Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu sản xuất vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú (Epinephelus spp.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

MẪN HỒNG PHƯỚC

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN BẤT HOẠT

PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH CHO CÁ MÚ

(Epinephelus spp.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Hà Nội, năm 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

MẪN HỒNG PHƯỚC

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN BẤT HOẠT

PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH CHO CÁ MÚ

(Epinephelus spp.)

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Mã số : 942 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS. Phạm Thị Tâm

PGS.TS. Đồng Văn Quyền

Hà Nội, năm 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện. Toàn

bộ số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng

được sử dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu để nhận học vị, các

thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2023

Tác giả luận án

ẫn HMMaanx ồng Phước

Mẫn Hồng Phước

Để hoàn thành đề tài luận án này tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ

LỜI CẢM ƠN

từ các tổ chức và cá nhân.

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Phạm Thị

Tâm (Viện Đại học Mở Hà Nội), PGS. TS. Đồng Văn Quyền (Viện Công

nghệ sinh học) đã định hướng, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện

thuận lợi để tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này.

Tôi xin cảm ơn anh, chị đồng nghiệp phòng Vi sinh vật học phân tử -

Viện Công nghệ sinh học luôn hỗ trợ, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện giúp tôi

hoàn thành luận án này

Để hoàn thành luận án này, tôi còn nhận được sự động viên, khuyến

khích giúp đỡ của các bạn bè, đồng nghiệp và đặc biệt là gia đình tôi. Tất cả

những sự giúp đỡ và tình cảm quý báu đó là nguồn động lực lớn giúp tôi có

thể hoàn thành công trình nghiên cứu này.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2023

Mẫn Hồng Phước

Tác giả luận án

Mẫn Hồng Phước

iii

MỤC LỤC

Lời cam đoan ............................................................................................... i

Lời cảm ơn .................................................................................................. ii

Mục lục ........................................................................................................ iii

Danh mục chữ viết tắt ................................................................................. vii

Danh mục bảng .......................................................................................... x

Danh mục hình ........................................................................................... xii

MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1

1. Lý do chọn đề tài: ................................................................................... 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................... 3

3. Nội dung nghiên cứu: .............................................................................. 3

4. Đối tượng nghiên cứu: ............................................................................ 4

5. Phạm vi nghiên cứu: .............................................................................. 4

6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn: .............................................................. 4

7. Đóng góp mới của luận án: ..................................................................... 5

8. Địa điểm và thời gian nghiên cứu: .......................................................... 5

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 6

1.1. Một số đặc điểm sinh học của cá mú ..................................................... 6

1.1.1. Hệ thống phân loại cá mú ................................................................. 6

1.1.2. Đặc điểm phân bố ............................................................................. 6

1.1.3. Đặc điểm sinh trưởng ........................................................................ 7

1.1.4. Đặc điểm sinh sản ............................................................................. 8

1.2. Tình hình bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới và Việt Nam . 9

1.2.1. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới ................................ 9

1.2.2. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú tại Việt Nam .............................. 10

1.3. Tổng quan về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh ............................................................ 12

1.4. Một số hiểu biết cơ bản về hệ miễn dịch của cá xương và vắc-xin ........ 18

1.4.1. Đáp ứng miễn dịch của cá xương ..................................................... 18

1.4.2. Tổng quan về vắc-xin thủy sản ......................................................... 22

1.4.3. Tình hình nghiên cứu và sử dụng vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần

kinh cho cá .......................................................................................................... 28

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 34

2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 34

2.1.1. Cá bệnh.............................................................................................. 34

2.1.2. Cá thí nghiệm .................................................................................... 34

2.1.3. Tế bào ................................................................................................ 34

2.1.4. Hóa chất ............................................................................................ 34

2.1.5. Thiết bị .............................................................................................. 35

2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 36

2.2.1. Sơ đồ các bước thực hiện chính ........................................................ 36

2.2.2. Phương pháp thu và xử lý mẫu ......................................................... 36

2.2.3. Kỹ thuật phân lập vi rút trên tế bào mẫn cảm GS01 ......................... 37

2.2.4. Kỹ thuật tách chiết ARN tổng số ...................................................... 38

2.2.5. Kỹ thuật RT - PCR ........................................................................... 38

2.2.6. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR ............................................. 39

2.2.7. Phương pháp điện di trên gel agarose ............................................... 39

2.2.8. Phương pháp giải trình tự AND ........................................................ 40

2.2.9. Phương pháp xác định TCID50 của NNV ......................................... 40

2.2.10. Phương pháp xác định LD50 của NNV ........................................... 41

2.2.11. Xác định điều kiện nhân giống vi rút .............................................. 42

2.2.12. Phương pháp bất hoạt vi rút ............................................................ 42

2.2.13. Phương pháp tạo vắc-xin keo phèn ................................................. 43

2.2.14. Phương pháp trung hòa trên tế bào ................................................. 44

2.2.15. Phương pháp gây miễn dịch ............................................................ 44

2.2.16. Phản ứng ELISSA gián tiếp ............................................................ 45

2.2.17. Phương pháp thử thách cường độc ................................................ 46

2.2.18. Đánh giá độ an toàn vắc-xin ........................................................... 46

2.2.19. Đánh giá hiệu quả vắc-xin ở điều kiện thực nghiệm ...................... 47

2.2.20. Kiểm tra độ thuần khiết của vắc-xin bất hoạt ................................. 48

2.2.21. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................. 49

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 50

3.1. Kết quả phân lập và lựa chọn chủng giống gốc phục vụ sản xuất vắc-

xin phòng bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú. ................................................... 50

3.1.1. Phân lập vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh từ cá mú nghi nhiễm

bệnh ở miền Bắc .................................................................................................. 50

3.1.2. Xác định độc lực vi rút ( TCID50 và LD50) ........................................ 55

3.1.3. Kết quả lựa chọn chủng giống gốc phục vụ chế tạo vắc-xin phòng

bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú .......................................................................... 60

3.2. Kết quả chế tạo vắc-xin bất hoạt keo phèn phòng bệnh ........................ 70

3.2.1. Tối ưu điều kiện nuôi cấy tế bào ....................................................... 70

3.2.2. Kết quả xác định điều kiện gây nhiễm vi rút. .................................. 73

3.2.3. Kết quả xác định điều kiện bất hoạt vi rút ........................................ 78

3.2.4. Xác định các điều kiện tạo vắc xin bán thành phẩm ......................... 85

3.3. Xây dựng quy trình kiểm tra chất lượng vắc-xin ................................... 91

3.3.1. Đánh giá chỉ tiêu vật lý ................................................................... 92

3.3.2. Đánh giá chỉ tiêu vô trùng .............................................................. 93

3.3.3. Đánh giá chỉ tiêu an toàn vắc-xin ................................................... 94

3.3.4. Đánh giá độ dài miễn dịch của vắc-xin bán thành phẩm ................ 97

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 103

Kết luận ....................................................................................................... 103

Kiến nghị ..................................................................................................... 103

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ........................................................................... 104

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................... 105

Tài liệu tiếng Việt ....................................................................................... 105

Tài liệu tiếng Anh ....................................................................................... 106

PHỤ LỤC ........................................................................................................... 134

Phụ lục 1: Kết quả sàng lọc mẫu cá nghi nhiễm NNV ............................... 134

Phụ lục 2: Trình tự gen T4 của 2 mẫu TB05 và HP02 ........................ 136

Phụ lục 3: Trình tự gen T4 của chủng NNV TB05 qua 10 đời cấy

chuyển ................................................................................................................. 137

Phụ lục 4: Ảnh tiêm cá thí nghiệm .............................................................. 142

Phụ lục 5: Thử nghiệm vắc-xin cho cá giống ............................................. 142

Phụ lục 6: TCVN 8684:2011 ...................................................................... 143

vii

DANH MỤC VIẾT TẮT

Chữ viết đầy đủ và nghĩa Việt

Chữ viết tắt

Amino acid (axit amin) Aa

Aluminum hydroxide AH

Aluminum phosphate AP

Ribonucleic acid (axit ribonucleic) ARN

Benary ethylenimine BEI

BFNNV Barfin flounder nervous necrosis virus (vi rút hoại tử thần

kinh ở cá bơn)

Bp Base pair (cặp bazơ)

BSA Bovine serum albumin (huyết thanh bò)

cDNA Complementary deoxyribonucleic acid (axit

deoxyribonucleic bổ sung)

Cytopathogenic effect (hiệu ứng hủy hoại tế bào) CPE

Colony forming unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) CFU

Central nervous system (hệ thống thần kinh trung ương) CNS

Cộng sự cs

Dalton Da

Diamino bezidine DAB

Deoxyribonucleic acid (axit deoxyribonucleic) DNA

EDTA Ethyllene diamine tetra acetic acid

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

Epithelioma papulosum cyprinid EPC

Ethidium bromide EtBr

fetal bovine serum (huyết thanh bào thai bò) FBS

Freun´d complete adjuvant (chất bổ trợ hoàn chỉnh FCA

Freund)

viii

Horseradish peroxidase (Enzyme Horseradish Peroxidase) HRP

Kilobase kb

Kilodalton kDa

Grouper spleen (lá lách cá mú) GS

Ig Immunoglobulin (kháng thể)

L-15 Leibovitz’s-15

Lethal Dose 50% (liều gây chết 50%) LD50

Major Histocompatibility Complex (tổ hợp tương hợp mô MHC

chính)

Melanomacrophage (tế bào hắc tố) MMC

Multiplicity of infection (Tỷ lệ lây nhiễm trùng) MOI

Non coding region (vùng không mã hóa) NCR

Not done (không thực hiện) ND

Nucleotide Nt

Nervous Necrosis Virus (vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh) NNV

Office International des Epizooties (Tổ chức Thú y thế OIE

giới)

Open Reading Frame (khung đọc mở) ORF

Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi Polymerase) PCR

Plaque Forming Units (đơn vị hình thành vết tan) PFU

RGNNV Red - spotted grouper nervous necrosis virus (vi rút hoại

tử thần kinh ở cá mú đốm đỏ)

RPS Relative percent survival (tỉ lệ bảo hộ)

RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

SDS Sodium dodecyl sulphate

SJNNV Striped jack nervous necrosis virus (vi rút hoại tử thần

kinh ở cá bơn sọc)

Tris acetate EDTA TAE

Tris Buffered Saline (đệm muối Tris) TBS

TBST TBS - Tween

Tissue culture infectious dose 50% (liều gây nhiễm 50% tế bào) TCID50

Tiger puffer nervous necrosis virus (vi rút hoại tử thần TPNNV

kinh ở cá nóc hổ)

Ultraviolet light (tia cực tím) UV

Viral encephalopathy and retinopathy (vi rút gây bệnh não VER

và võng mạc)

Virus-like particles (các phần tử giống vi rút) VLPs

Viral Nervous Necrosis (bệnh hoại tử thần kinh) VNN

DANH MỤC BẢNG

Nội dung bảng Trang TT

1 Bảng 1.1. Một số vắc xin phòng bệnh hoại tử thần kinh trên 30

cá mú

2 Bảng 3.1. Kết quả sàng lọc gen T4 trong các mẫu cá nghi 51

nhiễm NNV

Bảng 3.2. Kết quả nuôi cấy mẫu bệnh phẩm trên tế bào GS01 3 53

4 56 Bảng 3.3. Kết quả xác định TCID50 trên tế bào GS01

5 58 Bảng 3.4. Kết quả xác định LD50 trên cá mú giống

Bảng 3.5. So sánh mức độ tương đồng của trình tự đoạn 6 59

gen T4

7 Bảng 3.6. Hiệu giá kháng thể trung hòa kháng nguyên của 60

các mẫu

Bảng 3.7. Kết quả kiểm tra độ thuần khiết của giống gốc 8 62

Bảng 3.8. Kết quả xác định hiệu giá vi rút của chủng giống gốc 9 63

10 Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra độ ổn định của chủng NNV TB05 64

11 Bảng 3.10. Xác định pH tối ưu cho môi trường nuôi cấy tế 71

bào GS01

12 Bảng 3.11. Xác định mật độ tế bào ban đầu, thời điểm thu 71

hoạch vi rút

13 Bảng 3.12. Hiệu giá vi rút khi gây nhiễm với liều khác nhau 74

14 Bảng 3.13. Kết quả tinh sạch vi rút bằng hệ thống lọc 76

GLASSCO

15 Bảng 3.14. Hiệu suất thu hồi vi rút bằng lọc tiếp tuyến và 77

siêu ly tâm

16 Bảng 3.15. Kết quả đánh giá mức độ bất hoạt của NNV 79

17 Bảng 3.16. Xác định nồng độ hóa chất β-propiolactone 82

18 Bảng 3.17. Kết quả xác định vi rút sống tồn dư sau bất hoạt 84

19 Bảng 3.18. Các tiêu chuẩn kiểm nghiệm vắc-xin 92

20 Bảng 3.19. Kết quả kiểm tra tiêu chuẩn vật lý của vắc-xin 92

21 Bảng 3.20. Kết quả kiểm tra tiêu chuẩn vô trùng của vắc-xin 93

22 Bảng 3.21. Xác định mức độ an toàn của vắc-xin 95

23 Bảng 3.22. Kết quả theo dõi các tế bào có chức năng miễn dịch 98

xii

DANH MỤC HÌNH

Nội dung hình

TT 1 2 3 4 5 Trang 13 14 36 50 52

Hình 1.1. Cấu trúc không gian của vi rút hoại tử thần kinh Hình 1.2. Cấu trúc genome của vi rút hoại tử thần kinh Hình 2.1. Sơ đồ các bước thực hiện chính Hình 3.1. Mẫu cá mú ghi nhiễm vi rút NNV Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của một số mẫu nghi nhiễm 6 Hình 3.3. Hình ảnh tế bào GS01 7 Hình 3.4. Kết quả điện di kiểm tra trên gen 8 Hình 3.5. So sánh trình tự gen T4 của 10 đời vi rút Hình 3.6. Đông khô giống gốc vi rút NNV TB05 9 10 Hình 3.7. Ảnh hưởng môi trường đến mật độ tế bào 11 Hình 3.8. Tế bào trước và sau nuôi cấy vi rút hoại tử thần kinh 12 Hình 3.9. Kết quả xác định liều gây nhiễm MOI 13 Hình 3.10. Kết quả phát hiện kháng thể đặc hiệu của kháng 53 65 68 69 70 72 74 80

nguyên

14 Hình 3.11. Biến động kháng thể ở cá với kháng nguyên bất hoạt 15 Hình 3.12. Biến động kháng thể đặc hiệu của cá với kháng 82 84

nguyên sau bất hoạt (OD450)

16 Hình 3.13. Tỷ lệ sống của cá được gây miễn dịch với các liều 86

kháng nguyên

17 Hình 3.14. Tỷ lệ sống của cá được gây miễn dịch trong các mức 87

thời gian

18 Hình 3.15. So sánh mức độ bảo hộ cá với vắc-xin bất hoạt có 89

chất bổ trợ khác nhau

19 Hình 3.16. Kết quả kiểm tra tiêu chuẩn vô trùng của vắc-xin 94

20 Hình 3.17. Mô não và võng mạc cá nhuộm hematoxylin và eosin 96

21 Hình 3.18. Tỷ lệ sống của cá ở các lô thử nghiệm vắc-xin 100

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Việt Nam có điều kiện địa lý và khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm, có bờ

biển dài 3.260 km, 12 đầm phá eo vịnh, 112 cửa lạch và có hơn 600.000 ha

vùng triều [244]. Đó là các điều kiện thuận lợi cho việc phát triển nghề biển

nói chung và nghề nuôi trồng thuỷ sản nói riêng.

Ngành nuôi trồng thủy sản được xem là một trong những ngành kinh tế

mũi nhọn của Việt Nam và liên tục tăng trưởng trong những năm gần đây cả

về diện tích và sản lượng. Tổng sản lượng thủy sản năm 2022 ước đạt 9.026,3

nghìn tấn, tăng 2,7% so với năm 2021, trong đó sản lượng thủy sản nuôi trồng

ước đạt 5.163,7 nghìn tấn, tăng 6,3% so với năm 2021 [243]. Một số loài cá

có giá trị kinh tế được nuôi trồng như cá chẽm (Lates calcarifer), cá hồng

(Latjanus spp.), cá giò (Rachycentron canadum), cá mú (Epinephelus spp.)…

Sản lượng nuôi trồng cá biển đạt 58 nghìn tấn trên diện tích nuôi 6.000 ha

[243]. Tuy nhiên, nghành nuôi trồng thủy sản trên thế giới cũng như ở Việt

Nam luôn phải đối mặt với những khó khăn và thách thức, đặc biệt trong

những năm gần đây, các bệnh do vi rút trên động vật thủy sản như bệnh xuất

huyết cá trắm cỏ, bệnh vi rút mùa xuân trên cá chép, bệnh Iridovirus trên cá

mú, bệnh hoại tử tụy truyền nhiễm, hoại tử lách và thận truyền nhiễm, hoại tử

cơ quan tạo máu truyền nhiễm, tụ huyết trùng do vi rút gây thiệt hại nghiêm

trọng về kinh tế cho nuôi trồng thủy sản. Theo báo cáo của của Sneeringer và

cộng sự, 2019, hàng năm 10% sản lượng động vật thuỷ sinh thất thoát do các

bệnh truyền nhiễm, thiệt hại hơn 10 tỷ USD trên toàn cầu [198]. Ở Việt Nam,

thiệt hại gây ra bởi dịch bệnh đối với ngành thủy sản gần 1 tỷ USD mỗi

năm [17].

Bệnh hoại tử thần kinh (Viral nervous necrosis-VNN) được phát hiện ở

hầu hết các nước trên thế giới, gây ảnh hưởng đến hơn 120 loài cá biển [211],

trong đó có nhiều loài cá biển có giá trị kinh tế cao. Bệnh đã được xác định là

do vi rút hoại tử thần kinh (Nervous necrosis virus-NNV) gây ra [17, 29]. Cá

mắc bệnh hoại tử thần kinh xuất hiện các triệu chứng đặc trưng: bơi lội không

định hướng, thân sẫm màu, bỏ ăn, cá bị bệnh có thể chết sau 3-5 ngày với tỷ

lệ chết từ 80-100% [29, 154, 155]. Ở Việt Nam, bệnh hoại tử thần kinh xuất

hiện ở hầu hết các vùng nuôi cá trên cả nước. Mùa vụ phát bệnh từ tháng 5 đến tháng 10, khi nhiệt độ nước dao động từ 24 đến 300C. Tỷ lệ chết do vi rút

hoại tử thần kinh gây ra dao động từ 50-100% tùy thuộc theo loài và giai đoạn

xuất hiện bệnh [3]. Số liệu từ nghiên cứu của trường Đại học Nha Trang, Viện

Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II

cho thấy, tỷ lệ cá mú nhiễm vi rút hoại tử thần kinh lên tới 82% mẫu cá bệnh

thu thập [1, 4].

Dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản ngày càng có xu hướng gia tăng

qua các năm, phạm vi lây nhiễm rộng, tỷ lệ mắc cao, chủng loại đa dạng, thời

gian khởi phát kéo dài, vì thế, việc kiểm soát dịch bệnh trong nuôi trồng thủy

sản là vấn đề cấp thiết [50, 199]. Kiểm soát dịch bệnh bằng chế phẩm vi sinh,

chất kích thích miễn dịch, vắc-xin ngày càng được ứng dụng nhiều trong các

mô hình canh tác sinh thái. Trong đó, sử dụng vắc-xin là một biện pháp phòng

bệnh hiệu quả và an toàn để ngăn ngừa dịch bệnh gây nên bởi vi rút, vi khuẩn

[139, 199].

Vắc-xin phòng bệnh cho động vật thuỷ sản gồm nhiều loại khác nhau:

vắc-xin bất hoạt, vắc-xin nhược độc, vắc-xin tái tổ hợp, vắc-xin tiểu phần,

vắc-xin DNA [209]. Hiện tại, hầu hết các loại vắc-xin thủy sản thương mại

vẫn là loại vắc-xin bất hoạt bởi tính an toàn. Vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh

nghiêm trọng ở giai đoạn ấu trùng, cá bột, cá hương, cá giống với tỷ lệ chết

lên tới 100%, vì vậy, vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh thường được dùng

cho cá bằng đường ngâm [130].

Xuất phát từ cơ sở lý luận và nhu cầu thực tiễn trên, luận án: “Nghiên

cứu sản xuất vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú

(Epinephelus spp.) được tiến hành nhằm tạo được vắc-xin bất hoạt phòng

bệnh hoạt tử thần kinh cho cá mú.

2. Mục tiêu nghiên cứu

2.1. Mục tiêu chung

Nghiên cứu được vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá

mú từ chủng vi rút phân lập tại miền Bắc, Việt Nam.

2.2. Mục tiêu cụ thể

Phân lập và lựa chọn được chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh làm

giống gốc phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú.

Sản xuất được vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú.

Xây dựng quy trình kiểm tra chất lượng vắc-xin.

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

3.1. Ý nghĩa khoa học

Luận án đã sản xuất được vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần

kinh cho cá mú với các bước: phân lập, tuyển chọn chủng giống làm nguyên

liệu sản xuất vắc-xin, đánh giá chủng giống gốc, nhân nuôi vi rút trên tế bào,

bất hoạt vi rút, xác định các điều kiện tạo vắc-xin bán thành phẩm và đánh giá

chất lượng của vắc-xin bán thành phẩm. Kết quả nghiên cứu là dữ liệu khoa

học, cung cấp thêm tư liệu tham khảo cho các nghiên cứu sản xuất vắc-xin bất

hoạt phòng bệnh cho các đối tượng cá biển có giá trị kinh tế cao.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

Luận án đã nghiên cứu thành công vắc-xin bất hoạt keo phèn đạt chỉ

tiêu an toàn và hiệu quả trong phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú.

4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1. Đối tượng nghiên cứu:

Các chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh phân lập từ một số loài cá

mú nuôi ở một số tỉnh khu vực miền Bắc.

4.2. Phạm vi nghiên cứu:

Các chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh phân lập từ cá biển nuôi

tại các vùng biển quanh đảo Cát Bà, vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng), vùng

biển Vân Đồn, Quảng Yên (Quảng Ninh), vùng biển Đồng Châu (Thái Bình),

vùng biển Hải Thịnh, Nghĩa Hưng (Nam Định).

5. Đóng góp mới của luận án

Luận án đã nghiên cứu một cách toàn diện về các đặc điểm của chủng

giống gốc phục vụ sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú,

bao gồm tính thuần khiết, tính sinh miễn dịch bảo hộ, tính ổn định về mặt di

truyền và năng suất sau khi nhân nuôi trên tế bào GS01.

Luận án đã sản xuất được vắc-xin bất hoạt keo phèn bằng chủng vi rút

TB05 phân lập tại tỉnh Thái Bình, vắc-xin bất hoạt keo phèn được sử dụng

cho cá bằng phương pháp ngâm, tỷ lệ an toàn 100%, tỷ lệ bảo hộ đạt 75,8%

sau 3 tháng.

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Một số đặc điểm sinh học của cá mú

1.1.1. Hệ thống phân loại cá mú

Cá mú thuộc họ Serranidae, họ phụ cá mú (Epinephelinae), giống

Epinephelus, tên tiếng Anh: groupers. Có tất cả 87 loài được liệt kê trong chi

Epinephelus (E.), riêng khu vực Ấn Độ, Thái Bình Dương đã phát hiện được

63 loài thuộc giống Epinephelus [73]. Theo Viện Hải dương học Nha Trang,

vùng biển nước ta có khoảng 30 loài cá mú [10].

Giới (regnum) Animalia

Ngành (phylum) Chordata

Lớp (class) Actinoptergii

Bộ (ordo) Perciformes

Họ (familia) Serranidae

Phân họ (subfamilia) Epinephelinae

Chi (genus) Epinephelus

1.1.2. Đặc điểm phân bố

Cá mú là loài cá sống dưới đáy tại những rạn san hô, đá cứng, vùng

nước ấm, phân bố chủ yếu ở những vùng biển nhiệt đới, á nhiệt đới và ít thấy

ở vùng biển ôn đới. Nhiệt độ thích hợp cho các loài cá mú phát triển là từ 22- 320C, thích hợp nhất là 25-300C. Cá chịu được độ mặn từ 11- 41‰ [89, 182].

Môi trường sống của cá mú thay đổi tuỳ theo loài, phần lớn các loài

sống ở độ sâu dưới 100 m, E. flavolimbatus được tìm thấy ở đáy cát hoặc bùn

[108], trong khi đó, các loài E. nigritus, E. niveatus được tìm thấy ở độ sâu

lên tới 200 m hoặc 400-500 m. Con non của nhiều loài cá mú phân bố ở vùng

nước nông ven biển [184, 208], cá mú khổng lồ (E. itajara) đã được quan sát

thấy ở rừng ngập mặn [38]. Nhiều loài cá bắt gặp chủ yếu trong vùng rạn như

cá mú kẻ mờ (Cephalopholis boenak), cá mú sao (E. trimaculatus), cá mú

lưng dày (E. fasciatomaculosus), một số loài phân bố rộng trong nhiều sinh

cảnh khác nhau, cá mú mè (E. coioides) và cá mú nâu (E. bruneus) ở giai

đoạn cá con thường bắt gặp thấy ở vùng cửa sông, ven bờ và trong các vũng

vịnh [74, 89], cá mú điểm gai (E. malabaricus) được bắt gặt trong đầm phá,

rạn san hô, rừng ngập mặn, trên vùng nền đáy cát hoặc bùn; giai đoạn con non

bắt gặp ở vùng cửa sông và ven bờ [89].

1.1.3. Đặc điểm sinh trưởng

Sự tăng trưởng cá mú khác nhau giữa các loài. Thời gian nuôi để đạt

kích thước thương mại của cá mú nghệ (E. lanceolatus) là 6 tháng, cá mú

điểm gai là 12 tháng và cá mú mè từ 12 đến 15 tháng [200]. Cá mú khổng lồ

(E. itajara) là loài cá mú có kích thước lớn nhất, chúng sinh sống ở các đầm

phá và rạn san hô sâu trên khắp khu vực Ấn Độ Dương-Thái Bình Dương,

kích thước trưởng thành của loài này với tổng chiều dài 2,3 m và khối lượng

cơ thể 400 kg [89].

Nhìn chung, cá mú bột sau 1 ngày tuổi có chiều dài trung bình 2,18

mm, miệng đóng, chưa có sắc tố, khối noãn hoàng vẫn còn. Sau 3 ngày tuổi,

miệng mở, cá bắt đầu ăn thức ăn ngoài, lúc này ống tiêu hoá chưa hoàn chỉnh.

Khi cá đạt 12 ngày tuổi, dài 3,57 mm, miệng, mắt, ống tiêu hoá hoàn chỉnh,

bắt đầu phát triển sắc tố thân. Sau 18 ngày tuổi, chiều dài cá từ 5-8 mm, gai

lưng thứ 2 dài, giai đoạn này cá rất nhạy cảm với các yếu tố bên ngoài, vì vậy,

tỷ lệ hao hụt rất lớn. Cá 32 ngày tuổi, chiều dài 8-10 mm, vây phát triển hoàn

thiện và có sắc tố đen trên tất cả các tia vây, gai lưng thứ 2 và cơ thể ngắn lại.

Cá 39 ngày tuổi dài 10-12 mm, các vây hoàn chỉnh, tỷ lệ gai lưng thứ 2 giảm

đáng kể. Cá 54 ngày tuổi dài 16,5 mm, gai lưng ngắn, hình dáng và sắc tố

giống cá trưởng thành.

1.1.4. Đặc điểm sinh sản

Hầu hết tất cả các loài cá mú đều là loài lưỡng tính nguyên sinh [158].

Tuyến sinh dục ban đầu chưa được biệt hóa sau đó chúng được biệt hóa thành

buồng trứng ở tất cả các cá thể [156]. Sau khi trưởng thành thành con cái,

chúng trải qua quá trình thay đổi giới tính thành con đực, biến đổi buồng

trứng thành tinh hoàn [157]. Sự thay đổi giới tính tự nhiên ở các loài cá mú

xảy ra từ 3 đến 11 tháng tuổi, tùy theo loài [44, 203]. Ví dụ cá mú răng dài

thay đổi giới tính từ cái sang đực ít nhất 10 tháng tuổi trở lên [122].

Dựa trên các quan sát mô học của tuyến sinh dục ở cá mú tổ ong, sự

thay đổi giới tính tự nhiên được biết là xảy ra trong mùa không sinh sản ở

những cá thể có kích thước cơ thể lớn, khi tổng chiều dài >20 cm. Mặt khác,

các thay đổi môi trường cũng dẫn tới sự thay đổi giới tính ở hầu hết các loài

cá lưỡng tính [46, 132]. Các yếu tố môi trường như nhiệt độ nước và thời gian

chênh lệch chiếu sáng ban ngày và ban đêm kiểm soát sự khởi đầu và tiến

trình trưởng thành của tuyến sinh dục ở cá [138]. Dựa trên các đặc điểm nêu

trên, một số nhà khoa học đã thực hiện kích thích cá mú cái trưởng thành

trong mùa không sinh sản bằng cách điều chỉnh môi trường nuôi và điều trị

bằng hormone, Kanemaru và cộng sự, 2012 đã kích thích sinh sản ở cá mú tổ

ong cái (E. merra) trong điều kiện có kiểm soát nhiệt độ nước trong thời gian

dài, cùng với sử dụng GnRH [113]. Tương tự như vậy, ở cá mú đốm đỏ (E.

akkara) sự trưởng thành và rụng trứng chỉ có thể được tạo ra bằng cách điều

chỉnh môi trường nuôi trong mùa không sinh sản [127].

Cá mú có xu hướng đẻ trứng vào đầu mùa xuân và mùa hè. Mặc dù một

số loài như cá mú (E. cruentatus) sinh sản quanh năm, còn lại hầu hết các loài

cá mú sinh sản trong khoảng thời gian từ tháng 1 đến tháng 5 [192]. Hoạt

động sinh sản ở cá mú thường tương quan với chu kỳ của mặt trăng [183,

193], cá mú Nassau đã được báo cáo là sinh sản mạnh nhất vào thời điểm

trăng non ở Bahamas [197] và vào khoảng trăng tròn ở Belize [105]. Ngoài ra,

cá mú giống như nhiều loài cá sinh sản ở rạn san hô, đẻ trứng chủ yếu vào lúc

hoàng hôn [51], Colin, 1992 đã quan sát thấy quá trình sinh sản của cá mú

Nassau diễn ra khoảng 20 phút trước khi mặt trời lặn, với đỉnh điểm là 10

phút trước đến 10 phút sau khi mặt trời lặn [51].

1.2. Tình hình bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới và Việt Nam

1.2.1. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới

Bệnh hoại tử thần kinh (Viral nervous necrosis-VNN) do vi rút hoại tử

thần kinh (Nervous necrosis virus-NNV) gây ra, vi rút này còn được biết đến

như là tác nhân gây bệnh não và võng mạc (Viral encephalopathy and

retinopathy-VER) hoặc viêm cơ não ở hơn 120 loài cá biển, nước lợ và nước

ngọt [29, 52, 168, 229]. Vi rút hoại tử thần kinh phá hủy hệ thần kinh trung

ương của cá bị nhiễm bệnh, gây tỷ lệ tử vong cao, đặc biệt là ở giai đoạn ấu

trùng và cá bột, tỷ lệ tử vong lên đến 80-100% [29, 154, 155].

Bệnh hoại tử thần kinh đã được báo cáo chính thức trên toàn thế giới,

ngoại trừ Nam Mỹ [62]. Báo cáo của Tổ chức Thú y thế giới (Office

International des Epizooties-OIE) 2019 cho biết, VNN xuất hiện ở các quốc

gia khu vực châu Á như Ấn Độ, Indonesia, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn

Quốc, Malaysia, Philippines, Thái Lan, Việt Nam; Châu Đại Dương như Úc,

Tahiti; vùng Địa Trung Hải như Pháp, Hy Lạp, Ý, Malta, Bồ Đào Nha, Tây

Ban Nha, Tunisia hoặc các quốc gia khác như, Vương quốc Anh, Na Uy,

Quần đảo Caribe và Bắc Mỹ [168]. Mặc dù cho đến nay, vi rút hoại tử thần

kinh chưa được phân lập từ Nam Mỹ nhưng nó đã được phát hiện từ cá nhập

khẩu khỏe mạnh của Amazon [144].

Bệnh hoại tử thần kinh đã được báo cáo ở hầu hết các quốc gia Địa

Trung Hải liên quan đến sản xuất cá chẽm (Lates calcarifer) và cá tráp vây

vàng (Sparus latus) châu Âu như: Tây Ban Nha, Pháp, Ý và Hy Lạp, cũng như

ở các nước Bắc Phi [29]. Lần đầu tiên dịch bệnh bệnh hoại tử thần kinh được

phát hiện ở nhiều trang trại nuôi cá chẽm ở Địa Trung Hải vào mùa hè năm

1995, với tỷ lệ tử vong ngày càng tăng trong giai đoạn 1995–1998. Kể từ đó,

bệnh hoại tử thần kinh được coi là mối đe dọa thực sự đối với nuôi trồng thủy

sản ở Địa Trung Hải [182], hiện tại nó được coi là yếu tố hạn chế chính trong

sản xuất cá chẽm ở các nước Địa Trung Hải và là thách thức mới trong nghề

nuôi cá tráp biển [70, 155, 169, 242]. Gần đây, các đợt bùng phát bệnh hoại tử

thần kinh nghiêm trọng ở ấu trùng và cá giống đã được ghi nhận ở nhiều nơi,

tỷ lệ tử vong hàng loạt liên quan đến bệnh hoại tử thần kinh đã được mô tả ở

cá mú sẫm màu (E. marginatus) và cá chình (Muraena helena) [37, 114, 212,

214, 215, 220, 225].

Ở châu Á, tỷ lệ tử vong hàng loạt được ghi nhận ở giai đoạn ương

giống cá mú ở Singapore, cá mú chấm đỏ (E. akaara) và cá háo sọc

(Pseudocaranx dentex) ở Nhật Bản, cá đối đầu dẹt (Mugil cephalus) ở Trung

Quốc, cũng như cá hồng mỹ (Sciaenops ocellatus) ở Israel [90, 131, 150, 151,

213]. Ở Bắc Mỹ, bệnh VNN được phát hiện trên cá chẽm trắng (Atractoscion

nobilisthe) và cá tuyết Đại Tây Dương [55, 106]. Ngoài ra, bệnh hoại tử thần

kinh không chỉ lây nhiễm trên cá biển mà còn ở nhiều loại động vật thủy sinh

nước ngọt. Kể từ năm 2002, hơn 60 loài nước ngọt đã được xác minh là vật

chủ của Betanodavirus. Bệnh hoại tử thần kinh gây ra tỷ lệ tử vong cao ở các

quần thể bị nhiễm bệnh, bao gồm cá da trơn Úc (Tandanus tandanus) [154],

cá tầm (Acipenser gueldenstaedtii) [21], cá rô phi (Oreochromis niloticus)

[30], cá vàng (Carassius auratus) và cá ngựa vằn (Danio rerio) 2013 [31], cá

muỗi (Gambusia affinis) [175].

1.2.2. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú tại Việt Nam

Nghề nuôi cá mú ở Việt Nam bắt đầu từ năm 1990. Cho đến năm 2003

một số khu vực nuôi cá mú tập trung đã phát triển ở vùng biển Quảng Ninh,

Hải Phòng, Nghệ An, Nha Trang, Ninh Thuận, Bình Thuận, Vũng Tàu và

Kiên Giang [5, 10]. Trong những năm qua cả nước ta có 500 ha vùng biển ven

bờ được xây dựng thành các ao đìa nuôi cá mú. Sản lượng cá mú hàng năm

đạt trên 3000 tấn sản phẩm. Cá mú chấm đỏ, cá mú chấm nâu đang là các đối

tượng nuôi được lựa chọn đối với nhiều người dân vùng ven biển.

Ở Việt Nam đã phát hiện một số loài cá mú nhiễm bệnh hoại tử thần

kinh, bao gồm các loài: E. coioides, E. fuscogutatus, E. tauvina, E.

lanceolatus, E. malabaricus ở Khánh Hòa, E. coioides ở Cát Bà (Hải Phòng)

và Cửa Hội (Nghệ An). Bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam được

phát hiện lần đầu tiên vào năm 2002 ở các lồng nuôi tại Vân Đồn, Quảng

Ninh. Theo Phan Thị Vân và công sự, 2004, bệnh xuất hiện từ tháng 5 đến tháng 10 hàng năm khi nhiệt độ từ 25 đến 300C, ở nhiệt độ 280C độc lực của vi rút mạnh hơn nhiều so với ở nhiệt độ 160C [11].

Cá mú ương từ 40 đến 45 ngày tại Cửa Hội, Nghệ An bị bệnh hoại tử

thần kinh có dấu hiệu bỏ ăn, bơi xoay tròn, tỷ lệ chết lên tới 70 - 80% trong

vòng 7 ngày. Bằng phương pháp chẩn đoán mô bệnh học đã tìm thấy các

không bào có kích cỡ 5-7 µm, màu trắng đục trong não cá. Cá nuôi từ 45 ngày

đến 4 tháng tuổi nhiễm bệnh được nhận biết qua các dấu hiệu như: bơi không

định hướng, bơi quay tròn, cá kém ăn hay bỏ ăn, bóng hơi phồng, thân đen xám,

đuôi và vây chuyển màu đen, mắt đục, cá bệnh hoạt động yếu, đầu treo trên mặt nước

hoặc dưới đáy bể, lồng. Cá chết sau 3-5 ngày với tỷ lệ chết từ 80-100% [11].

Theo Trần Vĩ Hích và cộng sự, 2008, tại Khánh Hòa, có gần 30% hộ

nuôi cá biển chịu tác hại của VNN. Giai đoạn cá nhỏ (5-20 cm) thường chịu

tác hại nặng hơn giai đoạn cá lớn, tỷ lệ chết từ 50 đến 100%. Vào tháng 7 năm

2008, VNN xuất hiện trên cá mú cỡ 5-6 cm nuôi tại các bè của trại thực

nghiệm trường Đại học Nha Trang, bệnh lây lan rất nhanh và gây chết 100%

cá trong vòng một tuần. Khi cá nuôi lồng bị bệnh người ta còn quan sát được

một số loài cá khác sống xung quanh lồng cũng có dấu hiệu bệnh tương tự

[4]. Quan sát mô bệnh học trên cá mú chấm nâu, cá mú cọp, cá mú mỡ, cá mú

nghệ, cá chẽm, cá bớp (cá giò) chết với dấu hiệu của bệnh hoại tử thần kinh

nuôi tại Khánh Hoà cho thấy, vi rút đã phá huỷ các tế bào thần kinh và võng

mạc mắt, tạo ra các không bào có hình tròn và hình elip với kích thước từ 4-

30 µm [4].

Kết quả điều tra của khoa Nuôi trồng thủy sản, Đại học Nha Trang cho

thấy, cá mú nuôi tại vùng biển Khánh Hòa thường xuất hiện dấu hiệu tương tự

bệnh hoại tử thần kinh như bơi không định hướng, bơi thành vòng tròn trên

mặt nước, cá bỏ ăn, thân màu sậm [11].

Theo Nguyễn Ngọc Du và cộng sự, 2005, bệnh hoại tử thần kinh thường xảy ra

trên cá mú giống nuôi tại Vũng Tàu. Khi tiến hành xét nghiệm 64 mẫu cá thì có 53

mẫu cá nhiễm bệnh với tỷ lệ nhiễm là 82,8% bệnh đã gây chết toàn bộ cá nuôi [1].

Đầu năm 2013, dịch bệnh trên cá mú lại xuất hiện tại vùng nuôi của xã

Xuân Thịnh và Xuân Hòa thuộc thị xã Sông Cầu (tỉnh Phú Yên). Số lồng bị

bệnh là 370 trên tổng số 527 lồng nuôi trong khu vực. Tỷ lệ cá mắc bệnh từ

50-70%, kích cỡ cá bị bệnh từ 0,4-0,7 kg/con. Cá mú bị chết vào thời điểm

đầu tháng 5 đến tháng 8 [4].

1.3. Tổng quan về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh

Tác nhân gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá được xác định là

Betanodavirus [29, 52, 168].

Betanodavirus có hệ thống phân loại:

Ngành: Vi rút

Họ: Nodaviridae

Giống: Alphanodavirus (nhiễm trên côn trùng)

Betanodavirus (nhiễm trên cá) [168]

Vi rút không có vỏ bọc, hình cầu, đường kính từ 25-30 nm, có đối xứng

hình tứ diện, vỏ protein được bao gồm 180 protein với khối lượng 42 kDa

Hình 1.1 [188].

Hệ gen của Betanodavirus có cấu trúc ARN mạch đơn, sợi dương,

tuyến tính hai đầu [62] gồm có hai tiểu phần: Tiểu phần lớn của hệ gen chứa

ARN1 (3.1 kb) mã hóa cho một protein 1a có kích thước 110 kDa với chức

năng như là ARN polymerase (hay còn gọi protein A). Một khung đọc mở

(ORF) là ORF1b (khung đọc mở có trình tự là một phần ở đầu 3' của ORF1a),

(Nguồn: L. Tang and J.E. Johnson (1998))

ORF1b này mã hóa cho protein B1 (11 kDa) và B2 (8,5 kDa).

Hình 1.1. Cấu trúc không gian của vi rút hoại tử thần kinh

A: Mô phỏng cấu tạo hạt vi rút; B: Cấu trúc 20 mặt đối xứng với T=3 của vi

rút; C: Ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử của vi rút (50nm)

Tiểu phần nhỏ của hệ gen chứa gen ARN2 (1.4 kb) mã hóa cho phân tử

protein 2a có kích thước 42 kDa. Trên ARN2 chứa một khung đọc mở (ORF)

cho một protein vỏ đồng thời chứa hai vùng bảo thủ cao là T2 (870 bp) và T4

(420 bp) [164]. Gen ARN3 mã hóa protein B2 và có hoạt động ức chế ARN mạnh

mẽ, như trong các Alphanodavirus [115, 116, 168, 201, 241].

(Nguồn: L.A. Ball and K.L. Johnson (1998))

Hình 1.2. Cấu trúc hệ gen của vi rút hoại tử thần kinh

Đặc tính kháng nguyên của Betanodavirus

Các nghiên cứu huyết thanh học đã chứng minh rằng bốn kiểu gen của

vi rút hoại tử thần kinh có thể được mã hoá thành ba kiểu kháng nguyên riêng

biệt [151, 172]. Theo Mori kiểu kháng nguyên A sẽ tương ứng với kiểu gen

SJNNV, nhóm B với TPNNV và nhóm C với RGNNV và BFNNV [151], còn

Panzarin cho rằng kiểu kháng nguyên B sẽ bao gồm các chủng mang kiểu gen

BFNNV và TPNNV thuộc kiểu kháng nguyên C [172].

Đặc tính sinh học của Betanodavirus

Giống Betanodavirus được phân thành 4 kiểu gen chính, bao gồm: vi

rút hoại tử thần kinh ở cá bơn sọc (SJNNV), vi rút hoại tử thần kinh ở cá nóc

hổ (TPNNV), vi rút hoại tử thần kinh ở cá mú đốm đỏ (RGNNV) và vi rút

hoại tử thần kinh ở cá bơn (BFNNV) [52, 168, 188, 212], một nhóm kiểu gen

thứ năm có nguồn gốc từ cá bơn, được gọi là vi rút hoại tử thần kinh cá bơn

(TNV), được đề xuất bởi Kim và cộng sự, 2019 và vi rút hoại tử thần kinh trên

động vật có vỏ (KSNNV) ở Hàn Quốc [117]. Những phát hiện này cho thấy khả

năng có nhiều chủng mới khác dựa trên các loài cá khác vẫn chưa được biết đến.

Mỗi kiểu gen có sự phân bố theo vùng miền địa lý và đặc tính gây bệnh

khác nhau [32, 48, 124, 162, 210]. Kiểu gen RGNNV và BFNNV có phạm vi

ký chủ rộng, ảnh hưởng đến các loài cá nhiệt đới và ôn đới, RGNNV phân bố

rộng rãi không chỉ gây bệnh trên cá nuôi mà còn ở các loài cá hoang dã tại lưu

vực Địa Trung Hải, dọc theo bờ biển Châu Á và Châu Úc [48, 162, 210] hoặc

cá chẽm trắng nuôi (Atractoscion nobilis) ở California [55]. Ngược lại, kiểu

gen vi rút nhóm SJNNV và vi rút nhóm TPNNV có phạm vi ký chủ hẹp, kiểu

gen vi rút nhóm TPNNV chỉ được mô tả ở một loài tại Nhật Bản [164], kiểu

gen vi rút nhóm SJNNV trong một thời gian dài chỉ được phát hiện trên cá

nuôi ở vùng biển Nhật Bản, cá tráp biển ở Senegal và cá vằn nuôi trên bán

đảo Iberia [56].

Điều kiện nhiệt độ có thể giúp cá chống lại sự lây nhiễm của vi rút

nhưng cũng có khả năng giúp vi rút lây nhiễm vào cá [43]. Điều này đặc biệt

rõ ràng ở Betanodavirus, các kiểu gen của vi rút gây bệnh ở các nhiệt độ khác nhau (ở nhiệt độ 15-200C gây bệnh đối với vi rút nhóm BFNNV, ở nhiệt độ 200C gây bệnh đối với vi rút nhóm TPNNV, còn với vi rút nhóm SJNNV thì nhiệt độ gây bệnh từ 20-250C và nhiệt độ 25-300C gây bệnh đối với vi rút

nhóm RGNNV) [168]. Trong khi vi rút nhóm BFNNV đã được báo cáo gây bệnh ở nhiệt độ thấp từ 4 đến 150C [166], thì các đợt bùng phát vi rút hoại tử

thần kinh liên quan đến kiểu gen vi rút nhóm RGNNV được báo cáo ở các vùng có nhiệt độ nước từ 23 đến 300C (ở cá vược) và từ 28 đến 300C (ở các

loài cá mú khác nhau) [62, 210]. Các báo cáo thực nghiệm cũng đã chứng

minh ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút hoại tử thần

kinh [81, 210, 220].

Đặc điểm dịch tễ của Betanodavirus

Vi rút hoại tử thần kinh có thể lây truyền theo chiều ngang và chiều dọc

[88]. Trong môi trường nước biển, Betanodavirus có thể tồn tại ở nhiệt độ

thấp trong thời gian dài; sự lây truyền của vi rút này từ khu vực bị nhiễm bệnh

sang khu vực khác có thể do dòng thủy triều hoặc các phương tiện vận

tải di chuyển từ khu vực có mầm bệnh mang sang [167].

Phương thức truyền bệnh theo chiều ngang: vi rút từ những cá bị bệnh

lây lan sang những cá khoẻ mạnh qua tiếp xúc trực tiếp hoặc vi rút được lan

truyền gián tiếp thông qua thức ăn, dòng chảy bị ô nhiễm. Vi rút cũng có thể

theo dịch tiết của cá bị bệnh ô nhiễm vào môi trường nước và chúng xâm

nhập vào cá khỏe mạnh qua mang, da, miệng cá hoặc lây lan qua các dụng cụ

chuyên dùng trong nuôi cá như lưới, vợt, dây sục khí... Theo nghiên cứu của

Chi và cộng sự, 2003, những con cá tạp nhỏ được thu từ các trại nuôi cá bị

nhiễm vi rút hoại tử thần kinh khi dùng làm thức ăn thì cá nuôi có thể bị lây

nhiễm bệnh. Betanodavirus cũng được phát hiện ở động vật không xương

sống ở biển như các loài nhuyễn thể hai mảnh hoặc loài chân đốt [107, 171,

224]. Việc phát hiện Betanodavirus ở các sinh vật sống dưới nước khác như

các loài thân mềm và vai trò của chúng như là vật trung gian truyền bệnh

cũng đã được mô tả [219]. Ngoài ra, cá nuôi trong cùng một bể ăn thịt lẫn

nhau cũng được xem như một con đường lây nhiễm vi rút hoại tử thần kinh.

Có vài nhân tố ảnh hưởng đến phương thức lan truyền theo chiều ngang như

mật độ cá nuôi, nhiệt độ nước và độc lực của các chủng vi rút ở các điều kiện

nuôi dưỡng.

Phương thức truyền bệnh theo chiều dọc: Vi rút gây bệnh được truyền

từ bố mẹ sang con qua trứng và tinh trùng, điều này đã được báo cáo ở cá mú

7 vạch, cá măng sọc, cá bơn, cá chim khi sử dụng bằng phương pháp ELISA

để phát hiện sự có mặt của vi rút trong trứng và tinh trùng của cá bố mẹ [39].

Sự lây nhiễm vi rút vào buồng trứng cũng được công bố ở loài Dicentrarchus

labrax [22, 39]. Vi rút hoại tử thần kinh lây lan từ cá bố mẹ sang ấu trùng qua

con đường lây truyền dọc ở nhiều loài cá khác nhau, bao gồm cá vược sọc, cá

vược châu Âu và cá vược châu Á [26, 58].

Cơ chế gây bệnh của Betanodavirus

Vi rút xâm nhập vào tế bào vật chủ và tạo ra sự lây nhiễm chính thức

bằng cách xâm nhập vào các tế bào nhạy cảm của hệ thống thần kinh trung

ương bao gồm não, tủy sống và võng mạc [76]. Một số tác giả cho rằng, quá

trình xâm nhập của NNV vào vật chủ xảy ra bởi liên kết của vi rút với axit

sialic trên bề mặt tế bào vật chủ [100]. Gần đây, có những phát hiện khác cho

thấy sự tham gia của protein sốc nhiệt (Hsc70) trong quá trình xâm nhập của

vi rút với tế bào vật chủ, đóng vai trò là thụ thể hoặc đồng thụ thể để phản

ứng với vỏ vi rút và đóng vai trò chính trong giai đoạn đầu của quá trình lây

nhiễm [52, 137]. Một giả thuyết khác là vi rút xâm nhập trực tiếp vào tế bào

thần kinh thông qua vận chuyển trục đến thân não qua các dây thần kinh sọ

[82]. Mặc dù vi rút có tính hướng thần kinh, nhưng cũng có thể phát hiện thấy

chúng trong các mô khác, bao gồm: gan, thận, đường tiêu hóa, tim, lá lách,

ruột trước và ruột sau, dịch sinh dục, vây và mang bằng cách sử dụng phương

pháp lai tại chỗ/hóa mô miễn dịch hoặc kỹ thuật sinh học phân tử [124].

Phương pháp kiểm soát bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú thường là loại

trừ sự có mặt của vi rút ở các trại sản xuất giống hoặc ở khu vực nuôi bằng

cách khử trùng nước đồng thời loại trừ vi rút ở cá bố mẹ trong trại giống và

vùng nuôi. Một trong những hóa chất ức chế vi rút được dùng nhiều nhất là

iodphors có hiệu quả ngay cả ở nồng độ thấp từ 25-100 ppm [75]. Các nghiên

cứu thực nghiệm đã chỉ ra rằng Betanodavirus (vi rút nhóm SJNNV) có thể bị

bất hoạt với hóa chất nhóm hypochlorite (natri hypochlorite, canxi

hypochlorite, benzalkonium chloride) ở nồng độ 50 mg/L trong 10 phút ở 200C; nồng độ etanol 60%; pH là 12 trong 10 phút ở 200C; hoặc đun nóng ở 600C trong 30 phút. Liều tia cực tím hiệu quả để vô hiệu hóa BFNNV trong một nghiên cứu trên thực nghiệm là 1,0 x 105 µWsec/cm2 ở cường độ tia cực tím là 440 µW/cm2; liều tia cực tím là 1,5–2,5 x 105 µWsec/cm2 có thể vô

hiệu hóa SJNNV; ozone ở nồng độ 0,1 µg/mL đã vô hiệu hóa vi rút (SJNNV)

sau 2,5 phút [23].

Theo Munday, 2002, nước đi vào bể ương nên được xử lý với ozone và

không tái sử dụng, tuy nhiên, nếu điều kiện không cho phép thì chỉ nên tái sử

dụng tối đa 1/2 lượng nước của bể. Nhiều tác giả cũng khuyến cáo nên xử lý

nước với tia cực tím trước khi đưa vào bể nuôi [154].

Cá bố mẹ được sàng lọc để kiểm tra sự hiện diện của vi rút bằng cách

sử dụng kháng thể đặc hiệu và RT-PCR [39, 226]. Ngoài ra, các tác giả cũng

khuyến cáo rằng trứng cá nên được rửa bằng nước biển với ozon ở hàm lượng

0,2 µg/mL đối với cá măng sọc, 4 µg/mL đối với cá chim, hoặc ngâm trứng cá

măng sọc với PVP iodine 50 µg/mL trong 10 phút để hạn chế sự lây nhiễm

của vi rút [23]. Phương pháp kiểm soát khác là nuôi tách ấu trùng và cá măng sọc giống với nguồn nước được diệt khuẩn bằng tia cực tím ở 1,0 x 105 µW/s.cm2 hoặc ozon ở 0,1 µg/mL từ 2 đến 5 phút và xử lý các dụng cụ với

chlorine nồng độ 50 µg/mL trong 10 phút. Việc thực hiện chế độ vệ sinh

nghiêm ngặt ở các trại giống như không tái sử dụng nước, dùng hóa chất sát

trùng nước biển và khử trùng các bể trong suốt chu kỳ ấp nở trứng đã đem lại

thành công ở trang trại sản xuất giống cá chẽm.

1.4. Một số hiểu biết cơ bản về hệ miễn dịch của cá xương và vắc-xin

phòng bệnh cho cá

1.4.1 Đáp ứng miễn dịch của cá xương

Đặc điểm hệ miễn dịch của cá xương

Hệ thống miễn dịch của cá xương gồm miễn dịch không đặc hiệu và

miễn dịch đặc hiệu, hai hệ thống này hoạt động cùng nhau để kích hoạt quá

trình phòng vệ và loại bỏ kháng nguyên [190].

Hệ thống miễn dịch không đặc hiệu (hay còn gọi là miễn dịch tự nhiên,

miễn dịch bẩm sinh) là khả năng cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh bằng

các phản ứng không đặc hiệu, mang tính bẩm sinh, di truyền giữa các cá thể

cùng loài. Đây là tuyến phòng thủ đầu tiên bảo vệ cơ thể trong lúc các phản

ứng miễn dịch đặc hiệu chưa đáp ứng kịp trước sự xâm nhập của tác nhân gây

bệnh. Các yếu tố của miễn dịch không đặc hiệu bao gồm hàng rào vật lý, hệ

thống bổ thể, các enzym, interleukin, interferon và các tế bào bảo vệ, chẳng

hạn như bạch cầu hạt, bạch cầu đơn nhân, đại thực bào và các tế bào tiêu diệt

tự nhiên [142].

Hệ thống miễn dịch đặc hiệu (hay còn gọi là miễn dịch mắc phải, miễn

dịch thích nghi) là đáp ứng miễn dịch được tạo ra do kháng thể đặc hiệu với

kháng nguyên được tạo ra sau khi cơ thể tiếp xúc với kháng nguyên. Kháng

nguyên tiếp xúc với cơ thể có thể bằng cách ngẫu nhiên trong môi trường và

hoặc chủ động bằng cách tiêm vắc-xin phòng bệnh. Ở cá, các tế bào tham gia

vào hệ thống miễn dịch đặc hiệu bao gồm: tế bào lympho T, tế bào lympho B

[35, 65, 94].

Cá xương thiếu cả tủy xương và các hạch bạch huyết, do đó, hoạt động

phòng vệ của cá phải dựa vào các cơ quan bạch huyết, bao gồm tuyến thượng

thận, tuyến ức, lá lách và các mô lympho liên kết với niêm mạc để bảo vệ

chống lại vi rút, ký sinh trùng, vi khuẩn gây bệnh và nấm [125, 202]. Các cơ

quan và tế bào có thẩm quyền miễn dịch của cá đã được nghiên cứu ở một số

loài như cá da trơn, cá chép, cá hồi vân, cá tráp biển và cá giò, theo đó, sự

hình thành các cơ quan lympho phụ thuộc vào tuổi cá, và theo thứ tự nhất

định, ở cá hồi và cá chép, sự hình thành cơ quan lympho diễn ra theo thứ tự

sau: tuyến ức, thận và lá lách [120, 202], ở cá tráp và cá giò, thận là cơ quan

lympho đầu tiên hình thành, tiếp đến là lá lách và cuối cùng là tuyến ức [120].

Cá xương có cả hai cơ quan lympho chính bao gồm tuyến ức và tuyến thượng

thận chịu trách nhiệm sản xuất và biệt hoá các tế bào miễn dịch, bên cạnh đó,

thận, gan và các trung tâm đại thực bào cũng đóng vai trò quan trọng trong

việc bảo vệ cá xương chống lại các tác nhân gây bệnh [202].

Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch ở cá

Hệ thống miễn dịch và phản ứng miễn dịch của cá có thể bị ảnh hưởng

rất nhiều bởi các yếu tố như: tuổi cá, giới tính, yếu tố di truyền, chất lượng

nước, nhiệt độ và các yếu tố stress khác [195].

Tuổi và giới tính của cá là những yếu tố quan trọng có ảnh hưởng đến

hệ miễn dịch và phản ứng miễn dịch của cá [232], hoạt động miễn dịch của cá

có thể tăng dần theo độ tuổi và khác nhau giữa cá đực và cá cái. Nồng độ

immunoglobulin trong huyết thanh tăng lên theo tuổi cá, ở một số loài, như cá

tuyết, sự gia tăng này tiếp diễn trong suốt cuộc đời, trong khi ở các loài khác,

hàm lượng kháng thể đạt tối đa khi cá thành thục sinh dục [121, 141, 159].

Sự tương tác giữa hệ thống miễn dịch và hệ thống nội tiết ở cá liên

quan chủ yếu đến hóc môn. Hóc môn sinh dục ở cá đực và cá cái như

testosterone và estradiol-17β, đã được chứng minh là ảnh hưởng trực tiếp đến

các thông số miễn dịch trong quá trình trưởng thành [53, 146], báo cáo của

Hou và cộng sự, 1994 cho thấy, sự suy giảm nồng độ IgM trong huyết tương

được quan sát thấy ở cá hồi vân sau khi sử dụng hóc môn sinh dục [96], trong

khi ở cá vằn, cá tráp hóc môn sinh dục cá đực và cá cái có những tác động

khác nhau nhưng không ức chế hoạt động thực bào và bổ thể cũng như nồng

độ IgM [54].

Kháng thể đặc hiệu ở cá có thể được truyền từ cá mẹ sang cá con, giúp

bảo vệ ấu trùng trong thời gian ngay sau khi nở [85, 153]. Báo cáo của Breuil

và cộng sự ở cá hồi Đại Tây Dương, cá chim (Pleuronectes platessa), cá vược

(Dicentrarchus labrax) và cá rô phi (Oreochromis mossambicus) đã chứng

minh về khả năng truyền IgM từ mẹ sang cá con [39], trong khi ở cá tuyết

(Melanogrammus aeglefinus) không nhận thấy có sự di truyền IgM từ mẹ

sang cá con [191]. Ở cá tráp biển, khả năng bảo vệ thụ động chống lại các

bệnh cụ thể đã được phát hiện thấy ở cá con sau khi nhận được kháng thể từ

cá bố mẹ được tiêm phòng bệnh [86], trong trường hợp khác như ở cá hồi Đại

Tây Dương không có được sự bảo vệ như vậy [129]. Mặc dù hàm lượng

kháng thể mà cá con nhận được từ cá mẹ không cao và tồn tại trong thời gian

ngắn nhưng đã thể hiện được vai trò bảo vệ cá chống lại các tác nhân lây

truyền theo chiều dọc [202].

Ở cá, những thay đổi về môi trường có thể có những ảnh hưởng đáng

kể đến hệ thống miễn dịch [87]. Điều này đã được chứng minh bởi Pérez-

Casanova trong một nghiên cứu về phản ứng miễn dịch của cá tuyết được nuôi ở nhiệt độ từ 100C đến 190C, các thông số miễn dịch như sự biểu hiện của β2-microglobulin, MHC I và hàm lượng IgM đạt mức cao nhất ở 160C, thì sự biểu hiện của cytokine IL-1β chỉ đạt tối đa ở 190C [173].

Nhiệt độ là nhân tố ngoại cảnh chính tác động đến đáp ứng miễn dịch

của cá [72]. Miễn dịch không đặc hiệu hoạt động mạnh hơn ở nhiệt độ thấp

trong khi đó các thông số của miễn dịch đặc hiệu có xu hướng bị triệt tiêu ở

nhiệt độ thấp [33], vì vậy, nhiệt độ phù hợp để sử dụng vắc-xin ở các loài cá

có thể khác nhau [174]. Với cá hồi Đại Tây Dương, nhiệt độ phù hợp để tạo ra kháng thể sau khi tiêm vắc-xin từ 4 - 6 tuần là ở nhiệt độ 10-120C; nhưng đối

với cá chẽm, kháng thể được tạo ra chỉ sau 1 tuần tiêm chủng khi được nuôi nhiệt độ 220C. Các nghiên cứu khác cũng đã chứng minh rằng nhiệt độ thấp sẽ

ngăn chặn hoạt động của tế bào T và làm chậm phản ứng hình thành kháng

thể [92].

Yếu tố stress gây ức chế phản ứng đáp ứng miễn dịch và giảm khả năng

kháng bệnh. Nhiều thí nghiệm đã được tiến hành trên các loài cá khác nhau để

xem xét tác động của stress đối với hệ thống miễn dịch. Trong các thí nghiệm

này, các hóc môn gây căng thẳng như cortisol và adrenaline hoặc các protein

liên quan đến stress khác như protein sốc nhiệt và nồng độ đường trong máu

đã được theo dõi, cũng như các thông số miễn dịch không đặc hiệu và miễn

dịch đặc hiệu tác động lên khả năng kháng bệnh [77, 83]. Phân tích các thông

số miễn dịch và các yếu tố stress cũng như các nghiên cứu về protein cũng đã

được thực hiện [125]. Kết quả đã chỉ ra sự tương tác chặt chẽ giữa yếu tố thần

kinh với hệ thống miễn dịch ở cá và sự điều hòa của những tương tác này bởi

cytokine và neuropeptide [84, 226].

1.4.2. Tổng quan về vắc-xin thủy sản

Vắc-xin được xem là biện pháp hiệu quả nhất để phòng và kiểm soát

các bệnh do vi rút, vi khuẩn gây ra [139]. Vắc-xin thủy sản được bắt đầu

nghiên cứu từ những năm 1940, báo cáo đầu tiên về việc sử dụng vắc-xin ở cá

là vắc-xin chết phòng vi khuẩn gây bệnh Aeromonas salmonicida do Duff báo

cáo vào năm 1942 [64]. Kể từ những năm 1980 đã có những tiến bộ đáng kể

trong việc phát triển vắc-xin thủy sản. Theo thống kê chưa đầy đủ, tính đến

năm 2020, hơn 140 loại vắc-xin thủy sản đã được phê duyệt trên toàn thế giới

[103], bao gồm vắc-xin bất hoạt, vắc-xin tiểu đơn vị, vắc-xin tái tổ hợp, vắc-

xin axit nucleic và vắc-xin sống giảm độc lực. Trong đó, hơn 26 loại vắc-xin

cá đã được cấp phép sử dụng cho nhiều loại cá và được bán trên thị trường

toàn cầu như: vắc-xin ADN được cấp phép ở Canada; vắc-xin bất hoạt ở Na

Uy, Chile, Ireland, Phần Lan, Canada, Cộng hòa Séc, Singapore, Châu Âu,

Nhật Bản, Úc, Việt Nam, Vương quốc Anh, Đài Loan, Tây Ban Nha,

Indonesia, Brazil; vắc-xin tiểu đơn vị ở Canada, Hoa Kỳ, Chile, Bỉ và Na Uy;

và vắc xin nhược độc ở Israel và Hoa Kỳ [139]. Việc tiêm phòng bệnh hiện

nay thường được sử dụng ở một số loài cá quan trọng về mặt kinh tế như cá

hồi Đại Tây Dương, cá hồi vân, cá rô phi sông Nile, cá cam Nhật Bản và cá

tra [13, 24]. Mặc dù vậy, một số loại vắc-xin thương mại không phải lúc nào

cũng có tác dụng hiệu quả trong phòng bệnh và trong khi đó các bệnh thủy

sản vẫn tiếp tục diễn biến nghiêm trọng [71, 143].

Trong những năm gần đây, nghiên cứu về các hệ thống biểu hiện kháng

nguyên mới cũng như các hiểu biết về hệ thống miễn dịch của cá giúp cho

vắc-xin thủy sản phát triển nhanh chóng, góp phần vào sự phát triển bền vững

của ngành nuôi trồng thủy sản toàn cầu [109].

1.4.2.1. Vắc-xin và phân loại vắc-xin cho cá

Vắc-xin là chế phẩm sinh học kích thích hệ thống miễn dịch dịch thể

và/hoặc miễn dịch qua trung gian tế bào để tạo ra phản ứng miễn dịch giúp cơ

thể chống lại một kháng nguyên cụ thể [16].

Vắc-xin trong nuôi trồng thủy sản được xem là một biện pháp phòng

ngừa hiệu quả đối với nhiều bệnh và gần đây đã trở nên phổ biến. Theo tác

nhân gây bệnh, vắc-xin thủy sản có thể được phân loại thành vắc-xin vi

khuẩn, vắc-xin vi rút và vắc-xin ký sinh trùng. Chúng cũng có thể được phân

loại theo thành phần bao gồm vắc-xin đơn giá, vắc-xin đa giá hoặc vắc-xin

hỗn hợp, hoặc phân loại theo bản chất chẳng hạn như vắc-xin sống giảm độc

lực, vắc-xin bất hoạt, vắc-xin tiểu đơn vị, vắc-xin axit nucleic và vắc-xin tái tổ

hợp [57]. Cần lưu ý rằng mỗi loại vắc-xin đều có những ưu điểm và nhược

điểm, các loại vắc-xin khác nhau cần được phát triển và sử dụng cho các tác

nhân gây bệnh và động vật khác nhau.

Phần lớn các vắc-xin được cấp phép hiện nay sử dụng trong nuôi trồng

thủy sản được sản xuất bằng các phương pháp và nguyên tắc tương tự như

những vắc-xin được Jenner và Pasteur phát triển từ nhiều thế kỷ trước [209].

Vắc-xin sống giảm độc lực được điều chế từ một hoặc nhiều loại vi rút

hoặc vi khuẩn đã làm giảm độc lực hoặc độc lực thấp đối với loài cá mục tiêu.

Tác nhân gây bệnh có thể bị giảm độc lực bằng cách sử dụng các quá trình vật

lý hoặc hóa học, cấy truyền nhiều đời trong quá trình nuôi cấy tế bào trong

điều kiện bất lợi, hoặc bằng các kỹ thuật di truyền [60]. Hiện này, vắc-xin

thủy sản sống giảm độc lực được sử dụng phổ biến trong nuôi cá, chẳng hạn

như vắc-xin phòng bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết do vi rút (VHSV) được

chế tạo từ chủng nhược độc F25 [61], vắc-xin phòng bệnh hoại tử thận lách

truyền nhiễm (ISKNV), vắc-xin Furunculosis giảm độc lực, vắc-xin vi rút

hoại tử cơ quan tạo máu giảm độc lực (IHNV) [18, 115, 189, 218, 233].

Trong những năm gần đây, đã có những tiến bộ quan trọng trong việc

nghiên cứu vắc-xin sống giảm độc lực cho thủy sản. Liu và cộng sự, 2019 đã

tạo một chủng Streptococcus lactis TFJ0901 giảm độc lực (ký hiệu FJ-ery) từ

một chủng tự nhiên Streptococcus lactis bằng cách sử dụng kháng sinh

erythromycin, kết quả nghiên cứu cho thấy TFJ-ery là chủng nhược độc có

tiềm năng để sản xuất vắc-xin phòng bệnh hiệu quả cho cá rô phi khỏi nhiễm

trùng Streptococcus lactis [134]. Một loại vắc-xin sống giảm độc lực khác

cũng đã được tạo ra bởi Liu và cộng sự, 2018 để bảo vệ chống lại bệnh do

Vibrio spp. ở cá nóc hổ (Takifugu rubripes) đã cho thấy rằng, vắc-xin không

có tác động tiêu cực đến sự phát triển của cá nóc hổ, đồng thời, đáp ứng miễn

dịch bảo vệ hiệu quả cho cá sau khi được tiêm vắc-xin [133]. Zhang và cộng

sự, 2020 cũng đã phát triển một loại vắc-xin sống giảm độc lực hiệu quả

chống lại Streptococcus lactis, vắc-xin có khả năng tạo miễn dịch dịch thể và

miễn dịch tế bào ở cá rô phi, làm tăng đáng kể mức độ bảo hộ ở cá [235].

Cũng báo cáo của tác giả này cho thấy, vắc-xin sống giảm độc lực có chủng

kháng nguyên là Aeromonas hydrophila TH0426 đã kích thích tăng cường

hoạt động của enzyme trong huyết thanh và chất nhầy trên da của chạch cũng

như làm tăng biểu hiện của các gen liên quan đến miễn dịch, bao gồm cả IL-

1β, TNF-α, IL-10 và pIgR [235]. Zhou và cộng sự, (2020) đã phát triển một

loại vắc-xin sống giảm độc lực chống nhiễm trùng Vibrio alginolyticus làm

tăng biểu hiện của IgM, IL-1β, IL-6 và TNF-α và tạo ra phản ứng miễn dịch

bảo vệ ở cá ngựa vằn [240].

Vắc-xin sống có ưu điểm là sinh đáp ứng miễn dịch mạnh, trong thời

gian dài, tuy nhiên nhược điểm của vắc-xin này là khả năng tái độc của chủng

kháng nguyên [132]. Trong nuôi trồng thủy sản, vắc-xin sống có tiềm năng

lớn hơn được sử dụng qua đường uống hoặc ngâm [14, 119, 135, 140].

Vắc-xin chết (bất hoạt): là vắc-xin sử dụng các phương pháp vật lý

hoặc hóa học để làm bất hoạt vi sinh vật gây bệnh có độc lực cao, nhưng vẫn

giữ được tính sinh miễn dịch và tạo ra đáp ứng miễn dịch bảo vệ cho động vật

thủy sản sau khi tiêm phòng. Các phương pháp khử hoạt tính vật lý bao gồm

ánh sáng tia cực tím [237], gia nhiệt ở nhiệt độ cao [15, 98], siêu âm [128] và

tia γ [36]. Bất hoạt hóa học là quá trình làm cho vi khuẩn hoặc vi rút gây bệnh

không hoạt động bằng cách phá hủy axit nucleic hoặc protein của chúng bằng

hóa chất. Bất hoạt vật lý phức tạp tốn kém, hạn chế và không ổn định, ngược

lại, bất hoạt hóa học đơn giản chi phí thấp, đáng tin cậy và là phương pháp bất

hoạt được sử dụng phổ biến nhất [102, 236].

Vắc-xin bất hoạt thường an toàn, giá thành rẻ tuy nhiên, phản ứng miễn

dịch và thời gian miễn dịch hạn chế [152, 176]. Vắc-xin bất hoạt cũng thường

bị hạn chế do khả năng sinh miễn dịch đặc hiệu bị ảnh hưởng bởi quá trình

bất hoạt làm mất tính toàn vẹn của kháng nguyên [187]. Vắc-xin vi rút hoại tử

thần kinh bất hoạt bởi hóa chất binary ethylenimine 4 mmol/l không chỉ thúc

đẩy đáng kể sự biểu hiện của các gen chức năng miễn dịch ở cá mú, mà còn

kích thích tạo miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào [112].

Vắc-xin tiểu đơn vị được điều chế bằng cách đưa gen mã hóa kháng

nguyên của mầm bệnh vào vec tơ biểu hiện. Shin, 2013 đã thực hiện cho cá

tráp ăn mô lúa biến đổi gen có chứa gen mã hoá protein vỏ của Iridovirus, kết

quả đã làm tăng đáng kể khả năng kháng bệnh của cá [196]. VLPs của vi rút

gây bệnh hoại tử thần kinh cá tuyết Đại Tây Dương được biểu hiện ở cây

thuốc lá (Nicotiana benthamiana) đã có hiệu quả trong việc bảo vệ cá vược

khỏi sự tấn công của vi rút [145]. Protein tái tổ hợp GroEL và IglC của trùng

quả dưa (Francisella directionalis) giúp tăng cường phản ứng miễn dịch của

cá rô phi sông Nile và cải thiện khả năng miễn dịch ở cá [194].

Ưu điểm của các vắc-xin tiểu đơn vị là chỉ sử dụng thành phần kháng

nguyên để tiêm phòng và không có nguy cơ gây bệnh cho vật chủ. Điều đáng

lo ngại là vắc-xin tiểu đơn vị thường chứa một kháng nguyên duy nhất, dẫn

đến khả năng kích thích phản ứng miễn dịch của chúng có thể yếu hơn so với

vắc-xin bất hoạt và vắc-xin sống giảm độc lực, vì vậy, vắc-xin này cần phải

tiêm nhiều lần và bổ sung chất bổ trợ để cải thiện hiệu quả tiêm chủng [19,

123, 126, 140, 149].

Vắc-xin axit nucleic bao gồm vắc-xin ADN và ARN. Vắc-xin axit

nucleic thường rất hiệu quả trong việc ngăn ngừa nhiễm vi rút, chẳng hạn như

vi rút gây bệnh cho cá (rhabdovirus) bởi vì chúng sử dụng cùng cơ chế tế bào

mà vi rút sử dụng khi chúng xâm nhập vào tế bào chủ [59, 95]. Huo và cộng

sự, 2020 đã phát triển các plasmid tái tổ hợp pcORF25 và pcCCL35.2 để chế

tạo vắc-xin chống lại CyHV-2, kết quả thu được là pcORF25/pcCCL35.2 đã

làm tăng hiệu quả biểu hiện của các gen miễn dịch quan trọng như IL-1, IL-2,

IFN-γ2 và viperin, đồng thời ức chế đáng kể sự sao chép của CyHV-2 ở đầu

mô thận và lá lách [96].

So với vắc-xin thông thường, vắc-xin axit nucleic ổn định hơn, an toàn

hơn và không bị trở lại tính độc. Tuy nhiên, vắc-xin axit nucleic chưa được

nghiên cứu đầy đủ và hiện tại không thể xác định liệu bộ gen của vật chủ có

tích hợp với ADN ngoại sinh để phá vỡ cân bằng di truyền nội môi trong vật

chủ hay không. Hơn nữa, vắc-xin axit nucleic có các tác dụng phụ tiềm ẩn,

bao gồm khả năng dung nạp miễn dịch của sinh vật đối với kháng nguyên đã

biểu hiện, sự tích hợp nhiễm sắc thể và viêm nhiễm tại chỗ tiêm [59].

1.4.2.2. Phương pháp sử dụng vắc-xin cho cá

Trong nuôi trồng thủy sản, ba phương pháp sử dụng vắc-xin thường

được sử dụng bao gồm: vắc-xin dùng đường tiêm, vắc-xin dùng đường ngâm

và vắc-xin dùng đường ăn [217].

Vắc-xin đường tiêm: Kháng nguyên có thể được đưa trực tiếp vào cá

bằng phương pháp tiêm trong phúc mạc hoặc tiêm bắp [174]. Với phương

pháp này, thời gian bảo vệ kéo dài hơn so với phương pháp ngâm [223]. Tiêm

phúc mạc là cách tạo miễn dịch hiệu quả nhất cho cá, vì vậy, hầu hết các loại

vắc-xin gần đây chủ yếu được cung cấp qua đường này. Vắc-xin dùng đường

tiêm cần ít vắc-xin hơn và đặc biệt thích hợp đối với vắc-xin bất hoạt, vắc-xin

tiểu đơn vị và vắc-xin axit nucleic. Nhược điểm của vắc-xin đường tiêm là

gây stress cho cá, có thể tạo các vết thương tại chỗ tiêm gây ra các bệnh

nhiễm trùng thứ cấp. Hơn nữa, đối với cá có khối lượng dưới 5g, phương

pháp này không thực tế [223]. Hạn chế chính của vắc-xin tiêm là không thể

được sử dụng nhiều lần trong cả quá trình nuôi cá [61].

Vắc-xin dùng đường ngâm có thể được thực hiện bằng cả hai phương

pháp là nhúng và tắm. Ở cá ở giai đoạn cá bột, cá hương và cá giống có khối

lượng từ 0,5 đến 5g, vắc-xin đường ngâm được sử dụng rộng rãi và được đặc

biệt khuyến khích do hiệu quả, nhanh chóng, thuận tiện, ít stress và kinh tế.

Đối với phương pháp nhúng, cá thường được nhúng trong dung dịch vắc-xin

có nồng độ cao, trong thời gian 30 giây, trong khi đó đối với phương pháp

tắm, cá được phơi nhiễm trong thời gian dài hơn, thường là từ một đến vài

giờ, với nồng độ vắc-xin thấp hơn [148]. Vắc-xin sử dụng bằng phương pháp

nhúng được ưa thích hơn vì một số lượng lớn cá có thể được gây miễn dịch

nhanh chóng [125]. Nhược điểm của việc sử dụng vắc-xin bằng phương pháp

ngâm là thời gian miễn dịch ngắn hơn, hàm lượng kháng thể tạo thành không

đủ bảo hộ cho một số loài cá [148].

Vắc-xin cho ăn được sử dụng bằng cách kết hợp nó với thức ăn hoặc

bằng cách tạo lớp áo ngoài thức ăn [66, 186]. Để ngăn chặn việc rửa trôi

kháng nguyên khỏi viên thức ăn, vắc-xin phải được phủ lên trên thức ăn cùng

với chất kết dính (dầu). Plant và cộng sự, 2011 cho rằng trộn kháng nguyên

vào thức ăn cho cá mang lại một số lợi ích như chi phí thấp, cách sử dụng đơn

giản, an toàn trong tất cả các giai đoạn tuổi cá và giảm stress đối với cá [174].

Vắc-xin đường ăn được khuyến cáo sử dụng như một biện pháp tăng khả năng

bảo vệ chống lại một số bệnh mãn tính lưu hành [161].

1.4.3. Tình hình nghiên cứu và sử dụng vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần

kinh cho cá.

1.4.3.1. Tình hình nghiên cứu vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá

trên thế giới.

Betanodavirus là nguyên nhân gây bệnh hoại tử thần kinh trên nhiều loài cá

biển, gây thiệt hại lớn cho ngành nuôi cá biển. Nhiều nghiên cứu ở các cấp độ

khác nhau đã được thực hiện để phát triển vắc-xin phòng bệnh [29, 52, 62, 95].

Nghiên cứu của Tanaka và cộng sự, 2001 sử dụng protein tái tổ hợp của

vi rút hoại tử thần kinh (được biểu hiện trên E. coli) với liều tiêm 60µg vào cá

mú bảy dải (E. septemphasciatus) thì nồng độ kháng thể trong máu cá tăng

lên. Kết quả tương tự cũng đạt được khi tiêm lặp lại 3 liều ở cá mú chuột

(Cromileptes altivelis), mỗi liều chứa 70 µg hỗn hợp 3 protein tái tổ hợp vỏ vi

rút hoại tử thần kinh, mỗi lần cách nhau 10 ngày [204].

Ở cá mú nghệ (E. lanceolatus), sau khi gây miễn dịch với hạt giả vi rút VLPs

(virus like particles) của GNNV 2 liều, mỗi liều 100 µg cho thấy trong 3 tuần đạt

hiệu giá kháng thể cao, tỷ lệ sống của cá đạt từ 29% đến 38% [136].

Các nghiên cứu của Pakingking và cộng sự, 2009 đã báo cáo về tiềm

năng phòng bệnh của vắc-xin sử dụng chủng vi rút thuộc nhóm RGNNV được

gây bất hoạt bằng formalin trên cá vược châu Á, theo đó, vắc-xin đã tạo ra

kháng thể trung hòa ở cá vược từ ngày thứ 10 đến ngày thứ 116, mức kháng

thể cao nhất được ghi nhận ở ngày thứ 60 sau khi tiêm chủng [170].

Một nghiên cứu tương tự đã được thực hiện bằng cách sử dụng chủng

vi rút thuộc nhóm RGNNV của Philippine đã bất hoạt bằng formalin để tạo ra

phản ứng miễn dịch mạnh chống bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú hoa nâu (E.

fuscoguttatus), hiệu giá kháng thể trung hòa ở ngày thứ 15 và ngày 190 là

1:800 và 1:400 hiệu giá cao nhất được ghi nhận ở ngày thứ 60 sau khi tiêm

chủng (1:5120) [170]. Cá được tiêm chủng cho thấy tỷ lệ tử vong thấp hơn

đáng kể so với nhóm không được tiêm chủng, tỉ lệ sống ở cá được tiêm vắc-

xin đạt từ 86 đến 100%.

Nishizawa và cộng sự, 2012 đã chứng minh tiềm năng của vắc-xin sống giảm độc lực ở nhiệt độ nuôi thấp (170C) đối với cá mú bảy sắc, theo đó, tỷ lệ

bảo hộ đối với cá được thử thách công cường độc đạt 93,3% [165].

Vắc-xin ADN mã hóa protein vỏ của vi rút hoại tử thần kinh cũng đã

được nghiên cứu để phòng bệnh hoại tử thần kinh ở cá bơn, cá vược Đại Tây

Dương [207]. Tuy nhiên, kết quả thu được cho thấy, plasmid mang gen mã

hoá protein vỏ của vi rút hoại tử thần kinh không tạo được miễn dịch bảo hộ

chống lại bệnh hoại tử thần kinh.

Trong một nghiên cứu của Kim và cộng sự, 2015, protein vỏ tái tổ hợp

của vi rút hoại tử thần kinh được biểu hiện bằng cách sử dụng hệ thống tổng

hợp protein không tế bào (CFPS). Protein vỏ vi rút hoại tử thần kinh tái tổ

hợp này được sử dụng để gây miễn dịch cho cá mú bảy dải với các liều lượng

khác nhau. Kết quả cho thấy cá được bảo vệ với tỷ lệ chết tích lũy thấp hơn

10% so với nhóm không được gây miễn dịch sau ngày thứ 5 thử thách cường

độc. Mặc dù hiệu quả của phương pháp này phụ thuộc vào liều lượng sử dụng,

nhưng nghiên cứu này đã mở ra một cách tiếp cận mới để phát triển một loại vắc-

xin tái tổ hợp chống lại sự lây nhiễm Betanodavirus cho cá mú bảy dải [118].

Gần đây, một nghiên cứu của Huang và cộng sự, 2017 đã được thực

hiện để đánh giá hiệu quả của vắc-xin bất hoạt nhị giá để phòng bệnh VNN và

Iridovirus trên cá mú. Cá mú đốm cam thí nghiệm được tiêm vắc-xin qua

màng bụng, đối chứng được tiêm giả dược là dung dịch đệm

phosphate (phosphate buffered saline-PBS), ở lô cá sử dụng vắc-xin hiệu giá

kháng thể chống lại bệnh hoại tử thần kinh đạt 1:1810 đến 1:5120, hiệu giá

kháng thể chống lại Iridovirus đạt 1:57 đến 1:320 [97].

Hiện nay, hai loại vắc-xin bất hoạt bằng formalin phòng bệnh hoại tử

thần kinh do các chủng mang kiểu gen RGNNV là Alpha ject micro® 1Noda

(Pharmaq) và Icthiovac® VNN (Hipra) đã được thương mại để tiêm phòng cá

vược tại thị trường Địa Trung Hải.

Một nghiên cứu khác gần đây về vắc-xin tái tổ hợp sử dụng đoạn ADN

protein vỏ của vi rút được biểu hiện dưới dạng protein 6-histidine trong E.

coli BL21. Cá vược châu Á đã được chủng ngừa bằng kháng nguyên tinh

khiết r-FNCP42 sau đó được thử thách cường độc với Betanodavirus bằng

cách tiêm, kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ sống đạt 76% [221].

Trên thế giới hiện nay đã và đang sử dụng một số loại vắc-xin phòng

bệnh cho cá mú được thống kê trong Bảng 1.1.

Bảng 1.1. Một số vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú

Loại vắc-xin

Ký chủ

Liều dùng

Giai đoạn

Cách dùng

Thời gian bảo hộ

Nguồn tham khảo

E. akaara

TTT

In vitro

0,1 mL

8 tuần

[130]

E. lanceolatus

TTT

7 ngày

[136]

Tiêm cơ TCID50 = 10-7

Protein vỏ của GNNV Bất hoạt formaldehyde

Vắc-xin ADN

E .lanceolatus

TTT

7 ngày

[136]

Tiêm cơ TCID50 = 10-7

Hạt giả vi rút

E. lanceolatus

Cá giống Tiêm cơ

10-100 µg

2 tuần

[136]

Tái tổ hợp

E. coioides

ấu trùng

Cho ăn

35 ngày

[136]

TCID50 = 10-7

E. coioides

ấu trùng

Tắm

30 ngày

[111]

TCID50 = 10-7

E. fuscogutatus

Tiêm cơ

0,1 mL

75 ngày

[170]

TTT

Bất hoạt formaldehyde Bất hoạt formaldehyde

Sống

E. septemfasciatus

Ngâm

[165]

TCID50 = 10-7

TTT

(TTT: Tiền trưởng thành)

1.4.3.2. Tình hình nghiên cứu, sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá tại Việt Nam

Kim ngạch xuất khẩu thủy sản của Việt Nam tăng trưởng cao trong

những năm gần đây. Nghề nuôi trồng thủy sản được quan tâm, đầu tư lớn.

Tuy nhiên, dịch bệnh ngày càng gia tăng trong đó nghề nuôi cá đang gặp

nhiều khó khăn do dịch bệnh gây ra. Để kiểm soát dịch bệnh trên cá nhiều

biện pháp đã và đang được áp dụng như: cải tạo ao đầm, kiểm soát chất lượng

nước nuôi, chọn lọc cá bố mẹ và cá giống sạch bệnh, áp dụng tiến bộ khoa

học… nhưng hiệu quả nuôi cá vẫn chưa cao và dịch bệnh vẫn thường xảy ra.

Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất vắc-xin để phòng dịch bệnh cho cá có ý

nghĩa rất lớn.

Việt Nam hiện đã có một số công trình nghiên cứu và sử dụng vắc-xin

trong nuôi trồng thủy sản. Vũ Dũng Tiến và cộng sự, 2003 đã chế tạo vắc-xin

kết hợp giữa kháng nguyên ngoại bào và nội bào của vi khuẩn Aeromonas

hydrophila để phòng bệnh cho cá trắm cỏ, vắc-xin đã có hiệu quả bảo hộ đạt

100% [8]. Bùi Quang Tề và công sự, 2006 đã chế tạo thành công vắc-xin từ vi

khuẩn Aeromonas hydrophila để phòng bệnh cho cá trắm cỏ, vắc-xin có tỷ lệ

bảo hộ từ 90 đến 100% [7].

Năm 2006 - 2007, Viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản II đã triển

khai đề tài nghiên cứu tạo vắc-xin phòng bệnh đốm trắng trên gan thận lách

cá (bệnh gan thận mủ) do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá tra

(Pangasianodon hypothalmus) nuôi công nghiệp ở đồng bằng Sông Cửu

Long. Kết quả bước đầu cho thấy vắc-xin có hiệu quả tốt, với liều kháng nguyên là 3x109 CFU/cá, bằng phương pháp tiêm vắc-xin 2 lần cách nhau 14

ngày, thời gian phòng bệnh cho đàn cá có thể kéo dài đến 2 tháng [2].

Tiếp nối kết quả từ nghiên cứu trên của Viện Nghiên cứu nuôi trông

Thủy sản II Công ty Pharmaq Việt Nam đã sản xuất và đăng ký lưu hành

thành công vắc-xin ALPHA JECT Panga 1, đây là vắc-xin thương mại đầu

tiên cho cá tra tại Việt Nam và châu Á. Tỷ lệ chết do bệnh gan thận mủ do vi

khuẩn Edwardsilla iculuri ở các ao sử dụng vắc-xin là 0 - 4,7% trong khi các

ao không tiêm vắc-xin tỷ lệ cá chết do bệnh này lên tới 3,8 - 23% [246].

Nguyễn Thị Thanh Thùy và cộng sự, 2012 đã thực hiện nghiên cứu chế

tạo vắc-xin bất hoạt phòng chống bệnh do vi khuẩn V. parahaemolyticus gây

ra trên cá mú chấm cam (E. coioides). Vắc-xin được tạo ra từ chủng vi khuẩn

V. parahaemolyticus V3 (phân lập từ thận của cá mú bị bệnh) được bất hoạt trong formalin 0,5%, trong 24 giờ ở 40C. Đánh giá khả năng bảo hộ của vắc-

xin bất hoạt này trên cá mú chấm cam cho thấy, sau 30 ngày sử dụng vắc-xin

bất hoạt có kết hợp với chất bổ trợ (FIA với tỷ lệ 1:1) và không có chất bổ trợ,

tỷ lệ bảo hộ (RPS) tương ứng đạt 87,5% và 50%; sau 60 ngày tiêm chủng, tỷ

lệ bảo hộ đạt tương ứng là 41,1% và 10,9%. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng,

vắc-xin bất hoạt đã tạo được hiệu quả bảo hộ, tuy nhiên thời gian bảo hộ này

chưa dài [9].

Phan Thị Vân cộng sự, 2013 đã phát triển thành công vắc-xin bất hoạt

phòng bệnh Vibriosis cho cá giò nuôi. Vắc-xin (AquaVib) tạo từ 3 chủng vi

khuẩn V. alginolyticus, V. parahaemolyticus và V. harveyi được bất hoạt bằng

formalin kết hợp với nhũ dầu Montanide TMISA 760 (Seppic). Ở quy mô

phòng thí nghiệm, vắc-xin này có độ an toàn 100%, tỷ lệ bảo hộ 70 - 100%

sau 7 đến 30 ngày tiêm vắc-xin. Trong mô hình thực nghiệm, vắc-xin có độ

dài miễn dịch từ 3 đến 12 tháng, tỷ lệ bảo hộ trên 70%. Vắc-xin có thời gian bảo quản ở nhiệt độ 40C ít nhất 9 tháng [12].

Phạm Thị Tâm và cộng sự, 2015 đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên

cứu phương pháp phát hiện vi rút gây bệnh và sản xuất vắc-xin phòng bệnh

hoại tử thần kinh cho cá mú nuôi công nghiệp”. Kết quả đề tài đã chế tạo

được vắc-xin bất hoạt keo phèn có hiệu lực bảo vệ trên 83% cá giống, an toàn

100%, có độ vô trùng tuyệt đối [6].

Nguyễn Hữu Vũ và cộng sự, 2019 đã tiến hành thực hiện đề tài

“Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán và chế tạo vắc xin phòng bệnh

Streptococcosis trên cá rô phi ở Việt Nam”. Kết quả đã sản xuất được vắc xin

phòng Streptococcosis trên cá rô phi bằng đường ăn và đường tiêm quy mô

công nghiệp, vắc-xin đạt tiêu chuẩn vô trùng 100%, an toàn 100% và tỉ lệ bảo

hộ đạt trên 70%.

Trần Vĩ Hích và cộng sự, 2020 đã đánh giá hiệu quả bảo vệ cá bớp khỏi

bệnh mù mắt do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra ở cá bớp của vắc-xin bất

hoạt. Kết quả thí nghiệm cho thấy vắc-xin hoàn toàn an toàn với cá bớp

(không có sự khác biệt về chiều dài và khối lượng giữa cá thí nghiệm và cá

đối chứng, không có bất kì dấu hiệu bất thường nào được quan sát ở xoang

bụng cá được tiêm vắc-xin). Trong thí nghiệm công cường độc, vắc-xin đã

bảo vệ cho cá khỏi bệnh do S. iniae gây ra với tỉ lệ bảo hộ (RPS) là 85,19% tương ứng với liều tiêm là 104 CFU/cá. Hiệu giá kháng thể trung bình trong

huyết thanh của cá tiêm vắc-xin là 19,7 trong khi ở cá đối chứng là 0 [249].

Trần Vĩ Hích và cộng sự, 2021 đã đánh giá hiệu quả bảo vệ cá mú lai

khỏi bệnh cá mú ngủ do iridovirus gây ra của vắc-xin Piscivac Irido Si (chứa chủng iridovirus bất hoạt ≥ 106,6 TCID50/mL). Kết quả thí nghiệm cho thấy

vắc-xin hoàn toàn an toàn với cá mú (không có sự khác biệt về chiều dài và

khối lượng giữa cá thí nghiệm và cá đối chứng, không có bất kì dấu hiệu bất

thường nào được quan sát ở xoang bụng cá được tiêm vắc-xin). Trong thí

nghiệm công cường độc, vắc-xin Piscivac Irido Si đã bảo vệ cho cá khỏi bệnh

cá mú ngủ do iridovirus gây ra với tỉ lệ bảo hộ (RPS) là 72,9% [250].

Chương 2

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Cá bệnh

Mẫu cá mú được thu thập ở vùng nuôi trồng thủy sản ven biển quanh

đảo Cát Bà, khu vực vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng), vùng biển Vân Đồn,

Quảng Yên (Quảng Ninh), vùng biển Đồng Châu (Thái Bình), vùng biển Hải

Thịnh, Nghĩa Hưng (Nam Định).

Các mẫu cá nghi nhiễm bệnh hoại tử thần kinh được thu vào tháng 5, 6, 8 năm 2016 được lưu giữ trong các dụng cụ vô trùng ở 8-120C trong suốt quá

trình vận chuyển về phòng thí nghiệm tại khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại

học Mở Hà Nội để phân lập vi rút. Mẫu cá bệnh được dùng để phân lập vi rút

trong vòng 24 giờ ngay sau thời điểm thu mẫu.

2.1.2. Cá thí nghiệm

Cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) dài 2-2,5 cm, cá mú cọp

(Epinephelus fuscoguttatus) dài 2-2,5 cm và mú chuột (Cromileptes altivelis)

dài 5,5-6 cm được cung cấp bởi Trung tâm Quốc gia Giống hải sản miền Bắc,

Xuân Đán, Cát Bà, Hải Phòng. Cá được kiểm tra không nhiễm vi rút gây bệnh

2.1.3. Tế bào

hoại tử thần kinh bằng phản ứng RT-PCR trước khi thí nghiệm.

Tế bào GS01 (tế bào lách cá mú) do trường Đại học Wageningen, Hà

Lan cung cấp.

2.1.4. Hóa chất

Hóa chất cho nuôi cấy tế bào

Môi trường Leibovitz´s L-15 medium (Gibco, Mỹ), fetal bovine serum

-FBS (Gibco, Mỹ), penicillin-streptomycin (Gibco, Mỹ).

Hóa chất dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử

Kit RNeasy Qiagen (Qiagen, Mỹ), dH2O, 2xPCR Master mix solution

(Qiagen, Mỹ), mồi PCR, 50X TAE Buffer (Thermo Scientific, Mỹ), agarose

(Bio Basic, Canada), DNA Ladder 1kb (Invitrogen, Thermo Scientific, Mỹ),

ethidium bromide (Thermo Scientific, Mỹ).

Hóa chất sử dụng cho thí nghiệm đánh giá độc lực của vi rút: dung

dịch NaCl 0,9% (Việt Nam); phosphate buffered saline (PBS) được pha với

thành phần 4,3 mM Na2HPO4.7H2O (Merck, Đức); 1,4 mM KH2PO4 (Merck,

Đức); 2,7 mM KCl (Merck, Đức); 137 mM NaCl (Merck, Đức) với pH 7;

huyết thanh ngựa, cao nấm men (Himedia, Ấn Độ)

Hóa chất cho ELISA: Sữa tách bơ (skim milk), Tween 80 (Merck,

Đức), dung dịch H2SO4 (Merck, Đức), dung dịch cơ chất ABTS (Thermo

Scientific, Mỹ).

Môi trường đánh giá chất lượng vắc-xin:

- Môi trường canh thịt: Cao thịt 5g; peptone 10g; NaCl 5g, nước cất

1000mL, pH 6,8-7,0.

- Môi trường thạch máu: peptone 5g; cao nấm men 3g; NaCl 5g; agar

15g; máu bò 50 mL; nước cất 1000 mL, pH 7,2-7,4.

- Môi trường thạch saboroud: peptone 10g; đường dextrose 40g; agar

15g; nước cất 1000 mL; pH 5,4-5,6.

- Môi trường thạch XLD: cao nấm men 3g; L-lysine 5g; xylose 3,75g;

lactose 7,5g; sucrose 7,5g; sodium desoxycholate 2,5g; ferric ammonium

citrate 0,8g; sodium thiosulfate 6,8g; NaCl 5g; agar 15g; phenol red 0,08g;

nước cất 1000 mL, pH 7,2-7,4.

2.1.5. Thiết bị

Một số thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu như: Tủ cấy vô

trùng (Sanyo, Nhật Bản), máy PCR (Eppendorf AG 22331, Đức), nồi hấp vô trùng (Nhật), tủ ấm CO2 nuôi tế bào (Memmert, Đức), tủ lạnh -200C, -800C (Sanyo, Nhật Bản), bộ điện di ngang (Advance Tech, Nhật Bản), máy vortex

(IKA, Đức), máy li tâm (Sorvall, Mỹ), máy đông khô (Eppendorf, Đức), kính

hiển vi soi ngược (Sony, Nhật), chai nuôi cấy T25, T75 (Corning, Mỹ), đĩa

ELISA 96 giếng (NUNC, Thermo Scientific, Mỹ), đĩa nuôi cấy 24 giếng, 48

giếng và 96 giếng (Corning, Mỹ), màng lọc 0.22 μm (Merck Millipore,

Burlington, MA, USA), máy đông khô (Ependoft, Đức).

Các dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, đầu pipette, ống eppendorf, que cấy,

đèn cồn, lamen, lam kính, thùng nuôi cá, máy sục khí cho bể cá.

2.2. Nội dung nghiên cứu

2.2.1. Phân lập, lựa chọn chủng giống gốc phục vụ sản xuất vắc-xin phòng bệnh

hoại tử thần kinh cho cá mú

Phân lập vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh từ cá mú nghi nhiễm bệnh ở

miền Bắc.

Xác định độc lực của các chủng vi rút hoại tử thần kinh được phân lập;

Lựa chọn chủng giống gốc phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần

kinh cho cá mú: xác định chủng đại diện kháng nguyên; đánh giá tính thuần khiết,

khả năng kích thích sinh kháng thể bảo hộ ở cá mú; xác định hiệu xuất nhân giống

trên tế bào mẫn cảm; đánh giá sự ổn định về khả năng kích thích sinh kháng thể bảo

hộ, sự ổn định của gen mã hoá kháng nguyên.

2.2.2. Nghiên cứu sản xuất vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh

cho cá mú quy mô phòng thí nghiệm.

Xác định liều gây nhiễm và thời gian thu hoạch vi rút từ tế bào nuôi cấy;

Xác định hoá chất và các điều kiện gây bất hoạt vi rút;

Xác định các điều kiện tạo vắc-xin bán thành phẩm: liều kháng nguyên,

chất bổ trợ, điều kiện tạo vắc-xin keo phèn;

Đánh giá độ dài miễn dịch của vắc-xin bán thành phẩm.

2.2.3. Xây dựng quy trình kiểm tra tiêu chuẩn chất lượng vắc-xin.

Đánh giá tiêu chuẩn vật lý của vắc-xin

Đánh giá tiêu chuẩn vô trùng của vắc-xin

Đánh giá tiêu chuẩn an toàn của vắc-xin

Đánh giá độ dài miễn dịch của vắc-xin

2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi

sinh vật - Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội và phòng Vi

sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN

Việt Nam.

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 04/2016 đến tháng 04/2020.

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Sơ đồ các bước thực hiện chính

Hình 2.1. Sơ đồ các bước thực hiện

2.4.2. Phương pháp thu và xử lý mẫu

Phương pháp thu thập, lấy mẫu áp dụng theo OIE (2019) [168]. Tổng

cộng đã thu được 60 mẫu cá mú gồm 3 loài:

- Cá mú chấm cam (Epinephelus coioides), cá mú cọp (Epinephelus

fuscoguttatus) và cá mú chuột (Cromileptes altivelis) có kích cỡ từ 2 đến 12

cm. Địa điểm: vùng nuôi cá ven biển Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định và

Thái Bình, thời gian tháng 5, 6,8 năm 2016.

Mẫu cá bệnh được ký hiệu như sau:

- Mẫu thu thập tại Quảng Ninh: từ QN01-QN16

- Mẫu thu thập tại Hải Phòng: từ HP01-HP15

- Mẫu thu thập tại Nam Định: từ NĐ01-NĐ14

- Mẫu thu thập tại Thái Bình: từ TB01-TB15

Xử lý mẫu

Theo phương pháp của Hedge và cộng sự,2002, cá nghi mắc bệnh được

thu não và mắt. Nghiền các mô này trong dung dịch muối cân bằng Hanks

(Hank's Balanced Salt Solution - HBSS) với tỷ lệ 1:10 (w/v). Sau đó đem ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15 phút, ở 40C. Dịch nổi được hút ra và lọc qua màng lọc 0,22 µm, dịch bệnh phẩm được bảo quản 40C [90].

2.4.3. Kỹ thuật phân lập vi rút trên tế bào mẫn cảm GS01

Theo phương pháp Qin và cộng sự, (2006) [177]. Trước khi sử dụng, tế

bào được hoạt hóa trong đĩa nuôi cấy với môi trường Leibovitz’s L-15 (L-15)

có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê (fetal bovine serum - FBS) ở nhiệt độ 250C, 5% CO2 cho tới khi tế bào mọc thành một lớp ở đáy đĩa nuôi cấy với độ bao phủ khoảng 90%. Loại bỏ môi trường trong đĩa nuôi cấy và rửa lần 1

bằng cách tráng tế bào với L-15 không có FBS. Bổ sung môi trường

Leibovitz’s L-15, ủ từ 1-2 tiếng rồi loại bỏ hoàn toàn môi trường L-15 trước

khi lây nhiễm dịch bệnh phẩm.

Hút 0,05 mL dịch mẫu bệnh phẩm để láng hết trên toàn bộ bề mặt tế

bào của đĩa 24 giếng nuôi, lắc đều để vi rút tiếp xúc với toàn bộ bề mặt đĩa

nhằm trải đều dịch bệnh phẩm trên bề mặt tế bào trong giếng. Bổ sung thêm

môi trường L-15 chứa 10% FBS và 1% penicillin-streptomycin.

Mẫu đối chứng chỉ có tế bào GS01 và môi trường L-15, 10% FBS và

1% penicillin-streptomycin.

Đĩa tế bào gây nhiễm được nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 250C, 5% CO2. Hằng ngày dõi sự xuất hiện của hiệu ứng huỷ hoại tế bào (cytopathic effect -

CPE) bằng kính hiển vi soi ngược. Khi CPE đạt khoảng 90-95% thì thu dịch vi rút, ly tâm dịch nổi ở 8.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C và thu dịch nổi

Dịch vi rút được bảo quản ở -800C.

2.4.4. Kỹ thuật tách chiết ARN tổng số

Tách chiết ARN tổng số từ mẫu tế bào nhiễm VNN bằng Kit RNeasy

Qiagen của hãng Qiagen, Mỹ.

Cho 250 µL dịch tế bào + 100 µL ARNse-free water + 350 µL RLT buffer

(chứa guanidine thiocyanate) vào ống eppendorf 1,5 mL, vortex trong 5 phút.

Bổ sung 250 µL ethanol (96-100%), đảo trộn nhẹ bằng pipet.

Hút 700 µL sang cột tách silicagel, đậy nắp, ly tâm 10.000 vòng/phút

trong 15 giây ở 40C, thu cột.

Bổ sung 500 µL dung dịch RPE pha loãng với ethanol (tỷ lệ 1:4) vào

cột tách, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 giây ở 40C (rửa cột để loại bỏ tạp

chất), thu cột.

Bổ sung 500 µL RPE buffer pha loãng với ethanol (tỷ lệ 1:4) vào cột

tách, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút ở 40C, thu cột.

Chuyển cột sang tube mới, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút, thu cột.

Chuyển cột sang eppendorf 1,5mL có nắp. Bổ sung 30µL ARNase-free

water, đóng nắp ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch lọc có chứa

ARN tổng số.

2.4.5. Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)

(Thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit RT-PCR one step của hãng

Qiagen, Mỹ). Cặp mồi để khuếch đại đoạn gen T4 của NNV có kích thước

420 bp có trình tự như sau:

F2 (5’- CGTGTCAGTCATGTGTCGCT -3’) và

R3 (3’- CGAGTCAACACGGGTGAAGA -5’) [163]

Thành phần phản ứng RT-PCR:

Thành phần Thể tích (µL)

5 RT-PCR buffer

5 Q- solution

1 dNTP

1 Enzyme ADN-polymerase

0,2 Mồi: F2-R3

5 ARN temperlate

7,6 ARNse- free water

25 Tổng

Chu trình nhiệt RT: 500C / 30 phút PCR: biến tính 950C / 5 phút 940C / 30 giây 600C / 30 giây 30 chu kỳ 720C / 1 phút 720C / 5 phút

2.4.6. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR được tinh sạch sử dụng bộ sinh phẩm GenJET PCR Purification Kit (ThermoScientific). Quy trình thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.4.7. Phương pháp điện di trên gel agarose

Theo phương pháp của Sambrook và Russel, 2001 [185].

Cân 0,2 gam agarose cho vào 20mL dung dịch đệm TAE 1X, đun sôi

dung dịch trong lò vi sóng cho đến khi agarose tan hết (từ 1-2 phút). Để nguội gel đến khoảng 500C thì bổ sung Ethidium bromide (EtBr) rồi đổ vào khuôn

gel đã gắn lược, khoảng 20-30 phút sau khi gel đã nguội hoàn toàn thì rút lược

và đặt vào bể điện di chứa sẵn đệm TAE 1X, sao cho dung dịch đệm ngập

hoàn toàn bản gel.

Tra mẫu (sản phẩm RT-PCR): lấy một thể tích mẫu thích hợp (chứa

khoảng 1-2μg ADN), trộn với loading buffer sau đó tra vào các giếng của gel.

Điện di mẫu ở hiệu điện thế 110V, thời gian 20-30 phút.

Lấy bản gel ra khỏi bể điện di, quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng tia

tử ngoại có bước sóng λ= 260nm.

2.4.8. Phương pháp giải trình tự ADN

Trình tự ADN được xác định theo phương pháp của Sanger trên máy xác định trình tự ADN tự động ABI prism 3100 Sequencer (Applied Biosystems) với bộ Kit xác định trình tự BigDye® Terminater v3.1 Cycle Sequencing Kit của hãng Applied Biosystems.

2.4.9. Phương pháp xác định TCID50 của NNV

TCID50 của vi rút được xác định bằng phương pháp chuẩn độ trên đĩa

nhựa 96 giếng.

Trước khi thực hiện chuẩn độ, tế bào GS01 được cấy trong đĩa nhựa 96

giếng để tế bào mục phủ kín bề mặt đáy đĩa.

Dịch vi rút được pha loãng từ 10-1 đến 10-8 với L15 bổ sung 10% huyết

thanh bào thai bê rồi cấy vào đĩa tế bào GS01, mỗi giếng cấy 0,1 mL. Mỗi độ

pha loãng cấy vào 8 giếng. Các giếng đối chứng được bổ sung 0,1mL L15 bổ

sung 10% huyết thanh bào thai bê. Giữ đĩa đã cấy vi rút ở nhiệt độ 250C trong

2 giờ để vi rút hấp phụ lên tế bào.

Hút bỏ dịch vi rút trong đĩa nuôi cấy, bổ sung vào mỗi giếng 0,2 mL

L15 bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê. Nuôi đĩa nuôi cấy trong tủ ấm CO2 0,5%, 280C. Hằng ngày quan sát CPE.

TCID50 được tính theo công thức của Reed – Muench như sau [181]:

PD= (A1- 50)/(A1- A2)

Log TCID50= 10 + (A+PD) dx10A

TCID50= Log TCID50/f

Trong đó: f là hệ số pha loãng

A1: tỷ lệ cận trên 50% bệnh tích

B1: tỷ lệ cận dưới 50% có bệnh tích

A: độ pha loãng với tỷ lệ cận trên có bệnh tích

của NNV

2.4.10. Phương pháp xác định LD50

Cá mú chuột có kích thước 5,5-6 cm, cá được kiểm tra không nhiễm vi

rút hoại tử thần kinh bằng phương pháp RT-PCR. Chia cá thành các nhóm,

mỗi nhóm 30 con.

Dịch vi rút được nuôi cấy trong tế bào GS01 được gây nhiễm cho cá

mú bằng phương pháp tiêm, liều tiêm 0,1mL/con. Nhóm đối chứng được tiêm

nước muối sinh lý với lượng 0,1mL/con. Sau tiêm truyền, theo dõi cá sau 6

giờ đến 15 ngày để quan sát các biểu hiện lâm sàng, tỷ lệ chết.

Độc lực của vi rút hoại tử thần kinh trên cá mú được đánh giá bằng liều

gây chết 50% cá thí nghiệm (Lethal Dose - LD50). LD50 được tính dựa theo

phương pháp của Reed và Muench (1938) [181]. lgLD50 = αlgb + lgc

Trong đó:

b = Độ pha loãng của vi rút, trong thí nghiệm này b = 1/10 (10-1)

c = Độ pha loãng vi rút gây tỷ lệ chết cận trên 50%.

2.4.11. Xác định điều kiện nhân giống vi rút

Xác định liều gây nhiễm (multiplicity of infection-MOI) vi rút vào tế

bào GS01.

MOI = số PFU gây nhiễm/tổng số tế bào gây nhiễm

Hệ số tương quan TCID50 và PFU được tính theo công thức (Cell

Biology Protocol): PFU/mL = 0,69 x TCID50

Tế bào GS01 được nuôi cấy trong đĩa 48 giếng (3,5x104 tế bào/mL)

trong môi trường L-15 có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê, ở nhiệt độ 250C, 5% CO2.

Trước khi gây nhiễm vi rút, tế bào được rửa 2 lần với môi trường L-15.

Sau đó tế bào được gây nhiễm vi rút với các liều MOI khác nhau là 0,1; 0,01

và 0,001. Bổ sung thêm 0,5 mL môi trường L-15 chứa 10% FBS, tế bào gây nhiễm NNV được nuôi ở 250C, CO2 0,05%. Hằng ngày quan sát CPE, sau 3-6

ngày bắt đầu thực hiện chuẩn độ virus (TCID50) [20, 101].

+ Xác định thời điểm thu hoạch vi rút Tế bào GS01 được nuôi cấy trong đĩa 48 giếng (3,5x104 tế bào/mL)

trong môi trường L-15 bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê, nuôi tế bào ở nhiệt độ 250C, 5% CO2.

Gây nhiễm vi rút vào tế bào, liều gây nhiễm MOI 0,01. Bổ sung thêm

0,5 mL môi trường L-15 chứa 10% FBS, tế bào gây nhiễm NNV được nuôi ở 250C, CO2 0,05%. Hằng ngày quan sát CPE, sau 3-6 ngày bắt đầu thực hiện

chuẩn độ vi rút (TCID50) để xác định thời điểm thu hoạch vi rút.

2.4.12. Phương pháp bất hoạt vi rút

Đối với vắc-xin bất hoạt, việc lựa chọn hóa chất gây vô hoạt vi rút đòi

hỏi đáp ứng được 2 điều kiện: i) làm chết mầm bệnh nhưng vẫn duy trì tính

toàn vẹn của kháng nguyên, ii) đảm bảo độ an toàn của vắc-xin. Trong nghiên

cứu này, NNV được bất hoạt bằng 3 hóa chất:

+ Bất hoạt bằng formaldehyde: formaldehyde được bổ sung vào dịch vi rút để đạt nồng độ 0,1 và 0,2%. Hỗn hợp được ủ ở 370C /24 giờ.

Formaldehyde được loại khỏi dịch bất hoạt bằng cách trung hòa với PBS

trong 12 giờ.

+ Bất hoạt bằng Binary ethylenimine (BEI): BEI 0,1M bổ sung vào dịch vi rút để đạt nồng độ 0,001M và 0,002M. Hỗn hợp được ủ ở 370C/36 giờ.

BEI được loại khỏi dịch bất hoạt bằng cách trung hòa với 1M Na-thiosulfate

(Merck) trong 12 giờ.

+ Bất hoạt bằng β-propiolactone: chỉnh pH của dịch vi rút 7,3, bổ sung

β-propiolactone theo tỷ lệ 1:2000 (v/v). Khuấy hỗn hợp bằng máy khuấy từ trong 24 giờ/40C. Beta-propiolactone được loại bỏ bằng cách chỉnh pH về 7,0, 370C/24 giờ.

Dịch vi rút NNV TB05 sau khi bất hoạt bằng formaldehyde, BEI, beta-

propiolactone được gây miễn dịch cho thỏ 2 lần, lần 2 cách lần thứ nhất 15 ngày với với liều TCID50= 106,8, định kỳ 7 ngày 1 lần sau lần gây miễn dịch

đầu tiên, lấy huyết thanh thỏ để thực hiện phải ứng ELISA nhằm xác định khả

năng tạo đáp ứng miễn dịch của vi rút bất hoạt và lựa chọn hóa chất gây bất

hoạt phù hợp để sản xuất vắc-xin.

2.4.13. Phương pháp tạo vắc-xin keo phèn

Dịch vi rút sau khi bất hoạt được tạo dạng keo phèn với chất bổ trợ là

aluminum hydroxide (AH) và aluminum phosphate (AP) với nồng độ 2%, pH

6.0. Hỗn hợp được ủ 370C trong một giờ, sau đó ủ 2-80C qua đêm. Trong quá

trình ủ, khuấy hỗn hợp bằng máy khuấy từ, tốc độ 100 vòng/phút

Ly tâm kết tủa 10.000 vòng/phút ở 40C và rửa kết tủa hai lần bằng nước

muối sinh lý 0,9%.

Cho kết tủa trong nước muối sinh lý trở lại thể tích kháng nguyên ban

đầu. Thêm 1% thimerosal đến nồng độ cuối cùng là 0,01% làm chất bảo quản.

2.4.14. Phương pháp trung hòa trên tế bào

Phản ứng trung hòa NNV được thực hiện trên tế bào GS01 theo hướng

dẫn của Virology methods manual [40] gồm các bước sau:

Mẫu huyết thanh dương tính là mẫu huyết thanh cá mú được gây miễn

dịch với vi rút NNV TB05. Mẫu huyết thanh âm tính là mẫu huyết thanh cá

sạch bệnh. Mẫu thí nghiệm là các mẫu huyết thanh cá được gây miễn dịch với

các chủng vi rút hoại tử thần kinh đã được bất hoạt.

Bước 1: Nuôi cấy tế bào GS01 trong đĩa 96 giếng cho đến khi tế bào

mọc kín đáy đĩa.

Bước 2: Các mẫu vi rút được nuôi cấy trong tế bào GS01, chuẩn độ 1x

TCID50.

Bước 3: Trung hòa vi rút TB05 với các huyết thanh cá được gây miễn

dịch với các chủng NNV trong 12 giờ ở 280C.

Bước 4: Gây nhiễm trở lại dịch trung hòa vào tế bào GS01 và đánh giá

kết quả:

- Âm tính: Nếu toàn bộ các giếng phản ứng có bệnh tích tế bào ở tất cả

các độ pha loãng huyết thanh.

- Dương tính: Nếu các giếng phản ứng không có biểu hiện bệnh tích tế bào.

- Đối với các mẫu thí nghiệm: ở các giếng có độ pha loãng huyết thanh

cao, tế bào phát triển tốt, không hình thành các đám hủy hoại, không có tế bào

chết, bong khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy. Ở các giếng có độ pha loãng huyết thanh

thấp, có hình thành hiệu ứng hủy hoại tế bào đến hiệu ứng tan bào.

2.4.15. Phương pháp gây miễn dịch

Phương gây miễn dịch cho cá được thực hiện theo phương pháp của

Yoshihito.

Chuẩn bị chất gây miễn dịch (immunogen) như sau: Vi rút bất hoạt

được nhũ với dung dịch dầu Freun’d dạng hoàn chỉnh (FCA- Freun’d

Complete Adjuvant).

Miễn dịch cơ sở: cá trưởng thành có kích thước 20-25cm được gây miễn dịch với lượng 0,5mL/con, nồng độ vi rút là 106,8PFU/mL, thực hiện

tiêm 2 mũi, mũi tiêm thứ 2 cách mũi tiêm đầu 15 ngày, tiêm vào xoang

phúc mạc.

Hàng tuần lấy máu cá để kiểm tra biến động hiệu giá kháng thể.

2.4.16. Phản ứng ELISA gián tiếp

Phản ứng ELISA xác định kháng thể đặc hiệu được thực hiện theo mô

tả Gye và công sự, 2018; Valero và cộng sự, 2021 [83, 216].

Kháng nguyên (pha loãng ở nồng độ 2,5 µg/mL) được gắn vào đĩa ở nhiệt độ 40C qua đêm. Sau khi kháng nguyên được ủ trong đĩa, đổ bỏ dung

dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS (Phosphate Buffer

Saline) có chứa Tween 20, rửa đĩa 3 lần và đập khô.

Block đĩa: đĩa được phủ bằng dung dịch PBS chứa 5% sữa tách bơ

(skim milk), dùng pipet nhỏ 200µl mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ,

sau đó đổ bỏ dung dịch sữa trong các giếng. Rửa sạch đĩa 3 lần với PBS -

Tween 0,05% và đập khô đĩa.

Kháng thể (là huyết thanh thỏ) pha loãng theo tỷ lệ 1/200 trong dung

dịch PBS chứa 5% sữa tách bơ, nhỏ 100µl mỗi giếng. Kháng thể ủ trong đĩa ở nhiệt độ 370C, lắc sau 60 phút. Sau khi ủ, đổ bỏ dung dịch trong các giếng,

rửa đĩa 3 lần với PBS - Tween và đập khô đĩa.

Chất cộng hợp (conjugate) được pha loãng bằng dung dịch PBS với độ pha loãng là 10.000 lần, nhỏ 100µL mỗi giếng và ủ ở 370C trong 45 phút. Sau

đó lại đổ bỏ dung dịch trong giếng và rửa đĩa 5 lần với PBS - Tween 0,05%

và đập khô đĩa.

Cơ chất sinh màu (substrate): Cơ chất sinh màu được nhỏ 100µL mỗi

giếng, để nhiệt độ phòng 15 phút, phản ứng sẽ chuyển sang màu xanh lục nếu

là dương tính.

Dừng phản ứng bằng dung dịch H2SO4 2M, lúc này phản ứng có

màu vàng.

Đĩa phản ứng được đọc trên máy đọc đĩa ELISA ở bước sóng 450 nm.

2.4.17. Phương pháp thử thách cường độc

180 con cá mú cọp thí nghiệm (kích thước 2-2,5 cm), cá được ngâm 2 lần với vắc-xin bất hoạt (TCID50=106,8PFU/mL), liều sử dụng 1mL/10 cá thí

nghiệm trong thùng 80 lít, thời gian 60 phút, có sục khí, lần 2 cách lần thứ

nhất 15 ngày. Lô đối chứng gồm 50 con cá mú cọp (kích thước 2-2,5 cm) cá

được ngâm với giả dược.

Tại ngày thứ 30 sau khi gây miễn dịch, cá được chia thành 6 nhóm, mỗi

rồi thử thách cường độc với chủng NNV HP02

liều thử thách nhóm 30 cá (TCID50=106,8PFU/mL), là 0,2xTCID50, 0,5xTCID50,

1xTCID50, 2xTCID50, 3xTCID50, 4xTCID50. Tiếp tục theo dõi cá trong 15

ngày để đánh giá mức độ bảo hộ. Tỷ lệ bảo hộ được tính bằng công thức:

2.4.18. Đánh giá độ an toàn vắc-xin

Thí nghiệm đánh giá độ an toàn của vắc-xin được thí nghiệm trên 240

cá mú cọp (kích thước 2-2,5 cm). Cá được chia thành 8 nhóm, 6 nhóm thí

nghiệm được gây miễn dịch bằng phương pháp ngâm với vắc-xin keo phèn

với aluminum hydroxide (AH) hoặc aluminum phosphate (AP) theo liều kháng nguyên là 1xTCID50, 2xTCID50, 3xTCID50, (1xTCID50=106,8PFU/mL).

Hai nhóm cá đối chứng được ngâm với giả dược (keo phèn AH hoặc AP).

Cá mú cọp sau khi sử dụng vắc-xin bất hoạt được nuôi trong điều kiện ổn định về nhiệt độ 25-270C và nồng độ muối 25-30‰. Theo dõi cá trong 30

ngày để đánh giá mức độ an toàn của vắc-xin.

Mức độ an toàn của vắc-xin được đánh giá thông qua các triệu chứng

lâm sàng và tỷ lệ sống của cá sau khi sử dụng vắc-xin. Tỷ lệ sống được tính

theo công thức:

2.4.19. Đánh giá hiệu quả vắc-xin ở điều kiện thực nghiệm

Thí nghiệm được đánh giá trên 3.000 cá mú chuột (kích thước 2-2,5

cm) sản xuất tại Trung tâm giống Hải sản Cát Bà, cá thí nghiệm được gây

miễn dịch bằng phương pháp ngâm với vắc-xin keo phèn bất hoạt (TCID50=106,8PFU/mL) với liều 1mL/10 cá, thời gian 60 phút có sục khí,

hằng ngày cho ăn thức ăn là cá tạp đánh bắt ngoài tự nhiên. Vắc-xin được sử

dụng 3 lần, lần 1 được thử nghiệm trong bể composite trước khi thả lồng trên

biển 15 ngày; sau đó, vắc-xin được thử nghiệm trong bể giả trong lồng trên

biển lần 2 tại thời điểm 30 ngày và lần 3 tại thời điểm 60 ngày sau khi thả.

Lồng đối chứng: 3.000 cá mú chuột (kích thước 2-2,5 cm) được nuôi

thả lồng, hằng ngày cho ăn thức ăn là cá tạp đánh bắt ngoài tự nhiên và không

sử dụng vắc-xin.

Cá được theo dõi trong 6 tháng, các thông số đánh giá bao gồm:

i) Tỷ lệ sống = số cá sống sót sau thí nghiệm/tổng số cá trước khi thí

nghiệm*100

ii) Tăng trưởng theo khối lượng:

- Wtb1, Wtb2: Khối lượng trung bình tại thời điểm T1 và T2

iii) Tỷ lệ tăng trưởng chiều dài thân:

- Ltb1, Ltb2: Chiều dài toàn thân cá tại thời điểm T1 và T2

iv) Xác định hồng cầu tổng số, định lượng hồng cầu [160].

10µL máu được cho vào ống nghiệm nhựa có chứa EDTA. Mật độ

hồng cầu được xác định bằng buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi quang

học (40X). Mật độ hồng cầu được tính theo công thức: C x 10 x 5 x 200

(tb/mm3) với C là tổng số hồng cầu trên 5 vùng đếm.

v) Định lượng và định loại các tế bào bạch cầu

Mẫu máu đã được cố định trên lame được nhuộm bằng dung dịch

nhuộm Wright và Giemsa [49]. Theo thứ tự như sau: (1) nhuộm với dung dịch

Wright trong 3-5 phút; (2) ngâm trong dung dịch pH 6,2 – 6,8 trong 5 -6 phút;

(3) nhuộm với dung dịch Giemsa trong 20 – 30 phút; (4) ngâm trong dung

dịch pH 6,2 trong 15 – 30 phút; và (5) rửa sạch lại bằng nước cất, để mẫu khô

tự nhiên và đọc mẫu. Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính X100.

Tổng bạch cầu được xác định bằng cách đếm tổng số hồng cầu và bạch

cầu trên 2000 tế bào trên mẫu nhuộm. Tổng bạch cầu được xác định bằng

công thức: tổng bạch cầu (tb/mm3) = (số bạch cầu x mật độ hồng cầu trên

buồng đếm)/số hồng cầu trên mẫu.

Tổng số từng loại bạch cầu được xác định bằng cách đếm tổng số bạch

cầu trong 2000 tế bào. Mật độ từng loại bạch cầu (tb/mm3) = (số lượng mỗi

loại bạch cầu x mật độ tổng bạch cầu)/2000 [99].

2.4.20. Kiểm tra độ thuần khiết của vắc-xin vô hoạt

Sử dụng các môi trường cơ bản: môi trường canh thịt (Tryptone soya

broth); môi trường thạch máu (Tryptone soya agar thêm 7-10% máu cừu);

môi trường thạch nấm (Sabouraud dextrose agar); môi trường XLD (Xylose

lysine desoxycholate); canh thang PPLO có bổ sung huyết thanh ngựa và cao

nấm men (pleuropneumonia-like organism). Theo TCVN 8684:2011 “Vắc xin

và chế phẩm sinh học dùng trong thú y-Phép thử độ thuần khiết” gồm các nội

dung sau:

+ Kiểm tra sự tạp nhiễm vi khuẩn

+ Kiểm tra sự tạp nhiễm nấm mốc

+ Kiểm tra sự tạp nhiễm Salmonella

+ Kiểm tra sự tạp nhiễm Mycoplasma

Mỗi loại môi trường dùng 2 ống hoặc đĩa, có kèm theo đối chứng

dương, cấy 0,2 ml vắc-xin vào mỗi ống hoặc đĩa. Môi trường đã cấy sau đó được nuôi cấy nhiệt độ 370C và theo dõi trong 3 ngày. Riêng môi trường kiểm tra nấm nuôi nhiệt độ 25-280C và theo dõi trong 14 ngày.

2.4.21. Phương pháp xử lý số liệu

Các thí nghiệm trong nghiên cứu này đều được thực hiện 3 lần, kết quả

được biểu diễn ở dạng giá trị trung bình (Mean) ± sai số (SD). Số liệu trong

nghiên cứu được minh họa sử dụng Excel (Microsoft, USA) và phần mềm

SPSS ver 20. Sự khác biệt giữa các nhóm thí nghiệm được đánh giá bằng

ANOVA-one way sử dụng phần mềm IBM SPSS Statistic 20 (SPSS 20.0,

SPSS Inc., Chicago, IL, USA), sai khác có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05.

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả phân lập, lựa chọn chủng giống gốc phục vụ sản xuất vắc-xin

phòng bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú.

3.1.1. Phân lập vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh từ cá mú nghi nhiễm bệnh ở 4

tỉnh miền Bắc, Việt Nam.

Trong tổng số 60 mẫu cá mú có các triệu chứng của bệnh hoại tử thần

kinh như bơi bất thường theo hình trôn ốc, bơi không định hướng, thân sẫm

màu được thu thập từ các vùng biển quanh đảo Cát Bà, khu vực vịnh Lan Hạ,

Cát Hải (Hải Phòng), vùng biển Vân Đồn, Quảng Yên (Quảng Ninh), vùng

biển Đồng Châu (Thái Bình), vùng biển Hải Thịnh, Nghĩa Hưng (Nam Định).

Mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm vi rút được sàng lọc bằng phương pháp RT-PCR

nhằm phát hiện gen mã hóa kháng nguyên đặc hiệu của vi rút hoại tử thần kinh

Hình 3.1.

Hình 3.1. Mẫu cá mú

A: cá mú khỏe mạnh; B và C: mẫu cá mú nghi mắc VNN

Theo Nishizawa và cộng sự, 1994 [163] gen mã hóa kháng nguyên của vi

rút hoại tử thần kinh nằm trên cấu trúc ARN2, trên cấu trúc này chứa hai đoạn gen

có đặc điểm bảo tồn cao, bao gồm đoạn T2 có kích thước 870 bp và đoạn T4 có

kích thước 420 bp, trong đó vùng biến đổi T4 của đoạn ARN2 là cấu trúc làm

nên tính đa dạng của các kiểu gen của vi rút hoại tử thần kinh và đã được sử

dụng rộng rãi để nghiên cứu phát hiện loài và phát sinh loài của các chủng

Betanodavirus [163, 180]. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện

sàng lọc mẫu bệnh phẩm nghi nghiễm bệnh hoại tử thần kinh dựa vào gen T4. Kết

quả được trình bày trong Bảng 3.1; Hình 3.2 và Phụ lục 1.

Bảng 3.1. Kết quả sàng lọc gen T4 trong các mẫu cá nghi nhiễm VNN

Số mẫu dương Tỷ lệ dương tính Địa điểm Số lượng mẫu tính gen T4 (%)

QN 16 8 50,00

HP 15 6 40,00

NĐ 14 8 57,14

TB 15 10 66,67

Tổng số 60 32 53,33

Kết quả sàng lọc bằng phương pháp RT-PCR cho thấy, trong tổng số 60

mẫu cá mú nghi nhiễm bệnh hoại tử thần kinh thì có 32 mẫu phát hiện thấy

đoạn gen có kích thước 420 bp, tương ứng với kích thước của đoạn gen T4

của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh (Hình 3.2), trong đó, số lượng mẫu cá

dương tính với gen T4 ở Thái Bình là 10/15, chiếm tỷ lệ 66,67%, Nam Định

là 8/14, chiếm tỷ lệ 57,14%, Hải Phòng là 6/15, chiếm tỷ lệ là 40%, Quảng

Ninh là 8/16, chiếm tỷ lệ là 50%. Các mẫu dương tính với gen T4 được sử

dụng để phân lập vi rút trên tế bào mẫn cảm GS01.

Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của một số mẫu

nghi nhiễm bệnh hoại tử thần kinh

Giếng 1-5: các mẫu nghi nhiễm bệnh hoại tử thần kinh; M: thang ADN

chuẩn 1kb (ThermoScientific)

Bairoch, 2018 đã liệt kê 594 dòng tế bào có nguồn gốc từ cá [28],

những dòng tế bào này được dùng để phân lập hoặc nhân giống vi rút gây

bệnh trên động vật thuỷ sản [34]. Theo Qin và cộng sự, (2006), vi rút hoại tử

thần kinh thích nghi tốt trên tế bào GS01, vì vậy, trong nghiên cứu này, tế bào

GS01 được sử dụng để phân lập vi rút hoại tử thần kinh từ 32 mẫu cá mú thu

thập và đã được xác định dương tính với gen mã hoá kháng nguyên của vi rút

hoại tử thần kinh [177, 178].

Vi rút nhân lên trong tế bào và được đánh giá bằng hiệu ứng huỷ hoại tế

bào (cytopathic effects - CPE). Thực hiện nuôi cấy 32 mẫu bệnh phẩm trên tế

bào GS01 cho thấy: sau 72 giờ, trên đĩa tế bào GS01 bắt đầu xuất hiện hiện

tượng tế bào co tròn, bong tróc ra khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy, sau 96 giờ, toàn

bộ các mẫu bệnh phẩm đều gây hiệu ứng huỷ hoại tế bào với tỷ lệ 20%, sau

168 giờ, 32/32 mẫu bệnh phẩm đều gây bệnh tích tế bào trầm trọng, tỷ lệ tế

bào bị phá huỷ lên tới 85-98% Hình 3.3, Bảng 3.2.

Hình 3.3. Hình ảnh tế bào GS01

A: Tế bào GS01 chưa gây nhiễm mẫu NNV

B: Tế bào GS01 sau 120 giờ gây nhiễm NNV

Hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) theo thời gian (giờ)

Ký hiệu

STT

mẫu

120

144

168

192

QN02

++++

QN04

+++

++++

QN05

+++

++++

QN07

+++

QN08

++++

QN10

+++

++++

QN12

++++

QN14

+++

++++

HP02

+++

++++

HP03

+++

HP05

+++

++++

HP06

+++

Bảng 3.2. Kết quả nuôi cấy mẫu bệnh phẩm trên tế bào GS01

HP07

+++

HP09

+++

++++

HP12

+++

++++

HP15

+++

NĐ01

+++

++++

NĐ03

NĐ04

++++

NĐ05

NĐ07

+++

++++

NĐ08

+++

++++

NĐ10

+++

++++

NĐ12

+++

TB02

+++

++++

TB03

++++

TB05

+++

++++

TB07

+++

++++

TB08

+++

++++

TB10

+++

++++

TB11

+++

TB13

+++

++++

Ghi chú: ++++: CPE > 98%; +++: CPE > 85%; ++: CPE > 50%; +:

CPE > 20%; +: nghi ngờ có CPE > 10%; -: không có CPE

Kết quả Bảng 3.2 cho thấy, trong các đĩa nuôi cấy tế bào GS01, các

mẫu bệnh phẩm bắt đầu gây ra hiệu ứng hủy hoại tế bào sau 72 giờ gây

nhiễm, biểu hiện bệnh tích tế bào tăng trong các ngày tiếp theo và cao nhất từ

168 đến 192 giờ sau gây nhiễm.

Theo Valero và cộng sự, 2021, vi rút hoại tử thần kinh gây hình thành

không bào trong tất cả các dòng tế bào bào nuôi cấy, tuy nhiên, sự xuất hiện

và mức độ tiến triển của CPE do vi rút hoại tử thần kinh gây ra trong các dòng

tế bào là khác nhau, trong đó, hiệu ứng bệnh tích tế bào ở tế bào E11 và GF1

xuất hiện sớm hơn và trầm trọng hơn so với các tế bào DLB1, SAF1 và SaB1

[216]. Theo Iwamoto và cộng sự, 2000, trên dòng tế bào SSN-1, vi rút hoại tử

thần kinh gây ra hiệu ứng bệnh tích tế bào vào ngày thứ 3 với dấu hiệu đặc

thù là các tế bào co tròn riêng rẽ, chứa không bào ở tế bào chất và phá huỷ

hoàn toàn lớp tế bào vào ngày thứ 7 [101]. Sự tạo không bào của tế bào thần

kinh trong hệ thống thần kinh trung ương, đặc biệt là vùng tủy sống, sẽ dẫn đến

các rối loạn thần kinh và bơi lội bất thường [229].

Theo Qin và cộng sự, 2020, vi rút được phân lập từ các mô não, thận và lá

lách của cá bị bệnh có thể gây ra hiệu ứng hủy hoại tế bào trong các tế bào SSN-1, GF-1 và GS01 ở 250C. Sau 24 giờ nuôi cấy, tế bào SSN-1 bắt đầu xuất hiện xuất

hiện hiệu ứng bệnh tích tế bào, trong khi đó, hiệu ứng bệnh tích tế bào ở tế bào

GF-1 xuất hiện sau 36 giờ nuôi cấy và ở tế bào GS01, hiệu ứng bệnh tích tế bào

xuất hiện sau 72 giờ nuôi cấy. Tế bào SSN-1 nhiễm bệnh với các bệnh tích như tế

bào co tròn, cụm lại giống như trùm nho, trong khi đó bệnh tích của tế bào GF-1

bị nhiễm bệnh trở nên co tròn và căng phồng lên rõ rệt với các bong bóng lớn từ

màng sinh chất, còn tế bào GS01 bị nhiễm bệnh hình thành không bào rõ rệt trong

tế bào chất. Vào ngày thứ 7 sau khi gây nhiễm, tế bào SSN-1 cho thấy hiệu giá vi rút cao nhất đạt 1 × 108,4 TCID50/mL, hệu giá vi rút của tế bào GF-1 là 1 × 108,2 TCID50/mL và hiệu giá của tế bào GS01 là 1 × 107,3 TCID50/mL [178].

Kết quả nuôi cấy các mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm vi rút hoại tử thần

kinh trên tế bào GS01 trong nghiên cứu này tương đồng với các nghiên cứu

của nhiều tác giả trên thế giới, tế bào bị hủy hoại và biểu hiện bệnh tích trầm

trọng sau 7 ngày gây nhiễm [101, 178, 216].

3.1.2. Xác định độc lực vi rút (TCID50 và LD50)

Độc lực của vi rút được xác định bằng liều gây chết 50% tế bào (tissue

culture infective dose - TCID50) và/hoặc liều gây chết 50% động vật thí

nghiệm (Lethal dose- LD50). Các giá trị này càng nhỏ thì độc lực của vi rút

càng mạnh và ngược lại.

TCID50 của mẫu vi rút được xác định trên tế bào GS01, thí nghiệm

được thực hiện như mô tả trong phương pháp nghiên cứu. Kết quả xác định

TCID50 được trình bày trên Bảng 3.3.

Hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) (%) theo

Ký hiệu

TCID50/

các độ pha loãng vi rút

STT

mẫu

10-1

10-2

10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

10-8

10-9

QN02

100

10-6,9

10-3

QN04

10-3,9

QN05

10-4,9

QN07

QN08

100

10-6,8

10-4,3

QN10

10-4,9

QN12

10-4,8

QN14

10-6,8

HP02

100

10-5,9

10 HP03

10-3,9

11 HP05

10-4,9

12 HP06

10-6,8

13 HP07

100

10-3

14 HP09

10-4,9

15 HP12

10-5,9

16 HP15

Bảng 3.3. Kết quả xác định TCID50 trên tế bào GS01

10-3,9

17 NĐ01

10-4,9

18 NĐ03

10-3

19 NĐ04

10-3

20 NĐ05

10-2,7

21 NĐ07

22 NĐ08

100

10-6,8

23 NĐ10

100

10-6,8

10-4,9

24 NĐ12

10-4,8

TB02

10-5,9

TB03

10-6,8

TB05

100

10-3,9

TB07

10-2,7

TB08

10-4,9

TB10

10-4,3

TB11

10-5,9

TB13

Kết quả trong Bảng 3.3 cho thấy, 11/32 mẫu có TCID50 từ 10-5,9 đến 10- 6,9 (QN02, QN08, HP02, HP03, HP07, HP15, NĐ08, NĐ10, TB03, TB05, TB13); 9/32 mẫu có TCID50 từ 10-4,8-10-4,9 (QN07, QN12, QN14, HP06, HP12, NĐ03, NĐ12, TB02, TB10), 12/32 mẫu có TCID50 đạt 10-2,7-10-4,3 (QN04, QN05, QN10, HP05, HP09, NĐ01, NĐ04, NĐ05, NĐ07, TB07, TB08, TB11). Từ kết quả trong Bảng 3.3, bảy mẫu có TCID50 từ 10-6,8 đến 10- 6,9, bao gồm QN02, QN08, HP02, HP07, NĐ08, NĐ10, TB05 và 1 mẫu TB08 có TCID50 là 10-2,7 được lựa chọn để xác định LD50. Cá được gây nhiễm vi rút

bằng phương pháp tiêm theo như mô tả trong phần phương pháp. Kết quả thí

nghiệm thu được trong Bảng 3.4, Phụ lục 4.

Bảng 3.4. Kết quả xác định LD50 trên cá mú giống

Tỷ lệ chết tích luỹ sau 120 giờ ở các độ pha loãng vi rút (%) STT LD50 /mL Ký hiệu mẫu 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9

1 QN02 60 100 100 100 100 80

2 QN08 15 15 100 100 100 93,3 66,7 53,3 30

3 HP02 80 73,3 60 46,7 40

4 HP07

5 NĐ08 100 100 100 86,7 86,7 66,7 53,3 30

6 NĐ10 100 100 100 93,3 66,7 53,3 30

7 TB05 100 100 100 93,3 93,3 80

8 TB08 53,3 13,3 13,3 10-6,2 10-5,5 10-7,5 100 100 100 80 100 100 100 73,3 66,7 53,3 53,3 13,3 13,3 10-6,2 10-6,5 15 26,6 13,3 10-5,5 66,7 53,3 33,3 10-7,5 10-1,5 66,7 53,3 30 13,3 6,7 6,7 6,7 0 0

9 ĐC 0 0 0 0 0 0 0 0 0 K

Ghi chú: K không đánh giá

Kết quả trong Bảng 3.4 cho thấy: trong 7 mẫu vi rút có độc lực cao trên tế bào thì có 2 mẫu HP02, TB05 có độc lực cao nhất trên cá với LD50 đạt 10- 7,5, 5 mẫu gồm QN2, QN08, HP07, NĐ08, NĐ10 có LD50 từ 10-5,5 đến 10-6,5. Mẫu TB08 có độc lực thấp đối với tế bào có LD50 trên cá giống đạt 10-1,5. Từ

kết quả này, 2 mẫu có độc lực cao là HP02, TB05 được lựa chọn để xác định

loài bằng phương pháp sinh học phân tử.

Kết quả xác định loài của hai mẫu HP02 và TB05 thông qua trình tự

gen T4 được trình bày trong Bảng 3.5 và Phụ lục 2. Theo đó, trình tự gen T4

của mẫu vi rút TB05 có tỷ lệ tương đồng đạt 98,37%-99,19%, trình tự gen T4

của mẫu vi rút HP02 có tỷ lệ tương đồng đạt 97,95%-98,47% với trình tự

ARN2 của các chủng vi rút hoại tử thần kinh được công bố trên Genebank.

Kết quả này cho phép kết luận các chủng vi rút phân lập từ mẫu mang ký hiệu

HP02 và TB05 là vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh.

Bảng 3.5. So sánh mức độ tương đồng của trình tự đoạn gen T4 của

mẫu HP04 và TB05 với các trình tự của GenBank

Tên chủng và gen xác định trình tự

Mã số GenBank

Mức độ tương đồng (%)

Phần trăm trình tự được so sánh với GenBank (%)

Mẫu TB05

KU705815.1

99,19

Mouse grouper nervous necrosis virus isolate VI37 segment ARN2, complete sequence

MG874758.1

98,64

segment ARN2,

Epinephelus coioides nervous necrosis virus isolate HN1 complete sequence

AF283554.1

98,64

Yellow grouper nervous necrosis virus major coat protein gene, partial cds

MF144241.1

98,37

Einephelus coioides nervous necrosis virus strain KS1 segment ARN2, complete sequence

KY930894.1

98,37

Betanodavirus sp. strain KS1 segment ARN2 capsid protein mARN, complete cds

Mẫu HP02

KU705815.1

98,47

Mouse grouper nervous necrosis virus isolate VI37 segment ARN2, complete sequence

MG874758.1

97,95

segment ARN2,

Epinephelus coioides nervous necrosis virus isolate HN1 complete sequence

MF144241.1

98,18

Einephelus coioides nervous necrosis virus strain KS1 segment ARN2, complete sequence

KY930894.1

98,18

Betanodavirus sp. strain KS1 segment ARN2 capsid protein mARN, complete cds

3.1.3. Kết quả lựa chọn chủng giống gốc phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh

hoại tử thần kinh ở cá mú.

Hiệu quả phòng bệnh của vắc-xin phụ thuộc vào chất lượng của

chủng giống gốc với các đặc tính: đại diện kháng nguyên, hiệu quả kích thích

kháng thể bảo hộ, mức độ thuần khiết, hiệu xuất nhân giống trên tế bào mẫn cảm,

ổn định về khả năng kích thích sinh kháng thể bảo hộ và di truyền.

Việc lựa chọn chủng đại diện kháng nguyên được thực hiện bằng

phương pháp trung hòa trên tế bào GS01 giữa huyết thanh của cá được gây

miễn dịch với 2 chủng NNV HP02 và TB05 và kháng nguyên của 32 mẫu vi

rút phân lập. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Hiệu giá kháng thể trung hòa kháng nguyên của các

mẫu phân lập

Hiệu giá kháng thể

Ký hiệu

Hiệu giá kháng thể

Ký hiệu

trung hòa

mẫu vi rút

trung hòa

mẫu vi rút

HP02 256

TB05 512

HP02 64

TB05 128

NĐ01

QN02

128

256

NĐ02

128

QN04

128

256

NĐ03

128

QN05

256

128

NĐ04

128

256

QN07

128

NĐ05

256

QN08

256

512

NĐ08

256

512

QN10

128

NĐ10

128

QN12

128

NĐ12

128

QN14

HP02

256

512

TB02

128

HP03

128

512

TB03

128

HP05

128

TB05

256

512

HP06

128

TB07

128

HP07

256

128

TB08

512

HP09

128

TB10

128

HP12

128

TB11

128

HP15

256

TB13

128

Số liệu trong Bảng 3.6 cho thấy: kháng thể của hai chủng NNV

HP02 và NNV TB05 đều cho phản ứng trung hòa với các mẫu vi rút

phân lập, độ pha loãng kháng thể cho phản ứng trung hòa của chủng

NNV HP02 nằm trong khoảng 1/4-1/256, của chủng NNV TB05 tương

ứng là 1/128-1/512. Kết quả này bước đầu cho thấy, chủng NNV TB05

có khả năng tạo kháng thể trung hòa vượt trội hơn so với chủng NNV

HP02, vì vậy, chủng NNV TB05 được sử dụng để nghiên cứu chế tạo

vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú. Chủng NNV HP02

được lựa chọn làm chủng thử thách cường độc trong các thí nghiệm

đánh giá hiệu lực của vắc-xin.

Theo Tổ chức Thú y thế giới (OIE), 2018, chủng giống gốc phải được

mã hóa hồ sơ về giống, xác định rõ tên chủng, nguồn gốc và không được

nhiễm bất kỳ yếu tố ngoại lai như vi khuẩn, nấm mốc và các vi rút khác.

Giống gốc phải được bảo quản một cách cẩn thận, không được làm nhiễm

chéo giữa các chủng vi rút với nhau. Vì vậy, các lô giống gốc đều phải đánh

giá độ thuần khiết trước khi đưa vào sản xuất [167].

Thực hiện theo TCVN 8684: 2011 về phép thử độ thuần khiết của vắc-

xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y (Phụ lục 6), chủng NNV TB05

được kiểm tra trên các môi trường: nước thịt, thạch máu, thạch nấm và canh

thang PPLO để kiểm tra tạp nhiễm nấm, Mycoplasma, vi khuẩn hiếu khí, yếm

khí tổng số. Môi trường kiểm tra sau khi bổ sung giống gốc được tiến hành đem nuôi ở 35-370C, thời gian 20-24 giờ đối với các chỉ tiêu là vi khuẩn, nuôi nhiệt độ 25-280C, thời gian 7-10 ngày đối với chỉ tiêu nấm và Mycoplasma.

Mỗi lô giống được kiểm tra lặp lại 3 lần. Kết quả kiểm tra độ vô trùng giống

gốc được trình bày ở Bảng 3.7.

Bảng 3.7. Kết quả kiểm tra độ thuần khiết của giống gốc

Môi trường đánh giá

Kết luận

Chủng giống gốc

Thạch máu

Nước thịt

Thạch XLD

Số Lần kiểm tra

Thạch Sabou raud

Thời gian theo dõi (ngày)

PPLO (pleuropne umonia- like organism)

1 14 - - - - - Đạt

NNV 2 14 - - - - - Đạt TB05

3 14 - - - - - Đạt

Đối 1 14 - - - - - -

chứng

Ghi chú: - âm tính

Từ kết quả Bảng 3.7 cho thấy, các ống giống gốc NNV TB05 được kiểm

tra đều cho kết quả âm tính (không xuất hiện vi khuẩn, vi nấm và

Mycoplasma trên các môi trường đánh giá). Căn cứ theo TCVN 8684:2011 có

thể kết luận rằng chủng TB05 đạt tiêu chuẩn thuần khiết, vô trùng.

Hiệu giá vi rút là một chỉ tiêu quan trọng phải được xác định và được

lưu giữ trong hồ sơ giống gốc. Hiệu giá vi rút của chủng NNV TB05 (TCID50)

được chuẩn độ trên tế bào GS01... Kết quả xác định TCID50 của chủng NNV

TB05 được trình bày ở Bảng 3.8.

Bảng 3.8. Kết quả xác định hiệu giá vi rút của chủng giống gốc

Liều Chủng Số lần Dải pha Hiệu giá vi rút gây Hiệu giá vi rút giống kiểm loãng vi trung bình nhiễm (PFU/mL) gốc tra rút (PFU/mL) (mL)

1 10-1 – 10-8 0,1 10-6,7

NNV 10-6,8 2 10-1 – 10-8 0,1 10-6,9 TB05

3 10-1 – 10-8 0,1 10-6,8

Đối 10-1 – 10-8 0,1 đệm Âm tính Âm tính

chứng đệm PBS PBS

Từ kết quả Bảng 3.8 cho thấy: qua 3 lần kiểm tra, hiệu giá vi rút của chủng giống gốc NNV TB05 là ổn định, dao động từ 10-6,7 – 10-6,9 TCID50/mL, giá trị trung bình là 10-6,8 TCID50/mL.

Sự ổn định của chủng giống gốc về di truyền và khả năng nhân lên trong

tế bào mẫn cảm là yêu cầu cần có đối với chủng giống được lựa chọn để sản

xuất vắc-xin. Đánh giá sự ổn định về khả năng nhân lên của chủng TB05

được thực hiện bằng cách cấy chuyển liên tiếp trên tế bào GS01 trong 10 đời

liên tiếp. Sau mỗi đời cấy chuyển, xác định hiệu giá vi rút, kết quả được trình

bày tại Bảng 3.9.

Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra độ ổn định của chủng NNV TB05

Chủng giống Lần cấy chuyển Hiệu giá vi rút (PFU/mL)

Hiệu giá vi rút giống gốc (PFU/mL) 10-6,8 1

10-6,7 2

10-6,8 3

10-6,9 4 10-6,8

10-6,8 5 NNV TB05

10-6,8 6

10-6,9 7

106,8 8

10-6,7 9

10-6,8 10

1 Đối chứng Âm tính Âm tính

Kết quả trong Bảng 3.9 cho thấy: Hiệu giá của chủng NNV TB05 tương đối ổn định qua 10 lần cấy chuyển, dao động từ 10-6,7-10-6,9 TCID50/mL, thấp nhất ở lần cấy chuyển thứ 2 và 9 là 10-6,7 TCID50/mL và cao nhất ở lần cấy chuyển thứ 4 và 7 là 10-6,9 TCID50/mL, tuy nhiên sự khác biệt này không có ý

nghĩa thống kê (p > 0,05). Kết quả thu được có thể thấy, chủng NNV TB05 ổn

định về khả năng nhân lên trong tế bào GS01.

Sau 10 lần cấy chuyển liên tục, đồng thời với việc xác định hiệu giá vi

rút, mẫu nuôi cấy được kiểm tra sự ổn định của gen mã hoá kháng nguyên T4

của chủng NNV TB05. Bằng phương pháp RT-PCR và kỹ thuật giải trình tự

gen, kết quả kiểm tra thu được thể hiện trong Hình 3.4 và

Hình 3.5.

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu F2-R3, sản phẩm RT-PCR của mẫu vi rút thu

được trong 10 đời cấy chuyển đều nhân được đoạn gen có kích thước 420 bp

tương ứng với kích thước lý thuyết của đoạn gen T4.

Hình 3.4. Kết quả điện di kiểm tra trên gel agarose 1%

M: thang DNA chuẩn 1 kb (ThermoScientific); 1-10: Sản phẩm PCR khuếch

đại mẫu vi rút trong 10 đời cấy chuyển; 11: đối chứng âm; 12: sản phẩm PCR

khuếch đại mẫu vi rút TB05

Sản phẩm PCR được tinh sạch sử dụng bộ sinh phẩm GenJET PCR

Purification Kit (ThermoScientific-Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất, sau

đó được giải trình tự tại công ty MARCOGEN (Hàn Quốc), xử lý dữ liệu và

phân tích bằng phần mềm BioEdit version 7.2.1. Trình tự gen T4 của các mẫu

NNV TB05 trong 10 đời cấy chuyển đã được phân tích bằng công cụ BLAST,

10 20 30 40 50 60 70

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

kết quả thu được như sau:

f1 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA

f2 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA

f3 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA

f4 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA

f5 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA

f6 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA

f7 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA

f8 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA

f9 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA

f10AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA

80 90 100 110 120 130 140

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

f1 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA

f2 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA

f3 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA

f4 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA

f5 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA

f6 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA

f7 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA

f8 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA

f9 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA

f10CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA

150 160 170 180 190 200 210

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

f1 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC

f2 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC

f3 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC

f4 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC

f5 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC

f6 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC

f7 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC

f8 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC

f9 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC

f10GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC

220 230 240 250 260 270 280

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

f1 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA

f2 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA

f3 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA

f4 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA

f5 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA

f6 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA

f7 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA

f8 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA

f9 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA

f10CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA

290 300 310 320 330 340 350

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

f1 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG

f2 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG

f3 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG

f4 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG

f5 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG

f6 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG

f7 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG

f8 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG

f9 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG

f10ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG

360 370 380 390 400 410 420

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

f1 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG

f2 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG

f3 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG

f4 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG

f5 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG

f6 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG

f7 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG

f8 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG

f9 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG

f10CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG Hình 3.5. So sánh trình tự gen T4 của 10 đời vi rút

Kết quả phân tích cho thấy, sau 10 đời cấy chuyển, trình tự gen T4 của

chủng giống gốc NNV TB05 không bị biến đổi, không xuất hiện đột biến. Kết

quả này cho thấy, chủng giốc gốc NNV TB05 ổn định di truyền sau 10 đời

cấy chuyển.

Trong quy trình sản xuất vắc-xin, chủng vi rút đảm bảo đầy đủ các đặc

tính bao gồm thuần khiết, ổn định di truyền sau 5-10 lần cấy chuyển, khả

năng sinh miễn dịch tốt trên vật chủ, tương đồng với kháng nguyên của vi rút

gây bệnh đang lưu hành, có năng suất cao khi chế tạo sẽ được sử dụng làm

giống gốc (master seed). Xuất phát giống gốc, người ta tiếp tục cấy chuyển để

tạo giống sản xuất (worrking seed), thông thường, số đời cấy chuyển để tạo

giống sản xuất từ vi rút là 5 đời. Trong khi cấy truyền nhiều lần như vậy, bên

cạnh khả năng tạp khuẩn còn có các vấn đề xảy như i) vi rút bị biến đổi tính

di truyền dẫn tới không còn tính kháng nguyên ban đầu, ii) khả năng nhân lên

của vi rút có thể thay đổi, thông thường dẫn đến hiệu giá (năng suất thu

hoạch) vi rút giảm đi, vì các lý do này, sau mỗi đời cấy chuyển, các nhà sản

xuất phải đánh giá lại các đặc tính của giống gốc để đảm bảo chế tạo được

vắc-xin ổn định về hiệu lực, an toàn.

Từ các kết quả thu được, nghiên cứu này đã phân lập và tuyển chọn

được chủng giống gốc TB05 từ các chủng NNV phân lập từ mẫu bệnh phẩm

mắc bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú nuôi tại khu vực miền Bắc, Việt Nam.

Chủng NNV TB05 được tiến hành đông khô để lưu trữ. Việc lưu trữ

chủng giống gốc có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong sản xuất vắc-xin, điều

này đảm bảo các đặc tính của chủng giống gốc được ổn định lâu dài. Dịch giống gốc (nồng độ 106,8-107 PFU/ml) được hoà (tỉ lệ 1:1) trong chất mang chứa 22% sữa gầy (skim milk), 1,6 M sucrose và làm lạnh ở -800C trong

trong 24 giờ. Các ống giống được tiến hành đông khô trong thời gian 10 giờ,

hàm ẩm chất mang dưới 5%, tiến hành hàn ống giống bằng nhiệt. Kết quả

đông khô chủng giống gốc vi rút được thể hiện trong Hình 3.6.

Hình 3.6. Đông khô giống gốc vi rút NNV TB05

3.2. Kết quả chế tạo vắc-xin bất hoạt keo phèn phòng bệnh hoại tử thần

kinh cho cá mú quy mô phòng thí nghiệm.

3.2.1. Tối ưu điều kiện nuôi cấy tế bào GS01

3.2.1.1. Tối ưu môi trường nuôi cấy tế bào

Chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của tế bào

GS01 trên 3 loại môi trường có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò.

Hình 3.7. Ảnh hưởng môi trường đến mật độ tế bào

Kết quả trên Hình 3.7 cho thấy môi trường L-15 + 10% FBS cho mật độ tế bào cao nhất với giá trị trung bình đạt 53±1,05x106 tế bào/mL, trong khi

mật độ tế bào của môi trường DMEM + 10% FBS và môi trường MEM + 10% FBS chỉ đạt được giá trị trung bình tương ứng là 45,5±2,10x106 tế bào/mL và 28,5±1,15x106 tế bào/mL. Do vậy môi trường L-15 + 10% FBS

được lựa chọn cho nuôi cấy tế bào GS01 để sản xuất kháng nguyên.

3.2.1.2. Tối ưu pH môi trường nuôi cấy tế bào

Hầu hết các dòng tế bào thích ứng với điều kiện pH môi trường từ 6,8-

7,8. Tuy nhiên pH tối ưu cho mỗi loại tế bào phát triển có sự khác biệt. Chúng

tôi tiến hành đánh giá pH tối ưu cho quá trình nhân nuôi tế bào GS01 với 3

khoảng pH môi trường. Kết quả thể hiện trong Bảng 3.10

Bảng 3.10. Xác định pH tối ưu cho môi trường nuôi cấy tế bào GS01

Mật độ tế bào (x106 tế bào/mL)

pH môi trường Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình (x106 tế bào/mL)

38,5 37,2 ± 1,12 37,4 6,5-6,9 35,7

51,5 50,5 ± 2,25 50,9 7,0-7,4 49,1

39,2 38,7 ± 2,05 40,1 7,5-7,8 38,6

Kết quả trong Bảng 3.10 cho thấy tại khoảng pH 7,0-7,4 có mật độ tế bào cao nhất với giá trị trung bình đạt 50,5 ± 2,25x106 tế bào/mL, khoảng pH

6,5-6,9 và khoảng pH 7,5-7,8 cho giá trị trung bình thấp hơn lần lượt là 37,2 ± 1,12 x106 tế bào/mL và 38,7 ± 2,05 x106 tế bào/mL. Do vậy khoảng pH 7,0-

7,4 được chọn là điều kiện pH tối ưu cho môi trường nuôi cấy tế bào GS01.

3.2.1.3. Tối ưu mật độ tế bào ban đầu và thời điểm thu hoạch vi rút

Thời điểm thu hoạch vi rút có ý nghĩa quan trọng trong quá trình nhân

nuôi vi rút để đạt được lượng kháng nguyên cao nhất, do vậy chúng tôi tiến

hành khảo sát lượng tế bào ban đầu cấp vào chai nuôi và đánh giá thời điểm

thích hợp để đạt được hiệu giá vi rút cao nhất. Kết quả thể hiện trong Bảng

3.11 và Hình 3.8.

Bảng 3.11. Xác định mật độ tế bào ban đầu, thời điểm thu hoạch vi rút

Hiệu giá vi rút (PFU/mL)/giờ nuôi cấy

24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ

Mật độ tế bào ban đầu

120 giờ

144 giờ

168 giờ

192 giờ

216 giờ

1,58x 104 g

5,13x 104 g

3,03x 105 e

2,43x 106 f

4,06x 106 d

6,03x 106 b

3,33x 106 d

2,05x 106 f

1,35x 106 f

1x104 tế bào/mL

2,13x 104 g

6,05x 105 e

1,02x 106 c

4,78x 106 d

6,86x 106 a

6,82x 106 a

6,53x 106 b

6,33x 106 b

5,2x1 06 c

2x104 tế bào/mL

3,54x 104 g

8,43x 105 e

3,63x 106 d

4,53x 106 d

6,58x 106 a

6,74x 106 a

6,25x 106 b

5,73x 106 c

4,13x 106 d

4x104 tế bào/mL

Ghi chú: Mật độ tế bào ban đầu, hiệu giá vi rút/giờ nuôi cấy được so sánh

tương ứng; chữ bên phải số liệu biểu hiện giá trị được xử lý thống kê bằng

hàm ANOVA 2 nhân tố (mật độ tế bào và thời gian nuôi) giảm dần

a>b>c>d>e>f>g, những giá trị với các chữ cái khác nhau cho thấy sự khác

biệt đáng kể (p<0,05).

Hình 3.8. Tế bào trước và sau nuôi cấy vi rút hoại tử thần kinh ở các

thời điểm theo dõi khác nhau

A: tế bào chưa gây nhiễm; B: ngày thứ 3 sau gây nhiễm; C: ngày thứ 4

sau gây nhiễm; D: ngày thứ 5 sau gây nhiễm

Kết quả cho thấy với nồng độ tế bào ban đầu là 2x104 tế bào/mL, mật

độ tế bào cao nhất tại thời điểm 120 giờ và duy trì mật độ cao đến thời điểm

144 giờ nuôi cấy, sau đó giảm dần tại những ngày tiếp theo, với lượng tế bào

ban đầu là 1x104 tế bào/mL, tế bào nhân lên chậm và đạt được mật độ cao tại thời điểm 144 giờ và mật độ tế bào thấp hơn so với nồng độ 2x104 tế bào/mL, trong khi đó với nồng độ 4x104 tế bào/mL, tế bào nhân lên nhanh và mật độ

cao nhất cũng tại thời điểm 144 giờ. Mật độ tế bào không những không tăng mà con thấp hơn so với nồng độ 2x104 tế bào/mL. Mật độ tế bào ban đầu thấp

thì quá trình nhân lên của tế bào chậm, nồng độ tế bào cung cấp ban đầu cao

thì giai đoạn đầu mật độ tế bào tăng nhanh, tuy nhiên sự phát triển nhanh

chóng làm cho môi trường nuôi cấy giảm và sản phẩm phụ sinh ra nhiều, ức chế ngược lại sự nhân lên của vi rút. Vì vậy nồng độ 2x104 tế bào/mL được

lựa chọn và thời gian thu hoạch vi rút phù hợp là 5 ngày sau khi gây nhiễm.

3.2.2. Kết quả xác định điều kiện gây nhiễm vi rút

3.2.2.1. Xác định liều gây nhiễm (MOI- multiplicity of infection)

Trong nghiên cứu về khả năng gây nhiễm của vi rút vào tế bào mẫn

cảm, giá trị MOI (multiplicity of infection) được sử dụng để xác định liều gây

nhiễm phù hợp nhằm thu được số hạt virion nhiều nhất trong một mẻ nuôi

cấy. Đối với vi rút hoại tử thần kinh, theo báo cáo của Iwamoto và cộng sự,

2000, nhiệt độ nuôi cấy vi rút trong tế bào E-11 phù hợp là trong khoảng 25 - 300C, MOI là 1, thời gian nuôi cấy là 96 giờ [101]. Theo báo cáo của Souto và cộng sự, 2018, sự bám dính của vi rút vào tế bào tốt nhất ở 20 và 250C, trong đó nhiệt độ tốt nhất để nuôi cấy được xác định là 250C [199].

Ở nghiên cứu này, chủng NNV TB05 có TCID50= 10-6,8/mL được gây

nhiễm vào tế bào GS01, với 3 liều gây nhiễm (MOI) là 0,1; 0,01 và 0,001, nhiệt độ nuôi cấy là 250C. Tế bào sau khi gây nhiễm được nuôi ở môi trường

có huyết thanh và xác định đỉnh hiệu giá vi rút thông qua giá trị PFU/mL. Kết

quả thí nghiệm được trình bày trong Bảng 3.12 và Hình 3.9.

Bảng 3.12. Hiệu giá vi rút khi gây nhiễm với liều khác nhau

Hiệu giá vi rút theo MOI tại các thời điểm theo dõi (PFU/mL) 4 ngày 3 ngày 2 ngày 5 ngày 6 ngày 1 ngày 7 ngày

Liều gây nhiễm (MOI) 0,1

4,32 ±0,1 6,62 ±0,3 6,5 ±0,2 6,28 ±0,3 5,61 ±0,1 5,54 ±0,1 3,34 ±0,1

0,01

2,78 ±0,1 4,18 ±0,2 6,5 ±0,1 6,68 ±0,2 6,98 ±0,1 6,81 ±0,2 6,78 ±0,2

0,001 2,76 ±0,3 3,05 ±0,3 4,1 ±0,2 4,24 ±0,1 4,44 ±0,1 3,77 ±0,3 3,65 ±0,1

Hình 3.9. Kết quả xác định liều gây nhiễm (MOI) ý nghĩa thống kê được thực

hiện bằng cách so sánh mỗi giá trị MOI với giá trị của MOI 0,1. Giá trị trung

bình của ba xét nghiệm độc lập được hiển thị. Dấu hoa thị cho biết sự khác

biệt có ý nghĩa: (** p ≤ 0,001).

Kết quả trong Hình 3.9 cho thấy với liều gây nhiễm 0,001, hiệu giá vi

rút luôn ở mức thấp và chỉ tăng nhẹ vào ngày thứ 5 đạt 4,44 log PFU/mL. Ở

liều gây nhiễm cao nhất là 0,1, hiệu giá vi rút đã đạt cao nhất ở 3 ngày sau gây

nhiễm, đạt 6,62 log PFU/mL, vào những ngày tiếp theo, mặc dù môi trường

nuôi cấy vẫn tiếp tục được bổ sung vào các đĩa nuôi cấy vi rút nhưng hiệu giá

vi rút có xu hướng giảm, kết quả này chứng tỏ rằng với liều gây nhiễm 0,1

cho hiệu giá vi rút cao và sớm nhưng cũng gây hủy hoại tế bào nhanh và

mạnh. Với liều gây nhiễm 0,01, hiệu giá vi rút tăng dần đều sau 5 ngày nuôi

cấy, đỉnh hiệu giá vi rút đạt tại ngày thứ 5 là 6,98 log PFU/mL và duy trì ở

mức cao sau 7 ngày. Theo báo cáo của Chaves-Pozo và cộng sự, 2019, hiệu

giá vi rút trong môi trường tế bào nuôi cấy có liên quan chặt chẽ đến MOI

[45]. Giá trị MOI cao về mặt lý thuyết đảm bảo rằng tất cả các tế bào đều bị

nhiễm bệnh đồng thời [192]. Tuy nhiên, khi các giá trị MOI thấp được sử

dụng, tỷ lệ tế bào bị nhiễm và không bị nhiễm sẽ đảo ngược và trạng thái

kháng vi rút có thể được tạo ra ở các tế bào không bị nhiễm, điều này sẽ dẫn

đến sản sinh vi rút thấp hơn. Hiện tượng này đã được quan sát thấy ở các tế

bào não cá chẽm liên tục bị nhiễm vi rút hoại tử thần kinh [228], cũng như

trong các tế bào EPC (Epithelioma papulosum cyprinid) bị nhiễm vi rút hoại

tử tụy truyền nhiễm [110]. Từ kết quả thu được trong thí nghiệm cho phép kết

luận, giá trị MOI 0,01 là phù hợp để nhân giống vi rút.

3.2.2.2. Lựa chọn phương pháp tinh sạch và cô đặc vi rút

Dịch vi rút sau khi thu hoạch còn lẫn xác tế bào, các mảnh vỡ của tế

bào ảnh hưởng đến độ tinh khiết cũng như độ ổn định của vắc-xin sau này. Cô

đặc vi rút loại bớt các thành phần protein động vật từ môi trường nuôi cấy làm

kháng nguyên trở nên tinh khiết hơn. Bên cạnh đó, kháng nguyên trong vắc-

xin vô hoạt cần hàm lượng cao giúp gây miễn dịch tốt, vì thế cần cô đặc dịch

vi rút để chủ động trong việc điều chỉnh hàm lượng kháng nguyên trong vắc-

xin cho phù hợp. Một lợi ích nữa của việc cô đặc vi rút là làm thể tích nhỏ

nhưng hàm lượng vi rút cao, thuận tiện cho quá trình lưu trữ, bảo quản

kháng nguyên.

Vi rút sau khi được nhân sinh khối sẽ được tinh sạch bằng phương pháp

ly tâm tốc độ 5.000 vòng/phút trong 15 phút kết hợp với lọc qua màng lọc

kích thước lỗ 0,22 µm nhằm loại bỏ các mảnh vỡ của xác tế bào và giữ lại các

hạt vi rút nguyên vẹn. Dịch vi rút sau lọc được đánh giá tỉ lệ hao hụt so với

trước khi lọc, kiểm tra độ vô trùng và hiệu giá. Kết quả được thể hiện trong

Bảng 3.13.

Bảng 3.13. Kết quả tinh sạch vi rút bằng hệ thống lọc GLASSCO

Trước lọc

Sau lọc

Tỉ lệ % thể

Lần lặp

tích hao

Thể

lại thí

Vô

Hiệu giá

Vô

Hiệu giá

hụt so với

tích

nghiệm

trùng

(PFU/mL)

trùng

(PFU/mL)

trước lọc

(mL)

1000

Đạt

980

Đạt

10-5,8

2,00

1000

Đạt

970

Đạt

10-5,9

3,00

990

Đạt

970

Đạt

10-5,8

2,02

Trung

2990

10-5,83

2920

10-5,83

2,34

bình

Kết quả cho thấy dịch vi rút sau lọc đều đạt chỉ tiêu vô khuẩn, hiệu giá

vi rút không thay đổi bởi quá trình lọc. Mặc khác, thể tích dịch trong quá trình

lọc có sự hao hụt (trung bình 2,34%). Đây là tỉ lệ hao hụt nhỏ do dịch thẩm

tích và bám trên màng lọc.

Sau khi tinh sạch, dịch vi rút được thu hồi theo 2 phương pháp là lọc

tiếp tuyến và siêu ly tâm. Kết quả thể hiện trong bảng 3.14.

Bảng 3.14. Hiệu suất thu hồi vi rút bằng lọc tiếp tuyến và siêu ly tâm

Trước cô đặc Sau cô đặc Hiệu

xuất Phương Lô thí thu hồi Thể tích Thể tích

Hiệu giá

pháp nghiệm

(PFU/mL)

vi rút (mL) (mL)

(%)

91,84 90 1 980

Lọc tiếp 92,78 90 2 970

10-5,8 10-5,9 10-5,8 10-5,83

tuyến 92,78 90 3 970

10-6,8 10-6,9 10-6,8 10-6,83

92,47 90 Trung 973,3

10-5,8

10-6,2

bình

62,80 50 1 200

10-5,8

10-6,2

Siêu ly 62,80 50 2 200

10-5,8

10-6,2

10-5,8

tâm 62,80 50 3 200

10-6,2

62,80 50 Trung 200

bình

Kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi vi rút của 2 phương pháp có sự khác

biệt rõ rệt. Phương pháp thu hồi vi rút bằng phương pháp lọc tiếp tuyến cho

hiệu suất cao hơn nhiều so với phương pháp siêu ly tâm (92,47% so với

62,80%). Thu hồi vi rút bằng lọc tiếp tuyến còn có ưu điểm là dùng cho thể

tích lớn và thời gian ngắn rất phù hợp cho sản xuất vắc-xin ở quy mô công

nghiệp. Phương pháp siêu ly tâm mặc dù việc chuẩn bị và vận hành thiết bị

đơn giản nhưng nó lại khó áp dụng với lượng lớn dịch vi rút, hơn thế nữa hiệu

suất thu hồi vi rút bằng phương pháp siêu ly tâm cũng thấp, do vậy sẽ ảnh

hưởng tới giá thành sản xuất. Vì thế phương pháp lọc tiếp tuyến được lựa

chọn để thu hồi dịch vi rút.

3.2.3. Kết quả xác định điều kiện bất hoạt vi rút.

3.2.3.1. Lựa chọn hóa chất bất hoạt vi rút

Hiện tại, phần lớn vắc-xin thương mại sử dụng cho cá là vắc-xin bất

hoạt [179]. Trong quy trình sản xuất vắc-xin này, việc xác định được loại hóa

chất gây bất hoạt thích hợp, quy trình bất hoạt tối ưu và đánh giá hiệu quả bất

hoạt những yếu tố quan trọng, quyết định chất lượng của vắc-xin [25, 80, 91,

227]. Các loài, chủng vi rút cần được thiết lập quy trình bất hoạt cũng như

loại hóa chất, nồng độ hóa chất, thời gian gây bất hoạt, nồng độ vi rút phù hợp

[91]. Bằng phương pháp hóa học, người ta có thể sử dụng các loại hóa chất

như SDS, TRIzol, formaldehyde, methanol, β-propiolactone (BPL), binary

ethyleneimine (BEI). Formaldehyde và β-propiolactone là những chất bất hoạt

hóa học sẵn có nhất để gây bất hoạt vi rút và cả hai đều được các cơ quan

quản lý ở các quốc gia khác nhau chấp thuận để sản xuất các sản phẩm sinh

học chứa vi rút bất hoạt [78]. Formaldehyde làm bất hoạt vi rút thông qua tác

động vào liên kết ngang của protein bề mặt vi rút, trong khi β-propiolactone

làm bất hoạt vi rút chủ yếu thông qua quá trình acyl hóa hoặc alkyl hóa ADN

hoặc ARN của vi rút [69].

Formaldehyde là hóa chất phổ biến được sử dụng cho bất hoạt vi rút gây

bệnh ở cá như vi rút hoại tử truyền nhiễm tuyến tụy, vi rút hoại tử hệ tạo máu

truyền nhiễm và Iridovirus ở cá tráp đỏ [63]. Mặc dù vậy, Arimoto và cộng

sự, 1996 cho rằng nhóm vi rút có kiểu gen SJNNV có thể kháng lại

formaldehyde ở nồng độ thấp (0,05% ~ 0,16%) [23]. Frerichs và cộng sự, 2000

mô tả rằng vi rút gây bệnh thần kinh ở cá vược (SBNN) không bị tiêu diệt

hoàn toàn sau 6 giờ khi xử lý bằng formaldehyde 2% [75]. Yamashita và cộng sự, 2009 đã chứng minh rằng hơn 99% vi rút mất khả năng lây nhiễm ở 40C

trong ba ngày sau khi xử lý với formaldehyde ở nồng độ 0,5 và 1% [230].

Nghiên cứu của Kai và cộng sự, 2010 đã sử dụng formaldehyde 0,1% để ức

chế vi rút ở điều kiện 240C trong thời gian 9 ngày (quy trình chậm) và formaldehyde 0,2% ở điều kiện 300C trong 3 ngày (quy trình nhanh) để điều

chế hai loại vắc-xin bất hoạt [111]. Vắc-xin cyprinid herpesvirus loại 2 (CyHV-2) bất hoạt với β-propiolactone nồng độ 0,1% ở 40C tạo ra đáp ứng

miễn dịch đặc hiệu và miễn dịch không đặc hiệu ở cá chép chống lại vi rút, tỉ

lệ bảo hộ đạt 71,4% [234]. Vắc-xin chứa vi rút reovirus gây bệnh trên cá trắm

cỏ (GCRV) được bất hoạt bằng β-propiolactone 0,1% sau khi tiêm cho cá có

tỷ lệ bảo hộ đạt hơn 80% [233].

Trong nghiên cứu này, chủng NNV TB05 được gây bất hoạt với 3 loại

hóa chất, bao gồm formaldehyde, binary ethylenimine, β-propiolactone để lựa

chọn hóa chất thích hợp. Mức độ bất hoạt vi rút được đánh giá bằng cách nuôi

cấy lại mẫu vi rút sau khi xử lý bằng hoá chất trên tế bào GS01 và quan sát

hiệu ứng hủy hoại tế bào. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.15.

Bảng 3.15. Kết quả đánh giá mức độ bất hoạt của NNV

Hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) theo thời gian (giờ)

Hóa chất 12 24 36 48 60

Formaldehyde + + + - -

Binary ethylenimine + + - - -

β-propiolactone + - - - -

Ghi chú: (+): Vẫn còn hiện tượng hủy hoại tế bào (-): Không còn hiện tượng hủy hoại tế bào

Kết quả trong Bảng 3.15 cho thấy: các hóa chất formaldehyde, β-

propiolactone và binary ethylenimine đều có khả năng gây bất hoạt vi rút hoại

tử thần kinh, tuy nhiên thời gian cần thiết để bất hoạt hoàn toàn vi rút là khác

nhau. Với hóa chất là formaldehyde thời gian để bất hoạt hoàn toàn vi rút là

48 giờ, binary ethylenimine thời gian bất hoạt là 36 giờ, β-propiolactone thời

gian bất hoạt hoàn toàn vi rút là 24 giờ.

Để tìm hiểu ảnh hưởng của hóa chất bất hoạt vi rút đến khả năng tạo

đáp ứng miễn dịch của vi rút trên cá, chúng tôi đã thực hiện gây miễn dịch

cho cá với vi rút đã bị bất hoạt bởi formaldehyde, β-propiolactone và binary

ethylenimine rồi xác định kháng thể đặc hiệu tạo thành bằng phản ứng

ELISA. Kết quả được trình bày trong Hình 3.10.

Hình 3.10. Kết quả phát hiện kháng thể đặc hiệu của kháng nguyên

bất hoạt với 3 hóa chất khác nhau (OD450)

Kết quả trình bày ở Hình 3.10 cho thấy hiệu giá kháng thể đặc hiệu

trung bình được tạo ra từ vi rút bất hoạt với binary ethylenimine và β-

propiolactone cao hơn đáng kể so với vi rút bất hoạt bằng formaldehyde. Qua

kết quả trong Bảng 3.15 và Hình 3.10 có thể thấy formaldehyde có khả năng

bất hoạt vi rút nhưng làm giảm mức độ tạo đáp ứng miễn dịch chỉ đạt 0,46 và

0,47 tại thời điểm 28 ngày và 35 ngày. Trong khi đó binary ethylenimine và

β-propiolactone gây bất hoạt hoàn toàn vi rút nhưng vẫn đảm bảo tính kháng

nguyên của vi rút. Tuy nhiên vi rút bất hoạt bằng β-propiolactone cho hiệu giá

kháng thể cao và thời gian dài hơn so với bất hoạt bằng binary ethylenimine.

Tại thời điểm 28 ngày sau khi gây miễn dịch hiệu giá kháng thể trung bình

của vi rút bất hoạt bằng β-propiolactone đạt 0,75 và đến 35 ngày sau gây miễn

dịch vẫn còn tăng nhẹ, trong khi vi rút bất hoạt bằng binary ethylenimine sau

khi gây miễn dịch chỉ đạt kháng thể đặc hiệu trung bình cao nhất vào ngày 28

sau đó duy trì hiệu giá kháng thể trong máu hoặc có xu hướng giảm. Sự khác

biết hàm lượng kháng thể đặc hiệu trung bình của vi rút bất hoạt bằng 3 hóa

chất khác nhau có ý nghĩa (p < 0,05). Do vậy, β-propiolactone được chọn làm

hóa chất bất hoạt vi rút.

Theo Brown, 1995, formaldehyde gây chết vi rút theo cơ chế gây hiệu

ứng màng, khóa các cấu trúc protein vỏ của vi rút mà không gây phá hủy cấu

trúc hệ gen, vì vậy, acid nucleic của vi rút bất hoạt vẫn có thể nhân lên trong

tế bào vật chủ và gây hiện tượng nhiễm trùng cận lâm sàng [41]. Bên cạnh đó,

cấu trúc vỏ protein thay đổi có thể dẫn tới làm biến đổi tính kháng nguyên của

vi rút [27]. Binary ethylenimine, là hóa chất thuộc nhóm “aziridines” gây ảnh

hưởng lớn đến acid nucleic nhưng phản ứng yếu với các phân tử protein vì

vậy không làm thay đổi cấu trúc kháng nguyên bề mặt của vi rút. Trong một

nghiên cứu về vắc-xin IHNV, Tang và cộng sự, 2016 đã báo cáo về hiệu quả

bất hoạt và khả năng sinh miễn dịch tốt hơn khi sử dụng β-propiolactone so

với formaldehyde và binary ethylenimine [205].

Một nghiên cứu khác thực hiện nghiên cứu thử nghiệm bất hoạt vi rút

hoại tử tạo máu truyền nhiễm (IHNV) ở cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss)

bằng β-propiolactone, binary ethylenimine, formaldehyde và chứng minh

được rằng, IHNV đã bị bất hoạt hoàn toàn bởi β-propiolactone và vắc-xin có

hiệu quả tương đối trên cá [205].

3.2.3.2. Xác định nồng độ hóa chất bất hoạt vi rút

Nồng độ hóa chất có ảnh hưởng đến khả năng bất hoạt vi rút cũng như

tính kháng nguyên của vi rút sau khi bất hoạt. Nếu nồng độ hóa chất quá thấp

dẫn đến việc bất hoạt vi rút không triệt để, làm mất tính an toàn của kháng

nguyên. Ngược lại, nếu nồng độ hóa chất quá cao sẽ dễ gây ra các phản ứng

phụ là biến tính các protein quyết định kháng nguyên do vậy không tạo đáp

ứng miễn dịch sinh kháng thể đặc hiệu. Vì vậy cần xác định nồng độ phù hợp

để bất hoạt được hoàn toàn vi rút cũng như giữ được tính kháng nguyên.

Để xác định nồng độ hóa chất bất hoạt phù hợp, thí nghiệm lựa chọn 4

nồng độ β-propiolactone đã được khảo sát để bất hoạt vi rút.

Bảng 3.16. Xác định nồng độ hóa chất β-propiolactone

Nồng độ β- Hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) theo thời gian (giờ)

propiolactone 12 16 18 24 30 36 42 48

(%)

0,05 + + + + + + + -

0,1 + + + - - - - -

0,2 + + - - - - - -

0,4 - - - - - - - -

Ghi chú: (+): Vẫn còn hiện tượng hủy hoại tế bào (-): Không còn hiện tượng hủy hoại tế bào

Hình 3.11. Biến động kháng thể ở cá với kháng nguyên bất hoạt

β-propiolactone ở các nồng độ khác nhau (OD450)

Kết quả trong Bảng 3.16 và Hình 3.11 cho thấy với nồng độ 0,05% thì

phải mất 48 giờ mới bất hoạt hoàn toàn vi rút, trong khi với nồng độ 0,4%

thời gian bất hoạt hoàn toàn vi rút chỉ là 12 giờ. Còn ở nồng độ 0,1% và 0,2%

thì thời gian bất hoạt hoàn toàn vi rút là 24 giờ, như vậy, nồng độ hóa chất cao

thì vi rút bị bất hoạt nhanh và ngược lại nồng độ hóa chất thấp thì bất hoạt vi

rút chậm. Ở nồng độ hóa chất β-propiolactone 0,05% và 0,4% thì hiệu giá

kháng thể đặc hiệu của cá thấp hơn kháng thể đặc hiệu ở cá sử dụng hóa chất

ở nồng độ 0,1% và 0,2% sau khi gây miễn dịch cho cá. Mặc dù việc bất hoạt

bằng β-propiolactone được thực hiện trong thời gian ngắn, nhưng nó vẫn cần

ủ 24 giờ để bất hoạt hoàn toàn vi rút [248]. Bằng phương pháp phân tích

Western blot đã chỉ ra rằng nồng độ β-propiolactone ảnh hưởng đến kích

thước và tính toàn vẹn của virion. Ở nồng độ β-propiolactone thấp (0,02%)

đường kính virion không bị ảnh hưởng và hiệu giá HA không giảm, cấu trúc

virion và tính kháng nguyên còn nguyên vẹn [249]. Ngược lại, nồng độ β-

propiolactone 0,1% gây ra những biến đổi cấu trúc virion. Trong quá trình tạo

vắc-xin bất hoạt sử dụng hóa chất là β-propiolactone điều kiện bất hoạt ở nhiệt độ 40C, thời gian 18-24 giờ, tuy nhiên nồng độ β-propiolactone có thể

thay đổi tùy thuộc từng loại kháng nguyên dao động từ 0,1-0,25% [247].

Nồng độ hóa chất bất hoạt của β-propiolactone là 0,1% trong thời gian 24 giờ

được lựa chọn vì sẽ tiết kiệm được chi phí sản xuất và giảm thải trừ hóa chất

ra môi trường.

3.2.3.3. Đánh giá chất lượng kháng nguyên sau bất hoạt

Chất lượng vắc-xin bất hoạt phụ thuộc rất nhiều vào hiệu quả của quá

trình bất hoạt vi rút. Phương pháp bất hoạt đạt hiệu quả phải đảm bảo được

các điều kiện như: 1) Vi rút không có khả năng nhân lên khi cấy chuyển trên

các môi trường thích hợp hoặc không có khả năng gây bệnh cho động vật khi

tiêm truyền; 2) Vi rút sau bất hoạt vẫn bảo tồn được tính kháng nguyên.

Để đánh giá chất lượng kháng nguyên sau bất hoạt, chúng tôi tiến hành

nuôi cấy dịch vi rút sau bất hoạt trên tế bào GS01 để xác định sự tồn dư của vi

rút và tiến hành gây miễn dịch trên cá nhằm đánh giá khả năng kích thích

miễn dịch. Kết quả thể hiện trên Bảng 3.17 và Hình 3.12.

Bảng 3.17. Kết quả xác định vi rút sống tồn dư sau bất hoạt

Lô kháng Hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) theo thời gian (giờ)

nguyên bất 12 18 24 hoạt

Lô 1 + + -

Lô 2 + + -

Lô 3 + + -

Ghi chú: (+): Vẫn còn hiện tượng hủy hoại tế bào (-): Không còn hiện tượng hủy hoại tế bào

Hình 3.12. Biến động kháng thể đặc hiệu của cá với kháng nguyên

sau bất hoạt (OD450)

Kết quả xác định vi rút tồn dư sau bất hoạt bằng hóa chất β-

propiolactone với các lô kháng nguyên tại 3 lần lặp lại khác nhau cho thấy sau

24 giờ bất hoạt thì toàn bộ vi rút đã được bất hoạt hoàn toàn, không thấy có sự

nhân lên trên tế bào GS01, trong khi đó thời gian bất hoạt 12 giờ và 18 giờ thì

vi rút vẫn chưa được bất hoạt hoàn toàn. Kết quả kiểm tra kích thích đáp ứng

miễn dịch của cá bằng phương pháp ELISA khẳng định vi rút sau khi bất hoạt

vẫn giữ được tính kháng nguyên và kháng nguyên sau bất hoạt kích thích sinh

đáp ứng miễn dịch tốt cho cá, Do vậy, vi rút sau bất hoạt đáp ứng được yêu

cầu làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin.

3.2.4. Xác định các điều kiện tạo vắc-xin bán thành phẩm

3.2.4.1 Kết quả xác định liều lượng kháng nguyên thích hợp và thời gian gây

miễn dịch cho cá.

Vi rút hoại tử thần kinh gây bệnh chủ yếu cho cá mú ở giai đoạn ấu

trùng đến cá giống. Ở giai đoạn này, sử dụng vắc-xin bằng phương pháp

ngâm là một lựa chọn tối ưu vì tính hiệu quả, nhanh chóng, thuận tiện, ít gây

stress cho cá và tiết kiệm. Bên cạnh đó, sử dụng vắc-xin bằng phương pháp

ngâm cũng đã chứng tỏ hiệu quả bảo vệ cho cá trong một khoảng thời gian

đáng kể [57].

Liều lượng kháng nguyên và thời gian gây miễn dịch cần được xác định

để đạt hiệu quả phòng bệnh và tạo đáp ứng miễn dịch tối ưu nhất, liều lượng

kháng nguyên trong vắc-xin và thời gian gây miễn dịch không đủ thì vắc-xin

sẽ không đạt hiệu quả, ngược lại liều lượng kháng nguyên và thời gian gây

miễn dịch vượt quá yêu cầu thì có thể gây trạng thái ức chế miễn dịch khi sử

dụng. Trong nghiên cứu này, cá mú chuột (kích thước 2-2,5cm) được tắm với các hàm lượng kháng nguyên là 10-5TCID50/mL; 10-6TCID50/mL; 10- 7TCID50/mL với liều 1mL/10 cá trong vòng 20 phút, 60 phút và 120 phút, đối

chứng dùng PBS. Sau 1 tuần được gây miễn dịch, cá được thử thách cường

độc với chủng HP02, tiếp tục theo dõi cá trong 30 ngày để xác định tỷ lệ sống

sót. Kết quả được thể hiện trong Hình 3.13.

Hình 3.13. Tỷ lệ sống của cá được gây miễn dịch với các liều kháng

nguyên NNV sau khi thử thách cường độc. Ý nghĩa thống kê được thực hiện

bằng cách so sánh giá trị ở các liều lượng kháng nguyên khác nhau với đối

chứng PBS. Giá trị trung bình của ba xét nghiệm độc lập được hiển thị. Dấu

hoa thị cho biết sự khác biệt có ý nghĩa: (*p ≤ 0,05; ***p < 0,001)

Kết quả Hình 3.13 cho thấy, ở bể đối chứng toàn bộ cá gây nhiễm với

chủng HP02 tử vong. Tỷ lệ sống sót sau 30 ngày của bể cá được ngâm vắc- xin với nồng độ vi rút là 105TCID50/mL đạt 5,5% trong khi tỷ lệ sống của bể cá ngâm vắc-xin với nồng độ vi rút 106TCID50/mL và 107TCID50/mL lần lượt

là 89,5% và 94,5%. Như vậy, liều kháng nguyên tối thiểu trong phối trộn vắc- xin là 106TCID50/mL.

Nghiên cứu của Kai và cộng sự, 2008 đánh giá vắc-xin bất hoạt NNV

bằng binary ethylenimine với các nồng độ kháng nguyên lần lượt 105TCID50/mL; 106TCID50/mL và 107TCID50/mL cho kết quả là tỷ lệ sống của cá tương ứng với nồng độ kháng nguyên 105TCID50/mL, 106TCID50/mL và 107TCID50/mL lần lượt là 7,5%, 87,5% và 95% [111]. Từ kết quả thí

nghiệm, nhóm nghiên cứu đã lựa chọn liều kháng nguyên tối thiểu trong phối

trộn vắc-xin bất hoạt để phòng bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú bằng phương pháp tắm là 106 TCID50/mL.

Hình 3.14. Tỷ lệ sống của cá được gây miễn dịch ở các mức thời gian

khác nhau. Ý nghĩa thống kê được thực hiện bằng cách so sánh giá trị ở các

mốc thời gian lần lượt là 20 phút, 60 phút và 120 phút. Giá trị trung bình của

ba xét nghiệm độc lập được hiển thị. Dấu hoa thị cho biết sự khác biệt có ý

nghĩa: (***p < 0,001)

Kết quả Hình 3.14 cho thấy, thời gian gây miễn dịch bằng phương

pháp ngâm có ảnh hưởng đáng kế đến tỷ lệ bảo hộ của vắc-xin, theo đó, tỷ lệ

sống của cá sau khi thử thách cường độc ở các bể ngâm với vắc-xin trong 20

phút, 60 phút và 120 phút lần lượt là 75%, 95% và 90%. Với kết quả thu

được, thời gian ngâm cá được lựa chọn là 60 phút.

Kết quả của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Kai và cộng sự,

2008 trên ấu trùng cá mú được ngâm vắc-xin bất hoạt binary ethylenimine với nồng độ kháng nguyên là 107TCID50/mL trong 20, 60 và 120 phút có tỷ lệ

sống sót tương ứng lần lượt là 75%, 95% và 88%. Nhóm tác giả cũng đã kết

luận rằng, thời gian sử dụng vắc-xin bằng phương pháp ngâm cho ấu trùng cá

mú thích hợp nhất là 60 phút [111].

3.2.4.2. Kết quả xác định chất bổ trợ vắc-xin.

Đối với vắc-xin bất hoạt chất bổ trợ là thành phần không thể thiếu để

cải thiện hiệu quả và thời gian bảo vệ của vắc-xin [239]. Chất bổ trợ làm tăng

cường đáp ứng miễn dịch thu được [42, 222], nó có thể được phân loại thành

chất hỗ trợ tín hiệu 1 và tín hiệu 2 [79]. Nhũ dầu là chất hỗ trợ tín hiệu 1,

được sử dụng phổ biến nhất, chúng có thể là nhũ dầu toàn phần của Freund

(FCA), nhũ dầu không toàn phần của Freund (FIA) và Montanide [104]. FIA

là nhũ tương dầu-nước (W/O) đã được chứng minh làm tăng hiệu quả của

vắc-xin thông qua kích thích phản ứng tạo kháng thể trong máu và niêm mạc

chống lại Streptococcus agalactiae ở cá rô phi đỏ Oreochromis sp. [67]. Vắc-

xin bất hoạt nhũ dầu FIA đa giá chống lại Edwardsiella tarda và Vibrio

anguillarum ở cá bơn Nhật Bản cho tỷ lệ sống tương đối cao lần lượt là

70,9% và 67,4% [104]. Vắc-xin tiểu đơn vị chống lại S. agalactiae với chất

bổ trợ FIA hoặc Montanide đã được báo cáo cho RPS lần lượt là 76,7% và

74,4% [238]. Các chất hỗ trợ tín hiệu 2 bao gồm các hợp chất nhôm như

nhôm hydroxit và nhôm phosphate có tác dụng hoạt hoá các cytokine trong

giai đoạn nhận diện kháng nguyên, do đó làm tăng cường đáp ứng miễn dịch

trong đối tượng sử dụng vắc-xin và một điều quan trọng chất bổ trợ là muối

nhôm đều an toàn, rất ít gặp tác dụng phụ nghiêm trọng [222]. Với mục đích

nghiên cứu tạo được vắc-xin bất hoạt sử dụng cho cá mú bằng đường ngâm,

các hợp chất nhôm được sử dụng trong nghiên cứu này.

Hai chất bổ trợ gốc nhôm bao gồm aluminum hydroxide (AH) và

aluminum phosphate (AP) được sử dụng để chế tạo vắc-xin, liều kháng nguyên sử dụng là 106,8 PFU/mL, nồng độ chất bổ trợ gốc nhôm là 2%. Các lô

cá được ngâm với dịch vi rút 2 lần, cách nhau 21 ngày, tiếp tục theo dõi cá thí

nghiệm trong 60 ngày để đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hoà của vắc-

xin bán thành phẩm. Kết quả trình bày trong Hình 3.15.

Hình 3.15. So sánh mức độ bảo hộ cá với vắc-xin bất hoạt có chất

bổ trợ khác nhau giữa các nhóm thử nghiệm. Ý nghĩa thống kê được thực hiện

bằng cách so sánh giá trị ở các liều thử thách cường độc TCID50 khác nhau

với liều thử thách cường độc 4xTCID50. Giá trị trung bình của ba xét nghiệm

độc lập được hiển thị. Dấu hoa thị cho biết sự khác biệt có ý nghĩa: (** p ≤

0,01 và *** p ≤ 0,001)

Kết quả Hình 3.15 cho thấy: cá được gây miễn dịch với dịch vi rút

NNV TB05 bất hoạt có bổ sung nhôm hydroxit và nhôm phosphate cho khả

năng bảo hộ cao, với liều vi rút gây thử thách cường độc là 0,2xTCID50,

0,5xTCID50 và 1xTCID50 tất cả các lô thí nghiệm đều có tỷ lệ bảo hộ trên

75%; với liều vi rút thử thách cường độc từ 2-4xTCID50, tỷ lệ bảo hộ giảm

tương đối mạnh, chỉ đạt từ 25,33-63,33% đối với lô cá được gây miễn dịch

với dịch vi rút NNV TB05 bất hoạt bổ sung nhôm hydroxit và 21,33-60% đối

với cá được gây miễn dịch với dịch vi rút NNV TB05 bất hoạt bổ sung nhôm

phosphate.

Vắc-xin sử dụng chất bổ trợ gốc nhôm đầu tiên được điều chế bởi thêm

bazơ vào dung dịch kháng nguyên rồi trộn với nhôm kali sulfat, dẫn đến tạo

kết tủa dạng keo phèn giữa kháng nguyên và muối nhôm [77]. Trong một số

công bố trước đây, phèn chua được coi như là chất bổ trợ nhôm, tuy nhiên,

điều này chưa chính xác, phèn chua là tên gọi chung của dung dịch nhôm kali

sulfat. Quan trọng hơn, phèn chua không được chỉ định là chất bổ trợ gốc

nhôm được sử dụng trong vắc-xin. Vì vậy, vắc-xin keo phèn hiện nay được

chế tạo bằng cách hấp phụ kháng nguyên vào hydroxyde nhôm hoặc nhôm

phosphate dạng gel định hình [93]. Việc sử dụng chất bổ trợ gốc nhôm giúp

tăng cường khả năng tạo đáp ứng miễn dịch của vắc-xin theo các cơ chế: i)

tạo ra các hạt kháng nguyên hòa tan, giúp tăng cường sự hấp thu thông qua

quá trình thực bào bởi các tế bào tua; ii) hướng kháng nguyên đến các tế bào

trình diện kháng nguyên và tăng cường trình diện kháng nguyên bằng sự biểu

hiện gia tăng phức hợp MHC II-peptid, tăng kích hoạt tế bào lympho T và

CD4; iii) giữ lại kháng nguyên tại vị trí tiêm, cho phép có thời gian thu hút

các tế bào trình diện kháng nguyên thông qua giải phóng các cytokine và gây

ra tình trạng viêm cục bộ. Bên cạnh đó, nhôm hydroxyd gây hoạt hóa dòng

thác bổ thể, giải phóng C3a và C5a. Hai lớp bổ thể này làm tăng cường sự thu

hút các tế bào bạch cầu vào vị trí tiêm. Sự tăng cường hoạt hóa bổ thể gây ra

bởi nhôm hydroxyde là cơ sở cho tác dụng tăng cường miễn dịch của vắc-xin.

Từ kết quả thu được cũng như các phân tích ở trên, nhôm hydroxit làm

chất bổ trợ vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú.

Sơ đồ quy trình sản xuất vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần

kinh cho cá mú.

3.3. Xây dựng quy trình kiểm tra chất lượng vắc-xin

Vắc-xin được tạo ra dạng hấp phụ nhôm. Kết quả pha bán thành phẩm

cuối cùng của các loạt vắc-xin sản xuất thử nghiệm được trình bày trong Bảng

3.18. Bán thành phẩm được chia vào các lọ, mỗi lọ vắc-xin vô hoạt chứa 300

liều đơn sau khi hồi chỉnh. Các lô vắc-xin thành phẩm của các loạt thử

nghiệm được kiểm tra để đánh giá chất lượng như sau.

Bảng 3.18. Các chỉ tiêu kiểm nghiệm vắc-xin

Chỉ tiêu Tiêu chuẩn Tham khảo

Vật lý pH= 7; dịch vắc-xin

đồng nhất, không tách

lớp sau khi ly tâm 1500

vòng/phút

Vô khuẩn Không ph́ át hiện thấy [Phụ lục 6]

nấm và vi khuẩn sau 14

ngày theo dõi

An toàn 100% động vật thí [Phụ lục 6]

nghiệm

Hiệu lực RPS >75% [Phụ lục 6]

3.3.1. Đánh giá tiêu chuẩn vật lý.

Sự thay đổi tính chất vật lý của vắc-xin sẽ có ảnh hưởng rất lớn đến

chất lượng của vắc-xin như: giảm hiệu lực của vắc-xin hay mất hoàn toàn,

tăng phản ứng phụ sau khi dùng vắc-xin, độ dài miễn dịch ngắn lại...

Bảng 3.19. Kết quả kiểm tra tiêu chuẩn vật lý của vắc-xin Lô sản xuất

Vắc-xin bất hoạt

pH=7 7,0

170520

7,0

290520

6,9

030620

7,0

250620

Độ đồng nhất Không có sự tách lớp (Đạt) Không có sự tách lớp (Đạt) Không có sự tách lớp (Đạt) Không có sự tách lớp (Đạt)

Kết quả kiểm tra tiêu chuẩn vật lý của vắc-xin thành phẩm cho thấy các

lô sản xuất khác nhau có độ ổn định pH, vắc-xin đồng nhất sau quá trình nhũ

hóa và không có hiện tượng tách lớp.

3.3.2. Đánh giá tiêu chuẩn vô trùng của vắc-xin

Mục đích của kiểm tra vô trùng là phát hiện và loại bỏ các mẫu vắc-xin bị

tạp nhiễm (vi khuẩn hoặc nấm), nhằm đảm bảo vắc-xin khi sử dụng an toàn.

Thực hiện theo TCVN 8684:2011 “Vắc-xin và chế phẩm sinh học dùng

trong thú y-phép thử độ thuần khiết” (phụ lục 6). Mỗi lô vắc-xin được lấy ngẫu nhiên 3 lọ. Đặt vắc-xin trong tủ ấm 370C trong 1 giờ, lắc kỹ sau đó trộn

đều 3 lọ vắc-xin vào làm một. Dùng pipet hút vắc-xin và cấy vào các môi

trường kiểm tra với lượng 0,2 ml/ống với môi trường thử nghiệm là lỏng và

0,2 mL/đĩa với môi trường rắn

Kết quả kiểm tra tiêu chuẩn vô trùng trong Bảng 3.20 và Hình 3.16

Bảng 3.20. Kết quả kiểm tra tiêu chuẩn vô trùng của vắc-xin

Môi trường đánh giá

Kết luận

Nước thịt

Thạch máu

Thạch Saboroud

Thạch XLD

Lần kiểm tra

Lô vắc- xin

PPLO (pleuro pneumonia- like organism

Âm tính Âm tính

Âm tính

Đạt

Lô 1

Âm tính

Âm tính Âm tính

Âm tính

Đạt

Lô 2

Âm tính

Âm tính Âm tính

Âm tính

Đạt

Lô 3

Âm tính

Đối

Âm tính Âm tính

Âm tính

chứng

Hình 3.16. Kết quả kiểm tra độ vô trùng của vắc-xin

Kiểm tra sau khi nuôi cấy 7 ngày ở nhiệt độ 370C đối với môi trường

là: canh thịt, thạch máu và môi trường XLD (Xyloza Lysin Deoxycholat) và PPLO (pleuro pneumonia-like organism và 14 ngày ở nhiệt độ 250C đối với

môi trường thạch nấm. Kết quả cho thấy cả 3 lô vắc-xin khi cấy vào các môi

trường kiểm tra không phát hiện được bất kỳ vi sinh vật nào phát triển trên

các môi trường đánh giá.

3.3.3. Đánh giá mức độ an toàn của vắc-xin

Đánh giá mức độ an toàn của vắc-xin nhằm đảm bảo vắc-xin khi đưa

vào sử dụng không gây bệnh hoặc không gây hại cho động vật sử dụng. Thực

hiện đánh giá tính an toàn vắc-xin bất hoạt như miêu tả phần phương pháp.

Kết quả thể hiện trong Bảng 3.21.

Bảng 3.21. Xác định mức độ an toàn của vắc-xin

STT

Biểu hiện lâm sàng

Loại vắc-xin

Tỷ lệ chết (%)

Tỷ lệ sống (%)

NNV TB05 + AH

NNV TB05 + AP

Hai ngày đầu sau khi xử lý vắc- xin cá ăn kém, bơi lội chậm chạp. Các ngày tiếp theo biểu hiện bình thường. Tăng trưởng của cá không thay đổi so với lô đối chứng âm Hai ngày đầu sau khi xử lý vắc- xin cá ăn kém, bơi lội chậm chạp. Các ngày tiếp theo biểu hiện bình thường. Tăng trưởng của cá không thay đổi so với lô đối chứng âm

Các hoạt động sinh lý và biểu hiện lâm sàng bình thường

Đối chứng âm (không sử dụng vắc-xin hoặc chất bổ trợ) Nhìn chung, các lô cá sử dụng vắc-xin có chất bổ trợ đều có biểu hiện

giảm ăn, phản xạ bơi lội kém trong hai ngày đầu xử lý vắc-xin. Tuy nhiên các

ngày sau đó, hoạt động sinh lý của cá trở lại bình thường. Kết quả này chứng

tỏ, vắc-xin an toàn đối với cá thí nghiệm.

Vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh lây nhiễm cho cá qua các tế bào biểu

mô của đường tiêu hóa, hoặc qua các sợi trục thần kinh trên bề mặt da và hệ

thống tuần hoàn máu. Ở ấu trùng nhiễm bệnh tự nhiên, vi rút có thể được phát

hiện trong các tế bào biểu mô da, biểu mô ruột và tế bào thần kinh của hệ thần

kinh trung ương ngay trong giai đoạn đầu của quá trình lây nhiễm. Tổn

thương do vi rút hoại tử thần kinh ban đầu thường ở cột sống, sau đó tổn

thương đến não và võng mạc [124]. Trong các mô não và mắt, các tế bào bị

hoại tử để lại những không bào, những thay đổi bệnh lý này có thể được sử

dụng làm chỉ số cho thấy cá mú bị nhiễm vi rút hoại tử thần kinh [211].

Nghiên cứu của Roberts (2008) cho biết, trong một số cơ quan lympho của cá

bị nhiễm vi rút hoại tử thần kinh xuất hiện các trung tâm đại thực bào sắc tố

(melanomacrophage-MMC), sự xuất hiện và gia tăng các MMC là dấu hiệu

cho thấy phản ứng bảo vệ của cơ thể đối với vật chất lạ ở cá.

Với các phân tích ở trên, trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện

kiểm tra biến đổi vi thể của các mô não và võng mạc của cá sử dụng vắc-xin

và cá được gây nhiễm với chủng NNV TB05. Kết quả thu được như sau:

những con cá được gây nhiễm với chủng NNV TB05 có xuất hiện không bào

và các trung tâm đại thực bào sắc tố trong não và võng mạc (Hình 3.17 B, D),

cá tiêm vắc-xin không xuất hiện các tổn thương này (Hình 3.17 A, C).

Hình 3.17. Mô não và võng mạc cá nhuộm hematoxylin và eosin

A: Mô não cá sử dụng vắc-xin 21 ngày, B: Mô não cá gây nhiễm với chủng

NNV TB05, C: Mô võng mạc xá sử dụng vắc-xin 21 ngày, D: Mô võng mạc

cá gây nhiễm với chủng NNV TB05

Các nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng, ở cá nhiễm bệnh hoại tử

thần kinh, mặc dù vi rút hoại tử thần kinh cũng được phát hiện trong mang,

ruột, dạ dày, lá lách, gan, thận, môn vị, cơ xương, tế bào máu và vây, nhưng

các đặc điểm bệnh lý đặc trưng do vi rút hoại tử thần kinh gây ra ở cá là sự

hình thành không bào ở não và võng mạc [29,154]. Trong nghiên cứu hiện tại,

theo kết quả kiểm tra mô học não, mắt của cá, chúng tôi nhận thấy NNV

TB05 phá hủy nghiêm trọng não và mắt cá với các không bào được hình

thành dày đặc trong các mô kiểm tra, đặc điểm bệnh tích này phù hợp với đặc

điểm bệnh lý của vi rút hoại tử thần kinh đã được báo cáo. Trong khi đó, cá

được gây miễn dịch với vắc-xin sử dụng chủng NNV TB05 bất hoạt không

gây bệnh tích trong các mô não và mắt. Kết quả của nghiên cứu này có thể

khẳng định, vắc-xin bất hoạt keo phèn do chúng tôi nghiên cứu chế tạo là

hoàn toàn an toàn với cá thí nghiệm.

3.3.4. Đánh giá độ dài miễn dịch của vắc-xin bán thành phẩm

Trong nghiên cứu này, vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh ở

cá mú được sản xuất dưới dạng keo phèn, hấp phụ nhôm hydroxit. Cá sử dụng

vắc-xin sẽ được theo dõi trong 6 tháng, định kỳ hàng tháng kiểm tra các tế

bào có chức năng miễn dịch, đồng thời tách riêng 20 cá đã sử dụng vắc-xin để

thử thách cường độc với chủng NNV HP02, liều 1xTCID50 để đánh giá khả

năng bảo hộ của vắc-xin đối với cá thí nghiệm thông qua tỷ lệ cá được bảo hộ

sau khi thử thách cường độc.

Các tế bào có chức năng miễn dịch ở cá được sản sinh ra từ các mô

lympho trung ương như thận, tuyến ức, lách và các mô lympho ở niêm mạc

ruột, chúng bao gồm các tế hồng cầu, bạch cầu hạt, bạch cầu đơn nhân, tế bào

lympho, tế bào mast và tế bào huyết khối [47, 68, 147]. Quá trình tạo máu

được kiểm soát bởi các cytokine hoạt động trên các thụ thể tế bào đa năng,

việc đánh giá các thông số huyết học có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu

về tình trạng thể chất và tình trạng nhiễm bệnh của cá [84]. Nhìn chung, các tế

bào bạch cầu ở cá đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh hệ thống

miễn dịch bẩm sinh, với chức năng thực bào, chúng có khả năng tiêu diệt tác

nhân bệnh rất hiệu quả [47]. Trong số các tế bào có chức năng miễn dịch của

cá, tế bào tiểu cầu có khả năng thực bào bên cạnh chức năng đông máu [206];

bạch cầu đơn nhân có chức năng thực bào và gây độc không đặc hiệu [53];

bạch cầu trung tính được tìm thấy trong máu, các mô lympho và khoang phúc

mạc có thể thực bào các phần tử hoặc tế bào lạ và tạo ra các anion superoxide

là một hợp chất diệt khuẩn; bạch cầu ái toan được phân bố ở các mô liên kết,

đặc biệt là trong đường tiêu hóa, mang và hệ tuần hoàn, chúng có vai trò quan

trọng trong đáp ứng miễn dịch với ký sinh trùng; tế bào bạch cầu hạt đặc biệt

là các tế bào bạch cầu đa nhân được tìm thấy trong máu cá bị nhiễm ký sinh

trùng nhưng chức năng chính xác của chúng vẫn chưa được biết rõ.

Trong nghiên cứu này, để đánh giá hiệu quả của vắc-xin trong việc kích

thích đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu, chúng tôi theo dõi các chỉ tiêu; số

lượng hồng cầu tổng số, bạch cầu tổng số, bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn

nhân, tiểu cầu. Kết quả theo dõi được trình bày trong Bảng 3.22.

Bảng 3.22. Kết quả theo dõi các tế bào có chức năng miễn dịch ở cá

thử nghiệm vắc-xin

Chỉ tiêu theo dõi

Tháng thứ 2

Tháng thứ 6

Tháng thứ 3

Tháng thứ 4

Tháng thứ 5

Bố trí thí nghiệm

2.639,00 2.598,40 2.208,64 2.186,55 2.142,82

118,16

116,98

95,92

92,08

91,16

Lô thử nghiệm vắc-xin

82,48

78,36

75,22

74,47

72,24

Số lượng hồng (x103 tế cầu bào/mL máu) Tổng số bạch (x103 tế cầu bào/mL máu) Lympho (x103 tế bào/mL máu)

2,82

2,54

2,36

2,29

2,27

3,35

3,22

2,96

2,84

2,78

21,19

19,07

17,16

16,65

16,31

2.030,00 2.036,09 2.038,13 2.038,11 2.036,07

90,89

90,80

90,62

90,67

90,80

71,72

71,58

71,65

71,60

Lô đối chứng

2,31

2,32

2,68

2,69

2,68

2,69

16,05

16,19

16,21

16,22

16,19

Bạch cầu trung (x103 tế tính bào/mL máu) Bạch cầu đơn (x103 tế nhân bào/mL máu) Tiểu cầu (x103 tế bào/mL máu) Số lượng hồng cầu/mL máu (x103 tế bào/mL máu) Tổng số bạch cầu/mL máu (x103 tế bào/mL máu) Lympho (x103 tế bào/mL máu) Bạch cầu trung (x103 tính tế bào/mL máu) Bạch cầu đơn (x103 nhân tế bào/mL máu) Tiểu cầu (x103 tế bào/mL máu)

Số liệu trong Bảng 3.22 cho thấy, các chỉ số công thức máu ở lô cá sử

dụng vắc-xin cao hơn đáng kể so với lô đối chứng trong suốt 6 tháng theo

dõi, kết quả này chứng tỏ, vắc-xin đã kích thích cơ quan tạo máu sản sinh,

biệt hóa các tế bào có chức năng miễn dịch.

Theo Hibiya và cộng sự, 1982, mô máu của cá rất dễ bị tổn thương

bởi mầm bệnh và các yếu tố stress của môi trường, trong các trường hợp cá

bị bệnh, đặc biệt là các bệnh gây biến đổi chức năng của thận sẽ làm giảm

mạnh các bạch cầu và đại thực bào và lympho. Theo nghiên cứu của Ranzani

và cộng sự, 2004, số lượng tiểu cầu cũng giảm nhanh khi có sự xuất hiện của

vi khuẩn trong các tổ chức. Sự biến động của các tế bào có chức năng miễn

100

dịch của cá, có ảnh hưởng đáng kể đến tình trạng sức khỏe của cá, những

thay đổi theo xu hướng tăng lên của những thông số này biểu thị sự tăng

cường đáp ứng miễn dịch không đặc của cá đối với tác nhân nhiễm trùng.

Cùng với nghiên cứu làm rõ khả năng tăng cường đáp ứng miễn dịch

không đặc hiệu ở cá sử dụng vắc-xin, đáp ứng miễn dịch đặc hiệu được đánh

giá thông qua khả năng hình thành kháng thể bảo hộ, kết quả được trình bày ở

Hình 3.18; Phụ lục 5.

Hình 3.18. Tỷ lệ sống của cá ở các lô thử nghiệm vắc-xin. Tỷ lệ sống

sót được so sánh giữa các nhóm sử dụng thử nghiệm. Dấu hoa thị biểu hiện sự

khác biệt thống kê giữa các nhóm trong cùng một thời điểm theo thử nghiệm.

Dấu hoa thị cho biết sự khác biệt có ý nghĩa: (** p ≤ 0,01 và *** p ≤ 0,001)

Sau 6 tháng theo dõi, lô đối chứng âm sử dụng giả dược là dung dịch

nhôm hydroxit không có kháng nguyên bất hoạt có tỷ lệ sống đạt 70,9%. Ở lô

đối chứng dương, với liều gây nhiễm từ 1xTCID50 của chủng dại NNV TB05

101

trong 2-3 tháng đầu, tỷ lệ cá chết được gây nhiễm bằng chủng dại NNV TB05

tương ứng và 96,3% và 95,8%, từ tháng 4-6 tỷ lệ sống tương đối của cá tăng

lên tương ứng là 9,7%, 14,2% và 21,9%. Đối với lô cá sử dụng vắc-xin, tỷ lệ

sống tương đối của cá sau khi thử thách cường độc với chủng NNV HP02

giảm dần theo tháng, cụ thể, ở tháng thứ 2 tỷ lệ sống tương đối đạt 79,3%,

tháng thứ 3 đạt 75,8%, tháng thứ 4 đạt 63,1%, tháng thứ 5 đạt 51,1%, tháng

thứ 6 đạt 41,6%. Kết quả thí nghiệm chứng tỏ rằng vắc-xin đã kích thích tạo

kháng thể bảo hộ ở cá thí nghiệm, tuy nhiên, lượng kháng thể giảm dần qua

thời gian theo dõi.

Trong thực tế, cá mú nuôi thương phẩm thường được thu hoạch từ

tháng thứ 5-7, khi cá đạt khối lượng khoảng 0,5kg, đây là lý do chúng tôi thực

hiện nghiên cứu xác định độ dài miễn dịch của vắc-xin trong vòng 6 tháng.

Theo Bovo và cộng sự, 2008, Betanodavirus gây bệnh cho nhiều loài cá khác

nhau, bao gồm các loài cá nước mặn như cá đù đỏ (Sciaenops ocellatus), cá

bớp (Rachycentron canadum), cá vược (Dicentrachus labrax), cá chẽm (Lates

calcarifer), cá tráp (Sparus aurata), cá ngừ vây xanh Thái Bình Dương

(Thunnus directionalis), các loài cá mú khác nhau (Họ Serranidae), và nhiều

loài cá dẹt khác nhau, bao gồm cá bơn (Hippoglossus hippoglossus) và cá bơn

Nhật Bản (Paralichthys oliveatus). Đối với cá nước ngọt, NNV gây bệnh cá

rô phi (Oreochromis niloticus) [30] và cá bảy màu (Poecilia reticulata) [90].

Trên các đối tượng cá khác nhau, NNV gây phá hủy hệ thần kinh trung ương

và ảnh hưởng nghiêm trọng đến các giai đoạn cá còn non (ấu trùng, cá bột, cá

giống), tỷ lệ thất thoát dao động từ 15–100%, cá lớn hơn cũng có thể bị ảnh

hưởng bởi vi rút. Kết quả trong Hình 3.18 cũng cho thấy, ở giai đoạn 6 tháng

tuổi, tỷ lệ chết sau khi gây nhiễm với chủng NNV HP02 giảm đáng kể so với

tháng thứ 3 và 4, điều này chứng tỏ, ở giai đoạn trưởng thành, mức độ mẫn

cảm của cá với vi rút giảm đi. Theo quy định tại Thông tư số 10/2018/TT-

102

BNNPTNT ngày 14 tháng 8 năm 2018 về việc ban hành quy chuẩn kỹ thuật

quốc gia thuốc thú y - yêu cầu chung, yêu cầu đối với vắc-xin thủy sản là 60%

mẫu huyết thanh của lô động vật thủy sản dùng vắc-xin có hiệu giá kháng thể

đạt ngưỡng bảo hộ và 80% mẫu huyết thanh của lô động vật thủy sản không

dùng vắc-xin âm tính, như vậy, kết quả thể hiện trong Hình 3.18 cho thấy, sau

tháng thứ 3, tỷ lệ bảo hộ của vắc-xin đối với cá mú là 75,8%, tháng thứ 4 là

63,1%, tháng thứ 5 là 51,1%, kết quả này cho thấy, để vắc-xin có hiệu quả

theo quy định, cần thực hiện tiêm nhắc lại sau tháng thứ 3.

103

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

- Lựa chọn được chủng vi rút TB05 làm chủng giống gốc và đạt được tiêu chí sản xuất vắc-xin như: độc lực cao trên tế bào (106,8 TCID50/mL) và trên cá (107,5 LD50/mL), chủng giống gốc độ thuần khiết 100%, an toàn 100%

và ổn định nhân nuôi trên tế bào cũng như ổn định về mặt di truyền sau 10 đời

cấy chuyển.

- Đã nghiên cứu thành công vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần

kinh cho cá mú với đầy đủ thông số tối ưu như: +) Lựa chọn được điều kiện

nuôi cấy tế bào (môi trường L-15 + 10% FBS, pH 7,0-7,4); +) Điều kiện gây

nhiễm vi rút vào tế bào GS01 với liều gây nhiễm MOI 0,01 cho hiệu giá vi rút

cao nhất tại thời điểm 5 ngày sau nhân nuôi; +) Hóa chất β-propiolactone

nồng độ 0,1% được lựa chọn để bất hoạt vi rút; +) Vắc-xin bán thành phẩm

được phối trộn với nhôm hydroxit với liều kháng nguyên tối thiểu là 106TCID50/mL.

- Vắc-xin đạt tiêu chuẩn về: Tính ổn định, vô trùng, an toàn 100% và tỷ

lệ bảo hộ đạt 75,8% cho cá sau 3 tháng.

KIẾN NGHỊ

Tiếp tục nghiên cứu điều kiện, thời gian bảo quản vắc-xin và đánh giá

tính an toàn, hiệu lực bảo hộ của vắc-xin ở ngoài thực địa sau các thời gian

bảo quản, tiến đến có thể sản xuất ở quy mô công nghiệp nhằm đưa vắc-xin

vào phòng bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú tại Việt Nam.

104

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN

ĐỀ TÀI LUẬN ÁN TIẾN SĨ

1. Mẫn Hồng Phước, Phạm Thị Tâm, Đồng Văn Quyền, Nguyễn Thị

Thu Hiền, Nguyễn Mạnh Hùng (2018), “Phân lập và xác định đặc tính của vi

rút gây bệnh hoại tử thần kinh NNV (Nervous necrosis virus) ở cá mú

(Epinephelus sp.) tại miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển

nông thôn, số 15, tr.87-93.

2. Mẫn Hồng Phước, Phạm Thị Tâm, Đồng Văn Quyền, Vũ Thị Bích

Huyền, Lê Minh Hải (2022), “Nghiên cứu tạo vắc-xin bất hoạt phòng bệnh

hoại tử thần kinh trên cá mú (Epinephelus sp.) quy mô phòng thí nghiệm”,

Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, số 6, kỳ 2, tr. 66-71.

105

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

Nguyễn Ngọc Du, Lê Hữu Tài, Cao Thành Trung, Phạm Võ Ngọc Ánh,

Trương Hồng Việt, (2005), “Bệnh thường gặp trên cá mú nuôi tại Vũng

Tàu”, Hội thảo quốc gia về Phát triển thủy sản vùng hạ lưu sông Mekong,

trang 529-534.

Nguyễn Văn Hảo, Nguyễn Mạnh Thắng, (2008), “Vacxin phòng bệnh đốm

trắng trên cá tra, triển vọng và ứng dụng”, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy

sản II, Công ty NAVETCO 23/06/2008.

Đỗ Thị Hoà, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, (2004),

“Bệnh học thuỷ sản”, NXB Nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh.

Trần Vĩ Hích, Phạm Thị Duyên, (2008), “Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển

nuôi ở Khánh Hoà”, Đại học Nha Trang.

Võ Văn Quang, Trần Thị Lê Vân, Trần Quang Thịnh, (2013) , “Thành phần

loài và hiện trạng khai thác cá mú giống ở vịnh Quy Nhơn, Bình Định”, Tạp

chí Khoa học và Công nghệ Biển, tập 13, số 3, tr 241–247.

Phạm Thị Tâm, Phạm Công Hoạt, Trần Thế Mưu, Nguyễn Quang Linh,

Nguyễn Thị Thanh, (2015), “Nghiên cứu phương pháp phát hiện vi rút gây

bệnh và sản xuất vắc –xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú nuôi công

nghiệp”, Báo cáo tổng kết đề tài KC 04.03/11- 15

Bùi Quang Tề, Lê Xuân Thành, Nguyễn Thị Biên Thùy, (2006), “Kết quả

nghiên cứu vắc-xin phòng bệnh xuất huyết hoại tử nội tạng (đốm trắng) cho

cá tra và ba sa”, Báo cáo tổng kết đề tài KC-06-20-NN, Viện nghiên cứu

Nuôi trồng Thủy sản I.

Vũ Dũng Tiến, Đỗ Ngọc Liên, Lại Văn Hùng, Ngô Văn Quang, (2003), “Kết

quả ban đầu điều chế thử vắc-xin phòng bệnh đốm đỏ ở cá trắm cỏ

Ctenopharyngodon idellus”, Tuyển tập báo cáo khoa học về nuôi trồng thủy

sản, NXB Nông Nghiệp Hà Nội, trang 465 – 469.

106

Nguyễn Thị Thanh Thùy, Nguyễn Hữu Dũng, Wergeland H.I., (2012),

"Thành phần protein và độc tính của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây

bệnh lở loét trên cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) nuôi thương phẩm

tại Khánh Hòa", Tạp chí khoa học - Công nghệ thủy sản, 4/2012, tr. 180-184.

10.

Lê Anh Tuấn, (2004), “Tình hình nuôi cá mú ở Việt Nam: hiện trạng và trở ngại về

mặt kỹ thuật”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Thủy sản, trang 174–179.

11. Phan Thị Vân, Bùi Ngọc Thanh, (2004), “Những dấu hiệu mô bệnh học VNN

trên cá song chấm nâu Epinephelus coioides tại Hải Phòng và Nghệ An”,

Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I.

12.

Phan Thị Vân, Nguyễn Thị Hường, Nguyễn Thị Hạnh, Võ Anh Tú, (2013),

"Đánh giá kháng nguyên và tác dụng của nhũ dầu lên tính kháng nguyên của

vi khuẩn bất hoạt Vibrio alginolyticus, Vibrio paramaemolyticus, Vibrio

haveyi trên cá Giò (Rachycentron canadum) nuôi tại Việt Nam", Tạp chí

nông nghiệp và phát triển nông thôn, 13/2013, tr. 153-158.

Tài liệu tiếng anh

13. Adams A., (2019), “Progress, challenges and opportunities in fish vaccine

development”, Fish & Shellfish Immunology, 90, pp. 210-224.

14. Adamek M., Matras M., Rebl A., Stachnik M., Falco A., Bauer J., (2022),

“Don’t let it get under your skin vaccination protects the skin barrier of

common carp from disruption caused by cyprinid herpesvirus 3”, Front

Immunol, 13:787021.

15. Afsharipour E., Zorriehzahra M.J., Takami G.A., Kakoolaki S., Motallebi

A.A., Sharifpour I., (2021), “An investigation on protective effects of the

new killed vaccine against nervous necrosis virus

(NNV) using

histopathology and immunohistochemistry approach on the brain and eye

tissues of acipenser stellatus pallas 1771”, Fish & Shellfish Immunology,

116, pp. 91–97.

16. Aida V., Pliasas V.C., Neasham P.J., North J.F., Mcwhorter K.L., Glover

S.R., Kyriakis, C.S, (2021), “Novel Vaccine Technologies in Veterinary

107

Medicine: A Herald to Human Medicine Vaccines”, Frontiers in Veterinary

Science, 8, 654289.

17. Akazawa N., Alvial A., Blanc P.P., Miguel Burgos J., W. Chamberlain G.,

Forster J., Tung H., Ibarra R., Khoa L.V., Kibenge F., V. Lightner D., Hao

N.V., Lussian Nikuli H., Omar I., Ralaimarindaza L., Bondad-Reantaso M.,

St-Hilaire S., Dick Towner R., Loc T.H., Villarreal M., (2016), Reducing

disease risk in aquaculture Word bank Report number 88257-GLB, 119 pp.

18. Aksnes I., Braaen S., Markussen T., Akesson C.P., Villoing S., Rimstad E.,

(2021), “Genetically modified attenuated salmonid alphavirus: A potential

strategy for immunization of Atlantic salmon”, Journal of Fish Diseases, 44,

pp. 923–937.

19. Aly S.M., Eissa A.E., ElBanna N.I., Albutti A., (2021), “Efficiency of

monovalent and polyvalent Vibrio alginolyticus and Vibrio parahaemolyticus

vaccines on the immune response and protection in gilthead sea bream,

Sparus aurata (L.) against vibriosis”, Fish & Shellfish Immunology, 111, pp.

145–151.

20. Angsujinda K., Timothy J.M,, Duncan R.S., Jes K., Wanchai A., (2020),

“Expression profile of selected genes of the E-11 cell line in response to red-

spotted grouper nervous necrosis virus infection”, Aquaculture Reports,

Volume 18, 100468.

21. Athanassopoulou F., Billinis C., Prapas T., (2004), “Important disease

conditions of newly cultured species in intensive freshwater farms in Greece:

First incidence of Nodavirus infection in Acipenser sp”, Diseases of Aquatic

Organisms, 60, pp. 247-252.

22. Arimoto M., Mori K., Nakai T., Muroga K., Furusawa I., (1993), “Pathogenicity

of the causitive agent of viral nervous necrosis disease in striped jack,

Pseudocaranx dentex”, Journal of Fish Diseases, 16, pp. 461–469.

23. Arimoto M., Sato J., Maruya K., Mimura G., Furusawa I., (1996), “Effect of

chemical and physical treatments on the inactivation of striped jack nervous

necrosis virus (SJVNN)”, Aquaculture, 143, pp. 15–22.

108

24. Assefa A., Abunna F., (2018), “Maintenance of fish health in aquaculture:

review of epidemiological approaches for prevention and control of

infectious disease of fish”, Vet Med Int, 2018, pp. 1-10.

25. Awadasseid A., Wu Y., Tanaka Y., Zhang W., (2021),” Current advances in

the development of SARS-CoV-2 vaccines”, Int. J. Biol. Sci, 17, pp. 8–19.

26. Azad I., Shekhar M., Thirunavukkarasu A., Poornima M., Kailasam M.,

Rajan J., (2005), “Nodavirus infection causes mortalities in hatchery

produced larvae of Lates calcarifer”, First report from India. Diseases of

Aquatic Organisms, 63, pp. 113–118.

27. Bahnemann H.G., (1990), “Inactivation of viral antigens for vaccine

preparation with particular

reference

the application of binary

ethylenimine”, Vaccine, 8(4), pp. 299-303.

28. Bairoch A., (2018), “The Cellosaurus, a Cell-Line Knowledge Resource”, J

Biomol Tech, 29(2), pp. 25-38.

29. Bandín I., Souto S., (2020), “Betanodavirus and VER Disease: A 30-year

Research Review”, Pathogens, 9, 106.

30. Bigarré L., Cabon J., Baud M., Heimann M., Body A., Lieffrig F., (2009),

“Outbreak of Betanodavirus infection in tilapia, Oreochromis niloticus (L.), in

fresh water”, JouARNl of Fish Diseases, 32, pp. 667-673.

31. Binesh C., (2013), “Mortality due

to viral nervous necrosis

zebrafish Danio rerio and goldfish Carassius auratus”, Diseases of Aquatic

Organisms, 104, pp. 257-260.

32. Bitchava K., Chassalevris T., Lampou E., Athanassopoulou F., Economou

V., Dovas C.I. (2019), “Occurrence and molecular characterization of

Betanodavirus

fish and

invertebrates of

the Greek

territorial

waters”, Journal of Fish Diseases, 42, pp. 1773–1783.

33. Bly J.E., Clem L.W., (1992), “Temperature and teleost immune functions”,

Fish & Shellfish Immunology, 2, pp. 159–171.

34. Bols Niels C., Phuc H Pham, Dayeh Vivian R., Lee Lucy E.J., (2017),

“Invitromatics, invitrome, and invitroomics: introduction of three new terms

109

for in vitro biology and illustration of their use with the cell lines from

rainbow trout”, In Vitro Cell Dev Biol Anim, 53(5), pp. 383-405.

35. Boltaña S., Rohera N., Goetz F.W. and Mackenzie S.A., (2011), “PAMPs,

PRRs and the genomics of gram negative bacterial recognition in fish”, Dev

Comp Immunol, 35, pp. 1195-1203.

36. Boudarkov V.A., Sereda A.D., Carpov O.N., Ponomarev V.N., (2016),

“Using gamma rays to inactivate African swine fever virus”, Russ Agric Sci,

42, pp. 375–7.

37. Boukedjouta R., Pretto, T., Abbadi M., Biasini L., Toffan A., Mezali K., (2020),

“Viral encephalopathy and

retinopathy

is endemic

in wild groupers

(genus Epinephelus spp.) of the Algerian coast”, Journal of Fish Diseases, 43, pp.

801–812.

38. Bullock L.H. and Smith G.B., (1991), “Seabasses (Pisces: Serranidae)”,

Memoirs of the Hourglass Cruises 8(2): 1-243.

39. Breuil G., Pepin JF., Castric J., Fauvel C., Thiery R., (2000), “Detection of

serum antibodies against Nodavirus in wind and farmed adult sea bass:

application to the screening of brood stock in sea bass hatcheries”, Bull. Eur:

Assoc. Fish Pathol, 20, pp. 95–100.

40. Brian M., Hillar K., (1996), “Virology Methods Manual 1st Edition”,

Academic Press, page 374.

41. Brown F., (1995), “Vaccination today and tomorrow”, Biosci Rep, 15(6), pp.

493-502.

42. Brudeseth B.E., Wiulsrød R., Fredriksen B.N., Lindmo K., Løkling K.E.,

Bordevik M., Steine N., Klevan A., Gravningen K.,(2013), “Status and

future perspectives of vaccines for industrialized fin-fish farming”, Fish &

Shellfish Immunology, Volume 35, Issue 6, Pages 1759-1768.

43. Cascarano M.C., Stavrakidis-Zachou O., Mladineo I., Thompson K.D.,

Papandroulakis N., Katharios P., (2021), “Mediterranean Aquaculture in a

110

Changing Climate: Temperature Effects on Pathogens and Diseases of Three

Farmed Fish Species”, Pathogens, 10, pp. 1205.

44. Chauvet C., (1988), “Etude de la croissance du me´rou Epinephelus guaza

des coˇtes tunisiennes”, Aquat Living Resour, 1, pp. 277–288.

45. Chaves-Pozo E., Bandín I., Olveira J.G., Esteve-Codina A., Gómez-Garrido

J., Dabad M., Alioto T., Ángeles Esteban M., Cuesta A., (2019), “European

sea bass brain DLB-1 cell line is susceptible to Nodavirus: A transcriptomic

study”, Fish & Shellfish Immunology, 86, pp. 14–24.

46. Chen J., Xiao L., Peng C., Ye Z., Wang D., Yang Y., Zhang H., Zhao M., Li

S., Lin H., Zhang Y., (2019), “Socially controlled male-to-female sex

reversal in the protogynous orange-spotted grouper, Epinephelus coioides”,

Journal of Fish Biology, 94 (3), pp. 414-421.

47. Chettri J.K., Raida M.K., Andersen L.H., Kania P.W. and Buchmann K.,

(2011), “PAMP induced expression of immune relevant genes in head kidney

leukocytes of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)”, Dev Comp Immunol,

35, pp. 476-482.

48. Cherif N., Fatma A., (2017), “Nodavirus in wild fish population collected

around aquaculture cage sites from coastal areas of Tunisia”, Fish. Aquac. J.,

8, pp. 2–7.

49. Chinabut S., Limsuwan C., Kitsawat P., (1991), “Histology of the Walking

Catfish Clarias Batrachus). 96pp.

50. Chukwu-Osazuwa J., Cao T., Vasquez I., Gnanagobal H., Hossain A.,

Machimbirike V.I.,

(2022), “Comparative

reverse vaccinology of

piscirickettsia salmonis, aeromonas salmonicida, yersinia ruckeri, Vibrio

anguillarum and moritella viscosa, frequent pathogens of Atlantic salmon

and lumpfish aquaculture”, Vaccines, 10:473

51. Colin P.L., (1992), “Reproduction of the Nassau grouper, Epinephelus

striatus (Pisces: Serranidae) with relationship to environmental conditions”,

Env. Biol. Fish, 34, pp. 357-377.

111

52. Costa J.Z., Thompson K.D. (2016), “Understanding the interaction between

Betanodavirus and its host for the development of prophylactic measures for viral

encephalopathy and retinopathy”, Fish Shellfish Immunol, 53, pp. 35–49.

53. Cuesta A., Angeles Esteban M., Meseguer J., (1999), “Natural cytotoxic activity

of gilthead seabream (Sparus aurata L.) leucocytes assessment by flow cytometry

and microscopy”, Vet Immunology Immunopath 71: pp. 161-171.

54. Cuesta A., Vargas-Chacoff L., García-López A., Arjona F.J., Martínez-

Rodríguez G., Meseguer J., Mancera J.M., Esteban M.A., (2007), “Effect of

sex-steroid hormones, testosterone and estradiol, on humoral immune

parameters of gilthead seabream”, Fish & Shellfish Immunology, 23, pp.

693–700.

55. Curtis P., Drawbridge M., Iwamoto T., Nakai T., Hedrick R., Gendron A.

(2001), “Nodavirus infection of juvenile white seabass, Atractoscion nobilis,

cultured in southern California: First record of viral nervous necrosis (VNN)

in North America”, JouARNl of Fish Diseases, 24, pp. 263-271.

56. Cutrín J.M., Dopazo C.P., Thiéry R., Leao P., Olveira J.G., Barja J.L.,

Bandín I. (2007), “Emergence of pathogenic Betanodaviruses belonging to

the SJNNV genogroup

farmed

fish species

from

the

Iberian

Peninsula”, Journal of Fish Diseases, 30, pp. 225–232.

57. Dadar M., Dhama K., Vakharia V.N., Hoseinifar S.H., Karthik K., Tiwari R.,

(2017), “Advances in aquaculture vaccines against fish pathogens: global

status and current trends”, Rev Fish Sci Aquac, 25, pp. 184–217.

58. Dalla Valle L., Toffolo V., Lamprecht M., Maltese C., Bovo G., Belvedere

P., (2005), “Development of a sensitive and quantitative diagnostic assay for

fish nervous necrosis virus based on two-target real-time PCR”, Veterinary

Microbiology, 110, pp. 167–179.

59. Dalmo R.A., (2019), “DNA Vaccines for fish: Review and perspectives on

correlates of protection”, Journal of Fish Diseases, 41, pp. 1–9.

112

60. Desmettre P., Martinod S., Pastoret P.P., Blancou J., Vannier P., Verschueren C.,

(2015), “Research and development. In Veterinary Vaccinology Eds”, Elsevier

Press: Amsterdam, the Netherlands, 1997; pp. 175–194.

61. Dhar A.K., Manna S.K., Thomas Allnutt F.C., (2014), “Viral vaccines for

farmed finfish”, Virus disease, 25, pp. 1–17.

62. Doan Q.K., Vandeputte M., Chatain B., Morin T., Allal F., (2017), “Viral

encephalopathy in aquaculture: a review”, Journal of Fish Diseases; 40 (5):

p.717–742.

63. Dorson M., Castric J., Torchy C., (1978), “Infectious pancreatic necrosis

virus of salmonids: biological and antigenic features of a pathogenic strain

and of a non-pathogenic variant selected in RTG-2 cells”, Jounal of Fish

Diseases, Volume 1, Issue 4, pp. 309-320.

64. Duff D.C.B., (1942), “The oral immunization of trout against Bacterium

salmonicida”, J Immunol. 44, pp. 87-94.

65.

Elward K., Gasque P., (2003), ““Eat me” and “don't eat me” signals govern the

innate immune response and tissue repair in the CNS: emphasis on the critical

role of the complement system”, Molecular Immunology, 40, pp. 85-94.

66.

Embregts C.W.E., Forlenza M., (2016), “Oral vaccination of fish: lessons

from humans and veterinary species”, Dev Comp Immunol, 64, pp. 118–137.

67.

Evans Joyce J., Klesius Phillip H., Shoemaker Craig A., (2004), “Efficacy of

Streptococcus agalactiae (group B) vaccine in tilapia (Oreochromis

niloticus) by intraperitoneal and bath immersion administration”, Vaccines,

Volume 22, Issues 27–28, pp. 3769-3773.

68.

Evans T., (1997), “Developmental biology of hematopoiesis”, Hematol

Oncol Clinic North Am, 11, pp. 1115-1147.

69.

Fan C., Ye X., Ku Z., Kong L., Liu Q., Xu C., Cong Y., Huang Z., (2017),

“Beta-Propiolactone Inactivation of Coxsackievirus A16 Induces Structural

Alteration and Surface Modification of Viral Capsids”, J. Virol, 91, pp. 8-17.

113

70.

Fernández Sánchez J.L., Le Breton A., Brun E., Vendramin N., Spiliopoulos

G., Furones D., Basurco B., (2022), “Assessing the economic impact of

diseases in Mediterranean grow-out farms culturing European seabass”,

Aquaculture, 547, 737530.

71.

Figueroa C., Torrealba D., Morales-Lange B., Mercado L., Dixon B.,

Conejeros P., (2022), “Commercial vaccines do not confer protection against

two genogroups of piscirickettsia salmonis, LF-89 and EM-90, in Atlantic

salmon”, Biology-Basal, 11:993.

72.

Fletcher T.C., (1986), “Modulation of nonspecific host defenses in fish”, Vet

Immunol Immunopathol, 12, pp. 59–67.

73.

Froese R., Pauly D., (2022), FishBase. Epinephelus Bloch, 1793. Accessed

through:

World

Marine

Species

at:

https://www.marinespecies.org/aphia.php?p=taxdetails&id=126068 on 2022-12-05.

74.

Froese R., Pauly D., (2019), "Species in Epinephelus", FishBase

75.

Frerichs G.N., Tweedie A., Starkey W.G., Richards R.H., (2000),

“Temperature, pH and electrolyte sensitivity, and heat, UV and disinfection

inactivation of sea bass (Dicentrarchus labrax) neuropathy vi rút”,

Aquaculture, 185, pp.13–24.

76. Ghiasi M., Binaii M., Ghasemi M., Fazli H., Zorriehzahra M. J. , (2016),

“Haemato-biochemical disorders associated with Nodavirus like-agent in

adult leaping mullet Liza saliens (Risso, 1810) in the Caspian Sea”,

Virusdisease, 27(1), pp. 12-18.

77. Glenny A.T., Pope C.G., Waddington H., Wallace U.,

(1926),

“Immunological notes. XVI1.−XXIV”, J. Pathol. Bacteriol, 29, pp. 31-40.

78. Goldstein M.A., Tauraso N.M., (1970), “Effect of formalin, beta-

propiolactone, merthiolate, and ultraviolet light upon influenza virus

infectivity chicken cell agglutination, hemagglutination, and antigenicity”,

Appl. Microbiol, 19, pp. 290–294.

79. Gudding R., Lillehaug A., Evensen Ø., (1999), “Recent developments in fish

vaccinology”, Veterinary Immunology and Immunopathology, Volume 72,

Issues 1–2, pp. 203-212.

114

80. Gupta D., Parthasarathy H., Sah V., Tandel D., Vedagiri D., Reddy S.,

Harshan K.H., (2021), “Inactivation of SARS-CoV-2 by β-propiolactone

causes aggregation of viral particles and loss of antigenic potential”, Virus

Res, 305, 198555.

81. Grisez L., Tan Z., (2007), “Vaccine development for Asian aquaculture”,

The Fish Site, Intervet Norbio Singapore Pte Ltd.

82. Grotmol S., Nerland A. H., Biering E., Totland G. K., Nishizawa T., (2000),

“Characterisation of the capsid protein gene from a Nodavirus strain

affecting the Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus and design of an

optimal reversetranscriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) detection

assay”, Diseases of Aquatic Organisms, 39, pp. 79–88.

83. Gye H.J., Nishizawa T., (2018), “Reducing background optical density in

enzyme-linked immunosorbent assay for detecting nervous necrosis virus

(NNV)-specific IgM by immobilizing fish sera”, Aquaculture, 485, pp. 93–100.

84. Hanington P.C., Tamb J., Katzenback B.A., Hitchen S.J., Barreda D.R.,

Belosevic M., (2009), “Development of macrophages of cyprinid fish”, Dev

Comp Immunol, 33: pp. 411-429.

85. Hanif A., Bakopoulos V., Dimitriadis G.J., (2004), “Maternal transfer of

humoral specific and non-specific immune parameters to sea bream (Sparus

aurata) larvae”, Fish & Shellfish Immunology, 17, pp. 411–435.

86. Hanif A., Bakopoulos V., Leonardos I., Dimitriadis G.J., (2005), “The effect

of sea bream (Sparus aurata) broodstock and larval vaccination on the

susceptibility by Photobacterium damsela subsp. piscicida and on the humoral

immune parameters”, Fish & Shellfish Immunology, 19, pp. 345–361.

87. Hayward C.J., Bott N.J., Nowak B.F., (2009), “Seasonal epizootics of sea

lice, Caligus spp., on southern bluefin tuna, Thunnus maccoyii (Castelnau),

in a long-term farming trial”, Journal of Fish Diseases, 32, pp. 101–106.

88. Hazreen-Nita M., Azila A., Mukai Y., Firdaus-Nawi M., Nur-Nazifah M.,

(2019), “A Review of Betanodavirus Vaccination as Preventive Strategy to

Viral Nervous Necrosis (VNN) Disease in Grouper”, Aquacult. Int, 27, pp.

1565–1577.

115

89. Heemstra P.C., Randall J.E., (1993), “Groupers of the world (Family

Serranidae, Subfamily Epinephelinae). An annoted and illustrated catalogue

of the grouper, rockcod, hind, coral grouper and lyretail species known to

date”, FAO Species Catalogue, FAO Fisheries Synopsis no. 125, Rome

90. Hegde A., (2003), “Characterization and immunological studies of fish

nervous necrosis virus”, A thesis submitted for the degree of doctor of

philosophy department of Biological sciences National University of

Singapore.

91. Herrera-Rodriguez J., Signorazzi A., Holtrop M., de Vries-Idema J.,

Huckriede A., (2019), “Inactivated or damaged? Comparing the effect of

inactivation methods on influenza virions to optimize vaccine production”,

Vaccine, 37, pp. 1630–1637.

92. Hoare R., Hovland H., Langston A.L., Imsland A., Stefansson S.O., Mulcahy

M., Wergeland H.I., (2002), “Susceptibility of three different strains of

juvenile Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) cultured at two

different temperatures to Vibrio anguillarum and temperature effect on

antibody response”, Fish & Shellfish Immunology, 13, pp. 111–123.

93. Hogen E.H., Derek T.O., Christopher B.F., (2018), “Optimizing the

utilization of aluminum adjuvants in vaccines: you might just get what you

want”, Vaccines, 3:51.

94. Holland M.C.H., Lambris J.D. (2002), “The complement system in teleosts”,

Fish & Shellfish Immunology, 12, pp. 399-420.

95. Hølvold L.B., Myhr A.I., Dalmo R.A., (2014), “Strategies and hurdles using

ADN vaccines to fish”, Vet Res, 45, pp. 1–11.

96. Hou Y.Y., Suzuki Y., Aida K., (1999), “Effects of steroid hormones on

immunoglobulin M (IgM) in rainbow trout Oncorhynchus mykiss”, Fish

Physiol Biochem, 20, pp. 155–162.

97. Huang S.M., Cheng J.H., Tu C., Chen T.I., Lin C.T., Chang S.K., (2017), “A

bivalent inactivated vaccine of viral nervous necrosis virus and grouper

Iridovirus applied to grouper broodfish (Epinephelus coioides) reduces the

risk of vertical transmission”, Taiwan Vet J, 43(03), pp. 171–176.

116

98. Hussain I., Price G.W., Farid A.H., (2014), “Inactivation of aleutian mink

disease virus through high temperature exposure in vitro and under field-

based composting conditions”, Vet Microbiol, 173, pp. 50–58.

99. Hrubec T.C., Jenifer L.C., Stephen A.S., (2000), “Hematology and plasma

chemistry reference intervals for cultured tilapia (Oreochromis hybrid)”, Vet

Clin Pathol, 29(1), pp. 7-12.

100.

Ito Y., Okinaka Y., Mori K.I., Sugaya T., Nishioka T., Oka M., Nakai T.,

(2008), “Variable region of Betanodavirus RNA2 is sufficient to determine

host specificity”, Diseases of Aquatic Organisms, 79, pp. 199-205.

101.

Iwamoto T., Nakai T., Mori K., Arimoto M., Furusawa I., (2000), “Cloning of fish

cell line SSN-1 for piscine Nodavirus”, Dis. Aquat. Org, 43, pp. 81–89.

102. Jeong Y.U., Subramanian D., Jang Y.H., Kim D.H., Park S.H., Park K.,

(2016), “Protective efficiency of an

inactivated vaccine against

Streptococcus iniae in olive flounder paralichthys olivaceus”, Arch Polish

Fish, 24, pp. 23–32.

103. Jeong K.H., Kim H.J., (2020), “Current status and future directions of fish

vaccines employing virus-like particles”, Fish & Shellfish Immunology, 100,

pp. 49–57.

104. Jiao X., Shuang C., Yong-hua H., Li S., (2010), “Comparative study of the

effects of aluminum adjuvants and Freund's incomplete adjuvant on the

immune response to an Edwardsiella tarda major antigen”, Vaccine, Volume

28, Issue 7, pp. 1832-1837.

105. Johannes R.E., (1978), “Reproductive strategies of coastal marine fishes in

the tropics”, Env. Biol. Fish, 3, pp. 741-760.

106. Johnson S.C., Sperker S.A., Leggiadro C.T., Groman D.B., Griffiths S.G.,

Ritchie R.J., Cook M.D., Cusack R.R., (2002), “Identification and

characterization of a piscine neuropathy and Nodavirus from juvenile

Atlantic cod from the Atlantic coast of North America”, J Aquat Anim

Health, 14, pp. 124–133.

107. Johnstone C., Pérez M., Arizcun M., García-Ruíz C., Ciércoles C., Chaves-

Pozo E., (2021), “Detection of Red-spotted grouper nervous necrosis virus

117

(RGNNV) in shrimp and squid of the Mediterranean Sea”, In Proceedings of

the 20th International Conference on Diseases of Fish and Shellfish, Virtual,

20–23. September 2021; European Association of Fish Pathologist:

Aberdeen, Scotland, 2021.

108.

Jones R.S., Gutherz E.J., Nelson W.R., Matlock C., (1989), “Burrow utilization

by yellowedge grouper, Epinephelus flavolimbatus, in the northwestern Gulf of

Mexico”, Enviromental Biology of Fishes, 26, pp. 277-284.

109. Jose Priya T.A., Kappalli S., (2022), “Modern biotechnological strategies for

vaccine

development

aquaculture

prospects

and

challenges”, Vaccine, 40, pp. 5873–5881.

110. Jurado M., García-Valtanen P., Estepa A., Perez L., (2013), “Antiviral

activity produced by an IPNV-carrier EPC cell culture confers resistance to

VHSV infection”, Vet. Microbiol, 166, pp. 412–418.

111. Kai Y.H., Chi S.C., (2008), “Efficacies of inactivated vaccines against

betanodavirus

in grouper

larvae

(Epinephelus coioides) by bath

immunization”, Vaccine, 26, pp. 1450 – 1457.

112. Kai Y.H., Wu Y.C., Chi S.C., (2014), “Immune gene expressions in grouper

larvae (Epinephelus coioides) induced by bath and oral vaccinations with

inactivated Betanodavirus”, Fish & Shellfish Immunology, 40, pp. 563–569.

113. Kanemaru T., Nakamura M., Murata R. , Kuroki K., Horie H., Uchida

K., Senthilkumaran B., Kagawa H., (2012), “Induction of sexual maturation

of the female honeycomb grouper, Epinephelus merra, in the non-breeding

season by modulating environmental factors with GnRH analogue

implantation”, Aquaculture, 358, pp. 85-91.

114. Kara H.M., Chaoui L., Derbal F., Zaidi R., de Boisséson C., Baud M.,

Bigarré L., (2014), “Betanodavirus associated mortalities of adult wild

groupers Epinephelus marginatus (Lowe) and Epinephelus costae (Steindachner)

in Algeria”, Journal of Fish Diseases, 37, pp. 273–278.

115. Kim J.O., Kim W.S., Oh M.J., (2015), “Development of a Recombinant

Protein Vaccine Based on Cell-Free Protein Synthesis for Sevenband

118

Grouper (Epinephelus septemfasciatus) Against Viral Nervous Necrosis”, J.

Microbiol. Biotechnol, 25(10), pp. 1761–1767.

116. Kim J.O., Sih K.W., Cho J.K., Kim K.M., Son M.H., Oh M.J., (2014),

“Complete genome sequence of nervous necrosis virus isolated from

sevenband grouper (Epinephelus septemfasciatus) in South Korea”, 2(6).

117. Kim Y.C., Kwon W.J., Min J.G., Kim K., Jeong H., (2019), “Complete

genome sequence and pathogenic analysis of a new Betanodavirus isolated

from shellfish”, Journal of Fish Diseases, 42(4), pp. 1–13.

118. Kim M.S., Park J.S., Kim K.H., (2015), “Generation of G gene-deleted viral

hemorrhagic septicemia virus (VHSV) and evaluation of its vaccine potential

in olive flounder (Paralichthys olivaceus)”, Fish & Shellfish Immunology,

45, pp. 666–671.

119. Klafack S., Schroeder L., Jin Y., Lenk M., Lee P.Y., Fuchs W., (2022),

“Development of an attenuated vaccine against koi herpesvirus disease

(KHVD) suitable for oral administration and immersion”, NPJ Vaccines,

7:106.

120. Klosterhoff M.C., Pereira Junior J., Rodrigues R.V., (2015), “Ontogenic

development of kidney, thymus and spleen and phenotypic expression of

CD3 and CD4 receptors on the lymphocytes of cobia (Rachycentron

canadum)”, Anais da Academia Brasileira de Ciências, 87, pp. 2111–2121.

121. Klesius P.H., (1990), “Effect of size and temperature on the quantity of

immunoglobulin in channel catfish Ictalurus punctatus”, Vet Immunol

Immunopathol, 24, pp. 187–195.

122. Kobayashi Y., (2022), “Control of gonadal maturation and sex in grouper”,

Aquaculture and Fisheries, Volume 7, Issue 5, pp. 519-524.

123. Kole S., Shin SM., Kwak I.S., Cho S.H., Jung S.J., (2022), “Efficacy of

chitosan-PLGA

encapsulated

trivalent oral vaccine

against viral

haemorrhagic septicemia virus, Streptococcus parauberis, and miamiensis

avidus

in olive flounder (Paralichthys olivaceus)”, Fish & Shellfish

Immunology, 127, pp. 843–854.

119

124. Korsnes K., Karlsbakk E., Skår C.K., Sælemyr L., Nylund A., Kvamme

B.O., Mortensen S., (2017), “High nervous necrosis virus (NNV) diversity in

wild wrasse (Labridae) in Norway and Sweden”, Dis. Aquat. Organ, 126, pp.

43–50.

125. Kumar R., Joy K.P., Singh S.M., (2016), “Morpho-histology of head kidney

of female catfish Heteropneustes fossilis: Seasonal variations in melano-

macrophage centers, melanin contents and effects of lipopolysaccharide and

dexamethasone on melanins”, Fish Physiology and Biochemistry, pp. 1-20.

126. Lan N.G.T., Salin K.R., Longyant S., Senapin S., Dong H.T., (2021),

“Systemic and mucosal antibody response of freshwater cultured Asian

seabass (Lates calcarifer) to monovalent and bivalent vaccines against

Streptococcus agalactiae and Streptococcus

iniae”, Fish & Shellfish

Immunology, 108, pp. 7–13.

127. Lee C., Hu S., Kim B., Soyano K., Lee Y.D., (2020), “Induced maturation

and fertilized egg production of the red(cid:0)spotted grouper (Epinephelus

akaara) using adaptive physiology of photoperiod and water temperature”,

Aquaculture Research, 51 (5), pp. 2084-2090.

128. Li J., Suo Y., Liao X., Ahn J., Liu D., Chen S., (2017), “Analysis of

Staphylococcus aureus cell viability, sublethal injury and death induced by

synergistic combination of ultrasound and mild heat”, Ultrason Sonochem,

39, pp. 101–110.

129. Lillehaug A., Sevatdal S., Endal T., (1996), “Passive transfer of specific

maternal immunity does not protect Atlantic salmon (Salmo salar L.) fry

against yersiniosis”, Fish & Shellfish Immunology, 6, pp. 521–535.

130. Lin C.C., Lin J.H.Y., Chen M.S., Yang H.L., (2007), “An oral nervous

necrosis virus vaccine that induces protective immunity in larvae of grouper

(Epinephelus coioides)”, Aquaculture, 268, pp. 265–273.

131. Liu X.D., Huang J.N., Weng S.P., Hu X.Q., Chen W.J., Qin Z.D., Dong X.X.

, Liu X.L., Zhou Y., Asim M., Wang W.M., He J.G., Lin L., (2015),

120

“Infections of nervous necrosis virus in wild and cage-reared marine fish from

South China Sea with unexpected wide host ranges”, Journal of Fish Diseases,

38(6), pp. 533-540.

132. Liu G., Zhu J., Chen K., Gao T., Yao H., Liu Y., (2016), “Development of

Streptococcus agalactiae vaccines for tilapia”, Dis Aquat Organ, 122, pp.

163–170.

133. Liu X., Jiao C., Ma Y., Wang Q., Zhang Y., (2018), “A live attenuated vibrio

anguillarum vaccine induces efficient immunoprotection in tiger puffer

(Takifugu rubripes)”, Vaccine, 36, pp. 1460–1466.

134. Liu L., Lu D.Q., Xu J., Luo H.L., Li A.X., (2019), “Development of

attenuated erythromycin-resistant Streptococcus agalactiae vaccine for

tilapia (Oreochromis niloticus) culture”, Journal of Fish Diseases, 42, pp.

693–701.

135. Liu Y.L., He T.T., Jiang X.L., Sun S.S., Wang L.K., Nie P., (2022),

“Development of a hyper-adhesive and attenuated Edwardsiella ictaluri

strain as a novel

immersion vaccine candidate

in yellow catfish

(Pelteobagrus fulvidraco)”, Microb Pathog, 167:105577.

136. Lorenzen N., LaPatra SE., (2005), “ADN vaccines for aquacultured fish”,

Rev.sci. tech. Off. int. Epiz, 24 (1), pp. 201–213.

137. Low C.F., Syarul Nataqain B., Chee H.Y., Rozaini M.Z.H., Najiah M.,

(2017), “Betanodavirus: Dissection of the viral life cycle: Review”, Journal

of Fish Diseases, 00, pp. 1 -8.

138. Lubzens E., Young G., Bobe J., Cerdà J., (2010), “Oogenesis in teleosts:

How

fish

eggs

are

formed”, General

and Comparative

Endocrinology, 165 (3), pp. 367-389.

139. Ma J. Bruce T.J., Jones E.M., Cain K.D., (2019), “A review of fish vaccine

development strategies: conventional methods and modern biotechnological

approaches”, Microorganisms, 7(11), pp. 569-587.

121

140. Ma J., Casadei E., Bruce T.J., Sepahi A., Cain K.D., Salinas I., (2022),

“Long-term efficacy of nasal vaccination against enteric red mouth (ERM)

disease and infectious hematopoietic necrosis (IHN) in juvenile rainbow

trout (Oncorhynchus mykiss)”, Vaccine, 40, pp. 229–238.

141. Magnadottir B., Jonsdottir H., Helgason S., Bjornsson B., Jorgensen T.O.,

Pilstrom L., (1999), “Humoral immune parameters in Atlantic cod (Gadus

morhua L.): II. The effects of size and gender under different environmental

conditions”, Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 122, pp. 181–188.

142. Magnadottir B., Audunsdottir S.S., Bragason B.T.H., Gisladottir B., Jonsson

Z.O. and Gudmundsdottir S., (2011), “The acute phase response of Atlantic

cod (Gadus morhua): Humoral and cellular responses”, Fish Shellfish

Imunnol, 30, pp. 1124-1130.

143. Malecki J.K., Roy L.A., Arias C.R., Nhat Truong T., Hanson T.R., Lange

M.D., (2021), “Bioeconomic analysis of flavobacterium columnare vaccine

pond trials with channel catfish”, N Am J Aquac, 83, pp. 207–217.

144. Martinez D.J., (2015), “Epidemiology and pathogenesis of Nervous Necrosis

Virus”, A thesis submitted in fulfilment of the requirements for the degree of

Doctor of Philosophy. Farm Animal and Veterinary Public Health, Faculty of

Veterinary Science, the University of Sydney. 287P.

145. Marsian J., Hurdiss D.L., Ranson N.A., Ritala A., Paley R., Cano I., (2019),

“Plant made nervous necrosis virus like particles protect fish against

disease”, Front Plant Sci, 10:880.

146. Maule A.G., Schrock R., Slater C., Fitzpatrick M.S., Schreck C.B., (1996),

“Immune and endocrine responses of adult chinook salmon during

freshwater

immigration and sexual maturation”, Fish & Shellfish

Immunology, 6, pp. 221–233.

147. Metcalf D., Nicola N.A., (1995), “The hematopoietis colonystimulating

factors: From biological to clinical applications”, New York: Cambridge

University Press, USA, 329 p

122

148. Mohamed L.A., Soliman W.S., (2013), “Development and efficacy of fish

vaccine used against some bacterial diseases in farmed Tilapa”, Nat Sci,

11(6), pp. 120–128.

149. Mohammadi Y., Mesbah M., Dezfoulnejad M.C., Mehrgan M.S., Islami

H.R., (2021), “Growth performance, blood biochemical parameters, immune

response, and antioxidant defense of Asian seabass (Lates calcarifer)

fingerlings exposed

to monovalent and bivalent vaccines against

Streptococcus iniae and Vibrio harveyi”, Aquac Int, 29, pp. 2751–2767.

150. Mori K., Nakai T., Nagahara M., Muroga K., Mekuchi T., Kanno T., (1991),

“A viral disease in hatchery-reared larvae and juveniles of redspotted

grouper”, Fish Pathology, 26 (1991) (1991), pp. 209-210

151. Mori K., Nakai T., Muroga K., Arimoto M., Mushiake K., Furusawa I.,

(1992), “Properties of a new virus belonging to Nodaviridae found in larval

striped jack (Pseudocaranx dentex) with nervous necrosis”, Virology, 187,

pp. 368-371.

152. Mugimba K.K., Byarugaba D.K., Mutoloki S., Evensen O., Munang’andu

H.M., (2021), “Challenges and solutions to viral diseases of finfish in marine

aquaculture”, Pathogens, 10, 673.

153. Mulero I., García-Ayala A., Meseguer J., Mulero V., (2007), “Maternal

transfer of immunity and ontogeny of autologous immune competence of

fish: a minireview”, Aquaculture, 268, pp. 244–250.

154. Munday B.L., Kwang J., Moody N., (2002), “Betanodavirus infections of

teleost fish: a review”, Journal of Fish Diseases, 25, pp. 127–142.

155. Muniesa A., Basurco B., Aguilera C., Furones D., Reverté C., Sanjuan-

Vilaplana A., Jansen M.D., Brun E., Tavornpanich S., (2020), “Mapping the

knowledge of the main diseases affecting sea bass and sea bream in

Mediterranean”, Transbound. Emerg. Dis, 67, pp. 1089–1100.

156. Murata R., Karimata H., Ashraful M., Nakamura M., (2009), “Gonadal sex

differentiation

the Malabar grouper, Epinephelus malabaricus”,

Aquaculture, 293, (3), pp. 286-289.

123

157. Nakamura M., Kobayashi Y., Miura S., Alam M.A., Bhandari R.K., (2005),

“Sex change in coral reef fish”, Fish Physiology and Biochemistry, 31 (2–3),

pp. 117-122.

158. Nakamura M., Nozu R., Nakamura S., Higa M., Bhandari R.K., Kobayashi

Y., Horiguchi R., Komatsu T., Kojima Y., Murata R., Soyano K., Ogawa

S., Hirai T., Matsubara H., Tokumoto T., Kobayashi T., Kagawa H., Adachi

S., Yamauchi K., Nagahama Y., (2022), “Morphological and physiological

studies on sex change in tropical fish: Sexual plasticity of the ovaries of

hermaphroditic and gonochoristic fish”, Galaxea J. Coral Reef Stud., 24 (1),

pp. 5-17.

159. Nagae M., Fuda H., Hara A., Kawamura H., Yamauchi K., (1993), “Changes

in serum immunoglobulin M (IgM) concentrations during early development

of chum salmon (Oncorhynchus keta) as determined by sensitive elisa

technique”, Comp Biochem Physiol A Physiol, 106, pp. 69–74.

160. Natt Michael P., Herrick Chester A., (1952), “A New Blood Diluent for

Counting the Erythrocytes and Leucocytes of the Chicken”, Poultry Science,

Volume 31, Issue 4, pp. 735-738.

161. Newaj-Fyzul A., Austin B., (2015), “Probiotics, immunostimulants, plant

products and oral vaccines, and their role as feed supplements in the control

of bacterial fish diseases”, Journal of Fish Diseases, 38(11), pp. 937-955.

162. Nishioka T., Sugaya T., Kawato Y., Mori K., Nakai T., (2016),

“Pathogenicity of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV) Isolated from

asymptomatic wild Japanese jack mackerel Trachurus japonicas”, Fish

Pathol, 51, pp. 176–183.

163. Nishizawa T., Mori K., Nakail T., Furusawa I., Muroga K., (1994),

“Polymerase chain reaction (PCR) amplification of RNA of striped jack

nervous necrosis virus (SJNNV)”, Dis. aqua. Org, 18, pp. 103-107.

164. Nishizawa T., Furuhashi M., Nagai T., Muroga K., (1997), “Genomic

classification of fish nodaviruses by molecular phylogenetic analysis of the

coat protein gene”, Applied and Environmental Microbiology, 63, pp. 1633–

1636.

124

165. Nishizawa T., Gye H.J., Takami I., Oh M.J., (2012), “Potentiality of a live

vaccine with nervous necrosis virus (NNV) for sevenband grouper

Epinephelus septemfasciatus at a low rearing temperature”, Vaccine, 30 (6),

pp. 1056–1063.

166. Nylund A., Karlsbakk E., Nylund S., Isaksen T., Karlsen M., Korsnes K.,

Handeland S., Martinsen R., Mork Pedersen T. & Ottem K., (2008), “New

clade of Betanodaviruses detected in wild and farmed cod (Gadus morhua)

in Norway”, Archives of Virology, 153, pp. 541–547.

167. OIE (2018), “Viral encephalopathy and retinopathy”, Manual of Diagnostic

Tests for Aquatic Animals, pp. 1–20.

168. OIE (2019). “Viral encephalopathy and retinopathy,”

in Manual of

diagnostic

tests

for

aquatic

animals.

Available

at: https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/aahm/current/c

hapitre_viral_encephalopathy_retinopathy.pdf

169. Padrós F., Constenla M., Casal J., Fioravanti M., Ciulli S., Gustinelli A.,

Caffara M., Acosta F., Sitjà-Bobadilla A., Palenzuela O., (2020), “Perform

FISH (727610) Deliverable 3.2—Epidemiological Status of Mediterranean

Farmed Fish”, Zenodo, 2020.

170. Pakingking J.R., Bautista N.B., de Jesus-Ayson E.G., Reyes O., (2010),

“Protective immunity against viral nervous necrosis (VNN) in brown-

marbled grouper (Epinephelus fuscogutattus) following vaccination with

inactivated Betanodavirus”, Fish Shellfih Immunol, 28, pp. 525–533.

171. Panzarin V., Patarnello P., Mori A., Rampazzo E., Cappellozza E., Bovo G.,

(2010), “Development and validation of a real-time TaqMan PCR assay for

the detection of Betanodavirus in clinical specimens”, Archives of Virology,

155, pp. 1193–1203.

172. Panzarin V., Fusaro A., Monne I., Cappellozza E., Patarnello P., Bovo G.,

Capua I., Holmes E.C., Cattoli G., (2012), “Molecular epidemiology and

evolutionary dynamics of Betanodavirus in southern Europe”, Infect Genet

Evol. 12, pp. 63–70.

125

173. Pérez-Casanova J.C., Rise M.L., Dixon B., Afonso L.O.B., Hall J.R.,

Johnson S.C., Gamperl A.K., (2008), “The immune and stress responses of

Atlantic cod to long-term increases in water temperature”, Fish & Shellfish

Immunology, 24, pp. 600–609.

174. Plant K.P., Lapatra S.E., (2011), “Advances in fish vaccine delivery”,

Developmental and Comparative Immunology, 35(12), pp. 1256-1262.

175. Praveenraj J., Praveena P.E., Bhuvaneswari T., Krishnan A.N., Jithendran

K., (2018), “Experimental

infection of Betanodavirus

in freshwater

fish Gambusia affinis (Baird and Girard, 1853)—a potential infection model

for viral encephalopathy and retinopathy”, Aquaculture InteARNtional, 26,

pp. 617-627.

176. Pridgeon J.W., Klesius P.H., (2012), “Major bacterial diseases in aquaculture

and their vaccine development”, CAB Rev Perspect Agric Vet Sci Nutr Nat

Resour, 7, pp. 1–16.

177. Qin Q.W., Wu T.H., Jia T.L., Hegde A., Zhang R.Q., (2006), “Development

and characterization of a new tropical marine fish cell line from grouper,

Epinephelus coioides susceptible to iridovirus and nodavirus”, J. Virol.

Methods 131, pp. 58–64.

178. Qin Y., Liu J., Liu W., Shi H., Jia A., Lu Y., Liu X., (2020), “First isolation

and identification of red-grouper nervous necrosis virus (RGNNV) from

adult hybrid Hulong grouper (Epinephelus fuscoguttatus × Epinephelus

lanceolatus) in China”, Aquaculture, 529, 735662.

179. Radhakrishnan A., Vaseeharan B., Ramasamy P., Jeyachandran S., (2022),

“Oral vaccination for sustainable disease prevention in aquaculture—an

encapsulation approach”, Aquac Int, 14, pp. 1-25.

180. Rajan J.J.S., Praveena P.E., Bhuvaneswari T., Jithendran K.P., (2016),

“Design and evaluation of reverse transcription nested PCR primers for the

detection of betanodavirus in finfish”, Virus Disease, 27, pp. 123–129.

181. Reed L.T., Muench H., (1938), “A simple method of estimating fifty percent

end points”, The American JouARNl of Hygienne: pp. 493–497.

126

182. Rimmer M.A., Phillips M.J., Sim SY., (2006), “Aquaculture of groupers in

Asia and the Pacific”, In: Proceedings Economics and marketing of the live

reef fish trade in Asia–Pacific, Noumea, ACIAR Working Paper No. pp.

116–134.

183. Rivas L. R., (1979), “Review of the Lutjanus campechanus complex of red

snappers”, Quarterly Journal of the Florida Academy of Sciences, 15, pp.

117-135.

184. Rodgers C.J., Furones M.D., (1998), “Disease Problems in Cultured Marine

Fish in the Mediterranean” Fish Pathol, 33, pp. 157–164.

185. Sambrook J., Russell D.W., (2001), Molecular cloning: a laboratory manual,

CSHL Press.

186. Samat N.A., Yusoff F.M., Rasdi N.W., Karim M., (2020), “Enhancement of

live food nutritional status with essential nutrients for improving aquatic

animal health: a review”, Animals (Basel) 10.

187. Sanders B., Koldijk M., Schuitemaker H., (2015), “Inactivated viral

vaccines/Vaccine analysis: strategies, principles, and control”, Berlin,

Heidelberg: Springer, p. 45–80.

188. Sahul Hameed A.S., Ninawe A.S., Nakai T., Chi S.C., Johnson K.L., (2019),

“ICTV virus taxonomy profile: Nodaviridae”, J. Gen. Virol, 100, pp. 3–4.

189. Saito H., Okamura T., Shibata T., Kato G., Sano M., (2022), “Development

of a live attenuated vaccine candidate against herpesviral hematopoietic

necrosis of goldfish”, Aquaculture, 552, 737974.

190. Secombes C.J., Wang T., (2012), “The innate and adaptive immune system

of fish. In: Infectious disease in aquaculture: prevention and control”,

Woodhead Publishing Limited, Sawston, pp. 3–68.

191. Seppola M., Johnsen H., Mennen S., Myrnes B., Tveiten H., (2009),

“Maternal transfer and transcriptional onset of immune genes during

ontogenesis in Atlantic cod”, Dev Comp Immunol, 33, pp. 1205–1211.

192. Shabram

P., Aguilar-Cordova

E.,

(2000),

“Multiplicity

infection/multiplicity of confusion”, Mol. Ther, 2000, 2, pp. 420–421.

127

193. Shapiro D.Y., (1987), “Reproduction in groupers”, pp. 295-327. In: Tropical

snappers and groupers: biology and fisheries management. J. J. Polovina and

S. Ralston. Westview Press, Boulder, Colorado.

194. Shahin K., Pirezan F., Rogge M., LaFrentz B.R., Shrestha R.P., Hildebrand

M., (2020), “Development of IglC and GroEL recombinant vaccines for

Fancisellosis in Nile tilapia (Oreochromis niloticus)”, Fish & Shellfish

Immunology, 105, pp. 341–349.

195. Shefat S.H.T., (2018), “Vaccines for Use in Finfish Aquaculture”, Acta

Scientific Pharmaceutical Sciences, 2, (11), pp. 15-19.

196. Shin Y.J., Kwon T.H., Seo J.Y., Kim TJ., (2013), “Oral immunization of fish

against iridovirus infection using recombinant antigen produced from rice

callus”, Vaccine, 31, pp. 5210–5215.

197. Smith C. L., (1972), “A spawning aggregation of Nassau grouper

Epinephelus striatus (Bloch)”, Trans. Am. Fish. Soc, 101, pp. 257-261.

198. Sneeringer S., Bowman M., Clancy M. Economic research report 290026.

United States: Department of Agriculture, Economic Research Service

(2019)

199. Souto S., Olveira J.G., Va´zquez-Salgado L., Dopazo C.P., Bandi´n I.,

(2018), Betanodavirus infection in primary neuron cultures from sole”,

Veterinary Research, volume 49, 86.

200. Su H.M., (1999), “Grouper Aquaculture in Chinese Taipei”, In Report of the

APEC/NACA Cooperative Grouper Aquaculture Workshop, Hat Yai,

Thailand, 7–9 April 1999; Collaborative APEC Grouper Research and

Development Network. Network of Aquaculture Centers in Asia-Pacific; pp.

127–130.

201. Stathopoulou P., Rafailidou N., Tzokas K., Batargias C., Tsiamis G., (2018),

“Near-complete genome sequence of a fish nervous necrosis virus isolated

from a clinical disease outbreak in farm-reared bream sparus aurata in

Spain”, Genome Announc 6(1), pp. 1–2.

202. Swain P., Nayak S.K., (2006), “Role of maternally derived immunity in

fish”, Fish & Shellfish Immunology, 27, pp. 89–99.

128

203. Tan S.M., Tan K.S., (1974), “Biology of the tropical grouper Epinephelus

tauvina (Forskal) I. A preliminary study on hermaphroditism

in E.

tauvina”, Sing J Prim Ind, 2, pp. 123–133.

204. Tanaka S., Mori K., Arimoto M., Arimoto T., Nakai T., (2001), “Protective

immunity of sevenband grouper Epinephelus septemfasciatus Thunberg,

against experimental viral nervous necrosis”, Journal of Fish Diseases, 24,

p.15–22.

205. Tang L., Kang H., Duan K., Guo G., Lian G., Wu Y., Li Y., Gao S., Jiang

Y., Yin J., Liu M., (2016), “Effects of Three Types of Inactivation Agents on

the Antibody Response and Immune Protection of Inactivated IHNV Vaccine

in Rainbow Trout”, Viral Immunol, 29(7), pp. 430-435.

206. Tavares-Dias M., Schalch S.H.C., Martins M.L., Silva E.D., Moraes F.R. and

Perecin D., (1999), “Hematologia de teleósteos brasileiros com infecção

parasitaria. I. Variáveis do Leporinus macrocephalus Garavello & Britski,

1988

(Anostomidae) e Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887

(Characidae)”, Acta Sci Anim Sci, 21: pp. 337-342.

207. Thiery R., Cozien J., de Boisseson C., Kerbart-Boscher S., Nevarez L.,

(2004), “Genomic classification of new Betanodavirus

isolates by

phylogenetic analysis of the coat protein gene suggests a low host-fish

species specificity”, JouARNl of General Virology, 85, pp. 3079-3087.

208. Thompson R. and Munro J. L., (1978), “Aspects of the biology and ecology

of Caribbean reef fishes: Serranidae (hinds and groupers)”, Journal of Fish

Biology 12, pp. 115-146.

209. Tizard I., (1998), “Grease anthraxgate and kennel cough: A revisionist

history of early veterinary vaccines”, In Veterinary Vaccines and

Diagnostics, Volume 41, pp. 7–24.

210. Toffan A., Panzarin V., Toson M., Cecchettin K., Pascoli F., (2016), “Water

temprature affects pathogenicity of different Betanodavirus genotypes in

experimentally challenged Dicentrarchus labrax”, Dis Aquat Organ, 119

(3), pp. 231–236.

129

211. Toffan A., Panzarin V.,

(2020),

“Viral Encephalopathy

and

Retinopathy/Viral Nervous Necrosis (VER/VNN)”, Diagnostic Manual for

the main pathogens in European seabass and Gilthead seabream aquaculture,

pp. 45-60.

212. Toffan A., Biasini L., Pretto T., Abbadi M., Buratin A., Franch R., Dalla

Rovere G., Panzarin V.M., Marsella A., Bargelloni L., (2021), “Age

dependency of RGNNV/SJNNV viral encephalo-retinopathy in Gilthead Sea

Bream (Sparus aurata)”, Aquaculture, 539, 736605.

213. Ucko M., Colorni A., Diamant A., (2004), “Nodavirus infections in Israeli

mariculture”, Journal of Fish Diseases, 27(8), pp. 459-469.

214. Valencia J., Grau A., Box A., Nunez V., Cohen-Sánchez A., Catanese G.,

(2018), “First detection of Nodavirus as an etiological agent of MME of

morays (Muraena helena) in Ibiza and Formentera”, In Proceedings of the

First Detection of Nodavirus as an Etiological Agent of MME of Morays

(Muraena Helena) in Ibiza and Formentera; Societat d’Història Natural de

les Balears: Palma, Spain, 2018.

215. Valencia J.M., Grau A., Pretto T., Pons J., Jurado-Rivera J.A., Castro J.A.,

Toffan A., Catanese G., (2019), “Viral encephalopathy and retinopathy

(VER) disease in Epinephelus marginatus from the balearic islands marine

protected areas”, Dis. Aquat. Organ, 135, pp. 49–58.

216. Valero Y., Olveira J.G., López-Vázquez C., Carlos P. D., and Bandín I.,

(2021), “BEI Inactivated Vaccine Induces Innate and Adaptive Responses and

Elicits Partial Protection upon Reassortant Betanodavirus Infection in

Senegalese Sole”. Vaccines (Basel), 9(5): 458.

217. Vallejos-Vidal

E., Reyes-López

F., MacKenzie

S.,

(2017),

“Immunostimulant diets and oral vaccination in fish”, In: Diagnosis and

control of diseases of fish and shellfish, pp. 147-184.

218. Vargas D., Vallejos-Vidal E., Reyes-Cerpa S., Oyarzun-Arrau A., Acuna-

Castillo C., Imarai M., (2021), “The analysis of live-attenuated piscirickettsia

salmonis vaccine reveals the short-term upregulation of innate and adaptive

130

immune genes in Atlantic salmon (Salmo salar): An In situ open-Sea cages

study”, Microorganisms, 9:703.

219. Vázquez Salgado L., Olveira J.G., Dopazo C.P., Bandín I., (2020), “Role of

rotifer (Brachionus plicatilis) and Artemia (Artemia salina) nauplii in the

horizontal transmission of a natural nervous necrosis virus (NNV) reassortant

strain to Senegalese sole (Solea senegalensis) larvae”, Vet. Q., 40, pp. 205-

214.

220. Vendramin N., Patarnello P., Toffan A., Panzarin V., Cappellozza E.,

Tedesco P., Terlizzi A., Terregino C., Cattoli G., (2013), “Viral

Encephalopathy and Retinopathy in groupers (Epinephelus spp.) in southern

Italy: A threat for wild endangered species”, BMC Vet. Res, 9, pp. 20.

221. Vimal S., Madan N., Farook M.A., Nambi K.S.N., Majeed S.A., Rajkumar

T., Venu S., Thirunavukkarasu A.R., Hameed A.S.S., (2014), “Production of

recombinant vaccine using capsid gene of nodavirus to protect Asian sea

bass, Lates calcarifer (Bloch, 1790)”, Aquaculture, 418–419, pp. 148–154.

222. Vinay

Tharabenahalli-Nagaraju , Ye-Ji Kim, Myung-Hwa Jung, Wi-

Sik Kim, Do-Hyung Kim, Sung-Ju Jung.,

(2013),

“Inactivated vaccine

against viral hemorrhagic septicemia (VHS) emulsified with squalene and

aluminum hydroxide adjuvant provides long term protection in olive

flounder (Paralichthys olivaceus)”, Vaccine, Volume 31, Issue 41, Pages

4603-4610.

223. Vinitantharat S., Gravningen K., Greger E., (1999), “Fish vaccines”, Adv Vet

Med 41: pp. 539–550.

224. Volpe E., Pagnini N., Serratore P., Ciulli S., (2017), “Fate of redspotted

grouper nervous necrosis virus (RGNNV) in experimentally challenged

Manila clam Ruditapes philippinarum”, Dis. Aquat. Organ, 125, pp. 53–61.

225. Volpe E., Gustinelli A., Caffara M., Errani F., Quaglio F., Fioravanti M.L.,

Ciulli S., (2020), “Viral nervous necrosis outbreaks caused by the

RGNNV/SJNNV reassortant betanodavirus in gilthead sea bream (Sparus

131

aurata) and European sea bass (Dicentrarchus labrax)”, Aquaculture, 523,

735155.

226. Watanabe K., Nishizawa T., Yoshimuzu M., (2000), “Selection of

broodstock candidates of barfin flounder using an ELISA system with

recombinant protein of barfin flounder nervous necrosis virus”, Dis. Aqua.

Org, 41, pp. 219–223.

227. Widera M., Westhaus S., Rabenau H.F., Hoehl S., Bojkova D., Cinatl J.,

Ciesek S., (2021), “Evaluation of stability and inactivation methods of

SARS-CoV-2 in context of laboratory settings”, Med. Microbiol. Immunol,

210, pp. 235–244.

228. Wu Y.C.C., Chi S.C.C., (2006), “Persistence of Betanodavirus

Barramundi brain (BB) cell line involves the induction of Interferon

response”, Fish & Shellfish Immunology, 21, pp. 540–547.

229. Xing J., Zhang Z., Sheng X., Tang X., Chi H., Zhan W., (2020),“Identificatio

n and characterization of a new strain of nervous necrosis virus isolated from

pearl gentian grouper (Epinephelus lanceolatus × Epinephelus fuscoguttatus)

in China”, Aquaculture, 529.

230. Yamashita H., Mori K., Kuroda A., Nakai T., (2009), “Neutralizing antibody

levels for protection against betanodavirus infection in sevenband grouper,

Epinephelus septemfasciatus (Thunberg), immunized with an inactivated

virus vaccine”, J. Fish Dis, 32, pp. 767–775.

231. Yu S., Wei Y., Liang H., Ji W., Chang Z., Xie S., Wang Y., Li W., Liu Y.,

Wu H., (2022), “Comparison of Physical and Biochemical Characterizations

of SARS-CoV-2 Inactivated by Different Treatments”, Virus Res, 14, 1938.

232. Zapata A., Diez B., Cejalvo T., Gutierrez-De Frias C., Cortes A., (2006),”

Ontogeny of the immune system of fish”, Fish & Shellfish Immunology, 20,

pp. 126–136.

233. Zeng R., Pan W., Lin Y., He J., Luo Z., Li Z., (2021), “Development of a

gene deleted live attenuated candidate vaccine against fish virus (ISKNV)

with low pathogenicity and high protection”, iScience, 24, 102750.

132

234. Zhang L., Ma J., Fan Y., Zhou Y., Xu J., Liu W., (2016), “Immune response

and protection in gibel carp, carassius gibelio, after vaccination with β-

propiolactone

inactivated cyprinid herpesvirus 2”, Fish & Shellfish

Immunology, 49, pp. 344–350.

235. Zhang D., Gao Y., Li Q., Ke X., Liu Z., Lu M., (2020), “An effective live

attenuated vaccine against Streptococcus agalactiae infection in farmed Nile

tilapia (Oreochromis niloticus)”, Fish & Shellfish Immunology, 98, pp. 853–

859.

236. Zhang J., Hu Y., Sun Q., Li X., Sun L., (2021), “An inactivated bivalent

vaccine effectively protects turbot (Scophthalmus maximus) against vibrio

anguillarum and vibrio harveyi infection”, Aquaculture, 544:737158.

237. Zhang Y., Zhou L., Zhang Y., (2014), “Investigation of UV-TiO2

photocatalysis and its mechanism in bacillus subtilis spore inactivation”, J

Environ Sci (China), 26, pp. 1943–1948.

238. Zhang Z., Angen Y., Jiangfeng L., Zhang H., Hu M., Cheng J., Zhao L., Lin

L., We S.,

(2017), “GapA, a potential vaccine candidate antigen

against Streptococcus agalactiae in Nile tilapia (Oreochromis niloticus)”, Fish &

Shellfish Immunology, Volume 63, pp. 255-260.

239. Zheng Z., Wang Y., Wang Q., Deng N., Liao M., Qu J., Li B., Wang L.,

(2012), “Study on the immune enhancement of different immunoadjuvants

used in the pentavalent vaccine for turbots”, Fish & Shellfish Immunology,

Volume 32, Issue 3, Pages 391-395.

240. Zhou S., Tu X., Pang H., Hoare R., Monaghan S.J., Luo J., (2020), “A T3SS

regulator mutant of vibrio alginolyticus affects antibiotic susceptibilities and

provides significant protection

to danio rerio as a

live attenuated

vaccine”, Front Cell Infect Microbiol, 10, 183.

241. Zorriehzahra M.J., Adel M., Dadar M., Ullah S., Ghasemi M., (2019), “Viral

nervous necrosis (VNN) an emerging disease caused by Nodaviridae in

aquatic hosts: Diagnosis, control and prevention: A review”, Iranian

JouARNl of Fisheries Sciences, 18, pp. 30–47.

133

242. Zrnčić S., Padros F., Mladineo I., Fioravanti M.L., Gustinelli A., Palenzuela

O., Toffan A., Panzarin V., Cuilli S., Fouz B., (2020) “Bottlenecks in

diagnostics of Mediterranean fish diseases”, Bull. Eur. Ass. Fish Pathol, 40,

pp. 71-82.

243. https://www.gso.gov.vn/tin-tuc-thong-ke/2022/12/thong-cao-bao-chi-ve-tinh-

hinh kinh-te-xa-hoi-quy-iv-va-nam-2022/.

244. https://www.gso.gov.vn/tin-tuc-thong-ke/2022/10/day-manh-phat-trien-nuoi

trong-thuy-san/.

245. https://tongcucthuysan.gov.vn/vi-vn/tin-tức/nghề-cá-trong-nước/doc-

tin/2022-11-07/hoi-thao-quoc-gia-nuoi bien-viet-nam-nam-2022.

article-13155.tsvn)

247. Lawrence S.A., (2000), “β-Propiolactone: Viral Inactivation in Vaccines and

Plasma Products”, PDA J. Pharm. Sci. Technol, 54, pp. 209–217.

248. Abd-Elghaffar A.A., Ali A.E., Boseila A.A., Amin M.A., (2016),

“Inactivation of Rabies Virus by Hydrogen Peroxide”, Vaccine, 34, pp. 798–

802.

249. Trần Vĩ Hích, Nguyễn Thị Kim Cúc, (2020), “Đánh giá hiệu quả của vaccine

bất hoạt phòng bệnh mù mắt do liên cầu khuẩn gây ra ở cá bớp nuôi tại

Khánh Hòa”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ thủy sản, Trường Đại học Nha

trang, số 1, trang 54-58.

250. Trần Vĩ Hích, Takano R., Fukuda K., (2021), “Đánh giá hiệu quả của vắc xin

PISIVAC Irido Si trong việc phòng bệnh cá mú ngủ do Iridovirus gây ra ở cá

mú lai (Epinephelus fuscoguttatus x E. lanceolatus) nuôi tại Khánh Hòa”,

Tạp chí Khoa học và Công nghệ thủy sản, Trường Đại học Nha trang, số 2,

trang 55-58.

246. http://thuysanvietnam.com.vn/vaccine-cho-ca-tra-mot-huong-tiep-can-moi-

134

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Kết quả sàng lọc mẫu cá nhiễm NNV

Ký Ký Biểu Biểu hiện STT hiệu T4 STT hiệu hiện lâm T4 lâm sàng mẫu mẫu sàng

QN01 A B 31 HP16 A B C D 1 - -

QN02 A B C D 32 TB01 A B C D 2 + -

QN03 A B 3 - 33 TB02 A B +

QN04 A B C D 4 + 34 TB03 A B +

5 QN05 A B + 35 TB04 A B -

36 TB05 A B C D 6 QN06 A B - +

QN07 A B C D 37 TB06 A B C D 7 + -

8 QN08 A B + 38 TB07 A B +

9 QN09 A B - 39 TB08 A B +

10 QN10 A B + 40 TB09 A B -

11 QN11 A B - 41 TB10 A B +

+ 42 TB11 A B + 12 QN12 A B C D

- - 13 QN13 A B C D 43 TB12 A B C D

14 QN14 A B + + 44 TB13 A B

15 QN15 A B - - 45 TB14 A B C D

- 46 NĐ01 A B + 16 HP01 A B C D

17 HP02 A B + 47 NĐ02 A B +

18 HP03 A B + 48 NĐ03 A B +

19 HP04 A B - 49 NĐ04 A B +

+ + 20 HP05 A B C D 50 NĐ05 A B C D

21 HP06 A B + 51 NĐ06 A B -

22 HP07 A B + 52 NĐ07 A B -

135

23 HP08 A B C D 53 NĐ08 A B C D + -

24 HP09 A B C D 54 NĐ09 A B C D - +

25 HP10 A B 55 NĐ10 A B C D + -

26 HP11 A B 56 NĐ11 A B - -

27 HP12 A B 57 NĐ12 A B + +

28 HP13 A B 58 NĐ13 A B - -

29 HP14 ABC 59 NĐ14 A B C D - -

30 HP15 ABCD 60 NĐ15 A B C D - +

Ghi chú:

: Bỏ ăn A

: Bơi tách đàn, màu sắc cơ thể đen tối B

: Mắt lồi, bóng hơi căng, ruột chứa dịch C

: Bơi ngửa, bơi xoay tròn, có hiện tượng chết D

(-) : Không có gen T4

(+) : Có gen T4

136

Phụ lục 2: Trình tự gen T4 của 2 mẫu TB05 và HP02

TB05

AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGT

TCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACAAATGACTTCAAGTCCATCC

TCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTT

CCAGCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGA

GATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAGAAGTTTGCTGGAA

ATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACA

ACTTCAATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGA

GCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTTCACCCGT

GTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAA

GGGGAGGGG

HP02

ACAGGCAGCAGATATTGACGGGCTGCTCCATCAGAGTAGTAGGCA

ACGCCATCTGTGAACGTCTTATTGAAGTTGTCCCAGATGCCCCAGC

GAAACCAGCCTGCAGGTGTGCCAGCATTTCCAGCAAACTTCTTGA

GGTGCCAATAAACAGCACGATCAACATCTCCAGTTCCAAGGCTGT

AGTCGATGGACAGCGGACGGTCCAGCTGGAAGACTGCTCCATCAG

GGGCAATATCCAGTGGCGTGGATCCTAGGAGGATGGACTTGAAGT

CATTTGTGGAAAGGGAATCGTTGTACAGGGAACCTTGTGTCATGAT

GGGAGCGGTGGTCTCTTCAGGTGTCTCAAGAGATGGAACGCTCAG

TCGAACACTCCAGCGACACATGACTGAAGAATTTCCGGAGACTTG

GGGGGGGGGTTGT

137

Phụ lục 3. Trình tự gen T4 chủng NNV TB05 qua 10 đời cấy chuyển

Trình tự gen T4 Số lần cấy

chuyển

AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATG 1

ACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACA

AATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCA

CTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCAGCTG

GACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACT

GGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAG

AAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGG

TTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCAATAAGACG

TTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAG

CCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTTCA

CCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGT

CACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG

AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATG 2

ACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACA

AATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCA

CTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCAGCTG

GACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACT

GGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAG

AAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGG

TTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCAATAAGACG

TTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAG

CCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTTCA

CCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGT

CACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG

138

AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATG 3

ACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACA

AATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCA

CTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCAGCTG

GACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACT

GGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAG

AAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGG

TTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCAATAAGACG

TTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAG

CCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTTCA

CCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGT

CACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG

AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATG 4

ACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACA

AATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCA

CTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCAGCTG

GACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACT

GGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAG

AAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGG

TTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCAATAAGACG

TTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAG

CCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTTCA

CCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGT

CACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG

AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATG 5

ACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACA

AATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCA

139

CTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCAGCTG

GACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACT

GGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAG

AAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGG

TTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCAATAAGACG

TTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAG

CCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTTCA

CCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGT

CACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG

AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATG 6

ACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACA

AATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCA

CTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCAGCTG

GACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACT

GGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAG

AAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGG

TTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCAATAAGACG

TTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAG

CCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTTCA

CCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGT

CACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG

AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATG 7

ACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACA

AATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCA

CTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCAGCTG

GACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACT

GGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAG

140

AAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGG

TTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCAATAAGACG

TTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAG

CCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTTCA

CCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGT

CACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG

AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATG 8

ACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACA

AATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCA

CTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCAGCTG

GACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACT

GGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAG

AAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGG

TTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCAATAAGACG

TTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAG

CCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTTCA

CCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGT

CACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG

AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATG 9

ACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACA

AATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCA

CTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCAGCTG

GACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACT

GGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAG

AAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGG

TTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCAATAAGACG

TTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAG

141

CCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTTCA

CCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGT

CACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG

AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATG 10

ACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACA

AATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCA

CTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCAGCTG

GACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACT

GGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAG

AAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGG

TTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCAATAAGACG

TTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAG

CCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTTCA

CCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGT

CACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG

142

Phụ lục 4: Ảnh tiêm cá

Phụ lục 5: Thử nghiệm vắc-xin cho cá giống

143

Phụ lục 6: TCVN 8684:2011

VẮC XIN VÀ CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG THÚ Y –

PHÉP THỬ ĐỘ THUẦN KHIẾT

Veterinary vaccines and biological products – Purity test

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp thử độ thuần khiết của vắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y.

2. Thuốc thử và môi trường nuôi cấy

2.1 Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

2.1.1 Metylbenzothiazolon hydrazon hydroclorua.

2.1.2 Dung dịch sắt(II) clorua trong axit sulfamic.

2.1.3 Formaldehyt chuẩn.

2.2 Môi trường nuôi cấy

Sử dụng môi trường nuôi cấy đã pha chế sẵn hoặc chuẩn bị môi trường nuôi cấy ngay trước khi sử dụng.

2.2.1 Môi trường thioglycollat.

2.2.2 Môi trường trypticaza đậu tương.

2.2.3 Thạch máu.

2.2.4 Canh thang thịt.

2.2.5 Thạch Sabouraud.

2.2.6 Sản phẩm thủy phân casein đậu tương.

2.2.7 Canh thang PPLO, có bổ sung huyết thanh ngựa và chất chiết nấm men.

2.2.8 Thạch PPLO (tên đầy đủ pleuropneumonia-like organism agar, có bổ sung huyết thanh ngựa và chất chiết nấm men

144

2.2.9 Dung dịch DPN-cystein, có bổ sung nicotinamid adenin dinucleotid, L- cystein hydroclorua và huyết thanh ngựa.

2.2.10 Canh thang tim, có bổ sung proteoza pepton và chất chiết nấm men.

2.2.11 Thạch MacConkey.

2.2.12 Thạch Salmonella-Shigella.

2.2.13 Thạch brilliant green.

2.2.14 Thạch desoxycholat xitrat.

2.2.15 Thạch xyloza lysin deoxycholat (thạch XLD).

2.2.16 Canh thang selenit.

2.2.17 Canh thang tetrathionat.

3. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm sinh học thông thường và cụ thể như sau:

3.1 Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 37 0C.

3.2 Tủ ấm CO2.

3.3 Tủ sấy.

3.5 Máy lắc.

3.7 Máy đo quang phổ, sử dụng cuvet 1 cm, có thể đo được ở bước sóng 628 nm.

4. Cách tiến hành

4.1 Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn

4.1.1 Tiến hành

4.1.1.1 Cấy vắc xin trên 2 ống môi trường kiểm tra sau đây: môi trường thioglycollat (2.2.1), môi trường trypticaza đậu tương (2.2.2), 2 đĩa môi trường thạch máu (2.2.3), lượng vắc xin cấy từ 1 % đến 2 % (phần thể tích) so với môi trường kiểm tra. Nếu vắc xin ở dạng đông khô thì phải được hoà tan trở lại dung tích ban đầu.

145

Ủ môi trường đã cấy vắc xin trong tủ ở 37 oC, theo dõi từ 7 ngày đến 10 ngày.

4.1.1.2 Nếu vắc xin có chất diệt trùng thì giữ mẫu ở nhiệt độ từ 25 0C đến 30 0C trong thời gian từ 24 h đến 48 h trước khi tiến hành kiểm tra. Kiểm tra vắc xin có chất diệt trùng như sau:

– Cấy mẫu vào ống 10 ml canh thang thịt (2.2.4), theo dõi ở 37 0C trong 3 ngày.

– Cấy chuyển từ ống canh thang thịt trên sang 2 ống canh thang thịt mới chuẩn bị, theo dõi ở 37 0C trong thời gian từ 7 ngày đến 10 ngày.

4.1.2 Đọc kết quả

Mẫu vắc xin được xem là đạt tiêu chuẩn khi không có bất cứ vi sinh vật nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.

4.2 Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc

4.2.1 Tiến hành

Mẫu vắc xin được ria cấy trên môi trường thạch Sabouraud (2.2.5) hoặc sản phẩm thủy phân casein đậu tương (2.2.6). Theo dõi 14 ngày ở nhiệt độ phòng (từ 20 0C đến 25 0C).

4.2.2 Đọc kết quả

Mẫu vắc xin được xem là đạt tiêu chuẩn khi không có bất cứ tạp khuẩn nấm mốc nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.

4.3 Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma

4.3.1 Tiến hành

Mẫu vắc xin được cấy kiểm tra trên môi trường canh thang PPLO (2.2.7) với nồng độ từ 1 % đến 2 % vắc xin trong 100 ml môi trường và trên đĩa thạch PPLO (2.2.8) có bổ sung huyết thanh ngựa và chất chiết nấm men với thể tích 0,1 ml vắc xin trên 1 đĩa. Có thể sử dụng dung dịch DPN-cystein (2.2.9), được bổ sung nicotinamid adenin dinucleotid, L-cystein hydroclorua và huyết thanh ngựa hoặc sử dụng môi trường canh thang tim (2.2.10) được bổ sung proteoza pepton và chất chiết nấm men để làm môi trường kiểm tra.

146

Theo dõi môi trường lỏng trong 14 ngày ở nhiệt độ từ 330C đến 370C. Tại các thời điểm 3 ngày, 7 ngày, 10 ngày và 14 ngày, lấy canh khuẩn ở môi trường lỏng trên ria cấy vào môi trường thạch PPLO (2 đĩa). Ủ trong tủ ấm CO2 (3.2) ở 370C có 5 % khí CO2, theo dõi trong 28 ngày.

Trường hợp dùng Dung dịch DPN-cystein hoặc Môi trường canh thang tim thì ria cấy vào đâu???

4.3.2 Đọc kết quả

Mẫu vắc xin được xem là đạt khi không có khuẩn lạc Mycoplasma mọc trên môi trường kiểm tra.

4.4 Kiểm tra tạp nhiễm Salmonella

4.4.1 Tiến hành nuôi cấy

Mẫu vắc xin được cấy trên môi trường kiểm tra, dùng một trong các loại môi trường sau: thạch MacConkey (2.2.11), thạch Salmonella-Shigella (2.2.12), thạch Brilliant Green (2.2.13), thạch desoxycholat xitrat (2.2.14) hoặc thạch XLD (2.2.15), với nồng độ từ 1 % đến 2 % dung tích môi trường kiểm tra.

Ủ môi trường đã cấy vắc xin trong tủ ở 37 oC, theo dõi từ 18 h đến 24 h sau đó cấy chuyển tiếp sang ống môi trường nước, dùng một trong các loại môi trường sau: canh thang selenit (2.2.16) hoặc canh thang tetrathionat (2.2.17). Ủ trong tủ ở 37 oC, theo dõi từ 48 h đến 72 h.

4.4.2 Đọc kết quả

Mẫu vắc xin được xem là đạt khi không có vi khuẩn Salmonella mọc trên các loại môi trường kiểm tra.

4.5 Kiểm tra sự có mặt của formaldehyt trong vắc xin: phương pháp sắt(II) clorua

4.5.1 Tiến hành

Pha loãng vắc xin ở nồng độ 1 : 200 (phần thể tích) (nếu là vắc xin dạng nhũ dầu thì pha loãng ở nồng độ 1/20). Lấy 0,5 ml vắc xin đã pha loãng cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml formaldehyt chuẩn (2.1.3) đã pha loãng theo tỉ lệ

147

1/200 và 0,5 ml metylbenzothiazolon hydrazon hydroclorua (2.1.1). Đậy nắp ống nghiệm, lắc nhẹ bằng máy lắc (3.5) và để đứng ống nghiệm trong 60 min ở nhiệt độ phòng. Sau đó thêm 1,0 ml sắt(II) clorua trong axit sulfamic (2.1.2) và để đứng ống nghiệm trong 15 min ở nhiệt độ phòng.

Đo độ hấp phụ của vắc xin và chất chuẩn bằng máy đo quang phổ (3.7) tại bước sóng 628 nm.

4.5.2 Đọc kết quả

Mẫu vắc xin được xem là đạt nếu độ hấp thụ đo được nhỏ hơn 0,74.

5. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

- Mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

- Tất cả các điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tuỳ ý, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả.

- Kết quả thử nghiệm thu được.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] ASEAN standards for animal vaccines. Appendix 2 – Guidelines for sterility testing of veterinary vaccines

[2] 9 CFR 113.28: Dectection of Mycoplasma contamination

[3] 9 CFR 113.28: Dectection of Salmonella contamination