Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu sản xuất vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú (Epinephelus spp.)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

12
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài "Nghiên cứu sản xuất vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú (Epinephelus spp.)" nhằm phân lập và lựa chọn được chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh làm giống gốc phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú. Sản xuất được vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu sản xuất vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú (Epinephelus spp.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --------------------------- MẪN HỒNG PHƯỚC NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC-XIN BẤT HOẠT PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH CHO CÁ MÚ (Epinephelus spp.) Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Mã số : 942 02 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội - 2023
Công trình được hoàn thành tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (VAAS) Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Phạm Thị Tâm 2. PGS.TS. Đồng Văn Quyền Phản biện 1: PGS.TS. Võ Thị Bích Thủy Phản biện 2: PGS.TS. Kim Văn Vạn Phản biện 3: PGS.TS. Nguyễn Quang Huy Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (VAAS) ...... ngày .. tháng... năm............ Có thể tìm hiểu luận án tại: 1. Thư Viện Quốc gia 2. Thư Viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ngành nuôi trồng thủy sản được xem là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của Việt Nam và liên tục tăng trưởng trong những năm gần đây cả về diện tích và sản lượng. Tổng sản lượng thủy sản năm 2022 ước đạt 9.026,3 nghìn tấn, tăng 2,7% so với năm 2021, trong đó sản lượng thủy sản nuôi trồng ước đạt 5.163,7 nghìn tấn, tăng 6,3% so với năm 2021. Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy sản trên thế giới cũng như ở Việt Nam luôn phải đối mặt với những khó khăn và thách thức, đặc biệt trong những năm gần đây, các bệnh do vi rút trên động vật thủy sản như bệnh xuất huyết cá trắm cỏ, bệnh vi rút mùa xuân trên cá chép, bệnh Iridovirus trên cá mú, bệnh hoại tử tụy truyền nhiễm, hoại tử lách và thận truyền nhiễm, hoại tử cơ quan tạo máu truyền nhiễm, tụ huyết trùng do vi rút gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế cho nuôi trồng thủy sản. Bệnh hoại tử thần kinh (Viral nervous necrosis-VNN) được phát hiện ở hầu hết các nước trên thế giới, gây ảnh hưởng đến hơn 120 loài cá biển, trong đó có nhiều loài cá biển có giá trị kinh tế cao. Bệnh đã được xác định là do vi rút hoại tử thần kinh (Nervous necrosis virus-NNV) gây ra. Cá mắc bệnh hoại tử thần kinh xuất hiện các triệu chứng đặc trưng: bơi lội không định hướng, thân sẫm màu, bỏ ăn, 80 -100% cá bị bệnh có thể chết sau 3-5 ngày. Dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản ngày càng có xu hướng gia tăng qua các năm, phạm vi lây nhiễm rộng, tỷ lệ mắc cao, chủng loại đa dạng, thời gian khởi phát kéo dài, vì thế, việc kiểm soát dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản là vấn đề cấp thiết. Kiểm soát dịch bệnh bằng chế phẩm vi sinh, chất kích thích miễn dịch, vắc-xin ngày càng được ứng dụng nhiều trong các mô hình canh tác sinh thái. Trong đó, sử dụng vắc-xin là một biện pháp phòng bệnh hiệu quả và an toàn để ngăn ngừa dịch bệnh gây ra bởi vi rút, vi khuẩn. Hiện tại, hầu hết các loại vắc-xin thủy sản thương mại vẫn là loại vắc-xin bất hoạt bởi tính an toàn. Vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh nghiêm trọng ở giai đoạn ấu trùng, cá bột, cá hương, cá giống với tỷ lệ chết lên tới 100%, vì vậy, vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh thường được dùng cho cá bằng đường ngâm.
2 Xuất phát từ cơ sở lý luận và nhu cầu thực tiễn trên, đề tài: “Nghiên cứu sản xuất vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú (Epinephelus spp.)” được tiến hành nhằm tạo được vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoạt tử thần kinh ở cá mú. 2. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung: Nghiên cứu được vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú từ chủng vi rút phân lập tại miền Bắc, Việt Nam. Mục tiêu cụ thể: Phân lập và lựa chọn được chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh làm giống gốc phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú. Sản xuất được vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú. Xây dựng quy trình kiểm tra chất lượng vắc-xin. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 3.1. Ý nghĩa khoa học: Luận án đã chế tạo được vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú với các bước: phân lập, tuyển chọn chủng giống làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin, đánh giá chủng giống gốc, nhân nuôi vi rút trên tế bào, bất hoạt vi rút, xác định các điều kiện tạo vắc-xin bán thành phẩm và đánh giá chất lượng của vắc-xin bán thành phẩm. Kết quả nghiên cứu là dữ liệu khoa học, cung cấp thêm tư liệu tham khảo cho các nghiên cứu sản xuất vắc-xin bất hoạt phòng bệnh cho các đối tượng cá biển có giá trị kinh tế cao. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn: Luận án đã nghiên cứu thành công vắc-xin bất hoạt keo phèn đạt chỉ tiêu an toàn và hiệu quả trong phòng bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4.1. Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh phân lập từ một số loài cá mú nuôi ở một số tỉnh khu vực miền Bắc. 4.2. Phạm vi nghiên cứu: Các chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh phân lập từ cá biển nuôi tại các vùng biển quanh đảo Cát Bà, vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng), vùng biển Vân Đồn, Quảng Yên (Quảng Ninh), vùng biển Đồng Châu (Thái Bình), vùng biển Hải Thịnh, Nghĩa Hưng (Nam Định).
3 5. Những đóng góp mới của luận án Luận án đã nghiên cứu một cách toàn diện về các đặc điểm của chủng giống gốc phục vụ sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú, bao gồm tính thuần khiết, tính sinh miễn dịch bảo hộ, tính ổn định về mặt di truyền và năng suất sau khi nhân nuôi trên tế bào GS01. Luận án đã chế tạo được vắc-xin bất hoạt keo phèn bằng chủng vi rút TB05 phân lập tại tỉnh Thái Bình, vắc-xin bất hoạt keo phèn được sử dụng cho cá bằng phương pháp ngâm, tỷ lệ an toàn 100%, tỷ lệ bảo hộ đạt 75,8% sau 3 tháng. 6. Bố cục của luận án Luận án gồm (1) Mở đầu 5 trang, (2) Tổng quan 27 trang, (3) Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 16 trang, (4) Kết quả nghiên cứu 53 trang, (5) Kết luận và kiến nghị 1 trang, 250 TLTK, 22 bảng, 18 hình. Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Một số đặc điểm sinh học của cá mú Cá mú thuộc họ Serranidae, họ phụ cá mú (Epinephelinae), giống Epinephelus, tên tiếng Anh: groupers. Có tất cả 87 loài được liệt kê trong chi Epinephelus (E.), riêng khu vực Ấn Độ, Thái Bình Dương đã phát hiện được 63 loài thuộc giống Epinephelus, cá mú là loài cá sống dưới đáy tại những rạn san hô, đá cứng, vùng nước ấm, phân bố chủ yếu ở những vùng biển nhiệt đới, á nhiệt đới và ít thấy ở vùng biển ôn đới. Nhiệt độ thích hợp cho các loài cá mú phát triển là 25-300C, độ mặn từ 11- 41‰. Hầu hết tất cả các loài cá mú đều là loài lưỡng tính nguyên sinh. Tuyến sinh dục ban đầu chưa được biệt hóa sau đó chúng được biệt hóa thành buồng trứng ở tất cả các cá thể. Sau khi trưởng thành thành con cái, chúng trải qua quá trình thay đổi giới tính thành con đực, biến đổi buồng trứng thành tinh hoàn. Sự thay đổi giới tính tự nhiên ở các loài cá mú xảy ra từ 3 đến 11 tháng tuổi tùy theo loài. Cá mú có xu hướng đẻ trứng vào đầu mùa xuân và mùa hè. Mặc dù một số loài như cá mú sinh sản quanh năm, còn lại hầu hết các loài cá mú sinh sản trong khoảng thời gian từ tháng 1 đến tháng 5. 1.2. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới và Việt Nam Bệnh hoại tử thần kinh đã được báo cáo chính thức trên toàn thế giới, ngoại trừ Nam Mỹ. VNN xuất hiện ở các quốc gia khu vực châu Á như Ấn Độ, Indonesia, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Malaysia, Philippines, Thái Lan, Việt Nam; Châu Đại Dương như Úc, Tahiti; vùng Địa Trung Hải như Pháp, Hy Lạp, Ý, Malta, Bồ Đào Nha, Tây Ban Nha, Tunisia hoặc
4 các quốc gia khác như, Vương quốc Anh, Na Uy, Quần đảo Caribe và Bắc Mỹ. Ở châu Á, tỷ lệ tử vong hàng loạt được ghi nhận ở giai đoạn ương giống cá mú ở Singapore, cá mú chấm đỏ (E. akaara) và cá háo sọc (Pseudocaranx dentex) ở Nhật Bản, cá đối đầu dẹt (Mugil cephalus) ở Trung Quốc, cũng như cá hồng mỹ (Sciaenops ocellatus) ở Israel. Ở Bắc Mỹ, bệnh VNN được phát hiện trên cá chẽm trắng (Atractoscion nobilisthe) và cá tuyết Đại Tây Dương. Ngoài ra, bệnh bệnh hoại tử thần kinh không chỉ lây nhiễm trên cá biển mà còn ở nhiều loại động vật thủy sinh nước ngọt. Ở Việt Nam đã phát hiện một số loài cá mú nhiễm bệnh hoại tử thần kinh, bao gồm các loài: E. coioides, E. fuscogutatus, E. tauvina, E. lanceolatus, E. malabaricus ở Khánh Hòa, E. coioides ở Cát Bà (Hải Phòng) và Cửa Hội (Nghệ An). Bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam được phát hiện lần đầu tiên vào năm 2002 ở các lồng nuôi tại Vân Đồn, Quảng Ninh. 1.3. Tổng quan về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh Tác nhân gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá được xác định là Betanodavirus, Vi rút không có vỏ bọc, hình cầu, đường kính từ 25-30 nm, có đối xứng hình tứ diện, vỏ protein bao gồm 180 protein với khối lượng 42 kDa. Hệ gen của Betanodavirus có cấu trúc ARN mạch đơn, sợi dương gồm 2 tiểu phần: Tiểu phần lớn của hệ gen chứa ARN1 (3.1 kb) và Tiểu phần nhỏ của hệ gen chứa ARN2 (1.4 kb), trên ARN2 chứa một khung đọc mở (ORF) cho một protein vỏ đồng thời chứa hai vùng bảo thủ cao là T2 (870 bp) và T4 (420 bp). Giống Betanodavirus được phân thành 4 kiểu gen chính, bao gồm: vi rút hoại tử thần kinh ở cá bơn sọc (SJNNV), vi rút hoại tử thần kinh ở cá nóc hổ (TPNNV), vi rút hoại tử thần kinh ở cá mú đốm đỏ (RGNNV) và vi rút hoại tử thần kinh ở cá bơn (BFNNV) Vi rút xâm nhập vào tế bào vật chủ bằng phương thức lây truyền theo chiều ngang và chiều dọc và tạo ra sự lây nhiễm chính thức bằng cách xâm nhập vào các tế bào nhạy cảm của hệ thống thần kinh trung ương bao gồm não, tủy sống và võng mạc dẫn đến các biểu hiện lâm sàng của cá khi mắc bệnh như: bơi không định hướng, thân thẫm màu, mắt lồi, cong thân. 1.4. Tổng quan về vắc-xin thủy sản Vắc-xin trong nuôi trồng thủy sản được xem là một biện pháp phòng
5 ngừa hiệu quả đối với nhiều bệnh và gần đây đã trở nên phổ biến. Theo tác nhân gây bệnh, vắc-xin thủy sản có thể được phân loại thành vắc-xin vi khuẩn, vắc-xin vi rút và vắc-xin ký sinh trùng, chúng cũng có thể được phân loại theo thành phần bao gồm vắc-xin đơn giá, vắc-xin đa giá hoặc vắc-xin hỗn hợp, hoặc phân loại theo bản chất chẳng hạn như vắc-xin sống giảm độc lực, vắc-xin bất hoạt hoặc vắc-xin tiểu đơn vị, vắc-xin axit nucleic, vắc-xin tái tổ hợp. Cần lưu ý rằng mỗi loại vắc-xin đều có những ưu điểm và nhược điểm, các loại vắc-xin khác nhau cần được phát triển và sử dụng cho các tác nhân gây bệnh và động vật khác nhau. Phương pháp sử dụng vắc-xin trong thủy sản thường được dùng bằng đường tiêm, vắc-xin ngâm và vắc-xin cho ăn. Mỗi loại cũng có ưu và nhược điểm và phù hợp với từng đối tượng các khác nhau. Chương 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Cá bệnh Mẫu cá mú được thu thập ở vùng nuôi trồng thủy sản ven biển quanh đảo Cát Bà, khu vực vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng), vùng biển Vân Đồn, Quảng Yên (Quảng Ninh), vùng biển Đồng Châu (Thái Bình), vùng biển Hải Thịnh, Nghĩa Hưng (Nam Định). 2.1.2. Cá thí nghiệm Cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) dài 2-2,5 cm, cá mú cọp (Epinephelus fuscoguttatus) dài 2-2,5 cm và mú chuột (Cromileptes altivelis) dài 5,5-6 cm được cung cấp bởi Trung tâm Quốc gia Giống hải sản miền Bắc, Xuân Đán, Cát Bà, Hải Phòng. 2.1.3. Tế bào Tế bào GS01 (tế bào lách cá mú) do trường Đại học Wageningen, Hà Lan cung cấp. 2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Phân lập và lựa chọn được chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh làm giống gốc phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú. 2.2.2. Sản xuất được vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú.
6 2.2.3. Xây dựng quy trình kiểm tra chất lượng vắc-xin. 2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.3.1. Địa điểm: Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật - Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội và phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam. 2.3.2. Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 04/2016 đến tháng 04/2020. 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp thu và xử lý mẫu 2.4.2. Kỹ thuật phân lập vi rút trên tế bào mẫn cảm GS01 2.4.3. Kỹ thuật tách chiết ARN tổng số 2.4.4. Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) 2.4.5. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR 2.4.6. Phương pháp điện di trên gel agarose 2.4.7. Phương pháp giải trình tự ADN 2.4.8. Phương pháp xác định TCID50, LD50 của NNV 2.4.9. Xác định điều kiện nhân giống vi rút 2.4.10. Phương pháp bất hoạt vi rút 2.4.11. Phương pháp tạo vắc-xin keo phèn 2.4.12.Phương pháp trung hòa trên tế bào 2.4.13. Phương pháp gây miễn dịch 2.4.14. Phản ứng ELISA gián tiếp 2.4.15. Phương pháp thử thách cường độc 2.4.16. Đánh giá độ an toàn vắc-xin 2.4.17. Đánh giá hiệu quả vắc-xin ở điều kiện thực nghiệm 2.4.18. Phương pháp xử lý số liệu Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập, lựa chọn chủng giống gốc phục vụ sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú 3.1.1. Phân lập vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh từ cá mú nghi nhiễm bệnh ở 4 tỉnh miền Bắc, Việt Nam. Trong tổng số 60 mẫu cá mú có các triệu chứng của bệnh hoại tử thần kinh được thu thập từ các vùng biển quanh đảo Cát Bà, khu vực vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng), vùng biển Vân Đồn, Quảng Yên (Quảng Ninh), vùng biển Đồng Châu (Thái Bình), vùng biển Hải Thịnh, Nghĩa Hưng (Nam Định).
7 Hình 3.1. Mẫu cá mú nghi nhiễm bệnh hoại tử thần kinh A: cá mú khỏe mạnh; B và C: mẫu cá mú nghi mắc VNN Bảng 3.1. Kết quả sàng lọc gen T4 trong các mẫu cá nghi nhiễm NNV Số mẫu Số lượng dương Tỷ lệ dương Địa điểm mẫu tính gen tính (%) T4 QN 16 8 50,00 HP 15 6 40,00 NĐ 14 8 57,14 TB 15 10 66,67 Tổng số 60 32 53,33 Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của một số mẫu nghi nhiễm NNV
8 Giếng 1-5: các mẫu nghi nhiễm NNV; M: thang ADN chuẩn 1kb 420 bp Kết quả sàng lọc bằng sinh học phân tử từ 60 mẫu cá mú nghi nhiễm bệnh hoại tử thần kinh thì có 32 mẫu phát hiện thấy đoạn gen có kích thước 420 bp, tương ứng với kích thước của đoạn gen T4 của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh. Các mẫu dương tính với gen T4 được sử dụng để phân lập vi rút trên tế bào mẫn cảm GS01. Vi rút nhân lên trong tế bào và được đánh giá bằng hiệu ứng huỷ hoại tế bào (cytopathic effects - CPE). Hình 3.3 Hình ảnh tế bào GS01 A: Tế bào GS01 chưa gây nhiễm mẫu NNV B: Tế bào GS01 sau 120 giờ gây nhiễm NNV Bảng 3.2. Kết quả nuôi cấy mẫu bệnh phẩm trên tế bào GS01 Hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) Ký hiệu STT theo thời gian (giờ) mẫu 24 48 72 96 120 144 168 192 1 QN02 _ _ + + + ++ ++ ++++ 2 QN04 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 3 QN05 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 4 QN07 _ + + + ++ ++ ++ +++ 5 QN08 _ _ + + + ++ ++ ++++ 6 QN10 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 7 QN12 _ _ + + + ++ ++ ++++ 8 QN14 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 9 HP02 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 10 HP03 _ _ + + + ++ ++ +++ 11 HP05 _ + + + ++ +++ ++++ ++++
9 12 HP06 _ _ + + + ++ ++ +++ 13 HP07 _ _ + + + ++ ++ +++ 14 HP09 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 15 HP12 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 16 HP15 _ _ + + + ++ ++ +++ 17 NĐ01 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 18 NĐ03 _ _ + + + ++ ++ ++ 19 NĐ04 _ _ + + + ++ ++ ++++ 20 NĐ05 _ _ + + + ++ ++ ++ 21 NĐ07 _ + + + ++ ++ +++ ++++ 22 NĐ08 _ + + + ++ ++ +++ ++++ 23 NĐ10 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 24 NĐ12 _ _ + + + ++ +++ +++ 25 TB02 _ + + + ++ ++ +++ ++++ 26 TB03 _ _ + + + ++ ++++ ++++ 27 TB05 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 28 TB07 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 29 TB08 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 30 TB10 _ + + + ++ ++ +++ ++++ 31 TB11 _ + + + ++ ++ ++ +++ 32 TB13 _ _ + + + ++ +++ ++++ Ghi chú: ++++: CPE > 98%; +++: CPE > 85%; ++: CPE > 50%; +: CPE > 20%; +: nghi ngờ có CPE > 10%; -: không có CPE Kết quả phân lập vi rút trên tế bào GS01 cho thấy, trong các đĩa nuôi cấy tế bào GS01, các mẫu bệnh phẩm bắt đầu gây ra hiệu ứng hủy hoại tế bào sau 72 giờ gây nhiễm, biểu hiện bệnh tích tế bào tăng trong các ngày tiếp theo và cao nhất từ 168 đến 192 giờ sau gây nhiễm. 3.1.2. Xác định độc lực vi rút (TCID50 và LD50) Độc lực của vi rút được xác định bằng liều gây chết 50% tế bào nuôi cấy (Tissue culture infective dose - TCID50) và/hoặc liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (Lethal dose- LD50). Bảng 3.3. Kết quả xác định TCID50 trên tế bào GS01 Ký Hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) (%) theo TCID STT hiệu các độ pha loãng vi rút 50/mL mẫu 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9
10 1 QN02 100 100 98 85 80 70 50 25 10 10-6,9 2 QN04 65 60 55 40 15 5 + - - 10-3 3 QN05 70 70 60 50 35 20 5 + - 10-3,9 4 QN07 85 80 80 70 50 20 10 5 - 10-4,9 5 QN08 100 100 95 80 70 60 48 25 10 10-6,8 6 QN10 85 80 70 52 45 20 10 5 - 10-4,3 7 QN12 85 80 80 70 48 20 10 5 - 10-4,9 8 QN14 90 90 85 60 50 25 15 5 - 10-4,8 9 HP02 100 100 95 80 70 60 48 25 10 10-6,8 10 HP03 95 95 90 70 60 52 35 20 5 10-5,9 11 HP05 70 70 60 50 35 20 5 + - 10-3,9 12 HP06 90 90 85 70 50 25 15 5 - 10-4,9 13 HP07 100 100 95 80 70 60 48 25 10 10-6,8 14 HP09 60 60 50 40 20 5 + - - 10-3 15 HP12 90 90 85 70 50 25 15 5 - 10-4,9 16 HP15 95 95 80 75 60 52 35 20 5 10-5,9 17 NĐ01 70 70 60 50 35 20 5 + - 10-3,9 18 NĐ03 85 80 80 70 50 20 10 5 - 10-4,9 19 NĐ04 60 60 50 40 15 5 + - - 10-3 20 NĐ05 65 60 55 40 15 5 + - - 10-3 21 NĐ07 55 55 50 30 15 5 + - - 10-2,7 22 NĐ08 100 100 95 80 70 60 48 25 10 10-6,8 23 NĐ10 100 100 95 80 70 60 48 25 10 10-6,8 24 NĐ12 85 80 80 70 50 20 10 5 - 10-4,9 25 TB02 90 90 85 60 50 25 15 5 - 10-4,8 26 TB03 95 95 90 70 60 52 35 20 5 10-5,9 27 TB05 100 100 95 80 70 60 48 25 10 10-6,8 28 TB07 70 70 60 50 35 20 5 + - 10-3,9 29 TB08 55 55 50 30 15 5 + - - 10-2,7 30 TB10 90 90 85 70 50 25 15 5 - 10-4,9 31 TB11 85 80 70 52 45 20 10 5 - 10-4,3 32 TB13 95 95 90 70 60 52 35 20 5 10-5,9
11 Bảng 3.4. Kết quả xác định LD50 trên cá mú giống Ký Tỷ lệ chết tích luỹ sau 120 giờ ở các độ pha loãng vi rút (%) LD50/ STT hiệu mL mẫu 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 1 QN02 100 100 100 100 80 60 53,3 13,3 13,3 10-6,2 2 QN08 100 100 100 93,3 66,7 53,3 30 15 15 10-5,5 3 HP02 100 100 100 80 80 73,3 60 46,7 40 10-7,5 4 HP07 100 100 100 73,3 66,7 53,3 53,3 13,3 13,3 10-6,2 5 NĐ08 100 100 100 86,7 86,7 66,7 53,3 30 15 10-6,5 6 NĐ10 100 100 100 93,3 66,7 53,3 30 26,6 13,3 10-5,5 7 TB05 100 100 100 93,3 93,3 80 66,7 53,3 33,3 10-7,5 8 TB08 66,7 53,3 30 13,3 6,7 6,7 6,7 0 0 10-1,5 9 ĐC 0 0 0 0 0 0 0 0 0 K Ghi chú: K không đánh giá Kết quả xác định độc lực của vi rút trên tế bào nuôi cấy và trên cá xác định được 2 mẫu TB05 và HP02 có độc lực mạnh trên tế bào và cá với các liều TCID50 và LD50 tương ứng là 10-6,8TCID50/mL và 10-7,5LD50/mL, 2 mẫu có độc lực cao là TB05, HP02 được lựa chọn để xác định loài bằng phương pháp sinh học phân tử. Kết quả xác định loài của hai mẫu TB05 và HP02 thông qua trình tự gen T4 với trình tự ARN2 của các chủng vi rút hoại tử thần kinh được công bố trên Genebank. Kết quả này cho phép kết luận các mẫu TB05 và HP02 là vi rút hoại tử thần kinh. Bảng 3.5. So sánh mức độ tương đồng của trình tự đoạn gen T4 của mẫu HP02 và TB05 với các trình tự của GenBank Phần trăm Mức độ Tên chủng và gen xác định trình tự được Mã số GenBank tương trình tự so sánh với đồng (%) GenBank (%) Mẫu TB05 Mouse grouper nervous necrosis virus isolate VI37 KU705815.1 87 99,19 segment ARN2, complete sequence
12 Epinephelus coioides nervous necrosis virus isolate HN1 MG874758.1 87 98,64 segment ARN2, complete sequence Yellow grouper nervous AF283554.1 necrosis virus major coat 87 98,64 protein gene, partial cds Einephelus coioides nervous necrosis virus strain KS1 MF144241.1 87 98,37 segment ARN2, complete sequence Betanodavirus sp. strain KS1 KY930894.1 segment ARN2 capsid protein 87 98,37 mARN, complete cds Mẫu HP02 Mouse grouper nervous necrosis virus isolate VI37 KU705815.1 92 98,47 segment ARN2, complete sequence Epinephelus coioides nervous necrosis virus isolate HN1 MG874758.1 92 97,95 segment ARN2, complete sequence Einephelus coioides nervous necrosis virus strain KS1 MF144241.1 90 98,18 segment ARN2, complete sequence Betanodavirus sp. strain KS1 KY930894.1 segment ARN2 capsid protein 90 98,18 mARN, complete cds 3.1.3. Kết quả lựa chọn chủng giống gốc phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú. Hiệu quả phòng bệnh của vắc-xin phụ thuộc vào chất lượng của chủng giống gốc với các đặc tính: đại diện kháng nguyên, hiệu quả kích
13 thích kháng thể bảo hộ, mức độ thuần khiết, hiệu xuất nhân giống trên tế bào mẫn cảm, ổn định về khả năng kích thích sinh kháng thể bảo hộ và di truyền. Bảng 3.6. Hiệu giá kháng thể trung hòa kháng nguyên của các mẫu phân lập Ký Hiệu giá kháng thể Ký hiệu Hiệu giá kháng hiệu trung hòa mẫu vi rút thể trung hòa mẫu vi rút HP02 TB05 HP02 TB05 QN02 256 512 NĐ01 64 128 QN04 128 256 NĐ02 64 128 QN05 128 256 NĐ03 4 128 QN07 256 128 NĐ04 128 256 QN08 128 128 NĐ05 64 256 QN10 256 512 NĐ08 256 512 QN12 128 128 NĐ10 64 128 QN14 128 128 NĐ12 4 128 HP02 256 512 TB02 4 128 HP03 128 512 TB03 4 128 HP05 128 128 TB05 256 512 HP06 32 128 TB07 4 128 HP07 256 128 TB08 4 512 HP09 64 128 TB10 64 128 HP12 64 128 TB11 4 128 HP15 64 256 TB13 64 128 Bảng 3.7. Kết quả kiểm tra độ thuần khiết của giống gốc Môi trường đánh giá Lần Thời gian PPLO Chủng kiểm theo dõi Thạch máu Thạch Nước thịt (pleuropneu Kết luận giống gốc tra (ngày) (đĩa) nấm (đĩa) (ống) monia-like organism) 1 7 - - - - Đạt NNV 2 7 - - - - Đạt TB05 3 7 - - - - Đạt Đối 1 7 - - - - - chứng Ghi chú: - âm tính
14 Bảng 3.8. Kết quả xác định hiệu giá vi rút của chủng giống gốc Chủng Số lần Dải pha Liều Hiệu giá vi Hiệu giá vi giống gốc kiểm tra loãng vi rút gây rút rút trung nhiễm (TCID50/mL) bình (mL) (TCID50/mL) 1 10-1 – 10-8 0,1 10- 6,7 NNV 2 10-1 – 10-8 0,1 10-6,9 10-6,8 TB05 3 10-1 – 10-8 0,1 10-6,8 Đối chứng 10-1 – 10-8 0,1 đệm Âm tính Âm tính đệm PBS PBS Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra độ ổn định của chủng NNV TB05 Chủng giống Lần cấy Hiệu giá vi rút Hiệu giá vi rút giống chuyển (TCID50/mL) gốc (TCID50/mL) -6,8 1 10 2 10-6,7 3 10-6,8 4 10-6,9 5 10-6,8 10-6,8 NNV TB05 6 10-6,8 7 10-6,9 8 106,8 9 10-6,7 10 10-6,8 Đối chứng 1 Âm tính Âm tính Hình 3.4. Kết quả điện di kiểm tra trên gel agarose 1% M: thang DNA chuẩn 1 kb; 1-10: Sản phẩm PCR khuếch đại mẫu vi rút trong 10 đời cấy chuyển; 11: đối chứng âm; 12: sản phẩm PCR khuếch đại mẫu vi rút TB05 10 20 30 40 50 60 70
15 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| f1 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f2 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f3 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f4 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f5 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f6 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f7 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f8 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f9 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f10AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA 80 90 100 110 120 130 140 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| f1 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f2 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f3 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f4 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f5 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f6 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f7 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f8 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f9 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f10CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA 150 160 170 180 190 200 210 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| f1 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f2 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f3 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f4 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f5 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f6 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f7 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f8 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f9 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f10GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC 220 230 240 250 260 270 280 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| f1 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f2 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f3 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f4 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f5 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f6 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f7 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f8 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f9 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f10CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA 290 300 310 320 330 340 350 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| f1 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f2 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f3 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f4 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f5 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f6 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f7 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f8 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f9 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG
16 f10ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG 360 370 380 390 400 410 420 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| f1 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f2 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f3 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f4 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f5 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f6 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f7 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f8 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f9 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f10CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG Hình 3.5. So sánh trình tự gen T4 của 10 đời vi rút Từ các kết quả thu được, nghiên cứu này đã phân lập và tuyển chọn được chủng giống gốc TB05 từ các chủng NNV phân lập từ mẫu bệnh phẩm mắc bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú nuôi tại khu vực miền Bắc, Việt Nam. 3.2. Kết quả chế tạo vắc-xin bất hoạt keo phèn phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú quy mô phòng thí nhiệm. 3.2.1. Xác định liều gây nhiễm (multiplicity of infection - MOI) vào tế bào mẫn cảm và thời gian phù hợp để thu hoạch vi rút. Chủng NNV TB05 có TCID50= 10-6,8/mL được gây nhiễm vào tế bào GS01, với 3 liều gây nhiễm (MOI) là 0,1; 0,01 và 0,001, nhiệt độ nuôi cấy là 250C. Hình 3.6. Kết quả xác định liều gây nhiễm (MOI), ý nghĩa thống kê được thực hiện bằng cách so sánh giá trị mỗi giá trị MOI với giá trị của MOI 0.1. Giá trị trung bình của ba xét nghiệm độc lập được hiển thị. Dấu hoa thị cho biết sự khác biệt có ý nghĩa: (** p ≤ 0,001).
17 Hình 3.7. Tình trạng tế bào nuôi cấy vi rút hoại tử thần kinh ở các thời điểm theo dõi khác nhau A: tế bào chưa gây nhiễm; B: ngày thứ 3 sau gây nhiễm; C: ngày thứ 4 sau gây nhiễm; D: ngày thứ 5 sau gây nhiễm Từ kết quả thu được trong thí nghiệm cho phép kết luận, giá trị MOI là 0,01 là phù hợp để nhân giống vi rút, thời gian thu hoạch vi rút phù hợp là 5 ngày sau khi gây nhiễm. 3.2.2. Kết quả xác định điều kiện bất hoạt vi rút Trong nghiên cứu này, chủng NNV TB05 được gây bất hoạt với 3 loại hóa chất, bao gồm formaldehyde, binary ethylenimine, β- propiolactone. Bảng 3.10. Kết quả đánh giá mức độ bất hoạt của NNV Hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) theo thời gian (giờ) Hóa chất 12 24 36 48 60 Formaldehyde + + + - - Binary ethylenimine + + - - - β-propiolactone + - - - - Hình 3.8. Kết quả phát hiện kháng thể đặc hiệu với các mẫu vi rút bất hoạt (OD450)
18 Kết quả cho thấy hiệu vi rút bất hoạt bằng β-propiolactone cho hiệu giá kháng thể cao và thời gian dài hơn so với bất hoạt bằng binary ethylenimine và formaldehyde. Do vậy, β-propiolactone 0,1% được chọn làm hóa chất bất hoạt vi rút. 3.2.3. Xác định các điều kiện tạo vắc-xin bán thành phẩm 3.2.3.1 Kết quả xác định liều lượng kháng nguyên thích hợp và thời gian gây miễn dịch cho cá. Liều lượng kháng nguyên và thời gian gây miễn dịch cần được xác định để đạt hiệu quả phòng bệnh và tạo đáp ứng miễn dịch tối ưu nhất. Trong nghiên cứu này, cá mú chuột (kích thước 2-2,5cm) được tắm với các hàm lượng kháng nguyên là 10-5TCID50/mL; 10-6TCID50/mL; 10- 7 TCID50/mL với liều 1mL/10 cá trong vòng 20 phút, 60 phút và 120 phút, đối chứng dùng PBS. Hình 3.9. Tỷ lệ sống của cá được gây miễn dịch với các liều kháng nguyên NNV sau khi thử thách cường độc. Ý nghĩa thống kê được thực hiện bằng cách so sánh giá trị ở các liều lượng kháng nguyên khác nhau với đối chứng PBS. Giá trị trung bình của ba xét nghiệm độc lập được hiển thị. Dấu hoa thị cho biết sự khác biệt có ý nghĩa: (*p ≤ 0,05; ***p < 0,001)