Neurospora crassa và Aspergillus fumigatus cũng

sinh tổng hợp CoQ10 nhưng với hàm lượng thấp [45].

1.2.3.2. Coenzyme Q10 từ vi khuẩn

CoQ10 từ vi khuẩn đã được hai nhà khoa học là Carr và Exell nghiên cứu từ năm

1965 [12]. Đặc biệt, các nghiên cứu chọn lọc các chủng dại sinh CoQ10 cao đã tìm được

các loài A. tumefaciens [19], Rhodopseudomonas spheroids và P. denitrificans [54].

CoQ10 cũng được tìm thấy ở một số vi khuẩn quang hợp như R sphaeroides, R.

sulfidophilus [91], Rhodospirillum rubrum [89]. Trong đó hàm lượng CoQ10 đạt cao nhất

trong R. Rubrum đạt 10 mg/l. Ngoài ra CoQ10 cũng được thu nhận từ vi khuẩn

Sphingomnas sp [106], Rhizobium radiobacter [84], P. dentrificans [99], P. seudomonas

Các loài A. tumefaciens, R. sphaeroides, P. denitrificans đã được sử dụng cho sản xuất

CoQ10 ở quy mô công nghiệp và đạt nồng độ từ 30 † 130 mg/l [34, 91].

6

Trong số các chủng vi sinh vật thì vi khuẩn A. tumefaciens là một trong những vi

khuẩn đang được sử dụng để sản xuất CoQ10 hiện nay do chúng có nhiều ưu điểm như có

hàm lượng CoQ10 tương đối cao so với các vi sinh vật khác, chỉ tổng hợp CoQ10, môi

trường nuôi đơn giản, rẻ tiền, phù hợp sản xuất ở quy mô công nghiệp [16, 33, 34].

1.3. CON ĐƢỜNG TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ VI SINH VẬT

Con đường sinh tổng hợp CoQ10 từ vi sinh vật bao gồm 3 phần (Hình 1.4): tổng hợp

mạch vòng quinonoid, tổng hợp mạch nhánh decaprenyl diphosphate, và biến đổi vòng

quinonoid [18, 41, 58]. Sơ đồ chi tiết con đường sinh tổng hợp được trình bày ở phụ lục 8.

Con đƣờng MEP

Con đƣờng MVA

Hình 1.4. Con đường trao đổi chất tổng hợp CoQ10 từ vi sinh vật [41]

 Tổng hợp vòng quinonoid (A)

Sự tạo thành 4-hydroxybenzoate (pHBA) từ chorismate là bước đầu tiên trong quá

trình sinh tổng hợp CoQ10. Phản ứng này, được xúc tác bởi enzym chorismate

pyruvatelyase được mã hóa bởi gen ubiC.

Ở E. coli, pHBA, tiền chất của vòng quinonoid thu được tạo thành từ con đường

shikimate, đây là con đường quan trọng để tổng hợp các axit amin thơm thông qua

chorismate. pHBA được sử dụng cho quá trình prenyl hóa và biến đổi vòng.

Ở động vật có vú, pHBA được tạo thành từ axit amin tyrosine do thiếu con đường

shikimate.

7

Ở nấm men pHBA được tổng hợp trực tiếp từ chorismate giống với E. coli hoặc từ

tyrosine giống với các vi sinh vật nhân chuẩn bậc cao [18, 41, 63].

 Tổng hợp mạch nhánh (decaprenyl diphosphate) (B, C)

Isopentenyl diphosphate (IPP) và đồng phân của nó dimethylallyl diphosphate

(DMAPP) là một tiền chất quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp CoQ10. Để tổng hợp

IPP, có hai con đường: con đường mevalonate (MVA) (C) và con đường 2-C-methyl- D-

erythritol 4-phosphate (MEP) (non-MVA) (B).

Ở E. coli, tảo lục và có thể là hầu hết các vi khuẩn khác, IPP bắt đầu được tổng hợp từ

con đường MEP theo một phản ứng tổng hợp khởi đầu giữa pyruvate và glyceraldehyde-3-

phosphate (GA3P) để tạo ra IPP và DMAPP [25, 47]. Thực vật và Streptomycetes sử dụng

cả 2 con đường MVA và MEP.

Phản ứng đầu tiên của tổng hợp IPP của con đường MEP ở E. coli là hình thành 1-

deoxy-D-xylulose-5-phosphate (DXP) dưới sự xúc tác của gen dxs. DXP sau đó bị khử

thành MEP dưới sự xúc tác của EXP reductoisomerase (DXR) được mã hóa bởi gen ispC

(dxr). Sau đó MEP chuyển hóa thành IPP dưới sự xúc tác của các enzym được mã hóa bởi

các gen ispD (ygbP), ispE (ychB), ispF (ygbB), ispG (gcpE), và ispH (lytB) trong các phản

ứng tiếp và bị đồng phân hóa thành DMAPP bởi gen idi.

Vi sinh vật nhân chuẩn như nấm mốc và nấm men không có con đường MEP nên

tổng hợp IPP dựa vào con đường MVA[42]. Sinh tổng hợp IPP sử dụng con đường MVA

bắt đầu với sự chuyển 3 phân tử của acetyl-CoA thành MVA thông qua acetoacetyl-CoA

và HMG-CoA. MVA được chuyển thành MVA diphosphate bằng 2 quá trình phosphoryl

hóa nhờ xúc tác bởi lần lượt 2 enzym MVA kinase và phospho-MVA kinase. Sau đó,

MVA diphosphate trải qua quá trình dehydate hóa-decarboxyl hóa trong một phản ứng cần

ATP, tạo ra IPP. Enzym IPP isomerase xúc tác quá trình đồng phân hóa của IPP thành

DMAPP.

Ở bước tiếp theo của con đường này, farnesyl diphosphate (FPP) synthase xúc tác sự

bắt cặp 1‟-4 của IPP với DMAPP và geranyl diphosphate (GPP) dẫn đến sự hình thành lần

lượt GPP và FPP. Sản phẩm này được kéo dài bởi decaprenyl diphosphate synthase (DPS)

[41].

 Biến đổi vòng quinonoid (D)

Bước đầu tiên trong quá trình biến đổi vòng là pHBA bị prenyl hóa bởi một enzyme

bám màng 4- hydroxybenzoate decaprenyltransferase, chuyển các loại decaprenyl

diphosphate [6, 59]. Các phản ứng sau đó bao gồm 1 phản ứng decarboxyl hóa, 3 phản ứng

hydroxyl hóa và 3 phản ứng methyl hóa xảy ra với các thứ tự khác nhau ở sinh vật nhân sơ

8

và sinh vật nhân chuẩn [58]. CoQ cuối cùng được tổng hợp là kết quả của các phản ứng

biến đổi vòng. Ở nấm men, tiền chất chuỗi phụ được sử dụng cho prenyltransferase là

hexaprenyl diphosphate. Sản phẩm của phản ứng này, 3-hexa prenyl pHBA, trải qua các

phản ứng biến đổi vòng tiếp theo trong một thứ tự khác so với ở E. coli. Do đó, 3-hexa

prenyl pHBA trải qua hydroxyl hóa, methyl hóa, và decarboxyl hóa thành 2-polprenyl-6-

methoxyphenol. O-methylase được mã hóa bởi gen CoQ3 như UbiG chuyển 2-polyprenyl-

3-methyl-5-hydroxy-6-methoxy-1,4-benzoquinol thành ubiquinol. Ở con đường sinh tổng

hợp CoQ này, pHBA:polyprenyl diphosphate transferase, chuyển chuỗi phụ isoprenoid

thành khung quinone. pHBA:polyprenyl diphosphate transferase có tính đặc hiệu cơ chất

rộng, và chiều dài của cơ chất isoprenoid không làm thay đổi hoạt tính chuyển đổi của nó.

Chiều dài của chuỗi phụ không được xác định bởi tính đặc hiệu cơ chất của pHBA:

polyprenyl diphosphate transferase, nhưng được xác định bởi tính chất của isoprenoids. Ở

E. coli, quá trình prenyl hóa của pHBA thành 3-octaprenyl pHBA được xảy ra bởi enzym

liên kết màng pHBA:octaprenyltransferase. Enzym này là không đặc hiệu và có thể sử

dụng nhiều prenyl diphosphate như là các tiền chất chuỗi phụ. Enzym này cũng không có

tính đặc hiệu đối với cơ chất thơm này. Chiều dài của chuỗi phụ prenyl là một hằng số đối

với mỗi sinh vật, điều này được quyết định bởi sự sẵn có của prenyl diphosphate trong tế

bào. 3-octaprenyl pHBA được decarboxyl hóa thành 2-octaprenylphenol bởi 3-octaprenyl

pHBA decarboxylase. 2-octaprenylphenol này trải qua 3 phản ứng hydroxyl hóa và 3 phản

ứng methyl hóa dẫn đến sự tạo thành ubiquinol và sau đó là CoQ10 [18, 41].

Bảng 1.1. Các gen mã hóa cho các enzyme xúc tác tới quá trình tổng hợp CoQ10 [41]

Gen Enzym đƣợc mã hóa

phbA Acetoacetyl-CoA thiolase (PhbA)

mvS HMG-CoA synthase (MvaA)

mvaA HMG-CoA reductase (MvaS)

mvaK1 Mevalonate kinase (MvaK1)

mvaK2 Phosphomevalonate kinase (MvaK2)

mvaD Mevalonate-5-pyrophosphate decarboxylase (MvaD)

dxs 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DXS)

dxr 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXR)

ispD 4-Diphosphocytidyl-2-C-Methyl-D-erythritol synthase (IspD)

ispE 4-Diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase (IspE)

9

ispF 2-C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate synthase

ispG 4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate synthase

ispH 4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate reductase

idi Isopentenyl pyrophosphate isomerase (Idi)

ispA Farnesyl diphosphate synthase (IspA)

ispB Polyprenyl diphosphate synthase (IspB) – CoQ1

ddsA Decaprenyl diphosphate synthase (DdsA or DPS) – CoQ10

ubiA pHB-polyprenyltransferase (UbiA) – CoQ2

ubiG O-Methyltransferase (UbiG) – CoQ3

ubiE C-Methyltransferase (UbiE) – CoQ5

ubiH Monooxygenase (UbiH) – CoQ6

ubiF Monooxygenase (UbiF) – CoQ7

ubiB Monooxygenase (UbiB)

1.4. LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ A.

TUMEFACIENS

Để sử dụng CoQ10 có hiệu quả hơn cho những ứng dụng trong y học, mỹ phẩm và

hiểu rõ hơn những đặc tính của CoQ10, việc sản xuất CoQ10 với chi phí thấp là một yêu

cầu cần thiết. Giảm chi phí sản xuất CoQ10 bằng cách tối ưu trong quá trình lên men là các

nghiên cứu cơ bản để ứng dụng trong sản xuất công nghiệp. A. tumefaciens được coi là vi

khuẩn sản sinh CoQ10 đạt hiệu quả cao [16, 31, 99]. Do đó, đã có rất nhiều nghiên cứu về

ảnh hưởng của nguồn cacbon, nguồn nitơ và hàm lượng nitơ, pH và các điều kiện môi

trường khác đến sự sản xuất CoQ10.

1.4.1. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon và nồng độ cacbon

Nguồn cacbon cũng như nồng độ cacbon trong môi trường đóng vai trò quan trọng để

sinh tổng hợp CoQ10. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon là đến khả năng sinh

CoQ10 của A. tumefaciens, Ha và cộng sự (2007) đã nhận thấy rằng sucrose là nguồn

cacbon có hiệu quả hơn so với fructose, glucose trong sản xuất CoQ10 của chủng đột biến

A. tumefaciens KCCM 10413. Sản phẩm CoQ10 đạt cao nhất (89,5 mg/l) khi sucrose được

sử dụng là nguồn cacbon [34]. Cheong (2008) cũng chứng minh sucrose là nguồn cacbon

hiệu quả nhất trong quá trình lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens KCCM-

10554 tái tổ hợp hàm lượng CoQ10 thu được khi tiến hành lên men theo mẻ có bổ sung

đường sucrose trong quá trình lên men tăng gấp 1,26 lần so với lên men theo mẻ gián đoạn

10

đạt 352 mg/l [16]. Gu và cộng sự (2006) khi tiến hành nghiên cứu động học quá trình lên

men theo mẻ có bổ sung nguồn cacbon là 15% đường sucrose kết hợp với 33% mật đường

mía của chủng A. tumefaciens ATCC4452 hàm lượng CoQ10 thu được đạt 71,5 mg/l sau

96 giờ nuôi cấy tăng gấp 3,5 lần so với lên men gián đoạn [31]. Nhiều công trình nghiên

cứu cũng đã chứng minh đường sucrose là nguồn cacbon hiệu quả cho quá trình lên men

sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens [90, 99].

Sử dụng nồng độ cacbon cao trong môi trường lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ vi

khuẩn có thể giúp cho sinh trưởng của vi khuẩn nhưng có thể hạn chế sự tổng hợp CoQ10

trong canh trường do nồng độ cơ chất cao làm tăng độ nhớt của dịch lên men, giảm hàm

lượng oxy hòa tan trong môi trường. Để khắc phục hiện tượng này, trong môi trường lên

men có thể bổ sung nguồn sucrose ở nồng độ thấp rồi bổ sung dần trong quá trình lên men

đảm bảo đồng thời hai quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp CoQ10.

1.4.2. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ và nồng độ nitơ

Sinh tổng hợp CoQ10 không chỉ phụ thuộc vào nguồn nitơ mà còn phụ thuộc vào hàm

lượng nitơ được sử dụng. Hiện nay trong lên men sinh tổng hợp CoQ10, ta có thể cung cấp

nitơ bằng cách sử dụng nhiều loại nguyên liệu khác nhau. Có thể sử dụng nguồn nguyên

liệu nitơ vô cơ hay hữu cơ. Các nguồn nitơ bao gồm cao ngô, cao nấm men, peptone,

trypton, soytone, cao malt, (NH4)2SO4. Tuy nhiên trong quá trình lên men sinh tổng hợp

CoQ10 từ A. tumefaciens nguồn nitơ là cao ngô được đánh giá là có hiệu quả hơn cả. Ha và

cộng sự (2007) khi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ tới hàm lượng CoQ10 của

chủng đột biến A. tumefaciens KCCM 10413 các nguồn nitơ được lựa chọn là (cao ngô,

cao nấm men, peptone, cao malt, casein, troytone và soytone). Kết quả cho thấy vi khuẩn

sử dụng cao ngô làm nguồn nitơ cho hàm lượng CoQ10 và sinh khối tế bào cao nhất lần

lượt là (2,05 mg/ g sinh khối) và (41,8 g/l) so với các nguồn nitơ khác [16, 34]. Gu và cộng

sự (2006) đã sử dụng nguồn nitơ là 4% cao ngô trong quá trình lên men chủng A.

tumefaciens ATCC4452 hàm lượng CoQ10 thu được đạt 71,5 mg/l [31]. Cũng có nhiều

công trình nghiên cứu sử dụng cao ngô làm nguồn nitơ cho quá trình lên men sinh tổng

hợp CoQ10 từ A. tumefaciens [90, 99, 101].

Nguồn nitơ vô cơ như (NH4)2SO4 cũng được sử dụng trong nuôi cấy tổng hợp

CoQ10. Một số các nghiên cứu cho thấy sự kết hợp giữa các nguồn nitơ khác nhau trong

sinh tổng hợp CoQ10. Ngoài các nguồn nitơ hữu cơ như cao nấm men, peptone, cao ngô

thì (NH4)2SO4 cũng được sử dụng là nguồn nitơ vô cơ kết hợp cho sinh tổng hợp CoQ10.

11

Nuôi cấy trong điều kiện lên men gián đoạn 5 lít CoQ10 từ A. tumefaciens 1.2554 đạt

20,62 mg/l khi kết hợp cao ngô với (NH4)2SO4 [99, 101].

1.4.3. Ảnh hƣởng của nguồn khoáng

Trong quá trình lên men sinh tổng hợp CoQ10 sử dụng A. tumefaciens ta phải cung

cấp các nguyên tố đa lượng và vi lượng để đảm bảo sự phát triển của vi khuẩn. Các nguyên

tố đa lượng cho sinh tổng hợp CoQ10 trong vi khuẩn thường sử dụng là S, P, K, Ca, Mg.

Phospho chiếm tỷ lệ cao nhất trong thành phần khoáng của vi khuẩn. Phospho tham gia

cấu tạo nên nhiều chất hữu cơ rất quan trọng trong tế bào vi khuẩn. Lưu huỳnh tham gia vào thành phần một số axit amin. Kali tham gia vào quá trình trao đổi gluxit. Mg2+ mang

tính chất là một cofactơ đối với nhiều enzyme, nó tham gia vào quá trình hoạt hóa khoảng

80 enzyme trong tế bào (enzyme thủy phân, enzyme oxy hóa khử...). Canxi chiếm khoảng

vài phần trăm trong phần khoáng của tế bào vi khuẩn. Canxi không tham gia vào thành

phần các chất hữu cơ nhưng nó đóng vai trò trung gian giữa nhiều thành phần quan trọng

(như giữa các nucleotit, protein, axit nucleic). Trong nuôi cấy vi khuẩn để tổng hợp CoQ10

các nguyên tố khoáng đa lượng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy dưới dạng các muối

vô cơ như K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, CaCO3...[16, 90, 99, 101].

1.4.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ

Trong môi trường nuôi cấy nhiệt độ có ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp CoQ10. Thông thường A. tumefaciens được nuôi cấy ở nhiệt độ 25o-35oC là nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp CoQ10. Khi nuôi cấy ở nhiệt độ cao hơn 35oC hoặc thấp hơn 25oC

thì sinh trưởng chậm dẫn đến hàm lượng CoQ10 bị giảm [16, 34, 101].

Nhiệt độ tối ưu trong sự tổng hợp CoQ10 của chủng đột biến A. tumefaciens KCCM 10413 là 32oC. Khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn ở 25oC, 28oC, 30oC, 32oC, 35oC, kết quả cho thấy tại 32oC trọng lượng sinh khối tế bào, hàm lượng CoQ10, nồng độ CoQ10 cao nhất tương ứng là (32,4 mg/l, 6,90 mg/ g sinh khối, 223 mg/l). Từ 25 – 32oC tế bào tăng

trưởng và hàm lượng CoQ10 được cải thiện đáng kể [34]. Cũng theo Cheong (2008) nhiệt

độ tối ưu trong quá trình lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens KCCM-10554 tái tổ hợp là 32oC hàm lượng CoQ10 thu được sau 96 giờ lên men gián đoạn đạt 280 mg/l

[16]. Tian (2010) trong quá trình nghiên cứu các phương pháp tách chiết CoQ10 đã tiến hành lên men chủng A. tumefaciens 1.2554 trong điều kiện nhiệt độ 28oC [90, 101]. Theo Yoshida (1998) nhiệt độ lên men chủng A. tumefaciens KY-3085 (ATCC4452) là 30oC

hàm lượng CoQ10 đạt 180 mg/l sau 58 giờ lên men gián đoạn [99].

12

1.4.5. Ảnh hƣởng của pH

Điều kiện pH có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp CoQ10 ở

A. tumefaciens. Hàm lượng CoQ10 thu được là lớn nhất khi tiến hành nuôi cấy các chủng

A. tumefaciens trong điều kiện pH từ 7 – 7,5. Ha và cộng sự tiến hành nuôi cấy chủng đột

biến A. tumefaciens KCCM 10413 trong điều kiện pH từ 6 - 8 hàm lượng CoQ10 tại pH

7.0 (7,04 mg/ g sinh khối) cao hơn tại pH 7,5 (5,43 mg/g sinh khối). Tại pH 8,0 hàm lượng

CoQ10 giảm đi 4,11 mg/ g sinh khối. Tại pH 6,0 trọng lượng sinh khối và hàm lượng

CoQ10 giảm đi tương ứng là 24 g/l và 6.58 mg/g sinh khối. Sản phẩm CoQ10 cao nhất tại

pH 7,0 và giảm dần tại pH axit và pH kiềm [34]. Yoshida (1998) cũng tiến hành lên men

chủng A. tumefaciens KY-3085 (ATCC4452) tại pH 7,0. Trong khi đó, Tian (2010) và

Yuan (2012) đã tiến hành lên men chủng đột biến A. tumefaciens PK38 tại pH 7,2 [90,

101] .

1.4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ oxy hòa tan

Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan tới trọng lượng sinh khối tế bào và hàm lượng

CoQ10 của chủng đột biến A. tumefaciens KCCM 10413 được nghiên cứu thực hiện trong

96 giờ. Nồng độ oxy hòa tan được kiểm soát tại 0-10, 10-20, và 20-30% được điểu chỉnh

bằng tốc độ khuấy từ 500-900, 500-1,000 và 500-1,100 rpm. Kết quả cho thấy, ban đầu thì

nồng độ DO chưa được kiểm soát nhưng sau 24 giờ nuôi cấy, nồng độ DO được giới hạn

từ 0-10, 10-20, và 20-30% bằng cách điều chỉnh tốc độ khuấy. Trọng lượng sinh khối tế

bào của quá trình nuôi cấy khi chưa kiểm soát nồng độ DO là 36,5 g/l sau 24 giờ và không

tăng thêm nữa. Khi nồng độ DO tăng lên hàm lượng CoQ10 cũng tăng, tuy nhiên trọng

lượng sinh khối tế bào (48,4 g/l) và sản phẩm CoQ10 (320 mg/l) cao nhất tại nồng độ DO

từ 0-10% [34]. Cheong (2008) đã tiến hành nghiên cứu tốc độ khuấy và cấp khí ảnh hưởng

tới quá trình lên men chủng A. tumefaciens tái tổ hợp đã nhận thấy rằng tại tốc độ khuấy

500 (rpm), cấp khí 1.0 (vvm) hàm lượng CoQ10 thu được cao nhất đạt 250,4 mg/l [16].

13

1.5. KỸ THUẬT LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10

Lên men là quá trình phức tạp với nhiều yếu tố ảnh hưởng khác nhau, trong đó quá

trình sinh trưởng và quá trình hình thành sản phẩm không chỉ bị ảnh hưởng bởi các thông

số trong môi trường mà đặc biệt còn bị ảnh hưởng bởi kỹ thuật quá trình lên men, bao gồm

dạng thức lên men, chế độ cấp dinh dưỡng, tốc độ thông khí, tốc độ khuấy trộn...[57]

Có hai kỹ thuật lên men chính trong sinh tổng hợp CoQ10 ở vi khuẩn, đó là lên men

gián đoạn và lên men gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng. Tùy theo đặc điểm từng quá trình,

nhằm kiểm soát tốt hơn tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật và sự tạo thành sản phẩm.

1.5.1. Lên men gián đoạn

Quá trình lên men trên môi trường lỏng phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, bao gồm thành

phần môi trường, mức độ và hình thức thông khí, tốc độ khuấy, nồng độ oxy hòa tan, điều

kiện nuôi...

Hệ thống lên men gián đoạn là một hệ thống khép kín, tại đó các chất dinh dưỡng cần

thiết được cung cấp cho sự phát triển của vi sinh vật và sự hình thành sản phẩm ngay từ

đầu quá trình lên men. Vi sinh vật sau khi được cấy vào hệ thống lên men sẽ tăng trưởng

và phát triển. Hệ thống lên men có thể được kiểm soát các thông số như: nhiệt độ, oxy, pH.

Trong hệ thống lên men gián đoạn, mọi thông số của quá trình lên men đều biến động:

nồng độ cơ chất, nồng độ gam sinh khối, nồng độ sản phẩm...[57]. Tuy vậy, lên men gián

đoạn dễ kiểm soát và thường phải sử dụng khi quá trình yêu cầu phải tiệt trùng nghiêm

ngặt. Trong quá trình lên men gián đoạn chủng đột biến A. tumefaciens KCCM 10413 hàm

lượng CoQ10 thu nhận được là 320 mg/l, hiệu suất đạt 6,61 mg/g sinh khối [34]. Cheong

và cộng sự lên men gián đoạn chủng A. tumefaciens tái tổ hợp hàm lượng CoQ10 thu được

là 280,2 mg/l, hiệu suất đạt 5,47 mg/g sinh khối [16].

1.5.2. Lên men gián đoạn có bổ sung dinh dƣỡng (Fed – batch)

Lên men gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng (Fed – bath) hay còn gọi là lên men bán

liên tục là dạng lên men nằm giữa lên men gián đoạn và lên men liên tục. Trong lên men

dạng này, quá trình lên men được khởi động tương tự như lên men gián đoạn, sau một thời

gian nhất định, chất dinh dưỡng sẽ được bổ sung vào trong hệ thống lên men. Fed-batch có

thể được thực hiện nhiều cách khác nhau: thay thế hoàn toàn môi trường dinh dưỡng của

canh trường (tiến hành lên men đạt đến mức độ nhất định-bao gồm dinh dưỡng trong môi

trường được tiêu thụ - môi trường cũ sẽ được rút ra và thay vào đó môi trường mới với đầy

14

đủ các chất dinh dưỡng mới; hoặc bổ sung thêm vào hệ thống lên men chất dinh dưỡng

mới nhằm mục đích giữ cho sinh khối của vi sinh vật trong hệ thống lên men ở trạng thái

ổn định khi sinh khối tế bào đạt đến một giới hạn nhất định nào đó. Chiến lược này cho

phép vi sinh vật phát triển với một tốc độ tăng trưởng như mong muốn, hạn chế tối đa sự

tạo thành các sản phẩm phụ không mong muốn, và cho phép đạt được mật độ tế bào cao và

nồng độ sản phẩm lớn. Trong quá trình lên men chủng đột biến A. tumefaciens KCCM

10413, đường sucrose được bổ sung trong lên men bán liên tục làm tăng hàm lượng

CoQ10 (458 mg/l) so với lên men gián đoạn là 320 mg/l [34]. Đối với A. tumefaciens tái

tổ hợp quá trình lên men fed-batch có bổ sung đường sucrose cho CoQ10 đạt 352,6 mg/l

gấp 1,25 lần so với quá trình lên men gián đoạn đạt 280,2 mg/l [16]. Trong khi đó chủng E.

coli tái tổ hợp có chứa gen dps mã hóa cho decaprenyl diphosphatte synthase từ

Gluconobacter suboxydans trong quá trình lên men gián đoạn có bổ sụng đường glucose

cho hàm lượng CoQ10 vượt trội so với lên men gián đoạn (25,5 mg/l so với 0,97 mg/l)

[73].

Vì vậy, lên men fed-batch vượt trội hơn so với lên men gián đoạn, vì nó cho phép duy

trì được mật độ tế bào mong muốn và sản xuất sản phẩm lớn mà không tạo ra các sản phẩm

ức chế cho quá trình lên men.

1.6. TÁCH CHIẾT VÀ ĐẶC TÍNH COENZYME Q10

1.6.1. Tách chiết Coenzyme Q10

1.6.1.1. Phương pháp tách chiết sử dụng phương pháp phá vỡ tế bào bằng tác

nhân cơ học

 Phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm

Tian (2010) tiến hành thu nhận CoQ10 từ chủng A. tumefaciens 1.2554 theo quy

trình: sinh khối sau ly tâm bổ sung đệm 2mM Tris HCl (pH 7.5), tiến hành siêu âm (12

giây on, 10 giây off) năng lượng sóng siêu âm 500W, tổng thời gian siêu âm 12 phút. Thể

tích nước sử dụng là 40 mL/g sinh khối. Bổ sung Petroleum ether tỉ lệ 1:1, vortex thu pha

trên, lặp lại bước chiết 2 lần. Tiến hành làm khô, hòa tan CoQ10 trong 100% ethanol [90].

 Phá vỡ tế bào bằng hạt thủy tinh

Yoshida cũng tiến hành thu nhận CoQ10 từ 3 chủng vi khuẩn A. tumefaciens Y-

3085 (ATCC4452), P. denitrificans KY-3940 (ATCC19367) và R. sphaeroides KY-4113

(FERM-P4675) bằng phương pháp như sau: 5 ml dịch nuôi cấy vi sinh vật bổ sung 6 ml n-

15

propanol, 10 ml n-hexane và 5 g hạt thủy tinh được khuấy trộn 15,000 rpm trong 5 phút để

chiết xuất CoQ10 từ tế bào. Chiết xuất 2 lần bằng 3 ml hexane, làm khô và hòa tan trong

dioxane [99].

1.6.1.2. Phương pháp tách chiết sử dụng phương pháp phá vỡ tế bào không bằng

tác nhân cơ học

 Tách chiết bằng dung môi

Prafull Ranadive và cộng sự (2011) đã tiến hành thu nhận CoQ10 từ chủng

Sporidiobolus johnsonii ATCC 20490. 20 ml dịch nuôi được ly tâm 1000 vòng/phút trong

20 phút để thu sinh khối. Để chiết CoQ10, sinh khối được bổ sung 20 ml 100% ethanol lắc trong nước 60oC trong 3 giờ. Tế bào được loại bỏ bằng phương pháp ly tâm và thu dịch,

ethanol được chiết lại với 20 ml n-hexane. Thu lấy pha n-hexane có chứa CoQ10, cô đặc

tới 1 ml và đưa vào sắc ký để định lượng [75].

Narendra và cộng sự tiến hành thu nhận CoQ10 từ S. cerevisiae như sau: sinh khối ướt tế bào được ủ với ethanol tỷ lệ (1:5) ở 60oC trong 1 giờ. Chiết xuất lặp lại 3 lần bằng n-

hexane [66].

Theo Kiên (2010) CoQ10 từ R. sphaeroides đột biến được thu nhận theo phương pháp sau: 10 g sinh khối ướt được hòa trong 70 ml methanol, ủ 55oC trong 5 phút. Bổ sung 140 ml chloroform và khuấy ở 30oC trong 20 phút, sau đó được lọc qua giấy lọc (Whatman

no.1). Bổ sung NaCl (0.58%, w/v) bằng 1/5 so với thể tích dịch lọc. Dịch lọc và dung dịch

muối NaCl được đảo trộn, để yên, thu pha dưới, làm khô và hòa tan lại trong ethanol [67].

 Tách chiết bằng axit kết hợp với dung môi

CoQ10 được tách chiết từ S. pombe theo phương pháp biến đổi của Cheng và cộng sự. Các tế bào được xử lý với 3M HCl, khuấy ở 90oC trong 80 phút. Sau khi bổ sung dung

dịch NaOH để duy trì pH 7, tế bào được chiết ở nhiệt độ phòng trong 2,5 giờ với acetone. Hỗn hợp này được ly tâm và thu pha trên, làm khô bằng bay hơi chân không ở 30oC. Hòa

tan CoQ10 trong petroleum ether [15].

Tian (2010) cũng tiến hành nghiên cứu phá vỡ tế bào bằng axit HCl. Thí nghiệm

được thực hiện như sau: sinh khối sau ly tâm bổ sung axit HCl 3M với tỷ lệ 10.8 ml/g sinh khối, ủ 85oC trong 35 phút. Bổ sung petroleum ether (tỉ lệ 1: 2 so với dịch nuôi), vortex thu

pha trên, lặp lại bước chiết 2 lần. Tiến hành làm khô, hòa tan CoQ10 trong ethanol [90].

16

 Phƣơng pháp phá vỡ tế bào bằng enzyme

Theo Ha và cộng sự (2007b), khi thực hiện với chủng A. tumefaciens KCCM 10413

sinh khối được bổ sung dung dịch ly giải tế bào Cellytic B, ủ 30 phút, bổ sung hỗn hợp

dung môi propanol và n-hexane (3:5) vào dịch ly giải tế bào và khuấy mạnh. Chiết thu pha

trên sau đó đem cô đặc, hòa tan trong ethanol [34].

Dung giải bằng enzym cũng được Zahiri và cộng sự lựa chọn. Lysozym thường thủy

phân liên kết β (1-4) glucosid của các peptidoglucan vốn tạo ra độ cứng cho tế bào vi

khuẩn Gram dương và Gram âm. Lysozym thường được liên kết với EDTA để tạo phức

với canxi sẽ làm giải phóng các lipopolysacarit và phá hủy tế bào đặc biệt là vỏ tế bào vi

khuẩn gram âm. Nhóm nghiên cứu tách CoQ10 từ các tế bào E. coli tái tổ hợp theo phương

pháp sau: sinh khối sau ly tâm bổ sung dung dịch ly giải tế bào [8% sucrose, 5%, Triton X- 100, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM EDTA (pH 8.0) và 1 mg/ml of lysozym] ủ 37oC

trong 30 phút. Bổ sung n-hexane: n-propanol (5:3) (tỉ lệ 1: 2 so với dịch nuôi), thu pha

trên, lặp lại bước chiết 2 lần. Cô đặc, và hòa tan sản phẩm trong ethanol [102].

Theo Choi (2005), tế bào A. tumefaciens ATCC4452 được thu bằng ly tâm 13,000

rpm. Sau đó được rửa bằng nước vô trùng và rửa lại bằng đệm 20 mM Tris-Cl (pH 7.5). Tế

bào được hòa tan trong 450 µl Cell Lytic B trộn với 50 µl lysozyme (10 mg/ml) và ủ ở

nhiệt độ phòng trong 20 phút. Để chiết xuất CoQ10, 900 µl hexane và n-propanol (5:3)

được bổ sung vào 500 µl dịch phân giải tế bào. Sau đó vortex trong 5 phút, thu pha trên, bổ

sung 600 µl hỗn hợp dung môi để chiết xuất lần nữa. Làm khô dung môi trong 120 phút,

hòa tan bằng 100% ethanol. Park (2005) và Zhang D (2007) cũng tiến hành thu nhận

CoQ10 từ E. coli tái tổ hợp theo phương pháp trên [73, 104].

1.6.2. Tinh sạch Coenzyme Q10

CoQ10 được sản xuất theo một trong 3 phương thức như sau: tách chiết từ mô động

vật, sinh khối vi sinh vật và tổng hợp hóa học. Quá trình sản xuất được thực hiện bởi các

bước tách chiết phức tạp sử dụng các dung môi hữu cơ khác nhau và tinh sạch. Quá trình

tinh sạch có thể được thực hiện bằng phương pháp chiết với dung môi, sắc ký hấp phụ trên

cột silica và tái kết tinh,…. Cao và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu phương pháp sắc ký

ngược dòng tốc độ cao (HSCCC). Một hệ dung môi hai pha khan bao gồm heptane-

acetonitrile-dichloromethane (12:7:3.5; v/v/v) được lựa chọn cho phân tích HSCCC và

được sử dụng để tinh sạch CoQ10 từ 500 mg dịch chiết thô. Hiệu suất tinh sạch đạt được là

130 mg với độ tinh sạch HPLC đạt được là 99%. Hiệu suất tinh sạch (bao gồm % tinh

17

sạch, % thu hồi) bằng phương pháp HSCCC cao hơn so với phương pháp sắc ký cột. Tuy

nhiên, phương pháp HSCCC đã sử dụng các dung môi độc như dichloromethane và được

thực hiện bởi một thiết bị đặc biệt chuyên dụng [11]. Đối với phương pháp chiết pha rắn

đây là một phương pháp dùng để làm sạch và cô đặc các hợp chất. Rodriguez-Acuna và

cộng sự (2008) đã công bố kết quả tinh sạch CoQ9 và CoQ10 từ dầu thực vật bằng phương

pháp sử dụng chất nền SPE aminopropyl sử dụng hệ dung môi rửa giải heptanes:ethyl ether

(80:20, v/v). Kỹ thuật này có thể loại bỏ triacylglycerides [78]. Hagerman và cộng sự

(2001) đã sử dụng SPE để tinh sạch CoQ6 từ Saccharomyces cerevisiae (nấm men bia)

bằng cách sử dụng silica gel như là một chất hấp phụ và hỗn hợp dichloromethane và

hexane (2.5:1, v/v) làm hệ dung môi rửa giải. Tinh sạch pha rắn này có thể loại bỏ

ergosterol và các dẫn xuất ergosterol và giảm thời gian lưu trong quá trình phân tích từ 70

phút xuống còn 15 phút [35]. Silica gel cũng đã được sử dụng để nghiên cứu tinh sạch các

hợp chất ubiquinone như CoQ9, CoQ10 trong canh trường nuôi cấy tế bào thực vật sau khi

được chiết với chloroform và methanol [39].

Sắc ký cột thường được sử dụng với nhiều ưu điểm để tinh sạch lượng nhỏ hỗn hợp

hữu cơ. Nguyên lý của nó là dựa vào phân đoạn cấu tử cần phân tích giữa pha cố định và

pha linh động. Hiệu quả phân tách phụ thuộc vào kiểu chất hấp phụ và hệ dung môi. Đối

với việc chọn một dung môi sử dụng làm dung môi rửa giải, cần phải xem xét đến khả

năng hòa tan của các cấu tử phân tách trong dung môi đó và việc dễ dàng loại bỏ nó ở giai

đoạn sau. Các phân đoạn sau khi được rửa giải thường được đo bằng UV hoặc ánh sáng

thường và sắc ký bản mỏng thường được sử dụng để xác định các thành phần trong đó.

1.6.3. Đặc tính của Coenzyme Q10

1.6.3.1. Bảo quản Coenzyme Q10

CoQ10 rất nhạy cảm với ánh sáng [26, 98]. Vì vậy, để bảo quản CoQ10 cần tránh ánh

sáng trong suốt quá trình sản xuất và lưu giữ. Để cải thiện độ hòa tan, độ bền với ánh sáng

và một số đặc tính của CoQ10 đã có rất nhiều những nghiên cứu bao gồm bao gói CoQ10

trong carbohydrate như gum arabic, β – cylodextrin và ϒ – clyclodextrin [10, 27, 98], kết

hợp với poly (methyl methacrylate), trong hạt nano [48] và dạng thuốc bán nhũ tương hóa

CoQ10 [70]. Dạng đóng gói siêu vi CoQ10 trong gum arabic được tiến hành với dầu dừa

và muối sodium stearoyl lactylate sử dụng như là chất nhũ hóa trong khi dạng bao gói

CoQ10 với cyclodextrins được tiến hành tạo phức với nước. Dạng thuốc bán nhũ tương

hóa CoQ10 được chuẩn bị bằng cách sấy phun hệ nhũ hóa gồm CoQ10, glycerin, este của

18

đường sucrose với axit béo và hyroxypropyl cellulose. Tuy nhiên việc sử dụng

cyclodextrin như là một chất ổn định dường như là một phương pháp đầy hứa hẹn để bảo

quản CoQ10 một cách dễ dàng và đầy hiệu quả.

 β – cyclodextrin

β – cyclodextrin là hợp chất được tạo thành từ các phân tử đường liên kết với nhau

trong một vòng cyclic oligosaccharides. β – cyclodextrin gồm 7 đơn vị α-D-

glucopyranoside liên kết tạo thành [7, 92].

Hình 1.5. Cấu tạo của β – cyclodextrin

 Ứng dụng của β – cyclodextrin

β – cyclodextrin có nhiều ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm cũng như thực

phẩm. Trong công nghiệp thực phẩm, β – cyclodextrin giúp ổn định các hợp chất dễ bay

hơi, giảm mùi hôi và khẩu vị không mong muốn. Phức β – cyclodextrin với một số

carotenoid đã được chứng minh là làm tăng cường màu sắc, làm tăng độ hòa tan trong

nước và cải thiện sự ổn định ánh sáng. β – cyclodextrin còn được sử dụng để loại bỏ

cholesterol. Trong công nghê dược và thực phẩm chức năng, do có cấu tạo hình nón, bên

trong kị nước, bên ngoài ưa nước nên β – cyclodextrin có thể tạo phức với các hợp chất kị

nước. Do đó, có thể nâng cao khả năng hòa tan và hoạt tính sinh học của các hợp chất [7,

27, 92].

19

1.6.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Theo Kommuru và cộng sự (2001) đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính của CoQ10 trong vòng 16 tháng ở các nhiệt độ 37, 45 và 55oC. Kết quả thu được là ở nhiệt độ 45 và 55oC có tổn thất CoQ10, trong khi CoQ10 tương đối ổn định ở 37oC.

Kommuru cho rằng CoQ10 khá ổn định ở nhiệt độ phòng CoQ10 vẫn còn 90% hoạt tính

sau 6,3 năm [44].

Fir và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng CoQ10. Kết quả cho thấy ở nhiệt độ cao 80oC và giữ trong tối sau 92 giờ hàm lượng CoQ10 bị tổn thất 3,7%.

Còn theo dõi ở điều kiện nhiệt độ phòng nhóm tác giả thấy rằng hàm lượng CoQ10 hầu

như không thay đổi.

Trong khi đó khi CoQ10 được tạo phức với cyclodextrin thì độ bền của CoQ10 tăng lên nhiều so với CoQ10 tinh khiết. Sau 120 phút ở nhiệt độ 80oC và bị chiếu sáng bởi tia

cực tím CoQ10 tinh khiết bị phá hủy khoảng 72,3% trong khi đó với việc tạo phức với ϒ –

cyclodextrin CoQ10 chỉ bị phá hủy khoảng 35,1%. CoQ10 được bảo vệ tốt nhất khi tạo

phức với β – cylodextrin, hàm lượng CoQ10 bị tổn thất chỉ khoảng 20% khi có sự kết hợp

chiếu sáng UV và ở nhiệt độ cao [27].

1.6.3.3. Ảnh hưởng của ánh sáng

Trong nghiên cứu của Fir và cộng sự về độ bền của CoQ10 dưới ánh sáng của tia cực

tím, nhóm nghiên cứu nhận thấy rằng CoQ10 bị phá hủy 27,7% dưới ánh sáng của tia cực

tím sau 120 phút ở nhiệt độ phòng. Trong khi CoQ10 tạo phức với β-cyclodextrin thì

CoQ10 gần như không bị tổn thất dưới tác dụng của tia cực tím ở nhiệt độ phòng. Tuy nhiên ở nhiệt độ 80oC khoảng 72,3% CoQ10 bị tổn thất dưới tác dụng của tia cực tím. Một

số nghiên cứu trước đây cũng cho thấy CoQ10 bị nhạy cảm với ánh sáng và bị phân hủy

đến 80% sau 15 ngày chiếu sáng bởi ánh sáng tự nhiên. Molyneux (2006) cho rằng CoQ10

bị nhạy cảm với ánh sáng và bị phân hủy gần như hoàn toàn sau 24 giờ tiếp xúc với ánh

sáng (ánh sáng huỳnh quang), trong khi đó CoQ10 được bảo vệ tránh ánh sáng (gói trong

giấy nhôm) thì hàm lượng không thay đổi. Vì vậy cần bảo vệ mẫu khỏi ánh sáng trong quá

trình tách chiết là rất cần thiết. Khi tiến hành định lượng CoQ10 có thể được tiến hành

trong điều kiện ánh sáng bình thường của phòng thí nghiệm với thời gian không quá 2 giờ

[63].

20

1.6.3.4. Tính hòa tan

CoQ10 không tan trong nước, chỉ tan trong dung môi hữu cơ. Vì vậy, nhằm mục đích

cải thiện tính hòa tan trong nước đã có nhiều công trình nghiên cứu tạo phức CoQ10 với

cyclodextrin. Fir và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu khả năng hòa tan của CoQ10 với β, ϒ-

cyclodextrin tại các giá trị pH từ 2 – 6.5. Kết quả cho thấy khả năng hòa tan tương đối cao của CoQ10 tạo phức β, ϒ- cyclodextrin ở pH 6,5 và ở nhiệt độ 37oC [27].

1.7. CẢI BIẾN CHỦNG VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP COENZYME

Q10

1.7.1. Đột biến chủng

Để tăng cao hiệu quả sản xuất CoQ10, các phương pháp đột biến đã được áp dụng.

Phương pháp đột biến bằng tác nhân vật lý như dùng tia UV hoặc áp suất thủy tĩnh hoặc

bằng tác nhân hóa học như diethyl sulfate (DES) [101], N'-nitro-N-nitrosoguanidine

(NTG)[18]. Một số loại thuốc như L-ethionine (một chất tương tự L-methionine)

daunomycin và menadinone (vitamin K3) cũng được sử dụng để chọn lọc các chủng đột

biến.

Chủng đột biến A. tumefaciens AU-55 có thể sản sinh 180 mg CoQ10/l dịch lên men

trong 58 giờ với hàm lượng CoQ10 là 4,5 mg/g sinh khối khô. Chủng đột biến R.

sphaeroides Co-22-11 có thể sản xuất CoQ10 được 346,8 mg/l với hàm lượng 8,7 mg/g

sinh khối khô dưới điều kiện thông khí giới hạn [99].

Một số chủng đột biến khác như R. sphaeroides KACC 91339P [67], R. radiobacter,

S. johnsonii -ATCC 20490 [75], A. tumefaciens PK38 cũng cải thiện đáng kể hàm lượng

CoQ10 trong quá trình lên men [101].

Chủng đột biến A. tumefaciens ATCC 4452 cho hàm lượng CoQ10 cao hơn và giảm

độ nhớt do sự hình thành các polysaccharides sau khi tiến hành tối ưu hóa quá trình sản xuất CoQ10 với nồng độ đường 8%, 0.16 – 0,26% amoni, nhiệt độ 32 – 34oC, O2 0,84

mmol/l/1 phút. Hàm lượng CoQ10 thu được đạt 66 mg/l tương ứng 3,2 mg/g sinh khối

khô.[46]

1.7.2. Chủng tái tổ hợp

Để đáp ứng nhu cầu ứng dụng CoQ10 đang gia tăng mạnh, bên cạnh việc nghiên cứu

nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp CoQ10 của các chủng tự nhiên hoặc chủng đột biến bằng

21

các biện pháp thay đổi điều kiện lên men, đột biến hóa học, một giải pháp có hiệu quả là

tạo các chủng tái tổ hợp. Trình tự nguyên vẹn hoặc cải biến của các gen tăng cường quá

trình tổng hợp CoQ10 được đưa vào vật chủ không sinh độc tố, đã được nghiên cứu kỹ các

đặc tính và dễ dàng điều khiển quá trình biểu hiện gene ngoại lai. Phương pháp đang được

nghiên cứu nhiều là đưa các gen mã hóa các enzym chìa khóa của quá trình tổng hợp

CoQ10 vào các chủng vi sinh vật tái tổ hợp.

Một số chiến lược cải biến di truyền để nâng cao khả năng sinh tổng hợp CoQ10 ở vi

sinh vật như sau:

Con đƣờng MEP

Tăng cƣờng biểu hiện các gen con đƣờng MEP

Con đƣờng MVA Tăng cƣờng tiền chất IPP

Thêm các gen con đƣờng MVA

Chorismate FPP

Tăng cƣờng biểu hiện gen pHBA

- Knockout octaprenyl diphosphate synthase (ispB) - Tăng cƣờng biểu hiện DPS

pHBA DPP

Decaprenyl pHBA

Tăng cƣờng biểu hiện gen ubi

Tăng cƣờng sinh tổng hợp CoQ10

Hình 1.6. Các phương pháp điều khiển trao đổi chất để tăng sản xuất CoQ10 ở vi sinh vật [30]

22

1.7.2.1. Điều khiển trao đổi chất để tăng hàm lượng CoQ10 ở E. coli

Hầu hết các nghiên cứu để điều khiển con đường sinh CoQ10 được tập trung vào E.

coli vì vi khuẩn này rất phù hợp cho cải biến di truyền và lên men quy mô lớn (bảng 1.2).

Các enzym DPS và DXS được xem là các enzym quan trọng để sinh tổng hợp CoQ10

thông qua con đường MEP.

Quá trình tăng sự biểu hiện DXS làm tăng cường isopentenyl diphosphate (IPP) – tiền

chất . IPP synthase và FPP synthase thúc đẩy sinh tổng hợp tất cả E-FPP, là cơ chất allylic

của DPS, enzym điều khiển tổng hợp chiều dài chuỗi isoprene và cung cấp đuôi kỵ nước

dài. pHBA:polyprenyltransferase kết hợp với các nhóm đầu, đuôi và chuyển sản phẩm

phản ứng tới màng. Sự tăng cường biểu hiện hoạt tính của các enzym này và các chiều

hướng trao đổi chất sẽ là điều kiện thuận lợi cho các phương pháp sinh học trong hệ thống

sinh tổng hợp CoQ10. Ngoài ra một số thao tác di truyền có thể được thực hiện để sản xuất

CoQ10 trong E. coli tái tổ hợp: Biểu hiện tăng lên DPS từ các vi sinh vật sản xuất CoQ10,

ngừng biểu hiện octaprenyl diphosphate synthase (IspB) và biểu hiện tăng các gen của con

đường MEP hoặc MVA.

 Biểu hiện DPS ở E. coli

Enzyme DPS xúc tác phản ứng tổng hợp tiền chất IPP với allylic diphosphate là một

enzym quan trọng trong sinh tổng hợp đuôi decaprenyl ở CoQ10. Gen dps mã hóa cho

enzyme decaprenyl diphosphate synthase đã được thu nhận từ vi khuẩn, nấm men: S.

pombe, G. suboxydans, R. radiobacter, Rhodobacter capsulatus B10 [43, 68, 86, 102] và

A. tumefaciens, G. suboxydans, Leucosporidium scotti, P. denitrificans [50, 54, 86, 87].

Hầu hết các enzym DPS có sự tương đồng 30-50% với các polyprenyl diphosphate

synthase khác. Việc đưa gen mã hóa cho DPS được tách dòng từ một vi sinh vật sản xuất

CoQ10 là chiến lược chính được sử dụng để tạo biến chủng E. coli sản xuất CoQ10. Chiều

dài của đuôi isoprenoid của CoQ10 xác định bởi polyprenyl diphosphate synthase có mặt

trong sinh vật chủ này [69]. Ở E. coli, enzym octaprenyl diphosphate synthase (IspB) xúc

tác sự hình thành của octaprenyl diphosphate và lượng nhỏ hơn các prenyl diphosphate

ngắn hơn. Theo đó, dạng CoQ chính có mặt ở E. coli là CoQ8, và một số dạng nhỏ hơn từ

CoQ1 đến CoQ7. E. coli biểu hiện DPS của P. denitrificans (PdDPS) sản xuất CoQ10, bên

cạnh sản xuất CoQ8. Hơn nữa, tỷ lệ sản xuất CoQ10:CoQ8 phụ thuộc vào mức độ biểu

hiện của PdDPS [87]. Do đó, các chủng E. coli biểu hiện DPS ngoại lai sản sinh CoQ10,

bên cạnh việc sản xuất ở nhiều mức độ khác nhau CoQ8 và CoQ9, phụ thuộc vào mức độ

biểu hiện của DPS. Tuy nhiên, DPS của những vi khuẩn nhất định cho thấy sự đặc hiệu

23

hơn hướng tới decaprenyl diphosphate. Ví dụ, khi DPS từ R. sphaeroides được biểu hiện ở

E. coli, nó thể hiện tính đặc hiệu cao hơn hướng tới decaprenyl diphosphate so với DPS từ

A. tumefaciens [102]. Vì thế, việc tách dòng các enzym DPS với tính đặc hiệu sản phẩm

tuyệt đối, với mục tiêu thu được các chủng E. coli tái tổ hợp có khả năng sinh CoQ10 cao,

có thể là phương pháp tốt để tăng sản lượng CoQ10. Gần đây, các nghiên cứu quá trình lên

men trong sản xuất CoQ10 được thực hiện với E. coli tái tổ hợp chứa dps từ G.

suboxydans [73]. Lên men gián đoạn với lượng glucose hạn chế thu được nồng độ cuối

cùng: 103 g/L, 255 mg/l CoQ10, và 0,29 mg CoQ10/g sinh khối. Lượng ít thành phần

CoQ10 đặc hiệu này có thể được cải thiện bằng việc sử dụng kỹ thuật điều khiển trao đổi

chất của các con đường tổng hợp tiền chất. Hai phương pháp được nghiên cứu: Tăng chiều

tạo thành các tiền chất isoprenoid và tăng biểu hiện các gen ubi được lựa chọn tham gia

vào con đường sinh tổng hợp CoQ [102, 107]. Sản xuất CoQ10 cũng được báo cáo ở E.

coli tái tổ hợp mang gen dps từ A. tumefaciens [102].

Gen dps và dxs cũng được thu nhận đồng thời từ R. radiobacter, G. suboxydans, P.

aeruginosa và đồng biểu hiện trong làm tăng hàm lượng CoQ10 đạt 46,1 mg/l trong điều

kiện lên men fed – bath.

 Tăng biểu hiện các gen của con đƣờng MEP ở E. coli

Một phương pháp khác để tăng sản xuất CoQ10 trong E. coli tái tổ hợp là đồng biểu

hiện enzym DXS, xúc tác cho phản ứng tổng hợp giữa glyxcraldehyde-3-phosphate (GAP)

và pyruvate. Phản ứng này là bước đầu tiên của con đường MEP ở E. coli. DXS thực hiện

một vai trò điều hòa quan trọng trong con đường MEP để tổng hợp tiền chất IPP. Có nhiều

nghiên cứu chứng minh sự tăng lên đáng kể hàm lượng CoQ10 bằng cách tăng biểu hiện

DXS, nên việc tăng lượng IPP thông qua đồng biểu hiện DXS được mong đợi làm tăng quá

trình sản xuất CoQ10, mà sử dụng IPP như là một tiền chất để tổng hợp mạch nhánh

CoQ10. Để tăng hàm lượng CoQ10, DXS của Pseudomonas aeruginosa được đồng biểu

hiện trong một chủng E. coli tái tổ hợp, đồng thời mang gen dps từ G. suboxydans. Sự biểu

hiện gen dps này làm chuyển hóa hoàn toàn IPP ở E. coli. Sự tăng lên của lượng enzyme

DXS thông qua biểu hiện gene dxs của P. aeruginosa đã tạo ra lượng IPP gấp xấp xỉ 2 lần

lượng IPP đã chuyển hóa và làm tăng hàm lượng CoQ10. Nồng độ CoQ10 lớn nhất (46,1

mg/l) đạt được từ nhân nuôi gián đoạn với lượng hạn chế glucose của chủng E. coli tái tổ

hợp biểu hiện đồng thời 2 gen dps và dxs [43].

24

 Biểu hiện các gene con đƣờng MVA ngoại lai vào E. coli

Do E. coli chỉ có khả năng tổng hợp CoQ10 theo con đường MEP nên có một chiến

lược mới làm tăng cường khả năng sản xuất CoQ10 đó là đưa các gene ngoại lai của con

đường MVA vào E. coli. MVA là một chất trung gian quan trọng trong con đường MVA

và nó không được sản xuất hay sử dụng bởi chủng E. coli tự nhiên. Việc thêm vào con

đường MVA có lợi thế làm tăng nguồn cung cấp IPP trong các chủng E. coli tái tổ hợp sản

xuất CoQ10 này. Toàn bộ con đường MVA được phân chia thành con đường MVA trên

và dưới. Con đường MVA dưới chuyển MVA thành IPP và DMAPP thông qua 4 bước xúc

tác enzym với MVA kinase, phospho-MVA kinase, MVA diphosphate decarboxylase và

IPP isomerase. Con đường MVA trên biến đổi 3 phân tử acetyl-CoA thành MVA trong 3

bước xúc tác enzym với acetyl-CoA thiolase, HMG-CoA synthase, và HMG-CoA

reductase. Yoon và cộng sự (2006) đã kết luận rằng sản xuất lycopene ở E. coli tăng vài lần

khi sử dụng con đường MVA dưới của S. pneumoniae với nguồn bổ sung bên ngoài MVA.

Zahiri và cộng sự (2006) chỉ ra rằng việc thêm vào một con đường MVA ngoại lai làm

tăng nguồn cung IPP ở các chủng E. coli sản xuất CoQ10. Nửa dưới con đường MVA của

S. aureus, S. pyogenes, S. pneumoniae, Enterococcus faecalis, và S. cerevisiae đã được

kiểm tra. Con đường này của S. pneumoniae tạo ra sản lượng CoQ10 là 2,70 mg/g sinh

khối khô khi được bổ sung 3 mM MVA ngoại lai. Nửa con đường trên của vi khuẩn này

được sử dụng để tạo nên con đường MVA hoàn chỉnh. Con đường MVA ngoại lai này có

thể chuyển acetyl-CoA nội sinh thành IPP, dẫn đến sự sản xuất CoQ10 với sản lượng lên

tới 2,43 mg/g sinh khối khô, không cần bổ sung MVA ở E. coli DH5α tái tổ hợp chứa 3

plasmid mã hóa cho các enzym của con đường MVA trên (phbA, mvaS và mvaA) và dưới

(mvaK1, mvaK2, và mvaD cùng với idi) và DPS. Ngược lại, một con đường MVA đầy đủ

được cấu trúc trong một operon đơn kém hiệu quả hơn với sản lượng CoQ10 lên tới 1,71

mg/g sinh khối khô, cao hơn 1,9 lần so với khi sử dụng một gene dps. Chủng E. coli tái tổ

hợp này sản xuất CoQ10 và lượng nhỏ CoQ9, bên cạnh lượng CoQ8 xuất hiện tự nhiên.

CoQ9 được sản xuất có thể là kết quả của sự giải phóng chưa hoàn toàn một đoạn của các

chuỗi polyprenyl đang kéo dài từ DPS của A. tumefaciens.

Một số gen mã hóa cho các enzyme trong quá trình tổng hợp mạch nhánh CoQ10 theo

con đường MVA (Mevalonate pathway) như mvaK1, mvaD, mvaK2 được thu nhận từ vi

khuẩn như S. aureus , S. pneumoniae, S. pyogenes và nấm men như S. cerevisiae được kết

hợp với gen idd đã được biểu hiện đồng thời trong E. coli cho hàm lượng CoQ10 đạt 2700

µg /g sinh khối. Trong khi đó gen phbA được thu nhận từ Ralstonia eutropha ATCC 43123

25

kết hợp với gen mvaA, mvaS được thu nhận từ S. pneumonia được biểu hiện trong E. coli

cho hàm lượng CoQ10 thấp hơn đạt 2,4 mg / g sinh khối. Tuy nhiên, với việc đưa đồng

thời tất cả các gen mvaK1, mvaD, mvaK2, idd, phbA và gen mvaA, mvaS vào vector

pSTV28 biểu hiện trong E. coli hàm lượng CoQ10 chỉ đạt 1,7 mg/ g sinh khối [102].

Gần đây, Choi và cs (2009) đã kết luận rằng loại bỏ gen ispB và tăng cường biểu hiện

gene dps từ A. tumefaciens làm giảm thiểu sự sản xuất các CoQ khác và do đó cải thiện

hàm lượng CoQ10 của E. coli tái tổ hợp. Hơn nữa, đồng biểu hiện gen dxs làm tăng thành

phần đặc hiệu của CoQ10 từ 0,55-0,89 mg/g sinh khối khô thành 1,40 mg/g sinh khối khô.

Lên men gián đoạn E. coli BL21(DE3)_ispB/pAP1 + pDXS được thực hiện ở một môi

trường xác định để sản xuất lượng lớn CoQ10. pAP1 là một vector biểu hiện gen dps. Cuối

cùng, nồng độ CoQ10 là 99,4 mg/l, hàm lượng CoQ10 là 1,41 mg/g sinh khối khô và sản

lượng là 3,11 mg/l/h thu được sau lên men 33 giờ [17].

 Tăng biểu hiện các gen của con đƣờng chorismate

Zhu và cộng sự (1995) đã làm tăng quá trình sản xuất CoQ ở E. coli bằng cách tăng

biểu hiện gen ubiA và ispB. E. coli mang các plasmid chứa ubiAC và ispB hoặc chứa CoQ2

và ispB sản xuất CoQ nhiều hơn so với chủng tự nhiên [107]. Barker và Frost (2001) đã

chứng minh một sản lượng cao pHBA ở E. coli tái tổ hợp bằng cách tăng cường lượng

carbon thành pHBA thông qua sự tăng biểu hiện của các enzym con đường chorismate,

trong khi loại bỏ sự sản xuất các axit amin thơm, mà cạnh tranh các tiền chất giống hệt.

Chiến lược này tạo ra lượng pHBA cao hơn so với mức bình thường của E.coli [8].

Bảng 1.2. Chủng chủ và hệ biểu hiện vi khuẩn được dùng để sinh tổng hợp CoQ10

Chủng chủ Nguồn gen Vector

E. coli DH5α Gen đƣợc biểu hiện ddsA pTrc99A Promoter TL TK [102]

A. tumefaciens ATCC 33970 E. coli W3110 (ATCC 27325) R. capsulatus B10 Idd ddsA coli E. coli DH5α E. BL21(DE3)

coli ddsA, dxp G. suboxydans, P. aeruginosa trc T7 promoter, lac Lac [43] E. BL21(DE3)

coli ddsA G. suboxydans pET28a, pUC21, pMD18-T pACYC184 , pUCmod II pACYC184 Lac [73]

E. BL21(DE3) E. coli DH5α pSTV28 Lac [102] mvaK1, mvaD, mvaK2, idd

S. aureus ATCC 35556, S. pyogenes ATCC 12344, S. pneumoniae ATCC 6314, Enterococcus faecalis ATCC

26

E. coli DH5α 700802, S. cerevisiae S. pneumonia mvaS, Lac [102]

mvaA, phbA Dps dps, dxs [50] [83]

E. coli JM109 E. coli BL21(DE3) E. coli DH5α phbA eutropha ATCC Lac T7 promoter Lac [102]

E. coli DH5α pBBR1MC S2 pQE30 pET-28a, pET-32a pBBR1MC S2 pSTV28 Lac [102]

mvaK1, mvaD, mvaK2, mvaA, mvaS ,phbA, idd

A. tumefaciens (KFCC-10875) R. radiobacter ATCC 4718 Ralstonia 43123 S. aureus ATCC 35556, S. pneumoniae ATCC 6314, Enterococcus faecalis ATCC 700802, S. Cerevisiae, mvaA, mvaS, phbA A. tumefaciens LBA4404 pET28a (+) Lac [104] Dps

dps + dxs tumefaciens BNQ 0605 Pgprx CamV35S [16] A. (KCCM-10554) tumefaciens 0605 E. coli BL21 (DE3) A. BNQ (KCCM-10554)

1.7.2.2. Điều khiển trao đổi chất để tăng hàm lượng CoQ10 ở A. tumefaciens

Bước quan trọng nhất trong quá trình tổng hợp CoQ10 ở con đường MEP (Non –

Mevalonate pathway) được coi là bước tổng hợp DPS (decaprenyl diphosphate synthase)-

mạch nhánh của CoQ10. Hơn nữa, DXS (1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase) cũng

tham gia quá trình tạo isopentenyl diphosphate- một tiền chất quan trọng để tạo nên mạch

nhánh CoQ10. Vì vậy, để nâng cao năng suất của CoQ10, cần phải đưa hai gene biểu hiện

dps và dxs vào tế bào vật chủ. Nếu chỉ tăng biểu hiện của gen dxs sẽ tạo ra đồng thời

CoQ8, CoQ9 do vậy khó cho quá trình tinh sạch. Vì vậy một trong những hướng nghiên

cứu triển vọng để tăng cường hàm lượng CoQ10 và thuận lợi cho quá trình tinh sạch

CoQ10 sau này đó là đồng biểu hiện gen dps và dxs trong tế bào chủ A. tumefaciens.

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu tạo chủng E. coli tái tổ hợp mang ít nhất một trong

hai gen dps và dxs [43, 79]. Tuy nhiên, hàm lượng CoQ10 ở các chủng E. coli tái tổ hợp

thường rất thấp (0,3 mg/g sinh khối khô) so với hàm lượng được sản xuất bởi các chủng vi

sinh khác như P. denitrificans (0,86 mg/g sinh khối khô), R. sphaeroides (2,6 mg/g sinh

khối khô) và A. radiobacter (2,6 mg/g sinh khối khô). Ngoài ra, các chủng E. coli tái tổ

hợp không chỉ tổng hợp CoQ10 mà còn tổng hợp cả CoQ8 và CoQ9. Đây là điều bất lợi

đặc biệt là khi sản xuất ở quy mô công nghiệp vì cần rất nhiều bước tinh sạch và hoàn

thiện sản phẩm [41, 50, 52].

A. tumefaciens là một trong những vi khuẩn đang được quan tâm để sản xuất CoQ10

do có nhiều ưu điểm. Sự tăng biểu hiện trực tiếp của các enzym quan trọng này trong

27

chủng công nghiệp này là cần thiết để sản xuất lượng lớn CoQ10. Sự tăng biểu hiện DXS ở

A. tumefaciens có thể cải thiện quá trình sản xuất CoQ10 do IPP là một tiền chất quan

trọng trong sản xuất CoQ10 và DXS là enzym bước đầu tiên để tổng hợp IPP ở vi khuẩn.

Lee và cộng sự (2004) cho rằng rằng sự tăng biểu hiện của gen dxs ở A. tumefaciens

KCCM 10413 mang lại hàm lượng CoQ10 (502,4 mg/l) và năng suất CoQ10 là 8,3 mg/g

sinh khối khô, cao hơn 21,9% và 23,9% tương ứng so với A. tumefaciens hoang dại. DXS

dường như tạo thành một bước có ảnh hưởng trong sinh tổng hợp CoQ10 của A.

tumefaciens, với sự sản xuất CoQ10 hiệu quả đầy tiềm năng bởi kỹ thuật điều khiển trao

đổi chất ở A. tumefaciens [50].

Các báo cáo về sản xuất CoQ10 ở các biến chủng E. coli biểu hiện DPS từ các vi

khuẩn khác cho thấy rằng lượng CoQ8 hoặc CoQ9 khác nhau cũng được sản xuất cùng với

CoQ10 phụ thuộc vào sự biểu hiện DPS [87, 102], điều này làm cho việc sản xuất CoQ10

và các quá trình tinh sạch từ E. coli tái tổ hợp trở nên không kinh tế. Do đó, một chiến lược

tốt hơn là tăng biểu hiện đồng thời của các gen dxs và dps ở một chủng sinh CoQ10.

Vector biểu hiện pGPRX chứa các gen dps và dxs của A. tumefaciens được thiết kế và biến

nạp vào A. tumefaciens sản xuất CoQ10. Các điều kiện nhân nuôi của A. tumefaciens

pGPRX như nhiệt độ, pH, không khí, và tốc độ khuấy được tối ưu hóa để sản xuất CoQ10

nhiều nhất. Với nồng độ tối ưu của cao ngô, ammonium sulfate, và oxy hòa tan, nồng độ

CoQ10 cao nhất 744,2 mg/l đạt được với thành phần CoQ10 đặc hiệu là 11,4 mg/g sinh

khối khô. Chính vì vậy, A. tumefaciens là vi sinh vật chủ sản xuất CoQ10 trong công

nghiệp đầy triển vọng.

Chủng gốc

Chủng chủ Gen biểu hiện Hàm lƣợng

E. coli DH5α ddsA Ghi chú (Điều kiện nuôi cấy) Bình tam giác

A. tumefaciens ATCC 33970 S. pneumonia E. coli DH5α mvaS, Bình tam giác

E. coli DH5a Bình tam giác TL TK [102 ] [102 ] mvaA, phbA mvaK1, mvaD, mvaK2+ idd CoQ10 900 µg/ g sinh khối 2,4 mg / g sinh khối 2,7 mg / g sinh khối

E. coli DH5 α g Bình tam giác 1,7mg/ sinh khối [102 ] phbA, mvaK1, mvaD, mvaK2,mvaA, mvaS, idd

700802, S. aureus, S. pyogenes, S. pneumoniae, Enterococcus faecalis, S. cerevisiae S. aureus ATCC 35556, pyogenes ATCC S. 12344, S. pneumoniae ATCC 6314, faecalis Enterococcus ATCC S. Cerevisiae, mvaA, mvaS,

28

E.coli DH5α ddsA, dxp 46,1 mg/l Fed-bath [43]

E.coli DH5α E. coli JM109 ddsA Dps 26 mg/l Fed-bath Bình tam giác [73] [50]

BL21 dps, dxs Bình tam giác [79] phbA G. suboxydans, P. aeruginosa G. suboxydans A. tumefaciens (KFCC-10875) R. radiobacter ATCC 4718 E.coli (DE3)

0,94 mg/g gấp 2,1 so với 1 gen ddsA 50,29 mg/l Fed-bath [83] A. tumefaciens LBA4404 E. coli BL21 Dps

Fed-bath [16] tumefaciens BNQ dps, dxs 642,1 mg/l, 7,30 mg/g A. 0605 (KCCM-10554) tumefaciens 0605 (DE3) A. BNQ (KCCM-10554)

1.7.2.3. Điều khiển trao đổi chất để tăng hàm lượng CoQ10 ở nấm men

Nấm men S. pombe cũng được sử dụng cho quá trình biểu hiện gen hmgR mã hóa (3-

hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, HMG-CoA reductase) để sản xuất CoQ10.

Vectơ sử dụng cho quá trình biểu hiện là pREPG có chứa promoter Pnmt1, terminator

Tnmt1 và marker LEU2. Promoter nmt1 cảm ứng bằng thiamine trong suốt quá trình nuôi

cấy. Kết quả hàm lượng CoQ10 tăng lên đến 2,68 và 3,09 lần ở các chủng nấm men tái tổ

hợp khi không có và có bổ sung axit arachidonic. Điều này cũng chứng minh axit

arachidonic có thể điều khiển các hoạt động của HMG-CoA reductase và gen hmgR đóng

vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp CoQ10 [15].

1.8. VAI TRÕ VÀ ỨNG DỤNG CỦA COENZYME Q10

CoQ10 được tìm thấy ở hầu hết các mô của con người nhưng với hàm lượng khác

nhau, bao gồm cả tim, thận và gan [71]. Hơn nữa từ những nghiên cứu đã được công bố,

nhiều nhà khoa học cho rằng sự suy giảm CoQ10 trong cơ thể con người có ảnh hưởng tới

tuổi thọ, một số bệnh mãn tính như bệnh tim mạch, ung thư, AIDS và một số bệnh di

truyền như bệnh thần kinh, bệnh bại liệt [23, 71, 72] . Do đó sự bổ sung CoQ10 từ các

nguồn thực phẩm hoặc bổ sung trực tiếp là một điều hết sức cần thiết để duy trì sức khỏe.

1.8.1. Vai trò của Coenzyme Q10

1.8.1.1. Vận chuyển điện tử và cung cấp năng lượng

Vai trò quan trọng nhất của coenzyme Q10 là vận chuyển điện tử giữa phức hợp I và

II, phức hợp II và III trong chuỗi vận chuyển điện tử, mà sản phẩm cuối cùng là adenosine

triphosphate (ATP). Quá trình này thường được gọi là sự hô hấp.

29

Cả dạng khử (quinol) và dạng ôxi hóa (quinone) của coenzyme Q có thể di chuyển dễ

dàng trong lớp màng lipid. Mỗi lượt coenzyme Q lấy một điện tử từ phức hợp I hoặc II và

phân tán vào trong lớp màng ti thể cho đến khi va chạm với phức hợp III - lúc đó điện tử

lại được chuyển cho phức hợp III. Chính sự khuếch tán của CoQ cùng với Cytochrome C

trong lớp màng ti thể đã đóng vai trò quan trọng trong việc luân chuyển các điện tử đến các

phức hợp kế nhau trong chuỗi chuyển điện tử [63].

Hình 1.6. Chuỗi vận chuyển điện tử

1.8.1.2. Chức năng chống oxy hóa

Ngoài vai trò quan trọng trong việc sản sinh năng lượng theo yêu cầu, CoQ10 còn là

một trong các chất chống oxy hoá tự nhiên được tìm thấy trong thiên nhiên. CoQ10H2 là

chất chống oxy hóa chỉ hòa tan trong lipid được tổng hợp trong các mô động vật invivo.

CoQ10H2 có thể hoạt động như một chất chống oxy hóa trực tiếp bằng cách chống lại tia

UV, ngăn ngừa sự peoroxy hóa lipid ty thể, hoặc gián tiếp, bằng cách tái chế α-tocopherol

(vitamin E). Bên cạnh đó, CoQ10 bảo vệ protein và các axit nucleic (DNA, RNA) khỏi sự

tiêu hủy của các gốc tự do. CoQ10 cũng ức chế collagenase- một loại enzyme phá hủy các

mô liên kết của da [29, 63].

Weber và cộng sự (2001) đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc uống 90 mg

CoQ10/ngày tới khả năng chống oxy hóa trên các đối tượng khỏe mạnh. Họ đã chỉ ra rằng

uống CoQ10 có thể làm giảm tốc độ của các phản ứng oxy hóa [94]. Theo Papas (1999)

chức năng oxy hóa của coenzyme Q10 xảy ra theo hai cơ chế sau:

- Chống oxy hóa dây chuyền và làm giảm các gốc peroxyl (ROO*) và alcoxyl

CoQH + ROO* → Q* + ROOH

30

- CoQ10 tương tác với gốc tự do vitamin E thông qua một phản ứng oxy hóa khử do đó

có khả năng tái tạo vitamin E và vitamin C cũng tương tự như thế.

CoQH + TO* → Q* + TOH

Vai trò dọn dẹp gốc tự do trong cơ thể sống của CoQ10 kém hiệu quả hơn so với

vitamin, tuy nhiên vai trò của coenzyme Q10 là một chất chống oxy hóa có khả năng tái

tạo vitamin E thực tế mới là quan trọng hơn [72]. Quinn và Fabisiak (1999) đã đề xuất vai

trò tiềm năng của CoQ10 trong việc tái tạo vitamin E diễn ra trong chuỗi vận chuyển điện

tử [74].

1.8.1.3. Truyền dẫn tín hiệu trong các tế bào

Sự tự oxy hóa của dạng trung gian CoQ10 được hình thành trong các màng tế bào

trong suốt quá trình vận chuyển điện tử có thể là một cơ sở chính cho sự hình thành hydro

peroxide. H2O2 kích hoạt các yếu tố phiên mã như NFKB tạo ra quá trình biểu hiện gen.

Peroxide cũng có thể tham gia vào truyền tín hiệu canxi trong cơ tim. Nó cũng có thể gây

ra các phản ứng oxy hóa dẫn đến ức chế các gen khác [22, 29, 56].

1.8.2. Ứng dụng của Coenzyme Q10

1.8.2.1. Ứng dụng trong y học

 Giảm nguy cơ về bệnh tim mạch

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng lợi ích của việc bổ sung CoQ10 giúp cải thiện

chức năng của tim mạch thông qua tăng cường sản xuất năng lượng, cải thiện sự co bóp

của cơ tim và đặc biệt ngăn ngừa sự oxy hóa của lipoprotein LDL (Cholesterol xấu).

Yalcin và cộng sự (2004) đã chỉ ra mối liên quan giữa nồng độ CoQ10 trong huyết tương

thấp và bệnh động mạch vành, vì họ thấy rằng nồng độ CoQ10 ở những bệnh nhân bị bệnh

động mạch vành (0.43 μmol/L) thấp hơn so với nhóm kiểm chứng (0.77 μmol/L) [97].

Munkholm và cộng sự (1999) đã điều trị bệnh nhân bị suy tim sung huyết với CoQ10 200

mg/ngày và thấy rằng có thể làm giảm nguy cơ về bệnh tim mạch [65]. Langsjoen và cộng

sự (1999) cho rằng việc duy trì nồng độ CoQ10 trong huyết tương (> 3.5 μg/mL) cùng với

cách bổ sung CoQ10 có thể cải thiện chức năng của tim [49].

Ngoài ra, Conklin (2000) cũng chứng minh trong quá trình hóa trị liệu, bệnh nhân cần

được cung cấp coenzyme Q10 bổ sung để ngăn chặn doxorubicin gây ra các bệnh về tim

[20]. Nghiên cứu cũng cho thấy khi sử dụng CoQ10 kết hợp với fenofibrate làm giảm đáng

kể huyết áp tâm thu và huyết áp tâm trương, giảm glycosylated hemoglobin (HbA1C), cải

31

thiện rõ rệt chức năng nội mô của động mạch cánh tay là một yếu tố liên quan tới nguy cơ

 Bệnh Parkinson

tim mạch [93].

Một số nghiên cứu cho thấy CoQ10 có thể đóng một vai trò quan trọng trong điều bệnh

Parkinson, cung cấp một tác nhân bảo vệ cho những bệnh nhân Parkinson. Đối với những

người bị bệnh Parkinson thì hàm lượng CoQ10 ở trong máu, tiểu cầu ở ty thể và huyết

tương có sự suy giảm đáng kể. Một số thử nghiệm đối với những người bị bệnh Parkinson

bổ sung CoQ10 hàng ngày với liều cao từ 1.200 - 3.300 mg kết hợp với 1.200 IU vi tamin

E cho thấy nồng độ CoQ10 bổ sung hàng ngày là 2.400 mg có thể là liều hiệu quả tối đá

trong điều trị bệnh Parkinson. Ngoài ra hoạt động của tiểu cầu ở ty thể của các phức hợp I-

III đã được tăng lên đáng kể đối với những bệnh nhân có sử dụng CoQ10 so với đối chứng.

 Chức năng miễn dịch

CoQ10 cũng có khả năng tăng cường hệ miễn dịch thông qua làm tăng cường hoạt

động của đại thực bào và làm tăng sinh bạch cầu hạt. Barbieri và cộng sự (1999) đã chỉ ra

rằng hàm lượng kháng thể của nhóm đối tượng sử dụng 90 mg và 180 mg CoQ10/ngày cao

hơn so với nhóm dùng thuốc an thần [82]. Trong một nghiên cứu ở động vật, thí nghiệm sử

dụng 150 – 750 μg CoQ10 trên chuột cũng cho thấy tăng cường sự hoạt động của tế bào và

hàm lượng kháng thể đã được cải thiện một cách đáng kể [37]. Sự giảm nồng độ CoQ10

trong máu đã được phát hiện ở các bệnh nhân mắc hội chứng suy giảm miễn dịch, AIDS

[72, 105]. Ngược lại, những người không có các triệu chứng bị HIV dương tính có nồng độ

CoQ10 trong máu bình thường. Nồng độ CoQ10 chỉ thấp hơn với các bệnh phức tạp liên

quan đến sự phát triển bệnh AIDS (ARC) và suy giảm hơn nữa khi phát triển thành AIDS.

Zhang và cộng sự (1997) cho rằng, việc bổ sung 200 mg CoQ10/ngày có thể trì hoãn sự

phát triển từ ARC tới AIDS và làm tăng tỷ lệ tế bào lympho T4/T8. Dựa trên những phát

hiện trên cho thấy coenzyme Q10 có thể làm tăng cường chức năng miễn dịch ở người

khỏe mạnh và ốm yếu [105].

 Điều trị bệnh ung thƣ

CoQ10 có vai trò quan trọng đối với hoạt động hô hấp và chức năng của tế

bào. Bất kỳ sự thiếu hụt hoặc suy giảm quá trình sinh tổng hợp CoQ10 có thể làm ảnh

hưởng chức năng tế bào. Do đó, điều mà chúng ta có thể theo dõi được đó là sự phân chia

bất thường của tế bào sẽ gây nên bệnh ung thư. Hodges và cộng sự (1999) cũng đã chỉ ra

rằng nồng độ CoQ10 ở những bệnh nhân bị ung thư vú, ung thư phổi và ung thu tuyến tụy

32

thấp hon so với những người bình thường. Một số báo cáo chứng mình rằng sử dụng liều

lượng 390 mg CoQ10 hàng ngày làm suy thoái khối u di căn và làm biến mất khối u từ 1

đến 3 năm sau đó, tùy từng trường hợp, di căn có thể không xuất hiên trở lại. Có thể cơ chế

của CoQ10 trong điều trị bệnh ung thư bao gồm tăng cường hệ thống miễn dịch và các

hoạt động chống oxy hóa. Vì vậy, việc nghiên cứu CoQ10 có thể là tiềm năng điều trị ung

thư [37].

 Điều trị một số bệnh khác

Chuổi vận chuyển điện tử tham gia trọn vẹn vào quá trình chuyển hóa carbohydrate.

Một số nghiên cứu cho thấy nồng độ CoQ10 ở các bệnh nhân tiểu đường type 2 thường

thấp hơn so với người bình thường và bằng cách bổ sung CoQ10 có thể dùng để điều trị

bệnh cơ tim – đái tháo đường lâm sàng [62, 93].

Mancini và cộng sự chứng minh mức độ CoQ10 cao trong tinh dịch của con người

tương quan với số lượng và khả năng vận động của tinh trùng. Nghiên cứu cho thấy đối với

các bệnh nhân có tinh trùng yếu được điều trị bằng 200 mg CoQ10 hàng ngày trong 6

tháng có thể làm tăng đáng kể nồng độ CoQ10 trong huyết tương tinh dịch và số lượng tế

bào tinh trùng đồng thời cải thiện khả năng vận động của tinh trùng so với với các giá trị

kiểm chứng [53].

Đối với những bệnh nhân bị hen suyễn có nồng độ CoQ10 trong huyết tương và trong

máu thấp hơn so với những người khỏe mạnh. Giả thuyết được đưa ra là nồng độ CoQ10

thấp có thể tạo sự mất cần bằng oxy hóa và ghóp phần vào tình trạng viêm niêm mạc mãn

tính. Trong một thử nghiệm trên 41 bệnh nhân bị hen phế quản, 120 mg CoQ10 kết hợp

với 400 mg vitamin E và 250 mg vitamin C được dùng cho bệnh nhân hen suyễn cùng với

liệu pháp chống hen suyễn chuẩn (hít corticosteroid, beta agonist) trong 32 tuần. Kết quả

cho thấy bệnh nhân dùng corticosteroid làm giảm nồng độ CoQ10 trong huyết tương và tạo

ra sự mất cân bằng oxy hóa [32].

Bệnh đau nửa đầu: Nghiên cứu cho thấy sự suy giảm quá trình chuyển hóa năng lượng

trong bộ não của những người mắc chứng đau nửa đầu. Rozen và cộng sự đã bổ sung 150

CoQ10 hàng ngày trong 3 tháng và đã làm giảm 50% số ngày bị đau nửa đầu và nhức đầu.

CoQ10 cũng được điều trị với các bệnh nhân bị suy thận và làm giảm hàm lượng

creatinine, tăng nhanh quá trình đào thải creatinin và lượng nước tiểu.

33

1.8.2.2. Trong mỹ phẩm

CoQ10 được bổ sung vào mỹ phẩm có tác dụng ngăn ngừa các nếp nhăn. Thí

nghiệm đã chứng minh rằng CoQ10 có thể hoạt động như một chất chống oxy hóa chống

lại tác động của hydro peroxide và tia UVA trong quá trình nuôi cấy tế bào biểu bì sừng và

nguyên bào sợi da.

CoQ10 có hiệu quả trong việc bảo vệ các tế bào sừng bởi sự phá hủy của tia UVA.

CoQ10 cũng có hiệu quả đáng kể trong việc giảm sự lão hóa cơ thể người bằng cách làm

giảm nếp nhăn thông qua khả năng làm tăng cường sức đề kháng của da, giảm sự lão hóa

da và dọn dẹp gốc tự do. Một nhóm nghiên cứu của Đức thấy rằng CoQ10 cũng ức chế

collagenase, một enzyme gây thiệt hại của các mô liên kết của da . CoQ10 có thể xâm nhập

vào lớp biểu bì, nơi mà có sự biến đổi từ dạng oxy hóa sang dạng khử và hoạt động như

một chất chống oxy hóa. Như chúng ta đã biết lớp biểu bì có hàm lượng tương đối cao

NADPH quinone reductase – tiền đề sản sinh ra CoQ10 dạng khử. Vì vậy, CoQ10 có thể

bảo vệ tế bào khỏi tác hại của tia UVA và khi sử dụng CoQ10 thì không có tác dụng phụ

như dị ứng. Hiện nay CoQ10 được kết hợp với retinoic acid dùng để điều trị bệnh lão hóa.

Tóm lại, những kết quả nghiên cứu CoQ10 biến thành một chất mỹ phẩm độc đáo để bảo

vệ da khỏi lão hóa sớm, sự hình thành nếp nhăn và tăng cường hoạt động của tế bào [28,

37].

34

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.1.1. Chủng vi sinh vật và p asmid

Các mẫu nốt sần cây hoa hồng được thu thập từ phường Tây Tựu và huyện Mê Linh,

Hà Nội.

Chủng A. tumefaciens EHA105 từ Viện Công nghệ Sinh học, VAST.

Các cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu tách dòng và biểu hiện:

Mồi xuôi (DpsF): 5‟-ATAGAGCTCATTGCCGCGCAAGGCGTCAGTT-3‟;

Mồi ngược (DpsR): 5‟-TTTGGATCCTCAGTTGAGACGCTCGATGCA-3‟.

Mồi xuôi (DxsF): 5‟-TAAGGATCCACGCATAGAACAGGCCAAAC-3‟;

Mồi ngược (DxsR): 5‟-ATTGTCGACTCAGCCGGCGAAACCGACGC-3‟;

Cặp mồi 16 S được sử dụng trong giải trình tự:

Mồi xuôi 27F: 5‟-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3‟;

Mồi ngược 1492R: 5‟TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3‟.

Các plasmid được sử dụng trong nghiên cứu này được thống kê trong bảng 2.1.

Bảng 2.1. Các plasmid sử dụng

Tên gọi Đặc điểm chính Kích thƣớc (bp) Nguồn

pCAMBIA1301 11837 CAMBIA, Mỹ Promoter lac Z alpha, gene kháng Kanamycin

pJet1.2/Blunt 2974 Scientific, Promoter T7, gene kháng Ampicilin Thermo Mỹ

2.1.2. Hóa chất

 Các hóa chất dùng trong phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn, nuôi cấy: Lactose,

sucrose, tryptone, peptone, cao nấm men, cao ngô, NaCl, MgSO4, Na2HPO4,

KNO3, agar của Merck, Trung Quốc.

 Hóa chất dùng để tách chiết DNA tổng số, điện di DNA, chạy HPLC...của hãng

Sigma, Merck: Tris base, Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA), CH3COOK,

β-mercaptoethanol, Sodium dodecyl sulphate (SDS), ethanol 70%, Chloroform:

isoamyalcohol (24:1), agarose, ethydium bromide (EtBr) của Merck, methanol,

ethanol – HPLC grade của Merck.

35

 Taq polymerase, bộ kit tách dòng, kit tinh sạch DNA „‟PureLink PCR purification

kit, các enzyme hạn chế sử dụng BamHI, SalI, SacI, PstI, NdeI của hãng Fermentas,

Invitrogen, New England, Thermo Scientific.

 β – cyclodextrin (1135 g/mol), 2,2-diphenyl-1-1picrylhydrazyl radical (DPPH),

CoQ10 (863 g/mol) của Sigma.

 Hóa chất để tách chiết CoQ10 như n-hexan, ethanol của Trung Quốc.

2.1.3. Thiết bị sử dụng

Bảng 2.2. Máy và thiết bị

Thiết bị H ng sản xuất (nƣớc

Cân phân tích CPA 324S Satorius, CHLB Đức

Nồi khử trùng Harayama, Nhật Bản

Sắc ký lỏng cao áp Agilent, Mỹ

ESCO Tủ cấy vô trùng Class II Type A2

Máy đo pH Mettler Toledo

Máy đọc khay vi thể Biorad, Mỹ

Máy ổn nhiệt DTU-2C Taitec, Nhật Bản

Máy lắc ổn nhiệt eppendorf Mỹ

Máy li tâm lạnh Eppendorf Legend X1R Thermo Fisher, Mỹ

Máy li tâm lạnh Falcol Sorval Legend X1R Thermo Fisher, Mỹ

Hệ thống điện di BioRad, Mỹ

Bộ điện di DNA (Advance Tech) Advance Tech

Máy soi chụp ảnh gel BioRad, Mỹ

Máy PCR Biorad, Mỹ

Máy cô đặc SPD 1010 Thermo Fisher, Mỹ

Máy sấy phun Spray Dryer BUCHI, Thụy Sỹ

Thiết bị lên men BIOSTAT B PLUS Satorius, Đức

36

Hệ thống cô quay R215 BUCHI, Thụy Sỹ

Máy siêu âm Misonix, Mỹ

Tủ lạnh sâu -20oC Sanyo, Nhật Bản

Tủ lạnh -80oC Thermo Fisher, Mỹ

Thermo Fisher, Mỹ Tủ lạnh Heracus +4oC

2.1.4. Môi trƣờng và các dung dịch sử dụng

 Môi trƣờng LB (Luria-Bertani) (g/l): Peptone: 10, cao nấm men: 5, NaCl: 10, pH

7.0.

 Môi trƣờng Mac Conkey (g/l): Peptone G: 20, Lactose: 10, Oxbile: 5, Bromcresol

Purple: 0.01, Agar: 20, pH: 7.3.

 Môi trƣờng LB đặc (g/l): Peptone: 10, cao nấm men: 5, NaCl: 10, agar: 20, pH 7.0

 Môi trƣờng LB muối cao (g/l): Peptone: 10, cao nấm men: 5, NaCl: 20, pH 7.0

 Môi trƣờng M9-Mannitol (g/l): Na2HPO4: 6; KH2PO4: 3; NaCl: 0.5; NH4Cl: 1;

MgSO4 1mM; CaCl2 0.1M; Mannitol:10.

 Môi trƣờng xác định 3-Ketolactose (g/l): Lactose: 10; Cao nấm men: 1; Agarose:

20.

 Môi trƣờng YEB (g/l): Sucrose: 50, cao nấm men: 25, tryptone: 20, NaCl: 7,5

CaCO3: 2; MgSO4.7H2O: 0.25.

 Môi trƣờng MEM/10%FBS (Gibco)

 Môi trƣờng MT1 (g/l): Glucose: 60; peptone: 15; cao nấm men: 15; NaCl: 7,5.

 Môi trƣờng tổng hợp CoQ10 (MT2) (g/l): Sucrose: 50; Peptone: 20; cao nấm

men: 20; KH2PO4: 0,5; K2HPO4: 0,5; (NH4)2SO4: 10; MgSO4.7H2O: 0,25.

 Môi trƣờng tổng hợp CoQ10 (MT3) (g/l): Sucrose: 50; Cao ngô (CSL): 10;

KH2PO4: 0,5; K2HPO4: 0,5; (NH4)2SO4: 10; MgSO4.7H2O: 0,25.

37

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Phƣơng pháp vi sinh

2.2.1.1. Phương pháp phân lập A. tumefaciens [40]

- Lấy mẫu: Các mẫu nốt sần của cây hoa hồng được thu thập từ các vùng trồng hoa ở

phường Tây Tựu và huyện Mê Linh – Hà Nội. Các mẫu được đựng trong túi đã được vô

khuẩn, tránh nhiễm tạp.

- Phân lập: Mẫu được rửa lại dưới vòi nước để loại đất và các chất nguy hại. Các mẫu

nốt sần được khử trùng bằng 10% nước tẩy từ 2 – 3 phút, sau đó được rửa lại 3 lần bằng

nước vô trùng, mẫu được cắt nhỏ và ủ qua đêm trong nước vô trùng ở nhiệt độ phòng. Pha loãng thập phân đến nồng độ 10-6. Tại mỗi độ pha loãng 100 µl mẫu được lấy trang đều môi trường MacConkey agar. Sau 2 ngày nuôi ở 30oC, các khuẩn lạc riêng rẽ khác nhau về

hình thái được cấy chuyển sang các đĩa MacConkey. Các khuẩn lạc sau khi được làm thuần nhất được cấy chuyển sang đĩa MacConkey mới, nuôi ở 30oC và được kiểm tra sự phát

triển của từng khuẩn lạc.

2.2.1.2. Phương pháp tuyển chọn dựa theo đặc điểm sinh học và sinh hóa của A.

tumefaciens

Các chủng phân lập được kiểm tra dựa theo đặc điểm sinh học và phản ứng sinh hóa

theo mô tả của Bergey ( Holt et al., 1994); Moore et al; 1988; Sawada và Ieki et al., 1992).

Kiểm tra đặc tính hóa sinh gồm có: nhuộm Gram, khả năng sinh 3-ketolactose, sống trên

môi trường muối cao (2%), khả năng sử dụng đường Manitol.

2.2.1.3. Tuyển chọn chủng sinh tổng hợp Coenzyme Q10

Các chủng vi khuẩn được nuôi 4 ngày trong bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường sinh tổng hợp CoQ10 MT2 ở 30oC, lắc 130 vòng/phút và được tiếp giống (đã được hoạt hóa trước trong môi trường hoạt hóa 24 giờ với tỷ lệ 0,37×108 CFU/ml). Sau 4 ngày

thu sinh khối để xác định hàm lượng CoQ10. Chủng phân lập cho hàm lượng CoQ10 cao

nhất được lựa chọn.

2.2.1.4. Khảo sát điều kiện nuôi cấy chủng A. tumefaciens DPXS12 sinh tổng hợp

Coenzyme Q10

A. tumefaciens DPXS12 được nuôi trong bình tam giác trên môi trường MT2 ở nhiệt độ 30oC, tốc độ lắc 130 vòng/phút ở các điều kiện nuôi khác nhau về nguồn cacbon,

nồng độ sucrose từ 0 – 10%; nguồn nitơ khác nhau; nồng độ cao ngô 0,5 – 5%, pH từ 5 –

38

8, tỷ lệ cấp giống từ 0,37 108 CFU/ml, nhiệt độ từ 20 – 37oC, thời gian từ 1 – 5 ngày.

Định kỳ lấy mẫu và phân tích sinh khối, pH và hàm lượng Coenzyme Q10.

2.2.1.5. Phương pháp xác định các chỉ tiêu vi sinh

 Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí theo TCVN 4884:2005

 Xác Coliforms theo TCVN 6848:2007

 Xác E. coli theo TCVN 7924-2:2008

 Xác định S. aureus theo TCVN 4830-1:2005

 Xác định Shigella spp theo TCVN 7902:2008

 Xác định B. cereus theo TCVN 4992:2005

 Xác định Salmonella theo TCVN 4829:2005

 Xác định tổng số bào tử nấm men, mốc theo TCVN 8275-2:2010

2.2.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử

2.2.2.1. Tách chiết DNA tổng số

Vi khuẩn được nuôi trong 2 ml môi trường LB lỏng ở 30oC trên máy lắc với tốc độ

200 vòng/phút qua đêm. Sau một ngày, ly tâm dịch nuôi ở 5000 vòng/phút trong 5 phút,

thu cặn tế bào. Tiếp theo, bổ sung 500 µl lysis buffer, trộn đều và ủ 10 phút ở nhiệt độ

thường. Bổ sung 150 µl postassium acetate trộn đều. Sau đó ly tâm ở 10000 vòng/phút

trong 10 phút thu dịch nổi. Sau bước này, bổ sung CI (Chloroform: izoamyl ancol) theo tỉ

lệ 1:1, trộn nhẹ bằng tay 5 lần. Tiếp theo, ly tâm ở 10000 vòng/ phút trong 10 phút, thu

pha trên. Bổ sung iso propanol (tỉ lệ 1:1), ủ trong 15 phút rồi ly tâm 10000 vòng/phút

trong 10 phút. Kết tủa thu được sẽ rửa bằng Ethanol 70% 5 lần. Sau đó, làm khô kết tủa.

Bổ sung nước Đề ion với thể tích 20-50µl để hòa tan tủa. Cuối cùng, điện di kiểm tra sản

phẩm.

2.2.2.2. Tách chiết DNA plasmid

Vi khuẩn được nuôi trong 2 ml môi trường LB lỏng ở 30oC trên máy lắc với tốc độ

200 vòng/phút qua đêm. Sau một ngày, ly tâm dịch nuôi ở 5000 vòng/phút trong 5 phút,

thu cặn tế bào. Bổ sung 100 µL Sol I, trộn đều, để ở nhiệt độ phòng 5 phút, bổ sung 200

µL Sol II, mix nhanh bằng tay 5-8 lần. Bổ sung ngay 150 µL Sol III, trộn đều, ủ đá 5 phút. Bổ sung 5µL RNAse, ủ 65oC, 15 phút. Sau bước này bổ sung CI, tỷ lệ 11, mix nhẹ. Tiếp

theo ly tâm 12 000 vòng/phút, 5 phút, thu dịch trên. Tủa bằng isopropanol (tỷ lệ 1:1), ủ 45

phút trên đá lạnh. Ly tâm 12 000 vòng/phút, 15 phút, thu tủa. Kết tủa thu được sẽ được

39

rửa 3 lần bằng ethanol 70% . Sau đó, làm khô kết tủa. Bổ sung nước Đề ion với thể tích

20-50µl để hòa tan tủa. Cuối cùng, điện di kiểm tra sản phẩm.

Các hóa chất sử dụng: Sol I: 25 mM Tris-HCl, pH 8,0; 10 mM EDTA; 50mM glucose.

Sol II: 0,2 M NaOH; 1% SDS. Sol III: 14,73 g CH3COOK + 5,75 mL CH3COOH trong 50

mL H2O (pH 4,8-5,2).

2.2.2.3. Thiết kế mồi

- Tìm kiếm trình tự gen dps mã hóa enzym decapreny diphosphate synthase và dxs mã hóa

enzyme 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase của A. tumefaciens trên ngân hàng

NCBI.

- So sánh trình tự các đoạn gen này, để xác định trình tự đặc trưng. sử dụng phần mềm của

MultAlin (Multiple sequence alignment của Florence Corpet) (F. Corpet, 1988).

- Thiết kế mồi dựa vào phần mềm FastPCR: Tính toán Tm, Ta tối ưu, và mồi không tạo

dimer.

- Blast trình tự mồi lên ngân hàng gen để kiểm tra khả năng bắt cặp và tính đặc hiệu của

đoạn mồi được thiết kế.

2.2.2.4. Phương pháp PCR

Thành phần của phản ứng PCR với thể tích phản ứng 25µl là:

dNTPs (5 µM): 1.5 µl, buffer (10 X chứa 20 mM MgCl2): 2.5 µl, primer (5 µM): 2.0 µl,

DNA khuôn: 1.0 µl, H2O PCR: 17.7 µl, Taq polymerase: 0.3 µl.

Bảng 2.3. Chương trình thực hiện phản ứng PCR nhân gen dps

Bước Phản ứng Thời gian Số chu kì

1

x 30

Biến tính Biến tính Bắt cặp Kéo dài Hoàn tất kéo dài Nhiệt độ (oC) 95oC 95oC 58oC 72oC 72oC 5 phút 1 phút 1 phút 1 phút 45 giây 10 phút 1 1 2 3 4 5

Bảng 2.4. Chương trình thực hiện phản ứng PCR nhân gen dxs

Bước Phản ứng Thời gian Số chu kì

1

x 35

Biến tính Biến tính Bắt cặp Kéo dài Hoàn tất kéo dài Nhiệt độ (oC) 95oC 95oC 62oC 72oC 72oC 5 phút 1 phút 1 phút 2 phút 45 giây 10 Hút 1 1 2 3 4 5

40

2.2.2.5. Biến nạp plasmid vào tế bào khả biến E. coli DH10b bằng phương pháp

sốc nhiệt

 Tạo tế bào khả biến E. coli DH10b

- Cấy chuyển 10 µL dịch tế bào E. coli DH10b vào 2 mL môi trường LB, nuôi qua đêm, 37oC, lắc 200 vòng/phút.

- Cấy chuyển 500 µL dịch nuôi qua đêm vào 50 mL môi trường LB, nuôi lắc tiếp 200 vòng/phút, 3giờ, 30oC (đến đạt OD600 =0,4).

- Ly tâm 2500 vòng/phút, 5 phút để thu cặn tế bào.

- Hòa tan cặn tế bào trong 5 mL CaCl2 lạnh đã khử trùng, giữ lạnh trên đá 30 phút. - Ly tâm lạnh 4oC, 2500 vòng/phút, 5 phút, thu cặn tế bào.

- Hòa tan cặn tế bào trong 2 mL dung dịch lạnh đã thanh trùng chứa CaCl2 0,1M và

glycerol 15%.

- Chia đều ra các ống eppendorf, mỗi ống 200 µL dịch tế bào khả biến. - Bảo quản tế bào khả biến ở -80oC.

 Biến nạp vào E. coli DH10b bằng sốc nhiệt

- Giữ tế bào khả biến E. coli DH10b trên đá 30 phút.

- Bổ sung 10 µL DNA vào ống tế bào khả biến. Giữ lạnh trên đá 10 phút. - Shock nhiệt ở 42oC trong 90 giây.

- Giữ trên đá 2 phút. - Bổ sung 500 µL môi trường LB và lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ ở 37oC.

- Trải lên đĩa thạch môi trường LB chứa kháng sinh ampicilline hoặc kanamycine

(100 µg/mL).

- Nuôi 37oC qua đêm.

- Kiểm tra đĩa thạch.

2.2.2.6. Phương pháp biến nạp plasmid vào A. tumefaciens bằng phương pháp

xung điện

 Tạo tế bào khả biến A. tumefaciens

Làm mới giống trên môi trường thạch YEB. Khuẩn lạc đơn được cấy trong 2 ml môi

trường lỏng LB và nuôi lắc ở 28°C, 6 – 8 giờ. Chuyển 1 ml dịch vi khuẩn sang 100 ml môi

trường LB lỏng + 0,1% glucose và nuôi lắc ở 28°C đến khi OD660nm đạt 1– 1,5. Làm lạnh

mẫu trong đá 15 phút, ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút để thu cặn tế bào. Rửa cặn 3

lần bằng 1 mM HEPES (N–2–hydroxyethylpiperazine–N‟–2–ethanesulfonic acid) pH 7,0;

41

1 lần bằng 10% glycerol. Sinh khối được hòa lại trong 10% glycerol. Chia 100 l dịch tế

bào vào mỗi ống eppendorf, làm lạnh trong nitơ lỏng và bảo quản ở – 80°C.

 Biến nạp plasmid vào A. tumefaciens bằng phƣơng pháp xung điện

Plasmid được tinh sạch (PureLink PCR purification kit, Invitrogen) và xác định nồng

độ trước khi tiến hành biến nạp. Tế bào khả biến được làm tan trên đá trong 30 phút sau đó

được bổ sung 10 µl plasmid (40-50 ng/µl). Hỗn hợp được trộn đều, giữ trên đá 10 phút và

sau đó chuyển vào cuvet. Đặt cuvet vào thiết bị và tiến hành biến nạp ở điều kiện 2,5kV,

25F, 400Ω. Bổ sung 800 µl SOC vào cuvet và chuyển toàn bộ hỗn dịch sang ống

eppendorf và lắc ở 28°C trong 2 giờ. Dịch nuôi sau đó được trải lên môi trường thạch YEB

có bổ sung kanamycin và nuôi ở 28°C trong 2 ngày.

2.2.2.7. Tinh sạch DNA

- Bổ sung vào cột 4 lần thể tích Binding Buffer và sản phẩm PCR (V= 50-100 µl)

trộn đều.

- Ly tâm cột 10000 vòng/phút trong 1 phút.

- Cho 650 Wash Buffer vào cột. Ly tâm 10000 vòng/ phút trong 3 phút.

- Thôi DNA bằng cách bổ sung 50 µl nước (đề ion), để 3 phút ở nhiệt độ phòng.

- Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 3 phút.

- Thu dịch dưới cột.

2.2.2.8. Thiết kế plasmid nhân dòng gene dps và dxs trong E. coli DH10b

Hai đoạn trình tự mã hóa hai enzyme chìa khóa của con đường tổng hợp CoQ10 là

decaprenyl diphosphate synthase và 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase được nhân

lên từ DNA tổng số bằng phản ứng PCR với cặp mồi DpsF/R sẽ cho phép khuếch đại đoạn

gen dps có kích thước 1077 bp; với cặp mồi DxsF/R sẽ cho phép khuếch đại đoạn DNA có

kích thước 2103 bp bao gồm đoạn gene dxs (1920 bp) và đoạn DNA phía đầu 5‟ của gen

này (183 bp). Sản phẩm PCR của hai gen dps và dxs được xử lý bằng enzyme Klenow và

gắn vào vector tách dòng pJET1.2/blunt (Thermo Scienctific, USA) theo hướng dẫn sử

dụng của kit. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào E. coli DH10b bằng phương pháp sốc

nhiệt để chọn dòng mang vector tái tổ hợp. Thể biến nạp được sàng lọc trên môi trường LB

có bổ sung ampicillin 100 µg/ml. Những khuẩn lạc mọc trên môi trường trên có thể là

những dòng vi khuẩn có chứa plasmid tái tổ hợp mang gene mong muốn, vì vậy một số

khuẩn lạc được lựa chọn ngẫu nhiên, plasmid được tách bằng kit, sau đó được kiểm tra

bằng phản ứng PCR và được cắt kiểm tra bằng cặp enzyme giới hạn SacI/BamHI (gene

42

dps) và BamHI/SalI (gene dxs) và giải trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc). Cặp mồi

sử dụng giải trình tự là:

Mồi xuôi (DpsF): 5‟-ATAGAGCTCATTGCCGCGCAAGGCGTCAGTT-3‟;

Mồi ngược (DpsR): 5‟-TTTGGATCCTCAGTTGAGACGCTCGATGCA-3‟.

Mồi xuôi (DxsF): 5‟-TAAGGATCCACGCATAGAACAGGCCAAAC-3‟;

Mồi ngược (DxsR): 5‟-ATTGTCGACTCAGCCGGCGAAACCGACGC-3‟;

2.2.2.9. Thiết kế plasmid biểu hiện mang gene dps và dxs trong E. coli DH10b

 Thiết kế plasmid biểu hiện mang gene dps và dxs độc lập

Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế plasmid biểu hiện mang gene dps

Hai gen dps và dxs được cắt ra khỏi vector tách dòng bằng hai cặp enzyme cắt hạn chế

tương ứng là SacI/BamHI và BamHI/SalI. Hai đoạn gen này được tinh sạch bằng phương

pháp thôi gel sử dụng kit DNA gel purification kit (QIAGEN, Mỹ). Hai gen dps và dxs thu

được đã được gắn vào vector biểu hiện pCAMBIA1301 đã được mở vòng bằng cặp

enzyme cắt hạn chế tương ứng. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào E. coli DH10b bằng

phương pháp sốc nhiệt để chọn dòng. Thể biến nạp được sàng lọc trên môi trường LB có

43

bổ sung Kanamycin 100 µg/ml. Những khuẩn lạc mọc trên môi trường trên có thể là những

dòng vi khuẩn có chứa plasmid tái tổ hợp mang gene mong muốn, vì vậy một số khuẩn lạc

được lựa chọn ngẫu nhiên, plasmid được tách bằng kit, sau đó được kiểm tra bằng phản

ứng PCR và được cắt kiểm tra bằng cặp enzyme giới hạn SacI/BamHI (gene dps) và

BamHI/SalI (gene dxs). Plasmid tái tổ hợp chứa trình tự mã hóa của hai gene dps và dxs

được kí kiệu lần lượt là pCAM-dps, pCAM-dxs.

Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế plasmid biểu hiện mang gene dxs

44

 Thiết kế plasmid biểu hiện mang đồng thời hai gene dps và dxs

Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế plasmid biểu hiện mang đồng thời hai gene dps và dxs

Để tạo cấu trúc biểu hiện tái tổ hợp chứa đồng thời hai gen dps và dxs, gen dps thu

được từ vector tách dòng sau khi xử lý bởi cặp enzyme cắt hạn chế SacI và BamHI được

nối vào vector pCAM-dxs đã được mở vòng bởi SacI/BamHI. Sản phẩm nối ghép được

biến nạp vào E. coli DH10b bằng phương pháp sốc nhiệt để chọn dòng. Thể biến nạp được

sàng lọc trên môi trường LB có bổ sung Kanamycin 100 µg/ml. Những khuẩn lạc mọc trên

môi trường trên có thể là những dòng vi khuẩn có chứa plasmid tái tổ hợp mang gene

mong muốn, vì vậy một số khuẩn lạc được lựa chọn ngẫu nhiên, plasmid được tách bằng

kit, sau đó được kiểm tra bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi DpsF/R và được cắt kiểm

tra bằng căp enzyme hạn chế SacI/BamHI. Plasmid tái tổ hợp chứa trình tự mã hóa của hai

gene dps và dxs được kí kiệu là pCAM-dps-dxs.

2.2.2.10. Tạo chủng A. tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc pCAM-dps-dxs

Chủng A. tumefaciens EHA105 có khả năng tổng hợp CoQ10 và nhạy cảm với kháng

sinh kanamycin được sử dụng làm chủng chủ. Các cấu trúc tái tổ hợp pCAM-dps, pCAM-

45

dxs, pCAM-dps-dxs được biến nạp vào tế bào A. tumefaciens khả biến bằng phương pháp

xung điện. Các dòng tái tổ hợp được chọn lọc trên môi trường chứa kanamycin

(100µg/ml). Để xác định được khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các chủng tái tổ hợp,

các chủng pCAM-dps, pCAM-dxs, pCAM-dps-dxs, và chủng đối chứng pCAM được nuôi

cấy trong môi trường chứa 5% sucrose, 2% cao nấm men, 2% peptone, 1% (NH4)2SO4,

0,05% K2HPO4, 0,05% KH2PO4, MgSO4.7H2O, 0,2% CaCO3 và 100µg/ml kanamycin ở 30oC. Sinh khối được thu nhận sau 96 giờ nuôi cấy để tách chiết CoQ10.

2.2.3. Phƣơng pháp hóa ý, hóa sinh

2.2.3.1. Điện di gel agarose

DNA tổng số được điện di trên gel agarose 0.8%, 100V trong 45 phút, nhuộm bằng

EtBr 0,5 g/ml trong 5-10 phút, rửa, quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 300 nm trên máy soi

gel DNA và chụp ảnh.

2.2.3.2. Phương pháp tách chiết CoQ10 từ A. tumefaciens

 Khảo sát các phương pháp tách chiết CoQ10 từ A. tumefaciens

Phương pháp siêu âm: sinh khối thu sau lên men được siêu âm trong đệm Tris HCl 7.5

(2mM) trong 10 phút ((15 giây on, 10 giây off, W=60%). Bổ sung petrolium ether (5:3),

trộn đều trong 5 phút, thu pha trên (quá trình chiết được lặp lại 3 lần). CoQ10 thu nhận

bằng cách cô chân không đến khi dung môi bay hơi hoàn toàn [90].

Phương pháp xử lý bằng axit: sinh khối sau lên men được bổ sung axit HCl 3M với tỷ

lệ 10,8 mL/g sinh khối. Bổ sung petrolium ether (5:3) theo tỷ lệ 1:2, trộn đều trong 5 phút,

thu pha trên (quá trình chiết được lặp lại 3 lần). CoQ10 thu nhận bằng cô chân không đến

khi dung môi bay hơi hoàn toàn [90].

Phương pháp xử lý bằng ethanol theo mô tả Ranadive: sinh khối sau lên men được trộn đều với ethanol, ủ ở 60oC trong 3 giờ. Ly tâm thu dịch, dung dịch thu được trộn với hexane

theo tỷ lệ 1:1 để chiết CoQ10. CoQ10 thu nhận bằng cô chân không đến khi hexane bay

hơi hoàn toàn [75].

Phương pháp xử lý bằng enzyme theo mô tả của Zahiria: sinh khối sau lên men được

bổ sung đệm phá vỡ tế bào (8% sucrose, 5% Triton X100, 50 mM Tris HCl pH 8.0, 50

mM EDTA pH 8.0, 1mg/ml lysozym) ủ 37o trong 30 phút. Bổ sung n-hexane:n-propanol

(5:3) theo tỷ lệ 1:1, trộn đều trong 5 phút, thu pha trên (quá trình chiết được lặp lại 3 lần).

CoQ10 thu nhận bằng cô chân không đến khi dung môi bay hơi hoàn toàn [103].

46

 Khảo sát các điều kiện thích hợp tách chiết CoQ10 từ A. tumefaciens theo

phương pháp xử lý bằng cồn

Nhằm nâng cao hiệu suất tách chiết CoQ10 theo phương pháp xử lý bằng cồn, các điều kiện được lựa lựa chọn nghiên cứu, nhiệt độ xử lý bằng cồn (25oC, 37oC, 60oC), tỷ lệ cồn

với sinh khối (5, 10, 15 mL/g), thời gian siêu âm (1 phút, 2 phút, 3 phút, 5 phút, 10 phút,

15 phút), số lần chiết bằng n-hexan (1, 2, 3 lần).

2.2.3.3. Phương pháp tinh sạch Coenzyme Q10

 Phương pháp chiết tinh sạch CoQ10 bằng dung môi

Dịch chiết CoQ10 thu được như mô tả ở trên được gọi là dịch chiết 1 lần chiết. Sau

khi cô đặc đến khô, CoQ10 được hoàn tan trở lại trong hỗn hợp dung môi ethanol:hexane

và chiết lấy pha hexane; sau đó pha hexane được cô đặc đến khô và hòa tan trong ethanol

được gọi là dịch chiết 2 lần chiết. Tương tự, CoQ10 sau khi sấy khô ở lần chiết 2 được tiếp

tục hoàn tan trong hỗn hợp ethanol:hexane và chiết lấy pha hexane sau đó cô đặc đến khô

và hòa tan trong ethanol thu được dịch chiết 3 lần chiết.

 Phương pháp chiết tinh sạch CoQ10 bằng sắc ký cột silica

Hạt silica gel được sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký cột tinh sạch CoQ10. Dung môi

ethanol được sử dụng làm pha động. Cột được nhồi với silica chuẩn bị trong ethanol và

được cân bằng 10 lần thể tích cột bằng dung môi ethanol. Mẫu dịch chiết CoQ10 được đưa

lên cột và chạy với hệ dung môi rửa giải là ethanol. Do CoQ10 có màu vàng nên tiến hành

thu nhận các phân đoạn chứa CoQ10 và tiến hành phân tích.

2.2.3.4. Xác định hàm lượng Coenzyme Q10 bằng phương pháp Craven [77]

Xác định hàm lượng CoQ10 dựa trên phản ứng tạo màu giữa ethyl cyanoacetate.

Những ion từ II đến V được hình thành trong phản ứng để tạo màu xanh.

47

Hình 2.4. Phản ứng giữa ethyl cyanoacetate và CoQ10

Mẫu thí nghiệm gồm 100 µl mẫu thu được và 100 µl ethyl cyanoacetate. Mẫu kiểm

chứng gồm 100 µl Ethanol 100 % và 100 µl ethyl cyanoacetat. Trộn đều hỗn hợp, ủ trong

6 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, bổ sung 20 µl KOH 0.2 N. Trộn đều hỗn hợp, đo kết quả

phản ứng trong thiết bị đo quang, bước sóng 620 nm tại thời điểm 10 phút. Dựa vào đồ thị

đường chuẩn Coenzyme Q10 chuẩn để tính hàm lượng CoQ10 (Đường chuẩn CoQ10 trình

bày trong phụ lục). Tất cả các thí nghiệm đều được tiến hành lặp lại ít nhất 3 lần.

Phương trình tính toán hàm lượng được viết như sau:

X (mg)= [(Abs + 0,038) : 0,909]*D

Trong đó: X : hàm lượng CoQ10 có trong mẫu phản ứng

Abs: giá trị hấp thụ quang phổ của mẫu ở bước sóng 620nm

D : là hệ số pha loãng của mẫu

2.2.3.5. Phương pháp phân tích Coenzyme Q10 bằng HPLC

Phân tích CoQ10 bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC). Dịch chiết CoQ10

được phân tích bằng HPLC (Agilent 1200 Series, USA) trên cột Nucleosil C18-RP

nucleosil (250 mm x 4,6 mm, 5μm; Macherey-Nagel), sử dụng ethanol và methanol làm

pha động với tốc độ dòng chảy là 0,5 ml/phút theo phương pháp gradient, nhiệt độ cột là

48

35oC, bước sóng hấp phụ 275 nm, sử dụng đầu dò DAD, detecter UV-Vis. CoQ10 trong

mẫu được xác định dựa vào phổ HPLC của CoQ10 chuẩn chạy trong cùng điều kiện.

2.2.3.6. Khảo sát đặc tính của Coenzyme Q10

 Xác định độ bền nhiệt

CoQ10 được giữ tại các nhiệt độ khác nhau (4oC, 25oC, 37oC, 60oC) trong 144 giờ. Sau

mỗi 24 giờ tiến hành xác định hàm lượng CoQ10 còn lại. Đánh giá độ bền CoQ10 theo %

hàm lượng CoQ10 còn lại.

 Xác định độ bền pH

Dung dịch CoQ10 được chuẩn bị ở các giá trị pH khác nhau (pH 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0)

sau đó giữ ở nhiệt độ phòng trong 120 giờ. Sau mỗi 24 giờ tiến hành xác định hàm lượng

CoQ10 còn lại. Đánh giá độ bền CoQ10 theo % hàm lượng CoQ10 còn lại.

 Xác định sự ảnh hưởng bới ánh sáng

CoQ10 được giữ ở hai điều kiện khác nhau đó là giữ tối và chiếu sáng liên tục ở nhiệt

độ phòng trong 144 giờ. Hàm lượng CoQ10 thay đổi được xác định sau mỗi 24 giờ. Đánh

giá độ bền CoQ10 theo % hàm lượng CoQ10 còn lại.

2.2.3.7. Phương pháp tạo phức, kháo đặc tính của phức β-cyclodextrin -

Coenzyme Q10 (β-CDQ10) và đánh giá tỷ lệ thu hồi CoQ10 từ phức β-CDQ10

 Phương pháp tạo phức β-cyclodextrin - Coenzyme Q10 (β-CDQ10) [27]

Phức CoQ10 với β-cyclodextrin với các tỷ lệ mol khác nhau (1:1; 1:3; 1:5: 1:10) được

chuẩn bị theo phương pháp biến đổi của Fir và cộng sự: CoQ10 được hòa tan trong ethanol ở 60oC trong 30 phút, β-cyclodextrin được hòa tan trong nước ở 80oC trong 30 phút, tỷ lệ

ethanol/nước 1:1 (v/v) . Sau đó hỗn hợp CoQ10 và β-cyclodextrin được khuấy trộn trong 60 phút ở 60oC cho đồng nhất. Hỗn hợp được sấy phun ở nhiệt độ đầu vào 105oC, đầu ra 60oC. Phức β-CDQ10 dạng bột được thu nhận và nghiên cứu đặc tính.

 Khảo sát đặc tính của phức β-cyclodextrin - Coenzyme Q10 (β-CDQ10)

 Xác định độ bền nhiệt

β-CDQ10 được giữ tại các nhiệt độ khác nhau (4oC, 25oC, 37oC, 60oC, 100oC) trong

144 giờ. Sau mỗi 24 giờ tiến hành xác định hàm lượng CoQ10 còn lại. Đánh giá độ bền

của CoQ10 trong phức β-CDQ10 theo % hàm lượng CoQ10 còn lại.

49

 Xác định độ hòa tan của β-CD

β-CDQ10 được hòa tan trong nước ở các pH khác nhau (pH 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0, điều chỉnh bằng HCl 0,1M),vortex và lắc 37oC trong 30 phút. Tiến hành quan sát độ hòa

tan của phức β-CDQ10 theo thời gian.

 Xác định sự ảnh hưởng bới ánh sáng

β-CDQ10 được giữ ở hai điều kiện khác nhau đó là giữ tối và chiếu sáng liên tục ở

nhiệt độ phòng trong 144 giờ. Hàm lượng CoQ10 thay đổi được xác định sau mỗi 24 giờ.

Đánh giá độ bền của phức β-CDQ10 theo % hàm lượng CoQ10 còn lại.

 Phương pháp đánh giá tỷ lệ thu hồi CoQ10 từ phức β-CDQ10

Để lựa chọn tỷ lệ mol CoQ10: β-CD thích hợp tiến hành đánh giá tỷ lệ thu hồi của

CoQ10 từ các công thức (1:1, 1:3, 1:5, 1:10) (mol/mol) sau sấy phun. β-CDQ10 sau sấy phun được hòa tan trong ethanol, vortex và lắc 60oC trong 60 phút. Tiến hành ly tâm thu

dịch CoQ10 lặp lại bước chiết 2 lần. Hàm lượng CoQ10 còn lại trong phức β-CDQ10 được

định lượng. Đánh giá tỷ lệ thu hồi CoQ10 của các công thức CoQ10: β-CD theo tỷ lệ hàm

lượng CoQ10 trước và sau khi sấy phun.

2.2.3.8. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học của CoQ10

 Xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng cách loại bỏ gốc tự do DPPH [27]

Nguyên tắc: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là gốc tự do được dùng để sàng lọc

tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua

việc làm giảm màu DPPH của chất thử, được xác định bằng phép đo độ hấp thụ ở bước

sóng 517 nm trên máy quang phổ.

Phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất chống oxy hóa được minh họa bằng phản

ứng sau:

+ A.

+ AH

DPPHH

DPPH

Hình 2.5. Phương trình phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất chống oxy hóa

Phương pháp: Pha dung dịch DPPH có nồng độ 0,5 mM trong Ethanol (EtOH). Chất

thử được pha trong Ethanol 100% sao cho nồng độ cuối cùng đạt được một dãy các nồng

50

độ 0,8; 0,4; 0,2; 0,1; 0,05, 0,025 mM. Để thời gian phản ứng 30 phút ở 37oC, đọc mật độ

hấp thụ của DPPH chưa phản ứng bằng máy đọc Biotek ở bước sóng 517 nm. Phần trăm

thử)/ ODtrắng (%). EC50 được tính theo giá trị SC tương quan với các nồng độ khác nhau của

quét gốc tự do DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau: SC% = (OD trắng – OD mẫu

chất thử, thí nghiệm được lặp lại với n = 3.

 Xác định hoạt tính sinh học của CoQ10 đối với tế bào ung thư [38]

Ảnh hưởng của CoQ10 đối với dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hep-2C, FL và tế bào

thận thỏ bình thường RK13 được xác định theo Hsia và cộng sự (2014). Quy trình thử

nghiệm được tóm tắt như sau: CoQ10 được hòa tan trong 2-propanol ở các nồng độ 0, 5,

10, 20, 40 và 80 µM. Bổ sung 20 µl dung dịch CoQ10 ở mỗi nồng độ vào mỗi giếng chứa sẵn 2 ml môi trường MEM/ 10% FBS và 105 tế bào. Tế bào được nuôi trong tủ ấm 37oC,

5% CO2 và thu hoạch theo thời gian 24, 48 và 72 giờ để đếm số lượng tế bào sống.

2.2.3.9. Quy trình điều chế viên nang cứng chứa CoQ10

Trộn đều phức CoQ10 – β – cyclodextrin tỷ lệ 1:5 (mol/mol) với maltodextrin, rồi

đóng nang số 0 (vật liệu làm vỏ nang là gelatin) bằng máy đóng nang thủ công sao cho 1

viên nang chứa 400 mg khối bột β – CDQ10 – maltodextrin, hàm lượng CoQ10 đạt 10 mg.

Các phương pháp đánh giá viên nang

 Hình thức cảm quan: quan sát bằng mắt thường

 Độ đồng đều khối lượng: thử theo DĐVN IV [1]

 Độ đồng đều hàm lượng: thử theo DĐVN IV [1]

 Độ tan rã: thử theo DĐVN IV[1]

 Xác định Aflatoxin G1, G2, B1, B2: theo AOAC 990.33

 Xác định hàm lượng chì, thủy ngân, cadimi: theo AOAC 991.10

51

2.2.4. Phƣơng pháp toán học

Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp CoQ10 trong canh trường gián đoạn với các yếu tố

tối ưu là nồng độ cacbon, nồng độ nitơ, và nhiệt độ. Tiến hành quy hoạch bậc hai theo Box

– Behnken, sử dụng tối ưu 3 yếu tố với 17 thí nghiệm trong đó có 5 thí nghiệm lặp

tại tâm (Bảng 2.1). Sử dụng phần mềm Design-Expert 7.15 (State Ease, Inc., Minneapolis,

Mỹ) để phân tích các hệ số hồi quy, thiết lập bề mặt đáp ứng và tối ưu hóa theo hàm mong

2 +

2 Bước 1. Xây dựng mô hình toán học dạng y = b0 + b1X1 + b11 X1

đợi, ANOVA được sử dụng đánh giá các thông số thống kê.

+ b2 X2 + b22 X2

2 + b12 X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3

b3X3+ b33X3

Trong đó :

Y: hàm mục tiêu

Xi : Các biến mã số (chỉ nhận các giá trị -1, 0. +1)

bi : các hệ số diễn tả mức độ ảnh hưởng của các biến Xi đến hàm mục tiêu.

- Xác định các biến ảnh hưởng, các mức và khoảng thay đổi của từng biến từ khảo

sát thực nghiệm và tham khảo các tài liệu đã công bố.

Bảng 2.5. Các biến số và khoảng chạy của chúng

Biếnsố Yếu tố Đơn vị Mức -1 Mức +1

X1 Nồng độ sucrose % 2,5 7,5

X2 Nồng độ cao ngô % 0,5 1,5

oC

X3 Nhiệt độ 24 32

- Lập ma trận thực nghiệm theo Box-Behnken: gồm 17 thí nghiệm kết hợp các yếu tố

với 3 mức +1 (mức cao nhất), -1 (mức thấp nhất) và 0 (mức trung bình), trong đó có 5 thí

nghiệm lặp ở tâm (các yếu tố đều ở mức 0) (bảng 2.4).

52

Bảng 2.6. Ma trận thực nghiệm

TN

Nhiệt độ (X3) (độ C) Nồng độ sucrose (X1) (%) Hàm lượng CoQ10 (mg/l) Nồng độ caongô (X2) (%)

1 2,5 0,5 28

2 2,5 1,5 28

3 7,5 0,5 28

4 7,5 1,5 24

5 5,0 0,5 24

6 5,0 1,5 24

7 5,0 0,5 32

8 5,0 1,5 32

9 2,5 1,0 24

10 7,5 1,0 24

11 2,5 1,0 32

12 7,5 1,0 32

13 5,0 1,0 32

14 5,0 1,0 28

15 5,0 1,0 28

16 5,0 1,0 28

17 5,0 1,0 28

- Tiến hành thực nghiệm

Nuôi A. tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp CoQ10 bằng phương pháp nuôi cấy chìm.

Môi trường nuôi bao gồm (NH4)2SO4 2%; KH2PO4 0,05%; K2HPO4 0,05%; CaCO3 0,2%;

MgSO4.7H2O 0,02%; Sucrose thay đổi 2,5; 5,0 và 7,5%, cao ngô thay đổi nồng độ tương

ứng: 0,5; 1,0 và 1,5%. Sau đó đưa pH đầu về 8 cấp giống OD vào là 0,8. Tiến hành nuôi ở nhiệt độ 24, 28 và 32oC tương ứng với ma trận thực nghiệm (bảng 2.6). Sau 96 giờ lắc ở

110 vòng/phút, ly tâm thu sinh khối. Tách chiết thu CoQ10 và tiến hành xác định hàm

lượng định lượng CoQ10.

- Tính toán hệ số của hàm hồi quy.

- Kiểm tra độ phù hợp của mô hình và sự có nghĩa của các hệ số hồi quy.

- Đánh giá sự sai lệch giữa mô hình và thực nghiệm theo chuẩn Fisher.

Bước 2. Cực đại hóa hàm mục tiêu theo phương pháp hàm kỳ vọng

53

2 Tìm cực trị của phương trình hồi quy y= b0 + b1X1 + b11 X1

2 + b2 X2 + b22 X2

+ b3X3+ 2 + b12 X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3 bằng phần mềm Design-Expert 7.15 cho các kết quả b33X3

đạt giá trị cưc trị tại X1, X2, X3 tương ứng với giá trị nồng độ sucrose, nồng độ cao ngô và

nhiệt độ. Vậy hiệu suất sinh tổng hợp CoQ10 đạt giá trị lớn nhất tại X1, X2, X3 tương ứng

với giá trị nồng độ sucrose, nồng độ cao ngô và nhiệt độ thu được.

54

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN A. TUMEFACIENS SINH TỔNG HỢP

COENZYME Q10

3.1.1. Phân ập, tuyển chọn chủng sinh tổng hợp Coenzyme Q10

Theo nhiều nghiên cứu cho thấy A. tumefaciens là một trong những vi khuẩn có khả

năng sinh tổng hợp Coenzyme Q10 cao nhất [41]. Vi khuẩn này gây ra khối u (nốt sần)

chủ yếu trên các loại thực vật hai lá mầm, một số cây một lá mầm và một số thực vật hạt

trần [14, 55]. Một số nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng A. tumefaciens có thể được

phân lập từ nốt sần của một số loại thực vật như hoa hồng, mơ, thuốc lá [3, 14, 40]. Kết

quả từ 13 mẫu nốt sần khác nhau thu thập từ vùng trồng hoa hồng Mê Linh và Tây Tựu -

Hà Nội đã phân lập được 12 chủng vi khuẩn trên môi trường chọn lọc MacConkey, bao

gồm 5 chủng từ nốt sần hoa hồng phường Tây Tựu, 7 chủng từ nốt sần hoa hồng huyện Mê

Linh. Từ kết quả trên, để chứng minh các vi khuẩn phân lập được là A. tumefaciens, các

chủng phân lập được tiến hành sàng lọc dựa theo một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh

hóa và sinh học phân tử.

3.1.1.1. Sàng lọc theo phương pháp nhuộm Gram

Các chủng lựa chọn được nhuộm màu Gram và quan sát bằng kính hiển vi với độ

ML5

TT4

phóng đại 100X, phản ứng nhuộm Gram cũng được tiến hành song song với chủng chuẩn

Hình 3.1. Hình ảnh nhuộm Gram một số chủng phân lập (TT4, ML5), chủng chuẩn A. tumefaciens EHA và AA2 tương ứng

Kết quả cho thấy, các chủng phân lập đều là vi khuẩn Gram âm (hình 3.1 và bảng

3.1). A. tumefaciens là một loài vi khuẩn Gram âm, hình que, không sinh bào tử và có khả

năng di động. Vi khuẩn này gây ra bệnh nốt sần ở một loạt các loài thực vật, đặc biệt là họ

hồng [29]. Do đó, 12 chủng vi khuẩn Gram âm phân lập được từ nốt sần hoa hồng được

lựa chọn để tiếp tục sàng lọc chủng A. tumefaciens.

55

3.1.1.2. Sàng lọc bằng khả năng chịu muối cao và sử dụng mannitol

Theo các nghiên cứu trước đây, chủng A. tumefaciens có thể phát triển trên môi

trường muối cao [40]. Do đó, trong nghiên cứu này các chủng lựa chọn được nuôi trong

môi trường LB lỏng có chứa 2% NaCl. Sau 3 ngày nuôi cấy, 8 chủng (TT1, TT2.1, TT2.2,

TT4, ML2, ML3, ML5, ML6) phân lập được lựa chọn phát triển tốt trong môi trường muối

cao, 4 chủng (TT3, ML1, ML4, ML7) không phát triển (bảng 3.1). Sự không phát triển trên

môi trường có nồng độ muối cao có thể do khả năng chịu mặn của chúng thấp hơn hoặc

các chủng này không phải là A. tumefacien.

A. tumefaciens có khả năng sử dụng mannitol làm nguồn cacbon để phát triển. Do đó,

môi trường tối thiểu (M9) có chứa 1% mannitol là nguồn cacbon duy nhất được sử dụng để

nuôi cấy các chủng phân lập được lựa chọn. Kết quả cho thấy 6 chủng (TT1, TT2.1, TT2.2,

TT4, ML2, ML3, ML6) phát triển được trên môi trường chứa mannitol.

3.1.1.3. Sàng lọc theo khả năng sinh 3-ketolactose

Khả năng sinh 3-ketolactose được coi là đặc tính đặc trưng của A. tumefaciens. Khả

năng sinh 3-ketolactose các chủng lựa chọn đã được kiểm tra bởi sự thay đổi màu bề mặt

trên của các khuẩn lạc sau khi thêm thuốc thử Benedict (Hình 3.2).

TT1

TT1

EHA

EHA

TT21

TT21

TT4

TT4

TT22

TT22

A B

Hình 3.2. Khả năng sinh 3-ketolactose của các chủng lựa chọn. A: Màu của khuẩn lạc khi mới

thêm thuốc thử Benedict. B: Màu của khuẩn lạc khi thêm thuốc thử Benedict sau 75 phút

Kết quả hình 3.2 cho thấy, sau khi nhỏ thuốc thử Benedict lên khuẩn lạc trên mặt đĩa

thạch sau thời gian 75 phút, quanh các khuẩn lạc của 4 chủng (TT1, TT2.1, TT2.2, TT4)

xuất hiện các vòng màu vàng. Kết tủa màu vàng là Cu2O được tạo thành bởi phản ứng khử

56

Cu2+ thành Cu+ với nhóm aldehyt được tạo thành bởi phản ứng chuyển hóa đường lactose thành 3-ketolactose trong môi trường kiềm như sau: 2Cu2+ + HCOH + 5OH- = Cu2O + HCOOH- +

3H2O.

Tổng hợp các kết quả phân tích các chủng phân lập dựa trên đặc điểm hình thái,

sinh lý, sinh hóa được tóm tắt trong bảng 3.1. Dựa trên các kết quả thu được từ việc phân

tích đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa cho thấy các chủng TT1, TT2.1, TT2.2 và TT4

bước đầu được xác định là các chủng A. tumefaciens.

Kết quả sàng lọc các chủng A. tumefaciens được tóm tắt trong bảng 3.1.

Bảng 3.1. Đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng phân lập

Tuyển chọn

theo đặc điểm

A. tumefaciens

sinh lý, sinh hóa

TT1 TT2.1 TT2.2 TT3 TT4 ML1 ML2 ML3 ML4 ML5 ML6 ML7

EHA

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Nhuộm Gram

Nồng độ muối

+

+

+

-

+

-

+

+

+

+

-

-

+

cao (2%)

Sử dụng

+

+

+

-

+

-

+

+

-

-

-

-

+

Mannitol

Sinh 3-

+

+

+

-

+

-

-

-

-

-

-

-

+

ketolactose

Các chủng tuyển chọn

3.1.1.4. Sàng lọc bằng phương pháp so sánh trình tự gen dps và dxs

Để chắc chắn 4 chủng phân lập là A. tumefaciens, hai gen đặc trưng của A.

tumefaciens là dps và dxs mã hóa hai enzyme decarprenyl diphosphate synthase và 1-

deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase chìa khóa cho quá trình tổng hợp CoQ10, tương

ứng đã được nghiên cứu. DNA tổng số được tách từ tất cả các chủng phân lập và sử dụng

để làm khuôn khuếch đại hai gen đặc trưng bằng kỹ thuật PCR. Hai cặp mồi để khuếch đại

hai gen dps và dxs tương ứng là:

(DpsF): 5‟-ATTAAGATCTATTGCCGCACAAGGCATCAGTT-3‟; (DpsR): 5‟-

ATTTGCTAGCTCAGTTGAGACGCTCGATGCA-3‟; 5‟-TTTTCCATGGCCG (dxsF): GAATGCCACAGAC-3‟; (dxsR): 5‟-

TTTTGCTAGCTCAGCCGGCGAAACCGACGC-3‟.

Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR cho thấy 4 chủng (TT1, TT2-1, TT2-2, TT4) đều xuất

hiện băng DNA kích thước tương ứng lần lượt là 1077 bp và 1920 bp phù hợp với kích

thước của hai đoạn gen dps và dxs tương ứng theo như thiết kế. Tất cả các chủng khác đều

không xuất hiện băng DNA mong đợi với phản ứng khuếch đại hai gen này (hình 3.3A và

57

3.4A). với phản ứng khuếch đại gen hai gen này. Tuy nhiên để minh chứng thật sự đó là

hai đoạn gen dps và dxs, sản phẩm PCR gen dps và dxs của 4 chủng được cắt lần lượt bằng

enzyme hạn chế PstI và NdeI, theo tính toán nếu là gen dps sẽ tạo thành băng DNA có kích

thước 548 và 529 bp, nếu là gen dxs sẽ tạo thành băng DNA có kích thước 1379 và 548 bp.

Kết quả thu được thể hiện ở điện di đồ hình 3.3A và 3.3B. Từ ảnh điện di cho thấy sau khi

cắt sản phẩm PCR của hai gen dps và dxs bởi hai enzyme hạn chế đã tạo ra hai băng DNA

với kích thước xấp xỉ 529 và 548 bp và hai băng này đã trùng vị trí trong bản điện di với

gen dps; 1379 và 541 bp với gen dxs. Kết quả này cho thấy rằng gen dps và dxs được

khuếch đại là gen đặc trưng của A. tumefaciens và 4 chủng TT1, TT2.1, TT2.2, TT4 là vi

1 2 3 4 5 6 7 8 M

Kb

1077 bp

Kb – 3,0 – 2,0 – 1,5 – 1,2 1,0 – 0,5

khuẩn A. tumefaciens.

548 bp 529 bp

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 3,0 – 2,0 – 1,2 – 1,0 0,5 –

A B

Hình 3.3. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và sản phẩm cắt DNA bằng enzyme hạn chế cho gene dps (B). Đường chạy 1-12 (A), sản phẩm PCR gene dps từ DNA tổng số chủng TT1, TT2.1, TT2.2, TT3, TT4, ML1-ML7, tương ứng. Đường chạy 1-8 (B), sản phẩm PCR trước và sau khi cắt bằng PstI của 4 chủng TT1, TT2-1, TT2-2, TT4, tương ứng. M, thang DNA chuẩn 100 bp (Fermentas)

1 2 3 4 5 6 7 8 M

Kb

 1920 bp

1920 bp

1379 bp

541 bp

Kb – 3,0 – 2,0 – 1,5 – 1,2 0,6 – 0,5

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 3,0 – 2,0 – 1,5 –

0,5 – A B

Hình 3 4. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và sản phẩm cắt DNA bằng enzyme hạn chế cho gene dxs (B). Đường chạy 1-12 (A), sản phẩm PCR gene dxs từ DNA tổng số chủng TT1, TT2.1, TT2.2, TT3, TT4, ML1-ML7, tương ứng. Đường chạy 1-8 (B), sản phẩm PCR trước và sau khi cắt bằng NdeI của 4 chủng TT1, TT2-1, TT2-2, TT4, tương ứng. M, thang DNA chuẩn 100 bp (Fermentas)

58

3.1.1.5.Tuyển chọn chủng A. tumefaciens sinh tổng hợp CoQ10 cao

Từ các chủng phân lập trên và 3 chủng chuẩn A. tumefaciens tiến hành nuôi cấy trên môi trường MT2, nhiệt độ 30oC, pH đầu 7, để thu Coenzyme Q10. Sau 4 ngày nuôi cấy,

sinh khối tế bào được thu nhận bằng cách ly tâm và được tách chiết để xác định hàm lượng

Coenzyme Q10. Kết quả được thể hiện trên hình 3.5.

Hình 3.5. Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 các chủng A. tumefaciens. Bốn chủng phân lập TT1, TT2.1, TT2.2, TT4 và ba chủng đối chứng AA2, EHA 105, LBA 4404.

Kết quả cho thấy, chủng A. tumefaciens TT4 sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất sau 96 giờ

nuôi cấy (13 mg/l) so với các chủng phân lập và chủng chuẩn khác (hình 3.5). Chủng này

sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tăng cường sự sinh tổng hợp CoQ10.

3.1.2. Định tên chủng A. tumefaciens TT4

Tiến hành định tên chủng A. tumefaciens TT4 theo phương pháp sinh học phân tử

bằng cách xác định trình tự 16S-rRNA của TT4. Sản phẩm PCR với cặp mồi 16S: Mồi

xuôi 27F: 5‟-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3‟; Mồi ngược 1492R:

5‟TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3‟ có kích thước 1465 bp đã được tinh sạch, giải

trình tự và đăng kí trên GenBank (m số KR261089.1). Kết quả so sánh trình tự 16S

rDNA bằng công cụ Blastn trên ngân hàng NCBI cho thấy đoạn trình tự 16S rDNA của

TT4 có độ tương đồng 100% với trình tự vùng 16S của 24 chủng thuộc loài A.

tumefaciens. (bảng 3.2).

Từ các kết quả phân tích về hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử chủng vi

khuẩn phân lập TT4 được định danh là Agrobacterium tumfaciens TT4.

59

Bảng 3.2. Mã số trình tự một số chủng A. tumfaciens trên ngân hàng gen có độ tương đồng 100% về trình tự đoạn gen 16S rDNA được xác định của chủng A. tumefaciens TT4

TT Chủng M số trình TT Chủng M số trình

tự trên ngân tự trên ngân

hàng gen hàng gen

1 A. tumefaciens 12b3 KF875446.1 13 A. tumefaciens VA9S9 HQ916822.1

2 A. tumefaciens D19-1 KM488422.1 14 A. tumefaciens C115 HQ704711.1

3 A. tumefaciens ALEB 5A KF460525.1 15 A. tumefaciens 30D GQ337862.1

4 A. tumefaciens S10 JX498970.1 16 A. tumefaciens B228 GQ169811.1

5 A. tumefaciens EU87 JF681291.1 17 A. tumefaciens W3 FJ425916.1

6 A. tumefaciens SU-11 JQ756125.1 18 A. tumefaciens wsn1-4 DQ790018.1

7 A. tumefaciens WR45 JF700418.1 19 A. tumefaciens ORS EF054875.1

3405

8 A. tumefaciens Ch6 AM286273.1 20 A.tumefaciens AY513489.1

2002000903

9 A. tumefaciens Ch3 AM286270.1 21 A. tumefaciens DQ267109.1

CCBAU 01041

10 A. tumefaciens B8S AY850392.1 22 A. tumefaciens CFBP AJ389894.1

2884

11 A. tumefaciens S10 JX498970.1 23 A. tumefaciens D19 KM488421.1

12 A. tumefaciens OM-Ag01 KJ921982.1 24 A. tumefaciens 20-1 KM488423.1

60

3.2. NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN A. TUMEFACIENS SINH TỔNG HỢP

COENZYME Q10

3.2.1. Tách dòng gen dps và dxs từ A. tumefaciens TT4

Chủng A. tumefaciens TT4 được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng qua đêm để thu

sinh khối. DNA tổng số được tách chiết từ sinh khối và được kiểm tra bằng điện di trên gel

agarose (hình 3.6) cho thấy xuất hiện một băng DNA rất đậm, không thấy xuất hiện vệt

sáng phía dưới. Kết quả này chứng tỏ DNA thu được là nguyên vẹn. Kết quả đánh giá chất

lượng DNA bằng đo độ hấp thụ quang có tỷ lệ A260/A280 là 2,01 và A260/A230 là 1,98. Kết

quả này chỉ ra rằng DNA tổng số thu được là sạch, đảm bảo yêu cầu thí nghiệm. Hàm

lượng DNA đạt 505 ng/µl, đảm bảo đủ lượng DNA cho các nghiên cứu tách dòng gen tiếp

theo.

DNA tổng số →

Hình 3.6. Phổ điện di DNA tổng số tách chiết từ A. tumefaciens TT4

DNA tổng số đã tách chiết ở trên được dùng làm khuôn để khuếch đại hai đoạn gen

dps và dxs mã hóa hai enzyme chìa khóa của con đường tổng hợp CoQ10 là decaprenyl

diphosphate synthase và 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase. Theo thiết kế với cặp

mồi DpsF/R sẽ cho phép khuếch đại đoạn gen dps có kích thước 1077 bp; với cặp mồi

DxsF/R sẽ cho phép khuếch đại đoạn DNA có kích thước 2103 bp bao gồm đoạn gen dxs

(1920 bp) và đoạn DNA phía đầu 5‟ của gen này (183 bp). Kết quả phổ điện di sản phẩm

PCR cho thấy xuất hiện một băng DNA xấp xỉ 1,2 kb (hình 3.7A) và một băng kích thước

khoảng 2,1 kb (hình 3.7B) khi sử dụng cặp mồi DpsF/R và DxsF/R tương ứng. Kích thước

của các sản phẩm PCR thu được là hoàn toàn phù hợp với kích thước của hai đoạn gen

đích cần khuếch đại. Từ kết quả này cho thấy hai đoạn gen dps và dxs đã được khuếch đại

từ khuôn DNA tổng số của chủng A. tumefaciens TT4 bằng kỹ thuật PCR.

61

A

dps M

B

dxs M

Kb

Kb

- 3,0 - 2,0 - 1,2 - 0,5

- 3,0 - 2,0 - 1,2 - 0,5

1077 bp 

2100 bp 

- 0,2

- 0,2

Hình 3.7. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) và dxs (B) từ DNA tổng số của A. tumefaciensTT4. M, thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scientific, Mỹ)

Sản phẩm PCR của hai gen dps và dxs được xử lý bằng enzyme Klenow và gắn vào

vector tách dòng pJET1.2/blunt (Thermo Scienctific, USA) theo hướng dẫn sử dụng của

kit. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào E. coli DH10b để chọn dòng mang vector tái tổ

hợp. Vector pJET1.2/blunt mang gen kháng ampiciline và gen gây chết eco47IR cho phép

chọn lọc các dòng mang vector tái tổ hợp một cách hiệu quả. Theo thiết kế, gen đích sẽ

được gắn vào vị trí MCS nằm giữa gen eco47IR trên vector dẫn đến bất hoạt gen eco47IR

và cho phép E. coli mang vector tái tổ hợp có thể sinh trưởng được. E. coli mang vector

pJET1.2/blunt tự đóng vòng sẽ bị chết do chứa gen eco47IR ở trạng thái hoạt động. Kết

quả biến nạp cho thấy xuất hiện 10 và 7 khuẩn lạc trên môi trường LB thạch chứa

ampicilin (100 µg/ml) tương ứng với hai gen dps và dxs. Plasmid đã được tách chiết từ

những khuẩn lạc và được sử dụng cho sàng lọc sơ bộ để chọn ra một dòng tương ứng với

mỗi gen để nghiên cứu tiếp theo. Trước tiên, plasmid được sử dụng làm khuôn cho phản

ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu gen dps và dxs tương ứng. Kết quả cho thấy đều xuất

hiện băng sản phẩm PCR trên phổ diện di với kích thước phù hợp với kích thước của gen

dps (hình 3.8A) và dxs (hình 3.8B). Kích thước sản phẩm PCR từ khuôn DNA plasmid

tương đương với kích thước sản phẩm PCR từ khuôn DNA tổng số của chủng A.

tumefaciens TT4 ban đầu (hình 3.8). Kết quả nhận được chứng tỏ hai dòng được lựa chọn

mang gen đích tương ứng là dps và dxs. Tuy nhiên, để chắc chắn hơn DNA plasmid của

hai dòng này tiếp tục được xử lý bằng các enzyme hạn chế thích hợp.

62

A

C3 TT4 M

B

C6 TT4 M

Kb

Kb

- 3,0 - 2,0 - 1,2 - 0,5

1077 bp 

- 3,0 - 2,0 - 1,2 - 0,5

- 0,2

2100 bp 

- 0,2

Hình 3. 8. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) và dxs (B) từ DNA plasmid của các dòng tái tổ hợp. C3, C6 là khuôn DNA plasmid tách chiết từ clone số 3 và số 6. TT4 là khuôn DNA tổng số tách chiết từ chủng A. tumefaciens TT4. Đường chạy M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ)

Theo thiết kế hai trình tự cắt của enzyme hạn chế SacI và BamHI được đưa vào đầu 5‟

của cặp mồi DpsF/R và tương tự trình tự cắt của BamHI và SalI được đưa vào cặp mồi

DxsF/R. Kết quả xử lý bằng enzyme cắt hạn chế cho thấy đối với cả hai clone 3 và 6 đều

văng ra băng DNA có kích thước tương ứng với kích thước gen dps khoảng 1077 bp (hình

3.9A) và gen dxs khoảng 2100 bp (hình 3.9B). Từ các kết quả thu được có thể kết luận

A

1 2 M

B

3 4 M

Kb

Kb

 2100 bp 

- 3,0 - 2,0

- 3,0 - 2,0

- 1,2

- 1,2

 1077 bp 

- 0,5 - 0,2

- 0,5 - 0,2

rằng hai dòng số 3 và 6 là các dòng tái tổ hợp mang hai gen đích tương ứng là dps và dxs.

Hình 3. 9. Phổ điện di sản phẩm cắt DNA plasmid bằng các enzyme hạn chế đối với dòng số 3 mang gen dps (A) và dòng 6 mang gen dxs (B). Đường chạy 1, 3 là DNA plasmid chưa cắt; đường chạy 2, 4 là DNA plamid được cắt bằng cặp enzyme SacI/BamHI và BamHI/SalI tương ứng với clone 3 và 6. Đường chạy M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ)

Để kiểm tra trình tự và khung đọc của hai gen đích dps và dxs đã được tách dòng hai

plasmid tái tổ hợp được sử dụng làm khuôn cho phản ứng xác định trình tự. Trình tự

63

nuclecotide và axit amin suy diễn của gen dps (hình 3.10) và dxs (hình 3.11) đã được xác

định. Kết quả cho thấy gen được tách dòng chứa một khung đọc mở cho phép dịch mã tổng

ttgccgcacaaggcatcagtttttattgtcgaattcaaattcgaactggagtcctgtccc M P H K A S V F I V E F K F E L E S C P ttgggcgtcgtcataccgcttgaagaaagcaaaaacaaactcgcatccgtcaagccgctt L G V V I P L E E S K N K L A S V K P L gtcgacctgacccgccccgacatggaacgggtgaaccagcttatcctttccaaggccggt V D L T R P D M E R V N Q L I L S K A G tccgacgtgcagatgatacccgaggtggccaaccacctcatctcgtcaggcggcaagcgc S D V Q M I P E V A N H L I S S G G K R ctgcggccgatgctgacgctcgcctcggcctcgatgttcggttacgagggcgataatcac L R P M L T L A S A S M F G Y E G D N H atcaagctcgccacgagcgttgagttcatgcacacggcgacgcttctgcatgacgacgtg I K L A T S V E F M H T A T L L H D D V gtggatgaaagcgatctgcgtcgcggcaaatccaccgcacgcaccatctggggtaaccag V D E S D L R R G K S T A R T I W G N Q gcaagcgttctcgtcggcgacttcctgcttggccaggctttccgcatgatggtggatgtc A S V L V G D F L L G Q A F R M M V D V ggctctctcgatgccctcgacgtgctctccaccgccgcctcggtcatcgccgagggtgag G S L D A L D V L S T A A S V I A E G E gtgctgcagctttcggtcgccaagaacatggaaacgaccgaggacgattatcttcaggtg V L Q L S V A K N M E T T E D D Y L Q V attcgcgccaagacggctgccctcttcgccgccgcggccgaagtcggccccatcgtcgcc I R A K T A A L F A A A A E V G P I V A aagaccgacaaggcgacccgcagtgccctgaaatcttatggcatgaatctcggcctcgcc K T D K A T R S A L K S Y G M N L G L A ttccagctggtcgatgacgtcttggactatggcggcaagtcggccgatctcggcaaaaac F Q L V D D V L D Y G G K S A D L G K N acaggcgacgatttccgcgagggcaagatcaccctgccggtcatcctgtcctatcgccgc T G D D F R E G K I T L P V I L S Y R R ggcacgcaggatgagcgcgctttctggcgcaatgccatcgaaaaaggcgagagcagcgac G T Q D E R A F W R N A I E K G E S S D gagaacctcgaaaaggcgctcggcctgatcacaaaatataacggcctcggtgatacgata E N L E K A L G L I T K Y N G L G D T I ggccgtgcaacgcattatggcaccattgcccgcgatgcgcttgcaccgttgccgcagagc G R A T H Y G T I A R D A L A P L P Q S ccctggaaagatgcgcttctggaagtgatcgacttctgcatcgagcgtctcaactga

P W K D A L L E V I D F C I E R L N -

hợp một protein nguyên vẹn.

Hình 3.10. Trình tự nucleotide và axit amin suy diễn của gen dps được tách dòng

Từ kết quả phân tích trình tự decaprenyl diphosphate synthase từ A. tumefaciens TT4

(mã số ngân hàng gen AIC32316.1) có độ tương đồng protein với decaprenyl diphosphate

synthase của A. tumefaciens (ABI26723.1, AAP56240.1, AAY82368.1) là 99%, A.

tumefaciens AAY82368.1 là 97%, Agrobacterium sp. ATCC31749 (EGL64579.1) là 99%,

với polyprenyl synthetase của A. tumefaciens WP_035261923.1, WP_003503263.1,

WP_035219036.1) là 99%.

64

ttgaccggaatgccacagacaccattgcttgaccgggtgaattttccctccgatctcaag M T G M P Q T P L L D R V N F P S D L K gagatcgatgatcgcgacttgccggaactggcaagggaactgcgcgacgagatgatcgat E I D D R D L P E L A R E L R D E M I D gccgtgtcgaaaaccggtgggcatctgggtgccggccttggtgtggtggaactgacgatt A V S K T G G H L G A G L G V V E L T I gccatccacaaggtcttcaacacgcccgaagaccggctgatcttcgatgtcggacaccaa A I H K V F N T P E D R L I F D V G H Q tgttatccgcacaagatcctgaccggccggcgggatcgcatccgcacgctgcggcaggaa C Y P H K I L T G R R D R I R T L R Q E ggtggcctttccggtttcacccgccgtgcggaaagcgaatatgacgatttcggcgccggc G G L S G F T R R A E S E Y D D F G A G cattcctccacctccatttccgccggtctcggcatggcggtggcggcgggcttggatggc H S S T S I S A G L G M A V A A G L D G agcgaccgcaaggtgatcgctgtcatcggcgacggctcgatgtctgccggtatggccttt S D R K V I A V I G D G S M S A G M A F gaggcgctgaacaatgccggcgcgctcgatgcacgactgatcgtcatcttgaacgacaac E A L N N A G A L D A R L I V I L N D N gacatgtccattgcgccgccgacgggcgcgatgagcgcctatctggcgcgtctcgcttcc D M S I A P P T G A M S A Y L A R L A S ggccgcacctatatgggttttcgcgatttcggcaagaagctcaccgcctatctcggcaag G R T Y M G F R D F G K K L T A Y L G K acgatcgaccgcgccattacccgcgccgtgacccatgcgcgcggttacgtgaccggcggc T I D R A I T R A V T H A R G Y V T G G accctgttcgaggagctcggtttctatcacatcggcccgatcgacggtcactccttcgac T L F E E L G F Y H I G P I D G H S F D cacctgttgccggtgctgcgcaatgtgcgcgacaaccagaaaggccctgtcctcatccat H L L P V L R N V R D N Q K G P V L I H gtggtgacacagaaaggcaagggttatgcgccggcggaagccgcagcggacaaatatcac V V T Q K G K G Y A P A E A A A D K Y H ggcgtcaacaagttcgatgtcatcaccggcgcgcaggcgaaagccaagccgaatgcgccg G V N K F D V I T G A Q A K A K P N A P agctataccagcgtctttgccgaggcgctgatccaggaagccacgctcgatgagaaaatc S Y T S V F A E A L I Q E A T L D E K I atcggtgtgacggccgcgatgcccaacggtaccggcctcgacaagatggccgagctgttc I G V T A A M P N G T G L D K M A E L F ccggcgcgcaccttcgatgtcggcattgccgaacagcatgccgtcacctttgcggcggga P A R T F D V G I A E Q H A V T F A A G cttgcggctgacggttacaagccgttctgcgcgctttattccaccttcctgcagcgcggt L A A D G Y K P F C A L Y S T F L Q R G tacgaccagttggtgcatgatgtggcaatacagagcctgcccgtgcgtttcccgatcgac Y D Q L V H D V A I Q S L P V R F P I D cgcgccggttttgtcggcgccgacgggccgacccatgccggctctttcgacaccactttc R A G F V G A D G P T H A G S F D T T F ctcgccaccctccccggcatggtagttatggcggcctcggatgaggcggagctgaaacat L A T L P G M V V M A A S D E A E L K H atggtccgcacggcggcggcctatgacgaaggcccgatttccttccgttatccgcgcgga M V R T A A A Y D E G P I S F R Y P R G gaaggtgtcggcgttgaaatgcccgcacgcggggagattcttcagatcggcaagggtcgc E G V G V E M P A R G E I L Q I G K G R atcatcaaggaaggcacgaaggttgccctgctttccttcggaacccgccttgcggaatgc I I K E G T K V A L L S F G T R L A E C ctggcggcggccgaagacctggacgccgccggtcttcccacgacggttgccgatgcgcgc L A A A E D L D A A G L P T T V A D A R ttcgccaagccgctcgatctcgatctcatccgccagctcgccagccatcatgagattctg F A K P L D L D L I R Q L A S H H E I L gtgacggtcgaggaaggctcggtcggcggtttcggcgcacatgtgctgcatttcatggca V T V E E G S V G G F G A H V L H F M A agtggcggcctgctcgatcacggccccaaggtgcggacactcacactgccggaccagtgg S G G L L D H G P K V R T L T L P D Q W gtggaacaggccaagccagagaccatgtatgccaatgccggcctcgaccgggccggcatc

65

V E Q A K P E T M Y Atttccacggtgttcaatgcgctcggccag I S T V F N A L G Q

Hình 3.11. Trình tự nucleotide và axit amin suy diễn của gen dxs được tách dòng

Từ kết quả phân tích trình tự 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase từ A.

tumefaciens TT4 (mã số ngân hàng gen AIC32317) có độ tương đồng protein với 1-deoxy-

D-xylulose 5-phosphate synthase của A. tumefaciens (WP_010971117.1,

WP_035218598.1, WP_003521077.1, WP_035241704.1) là 98%, A. tumefaciens

KJX89273.1 là 99%, Agrobacterium sp (WP_037090795.1, WP_034495944.1,

WP_045532601.1, WP_035214476.1) là 99%.

Thông thường bộ ba mã hóa cho methionine là ATG. Tuy nhiên có một số công trình

nghiên cứu đã chứng minh riêng đối với một số chủng A. tumefaciens có trình tự protein

của gen dps mã hóa decaprenyl diphosphate synthase, trình tự protein của gen dxs mã hóa

1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase lại có bộ ba mở đầu là TTG. Ví dụ như gen dps

của chủng A. tumefaciens KFCC-10875 [50]. Gen dxs của chủng A. tumefaciens BNQ0605

[16]. Những kết quản nghiên cứu trên cũng hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của

luận án.

3.2.2. Tạo cấu trúc biểu hiện mang gen dps và dxs

Trong nghiên cứu này vector pCAMBIA1301 với kích thước 11837 bp được sử dụng

làm vector biểu hiện phù hợp chủng chủ A. tumefaciens. Hai gen dps và dxs sẽ được đưa

độc lập và đồng thời vào vector pCAMBIA1301để tạo ra các cấu trúc biểu hiện pCAM-

dps, pCAM-dxs và pCAM-dps-dxs. Cấu trúc biểu hiện tái tổ hợp được thiết kế là gen đích

được đặt vào cấu trúc biểu hiện LacZ điều khiển bởi promoter lac có sẵn trong vector

pCAMBIA1301. Promoter lac là một promoter điển hình ở E. coli nên nó có thể điều

khiển biểu hiện gen trong vật chủ này. Đối với A. tumefaciens, dựa vào thông tin hệ gen đã

được giải mã chúng tôi đã tìm được promoter lac trong vật chủ này. A. tumefaciens cũng là

một vi khuẩn có khả năng sử dụng lactose (kết quả đã được trình bày trong luận án). Ngoài

ra, theo nghiên cứu của Chen và cộng sự 1991 (Controlled Expression of the

Transcriptional Activator Gene virG in Agrobacterium tumefaciens by Using the

Escherichia coli lac Promoter) thì lac promoter đã được chứng minh phù hợp cho biểu hiện

gen ở A. tumefaciens. Do đó, vector pCAMBIA1301 có thể cho phép biểu hiện gen đích ở

trong cả E. coli và A. tumefaciens.

66

3.2.2.1. Tạo cấu trúc biểu hiện mang gen dps và dxs độc lập

Hai gen dps và dxs được cắt ra khỏi vector tách dòng bằng hai cặp enzyme cắt hạn chế

tương ứng là SacI/BamHI và BamHI/SalI. Hai đoạn gen này được tinh sạch bằng phương

pháp thôi gel sử dụng kit DNA gel purification kit (QIAGEN, Mỹ). Hai gen dps và dxs thu

được đã được gắn vào vector biểu hiện pCAMBIA1301 đã được mở vòng bằng cặp

enzyme cắt hạn chế tương ứng. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào E. coli DH10b để

chọn dòng. Kết quả biến nạp cho thấy xuất hiện 11 và 2 khuẩn lạc tương ứng với gen dps

và dxs trên môi trường LB thạch chứa kanamycin (100 µg/ml). DNA plasmid từ các dòng

đã được sử dụng để sàng lọc sơ bộ cho các nghiên cứu tiếp theo. Đối với gen dps, 8 dòng

đã được lựa chọn để kiểm tra sự có mặt của gen đích bằng phản ứng PCR sử dụng mồi đặc

hiệu (hình 3.12A) và xử lý bằng cặp enzyme cắt hạn chế SacI/BamHI (hình 3.12B). Kết

quả cho thấy cả 8 dòng đều xuất hiện băng DNA khoảng 1,1 kb tương ứng với kích thước

1 2 3 4 5 6 7 8 ĐC M

1 2 3 4 5 6 7 8 + - M

Kb

Kb

- 3,0 - 2,0 - 1,2

- 3,0 - 2,0 - 1,2

gen dps (1077bp) (hình 3.12B).

1077 bp 

A

B

- 0,5 - 0,2 - 0,5 - 0,2

Hình 3. 12. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và cắt enzyme hạn chế (B) của các dòng được lựa chọn đối với gen dps. Đường chạy 1-8 tương ứng với 8 dòng được lựa chọn. ĐC là sản phâm PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen. Đường chạy (+) là sản phẩm PCR từ khuôn gốc. Đường chay (-) là sản phẩm cắt plasmid đối chứng. M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ)

67

1 2 ĐC M

1 2 M

Kb

Kb

- 3,0 - 2,0 - 1,2

- 3,0 - 2,0 - 1,2

2100 bp 

A

B

- 0,5 - 0,5

2100 bp  Hình 3.13. Phổ điện di sản phẩm PCR (A) và cắt enzyme hạn chế (B) của các dòng được lựa chọn đối với gen dxs. Đường chạy 1-2 tương ứng với 2 dòng được lựa chọn. ĐC là sản phâm PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen. M là thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ)

Tương tự đối với gen dxs, 2 dòng đã được lựa chọn để kiểm tra sự có mặt của gen đích

bằng phản ứng PCR sử dụng mồi đặc hiệu (hình 3.13A) và xử lý bằng cặp enzyme

BamHI/SalI (hình 3.14B). Kết quả cho thấy cả 2 dòng đều xuất hiện băng DNA khoảng 2,1

kb tương ứng với kích thước đọan gen đích dxs (2103 bp) (hình 3.13B). Các kết quả thu

được cho thấy rằng gen dps và dxs đã được tách dòng thành công trong vector biểu hiện

pCAMBIA1301. Các cấu trúc tái tổ hợp được ký hiệu pCAM-dps và pCAM-dxs tương

ứng.

3.2.2.2. Tạo cấu trúc biểu hiện mang đồng thời hai gen dps và dxs

Để tạo cấu trúc biểu hiện tái tổ hợp chứa đồng thời hai gen dps và dxs, gen dps thu

được từ vector tách dòng sau khi xử lý bởi cặp enzyme cắt hạn chế SacI và BamHI được

nối vào vector pCAM-dxs đã được mở vòng bởi SacI/BamHI. Sản phẩm nối ghép được

biến nạp vào E. coli DH10b và kết quả thu được 10 khuẩn lạc. Kết quả PCR từ khuôn

plasmid sử dụng cặp mồi DpsF/R cho thấy cả 10 khuẩn lạc đều cho sản phẩm có kích

thước tương đương với kích thước đoạn gen dps (1077 bp) (hình 3.14A). Đối chứng sử

dụng khuôn pCAM-dxs không thấy xuất hiện sản phẩm, điều đó chứng tỏ plasmid từ 10

dòng thu được mang gen dps. Dòng số 9 được lựa chọn để kiểm tra plasmid bằng việc cắt

với SacI/BamHI, kết quả cho thấy xuất hiện 1 băng DNA xấp xỉ 1,2 kb (hình 3.14B). Từ

kết quả này có thể chứng minh rằng đã gắn được gen dps vào vector tái tổ hợp pCAM-dxs

để tạo cấu trúc tái tổ hợp mới chứa đồng thời hai gen dps và dxs, đượcký hiệu pCAM-dps-

dxs.

68

RE/9 M2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ĐC M1

Kb

Kb

- 3,0

- 3,0 - 2,0 - 1,2

- 2,0 - 1,0

- 0,5

A

- 0,5

B

1077 bp 

1077 bp  Hình 3.14. Phổ điện di sản phẩm PCR từ khuôn plasmid của 10 dòng sử dụng cặp mồi DpsF/R (A) và sản phẩm cắt enzyme hạn chế (B). Đường chạy 1-10, sản phẩm PCR từ khuôn plasmid của 10 dòng tương ứng; mẫu đối chứng sử dụng khuôn pCAM-dxs (ĐC); RE/9, dòng số 9 được xử lý bởi SacI/BamHI thang DNA chuẩn 100 bp (M1) và 1kb (M2)

Một số nghiên cứu trước đã chứng minh sự biểu hiện của gen dps và dxs thông qua

việc đánh giá khả năng sinh tổng hợp CoQ10 trong E. coli [50, 73, 104]. Vì vậy, trong

nghiên cứu này để đánh giá sự biểu hiện của hai gene dps và dxs, các cấu trúc tái tổ hợp

pCAM-dps, pCAM-dxs, pCAM-dps-dxs được biến nạp vào tế bào E. coli BL21 (DE3) khả

biến bằng phương pháp sốc nhiệt. Chủng E. coli tái tổ hợp được nuôi cấy trên môi trường LB, cảm ứng bằng 0.25 mM IPTG ở 37oC. Sau 12 giờ nuôi cấy CoQ10 được thu nhận từ tế

bào và phân tích bằng hệ thống HPLC. Kết quả được biểu diễn trên hình 3.16.

Từ hình 3.15 (B, C, D, E) đều xuất hiện cho thấy 3 phổ pic 1, 2 và CoQ10. Theo một

số nghiên cứu của của Lee và cộng sự (2004), Liu và cộng sự (2006) và Park và cộng sự

(2005) thì phổ pic 1 được dự đoán là CoQ8, phổ pic 2 là CoQ9 [50, 52, 73]. Vì vậy, dựa

theo kết quả hình 3.15B thì E. coli BL21 (DE3) chứa vector pCAM tổng hợp chủ yếu

CoQ8. Từ hình 3.15C cho thấy, E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp mang gen dxs chỉ tổng hợp

chủ yếu CoQ8, CoQ9 không đáng kể, tuy nhiên hàm lượng CoQ8 cao hơn so với E. coli

BL21 (DE3) chứa vector pCAM. Kết quả này có thể lý giải rằng gen dxs trong E. coli

BL21 (DE3) chỉ làm tăng tiền chất IPP, một tiền thân cho quá trình tổng hợp CoQ, tuy

nhiên trong E. coli không có gene xúc tác cho quá trình tạo mạch nhánh CoQ10 mà chỉ

tổng hợp được CoQ8 và CoQ9 do đó làm tăng hàm lượng CoQ8 so với E. coli BL21 (DE3)

chỉ mang vector pCAM. Trong khi E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp mang gen dps (hình

3.15D) ngoài sinh tổng hợp CoQ8, CQ9 còn sinh tổng hợp CoQ10 là do gene dps xúc tác

sự ngưng tụ giữa IPP và DMAPP để sản xuất decaprenyl diphosphate - mạch nhánh của

69

CoQ10. Đối với E. coli BL21 (DE3) chứa đồng thời 2 gene dps và dxs (hình 3.16E) cho

hàm lượng CoQ10 cao hơn so với E. coli BL21 chỉ mang gen dps vì cả 2 gene đều hỗ trợ

cho quá trình tổng hợp mạch nhánh của CoQ10. Những kết quả này cũng phù hợp với một

số nghiên cứu trước đây [50, 52, 73]. Những kết quả trên cho thấy 2 gene dps và dxs có

nguồn gốc từ A. tumefaciens TT4 đã được biểu hiện thành công và làm tăng hàm lượng

A

8 Q o C

B

8 Q o C

9 Q o C

C

9 Q o C

8 Q o C

D

8 Q o C

9 Q o C

E

CoQ10 trên E. coli BL21(DE3).

Hình 3.15. Phổ sắc ký HPLC của CoQ10 chuẩn (A), E. coli BL21 chứa pCAM (B), E. coli BL21chứa pCAM.dxs (C), E. coli BL21chứa pCAM.dps (D), BL21chứa pCAM.dps.dxs (E). Dịch chiết CoQ10 được phân tích bằng HPLC (Agilent 1200 Series, USA) trên cột C18 (250 mm x 4,6 mm), sử dụng ethanol và methanol là pha động với tốc độ dòng chảy là 0,5 ml/phút theo phương pháp gradient, nhiệt độ cột là 35oC, bước sóng hấp phụ 275 nm.

70

3.2.2.3. Tạo chủng A. tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc pCAM-dps-dxs

Như kết quả khảo sát ở trên chủng A. tumefaciens chuẩn EHA 105 có khả năng tổng

hợp CoQ10 và nhạy cảm với kháng sinh kanamycin được sử dụng làm chủng chủ. Các cấu

trúc tái tổ hợp pCAM-dps, pCAM-dxs, pCAM-dps-dxs được biến nạp vào tế bào A.

tumefaciens khả biến bằng phương pháp xung điện. Các dòng tái tổ hợp được chọn lọc trên

môi trường chứa kanamycin (100µg/ml). Để xác định được khả năng sinh tổng hợp CoQ10

của các chủng tái tổ hợp, các chủng chứa pCAM-dps, pCAM-dxs, pCAM-dps-dxs, và

chủng đối chứng pCAM được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung 100µg/ml kanamycin ở 30oC. Sinh khối được thu nhận sau 96 giờ nuôi cấy để tách chiết CoQ10. Khả năng sinh

tổng hợp CoQ10 của các chủng tái tổ hợp so với chủng đối chứng được thể hiện trên hình

3.16.

Hình 3.16. Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các chủng A. tumefaciens tái tổ hợp. Chủng tái tổ hợp chứa vector tái tổ hợp mang đơn gen pCAM-pds và pCAM-dxs và đồng thời hai gen pCAM- dps-dxs. Chủng đối chứng mang vector pCAMBIA1301

Kết quả hình 3.16 cho thấy chủng tái tổ hợp chứa đơn gen pCAM-dps và pCAM-dxs

có khả năng sinh tổng hợp CoQ10 tăng lên 1,4 lần so với đối chứng. Khi kết hợp cả hai gen

dps và dxs tạo chủng pCAM-dps-dxs đã làm tăng khả năng tổng hợp CoQ10 của A.

tumefaciens lên 1,80 lần so với chủng A. tumefaciens không mang gen (pCAM). Hàm

lượng CoQ10 được tăng lên sau khi đưa các gen dps và dxs vào tế bào chủ A. tumefaciens

được lý giải như sau: theo như hình 1.4 gen dxs mã hóa 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate

synthase làm tăng cường tiền chất isopentenyl diphosphate- một tiền chất quan trọng để tạo

nên mạch nhánh CoQ10 và gen dps mã hóa cho decaprenyl diphosphate synthase trực tiếp

để tạo ra mạch nhánh CoQ10 mang tính chất định hướng để tổng hợp CoQ10 bởi vì từ tiền

71

chất là isopentenyl diphosphate ngoài tổng hợp CoQ10 còn có thể tổng hợp các hợp chất

khác. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu trước đây của Cheong và cộng sự tạo

ra chủng A. tumefaciens BNQ-pGPRX11 mang đồng thời 2 gene dps và dxs và cũng chứng

minh sự biểu hiện của hai gen dps và dxs thông qua hai tế bào chủ là A. tumefaciens làm

tăng hàm lượng CoQ10 gấp 2,04 lần so với đối chứng [10].

Do đó các dòng A. tumefaciens mang cấu trúc pCAM-dps-dxs được lựa chọn cho

nghiên cứu tiếp theo.

Kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của 28 dòng A. tumefaciens pCAM-

dps-dxs tái tổ hợp cho thấy khả năng sinh tổng hợp CoQ10 là khác nhau (hình 3.17). Trong

số 28 dòng có 10 dòng (1, 2, 3, 8, 10, 11, 12, 14, 15, 20) có khả năng tổng hợp CoQ10 đạt

trên 75% so với dòng cao nhất, chỉ có 3 dòng (3, 12 và 15) có khả năng tổng hợp CoQ10

đạt trên 90% so với dòng cao nhất, dòng số 12 có khả năng tổng hợp CoQ10 cao nhất so

với dòng khác (19 mg/ml) gấp 2,16 lần so với chủng gốc mang vector pCAM, vì vậy dòng

số 12 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

Hình 3.17. Khả năng sinh tổng hợp CoQ10 của các dòng A. tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc pCAM-dps-dxs

Dòng số 12 được kiểm tra cấu trúc pCAM-dps-dxs bằng cách tiến hành tách plasmid,

thực hiện phản ứng PCR và xử lý bởi enzyme hạn chế. Kết quả PCR từ khuôn plasmid sử

dụng cặp mồi DpsF/R và DxsF/R cho thấy đều cho sản phẩm có kích thước tương đương

với kích thước đoạn gen dps (1077 bp) và dxs (2103bp) (hình 3.18B, 3.18A). Để kiểm tra

plasmid bằng việc cắt với SacI/BamHI, kết quả cho thấy xuất hiện 1 băng DNA xấp xỉ 1,2

72

kb (hình 3.1C). Từ kết quả này có thể khẳng định rằng vector tái tổ hợp pCAM-dps-dxs đã

Kb

M 1 3 M M 2

Kb - 3,0

-

- 2,0 - 1,0

2100bp 3,0 -

0,5 -

2,0 - 1,0 -

được đưa vào thành công trong A. tumefaciens. Dòng số 12 được ký hiệu là A. tumefaciens DPXS12. 3,0 - 2,0 -

1077 bp  1077 bp

- 0,5

A

B

C

Hình 3.18. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A, giếng 1) và dxs (B, giếng 2), sản phẩm cắt enzyme hạn chế SacI/BamHI (C, giếng 3) từ DNA plasmid của A. tumefaciens DPSX12. M, thang DNA chuẩn 100 bp (Thermo Scientific)

73

3.3. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SINH TỔNG

HỢPCOENZYME Q10 TỪ A. TUMEFACIENSTÁI TỔ HỢP

3.3.1. Ảnh hƣởng của các điều kiện môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp

CoQ10

3.3.1.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon

A. tumefaciens có khả năng sử dụng nhiều nguồn cabon khác nhau, nguồn cacbon có

thể là các loại carbohydrate đơn giản như đường đôi, đường đơn. Khi tiến hành thí nghiệm

nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens trên môi trường MT2 với các loại đường khác nhau ở điều kiện nhiệt độ 30oC,

pH đầu 7, cấp giống OD 0,05, lắc 130 vòng/phút trong 4 ngày. Kết quả được biểu diễn trên

hình 3.19.

Hình 3.19. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens

tái tổ hợp

Kết quả cho thấy, trong môi trường có chứa nguồn cacbon là sucrose cho sinh tổng

hợp CoQ10 cao nhất đối với chủng tái tổ hợp (16 mg/l). Trong môi trường có chứa đường

galactose, glucose A. tumefaciens tái tổ hợp vẫn sinh tổng hợp CoQ10 tương đối cao (hình

3.19). Tương tự như các chủng A. tumefaciens khác [24, 88], trong môi trường có chứa

nguồn cacbon là xylose A. tumefaciens tái tổ hợp cho sinh trưởng và tổng hợp CoQ10 thấp

nhất bằng 57% so với đường sucrose (9,1 mg/ml). Có thể xylose là đường 5 cacbon vì vậy

chủng A. tumefaciens khó sử dụng đường này cho sinh trưởng và phát triển nên hàm lượng

CoQ10 thấp hơn so với các nguồn cacbon khác. Kết quả nghiên cứu này hoàn phù hợp với

một số nghiên cứu của Ha, Yuan và cộng sự [34, 101]. Một số nghiên cứu khác của Gu và

74

cộng sự (2006) đã tiến hành nghiên cứu động học chủng A. tumefaciens ATCC4452 sử

dụng nguồn cacbon là đường glucose, Yoshia và cộng sự (1998) tiến hành nuôi chủng A.

tumefaciens đột biến KY-3085 sử dụng nguồn cacbon là mật mía [31, 99]. Từ kết quả trên,

đường sucrose được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu tối ưu.

3.3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose

Để xác định nồng độ tối ưu của sucrose cho sinh tổng hợp CoQ10, A. tumfaciens

DPXS12 được nuôi trong bình tam giác với môi trường MT2 ở các nồng độ sucrose từ 0 – 10%, pH đầu 7 nhiệt độ 30oC, lắc 130 vòng/phút trong 4 ngày. Tiến hành thu sinh khối,

tách chiết và định lượng CoQ10 thu được. Kết quả được biểu diễn trên hình 3.20.

Hình 3.20. Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp

Kết quả chỉ ra trong hình 3.20 cho thấy, hàm lượng CoQ10 tăng dần khi nồng độ

sucrose tăng từ 0 – 5%, và đạt cao nhất sau 4 ngày nuôi cấy (18,42 mg/l) ở nồng độ

sucrose là 5%. Khi nồng độ sucrose cao (7,5 – 10%) sự sinh tổng hợp CoQ10 giảm do

nồng độ sucrose cao làm tăng độ nhớt của dịch lên men, hạn chế sự hòa tan oxy. Ngoài ra

khi nồng độ đường cao sinh khối vi khuẩn sinh trưởng mạnh dẫn đến tăng tổng hợp

exopolysacharide (EPS), làm cho khả năng tổng hợp CoQ10 cũng bị giảm đi. Còn ở nồng

độ sucrose thấp (2,5%) không làm tăng hàm lượng CoQ10, có thể ở nồng độ sucrose này

nguồn cacbon không đủ cho A. tumefaciens tái tổ hợp cả sinh trưởng, phát triển và tổng

hợp CoQ10. Kết nghiên cứu cũng tương đồng với kết quả của Ha và cộng sự, nồng độ

sucrose 5% cho quá trình sinh tổng hợp CoQ10 ở A. tumefaciens KCCM 10413 cao nhất

đạt 89,5 mg/l tương ứng sau 4 ngày nuôi cấy [34, 101]. Trong khi đó Yuan và cộng sự đã

lựa chọn được nồng độ sucrose 3% cho quá trình sinh tổng hợp CoQ10 ở A. tumefaciens

75

PK38 cao nhất đạt 12,27 mg/l [101]. Vì vậy, nồng độ sucrose 5% được lựa chọn cho các

nghiên cứu tiếp theo.

3.3.1.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Khi tiến hành nghiên cứu lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ vi sinh vật, nhiều tác giả

cho rằng quá trình sinh tổng hợp CoQ10 bị ảnh hưởng rất lớn bởi thành phần nitrogen của

môi trường [10, 24, 88]. Hiện nay trong công nghiệp lên men sinh tổng hợp CoQ10, ta có

thể cung cấp nitơ bằng cách sử dụng nhiều loại nguyên liệu khác nhau. Các nghiên cứu đã

công bố nguồn nitơ hữu cơ chủ yếu sử dụng cho sinh trưởng và tổng hợp CoQ10 từ

A.tumefaciens là cao ngô, bên cạnh đó, nguồn nitơ vô cơ (NH4)2SO4 cũng được chứng

minh là có vai trò tăng cường quá trình sinh tổng hợp CoQ10 trong nghiên cứu của Yuan

và cộng sự [101].

Để khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp CoQ10 A.tumefaciens

DPXS12 được nuôi trên môi trường MT2 chứa 5% sucrose, pH 7, tỷ lệ giống cấp ban đầu là 0,37×108 CFU/ml, chứa các nguồn nitơ khác nhau với nồng độ 4%, nuôi ở 30oC, thời

gian 4 ngày trên máy lắc 130 vòng/phút. Kết quả nghiên cứu được thể hiện trên hình 3.21.

Hình 3. 21. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens

tái tổ hợp

Từ kết quả thu được hình 3.21, trong số 7 nguồn nitơ được khảo sát thì chủng nghiên

cứu có khả năng sử dụng cao ngô (CSL), cao nấm men, cao malt để sinh tổng hợp CoQ10

tốt hơn so với peptone và ure, trong đó hàm lượng CoQ10 thu được cao nhất khi môi

trường bổ sung cao ngô (26,68 mg/l). Điều này cũng hợp lý vì cao ngô khá giàu dinh

dưỡng, trong thành phần chứa protein, các axit amin, peptide, carbohydrate, muối, vitamin

76

và biotin. Vì vậy, cao ngô được sử dụng như một nguồn nitơ hiệu quả trong quá trình lên

men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens [10, 24, 88]. Kết quả cũng cho thấy, trên môi

trường sử dụng (NH4)2SO4 làm nguồn nitơ, hàm lượng CoQ10 thu được cũng tương đối

cao đạt 17,95 mg/l. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Yuan và Koratsu

[46, 101]. Cũng theo kết quả của 2 nhóm nghiên cứu này, nồng độ (NH4)2SO4 từ 1-2% đã

cho khả năng tổng hợp CoQ10 cao nhất ở Agrobacterium. Mặt khác, (NH4)2SO4 là nguồn

nitơ vô cơ rẻ tiền nên việc sử dụng nguyên liệu này thay thế một phần nguồn nitơ hữu cơ

có ý nghĩa cho lên men quy mô lớn. Vì vậy phương án phối hợp cao ngô với 2%

(NH4)2SO4 đã được lựa chọn làm nguồn nitơ cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.3.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ cao ngô

Để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ cao ngô tới khả năng sinh tổng hợp CoQ10 từ A.

tumefaciens DPXS12. Các nồng độ khác nhau của cao ngô được nghiên cứu là 0,5; 1; 2; 3; 4 và 5% kết hợp với 2% (NH4)2SO4. Tiến hành nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC, pH đầu 7, cấp

giống OD 0,05, lắc 130 vòng/phút trong 4 ngày. Kết quả được biểu diễn trên hình 3.22.

Hình 3. 22. Ảnh hưởng của nồng độ cao ngô (CSL) đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp

Kết quả cho thấy nồng độ cao ngô có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp CoQ10 từ A.

tumefaciens DPXS12. Khi nồng độ cao ngô biến thiên từ 0,5% đến 1% hàm lượng CoQ10

tăng dần và đạt cực đại ở nồng độ cao ngô là 1% (54,19 mg/l). Khi nồng độ cao ngô tăng

lên, hàm lượng CoQ10 giảm dần, tại nồng độ cao ngô là 5% hàm lượng CoQ10 chỉ còn

40% (giảm 32.12 mg/l) so với nồng độ cao ngô là 1% có thể tại nồng độ cao ngô quá cao

đã ứng chế quá trình sinh tổng hợp CoQ10 ở A. tumefaciens DPXS12. Cao ngô 1% tỏ ra

phù hợp cho sinh tổng hợp CoQ10 ở mức cao. Kết quả nghiên cứu có khác biệt so với một

số công trình nghiên cứu của Ha và cộng sự khi tối ưu hóa được nồng độ cao ngô là 5%

77

cho sinh tổng hợp CoQ10 của A. tumefaciens KCCM 10413 [34]. Trong khi đó đó Yuan và

cộng sự đã lựa chọn được cao ngô 3% cho quá trình sinh tổng hợp CoQ10 ở A. tumefaciens

PK38 cao nhất đạt 20,62,27 mg/l [101]. Do đó, nồng độ cao ngô là 1% được lựa chọn cho

các nghiên cứu tiếp theo.

3.3.2. Ảnh hƣởng của pH đầu môi trƣờng

Giá trị pH môi trường ban đầu ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp

CoQ10 của A. tumefaciens. Để đánh giá ảnh hưởng của pH đến khả năng tổng hợp CoQ10

của A. tumefaciens tái tổ hợp, quá trình nuôi cấy sinh tổng hợp CoQ10 được tiến hành trên

môi trường MT3 ở các giá trị pH ban đầu 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 và giá trị pH được xác định lại ở thời điểm cuối, nhiệt độ nuôi cấy 30oC, cấp giống OD 0,05, lắc 130 vòng/phút trong 4

ngày Kết quả được biểu diễn ở hình 3.23.

Hình 3. 23. Ảnh hưởng của pH đầu đến khả năng tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp

Dựa theo kết quả nghiên cứu của các nhóm nghiên cứu trước cho thấy, chủng A.

tumefaciens lên men sinh tổng hợp CoQ10 cao nhất ở pH 7,0. Do đó, trong nghiên cứu này

chúng tôi đã tiến hành khảo sát giá trị pH đầu ở xung quanh điểm pH 7 để kiểm tra xem giá

trị pH đầu nào là phù hợp. Kết quả cho thấy, với pH đầu là 8 thì giá trị pH tại thời điểm

cuối lên men (96 giờ) đạt khoảng 7 và hàm lượng CoQ10 cao nhất đạt 68,8 mg/l, còn khi

pH ban đầu từ 6,0 – 7,0 có pH cuối khoảng 6,5 hàm lượng CoQ10 giảm dần. Do vậy,

chúng tôi đã lựa chọn giá trị pH đầu là 8 cho các quá trình lên men tiếp theo mà không

khảo sát tiếp ở các giá trị pH đầu khác.

3.3.3. Ảnh hƣởng của tỷ ệ giống

Trong lên men lượng giống có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình sinh trưởng và tổng hợp

CoQ10 của chủng tái tổ hợp. A. tumefaciens DPXS12 được nuôi trên môi trường MT3 với

mật độ cấp giống ban đầu với OD lần lượt là 0.05; 0.1; 0.2; 0.4; 0.8; 1.2; 1.6 và 2. Tương

78

ứng với mật độ tế bào 0,37 108; 0,7 108; 1,5 108; 3 108; 6 108; 9 108; 1,2 109;

1,5 109 (CFU/ml), nhiệt độ 30oC, pH đầu 8, lắc 130 vòng/phút. Sau 4 ngày nuôi tiến hành

thu sinh khối, tách chiết và xác định hàm lượng CoQ10. Kết quả được biểu diễn trong hình

3.24.

Hình 3.24. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens

tái tổ hợp

Kết quả thu được cho thấy lượng giống cấp ban đầu có ảnh hưởng rõ rệt đến tốc độ

sinh trưởng và khả năng tổng hợp CoQ10. Khi tăng mật độ cấp giống OD ban đầu dần từ

0,05 đến 0,8 CoQ10 được tổng hợp ra càng tăng (hình 3.24). Hàm lượng CoQ10 thu được

cao nhất đạt tại OD = 0,8 đạt 108 mg/l cao gấp 1,6 lần so với OD = 0,05. Hàm lượng

CoQ10 giảm dần khi OD tăng dần từ 0,8 đến 2 (tương ứng với mật độ tế bào 6 108 –

15 108) (CFU/ml). Điều này có thể được lý giải khi lượng giống cấp ban đầu thấp, lượng

sinh khối khối A. tumefaciens không nhiều nên hàm lượng CoQ10 thu được thấp hơn. Tuy

nhiên, khi mật độ giống cấp ban đầu cao, sinh khối A. tumefaciens tăng nhanh, nhu cầu

dinh dưỡng của tế bào trong canh trường càng lớn, nguồn cacbon, nguồn nitơ trong môi

trường không đủ cho sinh trưởng và phát triển của các tế bào A. tumefaciens tái tổ hợp và

làm giảm lượng oxy trong canh trường dẫn đến ảnh hưởng xấu đến tổng hợp CoQ10 trong

quá trình nuôi cấy.

3.3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy

A. tumefaciens được xem là loài vi sinh vật tương đối nhạy cảm với điều kiện nuôi

cấy. Trong nghiên cứu này chủng A. tumefaciens tái tổ hợp đã được nghiên cứu lên men trên môi trường MT3 tại các nhiệt độ khác nhau 20, 25, 28, 30 và 37oC, pH đầu 8, OD cấp

giống 0,8, lắc 130 vòng/phút. Kết quả thể hiện trên hình 3.25.

79

Hình 3.25. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng CoQ10 cho thấy, khi tăng nhiệt độ từ 20 – 28oC hàm lượng CoQ10 tăng và đạt cực đại ở 28oC. Khi nhiệt độ lớn hơn 28oC hàm lượng CoQ10 giảm. Nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp CoQ10 của A. tumefaciens DPXS12 là 28oC, thấp hơn nhiệt độ tối ưu (30oC) của chủng A. tumefaciens

KCCM 10413 [34], song phù hợp với nhiệt độ nuôi cấy của một số chủng A. tumefaciens khác [90, 101]. Chủng A. tumefaciens ATCC4452 được nuôi cấy ở 30oC [21]. Khả năng hoạt động tối ưu ở nhiệt độ tương đối êm dịu 28 – 32oC có thể là đặc tính chung của A.

tumefaciens. Đặc tính này rất hữu ích trong quá trình lên men sinh tổng hợp CoQ10, chúng

ta không phải gia nhiệt, tiết kiệm năng lượng trong sản xuất ở quy mô công nghiệp. Từ kết quả nhận được, chúng tôi thấy rằng nhiệt độ 28oC là phù hợp để lên men sinh tổng hợp

CoQ10.

3.3.5. Ảnh hƣởng của thời gian

Thời gian lên men có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình sinh tổng hợp CoQ10. Tiến hành thí nghiệm lên men trên môi trường MT3 ở nhiệt độ 28oC, pH đầu 8, cấp giống OD

0,8 với các thời gian: 24, 48, 72, 96, 120, 144 giờ. Kết quả được biểu diễn ở hình 3.26.

80

Hình 3. 26. Ảnh hưởng của thời gian đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens

tái tổ hợp

Từ kết quả hình 3.26 cho thấy, thời gian lên men càng tăng thì hàm lượng CoQ10

được sinh tổng hợp cũng tăng. Tuy nhiên hàm lượng CoQ10 thu được từ 96 giờ đến 144

giờ tăng không đáng kể, sau 144 giờ hàm lượng CoQ10 chỉ tăng 1,03% (tăng 2,57 mg/l) so

với 96 giờ lên men (đạt 126 mg/l). Kết quả thu được cũng phù hợp với nghiên cứu của Ha,

Cheong và cộng sự [16, 34]. Từ kết quả thu được thời gian 96 giờ được lựa chọn để thu

nhận CoQ10 trong quá trình lên men.

3.4. TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP

COENZYME Q10 TỪ A. TUMEFACIENS

3.4.1. Chọn miền khảo sát

Quá trình sinh tổng hợp CoQ10 từ A. tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp phụ thuộc vào

nhiều yếu tố đã được khảo sát. Để tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp CoQ10,

chúng tôi sử dụng phần mềm Design-Expert 7.15 (State-Ease, Inc, Minneapolis, Mỹ) để xây

dựng quy hoạch bậc 2 Box-Behnken. Với ba yếu tố được lựa chọn để xác định ảnh hưởng

tới quá trình sinh tổng hợp CoQ10 là: X1- nồng độ sucrose, X2- nồng độ cao ngô, X3- nhiệt

độ nuôi. Ma trận thực nghiệm được thiết lập gồm 17 thí nghiệm kết hợp với các mức (cao,

thấp, trung bình) của các yếu tố khảo sát, riêng thí nghiệm kết hợp 3 yếu tố (thí nghiệm ở

tâm) được lặp lại 5 lần (bảng 3.3)

81

3.4.2. Thiết ập mô hình

Kết quả thực nghiệm tối ưu các điều kiện sinh tổng hợp CoQ10 theo quy hoạch bậc hai

Box – Behnken 3 yếu tô được trình bày trong bảng 3.3. Hàm hồi quy hoạch bậc 2 cho các

mục tiêu được xây dựng dựa trên kết quả thực nghiệm nhận được.

Bảng 3.3. Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hàm lượng CoQ10 thu được

TN Nồng độ Sucrose (%) Nồng độ Cao ngô (%) Nhiệt độ (oC) Hàm lƣợng CoQ10 (mg/l)

82,885 2,5 1 28 0,5

78,048 2,5 2 28 1,5

90,872 7,5 3 28 0,5

107,285 7,5 4 28 1,5

93,571 5,0 5 24 0,5

85,433 5,0 6 24 1,5

93,571 5,0 7 32 0,5

109,518 5,0 8 32 1,5

78,912 2,5 9 24 1,0

101,791 7,5 10 24 1,0

95,831 2,5 11 32 1,0

105,901 7,5 12 32 1,0

13 127,177 5,0 28 1,0

124,478 5,0 14 28 1,0

126,506 5,0 15 28 1,0

126,58 5.0 16 28 1.0

125,35 5.0 17 28 1.0

Từ số liệu bảng 3.1 nhận thấy hàm lượng CoQ10 cao nhất ở thí nghiệm 13, hàm lượng

CoQ10 đạt 127,177 mg/l. Trong khi đó hàm lượng CoQ10 thấp nhất ở thí nghiệm 2, đạt

78,048 mg/l.

82

Bảng 3.4. Phân tích phương sai ANOVA của mô hình

Thông số SS Df MS Chuẩn F Mức có nghĩa p

Mô hình 5134,64 570,52 509,48 < 0,0001 9

615,53 615,53 549,68 < 0,0001 1 Nồng độ sucrose (X1)

67,50 < 0,0001 75,59 75,59 1 Nồng độ Cao ngô (X2)

2

199,08 1 199,08 177,78 < 0,0001 Nhiệt độ (X3)

2

1279,27 1 1279,27 1142,42 < 0,0001 X1

2

1490,96 1 1490,96 1331,46 < 0,0001 X2

709,54 1 709,54 633,64 < 0,0001 X3

112,89 1 112,89 100,81 < 0,0001 X1× X2

41,02 1 41,02 36,63 0,0005 X1× X3

214,49 1 214,49 191,75 < 0,0001 X2× X3

Residual 7,84 7 1,12

Lack of Fit 3,12 3 0,88 0,5219 1,04

Sai số (pure error) 4,72 4

SS tổng số 5142,48 16

 SS: Tổng phương sai; df: bậc tự do; MS: trung bình bình phương sai: Chuẩn F:

chuẩn Fisher; Residual: phần dư; “ Lack of Fit”: chuẩn đánh giá độ không tương

thích của mô hình với thực nghiệm.

Kết quả phân tích phương sai của mô hình tối ưu bằng phần mềm Design-Expert 7.15

(State-Ease, Inc, Minneapolis, Mỹ) trình bày trong bảng 3.2 (bảng ANOVA) cũng cho thấy 3

yếu tố đều có ảnh hưởng tới sự sinh tổng hợp CoQ10. Giá trị F của mô hình là 509,48 với

p=0,0001 ( p< 0,05) cho thấy dạng mô hình đã được lựa chọn đúng. Giá trị p của “Lack of

Fit” là 0,5219( p >0,05) cho thấy mô hình này tương hợp với thực nghiệm.

Cả 3 yếu tố nồng độ cao ngô, nồng độ đường sucrose và nhiệt độ đều ảnh hưởng mạnh

tới quá trình sinh tổng hợp CoQ10 với các giá trị p đều bằng 0,0001. Nhận thấy tương tác

giữa nồng độ sucrose và nồng độ cao ngô (X1×X2), giữ nồng độ cao ngô và nhiệt độ

83

(X2×X3), đều cho ảnh hưởng mạnh tới sinh tổng hợp CoQ10. Tương tác giữa nồng độ

sucrose và nhiệt độ (X1×X3) (p=0,0005) cho ảnh hưởng yếu hơn tới sự tổng hợp CoQ10.

Chúng tôi cũng đưa ra được phương trình hàm hồi quy biểu diễn hàm lượng CoQ10

mô tả ảnh hưởng của các yếu tố độc lập và các mối tương tác giữa chúng được biểu diễn:

2 – 75,27.X2

2 – 81,98.X3

Hàm lượng CoQ10= - 634,73 + 36,11.X1 + 32,92.X2 + 344,62.X3 + 4,2.X1X2 - 0,32.X1X3 2 + 3,66.X2X3 – 2,78.X1

3.4.3. Tối ƣu hóa quá trình sinh tổng hợp Coenzyme Q10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp

Sử dụng phương pháp hàm kỳ vọng để tối ưu hàm lượng CoQ10 thu được bằng phần

mềm Design-Expert 7.15. Kết quả tìm được 43 phương án thí nghiệm có thể cực đại hàm

mục tiêu. Phương án tốt nhất là : nồng độ sucrose 5,26 %, nồng độ cao ngô 1,01 % và nhiệt độ 28,44oC

Hình 3.27. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng CoQ10

thay đổi, (c) khi nhiệt độ và nồng độ sucrose thay đổi.

(a) Khi nồng độ cao ngô và nồng độ sucrose thay đổi, (b) Khi nhiệt độ và nồng độ cao ngô

Hình 3.28. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu nuôi cấy chủng A. tumefacienstái tổ hợp

84

Hàm lượng CoQ10 đạt được trong các điều kiện trên theo tính toán là xấp xỉ

127,209 mg/l. Thực nghiệm kiểm chứng (nồng độ sucrose 5%, nồng độ cao ngô 1% và nhiệt độ 28oC) và với các điều kiện khác tương tự sau 96 giờ nuôi hàm lượng CoQ10 thu

được là 127, 18 mg/l, kết quả có độ tương thích cao so với lý thuyết.

3.5. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH

COENZYME Q10 TỪ CHỦNG A. TUMEFACIENSTÁI TỔ HỢP

3.5.1. Đánh giá các phƣơng pháp phá vỡ tế bào

Coenyzme Q10 (CoQ10) là một hợp chất có độ kỵ nước cao, không hòa tan trong

nước. Trong tế bào sống, CoQ10 nằm trên màng sinh chất của tế bào vi khuẩn và màng

trong ty thể của tế bào sinh vật nhân thực [9], do đó không thể thu nhận CoQ10 từ dịch lên

men. Sau khi lên men sinh khối vi khuẩn sẽ được thu nhận. Để tách chiết CoQ10, tế bào

cần phải được phá vỡ để giải phóng CoQ10 ra môi trường và chiết bằng dung môi phù hợp.

Hiệu quả phá vỡ tế bào sẽ ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất tách chiết CoQ10. Trong nghiên

cứu này màng tế bào A. tumefaciens được phá vỡ bằng bốn phương pháp khác nhau bao

gồm siêu âm, xử lý bằng axit HCl theo mô tả của Tian [90], xử lý bằng ethanol theo mô tả

của Ranadive [75] và xử lý bằng enzyme theo mô tả của Zahiria [102] kết hợp với các

bước tách chiết. Kết quả được biểu diễn trên hình 3.29.

Hình 3.29. Các phương pháp xử lý phá vỡ tế bào tách thu CoQ10

Kết quả cho thấy xử lý tế bào bằng ethanol cho hiệu quả thu nhận CoQ10 cao hơn so

với các phương pháp khác (hình 3.29). Tương tự như những vi khuẩn Gram âm khác, A.

tumefaciens có chứa một lớp màng trong và màng ngoài mỏng do đó dưới tác động của

ethanol sẽ làm các tương tác kỵ nước trên màng bị yếu đi dẫn đến cấu trúc màng tế bào bị

phá vỡ và giải phóng các thành phần nằm trên màng hoặc trong màng ra môi trường [28].

85

Tương tự ethanol, axit HCl cũng có vai trò làm giải phóng lipopolysaccharide và các thành

phần khác từ màng tế bào từ đó làm cho cấu trúc của màng bị phá vỡ [90]. Tuy nhiên do

CoQ10 là một chất kỵ nước nên hiệu quả giải phóng hợp chất này bởi ethanol là cao hơn

so với HCl. Điều này hoàn toàn phù hợp với kết quả nhận được trong nghiên cứu này.

Ngoài việc sử dụng hóa chất, một số enzyme như protease K, lysozyme cũng được xử

dụng để phá vỡ tế bào trong nhiều nghiên cứu ở quy mô phòng thí nghiệm. Tuy nhiên

trong nghiên cứu này việc sử dụng enyzme có hiệu quả thấp hơn so với hai phương pháp

xử lý bằng ethanol và HCl. Phương pháp siêu âm cũng là một trong số những phương pháp

thường được sử dụng để phá vỡ tế bào vì đây là phương pháp đơn giản, nhanh và ít tốn

kém. Tuy nhiên trong quá trình siêu âm thường tạo ra các bọt khí rất nhỏ dẫn đến việc phá

vỡ tế bào không hoàn toàn [90]. So với các phương pháp trên hiệu quả phá vỡ tế bào thu

nhận CoQ10 bằng phương pháp siêu âm là thấp nhất. Dựa vào các kết quả nhận được trong

nghiên cứu này, phương pháp xử lý tế bào bằng ethanol đã được lựa chọn để tiếp tục

nghiên cứu tối ưu và sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo.

3.5.2. Xác định điều kiện xử ý tế bào bằng ethano

3.5.2.1. Xác định tỷ lệ ethanol/sinh khối

Để đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ hòa tan sinh khối tế bào trong ethanol đến hiệu quả

tách chiết CoQ10 từ A. tumefaciens, các tỷ lệ ethanol với sinh khối được nghiên cứu là (5, 10, 15 ml/g) trong điều kiện xử lý 37oC, thời gian xử lý 3 giờ. Sau đó CoQ10 được chiết và

làm sạch bằng n-hexan, quá trình chiết bằng n-hexan được lặp lại 3 lần. Kết quả được thể

hiện trên hình 3.30.

Hình 3.30. Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/sinh khối đến hàm lượng CoQ10 tách chiết từ

A. tumefaciens tái tổ hợp

86

Kết quả cho thấy hàm lượng CoQ10 được chiết xuất tăng lên khi tỷ lệ ethanol/sinh

khối tăng (hình 3.30). Khi so sánh hàm lượng CoQ10 thu được với các tỷ lệ chiết khác

nhau cho thấy tỷ lệ 10:1 cao hơn 1,32 lần (tương đương 24,3%) so với tỷ lệ 5:1, trong khi

đó hàm lượng CoQ10 thu được ở tỷ lệ 15:1 chỉ cao hơn so với tỷ lệ 10:1 là 1,08 lần. Từ kết

quả thu được tỷ lệ ethanol/sinh khối (10 ml/g) sẽ được sử dụng để tách chiết CoQ10 trong

các nghiên cứu tiếp theo.

3.5.2.2. Xác định thời gian đồng hóa

Không giống như đồng hóa trong nước sinh khối vi khuẩn tương đối khó đồng hóa

trong ethanol 100%, kết tụ tạo thành các hạt nhỏ. Để tăng hiệu quả đồng hóa trong ethanol,

sinh khối vi khuẩn được đồng hóa bằng phương pháp siêu âm ở mức năng lượng thấp

(khoảng 30-40%) trong các khoảng thời gian 1, 2, 3, 5, 10 và 15 phút với tỷ lệ ethanol với sinh khối 10ml/g, trong điều kiện xử lý là 37oC, thời gian xử lý 3 giờ. Kết quả được thể

hiện trên hình 3.31.

Hình 3.31. Ảnh hưởng của thời gian đồng hóa đến hàm lượng CoQ10 tách chiết từ A. tumefaciens tái tổ hợp

Kết quả cho thấy hàm lượng CoQ10 thu được tăng lên khi thời gian đồng hóa tăng và

đạt cao nhất ở thời gian 3 phút. Tuy nhiên khi thời gian đồng hóa tăng tiếp thì hiệu quả thu

hồi CoQ10 lại giảm.

3.5.2.3. Xác định nhiệt độ xử lý

Để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý tế bào tới khả năng thu nhận CoQ10 từ A. tumefaciens, hỗn hợp sau khi đồng hóa sẽ được ủ ở các nhiệt độ khác nhau 25, 37 và 60oC

87

trong thời gian 3 giờ, tỷ lệ ethanol với sinh khối là 10ml/g. Kết quả được thể hiện trên hình

3.32.

Hình 3.32. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng CoQ10 tách chiết từ A. tumefaciens tái tổ hợp

Kết quả cho thấy khi nhiệt độ ủ tăng lên thì hàm lượng CoQ10 thu được cũng tăng (1,15 và 1,17 lần ở 37 oC và 60oC tương ứng so với điều kiện 25oC). Từ kết quả nhận được, chúng tôi thấy rằng nhiệt độ 37oC là phù hợp để thực hiện xử lý tế bào bằng ethanol.

Từ các kết quả thu được trong nghiên cứu này, quy trình tách chiết CoQ10 từ sinh

khối A. tumefaciens đã được xác lập và mô tả tóm tắt như sau: trộn sinh khối vi khuẩn với ethanol 100% theo tỷ lệ 10:1 (v/w), đồng hóa bằng siêu âm 3 phút, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 3 giờ, ly tâm loại bỏ xác tế bào, chiết với hexane theo tỷ lệ 1:1, cô đặc chân không ở 45oC.

3.5.3. Nghiên cứu tinh sạch Coenzyme Q10

3.5.3.1. Đánh giá so sánh độ sạch của dịch chiết Coenzyme Q10

CoQ10 thu được theo quy trình trên được phân tích và định lượng trên hệ thống HPLC

với các điều kiện sắc ký như sau: Pha động A: Metanol 100%, lắc siêu âm 30 phút, lọc qua

màng lọc 0.45 μm. Pha động B: Ethanol 100%, lắc siêu âm 30 phút, lọc qua màng lọc 0.45 μm. Cột C18 kích thước 250 mm x 4 mm nhồi hạt với kích thước 5μm. Nhiệt độ cột 35oC,

tốc độ dòng 0,5 ml/phút, thể tích tiêm 10 μl, detector UV – Vis tại bước sóng 275 nm.

. Kết quả được thể hiện trên hình 3.33A, 3.33B

88

A

B Hình 3.33. Phổ sắc ký HPLC của CoQ10 chuẩn (A) và dịch chiết từ A. tumefaciens tái tổ hợp (B)

Dịch chiết CoQ10 được phân tích bằng HPLC (Agilent 1200 Series, USA) trên cột C18 (250 mm x 4 mm, 5μm), sử dụng ethanol và methanol là pha động với tốc độ dòng chảy là 0,5 ml/phút theo phương pháp gradient, nhiệt độ cột là 35oC, bước sóng hấp phụ 275 nm.

Kết quả cho thấy với bước sóng hấp thụ cực đại của CoQ10 (275 nm), chỉ thấy xuất

hiện một số đỉnh phụ rất nhỏ so với đỉnh chính CoQ10 trên phổ sắc ký HPLC. So sánh với

phổ CoQ10 chuẩn của hãng Sigma chúng tôi thấy rằng dịch chiết CoQ10 là tương đối sạch

khi so sánh ở bước sóng 275 nm.

Tuy nhiên, trong dịch chiết còn có thể có chứa các hợp chất khác không hấp thụ

cực đại tại bước sóng 275 nm. Do đó để đánh giá độ sạch, dịch chiết được phân tích bằng

phương pháp quét phổ với bước sóng từ 200 – 800 nm và so sánh với CoQ10 chuẩn. Kết

quả cho thấy phổ hấp phụ của dịch chiết CoQ10 và CoQ10 chuẩn đều xuất hiện một đỉnh

hấp thụ cực đại ở bước sóng 275 nm, đây chính là đỉnh CoQ10. Khi so sánh phổ hấp thụ

này so với dịch CoQ10 chuẩn chúng tôi thấy hoàn toàn tương tự. Tuy nhiên, ngoài đỉnh

chính (bước sóng 247 – 309) thì cường độ hấp thụ dịch chiết CoQ10 cao hơn so với

89

CoQ10 chuẩn (hình 3.34), điều đó chứng tỏ trong dịch chiết vẫn còn lẫn tạp chất. Phân tích

tổng thể phổ hấp thụ (ngoại trừ đỉnh CoQ10) cho thấy cường độ hấp thụ của mẫu CoQ10

tách chiết cao hơn 2,59 lần so với CoQ10 chuẩn.

Hình 3.34. So sánh độ sạch của dịch chiết CoQ10 và CoQ10 chuẩn. L1 dịch chiết CoQ10 từ sinh

khối vi khuẩn, S dịch CoQ10 chuẩn

3.5.3.2. Nghiên cứu tinh sạch Coenzyme Q10 theo phương pháp chiết bằng dung

môi

Việc tinh sạch CoQ10 từ dịch chiết có thể được thực hiện bằng một số phương pháp

như sử dụng sắc ký ngược dòng tốc độ cao HSCCC, sắc ký cột hấp phụ, chiết bằng dung

môi, hoặc kết tinh. Mỗi phương pháp đều có những ưu nhược điểm riêng, ví dụ phương

pháp HSCCC cho độ sạch cao hơn so với phương pháp chiết, tuy nhiên phương pháp này

lại sử dụng hệ thống thiết bị chuyên dụng, hệ dung môi tương đối độc, do đó khó có thể áp

dụng ở quy mô lớn. Việc tách chiết và tinh sạch CoQ10 được thực hiện bằng phương pháp

chiết với dung môi nhiều lần được xem là phương pháp đơn giản nhất. Phương pháp này

đã được Yajima và cộng sự sử dụng và đăng ký bản quyền. Trong nghiên cứu của Yajima

và cộng sự, việc thu nhận CoQ10 được thực hiện bằng phương pháp tách chiết từ sinh khối

vi khuẩn sử dụng dung môi hữu cơ. CoQ10 được làm sạch bằng cách chiết 3 lần với hỗn

hợp dung môi isopropanol và hexane. Quy trình này đã được sử dụng ở quy mô lớn.

Trong nghiên cứu này, việc chiết CoQ10 được thực hiện 3 lần; tuy nhiên dựa trên các

kết quả nghiên cứu trước của luận án về việc sử dụng thành công ethanol trong tách chiết

CoQ10 và việc sử dụng ethanol có nhiều ưu điểm nên hệ dung môi được sử dụng để chiết

90

CoQ10 là ethanol:hexane theo tỷ lệ 1:1 về thể tích. Để đánh giá hiệu quả tinh sạch CoQ10,

dịch chiết CoQ10 với các lần chiết khác nhau: 1, 2, 3 được phân tích bằng phương pháp

quét phổ với bước sóng từ 200 – 800 nm. Kết quả được thể hiện ở hình 3.35. Kết quả so

sánh phổ hấp thụ dịch chiết thu được tương ứng với số lần chiết cho thấy cường độ phổ

hấp thụ của dịch chiết với 3 lần chiết thấp hơn khoảng 3,25 lần so với 1 lần chiết và 1,62

lần so với 2 lần chiết. Điều đó chứng tỏ dịch chiết CoQ10 với 3 lần chiết sạch hơn so với 1

và 2 lần chiết.

Hình 3.35. Phổ hấp thụ dịch chiết CoQ10 theo số lần chiết khác nhau

Để đánh giá độ sạch, dịch chiết tinh sạch được tiến hành phân tích phổ hấp thụ và so

sánh với phổ hấp thụ CoQ10 chuẩn. Kết quả được thể hiện trên hình 3.36. Kết quả cho

thấy phổ hấp phụ ở bước sóng 200 – 248 nm không có sự thay đổi. Tuy nhiên phổ hấp thụ

ở bước sóng 309 – 800 nm của dịch chiết sau 3 lần chiết có sự giảm rõ rệt và gần tương

đương như cường độ hấp thụ của dịch CoQ10 chuẩn. Trong giải bước sóng 309 – 800 nm,

cường độ hấp thụ giảm từ 5,46 lần (đối với dịch chiết 1 lần chiết) xuống còn 1,93 lần (đối

với dịch chiết 3 lần chiết) so với dịch CoQ10 chuẩn. Phân tích tổng thể, cường độ hấp thụ

giảm từ 2,59 xuống 1,91 đối với dịch chiết 3 lần chiết lần so với CoQ10 chuẩn. Từ kết quả

thu được cho thấy phương pháp chiết bằng 3 lần chiết đã thu được dịch chiết CoQ10 sạch

hơn đặc biệt là loại bỏ được các tạp chất hấp thụ ở bước sóng từ 309 – 800 nm. Phương

pháp này tương đối đơn giản và sử dụng hệ dung môi rẻ không độc hại nên có thể được áp

dụng ở quy mô lớn để tách chiết và tinh sạch CoQ10.

91

Hình 3.36. So sánh độ sạch của dịch tinh sạch CoQ10 và CoQ10 chuẩn. L1 dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn sau 1 lần chiết, L3, dịch chiết CoQ10 sau 3 lần chiết, S dịch CoQ10 chuẩn

3.5.3.3. Nghiên cứu tinh sạch Coenzyme Q10 theo phương pháp sắc ký lọc gel

qua cột silica

Phương pháp tinh sạch CoQ10 dựa vào sắc ký cột silica gel kết hợp với sự kết tinh đã

được đề xuất cho quá trình sản xuất CoQ10 công nghiệp. Thông thường, CoQ10 được tinh

sạch sử dụng chất hấp phụ thông dụng như hạt silica gel [11, 35] hoặc chất hấp phụ ngược

pha như amino-propyl [78]. Tuy nhiên, hạt silica là rẻ hơn 13 – 20 lần so với amino-propyl

hoặc C18 tương ứng. Ngoài ra, hạt silica còn có những ưu điểm như thao tác đơn giản và

có khả năng phân tách các hóa chất có đặc tính và cấu trúc tương tự nhau. Do đó trong

nghiên cứu này, dịch chiết CoQ10 sau 3 lần chiết được tiếp tục tinh sạch sử dụng sắc ký

cột silica gel. Quy trình tinh sạch được thực hiện theo mô tả trong phần phương pháp

nghiên cứu. Phân đoạn màu vàng có chứa CoQ10 được thu nhận, bay hơi tới khô trong hệ

thống cô quay chân không và được định lượng. Kết quả được thể hiện trên hình 3.37. Kết

quả cho thấy cường độ phổ hấp thụ của dịch CoQ10 sau khi tinh sạch bằng sắc ký cột silica

giảm đi ở cả hai vùng bước sóng 200-248 nm và 309-800 nm. Cường độ hấp thụ trong dải

bước sóng 200-248 nm giảm khoảng 13% sau khi tinh sạch; trong khi đó cương độ hấp thụ

trong dải bước sóng 109 – 800nm giảm 58%. Phân tích tổng thể cho thấy cường độ hấp thụ

giảm đi khoảng 24 % trong mẫu tinh sạch bằng silica gel (hình 3.37).

92

Hình 3.37. So sánh độ sạch của dịch tinh sạch CoQ10 và CoQ10 chuẩn. L3, dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn sau 3 lần chiết; E1, dịch CoQ10 sau khi tinh sạch bằng sắc ký cột silica gel; S, dịch CoQ10 chuẩn

Khi so sánh với CoQ10 chuẩn, cường độ hấp thụ của dịch tinh sạch chỉ còn cao hơn

là 1,46 lần và thấp hơn nhiều so với dịch CoQ10 chiết 1 lần (2,59) và dịch chiết 3 lần chiết

(1,91).

3.5.4. Quy trình thu nhận Coenzyme Q10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp

Dựa vào các kết quả nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy, phương pháp tách chiết

CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp luận án đã xây dựng quy trình thu nhận CoQ10 từ A.

tumefaciens tái tổ hợp như hình 3.38.

93

A. tumefaciens tái tổ hợp

Lên men (28oC, pH đầu 8, cấp giống OD giống 0.8, thời gian 96 giờ

Ly tâm thu sinh khối

Ethanol 100%

Phá vỡ tế bào Trộn sinh khối với ethanol tỷ lệ 10:1 ml/g, siêu âm 3 phút, ủ 37oC trong 3 giờ

Ly tâm thu dịch

n –hexan tỷ lệ 1:1

Tách chiết n-hexane tỷ lệ 1:1 (v/v)

Cô đặc chân không

Tinh sạch Chiết bằng ethanol:hexane, tinh sạch bằng cột silica

Cô đặc chân không

Chế phẩmCoQ10

Hình 3.38. Quy trình thu nhận CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp

Thuyết minh quy trình:

Lên men: A. tumefaciens tái tổ hợp được nuôi cấy chìm ở 28oC, pH đầu 8, cấp giống

OD 0.8, thời gian lên men 96 giờ.

Ly tâm: Sinh khối được thu từ dịch lên men bằng cách ly tâm tốc độ 8000 vòng/phút

trong 15 phút.

94

Phá vỡ tế bào: Sinh khối được đồng hóa trong ethanol bằng siêu âm trong 3 phút, tỷ

lệ sinh khối với ethanol là 10:1 (ml/g) ủ ở 37oC trong 3 giờ.

Tách chiết CoQ10: Tiến hành ly tâm thu dịch tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút,

bổ sung n-hexan theo tỷ lệ 1:1 (v/v), chiết thu pha trên. Quá trình tách chiết được lặp lại 3

lần.

Cô đặc: Sau khi chiết lấy pha trên tiến hành cô đặc chân không với áp suất 260 mbar,

nhiệt độ 45oC.

Tinh sạch: CoQ10 được hoàn tan trở lại trong hỗn hợp dung môi ethanol:hexane và

chiết lấy pha hexane; sau đó pha hexane được cô đặc đến khô (quá trình lặp lại 3 lần). Sau

đó CoQ10 tiếp tục được tinh sạch bằng cột silica với dung môi ethanol làm pha động và

được cân bằng 10 lần thể tích cột. Mẫu dịch chiết CoQ10 được đưa lên cột và chạy với hệ

dung môi rửa giải là ethanol. Do CoQ10 có màu vàng nên tiến hành thu nhận các phân

đoạn chứa CoQ10.

Cô đặc: Sau khi thu lấy phân đoạn chứa CoQ10 tiến hành cô đặc chân không với áp

suất 260 mbar, nhiệt độ 45oC.

Quy trình công nghệ thu nhận CoQ10 từ A. tumefaciens EHA105 tái tổ hợp tương tự

như quy trình của Prafull Ranadive và cộng sự (2011), Narendra và cộng sự khi thu CoQ10

từ nấm men. Hiện nay, hầu hết các công trình công bố về tách chiết CoQ10 từ vi sinh vật

đều sử dụng phương pháp tách chiết: phá vỡ tế bào sau đó chiết bằng hexan. Đây là

phương pháp đơn giản, phù hợp ở quy mô công nghiệp [41, 66, 75].

3.6. KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH HÓA LÝ CỦA COENZYME Q10

3.6.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới độ bền của Coenzyme Q10

Nhiệt độ là một trong những yếu tố cần được kiểm soát ở nhiều khâu trong toàn bộ

quá trình sản xuất CoQ10 và các sản phẩm ứng dụng của nó như lên men, tách chiết, bào

chế và bảo quản. Nhiệt độ có thể ảnh hướng đến hiệu suất của quá trình nhưng cũng có thể

ảnh hưởng đến hoạt tính cũng như độ bền của hợp chất nghiên cứu. Để đánh giá ảnh hưởng

của nhiệt độ đến độ bền của CoQ10, dung dịch CoQ10 được ủ ở các nhiệt độ khác nhau (4oC, 25oC, 37oC, 60oC) trong 144 giờ và hàm lượng CoQ10 được xác định lại sau mỗi 24

giờ. Kết quả được thể hiện trên hình 3.39.

95

)

%

i

ạ

n ò c

0 1 Q o C

Thời gian (giờ)

Hình 3.39. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của CoQ10 tách chiết từ tế bào A. tumefaciens

tái tổ hợp

Kết quả cho thấy hàm lượng CoQ10 hầu như không thay đổi sau 144 giờ ở tất cả các

điều kiện nhiệt độ được khảo sát (hình 3.39). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nghiên

cứu trước đây của Fir và cộng sự khi nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng

CoQ10 cho thấy ở nhiệt độ phòng CoQ10 hầu như không thay đổi và bị tổn thất 3,7% sau 92 giờ ở 80oC khi CoQ10 được giữ trong tối [27]. Theo như Kommuru CoQ10 bền ở 37oC và bị tổn thất ở nhiệt độ 45 và 55oC trong thời gian 16 tháng [44]. Từ những kết quả trên

có thể thấy CoQ10 có tính bền nhiệt cao, điều này có ý nghĩa trong sản xuất, bảo quản

cũng như ứng dụng của CoQ10 sau này.

3.6.2. Ảnh hƣởng của pH tới độ bền của Coenzyme Q10

pH là một trong những yếu tố có thể ảnh hưởng đến độ bền cũng như hoạt tính của các

hợp chất sinh học. Việc xác định ảnh hưởng của pH đến độ bền của CoQ10 giúp xác định

được công thức điều chế cũng như điều kiện bảo quản phù hợp. Trong nghiên cứu này độ

bền của CoQ10 được xác định ở các giá trị pH 5-9. Kết quả được biểu diễn trên hình 3.40.

96

)

%

i

ạ

n ò c

0 1 Q o C

Thời gian (giờ)

Hình 3.40. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của CoQ10 tách chiết từ tế bào A. tumefaciens

tái tổ hợp

Kết quả cho thấy CoQ10 tương đối bền trong dải pH 6-9. Độ bền tương đối đạt

khoảng 95% sau 120 giờ (hình 3.40). Tuy nhiên độ bền của CoQ10 giảm đi trong điều kiện

axit yếu (pH5). Hàm lượng CoQ10 giảm đi khoảng 18% sau 24 giờ và 32% sau 120 giờ.

Khả năng hoạt động tốt trong môi trường pH từ 6 – 9, cho phép CoQ10 được đảm bảo hoạt

tính trong các nghiên cứu ứng dụng sau này.

3.6.3. Ảnh hƣởng của ánh sáng tới độ bền của Coenzyme Q10

Để xác định độ bền của CoQ10 dưới tác động của ánh sáng, dung dịch CoQ10 được

chiếu sáng bởi đèn huỳnh quang trong thời gian 144 giờ và chiếu sáng bởi ánh sáng mặt

trời (ngày đêm) trong thời gian 72 giờ. Kết quả được biểu diễn trên hình 3.41.

)

%

i

ạ

n ò c

0 1 Q o C

Thời gian (giờ)

Hình 3.41. Ảnh hưởng của ánh sáng đến độ bền của CoQ10 tách chiết từ tế bào A. tumefaciens

tái tổ hợp

97

Kết quả cho thấy khi bị chiếu sáng huỳnh quang hàm lượng CoQ10 giảm 32% sau 24

và 56% sau 48 giờ chiếu sáng. Hàm lượng CoQ10 giảm đến 72% sau 144 giờ chiếu sáng

(hình 3.41). Khi bi chiếu sáng bởi ánh sáng mặt trời, hàm lượng CoQ10 giảm nhanh hơn so

với chiếu sáng huỳnh quang. Hàm lượng CoQ10 giảm đến 41% chỉ sau 24 giờ và khoảng

70% sau 48 giờ. Trong điều kiện tương tự, hàm lượng CoQ10 hoàn toàn không thay đổi

khi dung dịch CoQ10 được che tối hoàn toàn. Sự giảm nhanh hàm lượng CoQ10 khi bị

chiếu sáng bởi ánh sáng mặt trời là do tác động của tia cực tím. Theo nghiên cứu của Fir và

cộng sự CoQ10 bị phá hủy 27% dưới ánh sáng của tia cực tím sau 120 phút ở nhiệt độ

phòng [27]. Một số nghiên cứu trước đây cũng cho thấy CoQ10 bị nhạy cảm với ánh sáng

và bị phân hủy đến 80% sau 15 ngày chiếu sáng bởi ánh sáng tự nhiên [96]. Từ các dữ liệu

này cho thấy CoQ10 là nhạy cảm với ánh sáng, nên trong quá trình tách chiết cũng như bảo

quản cần tránh ánh sáng.

3.7. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA COENZYME

Q10

3.7.1. Hoạt tính chống oxy hóa của Coenzyme Q10

Ngoài vai trò quan trọng trong việc sản sinh năng lượng, CoQ10 còn là một trong các

chất chống oxy hoá tự nhiên rất tốt. Hoạt tính chống oxy hóa của CoQ10 có thể được xác

định thông qua việc làm giảm màu của thuốc thử DPPH. Kết quả được thể hiện trên hình

3.42 và 3.43.

Hình 3.42. Khả năng chống oxi hóa của CoQ10

Như vậy, qua kết quả hình 3.42 cho ta thấy hoạt tính chống oxi hóa của Coenzyme

Q10 tăng khi nồng độ Coenzyme Q10 tăng dần. Dựa trên kết quả tính toán, tại nồng độ

0,18 mM Coenzyme Q10 có khả năng làm giảm 50% gốc tự do 0,5 mM DPPH (EC50 =

0,18 mM).

98

T 0,025 0,05 0,1 0,2 0,4 0,8 mM

Hình 3.43. Phản ứng của CoQ10 các nồng độ khác nhau với DPPH (T-mẫu trắng)

3.7.2. Khả năng ức chế tế bào ung thƣ của Coenzyme Q10

Để thăm dò tác động của CoQ10 lên tế bào ung thư, hai dòng tế bào ung thư cổ tử

cung Hep-2C và FL được nuôi cấy trong điều kiện bổ sung CoQ10 ở các nồng độ khác nhau 5, 10, 20, 40 và 80 µM trên môi trường MEM/10% FBS, tế bào được nuôi ở 37oC,

5% CO2 và thu hoạch theo thời gian 24, 48, 72 giờ để đếm số lượng tế bào sống. Ảnh

hưởng của CoQ10 đến tế bào ung thư được đánh giá thông qua tỷ lệ tế bào còn sống sau

khi xử lý với CoQ10. Kết quả được biểu diễn trên hình 3.44.

99

A

80 µM

20 µM

0 µM

B

0 µM

20 µM

80 µM

C

0 µM

20 µM

80 µM

Hình 3.44. Ảnh hưởng của CoQ10 lên dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hep-2C (A), FL (B) và tế bào thận thỏ bình thường RK13 (C). Một số hình ảnh tế bào đại diện ở nồng độ 0, 20 và 80 µM CoQ10

100

Kết quả hình 3.44 cho thấy CoQ10 ảnh hưởng ít đến sự sinh trưởng của cả hai dòng tế

bào ung thư ở nồng độ dưới 20 µM sau 72 giờ xử lý. Tuy nhiên ở nồng độ cao hơn 40 và

80 µM, CoQ10 đã có sự ảnh hưởng rõ rệt lên cả hai dòng tế bào ung thư. Đối với tế bào

Hep-2C, tỷ lệ tế bào còn sống sau 48 giờ và 72 giờ xử lý ở nồng độ 40 µM là 35,1 và

27,1%; ở nồng độ 80 µM là 29,4 và 14,7% tương ứng (hình 3.44A). Đối với dòng tế bào

FL, tỷ lệ tế bào còn sống sau 48 giờ và 72 giờ xử lý ở nồng độ 40 µM là 50,8 và 26,1%

tương ứng; 100% tế bào bị chết ở nồng độ 80 µM sau 48 giờ xử lý (hình 3.44B). Kết quả

nghiên cứu trên dòng tế bào thận thỏ bình thường RK13 cho thấy tế bào sinh trưởng hoàn

toàn bình thường ở các nồng độ khảo sát (hình 3.42C). Các kết quả thu được từ nghiên cứu

này cũng tương tự như Hsia và cộng sự nghiên cứu trên các dòng tế bào ung thư

SKMEL28, Squamous carcinoma cells, MCF-7 và nguyên bào sợi bình thường [38]. Các

kết quả thu được trong nghiên cứu này là cơ sở để thực hiện các nghiên cứu sâu hơn về cơ

chế tác động của CoQ10 đối với tế bào ung thư và tiến tới ứng dụng phát triển thuốc ngăn

ngừa và chữa ung thư hiệu quả hơn.

3.8. ỨNG DỤNG CỦA COENZYME Q10 TRONG SẢN XUẤT THỰC

PHẨM CHỨC NĂNG DƢỚI DẠNG VIÊN NANG

3.8.1. Nghiên cứu tạo phức hợp Coenzyme Q10 với β-Cyclodextrin

Coenzyme Q10 có chứa đuôi isoprenyl kỵ nước nên không hòa tan trong nước. Để có

thể sử dụng làm thuốc, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm, CoQ10 cần được điều chế ở

trạng thái tan được trong nước. Beta-cyclodextrin (β-CD) gồm 7 phân tử glucopyranose

liên kết với nhau tạo thành cấu trúc vòng. β-cyclodextrin là một chất có bề mặt ưa nước ở

phía ngoài và phần kỵ nước nằm bên trong nên các phân tử β-cyclodextrin có khả năng bao

quanh CoQ10 kỵ nước để hình thành phức β-CDQ10 và làm tăng độ hòa tan trong nước,

độ bền, hoạt tính sinh học của chúng. Dạng hòa tan trong nước của CoQ10 sẽ tăng khả

năng hấp thu vào tế bào và đồng thời tăng cường quá trình hô hấp của ty thể. Cyclodextrin

có thể tạo phức hòa tan trong nước với nhiều hợp chất khác nhau và do vậy cyclodextrin đã

được ứng dụng trong thực phẩm và dược phẩm [7, 27, 92]. Theo lý thuyết tỷ lệ phân tử

lượng giữa β-CDQ10 và CoQ10 là 1,32 lần do đó có thể có nhiều hơn một phân tử β-CD

tạo phức với CoQ10. Trong nghiên cứu này, CoQ10 đã được tạo phức với β-cyclodextrin

với các tỷ lệ mol khác nhau (1:1, 1:3, 1:5, 1:10). Để lựa chọn tỷ lệ mol CoQ10: β-CD thích

hợp tiến hành đánh giá tỷ lệ thu hồi của CoQ10 từ các công thức thông qua hàm lượng

CoQ10 trước và sau khi sấy phun. Kết quả được thể hiện trên hình 3.45.

101

Hình 3.45. Hiệu suất thu hồi CoQ10 theo tỷ lệ phối trộn giữa CoQ10 với β-cyclodextrin

Kết quả trên hình 3.45 cho thấy tỷ lệ CoQ10: β-CD 1:5 và 1:3 cho khả năng thu hồi

CoQ10 cao hơn đáng kể so với các tỷ lệ khác. Trong đó, tỷ lệ 1:5 khả năng thu hồi CoQ10

là cao nhất đạt 99%. Tỷ lệ 1:1 khả năng thu hồi là thấp hơn cả (61,7%) có thể do tỷ lệ β-

CD quá ít để liên kết tạo phức với CoQ10, do đó CoQ10 tự do sẽ bị thất thoát trong quá

trình sấy phun.

3.8.2. Khảo sát một số đặc tính phức CoQ10- β- Cyclodextrin

3.8.2.1. Khả năng hòa tan của phức CoQ10- β- Cyclodextrin

Coenzyme Q10 là một chất có tính kỵ nước cao, trong khi đó β-CD có bề mặt bên

ngoài ưa nước nên phức β-CDQ10 sẽ giúp CoQ10 có thể dễ dàng phân tán vào nước. Tiến

hành nghiên cứu khả năng hòa tan trong nước của phức β-CDQ10. Kết quả được thể hiện

trên bảng 3.5 và hình 3.44.

Bảng 3 5. Khả năng hòa tan của các phức β-CDQ10 trong nước. CoQ10 tạo phức với

β-cyclodextrin theo các tỷ lệ khác nhau

Tỷ lệ CoQ10: β-CD 1/1 1/3 1/5 1/10

(+) xuất hiện nhiều kết tủa; (++) xuất hiện ít kết tủa; (+++) xuất hiện rất ít kết tủa hoặc không

xuất hiện kết tủa

+ + + + + + + + + Mức độ hòa tan

102

.

Hình 3.46. Khả năng hòa tan của các phức β-CDQ10 trong nước. CoQ10 tạo phức với Cyclodextrin theo các tỷ lệ khác nhau

Kết quả bảng 3.5 và hình 3.44 cho thấy khả năng hòa tan tăng lên khi tỷ lệ tạo phức

giữa CoQ10 và β-CD tăng. Với tỷ lệ 1:1 và 1:3, dung dịch β-CDQ10 xuất hiện kết tủa sau

60 phút, trong khi đó tỷ lệ 1:5 – 1:10 không thấy xuất hiện sự lắng cặn này.

Kết quả nghiên cứu khả năng hòa tan của các phức β-CDQ10 trong các pH khác nhau

cho thấy mức độ hòa tan là phụ thuộc vào pH và tỷ lệ giữa CoQ10: β-CD (Bảng 3.6). Ở pH

thấp (pH ≤ 5), mức độ hòa tan kém hơn so với ở pH 6 và 7. Mức độ hòa tan của tỷ lệ 1:1

và 1:3 kém trong tất cả các pH khảo sát (pH 2-7). Tỷ lệ 1:5 có khả năng hòa tan tốt ở pH 6-

7, giảm đi ở pH 2-5.

Từ những kết quả nghiên cứu trên, tỷ lệ 1:5 CoQ10 - β-cyclodextrin được chọn cho

các nghiên cứu tiếp theo.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của pH đến độ hòa tan của phức β-CDQ10

Thời gian (phút) 0 20 60 0 20 60 0 20 60

pH pH 2 pH 3 pH 4

+ 1/1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

+ 1/3 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

1/5 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

- β / 0 1 Q o C ệ l

n i r t x e d o l c y l c

ỷ T

1/10 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

pH pH 5 pH 6 pH 7

+ 1/1 + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + ++

+ 1/3 + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + ++

1/5 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

- β / 0 1 Q o C ệ l

n i r t x e d o l c y l c

ỷ T

1/10 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

103

(+) xuất hiện nhiều kết tủa; (++) xuất hiện ít kết tủa; (+++) xuất hiện rất ít kết tủa hoặc không

xuất hiện kết tủa

3.8.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới phức CoQ10- β- Cyclodextrin

Để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của CoQ10, β-CDQ10 được ủ ở các nhiệt độ khác nhau (4oC, 25oC, 37oC, 60oC) trong 144 giờ và hàm lượng CoQ10 được xác

định lại sau mỗi 24 giờ . Kết quả được thể hiện trên hình 3.47.

Hình 3.47. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của CoQ10 trong phức β- CDQ10

Kết quả cho thấy hàm lượng CoQ10 hầu như không thay đổi sau 144 giờ ở điều kiện nhiệt độ từ 4 – 60oC. Kết quả này tương tự như kết quả nghiên cứu với CoQ10 tự do và

phù hợp với nghiên cứu của Fir và cộng sự (2009). Từ kết quả thu được có thể thấy phức

CoQ10-CD không ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của CoQ10 trong phổ nhiệt độ nghiên cứu

và có tính bền nhiệt cao, điều này có ý nghĩa cho quá trình tạo chế phẩm CoQ10, bảo quản

cũng như ứng dụng của CoQ10 sau này.

3.8.2.3. Ảnh hưởng của ánh sáng tới phức CoQ10- β- Cyclodextrin

Để xác định độ bền của CoQ10 trong phức β-CDQ10 dưới tác động của ánh sáng, β-

CDQ10 được chiếu sáng bởi đèn huỳnh quang trong thời gian 144 giờ và chiếu sáng bởi

ánh sáng mặt trời (ngày đêm) trong thời gian 72 giờ. Kết quả được biểu diễn trên hình

3.48.

104

Hình 3.48. Ảnh hưởng của ánh sáng đến độ bền của CoQ10 trong phức β- CDQ10

Kết quả cho thấy khi bị chiếu sáng huỳnh quang hàm lượng CoQ10 giảm 16,4% sau

24 giờ và 45,4 % sau 144 giờ chiếu sáng (hình 3.48). Tuy nhiên mức độ giảm thấp hơn

khoảng 2 lần so với CoQ10 tự do. Khi bị chiếu sáng bởi ánh sáng mặt trời theo ngày đêm,

hàm lượng CoQ10 giảm nhanh hơn so với chiếu sáng huỳnh quang. Hàm lượng CoQ10

giảm đến 21% sau chỉ sau 24 giờ và khoảng 45% sau 96 giờ. Tương tự, sự tổn thất của

CoQ10 trong phức β-CDQ10 thấp hơn CoQ10 ở trạng thái tự do. Như vậy, việc tạo phức

với β-CD làm tăng đáng kể độ bền của CoQ10 dưới tác dụng của ánh sáng. Trong điều

kiện tương tự, hàm lượng CoQ10 hoàn toàn không thay đổi khi CoQ10 được che tối hoàn

toàn. Sự giảm nhanh hàm lượng CoQ10 khi bị chiếu sáng bởi ánh sáng mặt trời là do tác

động của tia cực tím. Theo nghiên cứu của Fir và cộng sự CoQ10 bị phá hủy 27% dưới ánh

sáng của tia cực tím sau 120 phút ở nhiệt độ phòng. Nghiên cứu trước đây cũng cho thấy

CoQ10 bị phân hủy đến 80% sau 15 ngày chiếu sáng bởi ánh sáng tự nhiên [27].

3.8.3. Xây dựng quy trình điều chế viên nang cứng chứa Coenzyme Q10

Dựa vào các kết quả nghiên cứu tạo phức CoQ10 với β-cyclodextrin và trên cơ sở xây

dựng tiêu chuẩn viên nang thực phẩm chức năng CoQ10. Quy trình công nghệ điều chế

thực phẩm chức năng bổ sung dưới dạng viên nang cứng chứa CoQ10 được thể hiện trên

hình 3.49.

105

Nguyên liệu chế phẩm CoQ10

β – cyclodextrin

Tạo phức với β – cyclodextrin tỷ lệ 1:5 (mol/mol)

Sây phun Nhiệt độ đầu vào 105oC, đầu ra 60oC

Maltodextrin

Phối trộn, đóng viên nang, bao gói

Sản phẩm viên nang cứng CoQ10

Hình 3.49. Quy trình công nghệ sản xuất viên nang thực phẩm chức năng chứa CoQ10

Thuyết minh quy trình:

Công thức bào chế viên nang cứng chứa CoQ10: 80 mg phức CoQ10, 320 mg

maltodextrin.

Tạo phức CoQ10- β – cyclodextrin: CoQ10 được hòa tan trong ethanol ở 60oC trong 30 phút, β-cyclodextrin được hòa tan trong nước ở 80oC trong 30 phút, tỷ lệ ethanol/nước 1:1 (v/v) . Sau đó hỗn hợp CoQ10 và β-cyclodextrin được khuấy trộn trong 60 phút ở 60oC

cho đồng nhất.

Sấy phun: Hỗn hợp được sấy phun ở nhiệt độ đầu vào 105oC, đầu ra 60oC, tốc độ

phun sương. Phức β-CDQ10 dạng bột được thu nhận.

Phối trộn: Trộn đều phức CoQ10 – β – cyclodextrin tỷ lệ 1:5 (mol/mol) với

maltodextrin theo tỷ lệ thành phần trong công thức với thời gian ít nhất 15 phút.

106

Đóng nang: Tách vỏ nang số 0 (vật liệu làm vỏ nang là gelatin) thủ công thành 2 phần

đáy và nắp nang. Dàn đáy và nắp nang vào khay đóng nang. Đổ bột lên mặt khay và dàn

đều bột nang vào các vỏ nang rồi nén bột nang. Đóng nắp nang ở khay vào đáy nang đã

chứa bột nang, xiết chặt nắp nang vào đáy nang. Tháo nang khỏi thiết bị đóng nang và làm

sạch nang.

Bảo quản: Viên nang thực phẩm chức năng CoQ10 được đóng gói ngay vào các túi

thiếc hoặc lọ thuốc chuyên dụng hợp vệ sinh an toàn thực phẩm bảo quản ở nơi thoáng

mát.

3.8.4. Phân tích đánh giá viên nang chứa Coenzyme Q10

3.8.4.1. Hình thức cảm quan

Viên nang cứng số 0, đầu xanh đậm, đầu xanh nhạt. Bột thuốc trong nang màu vàng,

vị hơi ngọt, mùi đặc trưng.

Hình 3.50. Viên nang thực phẩm chức năng bổ sung chứa CoQ10

3.8.4.2. Độ đồng đều khối lượng

Tiến hành cân 20 viên nang lấy ngẫu nhiên, tính khối lượng trung bình của nang

thuốc, khối lượng bột thuốc và vỏ viên nang. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.7.

Bảng 3.7. Kết quả kiểm nghiệm độ đồng đều về khối lượng

STT Khối lƣợng Khối lƣợng Khối lƣợng % so với % Chênh

nang thuốc (g) nang rỗng (g) bột thuốc (g) KLTB lệch so với

KLTB

1 0,5052 0,4073 0,0979 0,92 99,08

2 0,5168 0,4188 0,098 1,88 101,88

3 0,5146 0,4222 0,0924 2,70 102,70

4 0,5112 0,4176 0,0936 1,58 101,58

5 0,5011 0,4039 0,0972 1,75 98,25

6 0,5040 0,4067 0,0973 1,07 98,93

107

7 0,4863 0,0994 0,3869 94,12 5,88

8 0,5113 0,0953 0,416 101,20 1,20

9 0,5048 0,0992 0,4056 98,67 1,33

10 0,5197 0,0988 0,4209 101,27 1,27

11 0,5167 0,1004 0,4163 101,27 1,27

12 0,5279 0,0993 0,4286 104,26 4,26

13 0,5125 0,1001 0,4124 100,32 0,32

14 0,5124 0,0987 0,4137 100,64 0,64

15 0,5058 0,0979 0,4079 99,23 0,77

16 0,5161 0,1008 0,4153 101,03 1,03

17 0,5224 0,0971 0,4253 103,46 3,46

18 0,5121 0,1009 0,4112 100,03 0,03

19 0,4987 0,0996 0,3991 97,08 2,92

20 0,4841 0,0981 0,386 93,90 6,10

KLTB = 0,411 (g)

Kết quả kiểm tra độ đồng đều khối lượng ở bảng 3.7 cho thấy, % chênh lệch khối

lượng giữa các viên nang với khối lượng trung bình dao động từ 0,03 - 6,1%, trung bình %

chênh lệch giữa các viên nang với khối lượng trung bình là 2,02. Theo tiêu chuẩn Dược

điển Việt Nam IV thì giá trị cho phép là 7,5%. Do đó, từ kết quả này cho thấy viên nang

chứa CoQ10 dạng thực phẩm chức năng được điều chế đã đảm bảo yêu cầu về độ đồng đều

khối lượng.

3.7.4.3. Độ tan rã

Tiến hành thử độ rã của 10 viên nang trong nước, thời gian rã được ghi lại. Kết quả

được thể hiện trong bảng 3.8.

Bảng 3.8. Kết quả đo độ rã

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 STT

16 13 14 12 17 15 14 17 15 16

Thời gian r (phút)

Từ bảng 3.8 cho thấy, thời gian rã của 10 viên nang thử nghiệm dao động từ 12 – 17

phút, trung bình là 14,9 phút. Theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV thì thời gian rã tiêu

chuẩn đối với viên nang là dưới 30 phút, do đó viên nang được tạo ra trong nghiên cứu này

là hoàn toàn đảm bảo yêu cầu về độ rã.

108

3.8.4.4. Độ đồng đều hàm lượng CoQ10

Tiến hành xác định định lượng hàm lượng CoQ10 của 10 viên riêng lẻ bất kì. Chế

phẩm đạt yêu cầu phép thử, nếu có không quá một đơn vị có hàm lượng nằm ngoài giới

hạn 85 % đến 115 % và không có đơn vị nào có hàm lượng nằm ngoài giới hạn 75 % đến

125 % của hàm lượng trung bình. Kết quả được thể hiện qua bảng 3.9.

Bảng 3.9. Kết quả định lượng CoQ10 trong viên nang

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 STT TB

11,32 10,86 11,25 11,31 11,04 11,07 10,76 10,86 10,62 10,87 11,00

Hàm lƣợng CoQ10 (mg)

2,95 1,24 2,31 2,86 0,40 0,67 2,15 1,24 3,42 1,15 1,84

% Chênh lệch so với HLTB

Kết quả định lượng hàm lượng CoQ10 trung bình của 10 viên là 11 mg (bảng 3.9). Độ

lệch về hàm lượng CoQ10 của các viên nang so với giá trị hàm lượng trung bình dao động

từ 0,4% - 4,42% và trung bình là 1,84%. So sánh với tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam

IV, độ lệch trung bình của viên nang chứa CoQ10 là nhỏ hơn do đó các viên nang tạo ra

trong nghiên cứu này là hoàn toàn đảm bảo yêu cầu về độ đồng đều hàm lượng.

3.8.4.5. Kiểm tra, phân các chỉ tiêu của viên nang thực phẩm chức năng

Coenzyme Q10

 Kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn

Kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm men,

nấm mốc có khả năng sống lại được và phát hiện các vi khuẩn chỉ điểm y tế có trong thuốc.

Thử nghiệm này được thực hiện theo mô tả trong tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) cụ thể đối

với từng đối tượng vi sinh cần phân tích. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.10 và phụ lục

11.

Kết quả phân tích cho thấy các chỉ tiêu vi sinh đều nằm trong giới hạn cho phép của

thực phẩm chức năng do đó viên nang dạng CoQ10 dạng thực phẩm chức năng được điều

chế trong nghiên cứu này đảm bảo yêu cầu.

 Kiểm tra giới hạn độc tố

Hàm lượng độc tố Aflatoxin trong viên nang chứa CoQ10 được phân tích theo mô tả

trong tiêu chuẩn AOAC 990.33. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.10 và phụ lục 11.

109

Theo tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm chỉ tiêu độc tố Aflatoxin <5 ppb, do đó chỉ

tiêu độc tố aflatoxin trong viên nang CoQ10 là hoàn toàn đáp ứng an toàn thực phẩm.

 Kiểm tra giới hạn kim loại nặng

Hàm lượng kim loại nặng trong viên nang chứa CoQ10 được phân tích theo mô tả

trong tiêu chuẩn AOAC 991.10. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.10 và phụ lục 11.

Theo tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm đối với chỉ tiêu kim loại nặng chì (≤3,0 ppm),

thủy ngân (≤0,1 ppm), cadimi (≤1,0 ppm) do đó chỉ tiêu kim loại nặng chì, thủy ngân và

cadimi trong viên nang CoQ10 là hoàn toàn đáp ứng an toàn thực phẩm.

Bảng 3.9. Kết quả phân tích viên nang thực phẩm chức năng CoQ10

TT Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Kết quả Phƣơng pháp

Tổng số vi khuẩn hiếu khí 1 TCVN 4884:2005 KPH CFU/g

Coliforms 2 TCVN 6848:2007 KPH CFU/g

E. coli 3 TCVN 7924-2:2008 KPH CFU/g

S. aureus 4 TCVN 4830-1:2005 KPH CFU/g

Shigella spp 5 TCVN 7902:2008 KPH CFU/25g

B. cereus 6 TCVN 4992:2005 KPH CFU/g

Salmonella 7 TCVN 4829:2005 KPH CFU/25g

Tổng số bào tử nấm men, mốc CFU/g TCVN 8275-2:2010 8 KPH

Aflatoxin G1 9 KPH μg/kg

10 Aflatoxin B1 KPH μg/kg AOAC 990.33 11 Aflatoxin G2 KPH μg/kg

12 Aflatoxin B2 KPH μg/kg

13 Chì 0,120 μg/kg

14 Thủy ngân AOAC 991.10 0,040 μg/kg

15 Cadimi 0,028 μg/kg

110

3.8.4.6. Đánh giá độc tính cấp của trên động vật thí nghiệm đối với viên nang thực

phẩm chức năng chứa CoQ10

Việc đánh giá độc tính cấp trên động vật thí nghiệm đối với viên nang chứa CoQ10

được thực hiện như mô tả trong phần phụ lục 11 và kết quả đạt được như sau:

 Trọng lượng cơ thể chuột

Trọng lượng cơ thể chuột ở nhóm chứng và các nhóm thử được xác định sau 7 ngày

uống thử nghiệm. Tất cả chuột ở nhóm đối chứng và nhóm thử nghiệm đều tăng trọng bình

thường (bảng 3.11 và phụ lục 11).

Bảng 3.11. Bảng theo dõi trọng lượng chuột

STT Nhóm chứng STT Nhóm 1

Trƣớc TN (g) Sau TN (g) Trƣớc TN (g) Sau TN (g)

18.7 28.4 21.8 34.2 1 11

18.4 29.9 18.7 28.5 2 12

20.3 24.9 20.6 29.6 3 13

19.6 25.1 20.3 30.3 4 14

19.5 28.1 19.9 29.9 5 15

20.9 29.0 21.3 28.8 6 16

20.3 26.5 19.7 30.6 7 17

19.5 28.5 21.1 27.5 8 18

21.3 28.3 21.5 25.8 9 19

21.8 33.4 21.8 28.1 10 20

STT Nhóm 2 STT Nhóm 3

Trƣớc TN (g) Sau TN (g) Trƣớc TN (g) Sau TN (g)

20.5 31.1 19.9 25.3 21 31

21.0 26.4 19.1 26.7 22 32

20.3 24.9 18.2 30.7 23 33

21.5 29.4 18.2 26.8 24 34

19.2 28.9 19 24.2 25 35

20.3 23.7 20.2 29.9 26 36

20.5 31.1 19.2 24.5 27 37

19.8 31.3 21.6 33.5 28 38

21.2 26.8 20.5 33.5 29 39

111

21.7 29.7 19.7 29.7 30 40

Nhóm 4 STT

Trƣớc TN (g) Sau TN (g) Trƣớc TN (g) Sau TN (g)

20.2 25.0 20.4 26.5 41 46

20.8 28.8 20.7 28.7 42 47

20.5 30.8 21.1 26.9 43 48

19.3 25.0 21.4 33.4 44 49

20.1 30.4 21.7 29.8 45 50

 Tiêu thụ thức ăn và nước uống của chuột

- Nhóm chứng: Hoạt động và ăn uống bình thường.

- Các nhóm thử: Sau khi uống thuốc và trong 7 ngày theo dõi nhóm thử không nhận

thấy biểu hiện gì khác thường so với nhóm đối chứng.

 Quan sát dấu hiệu ngộ độc

- Không nhận thấy có biểu hiện ngộ độc ở các nhóm thử trong thời gian theo dõi.

- Không có chuột chết trong quá trình thử nghiệm.

Kết luận:

Từ các kết quả thu được, chúng tôi đưa ra kết luận sau: Cho chuột uống mẫu thử với

mức liều từ 5 – 20 viên/kg chuột (gấp 20,8 – 83,3 lần liều tương đương trên người. Kết quả

không nhận thấy biểu hiện khác thường so với nhóm chứng, không nhận thấy có biểu hiện

ngộ độc trên chuột thí nghiệm trong thời gian theo dõi. Tất cả chuột đều ăn uống, hoạt

động và tăng trọng bình thường. Không xác định được liều gây chết 50% động vật thí

nghiệm (LD50) vì mẫu thử không gây chết chuột thử nghiệm ở mức liều tối đa nhất có thể

cho uống (phụ lục 11).

112

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Luận án đ thu đƣợc những kết quả chính nhƣ sau:

1. Từ 12 chủng vi khuẩn phân lập được từ nốt sần cây hoa hồng huyện Tây Tựu – Hà

Nội đã tuyển chọn được chủng A. tumefaciens TT4 có khả năng sinh tổng hợp

CoQ10 cao cho nghiên cứu tiếp theo.

2. Đã tách dòng và giải trình tự được 2 gen dxs và dps mã hóa cho 2 enzyme chìa

khóa của con đường sinh tổng hợp CoQ10 từ chủng A. tumefaciens TT4 phân lập ở

VN và tạo được chủng A. tumefaciens tái tổ hợp mang 2 gen trên cho năng suất

sinh tổng hợp CoQ10 cao.

3. Xác định được điều kiện thích hợp nuôi cấy chủng A. tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp sinh tổng hợp CoQ10: sucrose 5 %, cao ngô: 1%, nhiệt độ 28oC, pH đầu 8, OD

cấp giống 0.8, thời gian 96 giờ, hàm lượng CoQ10 thu được đạt 127,18 mg/l.

4. Xây dựng được quy trình tách chiết CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp: Ethanol 100% theo tỷ lệ 10:1 (v/w), đồng hóa bằng siêu âm 3 phút, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 3 giờ, chiết bằng hexane theo tỷ lệ 1:1, cô đặc chân không ở 45oC, tinh sạch bằng hệ dung môi ethanol:hexane và cột silica, cô đặc chân không ở 45oC.

5. Đã xác định được một số đặc tính hóa lý và hoạt tính sinh học của CoQ10 từ A. tumefaciens tái tổ hợp. CoQ10 bền nhiệt 4 – 60oC, bền trong vùng pH 6 – 9, bị phá

hủy bởi ánh sáng mặt trời và ánh sáng huỳnh quang, có khả năng chống oxy hóa

thông qua khử gốc tự do DPPH (EC50 = 0,18 mM). Bước đầu chứng minh được

CoQ10 có khả năng ức chế hai dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hep-2C và FL.

6. Đã tạo được phức CoQ10 - β-cyclodextrin để hòa tan tốt trong nước và ứng dụng

trong sản xuất viên nang thực phẩm chức năng có hiệu quả.

Kiến nghị:

Tiếp tục khảo sát một số hoạt tính sinh học cũng như khả năng ứng dụng của

CoQ10 trong thực phẩm chức năng như sữa tươi và đồ uống có bổ sung CoQ10.

113

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

CỦA LUẬN ÁN

1. Nguyen Viet Phuong, Truong Quoc Phong, Đang Thi Thu (2013) Isolation and

screening of CoQ10 producing Agrobacterium tumefaciens strains from nudules of

rose trees in Viet Nam. International Workshop on Agricultural Engineering and

Post-Havest Technology for Asia Sustainability (AEPAS), pp. 545 -551.

2. Nguyễn Việt Phương, Trương Quốc Phong, Đặng Thị Thu (2014) Nghiên cứu cải

biến Agrobacterium tumefaciens sinh tổng hợp Coenzyme Q10. Tạp chí Khoa học

và Công nghệ, tập 52 số 6, pp. 721-734.

3. Nguyễn Việt Phương, Đặng Thị Thu, Trương Quốc Phong (2015) Nghiên cứu điều

kiện nuôi cấy chủng Agrobacterium tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp sinh tổng hợp

Coenzyme Q10. Tạp chí Sinh học, tập 37 số 1se, pp 105-110.

4. Trương Quốc Phong, Nguyễn Việt Phương, Ngô Thu Hường, Đặng Thị Thu (2015)

Nghiên cứu hoạt tính sinh học Coenzyme Q10 và một số đặc tính của phức

Coenzyme Q10 – cyclodextrin” Tạp chí Công nghệ Sinh học, tập 13 số 2A, pp. 597-

602.

5. Nguyen Viet Phuong, Dang Thi Thu, Luu Hong Son, Nguyen Thi Phuong Hanh,

Truong Quoc Phong (2015) Extraction and property studies of coenzyme Q10 from

recombinant Agrobacterium tumefaciens. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tập 53

số 6.

114

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Bộ Y Tế (2009) Dược điển Việt Nam IV. NXB Y Học, Hà Nội

2. Đào Thị Lương, Trần Thị Lệ Quyên (2009) Tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm

phân loại của các chủng nấm men sinh CoQ10, phân lập ở Việt Nam. Tạp chí Di

truyền học và ứng dụng, Chuyên san Công nghệ Sinh học số 5, pp. 8-14

3. Ngô Thị Xuyên, Lê Lương Tề (2006) Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens và bệnh u sùi rễ hoa hồng tại một số tình miền Bắc Việt

Nam. Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội

4. Trần Thị Lệ Quyên, Đào Thị Lương (2010) Phân loại và nghiên cứu điều kiện nuôi

thích hợp cho sinh trưởng và tổng hợp coenzyme Q10 ở chủng nấm men PL5-2.

Tạp chí Di truyền học và ứng dụng - Chuyên san Công nghệ sinh học sô 6, pp.7-13

Tiếng Anh

5. Alan.R. Gaby (1996) The Role of Coenzyme Q10 in Clinical Medicine. Alternative

Medicine Review

6. Ashb.M. N, Acherman.S, Tzagoloff.A, Edwards.P. A (1992) COQ2 is a candidate

for the structural gene encoding para-hydroxybenzoate:polyprenyltransferase. J

Biol Chem, 267, pp. 4128–4136

7. Astray.G, Mejuto.J. C; Morales.J (2010) Factors controlling flavors binding

constants to cyclodextrins and their applicaitons in foods. Food Research

International, 43, pp. 1212-1218

8. Barker.J. L, Frost.J. W (2001) Microbial synthesis of p-hydroxybenzoic acid from

glucose. Biotechnol Bioeng, 76, pp. 376–390

9. Brandt.U, Trumpower. B (1994) The protonmotive Q cycle in mitochondria and

bacteria. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 29, pp. 165-197

10. Bule.M. V, Singhal.R. S, Kennedy.J. F, (2010) Microencapsulation of ubiquinone-

10 in carbohydrate matrices for improved stability. Carbohydrate Polymers, 82,

pp. 1290-1296

11. Cao.X. L (2006) Purification of coenzyme Q10 from fermentation extract:High-

speed counter-current chromatography versus silicagel column chromatography.

Journal of Chromatography A, 1127 pp. 92–96

12. Carr.G., Exell.G (1965) Ubiquinone concentrations in Athiorhodaceae grown

under various environmental conditions. Biochem, 96, pp. 688-692

115

13. Chen.Y. Z, Y.G, Fu.Y .J, Zhang.X, Yu.P, Sun.G. Y, Efferth.T (2010) Efficient

lewis acid ionic liquid-catalyzed synthesis of the key intermediate of coenzyme Q10

under microwave irradiation. Molecules, 12, pp. 9486-9495

14. Chen.F.C., H. S. H., Hung.S. T., Chen.M. C., Lin.C. Y (1999) Leaf, stem and

crown galls on perennial asters caused by Agrobacterium tumefaciens in Taiwan.

Bot. Bull. Acad. Sin, 40, pp. 237-242

15. Cheng.B, Yuan.Q. P, Li.W. J (2010) Enhanced Production of Coenzyme Q10 by

Overexpressing HMG-CoA Reductase and Induction with Arachidonic Acid in

Schizosaccharomyces pombe. Appl Biochem Biotechnol 160, pp. 523–531

16. Cheong.S. R, Sang.Y. K., Jung.K, Hyeon. X, Suk.J. H (2008) Fermentation process

for preparing Coenzyme Q10 by the recombinant Agrobacterium Tumefaciens.

Patent Application Publication

17. Choi.J, R.Y, Park.Y, Seo.J (2009) Synergistic effects of chromosomal ispB deletion

and dxs overexpression on coenzyme Q 10 production in recombinant Escherichia

coli expressing Agrobacterium tumefaciens dps gene. J Biotechnol 144(1), pp. 64 –

69

18. Choi.J. H, R.Y. W, SeoJ. H (2005) Biotechnological production and applications of

coenzyme Q10. Appl Microbiol Biotechnol 68, pp. 9-15

19. Choi.G. S., K.Y. S, Seo.J. H, Ryu.Y. W (2005) Restricted electron flux increases

coenzyme Q10 productionin Agrobacterium tumefaciens ATCC4452. Process

Biochemistry 40, pp. 3225–3229

20. Conklin.K. A (2000) Dietary antioxidant during cancer chemotherapy: impact on

chemotherapeutic effectiveness and development of side effects. Nutr Cancer 37(1),

pp. 1–18

21. Crane.F. L, Lester.R. L, Widmer.C (1957) Isolation of a quinone from beef heart

mitochondria. Biochim Biophys Acta, (25), pp. 220-221

Crane.F. L (2000) New functions for coenzyme Q. Protoplasma, 113, pp. 213:127 22.

Cupp.M. J, TracyT. S (2003) Coenzyme Q10 (ubiquinone, ubidecarenone). 23.

Humana Press Inc, pp. 53–85

24. Dhanasettakorn.K (2008) Coenzyme Q10 content, composition, texture and

physiochemical characteristics of pasta fortified with freeze dried beef heat. A

Dissertation presented to the Faculty of the Graduate School at the University of

Missouri Columbia.

116

25. Eisenreich.W, Bacher.A, Arigoni.D, Rohdich. F, (2004) Biosynthesis of isoprenoids

via the non-mevalonate pathway. Cell Mol Life Sci, 61, pp. 1401–1426

26. European Pharmacopoeia 4 (2002) Monogragh of ubidecarenone. 1578(4)

27. Fir.M. M, Milivojevic.L, Zmitek.J. and Prosek.M (2009) Studies of CoQ10 and

cyclodextrin complexes: solubility,thermo- and photo-stability. Journal of Inclusion

Phenomena and Macrocyclic Chemistry 64 pp. 225-232

28. Fred.Z, Esther. B, Daniel.S (2006) Preparation and Properties of Coenzyme Q10

Nanoemulsions. Cosmetic Science Technology

29. Frederick.L. C (2001) Biochemical Functions of Coenzyme Q10. Department of

Biological Sciences, Purdue University, West Lafayette, Indiana

30. Fujita.Y. I, Onishi.M. T, Nishida.T (1982) A new efficient and stereoselective

synthesis of ubiquinone-10. Bull. Chem. Soc. Jpn, 55, pp. 1325-1326

31. Gu.S. B, Yao.J. M, Yuan.Q. P., Xue.P. J, Zheng.Z. M (2006) Kinetics of

Agrobacterium tumefaciens ubiquinone-10 batch production. Process Biochemistry

41 pp. 1908_1912

32. Gvozdjakova.A. K, Bartkovjakova.M (2005) Coenzyme Q10 supplementation

reduces corticosteroids dosage in patients with bronchial asthma. Biofactors,

25(235-240)

33. Ha.S. J, K.S. Y, Seo.J. H, Moon.H. J, Lee.K. M, Lee.J. K (2007a) Controlling the

sucrose concentration increases coenzyme Q10 production in fed-batch culture of

Agrobacterium tumefaciens. Applied Microbiology and Biotechnology 76, pp.

109_116

34. Ha.S. J, K.S. Y, Seo.J. H, Oh.D. K., Lee.J. K (2007b) Optimization of culture

conditions and scale-up to pilot and plant scales for coenzyme Q10 production by

Agrobacterium tumefaciens. Appl Microbiol Biotechnol, 74, pp. 974-980

35. Hagerman.R. A, Anthony.M. J, Willis.R. A (2001) Solid-phase extraction of lipid

from Saccharomyces cerevisiae followed by high-performance liquid

chromatography analysis of coenzyme Q content. Analytical Biochemistry, 296,

pp. 141-143

36. Hamano.Y, Dairi.T, Yamamoto.M, Kuzuyama.T, Itoh.N, Seto.H (2002) Growth-

phase dependent expression of the mevalonate pathway in a terpenoid antibiotic-

producing Streptomyces strain. Biosci Biotechnol Biochem 66, pp. 808–819

37. Hoppe.U, Bergemanna.J, Diembecka.W (1999) Coenzyme Q10, a cutaneous

antioxidant and energizer. BioFactors, 9 pp. 371–378

117

38. Hsia.S. L, Narain.N. R, Li.J, Russell.K. J, Woan.K. W (2014) Topical Coenzyme

Q10 formulations and methods of use. Publication USPA, editor. United States:

University of Miami, (51)

39. Ikeda.M, Kagei.K (1979) Ubiquinone content of eight plant species in cell culture.

Phytochemistry, 18, pp. 1577-1578

40. Islam.M. S, Akter.M. M, Rahman M. A, Rahman.M. M, Akhtar.M. M, Alam.M. F.

(2010) Isolation of Agrobacterium tumefaciens Strains from Crown Gall Sample of

Dicot Plants in Bangladesh. Current Research in Bacteriology 3, pp. 27-36

41. Jeya.M, Moon.H. J, Lee.J. L, Kim.I.W, Lee.J. K. (2010) Current state of coenzyme

Q10 production and its applications. Microbiol Biotechnol 85, pp. 1653–1663

42. Katsuki.H, Bloch.K. (1967) Studies on the biosynthesis of ergosterol in yeast:

formation of methylated intermediates. J Biol Chem, 242, pp. 222–227

43. Kim.S. J, Kim.M. D, Choi.J.H (2006) Amplification of 1-deoxy-D-xyluose 5-

phosphate (DXP) synthase level increases coenzyme Q10 production in

recombinant Escherichia coli. Mol. Biotechnol, 72, pp. 982–985

44. Kommuru.T. R, Ashraf.M, Khan.M. A, Reddy.I. K (1999) Stability and

bioequivalence studies of two marketed formulations of coenzyme Q10 in beagle

dogs. Chem. Pharm. Bull, 47, pp. 1024–1028

45. Kondo (1971) Method of producing coenzyme Q10 by microorganisms. United

States Patent

46. Kuratsu.Y, Hagino.H, Inuzuka.K (1984) Effect of ammonium ion on coenzyme Q10

fermentation by Agrobacterium species. Agric. Biol. Chem, 48, pp. 1347– 1348

47. Kuzuyama.T (2002) Mevalonate and nonmevalonate pathways for the biosynthesis

of isoprene units. Biosci Biotechnol Biochem, 66, pp. 1619–1627

48. Kwon.S. S, Nam.Y. S, Lee.J. S (2002) Preparation and characterization of

coenzyme Q10-loaded PMMA nanoparticles by a new emulsification process based

on microfluidization. Physicochemical and Engineering Aspects, 210, pp. 95-104

49. Langsjoen.P. H, Langsjoen.A (1999) Overview of the use of CoQ10 in

cardiovascular disease. Biofactors, 9(2–4), pp. 273–84

50. Lee.J. K, Her.G, Kim.S. Y, Seo.J .H. (2004) Cloning and Functional Expression of

the dps Gene Encoding Decaprenyl Diphosphate Synthase from Agrobacterium

tumefaciens. Biotechnol. Prog, 20, pp. 51-56

51. Lipshutz.B. H, Mollard.P, Pfeiffer.S. S, Chrisman.W (2002) A short highly efficient

synthesis of coenzyme Q10. J Am Chem Soc, 124, pp. 14282–14283

118

52. Liu.X, Wu.H, Ye.J, Yuan.Q, Zhang.H (2006) Cloning and characterization of the

ddsA gene encoding decaprenyl diphosphate synthase from Rhodobacter

capsulatus B10. Can. J. Microbiol 52, pp. 1141–1147

53. Mancini.A, De.M. L, Oradei.A (1994) Coenzyme Q10 concentrations in normal

and pathological human seminal fluid. J Androl, 15(591-594)

54. Matsumura.M, Kobayashi.T, Aiba.S (1983) Anaerobic production of ubiquinone-

10 by Paracoccus dentrificans. Eur J ApplMicrobiol Biotechnol 17, pp. 85–89

55. Matthysse.A. G (2006) The genus Agrobacterium. Prokaryotes, 5(91-114)

56. McLennan.H, Degli.E. M (2000) The contribution of mitochondrial respiratory

complexes to the production of reactive oxygen species. J Bioenerg Biomemb, 32,

pp. 153–162

57. Mcneil.B, Harvey.L. M (2008) Practical Fermentation Technology, Strathclyde

Fermentation Centre. Strathclyde University, UK

58. Meganathan.R (2001) Ubiquinone biosynthesis in microorganisms. FEMS

Microbiol Lett 203, pp. 131–139

59. Melzer.M, Heide.L (1994) Characterization of polyprenyldiphosphate: 4-

hydroxybenzoate polyprenyltransferase from Escherichia coli. Biochim Biophys

Acta 1212, pp. 93–102

60. Michael.R. S (2010) Coenzyme Q10 Biosynthesis in Plants. A dissertation

submitted to the Graduate Faculty of North Carolina State University in partial

fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy

61. Min.J. H, Lee.J. S, Yang,J. D, Koo.S (2003) The Friedel-Crafts alkylation of a

prenyl group stabilized by a sulfone moiety: Expeditious synthesis of ubiquinones

and menaquinones. J. Org. Chem, 68, pp. 7925-7927

62. Miyake.Y, Shouzu.A, Nishikawa.M (1999) Effect of treatment with 3-hydroxy-3-

methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors on serum coenzyme Q10 in

diabetic patients. Arzneimittelforschung, 49(324-329)

63. Molyneux.S. L (2006) Development of assays for Coenzyme Q10 and their

application in clinical trials. A thesis submitted in partial fulfilment of the

requirements for the degree of Doctor of Philosophy in Chemistry in the University

of Canterbury

64. Mu.F. S, Luo.M, Fu.Y. J, Zhang.X, Yu.P (2011) Synthesis of the Key Intermediate

of Coenzyme Q10. Molecules 2011, 16, pp. 4097-4103

119

65. Munkholm.H, Hansen.H, Rasmussen.K (1999) Coenzyme Q10 treatment in serious

heart failure. Biofactors 9, pp. 285–9

66. Narendra.K. S, Puspha.A, Sujata.A. S, Bhavana.B. K (2012) Fermentation, media

optimization studies for Coenzyme Q10 production by Saccharomyces cerevisiae.

International research journal of pharmacy ISSN pp. 2230 – 8407

67. Nguyen Ba Kien, K.I. S, Lee.M. G, Kim.J. K (2010) Coenzyme Q10production in a

150-l reactor by a mutant strain of Rhodobacter sphaeroides. J Ind Microbiol

Biotechnol 37, pp. 521–529

68. Okada.K, Kainou T, Tanaka.K, Nakagawa.T, Matsuda.H, Kawamukai.M (1998b)

Molecular cloning and mutational analysis of the ddsA gene encoding decaprenyl

diphosphate synthase from Gluconobacter suboxydans. Eur J Biochem 255, pp. 52–

59

69. Okada.K, Suzuki.K, Kamiya.Y, Zhu.X, Fujisaki.S, Nishimura.Y, Nishino.T,

Nakagawa.T, Kawamukai.M, Matsuda.H (1996) Polyprenyl diphosphate synthase

essentially defines the length of the side chain of ubiquinone. Biochim Biophys

Acta 1302, pp. 217–223

70. Onoue.S, Uchida.A, Kuriyama.K (2012) Novel solid self-emulsifying drug delivery

system of coenzyme Q10 with improved photochemical and pharmacokinetic

behaviors. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 46, pp. 492-499

71. Overvad.K, Diamant.B, Holm.L, Holmer.G, Mortensen.S. A, Stender.S (1999) Q10

in health and disease. Europ J Clin Nutr, 53, pp. 764–70

72. Papas.A. M (1999) Other antioxidants”. Antioxidant status, diet, nutrition, and

health. New York: CRC Press LLC, pp. 231–48

73. Park.Y. C, Kim.S. J, Choi.J. H, Lee.W .H, Park.K. M, Kawamukai.M, Ryu.Y. W,,

Seo.J. H (2005) Batch and fed-batch production of coenzyme Q10 in recombinant

Escherichia coli containing the decaprenyl diphosphate synthase gene from

Gluconobacter suboxydans. Appl Microbiol Biotechnol, 67, pp. 192–196

74. Quinn.P. J, Fabisiak. J (1999) Expansion of antioxidant function of vitamin E by

coenzyme Q. Biofactors, 9(2–4), pp. 149–54

75. Ranadive.P, Mehta. A, George.S (2011) Strain improvement of Sporidiobolus

johnsonii-ATCC. International Journal of Chemical Engineering and Applications,

2

76. Ravada.S. R, Emani.L. R, Garaga.M. R, Meka. B, Golakoti. T (2209) Synthesis of

coenzyme Q10. Am. J. Infect. Dis, 2, pp. 83-89

120

77. Redalieu.E, Nilsson.I. M, Farley.T. M., Folkers.K (1968) Determination and levels

of Coenzyme Q10 in Human Blood. Analytical biochemistry 23 23 pp. 1132 - 1140

78. Rodriguez.A. R, Brenne.E, Lacoste.F (2008) Determination of Coenzyme Q10 and

Q9 in vegetable oils. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56, pp. 6241-

6245

79. Rohmer.M, Knani.M, Simonin.P, Sutter.B, Sahm.H (1993) Isoprenoid biosynthesis

in bacteria: a novel pathway for the early steps leading to isopentenyl diphosphate.

Biochem J 295(Pt 2), pp. 517–524

80. Rüegg.R, Gloor.U, Goel.R.N, Ryser.G, Wiss.O, Isler.O (1959) Synthesis of

bichinon and ubichinon. Helv. Chim. Acta, 42, pp. 2616-2621

81. Sauchet.N, Laplante.S (2006) Seasonal variation of Co-enzyme Q10 content in

pelagic fish tissues from Eastern Quebec. Journal of Food Composition and

Analysis 20, pp. 403-410

82. Scaglione.F, Barbieri.B, Lundstrom.B, Lund.B (1999) Coenzyme Q10

administration increases antibody titer in hepatitis B vaccinated volunteers–A

single blind placebo–controlled and randomized clinical study. Biofactors, 9, pp.

351–7

83. Seo.J. M, Im.E. M, Nam.J. Y, Kim.S.O (2007) Increase of CoQ10 Production

Level by the Coexpression of Decaprenyl Diphosphate Synthase and 1-Deoxy-D-

xylulose 5-Phosphate Synthase Isolated from Rhizobium radiobacter ATCC 4718 in

Recombinant Escherichia coli. J. Microbiol. Biotechnol, 17(6), pp. 1045–1048

84. Seo.M. J, Kim.S. O (2010) Effect of Limited Oxygen Supply on Coenzyme Q10

Production and Its Relation to Limited Electron Transfer and Oxidative Stress in

Rhizobium radiobacter T6102. J. Microbiol. Biotechnol, 20(2), pp. 346–349

85. Serge.L, Nathalie.S, Piotr.B, (2009) Comparison of low-temperature processes for

oil and coenzyme Q10 extraction from mackerel and herring. Eur. J. Lipid Sci.

Technol, 111, pp. 135–141

86. Suzuki.K, Okada.K., Kamiya.Y, Zhu.X. F, Nakagawa.T, Kawamukai.M,

Matsuda.H (1997) Analysis of the decaprenyl diphosphate synthase (dps) gene in

fission yeast suggests a role of ubiquinone as an antioxidant. J Biochem 121, pp.

496–505

87. Takahashi.S, Nishino.T, Koyama.T (2003) Isolation and expression of Paracoccus

denitrificans decaprenyl diphosphate synthase gene for production of ubiquinone-

10 in Escherichia coli. Biochem Eng J, 16, pp. 183–190

121

88. Terao.S, Kato.K, Shiraishi.M, Morimoto.H (1979) Synthesis of ubiquinones. 2. An

efficient preparation of ubiquinone-10. J. Org. Chem, 44, pp. 868-869

89. Tian.Y (2010a) Improvement of cultivation medium for enhanced production of

coenzyme Q10 by photosynthetic Rhodospirillum rubrum. Biochemical Engineering

Journal, 51, pp. 160–166

90. Tian.Y (2010b) Effects of Cell Lysis Treatments on the Yield of Coenzyme Q10

Following Agrobacterium tumefaciens Fermentation. Food Sci Tech Int, 16(2), pp.

0195–9

91. Urakami.T, Yoshida.T (1993) Production of ubiquinone and bacteriochlorophyll a

by Rhodobacter sphaeroides and Rhodobacter sulfidophilus. J Ferment Bioeng

76(3), pp. 191-194

92. Valle.D, E.M. M (2004) Cyclodextrins and their uses. Process Biochemistry, 39,

pp. 1033-1046

93. Watts.G. F, Playford.D.A, Croft.K. D (2002) Coenzyme Q10 improves endothelial

dysfunction of the brachial artery in Type II diabetes mellitus. Diabetologia,

45(420-426)

94. Weber .C (2001) “Dietary intake and absorption of coenzyme Q10”, Coenzyme Q:

molecular mechanisms in health and disease. New York: CRC Press LLC, pp.

209–26

95. Weber.C, Bysted.A, Holmer.G (1997) The coenzyme Q10 content of the average

Danish diet. Int J Vit Nutr Res 67, pp. 123–9

96. Xia.Q, Wang.H (2011) Study on stability of Coenzyme Q10-loaded nanostructured

lipid carriers. Integrated Ferroelectrics: An international Journal 129(1) pp. 208-

214

97. Yalcin.A, Kilinc.E, Sagcan.A, Kultursay.H (2004) Coenzyme Q10 concentrations

in coronary artery disease. Clin Biochem 37, pp. 706–9

98. Yang.H. Y, Song.J. F (2006) High-sensitive determination of coenzyme Q10 in

iodinate β – cylodextrin medium by inclusion reaction and catalytic polarography.

Analytical Biochemistry, 348

99. Yoshida.H, Kotani. Y (1998) Production of ubiquinone-10 using bacteria. J. Gen.

Appl. Microbiol, 44, pp. 19–26

100. Yoshizawa.T, Toyofuka.H, Tachibana.K.,Kuroda.T (1982) Regioselective

polyprenyl rearrangement of polyprenyl 2,3,4,5-tetrasubstituted phenyl ethers

promoted by boron trifluoride. Chem. Lett, 8, pp. 1131-1134

122

101. Yuan.Y, Tian.Y, Yue.T (2012) Improvement of Coenzyme Q10 Production:

Mutagenesis Induced by High Hydrostatic Pressure Treatment and Optimization of

Fermentation Conditions. Journal of Biomedicine and Biotechnology,

102. Zahiria.H. S (2006) Coenzyme Q10 production in recombinant Escherichia coli

strains engineered with a heterologous decaprenyl diphosphate synthase gene and

foreign mevalonate pathway. Metabolic Engineering 8, pp. 406–416

103. Zahiria.H. S (2009) Effect of concomitant lycopene biosynthesis on CoQ10

accumulation in transformed Escherichia colistrains.

104. Zhang.D, Shrestha.B, Li.Z, Tan.T (2007) Ubiquinone-10 production using

Agrobacterium tumefaciens dps gene in Escherichia coli by coexpression system.

Mol. Biotechnol, 35(1), pp. 1-14

105. Zhang.Z, Inserra.P.F, Watson.R. R (1997) “Antioxidants and AIDS”. Antioxidants

and disease prevention. New York: CRC Press LLC, pp. 31–43

106. Zhong.W, Fang.J, Liu.H, Wang.X (2009) Enhanced production of CoQ10 by newly

isolated Sphingomonas sp. ZUTEO3 with a coupled fermentation–extraction

process. J Ind Microbiol Biotechnol 36, pp. 687–693

107. Zhu X., Yuasa.M, Okada.K, Suzuki.K., Nakagawa.T, Kawamukai.M, Matsuda.H

(1995) Production of ubiquinone in Escherichia coli by expression of various genes

responsible for ubiquinone biosynthesis. J Ferment Bioeng 79, pp. 493 – 495

.

123

PHỤ LỤC

LOCUS KR261089 1322 bp DNA linear BCT 10- OCT-2015 DEFINITION Agrobacterium tumefaciens strain TT4 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. ACCESSION KR261089 VERSION KR261089.1 GI:936294395 KEYWORDS . SOURCE Agrobacterium tumefaciens (Rhizobium radiobacter) ORGANISM Agrobacterium tumefaciens Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiaceae; Rhizobium/Agrobacterium group; Agrobacterium; Agrobacterium tumefaciens complex. REFERENCE 1 (bases 1 to 1322) AUTHORS Truong,P.Q., Nguyen,P.V. and Dang,T.T. TITLE Isolation and screening of the coq10 producing Agrobacterium tumefaciens strains from nodules of rose trees in vietnam JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 1322) AUTHORS Truong,P.Q., Nguyen,P.V. and Dang,T.T. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (23-APR-2015) Center for Research and Development in Biotechnology, Hanoi University of Science and Technology, No 1 Dai Co Viet, Hai Ba Trung, Hanoi 00000, Vietnam COMMENT ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES Location/Qualifiers source 1..1322 /organism="Agrobacterium tumefaciens" /mol_type="genomic DNA" /strain="TT4" /db_xref="taxon:358" /country="Viet Nam" /lat_lon="21.5 N 105.44 E" /collection_date="10-Feb-2012" /collected_by="Phong T.Q." rRNA <1..>1322 /product="16S ribosomal RNA" ORIGIN 1 acgccccgca aggggagtgg cagacgggtg agtaacgcgt gggaacatac cctttcctgc 61 ggaatagctc cgggaaactg gaattaatac cgcatacgcc ctacggggga aagatttatc 121 ggggaaggat tggcccgcgt tggattagct agttggtggg gtaaaggcct accaaggcga 181 cgatccatag ctggtctgag aggatgatca gccacattgg gactgagaca cggcccaaac 241 tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc gcaagcctga tccagccatg 301 ccgcgtgagt gatgaaggcc ttagggttgt aaagctcttt caccgatgaa gataatgacg 361 gtagtcggag aagaagcccc ggctaacttc gtgccagcag ccgcggtaat acgaaggggg 421 ctagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgtag gcggatattt aagtcagggg

Phụ lục 1. Trình tự và đặc điểm gen 16S của A. tumefaciens TT4

124

481 tgaaatcccg cagctcaact gcggaactgc ctttgatact gggtatcttg agtatggaag 541 aggtaagtgg aattccgagt gtagaggtga aattcgtaga tattcggagg aacaccagtg 601 gcgaaggcgg cttactggtc cattactgac gctgaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca 661 ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgaat gttagccgtc gggcagtata 721 ctgttcggtg gcgcagctaa cgcattaaac attccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt 781 aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa 841 gcaacgcgca gaaccttacc agctcttgac attcggggta tgggcattgg agacgatgtc 901 cttcagttag gctggcccca gaacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag 961 atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa ccctcgccct tagttgccag catttagttg 1021 ggcactctaa ggggactgcc ggtgataagc cgagaggaag gtggggatga cgtcaagtcc 1081 tcatggccct tacgggctgg gctacacacg tgctacaatg gtggtgacag tgggcagcga 1141 gacagcgatg tcgagctaat ctccaaaagc catctcagtt cggattgcac tctgcaactc 1201 gagtgcatga agttggaatc gctagtaatc gcagatcagc atgctgcggt gaatacgttc 1261 ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttg gttttacccg aaggtagtgc 1321 gc

LOCUS KJ619965 1077 bp DNA linear BCT 11- JUN-2014 DEFINITION Agrobacterium tumefaciens strain TT4 decaprenyl diphosphate synthase (dps) gene, partial cds. ACCESSION KJ619965 VERSION KJ619965.1 GI:647841698 KEYWORDS . SOURCE Agrobacterium tumefaciens (Rhizobium radiobacter) ORGANISM Agrobacterium tumefaciens Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiaceae; Rhizobium/Agrobacterium group; Agrobacterium; Agrobacterium tumefaciens complex. REFERENCE 1 (bases 1 to 1077) AUTHORS Truong,P.Q., Nguyen,P.V. and Dang,T.T. TITLE Reconstruction of Agrobacterium tumefaciens strain for enhancing coq10 producibility JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 1077) AUTHORS Truong,P.Q., Nguyen,P.V. and Dang,T.T. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (25-MAR-2014) Center for Research and Development in Biotechnology, Hanoi University of Science and Technology, No1 Dai Co Viet, Hai Ba Trung, Hanoi 00000, Vietnam COMMENT ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES Location/Qualifiers source 1..1077 /organism="Agrobacterium tumefaciens" /mol_type="genomic DNA" /strain="TT4" /isolation_source="rose nodule" /specimen_voucher="TT4"

Phụ lục 2. Trình tự và đặc điểm gene dps

125

/db_xref="taxon:358" /country="Viet Nam" /lat_lon="21.5 N 105.44 E" /collection_date="10-Feb-2012" /collected_by="Phong T.Q." gene <1..1077 /gene="dps" CDS <1..1077 /gene="dps" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="decaprenyl diphosphate synthase" /protein_id="AIC32316.1" /db_xref="GI:647841699"

/translation="LPHKASVFIVEFKFELESCPLGVVIPLEESKNKLASVKPLVDLT RPDMERVNQLILSKAGSDVQMIPEVANHLISSGGKRLRPMLTLASASMFGYEGDNHIK LATSVEFMHTATLLHDDVVDESDLRRGKSTARTIWGNQASVLVGDFLLGQAFRMMVDV GSLDALDVLSTAASVIAEGEVLQLSVAKNMETTEDDYLQVIRAKTAALFAAAAEVGPI VAKTDKATRSALKSYGMNLGLAFQLVDDVLDYGGKSADLGKNTGDDFREGKITLPVIL SYRRGTQDERAFWRNAIEKGESSDENLEKALGLITKYNGLGDTIGRATHYGTIARDAL APLPQSPWKDALLEVIDFCIERLN"

ORIGIN

1 ttgccgcaca aggcatcagt ttttattgtc gaattcaaat tcgaactgga gtcctgtccc 61 ttgggcgtcg tcataccgct tgaagaaagc aaaaacaaac tcgcatccgt caagccgctt 121 gtcgacctga cccgccccga catggaacgg gtgaaccagc ttatcctttc caaggccggt 181 tccgacgtgc agatgatacc cgaggtggcc aaccacctca tctcgtcagg cggcaagcgc 241 ctgcggccga tgctgacgct cgcctcggcc tcgatgttcg gttacgaggg cgataatcac 301 atcaagctcg ccacgagcgt tgagttcatg cacacggcga cgcttctgca tgacgacgtg 361 gtggatgaaa gcgatctgcg tcgcggcaaa tccaccgcac gcaccatctg gggtaaccag 421 gcaagcgttc tcgtcggcga cttcctgctt ggccaggctt tccgcatgat ggtggatgtc 481 ggctctctcg atgccctcga cgtgctctcc accgccgcct cggtcatcgc cgagggtgag 541 gtgctgcagc tttcggtcgc caagaacatg gaaacgaccg aggacgatta tcttcaggtg 601 attcgcgcca agacggctgc cctcttcgcc gccgcggccg aagtcggccc catcgtcgcc 661 aagaccgaca aggcgacccg cagtgccctg aaatcttatg gcatgaatct cggcctcgcc 721 ttccagctgg tcgatgacgt cttggactat ggcggcaagt cggccgatct cggcaaaaac 781 acaggcgacg atttccgcga gggcaagatc accctgccgg tcatcctgtc ctatcgccgc 841 ggcacgcagg atgagcgcgc tttctggcgc aatgccatcg aaaaaggcga gagcagcgac 901 gagaacctcg aaaaggcgct cggcctgatc acaaaatata acggcctcgg tgatacgata 961 ggccgtgcaa cgcattatgg caccattgcc cgcgatgcgc ttgcaccgtt gccgcagagc

1021 ccctggaaag atgcgcttct ggaagtgatc gacttctgca tcgagcgtct caactga

LOCUS KJ619966 1890 bp DNA linear BCT 11- JUN-2014 DEFINITION Agrobacterium tumefaciens strain TT4 1-deoxy-D-xylulose 5- phosphate synthase (dxs) gene, partial cds. ACCESSION KJ619966 VERSION KJ619966.1 GI:647841711 KEYWORDS . SOURCE Agrobacterium tumefaciens (Rhizobium radiobacter) ORGANISM Agrobacterium tumefaciens Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales;

Phụ lục 3. Trình tự và đặc điểm gene dxs

126

Rhizobiaceae; Rhizobium/Agrobacterium group; Agrobacterium; Agrobacterium tumefaciens complex. REFERENCE 1 (bases 1 to 1890) AUTHORS Truong,P.Q., Nguyen,P.V. and Dang,T.T. TITLE Reconstruction of Agrobacterium tumefaciens strain for enhancing coq10 producibility JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 1890) AUTHORS Truong,P.Q., Nguyen,P.V. and Dang,T.T. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (25-MAR-2014) Center for Research and Development in Biotechnology, Hanoi University of Science and Technology, No1 Dai Co Viet, Hai Ba Trung, Hanoi 00000, Vietnam COMMENT ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES Location/Qualifiers source 1..1890 /organism="Agrobacterium tumefaciens" /mol_type="genomic DNA" /strain="TT4" /isolation_source="rose nodule" /specimen_voucher="TT4" /db_xref="taxon:358" /country="Viet Nam" /lat_lon="21.5 N 105.44 E" /collection_date="10-Feb-2012" /collected_by="Phong T.Q." gene <1..>1890 /gene="dxs" CDS <1..>1890 /gene="dxs" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase" /protein_id="AIC32317.1" /db_xref="GI:647841712"

/translation="LTGMPQTPLLDRVNFPSDLKEIDDRDLPELARELRDEMIDAVSK TGGHLGAGLGVVELTIAIHKVFNTPEDRLIFDVGHQCYPHKILTGRRDRIRTLRQEGG LSGFTRRAESEYDDFGAGHSSTSISAGLGMAVAAGLDGSDRKVIAVIGDGSMSAGMAF EALNNAGALDARLIVILNDNDMSIAPPTGAMSAYLARLASGRTYMGFRDFGKKLTAYL GKTIDRAITRAVTHARGYVTGGTLFEELGFYHIGPIDGHSFDHLLPVLRNVRDNQKGP VLIHVVTQKGKGYAPAEAAADKYHGVNKFDVITGAQAKAKPNAPSYTSVFAEALIQEA TLDEKIIGVTAAMPNGTGLDKMAELFPARTFDVGIAEQHAVTFAAGLAADGYKPFCAL YSTFLQRGYDQLVHDVAIQSLPVRFPIDRAGFVGADGPTHAGSFDTTFLATLPGMVVM AASDEAELKHMVRTAAAYDEGPISFRYPRGEGVGVEMPARGEILQIGKGRIIKEGTKV ALLSFGTRLAECLAAAEDLDAAGLPTTVADARFAKPLDLDLIRQLASHHEILVTVEEG SVGGFGAHVLHFMASGGLLDHGPKVRTLTLPDQWVEQAKPETMYANAGLDRAGIISTV FNALGQ"

ORIGIN

1 ttgaccggaa tgccacagac accattgctt gaccgggtga attttccctc cgatctcaag 61 gagatcgatg atcgcgactt gccggaactg gcaagggaac tgcgcgacga gatgatcgat

127

121 gccgtgtcga aaaccggtgg gcatctgggt gccggccttg gtgtggtgga actgacgatt 181 gccatccaca aggtcttcaa cacgcccgaa gaccggctga tcttcgatgt cggacaccaa 241 tgttatccgc acaagatcct gaccggccgg cgggatcgca tccgcacgct gcggcaggaa 301 ggtggccttt ccggtttcac ccgccgtgcg gaaagcgaat atgacgattt cggcgccggc 361 cattcctcca cctccatttc cgccggtctc ggcatggcgg tggcggcggg cttggatggc 421 agcgaccgca aggtgatcgc tgtcatcggc gacggctcga tgtctgccgg tatggccttt 481 gaggcgctga acaatgccgg cgcgctcgat gcacgactga tcgtcatctt gaacgacaac 541 gacatgtcca ttgcgccgcc gacgggcgcg atgagcgcct atctggcgcg tctcgcttcc 601 ggccgcacct atatgggttt tcgcgatttc ggcaagaagc tcaccgccta tctcggcaag 661 acgatcgacc gcgccattac ccgcgccgtg acccatgcgc gcggttacgt gaccggcggc 721 accctgttcg aggagctcgg tttctatcac atcggcccga tcgacggtca ctccttcgac 781 cacctgttgc cggtgctgcg caatgtgcgc gacaaccaga aaggccctgt cctcatccat 841 gtggtgacac agaaaggcaa gggttatgcg ccggcggaag ccgcagcgga caaatatcac 901 ggcgtcaaca agttcgatgt catcaccggc gcgcaggcga aagccaagcc gaatgcgccg 961 agctatacca gcgtctttgc cgaggcgctg atccaggaag ccacgctcga tgagaaaatc 1021 atcggtgtga cggccgcgat gcccaacggt accggcctcg acaagatggc cgagctgttc 1081 ccggcgcgca ccttcgatgt cggcattgcc gaacagcatg ccgtcacctt tgcggcggga 1141 cttgcggctg acggttacaa gccgttctgc gcgctttatt ccaccttcct gcagcgcggt 1201 tacgaccagt tggtgcatga tgtggcaata cagagcctgc ccgtgcgttt cccgatcgac 1261 cgcgccggtt ttgtcggcgc cgacgggccg acccatgccg gctctttcga caccactttc 1321 ctcgccaccc tccccggcat ggtagttatg gcggcctcgg atgaggcgga gctgaaacat 1381 atggtccgca cggcggcggc ctatgacgaa ggcccgattt ccttccgtta tccgcgcgga 1441 gaaggtgtcg gcgttgaaat gcccgcacgc ggggagattc ttcagatcgg caagggtcgc 1501 atcatcaagg aaggcacgaa ggttgccctg ctttccttcg gaacccgcct tgcggaatgc 1561 ctggcggcgg ccgaagacct ggacgccgcc ggtcttccca cgacggttgc cgatgcgcgc 1621 ttcgccaagc cgctcgatct cgatctcatc cgccagctcg ccagccatca tgagattctg 1681 gtgacggtcg aggaaggctc ggtcggcggt ttcggcgcac atgtgctgca tttcatggca 1741 agtggcggcc tgctcgatca cggccccaag gtgcggacac tcacactgcc ggaccagtgg 1801 gtggaacagg ccaagccaga gaccatgtat gccaatgccg gcctcgaccg ggccggcatc 1861 atttccacgg tgttcaatgc gctcggccag

Phụ lục 4. Đồ thị đường chuẩn DPPH (mM)

128

Phụ lục 5. Đồ thị đường chuẩn Coenzyme Q10 (mg/ml)

Phụ lục 6. Đường chuẩn CoQ10 chuẩn theo HPLC

Phụ lục 7. Nồng độ CoQ10 trung hòa gốc tự do DPPH

STT Tên mẫu Nồng độ phần trăm trung hòa gốc tự do DPPH (%)

EC 50 (mM) 0 mM 0,025 mM 0,05 mM 0,1 mM 0,2 mM 0,4 mM 0,8 mM

100 84.31 76.15 62.72 41.01 14.54 9.17 0, 18

Coenzyme Q10 tách chiết từ A. tumefaciens tái tổ hợp

129

Phụ lục 8. Sơ đồ chi tiết quá trình tổng hợp CoQ10 ở vi sinh vật

Con đƣờng MEP Con đƣờng MVA

130

Phụ lục 9. Các bảng số liệu về kết quả tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A.

tumefaciens tái tổ hợp

Phụ lục 9.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh tổng hợp CoQ10

Sucrose Lactose Manose Glucose Xylose Galactose

16.0 11.0 14.2 14.6 9.1 15.1

Nguồn cacbon CoQ10 (mg/l)

Phụ lục 9.2: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến sinh tổng hợp CoQ10

0 2.5 5.0 7.5 10

6.2 13.97 18.42 13.33 10.79

Nồng độ sucrose (%) CoQ10 (mg/l)

Phụ lục 9.3: Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sinh tổng hợp CoQ10

Nguồn nitơ Peptone Tryptone CSL Ure (NH4)2SO4

14.96 18.10 26.68 17.95 13.55 Cao malt 20.09 Cao nấm men 18.68

CoQ10 (mg/l)

Phụ lục 9.4: Ảnh hưởng nồng độ CSL đến sinh tổng hợp CoQ10

0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0

Nồng độ CSL (%)

51.84 54.19 39.55 30.27 26.84 22.07

CoQ10 (mg/l)

Phụ lục 9.5: Ảnh hưởng của pH đầu đến sinh tổng hợp CoQ10

6.0 34.97 6.5 54.27 7.0 54.07 7.5 66.54 8.0 68.82

pH CoQ10 (mg/l)

Phụ lục 9.6: Ảnh hưởng của lượng giống đến sinh tổng hợp CoQ10

0.05 0.1 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0

67.80 90.09 100.30 103.82 108.76 100.66 91.89 58.69

Lƣợng giống OD(660) CoQ10 (mg/l)

131

Phụ lục 9.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh tổng hợp CoQ10

20 45.82 25 98.29 28 125.08 30 94.64 37 13.52

Nhiệt độ (oC) CoQ10 (mg/l)

Phụ lục 9.10 : Ảnh hưởng của thời gian đến sinh tổng hợp CoQ10

0 24 48 72 96 120 144

0 56.72 78.72 111.02 126 126.45 128.56

Thời gian (giờ CoQ10 (mg/l)

Phụ lục 10. Cây phân loại chủng A. tumefaciens Tt4 theo trình tự 16S. Cây phân loại được thiết lập theo phương pháp neighbour-joining sử dụng phần mềm ClustalW2 [www.ebi.ac.u/clustalw2]. Các ký tự và chữ số trước tên chủng là mã số của trình tự gene trên ngân hàng gen.

132

Phụ lục 11. Các kết quả phân tích hàm lượng aflatoxin, an toàn vệ sinh thực phẩm, độc

tính cấp của CoQ10

133