intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Thực tập sinh học động vật

Chia sẻ: Nguyen Lan | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:34

Thêm vào BST
Báo xấu
72
lượt xem 13
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Phân loại học, Khu hệ động vật, Sinh thái học của các nhóm: Giun đất, Động vật chân khớp (Arthropoda), Côn trùng hại cây trồng, Thân mềm Chân bụng ở cạn, Động vật đáy trong hệ sinh thái rừng ngập mặn: Giáp xác, Thân mềm Chân bụng và Hai mảnh vỏ; Nghiên cứu về Cá nước ngọt, Lưỡng cư, Bò sát, Chim, Thú,

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Thực tập sinh học động vật

  1. Bài giảng TH CNSHĐV Baøi 1 NHAÄN DIEÄN KHAÙNG NGUYEÂN BAÈNG PHÖÔNG PHAÙP OUTERLONY I. CÔ SÔÛ LYÙ THUYEÁT 1. Caùc khaùi nieäm caàn nhôù Mieãn dòch laø khaû naêng cuûa cô theå nhaän ra vaø loaïi boû caùc vaät laï (khaùng nguyeân - Ag: Antigen). Töø coå xöa, ngöôøi ta ñaõ bieát öùng duïng mieãn dòch trong vieäc phoøng tröø moät soá beänh nhieãm khuaån, vì theá khaùi nieäm veà mieãn dòch hoïc ñaõ xuaát hieän töø raát sôùm. Tuy nhieân, cho tôùi cuoái theá kyû thöù XIX, mieãn dòch hoïc môùi trôû thaønh moät moân khoa hoïc rieâng bieät. Trong lòch söû phaùt trieån cuûa moân mieãn dòch hoïc, quan nieäm veà ñaùp öùng mieãn dòch thay ñoåi theo tieán boä cuûa khoa hoïc kyõ thuaät vaø ñoàng thôøi noù cuõng coù moái lieân heä maät thieát vôùi moät soá ngaønh khoa hoïc khaùc nhö Sinh hoïc phaân töû, Y sinh hoïc, Döôïc hoïc, Thuù y, Vi sinh hoïc… Trong cô theå ñoäng vaät baäc cao (trong ñoù coù ngöôøi), ñaùp öùng mieãn dòch coù theå taïm chia ra thaønh hai loaïi: ñaùp öùng mieãn dòch töï nhieân vaø ñaùp öùng mieãn dòch thu ñöôïc. Tuy nhieân hai khaùi nieäm naøy coù moái quan heä maät thieát vôùi nhau. Noùi chung, khi coù moät yeáu toá laï coù haïi - coù theå gaây caùc hieäu öùng sinh hoùa (khaùng nguyeân) xaâm nhaäp vaøo cô theå, heä thoáng mieãn dòch coù nhieäm vuï nhaän bieát vaø sau ñoù coù nhöõng hoaït ñoäng coù hieäu quaû tieáp theo ñeå loaïi boû. Ñaùp öùng mieãn dòch dòch theå vaø ñaùp öùng mieãn dòch teá baøo laø hai phöông thöùc maø heä thoáng mieãn dòch söû duïng ñeå choáng laïi khaùng nguyeân. Ñoái vôùi mieãn dòch dòch theå thì khaùng theå hoøa tan, chính xaùc hôn laø globulin mieãn dòch ñaûm ñöông chöùc naêng naøy. Caùc globulin mieãn dòch naøy ñöôïc saûn xuaát töø caùc teá baøo plasma (töông baøo), bieät hoùa töø lympho baøo B. Theo nghóa roäng thì taát caû caùc chaát noäi dòch ñeàu coù theå giuùp sinh vaät choáng ñôõ laïi yeáu toá khaùng nguyeân xaâm nhaäp vaøo cô theå. Tuy nhieân, khaùng theå dòch theå ñöôïc hieåu ôû ñaây laø thaønh phaàn globulin mieãn dòch coù trong huyeát thanh mieãn dòch (thaønh phaàn naøy coù khoaûng 20% trong huyeát thanh). 1
  2. Bài giảng TH CNSHĐV Hình 45 :Sô ñoà caáu truùc phaân töû Ig. Veà phaân loaïi, ngöôøi ta chia Ig thaønh caùc lôùp phaân töû sau: + Globulin mieãn dòch G (IgG): chieám khoaûng 70-75% toång soá Ig cuûa huyeát thanh ngöôøi. Ñaây laø lôùp khaùng theå chuû yeáu trong ñaùp öùng mieãn dòch vaø cuõng laø phaân töû ñoäc quyeàn khaùng ñoäc toá. Lôùp IgG coù vai troø quan troïng nhaát trong cô cheá ñaùp öùng mieãn dòch. + Globulin mieãn dòch A (IgA): chieám khoaûng 15-20% toång soá Ig trong huyeát thanh. Chuùng coù hai loaïi laø IgA noäi dòch huyeát thanh vaø IgA tieát ra ngoaøi nieâm maïc. IgA laø phöông tieän baûo veä taïi choã raát höõu hieäu cuûa cô theå, ngaên caûn söï xaâm nhaäp cuûa khaùng nguyeân (virus, vi khuaån, teá baøo laï, caùc phaân töû sinh hoùa…) + Globulin mieãn dòch M (IgM): chieám khoaûng 10% toång löôïng IgG huyeát thanh, chuùng coù vai troø ñaëc bieät quan troïng trong nhöõng tröôøng hôïp nhieãm khuaån sôùm. + Globulin mieãn dòch D (IgD): chieám 1% toång löôïng Ig huyeát thanh. Cho tôùi hieän nay thì chöùc naêng chính cuûa IgD vaãn chöa ñöôïc xaùc ñònh roõ raøng, nhöng ngöôøi ta thöôøng thaáy noàng ñoä cuûa chuùng taêng chaäm trong nhöõng tröôøng hôïp nhieãm khuaån maõn tính nhöng khoâng ñaëc hieäu cho loaïi nhieãm khuaån naøo. + Globulin mieãn dòch E (IgE): raát ít, chuùng chæ chieám khoaûng 0,004% toång löôïng Ig huyeát thanh. Vai troø cuûa IgE laø khôûi ñoäng vieäc giaûi phoùng caùc saûn phaåm töø teá baøo baïch caàu öa kieàm. 2
  3. Bài giảng TH CNSHĐV 2. Phaûn öùng khaùng nguyeân- khaùng theå IgG trong heä thoáng mieãn dòch coù nhieäm vuï keát hôïp ñaëc hieäu vôùi khaùng nguyeân. Ñaây laø moät trong nhöõng chöùc naêng quan troïng nhaát beân caïnh caùc chöùc naêng khaùc nhö hoaït hoùa baïch caàu, boå theå, hoaït hoùa cô cheá vaän chuyeån qua maøng teá baøo… Khaû naêng keát hôïp ñaëc hieäu vôùi khaùng nguyeân coù ñöôïc laø do caáu truùc ñaëc bieät cuûa phaân töû globulin mieãn dòch . Hình 46:Hình caáu truùc khoâng gian cuûa protein khaùng theå vaø caùch baét Ag. Phaûn öùng in-vitro dieãn ra giöõa khaùng nguyeân khaùng theå hay coøn ñöôïc goïi laø caùc phöông phaùp huyeát hoïc (serological assays) ñaõ vaø ñang ñöôïc söû duïng roäng raõi trong chaån ñoaùn beänh. Söï keát hôïp giöõa khaùng nguyeân - khaùng theå chính laø keát quaû cuûa haøng loaït caùc phaûn öùng tuûa, phaûn öùng ngöng keát, phaûn öùng coá ñònh boå theå vaø phaûn öùng mieãn dòch ñaùnh daáu. Saûn phaåm hoùa lyù cuûa söï keát hôïp khaùng nguyeân vôùi khaùng theå maø cuï theå laø keát quaû cuûa phaûn öùng trung hoøa khaùng nguyeân coù yù nghóa raát lôùn vaø ñöôïc 3
  4. Bài giảng TH CNSHĐV II. NGUYEÂN LIEÄU, HOÙA CHAÁT, DUÏNG CUÏ - Lame 9 x 8,5cm. - Boä duïng cuï ñuïc loã thaïch. - Bình tam giaùc. - OÁng tieâm 1ml. - Buoàng aåm. - Agarose tinh khieát. - Nöôùc muoái sinh lyù. - Dung dòch ñeäm PBS. - Dung dòch nhuoäm maøu Commassive brilliant blue. - Dung dòch taåy maøu. - Vaccine DPT. - Huyeát thanh khaùng ñoäc toá baïch haàu. - Huyeát thanh chuaån (ñaõ bieát tröôùc noàng ñoä). - Giaûi ñoäc toá baïch haàu. III. TIEÁN HAØNH THÍ NGHIEÄM (Phöông phaùp khuyeách taùn hai chieàu do Outerlony ñeà xuaát) - Giaûi haáp phuï vaccine DPT: duøng vaccine DPT ñeå giaûi haáp phuï ñoäc toá baïch haàu ra khoûi gel aluminum baèng dung dòch Na Citrat noàng ñoä 2% trong 24 giôø. - Tieán haønh phaûn öùng nhaän dieän: duøng phaûn öùng khuyeách taùn keùp (double diffusion) do Outerlony ñeà xuaát (ñöôïc goïi taét laø phaûn öùng Outerlony). - Caùc böôùc tieán haønh nhö sau: + Chöng thaïch: Agarose tinh khieát 1% pha trong dung dòch ñeäm PBS coù pH= 7,2. + Ñoå thaïch leân lame: duøng lame nhoû hoaëc film 2,5x8cm, khoaûng 3ml thaïch/ lame. + Ñuïc loã thaïch. 4
  5. Bài giảng TH CNSHĐV Vaccine DPT ñaõ giaûi haáp phuï ñöôïc pha loaõng ôû caùc noàng ñoä khaùc nhau Huyeát thanh khaùng ñoäc toá baïch haàu 50 Iu/ml Lame Hình 47 : Caùch boá trí caùc loã thaïch treân lame. Tieán haønh phaûn öùng Outerlony trong buoàng aåm, thöïc hieän nhuoäm vaø eùp tieâu baûn. GOÀM CAÙC BÖÔÙC SAU:  Ngaâm tieâu baûn vaøo dung dòch sinh lyù trong 12- 18 ñeå loaïi boû caùc yeáu toá keát hôïp khoâng ñaëc hieäu.  Nhuoäm tieâu baûn baèng thuoác nhuoäm commassive brilliant blue trong 10 phuùt.  Röûa saïch thuoác nhuoäm baèng caùch ngaâm tieâu baûn vaøo dung dòch taåy maøu (chuù yù trong quaù trình ngaâm phieán phaûi thay dung dòch taåy maøu thöôøng xuyeân). Caån thaän traùnh laøm bieán daïng phieán thaïch hoaëc bong agarose.  EÙp khoâ tieâu baûn. IV. NHÖÕNG ÑIEÅM CAÀN LÖU YÙ Khoâng ñeå hoùa chaát daây vaøo tay, quaàn aùo Laøm thí nghieäm, sinh vieân phaûi mang gaêng tay V. YEÂU CAÀU - Noäp laïi cho cán bộ hướng dẫn maãu keát quaû 5
  6. Bài giảng TH CNSHĐV Baøi 2 PHÖÔNG PHAÙP THU NHAÄN HUYEÁT THANH TÖØ MAÙU NGÖÔØI VAØ ÑOÄNG VAÄT I. CÔ SÔÛ LYÙ THUYEÁT a. Ñònh nghóa Huyeát thanh laø huyeát töông khoâng coù fibrinogen vaø moät soá yeáu toá ñoâng maùu khaùc. b. Vai troø cuûa huyeát thanh trong Coâng ngheä Sinh hoïc ñoäng vaät Laø thaønh phaàn quan troïng, khoâng theå thieáu ñoái vôùi moâi tröôøng nuoâi caáy moâ vaø teá baøo ñoäng vaät. Huyeát thanh coù caùc ñaëc ñieåm: (1) Cung caáp caùc chaát dinh döôõng quan troïng cho teá baøo nhö caùc amino acid thieát yeáu, tieàn chaát cuûa nucleic acid, caùc nguyeân toá vi löôïng… (2) Cung caáp caùc nhaân toá taêng tröôûng, kích thích cho teá baøo phaân chia. (3) Chöùa caùc protein coù khaû naêng laøm baát hoaït trypsin (moät enzyme ñöôïc söû duïng ñeå taùch teá baøo ñoäng vaät) traùnh hieän töôïng enzyme gaây toån thöông teá baøo. (4) Caûi thieän tính tan cuûa caùc chaát dinh döôõng. (5) Caûi thieän tính dính cuûa teá baøo leân beà maët bình nuoâi nhôø caùc yeáu toá laøm taêng ñoä dính cuûa teá baøo leân giaù ñôõ. (6) Choáng oxy hoùa: huyeát thanh coù tính khaùng oxy maïnh vaø öùc cheá ñoäc tính cuûa oxy. Huyeát thanh coøn laø nguyeân lieäu haøng ñaàu trong ñieàu cheá vaccin vaø coâng nghieäp döôïc phaåm noùi chung. c. Nguyeân taéc thu nhaän huyeát thanh Maùu töôi vöøa ñöôïc laáy ra tröïc tieáp töø cô theå ñoäng vaät thöôøng ñöôïc ñeå yeân trong vaøi giôø, trong suoát thôøi gian naøy fibrinogen chuyeån thaønh fibrin gel (cuïc maùu ñoâng). Cuïc maùu ñoâng naøy co daàn laïi vaø laøm chöøa ra phaàn dòch loûng hay huyeát thanh cuûa maùu. Ngöôøi ta thu nhaän laáy phaàn dòch loûng naøy trong ñieàu kieän voâ truøng. 6
  7. Bài giảng TH CNSHĐV Caùc böôùc thieát yeáu trong vieäc thu nhaän huyeát thanh bao goàm: - Thu nhaän maùu töø cô theå. - Taïo cuïc maùu ñoâng trong bình chöùa. - Taùch huyeát thanh khoûi cuïc maùu ñoâng baèng loïc vaø ly taâm. - Tinh saïch, baûo quaûn. II. NGUYEÂN LIEÄU, HOÙA CHAÁT, DUÏNG CUÏ 1. Hoùa chaát - Hoùa chaát baûo quaûn: merthiolate caàn ñöôïc söû duïng vôùi noàng ñoä sao cho vieäc boå sung chuùng vaøo huyeát thanh seõ khoâng laøm loaõng huyeát thanh. - Maãu maùu (thu nhaän töø thoû). 2. Duïng cuï - thieát bò a. Duøng cho vieäc thu maùu  Thoû 2,5kg hoaëc naëng hôn (khoâng cho aên trong 12 giôø tröôùc ñoù ñeå huyeát thanh thu ñöôïc ít lipid nhaát).  Baøn coät thoû, 4 ñoaïn daây coät.  Dao caïo môùi.  Keùo, pince y teá.  Boâng goøn + coàn 70o.  Boä duïng cuï laáy maùu: + Kim tieâm voâ truøng, 18G, 2in. + OÁng daãn nhöïa hoaëc cao su. + OÁng nghieäm voâ truøng coù saün naép ñaäy.  Ñeøn boùng troøn 15W (ñaët beân döôùi tai thoû, laøm noùng ñeå maùu khoâng ñoâng nhanh trong quaù trình laáy maùu).  Baêng keo y teá.  Chai ñöïng maùu coù naép ñaäy (ñaõ haáp khöû truøng).  10.Giaù ñeå oáng nghieäm.  11.Gaêng tay, khaåu trang vaø quaàn aùo baûo hoä.  12.Ñoà caáp cöùu caù nhaân. b. Duøng cho vieäc thu nhaän huyeát thanh  Tuû laïnh.  Que goã voâ truøng. 7
  8. Bài giảng TH CNSHĐV  Micropipette 100-1000l + tip.  Maùy li taâm oáng nghieäm.  Chai thuûy tinh coù naép vaën ñeå chöùa huyeát thanh (voâ truøng).  Pheãu loïc + giaáy loïc (voâ truøng).  Milipore filter (maøng loïc) 0,22-0,45m.  Thieát bò laøm laïnh saâu (-800C  -200C).  Giaáy hoaëc khaên lau saïch. III. TIEÁN HAØNH THÍ NGHIEÄM 1. Phöông phaùp thu maùu a. Coá ñònh thoû naèm uùp treân baøn thao taùc b. Caïo loâng treân tai thoû ñeå coù theå nhìn thaáy roõ tónh maïch tai. c. Ñeå laáy maùu deã daøng, caàn laøm giaõn nôû maïch baèng caùch duøng ñeøn boùng troøn 15W laøm aám maët trong cuûa tai thoû. d. Saùt truøng nôi ñònh laáy maùu treân tai thoû. e. Ghim kim tieâm vaøo tónh vaïch theo chieàu höôùng vaøo goác tai thoû (ngöôïc vôùi chieàu chaûy cuûa maùu). f. Giöõ thoû naèm yeân vaø thu maùu vaøo oáng nghieäm voâ truøng gaén vôùi kim tieâm qua oáng daãn. g. Phöông phaùp naøy coù theå thu ñöôïc ñeán 20ml maùu thoû (moät con, moät laàn). Neáu maùu ngöng chaûy, buùng nheï vaøo tónh maïch tai ñeå coù theå tieáp tuïc thu maùu. h. Sau khi thu ñuû theå tích maùu caàn duøng, ñaët goøn hoaëc gaïc leân veát caét, duøng ngoùn caùi vaø ngoùn troû ñeå eùp chaët veát thöông laïi. i. Duøng baêng keo ñeå giöõ mieáng gaïc ñuùng vò trí. j. Thu huyeát thanh theo quy trình beân treân. k. Xöû lyù vaø baûo quaûn. 2. Thu nhaän huyeát thanh a. Ñeå yeân maãu maùu trong 1-2 giôø ôû nhieät ñoä phoøng nhaèm taïo cuïc maùu ñoâng. Caån thaän taùch cuïc maùu ñoâng khoûi thaønh oáng nghieäm baèng thìa theùp hoaëc que goã. Giöõ oáng nghieäm ñöïng maùu trong tuû laïnh trong voøng 12-24 giôø ñeå cuïc maùu ñoâng co laïi. b. Gaïn laáy phaàn huyeát thanh vaøo caùc oáng nghieäm saïch vaø li taâm vôùi toác ñoä 1000xg trong 30 phuùt ôû 4oC (khoaûng 2500 voøng ñoái vôùi 8
  9. Bài giảng TH CNSHĐV rotor coù baùn kính 14cm). Caån thaän laáy huyeát thanh ra baèng caùch gaïn laáy phaàn dòch trong beân treân hoaëc duøng pipette huùt ra c. Thöôøng thì huyeát thanh thu ñöôïc ôû laàn li taâm ñaàu tieân chöùa moät ít baïch caàu, ñeå loaïi nhöõng teá baøo naøy, caàn li taâm laëp laïi caùc saûn phaåm ñaõ thu ôû laàn ly taâm thöù nhaát nhö moâ taû treân. e. Khöû truøng huyeát thanh thu ñöôïc baèng phöông phaùp loïc f. Theâm chaát baûo quaûn, sau ñoù baûo quaûn laïnh ñeå giöõ ñöôïc huyeát thanh trong nhieàu ngaøy. g. Ñeå thuaän lôïi cho vieäc löu giöõ huyeát thanh vaø do moãi khi söû duïng chæ caàn moät löôïng nhoû, huyeát thanh caàn ñöôïc chia vaøo nhieàu chai ñöïng coù kích thöôùc nhoû. Ñaây laø ñieàu baét buoäc khi thöïc hieän löu tröõ huyeát thanh ôû traïng thaùi ñoâng laïnh. IV. NHÖÕNG ÑIEÅM CAÀN LÖU YÙ  Trong quaù trình laøm caàn thaät nheï nhaøng, traùnh gaây laéc maïnh oáng ñöïng maùu khieán vôõ teá baøo hoàng caàu.  Sau khi laáy maùu (khoâng quaù 10ml) thì phaûi khöû truøng veát thöông treân tai thoû ngay vaø baêng laïi.  Khöû truøng toaøn boä duïng cuï.  Tröôùc khi li taâm phaûi caân ñoái troïng cho ñeàu caùc oáng nghieäm V. YEÂU CAÀU - Huyeát thanh coù maøu vaøng nhaït ñeàu, trong suoát, ít coù hoàng caàu vôõ. - Khoâng coù lôùp môõ vaùng beân treân. - Khoâng coù lôùp caën döôùi ñaùy chai ñöïng. - Khoâng coù boït khí hoaëc vaät laï hoaëc caùc sôïi huyeát lô löûng. - Huyeát thanh thu ñöôïc ñaûm baûo voâ truøng. + Dòch nuoâi caáy ñuïc so vôùi ban ñaàu: coù söï hieän dieän cuûa vi sinh vaät trong maãu huyeát thanh. + Dòch nuoâi caáy khoâng ñoåi so vôùi ban ñaàu: khoâng coù söï hieän dieän cuûa vi sinh vaät trong maãu huyeát thanh. - Cuõng coù theå kieåm tra vi sinh vaät baèng caùch caáy maãu ñeå theo doõi söï phaùt trieån cuûa caùc khuaån laïc 9
  10. Bài giảng TH CNSHĐV Thu maùu Ñeå yeân 1-2h, to phoøng Taùch cuïc maùu ñoâng khoûi thaønh chai ñöïng Ñeå laïnh 4oC, 12-24h Gaïn laáy phaàn huyeát thanh cho vaøo chai ñöïng Ly taâm 1000g, 30 phuùt, to=40oC Huùt dòch trong ra Laëp laïi 2-3 laàn Ly taâm 4oC, 50.000g, 20 phuùt Loïc qua giaáy loïc nhaùm Loïc voâ truøng Chia thaønh caùc maãu nhoû BAÛO QUAÛN ÔÛ –20OC QUY TRÌNH THU NHAÄN HUYEÁT THANH. 10
  11. Bài giảng TH CNSHĐV Baøi 3 TAÙCH TEÁ BAØO TÖØ MOÂ ÑOÄNG VAÄT BAÈNG PHÖÔNG PHAÙP TRYPSIN I. CÔ SÔÛ LYÙ THUYEÁT 1. Nuoâi caáy sô caáp (primary culture) Nuoâi caáy sô caáp laø giai ñoaïn nuoâi caáy ñaàu tieân nhöõng teá baøo vöøa ñöôïc taùch ra töø moâ hay cô quan. Caùc teá baøo thu ñöôïc trong laàn nuoâi sô caáp naøy ñöôïc goïi laø teá baøo sô caáp (primary cell). Caùc teá baøo sô caáp thöôøng khoâng thuaàn nhaát vì laø haäu dueä cuûa nhieàu teá baøo ban ñaàu khaùc nhau. Ñeå thöïc hieän quaù trình nuoâi caáy sô caáp teá baøo ñoäng vaät, böôùc ñaàu tieân laø taùch chuùng thaønh caùc teá baøo rieâng reõ töø nhöõng maûnh moâ vaø cho chuùng baùm vaøo giaù theå phuø hôïp. Vieäc taùch teá baøo coù theå thöïc hieän baèng bieän phaùp cô hoïc hay baèng enzym ñeå taïo thaønh moät dòch huyeàn phuø teá baøo. Haàu heát caùc loaïi teá baøo ñoäng vaät bình thöôøng (tröø teá baøo maùu) ñeàu caàn baùm vaøo moät giaù theå ñeå soáng vaø phaùt trieån vôùi hieäu quaû cao nhaát. Tuy nhieân, nhöõng teá baøo ung thö coù theå phaùt trieån ôû traïng thaùi lô löûng trong moâi tröôøng. Coù nhieàu loaïi enzym ñöôïc söû duïng ñeå taùch teá baøo nhö collagenase, elastase, hyaluronidase, pronase…nhöng trypsin ñöôïc duøng phoå bieán nhaát vì hieäu quaû taùch teá baøo cao vaø giaù reû. Trypsin coù theå taùch hoaøn toaøn teá baøo töø moâ baèng caùch thuûy phaân caùc protein lieân keát caùc teá baøo vôùi nhau. Tuy nhieân trypsin cuõng coù theå laøm toån thöông maøng teá baøo trong quaù trình taùch, do ñoù caàn phaûi xaùc ñònh noàng ñoä enzym vaø thôøi gian taùch toái öu. Caùc nhaø khoa hoïc thöôøng mong muoán coù theå tieán haønh nghieân cöùu moät chöùc naêng nhaát ñònh cuûa moät moâ hay moät teá baøo trong moät heä thoáng ñôn giaûn. Ñeå thöïc hieän ñieàu naøy, ngöôøi ta tìm caùch taùch teá baøo ra khoûi moâ noäi quan cuûa cô theå vaø tieán haønh nuoâi caáy chuùng trong ñieàu kieän nhaân taïo. Ñaây laø kyõ thuaät cô baûn trong nuoâi caáy teá baøo ñoäng vaät. Baèng kyõ thuaät taùch teá baøo ñoäng vaät, chuùng ta coù theå laøm chuû ñöôïc nhöõng doøng teá baøo taïm thôøi hay lieân tuïc, töø ñoù coù nhöõng öùng duïng quan troïng veà sau. 11
  12. Bài giảng TH CNSHĐV Teá baøo sô caáp laø caùc teá baøo ñöôïc taùch ra laàn ñaàu tieân vaø chöa heà qua nuoâi caáy. Caùc teá baøo naøy coù theå taïo lôùp ñôn. Ngöôøi ta coù theå duøng caùc teá baøo lôùp ñôn ñeå thöïc hieän caùc test vi sinh vaät vaø mieãn dòch. Moãi lôùp ñôn cuûa caùc teá baøo sô caáp thöôøng raát nhieàu chuûng loaïi, coù theå tìm kieám ñöôïc caùc teá baøo maàm trong lôùp ñôn khi phaân laäp vaø ñem caáy chuyeàn nhieàu laàn. Vieäc taùch teá baøo theo phöông phaùp söû duïng enzyme cho pheùp coù theå thu ñöôïc moät löôïng lôùn teá baøo rôøi trong thôøi gian ngaén. Nhôø ñoù, vieäc nuoâi caáy sô caáp coù nhieàu thuaän lôïi vaø tieát kieäm ñöôïc thôøi gian, do coù söï taêng cöôøng khaû naêng tieáp xuùc giöõa caùc teá baøo vôùi moâi tröôøng. Tuy nhieân, ñieàu quan troïng caàn chuù yù laø phaûi laøm giaûm ñeán möùc thaáp nhaát söï tieáp xuùc giöõa teá baøo vôùi trypsin hoaït ñoäng, nhaèm giöõ cho tyû leä soáng cuûa teá baøo caøng cao caøng toát. + Do ñoù trong quaù trình taùch teá baøo baèng trypsin ôû 36,5oC thì caùc teá baøo rôøi caàn ñöôïc thu moãi 30 phuùt. Trypsin ñöôïc loaïi ra baèng caùch ly taâm vaø hoaït tính bò öùc cheá do huyeát thanh hieän dieän trong moâi tröôøng. + Quy trình taùch teá baøo baèng caùch ngaâm moâ trong trypsin ôû 4oC, 6- 18 giôø seõ cho pheùp trypsin thaám vaøo khoái moâ vôùi hoaït tính trypsin thaáp nhaát vaø quaù trình phaân giaûi coù theå tieán haønh tieáp theo ñoù vôùi thôøi gian ngaén hôn nhieàu (20-30 phuùt), ôû 37oC. Maëc duø phöông phaùp söû duïng trypsin laïnh cho pheùp thu ñöôïc nhieàu teá baøo soáng vaø teá baøo cuõng ít bò aûnh höôûng cuûa trypsin hôn, nhöng phöông phaùp söû duïng trypsin aám vaãn ñöôïc söû duïng moät caùch roäng raõi do ít toán thôøi gian vaø ít phöùc taïp hôn. 12
  13. Bài giảng TH CNSHĐV II. NGUYEÂN LIEÄU, HOÙA CHAÁT, DUÏNG CUÏ 1.Vaät lieäu: Gan boø 13
  14. Bài giảng TH CNSHĐV 2. Hoùa chaát -Dung dòch PBS. -Dung dòch trypsin 1%. -Moâi tröôøng nuoâi caáy (E'MEM-10% huyeát thanh). 3. Duïng cuï- thieát bò -Erlen 50ml voâ truøng. -Pipetman 200 -1000l. -Pipetman 10 -100l. -Ñaàu tip voâ truøng. -Maùy laéc. -Keùo nhïn voâ truøng. -Ñóa petri voâ truøng. -Becher 250ml. -Pipette 1ml, 2ml, 5ml voâ truøng. -Boùp cao su (loaïi nhoû). -Boùp cao su (caùc loaïi). -Kính hieån vi. -Buoàng ñeám teá baøo. -Maùy Vortex. -Maùy saáy. -Lamelle. III. TIEÁN HAØNH THÍ NGHIEÄM 1. Taùch teá baøo a) Caân 3 maãu moâ gan, moãi maãu 5g. Röûa maãu trong ñóa Petri voâ truøng baèng dung dòch PBS 3 laàn, huùt boû dòch röûa. b) Cho 3 maãu gan vaøo 3 erlen voâ truøng, caét nhuyeãn moâ gan baèng keùo voâ truøng. c) Cho vaøo moãi erlen (ñaùnh soá 1, 2, 3). -Erlen 1: 18ml PBS + 2ml trypsin 1%. -Erlen 2: 15ml PBS + 5ml trypsin 1%. -Erlen 3: 12ml PBS + 8ml trypsin 1%. Nhö vaäy, ta ñöôïc 3 dung dòch trypsin coù noàng ñoä 0,1; 0,25; 0,4% töông öùng vôùi erlen 1, 2, 3. d) Laéc caùc erlen maãu treân maùy laéc. 14
  15. Bài giảng TH CNSHĐV e) Sau 60, 90, 120 phuùt, laáy maãu ôû moãi erlen vaø xaùc ñònh maät ñoä teá baøo gan trong dung dòch baèng buoàng ñeám. Löu yù phaân bieät teá baøo gan vaø teá baøo hoàng caàu. Hình : Teá baøo ñoäng vaät trong phoøng ñeám. IV. NHÖÕNG ÑIEÅM CAÀN LÖU YÙ - Thôøi gian phaûi chính xaùc trong suoát quaù trình laéc vaø ñeám maät ñoä teá baøo. - Röûa saïch maùu ñeå traùnh ñeám nhaàm teá baøo maùu trong buoàng ñeám. V. YEÂU CAÀU Xaùc ñònh noàng ñoä trypsin vaø thôøi gian toái öu ñeå taùch teá baøo. 15
  16. Bài giảng TH CNSHĐV Baøi 4 TAÙCH VAØ NUOÂI CAÁY SÔ CAÁP TEÁ BAØO SÔ PHOÂI GAØ I. MUÏC ÑÍCH:  Laøm quen vôùi kyõ thuaät nuoâi caáy teá baøo ñoäng vaät.  Taùch teá baøo töø phoâi gaø vaø nuoâi caáy sô caáp.  Phaân laäp doøng teá baøo cô baûn töø phoâi gaø.  So saùnh keát quaû nuoâi caáy töø hai doøng teá baøo cô. II. PHÖÔNG PHAÙP TAÏO TEÁ BAØO SÔ CAÁP :  Teá baøo sô caáp laø teá baøo ñöôïc taùch ra laàn ñaàu tieân vaø chöa heà qua nuoâi caáy. Caùc teá baøo naøy coù theå taïo lôùp ñôn. Ngöôøi ta coù theå duøng caùc teá baøo lôùp ñôn ñeå thöïc hieän caùc test vi sinh vaät vaø mieãn dòch. Moãi lôùp ñôn cuûa caùc teá baøo sô caáp thöôøng raát nhieàu chuûng loaïi, coù theå tìm kieám ñöôïc caùc teá baøo maàm trong lôùp ñôn khi phaân laäp vaø ñem caáy chuyeàn nhieàu laàn.  Vieäc taùch teá baøo theo phöông phaùp söû duïng enzyme cho pheùp coù theå thu ñöôïc moät löôïng lôùn teá baøo rôøi trong thôøi gian ngaén. Nhôø ñoù, vieäc nuoâi caáy sô caáp coù nhieàu thuaän lôïi vaø tieát kieäm ñöôïc thôøi gian, do coù söï taêng cöôøng khaû naêng tieáp xuùc giöõa caùc teá baøo vôùi moâi tröôøng maø vieäc taùch teá baøo cuõng trôû neân deã daøng hôn.  Tuy nhieân, ñoái vôùi phöông phaùp naøy, ñieàu quan troïng caàn chuù yù laø phaûi laøm giaûm ñeán möùc thaáp nhaát söï tieáp xuùc giöõa teá baøo vôùi enzyme Trypsin hoaït ñoäng, nhaèm giöõ cho tyû leä soáng cuûa teá baøo caøng cao caøng toát. Ñeå thöïc hieän ñieàu naøy chuùng ta coù 2 phöông phaùp: + Qui trình Trypsin aám: Trong quaù trình taùch teá baøo baèng Trypsin 0 ôû 36,5 C, caùc teá baøo seõ ñöôïc taùch rôøi vaø ñöôïc thu nhaän sau 30 phuùt. Trypsin ñöôïc loaïi ra baèng caùch li taâm, loïc baèng giaáy loïc. Sau ñoù, cho vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy. Hoaït tính bò öùc cheá do huyeát thanh hieän dieän trong moâi tröôøng. 16
  17. Bài giảng TH CNSHĐV + Qui trình Trypsin laïnh: Quaù trình taùch teá baøo baèng caùch ngaâm moâ trong trypsin baèng 40 C trong 6- 18 giôø seõ cho pheùp Trypsin ngaám vaøo khoái moâ vôùi hoaït tính Trypsin ôû möùc thaáp nhaát. Sau khi loaïi boû Trypsin, quaù trình phaân giaûi coù theå tieán haønh baèng caùch uû aám oáng chöùa moâ ôû 36.50 C vôùi thôøi gian ngaén hôn nhieàu (20-30 phuùt).  Maëc duø phöông phaùp söû duïng Trypsin laïnh cho pheùp thu ñöôïc nhieàu teá baøo soáng vaø teá baøo cuõng ít bò aûnh höôûng cuûa Trypsin hôn , nhöng phöông phaùp söû duïng Trypsin aám vaãn ñöôïc söû duïng moät caùch roäng raõi do ít toán thôøi gian vaø ít phöùc taïp hôn .  Coù moät soá phöông phaùp taùch baèng cô hoïc thuaàn tuùy, tuy nhieân caùc phöông phaùp naøy khoâng ñem laïi hieäu quaû cao. ÔÛ baøi naøy, chuùng ta söû duïng qui trình Trypsin aám ñeå taùch teá baøo phoâi gaø vaø tieán haønh nuoâi caáy sô caáp nhöõng teá baøo naøy. II.1. Duïng cuï  Khay inox  Mieáng loùt cao su  2 boä duïng cuï moå (keùo thaúng, keùo cong, pinch thaúng, pinch cong)  Oáng nghieäm  Ñóa petri (ñöôøng kính 10cm)  Becher 50ml vaø 100ml  Erlen 50 ml  Eppendorf 1500l  Kim tieâm 1ml  Tip 10 - 100l vaø 100 - 1000l  Lame  Pipette (1ml, 2ml, 5ml, 10ml)  Micropipette (10 - 100l vaø 100 - 1000l)  Pipettus - Junior  Phoøng ñeám teá baøo NEUBAUER  Ñóa nuoâi caáy 4 gieáng, ñóa petri nuoâi caáy teá baøo  Ñeøn coàn  Goøn khoâng thaám, goøn thaám, vaûi muøng, giaáy loïc  Oáng ñong 100ml, 500ml, 1000ml  Bình ñònh möùc 100ml  Chai thuûy tinh nuùt nhaùm 100ml 17
  18. Bài giảng TH CNSHĐV II.2. Thieát bò  Phoøng voâ truøng  Caân ñieän töû  pH keá  Autoclave  Phin loïc (filter)  Tuû laïnh  Tuû caáy voâ truøng II.3. Hoùa chaát II.3.1.Dung dòch PBS (Phosphate Buffered Saline)  NaCl :10g  KCl : 0,25g  Na2HPO4.12H2O: 3,6g  KH2PO4 : 0,255g  Nöôùc caát : ñuû 1.000ml II.3.2.Dung dòch L - Glutamine 200mM  L-glutamine: 7,25g  NaCl : 5g  Nöôùc caát : ñuû 500ml II.3.3.Penicillin - Streptomycin 200X  Penicillin G : 1.000.000 ñôn vò  Streptomycin sulfate: 1g  PBS : ñuû 50ml II.3.4.Amphotericin B 0,1%  Amphotericin B voâ truøng: 100mg  Nöôùc caát voâ truøng : 100ml II.3.5.Bicarbonate 7,5%  NaHCO3: 7,5g  Nöôùc caát: ñuû 100ml Boå sung: _100l Pen-strep 200X _ 20l Ampotericin B 18
  19. Bài giảng TH CNSHĐV II.3.6.HEPES 1M  HEPES : 11,915g  Nöôùc caát: ñuû 50ml II.3.7.Phenol Red 0,4%  Phenol red: 0,2g  Nöôùc caát : 50ml II.3.8.Dung dòch NH4Cl 10X  NH4Cl : 8,4g  Nöôùc caát: 100ml II.3.9.Moâi tröôøng E'MEM 5%  E’MEM : 4,72g E'MEM coù thaønh phaàn nhö sau: Thaønh Noàng ñoä phaàn Muoái voâ cô CaCl2 (mg/l) 200. 0 KCl 400. 0 MgSO4. 7 H2O 200. 0 NaCl 6800. 0 NaHCO3 2200. 0 NaH2PO4.H2O 140. 0 Glucose D-Glucose 1000. 0 Amino acid L-Arginine .HCl 126. 0 L-Cystine 24. 0 L-Glutamin 292. 0 L-Histidine. HCl. 42. 0 H2O L-Isoleucine 52. 0 L-Leucine 52. 0 L-Lysine. HCl 73. 1 L-Methyonine 15. 0 L-Phenylalanine 33. 0 19
  20. Bài giảng TH CNSHĐV L-Threonine 48. 0 L-Tryptophane 10. 0 L-Tyrosine 36. 0 L-Valine 47. 0 Vitamin D-Ca pantothenate 1. 0 Choline chloride 1. 0 Acid Folic 1. 0 I-Inositol 2. 0 Nicotinamide 1. 0 Pyridoxal HCl 1. 0 Riboflavine 0. 1 Thyamine HCl 1. 0  Phenol Red 0,4% : 1ml  NaHCO3 7,5% voâ truøng : 7,5ml  HEPES 1M voâ truøng : 10ml  Amphotericin B voâ truøng: 125l  Pen-strep 200X : 2,5ml  Glutamine 200mM : 5ml  Huyeát thanh : 50ml (FBS: Fetal Bovine Serum)  Nöôùc caát : ñuû 500 ml 20
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2