Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của bảy lá một hoa - Paris polyphylla var. chinensis Franchet thu thập tại Việt Nam

Chia sẻ: Thi Thi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

62
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận án là nghiên cứu thành phần hóa học Paris polyphylla var. chinensis, xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của bảy lá một hoa. Để hiểu rõ hơn, mời các bạn tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của bảy lá một hoa - Paris polyphylla var. chinensis Franchet thu thập tại Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ……..….***………… Nguyễn Thị Duyên NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA – PARIS POLYPHYLLA VAR. CHINENSIS THU THẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên Mã số: 62 44 01 17 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2017
Công trình đƣợc hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Đỗ Thị Hà 2. GS. TS. Phạm Quốc Long Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Hội trường Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng … năm 2017. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Đất nước Việt Nam có dạng hình chữ S gồm phần đất liền trải dài theo vĩ độ Bắc từ 8030’ đến 23022’, có 4/5 diện tích là đồi núi, khí hậu nhiệt đới gió mùa. Những yếu tố địa lý và khí hậu như trên là điều kiện thuận lợi để các sinh vật phát triển đa dạng về số lượng, phong phú về chủng loại. Theo ước tính, Việt Nam có khoảng 11.000 loài thực vật bậc cao có mạch, 800 loài rêu, 600 loài nấm và hơn 2000 loài tảo. Trong đó, có nhiều loài được dùng làm thuốc. Đặc biệt, năm 2016 Viện Dược liệu đã công bố 5117 loài cây thuốc trong Danh mục Cây thuốc Việt Nam. Căn cứ theo hệ thống phân loại mới nhất APG năm 2011 (dựa trên những dẫn liệu về sinh học phân tử) chi Paris thuộc họ Hắc dược hoa - Melanthiaceae gồm 26 loài với 13 thứ, phân bố ở vùng cận nhiệt ôn đới hoặc ôn đới ẩm Bắc bán cầu. Kết quả nghiên cứu tài liệu cho thấy các loài thuộc chi Paris có hoạt tính đáng quý như: tác dụng chống ung thư, tác dụng điều hòa miễn dịch, tác dụng cầm máu và tan máu, tác dụng chống oxy hóa, tác dụng kháng virus, kháng nấm và chống ký sinh trùng, tác dụng trên dạ dày, tác dụng hạ sốt, giảm đau, an thần. Về thành phần hóa học, các hợp chất đã được phân lập từ một số loài Paris bao gồm saponin, flavonol, sphingolipid và các glycosid khác. Trong đó, nhóm cấu trúc saponin được nghiên cứu nhiều nhất là saponin steroid (có trên 120 hợp chất) từ 22 loài thuộc chi Paris đã được công bố. Ở Việt Nam, chi Paris là chi hiếm gặp và phân bố chủ yếu ở một số tỉnh miền núi phía bắc và vùng núi cao Tây Nguyên - nơi có khí hậu mát, độ ẩm cao. Cho đến nay đã phát hiện ở nước ta có 8 loài và 2 thứ thuộc chi Paris gồm: Paris dunniana H.Lév., Paris fargesii Franch., Paris vietnamensis (Takht.) H.Li, Paris caobangensis Y.H.Ji, H.Li & Z.K.Zhou, Paris cronquistii (Takht.) H.Li, Paris xichouensis (H. Li) Y.H.Ji, H.Li & Z.K.Zhou, Paris delavayi Franch., Paris polyphylla Sm., Paris polyphylla var. yunnanensis (Franch.) Hand. - Mazz., và Paris polyphylla var. chinensis (Franch.) H.Hara. Trong y học cổ truyền Việt Nam, thân rễ của một số loài thuộc chi Paris với tên thường gọi bảy lá một hoa (hay thất diệp nhất chi hoa) được dùng để chữa sốt, sốt rét cơn, giải độc nhất là khi bị rắn cắn, chữa mụn nhọt, viêm tuyến vú, sốt rét, ho lao, ho lâu ngày, hen suyễn. Dùng ngoài với tác dụng sát trùng những nơi bị sưng đau, vết rắn cắn, tràng nhạc, mụn lở, nhọt [1]. Mặc dù có nhiều công bố về chi Paris ở nước ngoài, nhưng chủ yếu tập trung trên đối tượng Paris polyphylla var. yunnanensis, các nghiên cứu trên đối tượng Paris polyphylla var. chinensis còn khá khiêm tốn chính vì vậy chúng tôi
thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của bảy lá một hoa - Paris polyphylla var. chinensis Franchet thu thập tại Việt Nam” 2. Mục tiêu luận án: Đề tài nghiên cứu thực hiện hai mục tiêu nghiên cứu sau: Mục tiêu 1: Nghiên cứu thành phần hóa học Paris polyphylla var. chinensis Mục tiêu 2: Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro của bảy lá một hoa 3. Luận án đã thực hiện những nội dung nghiên cứu sau: - Nghiên cứu thành phần hóa học loài Paris polyphylla var. chinensis Franchet trồng tại Lào Cai: + Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được. + Bước đầu xây dựng dấu vân tay hóa học để phân biệt một số loài thuộc chi Paris. - Khảo sát khả năng gây độc tế bào ung thư và tìm hiểu cơ chế tác dụng của hợp chất paris saponin II trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7. NỘI DUNG CHÍNH CỦA LUẬN ÁN CHƢƠNG I: TỔNG QUAN Phần tổng quan tập hợp các nghiên cứu trong nước và ngoài nước về các vấn đề: - Đặc điểm thực vật, phân bố và công dụng chi Paris; - Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Paris; - Đặc điểm thực vật; phân bố; và các nghiên cứu về thành phần hóa học; hoạt tính sinh học của cây bảy lá một hoa Paris polyphylla var. chinensis. CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng Mẫu tiêu bản số P8102013 và N.T.T 01/08/2015 được giám định tên khoa học là Paris polyphylla var. chinensis Franchet (tên đồng nghĩa là: Paris chinensis Franchet) thuộc họ Trọng Lâu. Mẫu dược liệu PPC sử dụng trong nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học là mẫu trồng tại Sapa – Lào Cai. Cả hai mẫu tiêu bản được lưu tại Khoa hóa Thực vật 2 – Viện Dược liệu 2.2. Phƣơng pháp hóa học Sử dụng các phương pháp chiết lỏng - rắn và lỏng - lỏng để chiết xuất các phân đoạn, các lớp chất có độ phân cực khác nhau. Sử dụng chủ yếu phương pháp sắc ký như lớp mỏng để phân tích các phần
chiết, kiểm tra độ tinh khiết của các chất; sắc ký cột với các chất hấp phụ khác nhau để phân lập các chất. Bên cạnh đó luận án cũng sử dụng phương pháp kết tinh lại tách và làm sạch các chất. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các thông số vật lý: điểm chảy, năng suất quay cực và các phương pháp phổ: phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR): 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT, và hai chiều (2D-NMR): HSQC, HMBC, COSY. Phương pháp xác định dấu vân tay hóa học Sử dụng phương pháp TLC và HPLC trong nghiên cứu đa dạng hóa học của các mẫu thực vật thuộc chi Paris. 2.3. Các phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học 2.3.1. Các phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào Sử dụng phương pháp MTT theo mô hình Mosmann (1983), trên 4 dòng tế bào ung thư: A549, HL-60, Hela và Caco-2. Sử dụng phần mềm chuyên dụng là graphpad prism 5 để xác định giá trị IC50. Số liệu định lượng được trình dưới dạng ± SE. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thư vú MCF-7 bổ sung yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF): Tiến hành tương tự như phương pháp MTT. Sử dụng phần mềm phân tích phương sai ANOVA để xử lý số liệu và sự khác biệt được coi là có ý nghĩa khi p
độ biểu hiện của các protein p53, p21, p27, Bax, cylclin D1, p-Rb, Rb, E2F1, β- actin trong tế bào ung thư vú MCF7 bằng kỹ thuật lai Western blot. Hình ảnh được chụp lại bằng máy ImageQuant 350 analyzer (Amershan Biosciences, Little Chalfont, UK). Sử dụng phần mềm xử lý số liệu Student’s t-test. Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa khi p
3.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất đã phân lập từ PPC Hợp chất RE1: bột trắng xốp, mp. 207-209OC APCI-MS m/z 415 [M+H]+ 1 H-NMR (500MHz, CDCl3) δH: 5,35 (1H, d, J = 5,5 Hz, H-6), 4,41 (1H, dd, J = 7,5, 15,0 Hz, H-16), 3,53 (1H, m, H-3), 1,03 (3H, s, H-19), 0,79 (3H, s, H-18), 0,79 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-27). 13 C-NMR (500MHz, CDCl3) δC: 141,0 (C-5), 121,6 (C-6), 109,4 (C-22), 81,0 (C-16), 71,9 (C-3), 67,0 (C-26), 62,3 (C-17), 56,7 (C-14), 50,2 (C-9), 42,4 (C-4), 41,8 (C-20), 40,4 (C-13), 39,9 (C-12), 37,4 (C-1), 36,8 (C-10), 32,2 (C-2), 32,0 (C-15), 31,8 (C-23), 31,6 (C-7), 31,5 (C-8), 30,5 (C-25), 29,0 (C-24), 21,0 (C-11), 19,6 (C-19), 17,3 (C-27), 16,4 (C-18), 14,7 (C-21). Hợp chất RE2: dạng vô định hình màu trắng, mp. 286°C Hiện màu tím đậm với thuốc hiện vanillin/ H2SO4 đặc, là hỗn hợp của 2 hợp chất RE2A và RE2B Hợp chất RE2A 1 H-NMR (CDCl3&CD3OD, 500 MHz) δH: 3,60 (1H, m, H-3), 5,24 (1H, brs, H-6), 0,72 (3H, s, H-18), 1,03 (3H, s, H-19), 0,94 (3H, d, J= 6,5 Hz, H-21), 5,17 (1H, dd, J=15,0; 8,5 Hz, H-22), 5,04 (1H, dd, J=15,0; 8,5 Hz, H-23), 0,79 (3H, d, J= 7,0 Hz, H- 26), 0,87 (3H, d, J= 7,0 Hz, H-27), 0,80 (3H, t, J= 7,0 Hz, H-29). Glc: 4,40 (1H, d, J= 7,5 Hz, H-1), 3,41 (1H, dd, J= 5,0; 8,5 Hz, H-2), 3,22 (1H, dd, J= 5,0; 8,5, Hz, H-3), 3,41 (1H, dd, J= 8,5 Hz, H-4), 3,29 (1H, m, H-5), 3,85 (1H, dd, J= 12,0; 2,0 Hz, H-6a), 3,74 (1H, dd, J= 12; 5,0 Hz, H-6b). 13 C-NMR (CDCl3&CD3OD, 125 MHz), δC: 140,2 (C-5), 138,2 (C-22), 129,2 (C-23), 121,9 (C-6), 75,7 (C-3), 56,7 (C-14), 55,8 (C-17), 51,1 (C-24), 50,1 (C-9),42,1 (C-13), 40,3 (C-20), 39,6 (C-4), 38,5 (C-12), 37,1 (C-1), 36,5 (C-10), 31,7 (C-7), 31,7 (C-8), 31,7 (C-25), 29,4 (C-2), 28,7 (C-16), 25,2 (C-28), 24,2 (C-15), 20,9 (C-11), 20,9 (C-
21), 20,8 (C-27), 11,9 (C-29), 19,5 (C-19), 18,7 (C-26), 11,8 (C-18). Glc: 100,9 (C-1), 79,0 (C-3), 79,0 (C-5), 73,4 (C-2), 69,7 (C-4), 61,3 (C-6). Hợp chất RE2B 1 H-NMR (CDCl3&CD3OD, 500 MHz), δH: 3,60 (1H, m, H-3), 5,04 (1H, brs, H- 6), 0,70 (3H, s, H-18), 1,03 (3H, s, H-19), 0,94 (3H, d, J= 6,5 Hz, H-21), 0,81 (3H, d, J= 7,0 Hz, H-26), 0,83 (3H, d, J= 7,0 Hz, H-27), 0,86 (3H, t, J= 7,0 Hz, H-29). Glc: 4,40 (1H, d, J= 7,5 Hz, H-1), 3,41 (1H, dd, J= 5,0; 8,5 Hz, H-2), 3,22 (1H, dd, J= 5,0; 8,5, Hz, H-3), 3,41 (1H, dd, J= 8,5 Hz, H-4), 3,29 (1H, m, H-5), 3,85 (1H, dd, J= 12,0; 2,0 Hz, H-6a), 3,74 (1H, dd, J= 12; 5,0 Hz, H-6b). 13 C-NMR (CDCl3&CD3OD, 125 MHz), δC: 140,2 (C-5), 121,9 (C-6), 75,7 (C-3), 56,6 (C-14), 55,9 (C-17), 50,1 (C-9), 45,7 (C-24), 42,2 (C-13), 39,5 (C-4), 38,5 (C-12), 37,1 (C-1), 36,5 (C-10), 35,7 (C-20), 33,8 (C-22), 31,7 (C-7), 31,7 (C-8), 29,4 (C-2), 29,0 (C-25), 28,1 (C-16), 25,9 (C-23), 24,1 (C-15), 22,9 (C-28), 20,9 (C-11), 19,5 (C-19), 19,0 (C-27), 18,8 (C-26), 18,5 (C-21), 11,6 (C-18), 11,7 (C-29). Glc: 100,9 (C-1), 79,0 (C-3), 69,7 (C-4), 79,0 (C-5), 73,4 (C-2), 61,3 (C-6). Hợp chất RE3 (PE07): bột màu trắng HR-ESI-MS m/z 885,4837 [M+H]+ IR (KBr) υmax: 3429, 2935, 1450, 1048cm-1 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 5,13 (1H, H-1Rha), 4,43 (1H, d, J = 7.5 Hz, H- 1GlcI), 4,27 (1H, J = 8,0 Hz H-1GlcII), 3,71 & 3,36 (2H, m, H-GlcI), 3,62 & 3,44 (2H, m, H-GlcII), 3,52 (1H, t, J = 6,0, 17,0 Hz, H-3), 1,07 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-6Rha), 0,96 (3H, s, H-19), 0,90 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-21), 0,73 (3H, s, H-18), 0,73 (3H, d, J = 5,5 Hz, H-27). 13 C-NMR (125MHz, DMSO-d6) δC: 140,3 (C-5), 121,3 (C-6), 108,4 (C-22), 80,2 (C- 16), 76,0 (C-3), 65,9 (C-26), 61,8 (C-17), 55,8 (C-14), 49,6 (C-9), 41,1 (C-20), 40,1 (C- 13), 39,1 (C-12), 37,4 (C-4), 36,9 (C-1), 36,2 (C-10), 31,5 (C-7), 31,5 (C-15), 31,0 (C- 8), 31,0 (C-23), 29,8 (C-25), 29,0 (C-2), 28,5 (C-24), 20,4 (C-11), 19,0 (C-19), 17,1 (C- 27), 16,0 (C-18), 14,7 (C-21). GlcI: 98,0 (C-1), 88,3 (C-3), 76,0 (C-5), 75,2 (C-2), 68,5 (C-4), 61,0 (C-6). Rha: 100,5 (C-1), 72,0 (C-4), 70,5 (C-2), 70,3 (C-3), 68,1 (C-5), 17,8 (C-6). GlcII: 103,3 (C-1), 77,0 (C-3), 76,8 (C-5), 73,4 (C-2), 70,0 (C-4), 60,8 (C-6). Hợp chất RE4 (PE09): bột màu trắng, mp. 265-266oC : -77,5 (c 0,72, MeOH) APCI – MS m/z = 935,3 (M+Cl)- 1 H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δH: 5,33 (1H, d, J=4,0Hz, H-6), 5,13 (1H, brs, H- 1Rha), 5,05 (1H, H-Glc), 4,43(1H, d, J=8,0 Hz, H-1Glc), 3,9 (1H, t, J=6,5Hz, H- 3GlcI), 3,53 (1H, m, H-3), 3,51 (1H, t, J=8,0 Hz, H-16), 3,41&3,73 (2H, m, H-6GlcII), 3,38 & 3,68 (2H, m, H-6GlcI), 1,08 (3H, d, J=6,5Hz, H-6Rha), 0,96 (3H, s, H-19), 0,79 (3H, d, J=7,5Hz, H-21), 0,74 (3H, d, J=6 Hz, H-27), 0,73 (3H, s, H-18). 13 C-NMR (125MHz, DMSO-d6) δC: 140,2 (C-5), 121,3 (C-6), 108,7 (C-22), 88,9 (C- 17), 88,3 (C-16), 76,0 (C-3), 65,8 (C-26), 51,9 (C-14), 49,5 (C-9), 44,6 (C-20), 44,3 (C- 13), 36,9 (C-1), 37,4 (C-4), 36,3 (C-10), 30,8 (C-23), 28,9 (C-2), 31,5 (C-7), 31,5 (C-8), 29,6 (C-25), 31,3 (C-12), 31,2 (C-15), 28,0 (C-24), 18,9 (C-19), 16,6 (C-27), 20,0 (C- 11), 17,0 (C-18), 9,3 (C-21). GlcI: 97,9 (C-1), 88,3 (C-3), 76,9 (C-5), 75,1 (C-2), 68,4 (C-4), 60,9 (C-6). Rha: 100,5 (C-1), 71,9 (C-4), 70,3 (C-3), 69,9 (C-2), 68,1 (C-5), 17,7
(C-6). GlcII: 103,2 (C-1), 76,8 (C-3), 76,0 (C-5), 73,3 (C-2), 70,4 (C-4), 60,7 (C-6). Hợp chất RE5: bột màu trắng, mp. 281-283oC APCI-MS m/z: 905,4 [M+Cl]- 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 5,35 (1H, H-6), 5,05 (1H, H-1Ara), 4,89 (1H, d, J =2,0 Hz, H-1Rha), 4,43(1H, d, J =6,0 Hz, H-1Glc), 3,47 & 3,63 (2H, m, H-5Ara), 3,42 & 3,53 (2H, m, H-6Glc), 1,1 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-6Rha), 0,96 (3H, s, H-19), 0,80 (3H, d, J = 7,5 Hz, H-21), 0,75 (3H, d, J = 5,5 Hz, H-27), 0,74 (3H, s, H-18). 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 140,2 (C-5), 121,3 (C-6), 108,7 (C-22), 88,9 (C- 16), 88,3 (C-17), 76,3 (C-3), 65,8 (C-26), 51,9 (C-14), 49,5 (C-9), 44,3 (C-13), 43,6 (C- 20), 37,6 (C-4), 36,9 (C-1), 36,3 (C-10), 31,6 (C-12), 31,5 (C-8), 31,4 (C-15), 31,2 (C- 7), 30,8 (C-23), 29,7 (C-25), 29,0 (C-2), 28,0 (C-24), 20,0 (C-11), 19,0 (C-19), 17,1 (C- 18), 16,6 (C-27), 9,3 (C-21). Glc: 98,0 (C-1), 76,2 (C-4), 76,1 (C-5), 75,9 (C-2), 74,9 (C-3), 61,3 (C-6). Rha: 107,8 (C-1), 71,9 (C-4), 70,6 (C-3), 70,4 (C-2), 67,9 (C-5), 17,7 (C-6). Ara: 100,0 (C-1), 84,5 (C-4), 81,4 (C-2), 76,5 (C-3), 60,0 (C-5). Hợp chất AE6: dạng sáp màu vàng nhạt 1 H-NMR (500MHz, metanol-d4) δH: 5,37 (m, H 16, H9, H12, H13, H15&H10); 4,26 (d, J=7,5 Hz, H1ʹ), 4,18 & 4,17 (dd, J=5,0&10,5 Hz, H-Sn1), 4,01 (m, H-Sn2), 3,68 & 3,93 (2H, dd, J=5,0, 10,5 Hz, H-Sn3), 3,74&3,54 (2H, m, H6ʹ), 0,99 ( t, J=7,5Hz). 13 C-NMR (125MHz, metanol-d4) δC: 175,4 (C1), 132,7 (C16), 131,0 (C9), 129,2 (C12), 129,2 (C13), 128,8 (C15), 128,1 (C10), 105,2 (C1ʹ), 76,7 (C3ʹ), 74,7 (C5ʹ), 72,5 (C2ʹ), 71,8 (Sn3), 70,2 (C4ʹ), 69,6 (C-Sn2), 66,5 (C-Sn1), 62,4 (C6ʹ), 34,9 (C2), 30,6 (C7), 30,2 (C6), 30,1 (C4), 30,1 (C5), 28,1 (C8), 26,5 (C11), 26,4 (C14), 25,9 (C3), 21,5 (C17), 14,7 (C18). Hợp chất AE7: tinh thể hình kim màu trắng, mp. 168-170oC 1 H-NMR (500MHz, CDCl3) δH: 5,35 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-6), 5,16 (1H, dd, J = 9,0, 15,5 Hz, H-22), 5,02 (1H, dd, J = 8,5, 15,0 Hz, H-23), 3,52 (m, H-3), 1,02 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21), 1,01 (3H, s, H-18), 0,85 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-29), 0,82 (3H, d, J = 7,5 Hz, H-28), 0,80 (3H, d, J = 7,5 Hz, H-26). Hợp chất AE8: bột trắng, mp. 219-221oC. APCI-MS m/z: 431 [M+H]+ 1 H-NMR (500MHz, CDCl3) δH: 5,35 (1H, d, J = 5,5 Hz, H-6), 3,99 (1H, t, J = 7,5 Hz H- 16), 3,51 (1H, m, H-3), 1,03 (3H, s, H-19), 0,89 (3H, m, H-21), 0,82 (3H, s, H-18), 0,80 (3H, J = 6,5Hz, H-27). 13 C-NMR (125MHz, CDCl3) δC: 140,8 (C-5), 121,3 (C-6), 110,1 (C-22), 90,9 (C-16), 90,2 (C-17), 71,7 (C-3), 66,8 (C-26), 52,9 (C-14), 49,6 (C-9), 44,6 (C-20), 43,7 (C-13), 42,2 (C-4), 37,2 (C-1), 36,6 (C-10), 32,0 (C-23), 31,6 (C-8), 31,6 (C-2), 31,6 (C-12), 31,2 (C-7), 30,7 (C-25), 30,1 (C-15), 28,1 (C-24), 20,7 (C-11), 19,4 (C-19), 17,1 (C- 27), 17,0 (C-18), 8,1 (C-21). Hợp chất AE9 (PE34): bột màu vàng, mp. 313-314ºC 1 H-NMR (500MHz, actone-d6) δH: 7,82 (1H, d, J=2,0 Hz,H2΄), 7,69 (1H, dd, J=8,5, 2,0 Hz, H6΄), 6,99 (1H, d, J=8,5 Hz, H5΄), 6,51 (1H, d, J=2,0 Hz, H8), 6,26 (1H, d, J=2,0 Hz, H6). 13 C-NMR (125MHz, actone-d6) δC: 176,5 (C4), 164,9 (C7), 162,3 (C5), 157,7 (C9),
148,3 (C4΄), 146,9 (C2), 145,8 (C3΄), 136,7 (C3), 123,7 (C1΄), 121,4 (C6΄), 116,2 (C5΄), 115,7 (C2΄), 104,1 (C10), 99,1 (C8), 94,4 (C6). Hợp chất AE11 (PE32): bột màu trắng, mp. 185-187ºC APCI-MS m/z 265 [M+Na]+, 240,9 [M-H]- 1 H-NMR (500Hz, DMSO-d6) δH: 7,68 (1H, s, H-2), 6,15 (1H, t, J = 6,5; 14 Hz, H-1′), 4,23 (1H, s, H-3′), 3,75 (1H, H-4′), 3,55 (2H, m, H-5′), 2,07 (2H, m, H-2′), 1,77 (3H, s, 3-CH3) 13 C-NMR (125Hz, DMSO-d6) δC: 163,9 (C-4), 150,6 (C-6), 136,2 (C-2), 109,5 (C-3), 83,9 (C-1′), 87,3 (C-4′), 70,5 (C-3′), 61,4 (C-5′), 39,5 (C-2′), 12,3 (3-CH3). Hợp chất AE12 (PE38):bột màu kem, mp. 261-263 °C UV (MeOH) λmax: 217, 306 IR (KBr): υmax 3277 (OH), 1583, 1511, 1460 (C-H) ESI-MS m/z: 227 [M-H]- 1 H-NMR (500 MHz, metanol-d4) δH: 6,47 (1H, d, 2 Hz, H-2, H-6), 6,18 (1H, t, H-4), 7,36 (1H, d, 3 Hz, H-2′, H-6′), 6,79 (1H, d, 8,5 Hz, H-3′), 6,78 (1H, d, 8,5 Hz, H-5′), 6,83 (1H, 16,3 Hz, H-a), 6,96 (1H, d, 16,3 Hz, H-b). 13 C-NMR (500 MHz, metanol-d4) δC: 141,3 (C-1), 105,8 (C-2, C-6), 159,6 (C-3, C-5), 102,7 (C-4), 130,4 (C-1′), 128,8 (C-2′, C-6′), 116,5 ( C-3′, C-5′), 158,3 (C-4′), 127,0 (C- a), 129,4 (C-b). Hợp chất AE13 (PE31) 1 H-NMR (500 MHz, metanol-d4) δH: 7,17 (2H, d, J=9,0 Hz, H2, H6), 7,06 (2H, d, J=8,5 Hz, H2ʹ, H6ʹ), 6,84 (1H, d, J=16,0 Hz, H-7ʹ), 6,79 (2H, d, J=8,5 Hz, H3, H5), 6,67 (2H, d, J=8,5 Hz, H3ʹ, H5ʹ), 6,65 (1H, d J=2,0 Hz, H-14ʹ), 6,59 (1H, d, J=16,0 Hz, H8ʹ), 6,27 (1H, d, J=1,5 Hz, H-12ʹ), 6,21 (1H, t, J=2,0 Hz, H-12), 6,19 (2H, d, J=2,0 Hz, H10, H14), 5,39 (1H, d, J=6,5 Hz, H-7), 4,37 (1H, d, J=6,5 Hz, H8). 13 C-NMR (125 MHz, metanol-d4) δC: 162,8 (C-11ʹ), 160,0 (C-11&C-13), 159,6 (C13ʹ), 158,4 (C4ʹ), 158,3 (C4), 147,3 (C9), 137,0 (C9ʹ), 133,9 (C1), 130,4 (C7ʹ), 129,9 (C1ʹ), 128,8 (C2ʹ&C6ʹ), 128,2 (C2&C6), 123,7 (C8ʹ), 120,1 (C10ʹ), 116,4 (C3ʹ&C5ʹ), 116,3 (C3&C5), 107,5 (C10&C14), 104,4 (C14ʹ), 102,3 (C12), 96,9 (C12ʹ), 94,8 (C7), 58,3 (C8). Hợp chất AE14 (PE34): bột màu vàng, mp. 181-183OC 1 H-NMR (500MHz, metanol-d4) δH: 7,35 (1H, d, J=2,0Hz, H-2΄), 7,32 (1H, dd, J=2,0, 8,5Hz, H-6΄), 6,93 (1H, d, J=8,5Hz, H-5΄), 6,37 (1H, d, J=1,5Hz, H-8), 6,21 (1H, d, J=1,5Hz, H-6), 5,37 (1H, d, J=1,0Hz, H1''), 4,87 (1H, H-4''), 4,24 (1H, br d, J=3,0, H- 2''), 3,76 (1H, dd, J=3,0, 9,0Hz, H-3''), 3,33 (1H, m, H-5''), 0,96 (3H, d, J=6,0Hz, H-6''). 13 C-NMR (125MHz, metanol-d4) δC: 179,6 (C4), 165,8 (C7), 163,1 (C5), 158,5 (C9), 158,3 (C2), 149,7 (C4'),146,4 (C3'), 136,2 (C3), 122,9 (C1'), 122,9 (C6'), 116,9 (C5'), 116,4 (C2'), 105,9 (C10), 103,5 (C1''), 99,8 (C6), 94,7 (C8), 73,3 (C4''),72,1 (C2''), 72,0 (C3''), 71,9 (C5''),17,6 (C6'') Hợp chất AE15 (PE 25): bột màu trắng, ESI-MS (m/z) 722 [M-H]- 1 H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δH: 3,46 (1H, d, J=5,5Hz, H-3), 5,32 (1H, H-6), 0,74 (3H, s, H-18), 0,97 (3H, s, H-19), 0,91 (3H, d, J=7,0Hz, H-21), 0,73 (3H, d, J=4,5Hz, H-27), 4,27 (1H, d, J=8,0Hz, H-1Glc), 3,75&3,40(2H, m, H-6Glc), 4,70 (1H, H-1Rha), 1,09 (3H, d, J=6,5Hz, H-6Rha).
13 C-NMR (125MHz, DMSO-d6) δC: 36,8 (C-1), 30,9 (C-2), 77,1 (C-3), 38,3 (C-4), 140,4 (C-5), 121,0 (C-6), 31,5 (C-7), 31,0 (C-8), 49,5 (C-9), 36,4 (C-10), 20,4 (C-11), 39,0 (C-12), 39,8 (C-13), 55,7 (C-14), 31,4 (C-15), 80,2 (C-16), 61,8 (C-17), 15,9 (C- 18), 19,1 (C-19), 41,1 (C-20), 14,5 (C-21), 108,4 (C-22), 29,2 (C-23), 28,4 (C-24), 29,8 (C-25), 65,9 (C-26), 17,0 (C-27). Glc: 100,7 (C-1), 73,7 (C-2), 75,2 (C-3), 76,7 (C-4), 75,3 (C-5), 61,0 (C-6). Rha: 100,5 (C-1), 70,7 (C-2), 70,6 (C-3), 71,9 (C-4), 68,3 (C-5), 17,7 (C-6). Hợp chất AE16 (PE24): Bột màu trắng. ESI-MS m/z= 745,4 [M+Na]+ 1 H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δH: 3,48 (1H, m, H-3), 5,32 (1H, H-6), 0,73 (3H, s, H- 18), 0,96 (3H, s, H-19), 0,90 (3H, d, J=7,0 Hz, H-21), 0,73 (3H, d, J=6,0 Hz, H-27), 4,35 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1Glc), 3,41 (2H, m, H-6Glc), 4,70 (1H, d, J=1,0 Hz, H-1Rha), 1,08 (3H, d, J=6,0Hz, H-6Rha). 13 C-NMR (125MHz, DMSO-d6) δC: 36,8 (C-1), 29,0 (C-2), 76,1 (C-3), 37,6 (C-4), 140,3 (C-5), 121,2 (C-6), 31,5 (C-7), 31,0 (C-8), 49,5 (C-9), 36,4 (C-10), 20,3 (C-11), 39,0 (C-12), 39,9 (C-13), 55,8 (C-14), 30,9 (C-15), 80,2 (C-16), 61,8 (C-17), 16,0 (C- 18), 18,9 (C-19), 41,1 (C-20), 14,5 (C-21), 108,4 (C-22), 31,4 (C-23), 28,5 (C-24), 29,8 (C-25), 65,9 (C-26), 17,0 (C-27). Glc: 98,2 (C-1), 76,3 (C-2), 77,7 (C-3), 70,2 (C- 4), 76,5 (C-5), 61,0 (C-6). Rha: 100,0 (C-1), 70,6 (C-2), 70,5 (C-3), 71,9 (C-4), 67,8 (C-5), 17,7 (C-6). Hợp chất AB17 (PE29): Dạng bột màu trắng, mp. 167-169OC. HR-ESI-MS m/z: 885,4829 [M+H]+. 1 H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δH: 5,33 (1H, d, J=4,5Hz, H-6), 4,77 (1H, brs, H- 1RhaI), 4,72 (1H, H-1RhaII), 4,43 (1H, d, J=8,0 Hz, H-1Glc), 4,20 (1H, m, H-16), 3,66 (1H, m, H-3), 3,63&3,43 (2H, m, H-6Glc), 3,50 (1H, m, H-12), 3,46 (1H, H-3Glc), 3,2 (1H, H-2Glc), 1,10 (3H, d, J=6,0 Hz,H-6RhaI), 1,09 (3H, d, J=4,5 Hz,H-6RhaII), 0,98 (3H, d, J=7,0 Hz, H-21), 0,93 (3H, s, H-19), 0,73 (3H, d, J=6,5 Hz, H-27), 0,71 (3H, s, H-18). 13 C-NMR (125MHz, DMSO-d6) δC: 140,4 (C-5), 121,4 (C-6), 108,4 (C-22), 80,0 (C- 16), 76,1 (C-3), 70,1 (C-12), 66,0 (C-26), 52,6 (C-17), 47,2 (C-14), 44,0 (C-13), 43,4 (C-9), 41,3 (C-20), 37,5 (C-4), 36,7 (C-1), 36,1 (C-10), 31,5 (C-15), 31,1 (C-8), 31,0 (C-23), 30,0 (C-2), 29,9 (C-25), 28,5 (C-24), 28,2 (C-11), 18,8 (C-19), 16,6 (C-27), 16,0 (C-18), 14,4 (C-21). Glc: 97,8 (C-1), 85,0 (C-3), 77,2 (C-2), 76,4 (C-5), 69,0 (C- 4), 60,8 (C-6). RhaI: 101,0 (C-1), 71,8 (C-4), 70,6 (C-3), 70,5 (C-2), 68,9 (C-5), 17,8 (C-6). RhaII: 102,0 (C-1), 71,3 (C-4), 70,5 (C-3), 70,5 (C-2), 68,5 (C-5), 17,7 (C-6). Hợp chất AB18 (PE 36): Tinh thể màu trắng đục, mp. 274-276 OC. APCI-MS: m/z = 903,6 [M+Cl]-. 1 H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δH: 5,33 (1H, H-6), 5,02 (1H, H-RhaI), 4,39 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-Glc), 4,93 (1H, H-RhaII), 3,57 & 3,41 (2H, m, H-Glc), 3,38 (1H, m, H3), 1,10 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-6RhaII), 1,09 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-RhaI), 0,96 (3H, s, H- 19), 0,90 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-21), 0,73 (d, J = 5,5 Hz, 3H), 0,73 (3H, s, H-18). 13 C-NMR (125MHz, DMSO-d6) δC: 140,3 (C-5), 121,2 (C-6), 108,4 (C-22), 80,2 (C- 16), 76,3 (C-3), 65,9 (C-26), 61,8 (C-17), 55,8 (C-14), 49,6 (C-9), 41,1 (C-20), 40,0 (C- 13), 39,0 (C-12), 37,4 (C-4), 36,8 (C-1), 36,4 (C-10), 31,5 (C-7), 31,5 (C-15), 31,0 (C-
8), 30,9 (C-2), 29,8 (C-25), 29,0 (C-23), 28,5 (C-24), 20,4 (C-11), 19,0 (C-19), 17,1 (C- 18), 16,0 (C-21), 14,6 (C-27). Glc: 98,2 (C-1), 77,0 (C-2), 76,8 (C-4), 76,1(C-5), 75,2 (C-3), 60,1(C-6). RhaI: 100,3 (C-1), 71,9 (C-4), 70,6 (C-3), 70,4 (C-2), 68,0 (C-5), 17,8 (C-6). RhaII: 100,5 (C-1), 71,9 (C-4), 70,7 (C-2), 70,6 (C-3), 68,7 (C-5), 17,7 (C-6). Hợp chất AB19 (PE22): bột màu trắng, mp. 203-206 C : -91,8 (c 0,0055, pyridine) HR-ESI-MS m/z 1015,5472 (M+H)+, 1037,5292 (M+Na)+ 1 H-NMR (500 MHz, pyridin-d5) δH: 6,43 (1H, br s, H-1RhaI), 6,31 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-1RhaIII), 5,82 (1H, br s, H-1RhaII), 5,33 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-6), 4,97 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1Glc), 4,25 & 4,2 (2H, m, H-6Glc), 1,79 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-6RhaI), 1,63 (3H, d, J = 3,0 Hz, H-6RhaIII), 1,61 (3H, d, J = 3 Hz, H-6RhaII), 1,16 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-21), 1,07 (3H, s, H-19), 0,85 (3H, s, H-18), 0,72 (3H, d, J = 5,5 Hz, H-27). 13 C-NMR (125 MHz, pyridin-d5) δC: 141,3 (C-5), 122,3 (C-6), 109,7 (C-22), 81,6 (C- 16), 78,2 (C-3), 67,3 (C-26), 63,4 (C-17), 57,1 (C-14), 50,8 (C-9), 42,4 (C-20), 40,9 (C- 13), 40,3 (C-12), 39,4 (C-4), 38,0 (C-1), 37,6 (C-10), 32,7 (C-7), 32,7 (C-15), 32,3 (C- 23), 32,1 (C-8), 31,1 (C-25), 30,6 (C-2), 29,7 (C-24), 21,6 (C-11), 19,9 (C-19), 17,8 (C- 27), 16,8 (C-18), 15,5 (C-21). Glc: 100,8 (C-1), 78,5 (C-2), 78,4 (C-3), 78,2 (C-4), 77,5 (C-5), 61,7 (C-6). Rha I: 102,7 (C-1), 74,6 (C-4), 73,8 (C-2), 73,1 (C-3), 70,0 (C-5), 19,1 (C-6). Rha II: 102,7 (C-1), 80,9 (C-4), 73,8 (C-2), 73,3 (C-3), 68,9 (C-5), 19,4 (C- 6). Rha III: 103,8 (C-1), 74,5 (C-4), 73,3(C-3), 70,9 (C-5), 70,3 (C-2), 18,9 (C-6). Hợp chất AB20 (PE26): Bột màu ngà, mp. 240-242 C ESI-MS m/z=1053,3 [M+Na]+ 1 H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δH: 5,33 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-6), 5,06 (1H, H- 1RhaIII), 5,02 (1H, H-1RhaI), 4,68 (1H, H-1RhaII), 4,38 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1Glc), 3,58 & 3,41 (2H, m, H-6Glc), 3,48 (1H, m, H-3), 1,12 (3H, d, J = 2,5 Hz, H-6RhaII), 1,11 (3H, d, J = 2,5 Hz, H-6RhaI), 1,08 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-6RhaIII), 0,95 (3H, s, H- 19), 0,78 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-21), 0,74 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-27), 0,73 (3H, s, H-18). 13 C-NMR (125MHz, DMSO-d6) δC: 140,3 (C-5), 121,3 (C-6), 108,7 (C-22), 88,9 (C- 17), 88,3 (C-16), 76,3 (C-3), 65,8 (C-26), 52,0 (C-14), 49,5 (C-9), 44,3 (C-13), 43,6 (C- 20), 37,6 (C-4), 36,9 (C-1), 36,3 (C-10), 31,6 (C-8), 31,6 (C-12), 31,4 (C-15), 31,2 (C- 7), 30,8 (C-23), 29,7 (C-25), 29,0 (C-2), 28,0 (C-24), 20,0 (C-11), 19,0 (C-19), 17,1 (C- 27), 16,6 (C-18), 9,3 (C-21). Glc: 98,2 (C-1), 77,1 (C-2), 76,1 (C-4), 76,0 (C-3), 75,3 (C-5), 60,0 (C-6). Rha I: 100,3 (C-1), 71,9 (C-2), 71,9 (C-4), 71,3 (C-3), 67,9 (C-5), 17,8 (C-6). Rha II: 100,0 (C-1), 77,9 (C-4), 71,3 (C-2), 70,7 (C-3), 66,8 (C-5), 19,0 (C- 6). RhaIII: 101,1 (C-1), 71,9 (C-4), 70,6 (C-2), 70,3 (C-3), 68,9 (C-5), 17,7 (C-6). 3.3. Xây dựng dấu vân tay hóa học Nguyên liệu: 6 mẫu thực vật do Ths. Nguyễn Quỳnh Nga – Khoa Tài nguyên Dược liệu – Viện Dược liệu cung cấp (trong khuôn khổ đề tài quỹ gen cấp Viện Dược liệu) cùng vào thời điểm là 3/2016. Các mẫu được cung cấp có sự tương đồng khá cao như: đối với phần trên mặt đất gồm thân lá và hoa; đối với phần dưới mặt đất gồm từ 5 đến 6 đốt trên phần thân rễ. 05 hợp chất tinh khiết thuộc nhóm saponin spirotan phân lập từ PPC: gracillin (RE3), paris saponin D (RE4), paris saponin H (RE5), paris saponin II (AB19) và paris saponin VII
(AB20). Chuẩn bị mẫu: Cân 250 mg gồm 12 mẫu của 6 mẫu dược liệu (được mã hóa số) cho vào ống nghiệm 5 ml metanol chiết nóng trong 10 phút. Sau đó, để nguội tự nhiên rồi lọc dịch chiết qua màng lọc 0,22 µm và bổ sung thêm metanol để đạt 5 ml. Đối với 05 chất tinh khiết gồm: gracillin (RE3), paris saponin D (RE4), paris saponin H (RE5), paris saponin II (AB19) và paris saponin VII (AB20) được tiến hành pha trong MeOH với nồng độ 1 mg/ml. Các mẫu được cho vào lọ sắc ký HPLC 1 ml, để tiến hành sắc ký TLC và HPLC. Tiến hành TLC xây dựng dấu vân tay hóa học được lập chương trình tiêm mẫu tự động trên máy Linomat 5.0. Tiến hành HPLC xây dựng dấu vân tay hóa học Tiến hành khảo sát chương trình chạy và tham khảo các tài liệu tiến hành với mẫu có saponin steroid hệ dung môi chạy HPLC là: axetonitril (A)- axid phosphoric 0,1% nước (B); tốc độ dòng: 1ml/phút; bước sóng phát hiện: 205 nm và nhiệt độ cột là 300C Kết quả được trình bày như trong phần 4.2 3.4. Hoạt tính sinh học 3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư bằng phương pháp MTT a. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư bằng phương pháp MTT Tiến hành trên 8 mẫu cao phân đoạn và 8 hợp chất tinh khiết spirostan steroid phân lập từ PPC gồm: RE1, RE3, RE4, RE5, AE8, AB18, AB19 và AB20. Kết quả được trình bày ở phần 4.3.1 b. Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thư vú MCF-7 bổ sung EGF Tiến hành trên 8 mẫu cao phân đoạn và 6 hợp chất tinh khiết phân lập từ PPC. Kết quả được trình bày ở phần 4.3.1 3.4.2. Đánh giá ảnh hưởng của paris saponin II lên hoạt độ của hai yếu tố phiên mã NF-κB và Ap-1 gây bởi yếu tố kích thích viêm LPS trong đại thực bào RAW 264.7. Tiến hành các bước như trong kít luciferase (Promega, WI), có sử dụng yếu tố kích thích viêm LPS trong đại thực bào RAW 264.7. Thiết bị đo cường độ sáng Luminometer (LB941, Berthold Technologies) xác định hoạt độ của enzym luciferase. Thông qua mức độ hoạt độ của luciferase cho quy đổi hoạt độ tương đương của hai yếu tố NF-κB và Ap-1. Phép thử tiến hành tại các nồng độ hợp chất paris saponin II: 1, 3, 10, 30 µM (-): Chứng âm không bổ sung LPS và mẫu thử. (+): Chứng dương có bổ sung LPS và không bổ sung mẫu thử. Kết quả được trình bày ở phần 4.3.2 3.4.3. Đánh giá mức độ biểu hiện của các protein trong tế bào ung thư vú MCF- 7 dưới tác dụng paris saponin II Tế bào MCF-7 được nuôi qua đêm trong các đĩa 6 cm ở nhiệt độ 37OC. Hợp
chất paris saponin II tại các nồng độ 1, 3, 10 và 30 µM được thêm vào mỗi đĩa rồi ủ trong 24h, sau đó thu lại rồi rửa sạch với nước muối đệm phosphat lạnh (PBS). Các tế bào được ly giải trên băng trong 30 phút trong 100 ul dung dịch ly giải [60 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol]. Dịch chiết tế bào sau đó được đun sôi trong 5 phút (1000C) và ly tâm với tốc độ 12000 rpm trong 30 phút. Nồng độ dịch chiết tế bào được xác định bằng phương pháp BCA (Pierce, Rockford, IL) và điện di trên gel SDS – polyacrylamid 10%. Sau khi điện di kết thúc, protein trong gel được chuyển sang màng nitrocellulose, sau đó được ủ với kháng thể nguyên cấp (p53, p21, p27, bax, cyclin D1, phospho-Rb, Rb, E2F1, β-actin). Tiếp đó kháng thể thứ cấp (HRP-conjugated anti-rabbit IgG với độ pha loãng 1:5000) được bổ sung và ủ tiếp trong 1h ở nhiệt độ phòng. Hình ảnh điện di được thể hiện trên phim bằng kit thử chemiluminescence (Amerhasm Bioscience, Mỹ). Kết quả được trình bày tại phần 4.3.3. Các phép thử về hoạt tính sinh học được thực hiện tại phòng thực nghiệm dược học - Đại học Lund, 22184 Lund, Thụy Điển. CHƢƠNG VI. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ bảy lá một hoa Từ phần thân rễ bảy lá một hoa đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học 6 hợp chất (RE1, RE2A, RE2B, RE3 – RE5) gồm diosgenin (RE1), RE2 hỗn hợp: stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid (RE2A), β-sitosterol-3-O-β-D- glucopyranosid (RE2B), gracillin (RE3), paris saponin D (RE4), paris saponin H (RE5). Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc từ phần dƣới mặt đất PPC Từ phần trên mặt đất bảy lá một hoa phân lập và xác định cấu trúc hóa học 15 hợp chất (AE6-AB20) trong đó 1 hợp chất mới (AB17) và 7 hợp chất lần đầu tiên phân lập từ PPC là: 1-O-α-linolenoyl-3-β-D-galactopyranosyl-glyxerol (AE6), stigmasterol (AE7), quercetin (AE9), thymidine (AE11), resveratrol
(AE12), ε-viniferin (AE13), quercetrin (AE14), và các hợp chất khác: penogenin (AE8), stigmasterol-3-O-D-glucosid (AE10), diosgenin-3-O-α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glycopyranosid (AE15), diosgenin-3-O-α-L- rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glycopyranosid (AE16), dioscin (AB18), paris saponin II (AB19), paris saponin VII (AB20). Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc từ phần trên mặt đất PPC Biện giải cấu trúc hợp chất AB17 (Hợp chất mới) Hợp chất 17: phân lập có dạng bột màu trắng, có nhiệt nóng chảy 167-169OC. Phổ 1D-NMR phần aglycon cho các tín hiệu đặc trưng của spirostan steroid 4 nhóm metyl trong đó có hai nhóm có tín hiệu singlet tại δ 0,71 (s), 0,93 (s) và hai tín hiệu douplet tại δ 0,88 (d, J=7,0 Hz), 0,73 (d, J=6,5 Hz); một proton thế ba lần tại δ 5,33 (d, J=4,5Hz); và tín hiệu proton nhóm oxymetin tại δ 3,5 (H-3) và 27 cacbon trên phổ 13C-NMR với 1 cacbon spirostan tại δ 108,4. Mặt khác, tín hiệu hai nhóm metin tại δ 80,0 (C-16) và 52,6 (C-17) gợi ý dạng cấu trúc spirostan này là diosgenin. Vị trí của cacbon được xác định bằng tương tác H→C trực tiếp trên phổ HSQC gồm 4 nhóm metyl tại δ 16,0, 18,8, 14,4 và 16,6, một nối đôi thế ba lần tại δ 121,4 (C6) và 140,4 (C5); một nhóm oxymetin tại C3 (δ 76,1). Tuy nhiên, khi so sánh dữ liệu phổ 1D-NMR của hợp chất AB17 với dioscin (dioscin là một saponin diosgenin với 3 phân tử đường) và hợp chất (25R)-spiros-5-ene-3β, 12α-diol3-O-α-L-Rha(1→4)-α-L-Rha(1→4)- [α-L-Rha(1→2)]-β-D-Glc có một số khác biệt: Dữ liệu phổ 1D-NMR cuả dioscin và hợp chất AB17 (xem bảng 4.1) cho các tín hiệu tương tự nhau chỉ khác tại một số điểm như dioscin có 10 nhóm metylen trong khi hợp chất AB17 chỉ có 9 nhóm và thiếu một tín hiệu nhóm này δ tại
>20 ppm và có hơn một tín hiệu hydroxymetin tại δ 70,1, kết quả này cho phỏng đoán một nhóm metylen đã bị hydroxy hóa trong cấu trúc của hợp chất AB17. Mặt khác khi so sánh phần dữ liệu phổ phần aglycon của hợp chất (25R)-spiros-5-ene-3β, 12α-diol3-O-α-L-Rha(1→4)-α-L-Rha(1→4)-[α-L- Rha(1→2)]-β-D-Glc (có liên kết OH tại C12) có tịnh tiến tương dương với phổ của hợp chất AB17. Kết quả phỏng đoán này được khẳng định khi phân tích các tương tác trên phổ HMBC các nhóm metyl H27 (δ 0,71)/C25 (δ 29,9) và C26 (δ 66,0), H21 (δ 0,88)/C20 (δ 41,3) và C17 (δ 52,6), H19 (δ 0,93)/C10 (δ 36,1) và C9 (δ 43,4), H18 (δ 0,71)/C17 (δ 52,6) và C13 (δ 44,0). Đặc biệt phổ HMBC thực nghiệm cho tương tác H18/C12 (δ 70,1), cho kết luận về vị trí hydroxy hóa tại C12. Như vậy, với kết quả phân tích phổ trên có thể khẳng định diosgenin đã bị hydroxy hóa tại vị trí C12 và phần aglycon của hợp chất AB17 là 12- hydroxy-diosgenin. Trên phổ 13C-NMR và DEPT cho tín hiệu 45 cacbon gồm 27 cacbon thuộc khung steroid và 18 cacbon thuộc 3 phân tử đường có 6 cacbon. Mặt khác trên phổ 1H-NMR cho tín hiệu 3 proton anome tại δ 4,43 (d, J=8,0 Hz), 4,77 (br s) và 4,72 (br s), dễ dàng xác định vị trí của cacbon anome tương ứng bằng tương tác H→C trực tiếp trên phổ HSQC tại δ 97,8, 101,0 và 102,0. Hằng số tương tác của proton anome là 8,0 Hz xác định cấu hình β của đường glucopyranosyl. Cấu hình α của hai đường rhamnopyranosyl được xác định bằng hằng số tương tác của proton anome là br s. Các tín hiệu proton douplet tại δ 1,10 (d, J=6,0 Hz) và 1,09 (d, J=4,5 Hz) đặc trưng cho 2 nhóm metyl của hai phân tử rhamnose. Từ vị trí của anome xác định các tương tác trên phổ HMBC gồm H-1Glc (δ 4,43)/C3 (δ 76,1) xác định vị trí glycosid hóa phân tử 12hydro- diosgenin tại C3; H-1Rha (δ 4,77)/C2Glc (δ 77,2) và C-5RhaI (δ 68,9); H- 1RhaII (δ 4,72)/C3Glc (δ 85,0) và C-5RhaII (δ 68,9), và tương tác của các metyl trong các phân tử rhamnose H-6Rha/C5Rha và C-4Rha. Kết quả phân tích các tương tác anome xác định cấu trúc phần đường là 3-O-α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranosid. Phổ HR-ESI-MS cho píc ion tại m/z 885,4829 [M+H]+ cho xác định một công thức phân tử là C45H72O17 có M=884,4770. Như vậy, phân tích phổ 1D, 2D-NMR và HR-ESI-MS thực nghiệm kết hợp với so sánh dữ liệu phổ tài liệu có thể kết luận hợp chất AB17 là 12-hydroxy- diosgenin-3-O-α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)-[α- Công thức cấu tạo của hợp chất AB17 L-rhamnopyranosyl-(1→3)]- (12-hydroxy-diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl- (1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D- β-D-glucopyranosid glucopyranosid)
Tham chiếu cấu trúc của hợp chất AB17 trên phần mềm scifinder không tìm thấy cấu trúc nào tương tự nên có thể kết luận hợp chất này là hợp chất mới trong tự nhiên cũng như trong tổng hợp hữu cơ. 4.2. Xây dựng dấu vân tay hóa học các mẫu thuộc chi Paris 4.2.1. Xây dựng dấu vân tay bằng phương pháp TLC Chuẩn bị mẫu cao và pha tinh khiết phân lập từ PPC như phần 3.3, tiến hành mã hóa các mẫu và thực hiện TLC trên máy chấm sắc ký Linomat 5.0 thu được sắc ký đồ sau: Kết sắc ký đồ phần trên mặt đất các mẫu chi Paris A B A, B Sắc ký đồ trên silica gel 60 RP-18 F254 (Merck, 20x10 cm) phần trên mặt đất các mẫu chi Paris Hệ dung môi: aceton/nước (3/1) C, D Sắc ký đồ trên silica gel 60 F254 (Merck, C 20x10 cm) phần trên mặt đất các mẫu chi D Paris Hệ dung môi: CHCl3/MeOH/H2O (14/6/1) A, C: Sắc ký đồ dưới ánh sáng thường B, D: Sắc ký đồ chụp tại UV 366nm thường Sắc ký đồ TLC các mẫu phần trên mặt đất chi Paris, sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% và hơ nóng. Trong đó: 1 Dịch chiết metanol phần trên mặt đất Paris vietnamensis 2 Dịch chiết metanol phần trên mặt đất Paris polyphylla var. polyphylla 3 Dịch chiết metanol phần trên mặt đất Paris caobangenis 4 Hợp chất paris saponin VII (AB20) 5 Hợp chất paris saponin II (AB19) 6 Dịch chiết metanol phần trên mặt đất Paris polyphylla var. yunnanesis 7 Dịch chiết metanol phần trên mặt đất Paris polyphylla var. chinensis trồng tại Sapa – Lào Cai 8 Dịch chiết metanol phần trên mặt đất Paris polyphylla var. chinensis thu hái tự nhiên Kết sắc ký đồ phần thân rễ các mẫu chi Paris Bàn luận: Đã tiến hành TLC trên pha đảo và pha thường phần trên mặt đất và phần dưới mặt đất của 6 mẫu thực vật; 3 chất tinh khiết phân lập từ phần dưới mặt đất là gracillin, paris saponin D và paris saponin H; 2 chất tinh khiết phân lập từ phần trên mặt đất là paris saponin II và paris saponin VII. Kết quả sắc ký đồ cho thấy các chất tinh khiết không phát hiện tại UV 254 và 366 nm và chỉ phát hiện với thuốc thử H2SO4 10% trong cồn tuyệt đối và hơ nóng; các hệ dung môi cho sự phân tách của các chất tinh khiết khá tốt: + Đối với phần trên mặt đất hai chất paris saponin II và paris saponin VII có sự phân bố tỉ lệ nghịch trên các mẫu thực vật. + Đối với phần dưới mặt đất nên sử dụng cả TLC trên pha đảo và pha thường để phân tích sắc ký đồ của 3 chất tinh khiết. Kết quả sắc ký đồ trên 6 mẫu thực vật có sự khác biệt và hoàn toàn có thể sử dụng TLC để phân biệt các
loài và dưới loài. A B E F C D A: Sắc kýđồ trên silica gel 60 F254, Hệ dungmôi: CHCl3/MeOH/H2O (2/1/0,01), ánh sáng thường B: Sắc ký đồ trên silica gel 60 F254, Hệ dung môi: CHCl3/MeOH/H2O (2/1/0,01), bước sóng 366nm C: Sắc ký đồ trên silica gel 60 F254, Hệ dung môi: CHCl3/MeOH/H2O (14/6/1), ánh sáng thường D: Sắc ký đồ trên silica gel 60 F254, Hệ dung môi: CHCl3/MeOH/H2O (14/6/1), bước sóng 366nm E: Sắc ký đồ trên silica gel 60 RP-18 F254, Hệ dung môi: MeOH:H2O (20/3), ánh sáng thường F: Sắc ký đồ trên silica gel 60 RP-18 F254, Hệ dung môi: MeOH:H2O (20/3), bước sóng 366nm Sắc ký đồ TLC phần dƣới mặt đất các mẫu chi Paris, sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn tuyệt đối và hơ nóng Trong đó 1 Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris polyphylla var. chinensis thu hái tự nhiên Sapa- Lào Cai (PPCW) 2 Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris polyphylla var. chinensis trồng tại Sapa-Lào Cai (PPC) 3 Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris polyphylla var. yunnanesis (PPY) 4 Hợp chất paris saponin H (RE5) 5 Hợp chất gracillin (RE 3) 6 Hợp chất paris saponin D (RE 4) 7 Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris caobangenis (PC) 8 Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris polyphylla var. polyphylla (PPP). 9 Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris vietnamensis (PV) 4.2.2. Xây dựng dấu vân tay bằng phương pháp HPLC Chuẩn bị mẫu cao và các chất tinh khiết như phần phần 3.3 thu được kết quả sắc ký đồ phần trên và dưới mặt đất: Sắc ký đồ HPLC của các mẫu phần trên Sắc ký đồ HPLC của các mẫu phần thân mặt đất chi Paris rễ chi Paris
Trong đó: 1. Hợp chất paris saponin D (RE 4) 1. Hợp chất paris saponin VII (AB20) 2. Hợp chất gracillin (RE 3) 2. Hợp chất paris saponin II (AB19) 3. Hợp chất paris saponin H (RE 5) 3. Dịch chiết metanol phần trên mặt đất mẫu Paris 4. Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris vietnamensis (PV) polyphylla var. chinensis thu hái tự nhiên 4. Dịch chiết metanol phần trên mặt đất mẫu Paris (PPCW) polyphylla var. polyphylla (PPP) 5. Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris 5. Dịch chiết metanol phần trên mặt đất mẫu Paris polyphylla var. chinensis được trồng tại Sapa-Lào Cai caobangensis (PC) (PPC) 6. Dịch chiết metanol phần trên mặt đất mẫu Paris 6. Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris polyphylla var. yunnanesis (PPY) caobangensis (PC) 7. Dịch chiết metanol phần trên mặt đất mẫu Paris 7. Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris polyphylla var. chinensis được trồng Sapa- Lào Cai polyphylla var. yunnanesis (PPY) (PPC) 8. Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris Dịch chiết metanol phần trên mặt đất mẫu Paris polyphylla var. polyphylla (PPP) polyphylla var. chinensis thu hái tự 9. Dịch chiết metanol phần dưới mặt đất Paris vietnamensis (PV) Nhận xét: - Sắc ký đồ HPLC phần trên mặt đất và phần dưới mặt đất cho các pic tách nhau rõ nét Đối với phần trên mặt đất: + Sắc ký đồ bằng HPLC đã phản ánh đúng kết quả như trong TLC về sự phân bố tỉ lệ nghịch hai hợp chất paris saponin II và paris saponin VII trong các mẫu: paris saponin II phân bố trong mẫu được sắp xếp: PPC > PPCW, PV và rất ít trong mẫu PC và PPP; paris saponin VII phân bố nhiều trong mẫu PC và PPP nhưng lại có ít trong các mẫu còn lại + Các pic chất nhiều nhất trong mẫu PPC và ít nhất trong mẫu PC. Đối với phần dưới mặt đất: + Hai chất paris saponin D và gracillin là hai saponin chính trong các mẫu thuộc chi Paris. Paris saponin H có trong các mẫu nhưng lượng nhỏ hơn. + Khi so sánh sự tích lũy của 3 chất tinh khiết này trong mẫu PPC trồng và thu hái tự nhiên có sự khác nhau theo chiều hướng loài hoang dại tích lũy cao hơn. Kết quả này phù hợp với sắc ký đồ bằng phương pháp TLC. + Số lượng các pic chất của các mẫu thuộc chi Paris cũng có sự khác biệt theo thứ tự: PPCW>PPC, PPY, PV và ít nhất trong mẫu PPP. 4.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học 4.3.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các cao chiết, các cao phân đoạn và 8 hợp chất spirostan steroid tinh khiết phân lập từ PPC trên 4 dòng tế bào A549, HL-60, Hela và Caco-2. Sử dụng Adriamycin làm chứng dương Giá trị IC50 của cao tổng, cao phân đoạn và 8 hợp chất tinh khiết phân lập từ PPC Ký hiệu mẫu IC50 (µg/ml)
A549 HL-60 Hela Caco-2 RPC 10,46 ±0,76 15,55 ±0,98 11,05 ±0,67 23,57 ±1,78 RPCBt 7,54 ±0,55 9,52 ±0,65 10,47 ±0,89 11,92 ±1,05 RPCEt 6,42 ±0,52 7,0 ±0,35 9,467 ±0,53 9,78 ±0,89 RPCW 10,16 ±1,02 18,59 ±0,98 9,144 ±0,43 22,7 ±1,56 PC 7,76 ±0,63 13,46 ±0,89 8,41 ±0,54 20,19 ±1,36 PCEt 9,33 ±0,65 11,77 ±0,97 9,24 ±0,68 8,23 ±0,43 PCBt 10,54 ±0,98 12,4 ±1,23 8,09 ±0,57 8,66 ±0,69 PCW 7,89 ±0,56 15,03 ±1,06 11,6 ±0,78 25,70 ±1,68 Pennogenin 7,62 ± 0,49 6,72 ± 0,52 4,79 ± 0,48 14,94 ± 0,50 Paris saponin D 26,95 ± 1,05 14,80 ± 1,12 19,24 ± 1,05 39,50 ± 1,04 Paris saponin H 30,76 ± 1,01 19,41 ± 1,09 10,96 ± 1,05 43,59 ± 1,25 Paris saponin VII 35,86 ± 1,23 13,06 ± 1,21 13,17 ± 1,14 26,01 ± 1,17 Diosgenin 17,09 ± 0,50 20,05 ± 0,54 10,63 ± 0,49 18,99 ± 0,60 Gracillin 31,26 ± 1,03 11,34 ± 1,07 10,13 ± 1,03 39,68 ± 1,03 Dioscin 85,86 ± 1,07 102,98 ± 1,34 39,90 ± 1,12 50,36 ± 1,02 Paris saponin II 67,14 ± 1,23 52,98 ± 1,32 13,46 ± 1,17 37,28 ± 1,19 Adriamycin 0,95 ± 0,09 0,54 ± 0,07 0,31 ± 0,01 2,04 ± 0,35 Trong đó: RPC: Mẫu cao tổng phần thân rễ; RPCBt: Mẫu cao phân đoạn butanol phần thân rễ; RPCEt: Mẫu cao phân đoạn etyl axetat phần thân rễ; RPCW: Mẫu cao phân đoạn nước phần thân rễ; PC: Mẫu cao tổng phần trên mặt đất; PCEt: Mẫu cao phân đoạn etyl axetat phần trên mặt đất; PCBt: Mẫu cao phân đoạn butanol phần trên mặt đất; PCW: Mẫu cao phân đoạn nước phần trên mặt đất. Nhân xét: Cao tổng phần trên mặt đất và phần dưới mặt đất có tác dụng gây độc 3 dòng tế bào ung thư A549, Hela và HL-60 với giá trị IC50 từ 7,56 - 15,55 µg/mL, không có tác dụng trên Caco-2 (giá trị IC50 > 20 µg/mL). Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của phần trên mặt đất mạnh hơn cả phần dưới mặt đất kết quả này cho thấy có thể dùng thay thế phần thân rễ bằng phần trên mặt đất trong nghiên cứu ung thư. Phân đoạn etyl axetat trên và dưới mặt đất có tác dụng độc tế bào đối với 4 dòng tế bào ung thư A549, HL-60, Hela và Caco-2 với giá trị IC50 từ 6,42 - 11,7 µg/mL. Phân đoạn butanol trên và dưới mặt đất có tác dụng độc tế bào đối với 4 dòng tế bào ung thư A549, HL-60, Hela và Caco-2 với giá trị IC50 từ 7,54 - 12,4 µg/mL. Trong 8 hợp chất tinh khiết spirostan steroid phân lập từ PPC chỉ có hợp chất pennogenin (AE8) biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư mạnh nhất với giá trị IC50 từ 4,79 – 7,62 µg/mL trên 3 dòng tế bào là A549, HL-60 và