intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE

Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa hình đột biến gen CYP2C19, CYP3A5 và CYP2D6 cytochrome P450 ở người Kinh Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

22
lượt xem
3
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là xây dưng cơ sở dữ liệu về đa hình/đột biến của 04 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 ở người Kinh Việt Nam; xác định kiểu gen và tần số các allele của 04 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 trên người Kinh ở Việt Nam đồng thời phân tích và dự đoán chức năng của các biến thể mới.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đa hình đột biến gen CYP2C19, CYP3A5 và CYP2D6 cytochrome P450 ở người Kinh Việt Nam

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ---------------------------- Vũ Phương Nhung NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH/ĐỘT BIẾN GEN CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 VÀ CYP2D6 CYTOCHROME P450 Ở NGƯỜI KINH VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghê ̣ sinh ho ̣c Mã số : 9420201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nô ̣i - Năm 2020
  2. Luận án được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: TS. Nguyễn Hải Hà Người hướng dẫn khoa học 2: GS. TS. Nông Văn Hải Phản biện 1: ……………………… Phản biện 2: ……………………… Phản biện 3: ……………………… Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ …’, ngày ….. tháng ….. năm 20….. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
  3. MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Sự khác nhau trong đáp ứng thuốc giữa các cá nhân là điều khó tránh khỏi trong điều trị, trong đó có các phản ứng có hại của thuốc (Adverse drugs reaction-ADR). Các ADR là một trong những nguyên nhân chính của các trường hợp bệnh nhân phải nhập viện, một số có thể dẫn tới tử vong. Từ năm 2009, Hiệp hội ứng dụng Di truyền dược học lâm sàng (Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium-CPIC) đã cung cấp các thông tin về việc xét nghiệm di truyền có thể được sử dụng trong tối ưu hóa phác đồ sử dụng thuốc. Đối với một vài loại cặp gen-thuốc, CPIC cũng đã đưa ra những chỉ dẫn về liều dùng cụ thể. Các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 là 4 trong số các gen CYP có tính đa hình cao mà các dạng đa hình của chúng khiến cho bệnh nhân có khả năng chuyển hóa từng loại thuốc cụ thể rất khác nhau, từ mạnh tới yếu. Cho tới nay, các hiểu biết về đa dạng di truyền của nhóm gen CYP tham gia chuyển hóa thuốc ở người Việt Nam còn rất hạn chế. Ngày nay, với vai trò của dược lý học di truyền liên quan đến chuyển hóa thuốc và tương tác thuốc trong lâm sàng mang tính cấp bách và rất cần đầu tư nghiên cứu. Nghiên cứu này tập trung vào việc phát hiện các allele đã biết cũng như xác định cả những allele mới ở người Việt Nam. Số liệu thu được từ nghiên cứu sẽ cung cấp những thông tin khoa học về đa dạng di truyền của các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 trên người Việt Nam. Đây cũng là những tiền đề có ý nghĩa và đóng góp một phần cho sự phát triển của lĩnh vực di truyền dược học và y học cá thể trong tương lai. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án - Xây dựng cơ sở dữ liê ̣u về đa hiǹ h/đô ̣t biế n của 04 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 ở người Kinh Viê ̣t Nam. - Xác định kiểu gen và tần số các allele của 04 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 trên người Kinh ở Việt Nam đồ ng thời phân tích và dự đoán chức năng của các biế n thể mới. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án - Thu thập và tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu của 136 người Kinh Việt Nam khỏe ma ̣nh, không có quan hê ̣ huyế t thố ng. - Xác định tất cả các biến thể nằm trong vùng promoter cùng với 9 exon và vùng biên của 03 gen CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6 bằng phương 1
  4. pháp giải trình tự. Đối với gen CYP3A5, giải triǹ h tự các vùng gen chứa các biế n thể đã đươ ̣c công bố là *3, *6, *8 và *9. - Xác định các biến thể số bản sao (copy number variant-CNV) của các gen bằng phương pháp khuếch đại đa đầu dò phụ thuộc vào ghép nối (Multiplex ligation-dependent probe amplification-MLPA). - Xác định thành phần kiểu gen và tần số allele của các gen CYP450 trên người Việt Nam. - So sánh tần số và mức độ phân bố các allele của các gen CYP450 ở quần thể người Việt Nam so với các quần thể khác. - Dự đoán chức năng in silico của các đa hình/đột biến mới phát hiện. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. CYP450 và chuyển hóa thuốc trong gan Các enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc pha I là các protein biểu hiện chủ yếu trên mạng lưới nội chất trơn và ti thể của các tế bào gan và biểu mô ruột non (ngoài ra cũng còn ở một số cơ quan khác). Ở người, có 115 gen CYP450 bao gồm cả các gen giả, được đặt tên bắt đầu từ CYP1A1 và kết thúc bởi CYP51P3. Các protein được mã hóa bởi các CYP450 được phân loại dựa trên độ tương đồng về trình tự các amino acid thành các cấp độ từ họ (ví dụ: CYP1, CYP2…), phân họ (ví dụ: CYP1A, CYP2B…) và enzyme riêng lẻ (ví dụ: CYP1A1, CYP2D6…). Trong số các CYP450 được biểu hiện trong gan thì CYP3A4 có mức độ biểu hiện mạnh nhất (chiếm 22,1%), tiếp theo là 2 enzyme CYP2E1 (15,3%) và CYP2C9 (14,6%) tính trên tổng số protein trong gan. Các enzyme CYP450 tham gia xúc tác cho nhiều loại phản ứng như: oxi hóa, oxi hóa sulpho (lưu huỳnh), hydroxyl hóa vòng (nhân) thơm, hydroxy hóa hợp chất không vòng, khử (tách) nhóm N- alkyl, khử (tách) nhóm O-alkyl (alkoxy). 1.2. Đa dạng di truyền các gen mã hóa cho enzyme CYP450 tham gia chuyển hóa thuốc Các kiểu đa hình di truyền khác nhau của các gen CYP450 sẽ quyết định về mặt chức năng và kiểu hình chuyển hóa thuốc: chuyển hóa thuốc bình thường (Extensive metabolizer-EM), chuyển hóa thuốc trung bình (Intermediate Metabolizer-IM), chuyển hóa thuốc yếu (Poor Metabolizer- PM) và chuyển hóa thốc cực nhanh (Ultra rapid Metabolizer-UM). Những CYP450 tham gia vào chuyển hóa nhiều loại thuốc trên thị trường nhất hiện nay là CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A4/5. Năm gen CYP450 nói 2
  5. trên mã hóa cho các enzyme tham gia vào chuyển hóa 60-80% các loại thuốc thường được kê đơn. Trong số các protein thuộc 18 họ CYP450, các protein có tính đa hình cao nhất là CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2D6 và CYP2C19. Bên cạnh đó có một số protein CYP450 thuộc các phân họ khác có tính đa hình thấp hơn như CYP1A1, CYP1A2, CYP2E1. Về chức năng chuyển hóa thuốc, CYP3A4/5 tham gia chuyển hóa nhiều loại thuốc trên thị trường nhất, tiếp theo là các enzyme CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 và CYP2E. 1.3. Ảnh hưởng của đa dạng di truyền các gen dược học đối với các ADR và sự khác biệt trong đáp ứng thuốc ADR là một đáp ứng với thuốc dưới dạng ngộ độc và ngoài ý muốn mặc dù dùng thuốc ở liều thông thường phục vụ cho mục đích dự phòng, điều trị hay chẩn đoán cũng như điều chỉnh chức năng sinh lý (Theo Tổ chức Y tế thế giới). Đã có nhiều báo cáo về ảnh hưởng của các biến thể thuộc các gen CYP450 mã hóa cho enzyme chuyển hóa thuốc pha I đến sự khác biệt trong đáp ứng thuốc của mỗi cá nhân. Một số bằng chứng cho thấy những kiểu gen CYP2B6 gây ra kiểu hình PM (đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép đối với 2 allele *6 và/hoặc *8) có liên quan đến giảm lượng thuốc efavirenz được chuyển hóa, đồng thời tăng nguy cơ ngộ độc thuốc này. Đối với phenytoin, CYP2C9 đóng vai trò chuyển hóa 90% loại thuốc này, trong đó các allele CYP2C9*2 và *3 làm giảm hoạt tính enzyme trong phản ứng chuyển hóa phenytoin. Bên cạnh đó, các allele *4 và *6 đã được báo cáo là xuất hiện ở những bệnh nhân có phản ứng phụ khi điều trị với phenytoin. Các trường hợp đa hình của CYP2D6 cũng đã được chỉ ra là có ảnh hưởng đến chuyển hóa thuốc sử dụng trong điều trị ung thư, rối loạn tim mạch, rối loạn tâm thần và giảm đau. Ngoài các enzyme chuyển hóa thuốc pha I và pha II, đa hình của các gen mã hóa cho các kênh vận chuyển thuốc cũng góp phần tạo nên ADR. 1.4. Ứng dụng và triển vọng của di truyền dược học trong lâm sàng Trong tương lai, các nghiên cứu xa hơn về di truyền dược học cần phải tăng cường sự hợp tác giữa các nhóm nghiên cứu trên toàn cầu. Nghiên cứu di truyền dược học cần thực hiện thu thập mẫu và phân tích tạo nên các cơ sở dữ liệu nhằm phục vụ cho quá trình phát triển thuốc. Trong các giai đoạn thử nghiệm thuốc lâm sàng, số liệu thu được của di truyền dược học có thể được áp dụng nhằm dự đoán đáp ứng thuốc cá nhân ở các cấp độ như: đáp 3
  6. ứng thuốc tốt, nguy cơ ADR, không đạt hiệu quả điều trị. Một trong những thử thách mà lĩnh vực hệ gen dược học đang đối mặt đó là cần phải phát triển các phương pháp thông lượng cao, qua đó có thể phân tích chức năng của số lượng lớn các biến thể chưa rõ chức năng tìm được khi sử dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới trên một lượng lớn các đối tượng bệnh nhân. Trong những năm gần đây, rất nhiều các nghiên cứu tương quan toàn bộ hệ gen về đáp ứng thuốc đã được tiến hành. 1.5. Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền của các gen CYP450 Các phương pháp sinh học phân tử đã và đang được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền các gen CYP450 như: giải trình tự Sanger, khuếch đại đặc hiệu và cắt bằng enzyme giới hạn (PCR-RFLP), và SNP array nhằm phát hiện các đa hình đơn nucleotide (Single nucleotide polymorphism-SNP) và các indel. Các phương pháp được sử dụng phổ biến để nghiên cứu các CNV của các gen CYP450 bao gồm: real-time PCR, phương pháp khuếch đại đa đầu dò phụ thuộc vào ghép nối (Multiplex ligation-dependent probe amplification-MLPA), phương pháp lai so sánh toàn bộ hệ gen (Comparative Genomic Hybridization-CGH), PCR kĩ thuật số. 1.6. Tình hình nghiên cứu đa hình di truyền một số gen CYP450 trên người Việt Nam và phạm vi nghiên cứu của luận án Đối với nhóm gen CYP450 mã hóa cho các enzyme tham gia chuyển hóa thuốc ở người, nhóm nghiên cứu thuộc Đại học Y Hà Nội và Bệnh viện K Trung ương đã tập trung vào đa hình phổ biến của CYP2D6 là CYP2D6*10. Năm 2018, nhóm nghiên cứu thuộc Khoa Y dược-Đại học quốc gia Hà Nội bước đầu nghiên cứu về mối liên quan giữa đa hình CYP2C19 tới hiện tượng kết tập tiểu cầu trên bệnh nhân mắc hội chứng mạch vành cấp tính tại Việt Nam. Cho đến nay mới chỉ có 06 công bố quốc tế về tần số của các allele đã biết gây kiểu hình PM, IM và UM của các gen CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4 và CYP3A5 trên người Việt Nam. Như vậy, chưa có thông tin về toàn bộ các biến thể trên các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 trên người Việt Nam. Luận án tập trung nghiên cứu sự phân bố của toàn bộ các allele thuộc CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và các allele với chức năng đã biết của CYP3A5 (*3, *5, *6 và *8) ở người Kinh Việt Nam sử dụng phương pháp giải trình tự trực tiếp. Ngoài ra, luận án cũng tiến hành phân tích các CNV của 4 gen nghiên cứu trên đối tượng người Kinh. 4
  7. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Một trăm ba mươi sáu người Kinh khỏe mạnh và không có quan hệ huyết thống tuổi từ 18-35 tình nguyện tham gia vào nghiên cứu (55 nam, 81 nữ. 2.2. Các thiết bị, dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu Các máy móc, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm phục vụ cho nghiên cứu thuộc Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Tách chiết DNA tổng số Mẫu máu ngoại vi (2ml mỗi cá thể) được thu vào ống chứa máu EDTA K2 và lưu giữ ở -200C cho đến khi sử dụng. DNA tổng số được tách chiết bằng ExgeneTM Blood SV mini Kit (GeneAll, Hàn Quốc), sau đó kiểm tra bằng điện di trên agrose 0,8% và đo nồng độ DNA. 2.3.2. Xác định nồng độ DNA tổng số 2.3.3. Khuếch đại đặc hiệu các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 Trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho các vùng gen của CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 dùng trong nghiên cứu được thiết kế bằng phần mềm Primer 3 (v.0.4.0) dựa trên trình tự gen tham chiếu của các gen nói trên tại cơ sở dữ liệu NCBI. Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế, vùng promoter cùng với tất cả 9 exon và các vùng biên của 3 gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và các đoạn gen của CYP3A5 mang các biến thể *3, *6, *8 và *9 được khuếch đại theo quy trình chuẩn. Tất cả các sản phẩm sau khi PCR được tinh sạch bằng Multiscreen PCR 96 Filter Plate theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 2.3.4. Giải trình tự Sanger Khuôn dùng cho phản ứng PCR này là sản phẩm PCR đặc hiệu đã tinh sạch như nêu ở trên. Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự, các đoạn DNA được điện di mao quản trên máy giải trình tự ABI 3500 Genetic Analyzer. Tín hiệu được ghi tự động, lưu trữ và phân tích trên máy tính. 2.3.5. Phương pháp MLPA 5
  8. Các CNV của các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 được phân tích bằng phương pháp MLPA sử dụng bộ kit thương mại SALSA MLPA P128-C1 Cytochrome P450 Probemix. Các đầu dò của bộ kit được thiết kế đặc hiệu cho việc lai và khuếch đại một số exon của các 04 gen nói trên. DNA được biến tính ở 98oC và lai với các đầu dò ở 60oC trong 16h. Phản ứng ghép nối được tiến hành ở 54oC và sau đó các đoạn đầu dò được ghép nối tiếp tục được khuếch đại. Cuối cùng, các sản phẩm khuếch đại được điện di mao quản nhằm phân tách các đoạn theo kích thước trên máy giải trình tự ABI 3500 Genetic Analyzer. 2.3.6. Long range (LR) PCR Để xác định biến thể CYP2D6*5, phản ứng LR-PCR được thực hiện với tổng thể tích là 25μl và sử dụng các cặp mồi được tham khảo từ nghiên cứu trước đó. Tất cả các sản phẩm LR-PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. 2.3.7. Real-time PCR Số bản sao CYP2C9 của các mẫu được kiểm chứng lại bằng phương pháp real-time PCR. Phản ứng real-time PCR được thực hiện sử dụng hóa chất Luna Universal qPCR Master Mix (NEB). Các cặp mồi được thiết kế nhằm định lượng số bản sao của CYP2C9 tại vị trí exon 4 và 7. Mẫu đối chứng là mẫu mà trước đó được xác định là có số bản sao bình thường (2 bản sao CYP2C9) từ dữ liệu MLPA. 2.3.8. Phân tích số liệu nghiên cứu Phần mềm Bioedit được sử dụng để phân tích các kết quả giải trình tự từ máy giải trình tự tự động. Trạng thái cân bằng quần thể Hardy-Weinberg của mỗi biến thể được tiến hành thông qua phần mềm HAPLOVIEW. Kiểm định khi bình phương (χ2) và Fisher exact trên Microsoft Excel 2010 được áp dụng để so sánh tần số allele của các gen trong nghiên cứu với các quần thể khác trên thế giới. 2.3.9. Dự đoán chức năng in silico của các biến thể mới Chức năng của các biến thể mới được dự đoán sử dụng các công cụ như Polyphen-2, PROVEAN (cho các biến thể làm thay đổi amino acid), Human Splicing Finder (cho các biến thể trong vùng intron) và MATCH (cho các biến thể trong vùng promoter). 6
  9. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết DNA tổng số DNA tổng số sau khi tách chiết từ máu ngoại vi được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. DNA tổng số thu được không bị đứt gẫy và có độ tinh khiết cao, với nồng độ nằm trong khoảng từ 19,4 đến 139,6 ng/µl. 3.2. Khuếch đại đặc hiệu các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A5 và giải trình tự Nghiên cứu này đã tiến hành khuếch đại đặc hiệu thành công vùng promoter, toàn bộ 9 exon và vùng biên của 2 gen CYP2C9, CYP2C19 và các đoạn gen CYP3A5 mang các biến thể *3, *6, *8 và *9 của tổng số 100 mẫu nghiên cứu (40 nam, 60 nữ). Đối với gen CYP2D6, chúng tôi đã khuếch đại đặc hiệu thành công vùng promoter, toàn bộ 9 exon và vùng biên của136 mẫu nghiên cứu (55 nam, 81 nữ). Các băng điện di có kích thước phù hợp với tính toán lý thuyết và tất cả sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch để sử dụng cho các phản ứng giải trình tự tiếp theo. 3.3. Phân tích đa hình/đột biến các gen CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 và CYP3A5 ở quần thể người Kinh Việt Nam 3.3.1. Đa hình/đột biến của gen CYP2C9 Đối với CYP2C9, nghiên cứu này đã xác định được tổng số 14 biến thể. Đáng chú ý, có 6 biến thể mới của CYP2C9 chưa được công bố trên cả 3 cơ sở dữ liệu đa hình di truyền dược học, NCBI dbSNP và 1000 Genomes. Những biến thể mới này bao gồm 4 thay đổi đơn nucleotide trong intron 2 (3415C>T), 6 (33622t>C, 38658A>G) và 7 (42801A>G), 01 biến thể xóa nucleotide trong intron 8 (47543delT) và một biến thể thay thế đơn nucleotide trong exon 7 (42627C>A) (Hình 3.6). Khi tiến hành xác định các CNV của CYP2C9 bằng phương pháp MLPA, có 3/100 mẫu nghiên cứu được xác định là mất 1 bản sao của gen này. Kết quả MLPA được kiểm tra lại bằng real-time PCR cho thấy tương đồng 100% ở 2 phương pháp này. Hiện tượng tăng số bản sao của CYP2C9 không được xác định trong tất cả 100 mẫu nghiên cứu. 7
  10. Hình 3.6. Các biến thể mới trong vùng intron và exon của CYP2C9 Các biến thể mới được xác định trong vùng từ intron 2 đến intron 8 của CYP2C9, bao gồm 5 biến thể mới trong intron và 1 biến thể mới trong exon 7. a) 3415C>T (intron 2), b) 33622T>C (intron 6), c) 38658A>G (intron 6), e) 42801A>G (intron 7), f) 47543delT (intron 8), và d) 42627C>A (exon 7). Vị trí nucleotide bị thay đổi được đánh dấu bằng mũi tên. Từ các số liệu thu được, nghiên cứu này xác định được 3 kiểu gen của CYP2C9 trong 100 mẫu nghiên cứu (Bảng 3.3). Trong đó, kiểu gen chiếm tần số lớn nhất là đồng hợp tử kiểu dại CYP2C9*1/*1 (90%) có hoạt tính enzyme bình thường. Hai kiểu gen ít phổ biến hơn là dị hợp tử CYP2C9*1/*3 (7%) có hoạt tính enzyme giảm (chuyển hóa thuốc trung bình) và CYP2C9*1/Del (mất 1 allele) với hoạt tính enzyme chưa rõ. Từ đó, tổng số có 3 allele của CYP2C9 đã được xác định trong nghiên cứu này là 8
  11. CYP2C9*1, CYP2C9*3 và CYP2C9Del (Bảng 3.4). Trong đó, *1 là allele kiểu dại và chiếm tỉ lệ cao nhất trong quần thể với 95%, *3 chiếm tỉ lệ thấp hơn với 3,5% và tỉ lệ thấp nhất là Del với 1,5%. Bảng 3.3. Tần số kiểu gen CYP2C9 trong quần thể người Kinh Việt Nam Kiểu hình Tổng số Tần số Kiểu gen chuyển hóa thuốc (N=100) (%) (Theo CPIC) *1/*1 EM 90 90 *1/*3 IM 7 7 *1/Del - 3 3 N: tổng số mẫu nghiên cứu Bảng 3.4. Tần số các allele CYP2C9 trong quần thể người Kinh Việt Nam Allele Tổng số (n=200) Tần số (%) *1 190 95 *3 7 3,5 Del 3 1,5 n: tổng số allele trong quần thể 3.3.2. Đa hình/đột biến của gen CYP2C19 Đối với CYP2C19, tổng số 14 biến thể đã được xác định trong trong số 100 mẫu nghiên cứu. Các biến thể mới bao gồm 12637C>G (intron 2), 57637delG (intron 5) và 90008C> (intron 8) (Hình 3.9). Có 6 kiểu gen của CYP2C19 được xác định với tỉ lệ dao động từ 1%-58% (Bảng 3.7). Kiểu gen phổ biến nhất là CYP2C19*1/*1 (58%) và dị hợp tử CYP2C19*1/*2 (32%). Kiểu gen dị hợp tử CYP2C19*2/*3 chiếm tỉ lệ thấp nhất với 1%. Tổng số có 4 allele của CYP2C19 đã được tìm thấy trong số 100 mẫu nghiên cứu bao gồm: CYP2C19*1, CYP2C19*2, CYP2C19*3 và CYP2C19*17 (Bảng 3.8). Allele kiểu dại CYP2C19*1 chiếm tần số cao nhất với 76% trong số các mẫu nghiên cứu. Trong khi đó, các allele còn lại là CYP2C19*2, CYP2C19*3 và CYP2C19*17 lần lượt chiếm tỉ lệ 20,5%, 2,5% và 1%. Phân tích MLPA cho 9
  12. thấy không có CNV nào của CYP2C19 được xác định ở 100 mẫu nghiên cứu. Hình 3.9. Các biến thể mới trong vùng intron của CYP2C19. Nghiên cứu này xác định được 03 biến thể mới trong vùng intron của CYP2C19: a) biến thể 2637C>G (intron 2), b) biến thể 57637delG (intron 5) và c) biến thể 90008C>T (intron 8-sử dụng mồi ngược cho giải trình tự). Các vị trí nucleotide bị biến đổi được đánh dấu bằng mũi tên. Bảng 3.7. Tần số kiểu gen của CYP2C19 trong quần thể người Kinh Việt Nam Kiểu hình chuyển hóa thuốc Tần số (%) Kiểu gen Tổng số (N=100) (Theo CPIC) *1/*1 58 EM 58 *1/*2 32 IM 32 *1/*3 4 IM 4 *2/*2 3 PM 3 *2/*3 1 PM 1 *2/*17 2 IM 2 N: Tổng số mẫu nghiên cứu 10
  13. Bảng 3.8. Tần số các allele CYP2C19 trong quần thể người Kinh Việt Nam Allele Tổng số Tần số % (n=200) *1 154 76 *2 41 20,5 *3 5 2,5 *17 2 1 n: tổng số allele trong quần thể 3.3.3. Đa hình/đột biến của gen CYP2D6 Phương pháp giải trình tự đã xác định được tổng số 30 biến thể trong 136 mẫu nghiên cứu, trong đó có 7 biến thể mới. Các biến thể mới bao gồm 3 biến thể trong vùng promoter (-498C>A, -184A>T, -175A>T) (Hình 3.10), 2 biến thể trong intron 4 và 6 (2137G>C, 2988G>A) và 2 biến thể trong exon 7 và exon 8 (3157G>T, 3851G>A) (Hình 3.11). Hình 3.10. Các biến thể mới trong vùng promoter CYP2D6 Nghiên cứu này xác định được 03 biến thể mới trong vùng promoter (sử dụng mồi ngược cho giải trìn tự): a) biến thể -175A>T, b) biến thể -184A>T, c) biến thể - 498C>A. Các vị trí nucleotide bị biến đổi được đánh dấu bằng mũi tên. Các biến thể 11
  14. trên đều được xác định ở trạng thái dị hợp tử, riêng biến thể -498C>A được xác định cả ở trạng thái dị hợp tử và đồng hợp tử. Hình 3.11. Các biến thể mới trong vùng intron và exon của CYP2D6 Nghiên cứu này xác định được 2 biến thể mới trong intron và 2 biến thể mới trong exon của CYP2D6: a) biến thể 2137G>C (intron 4), b) biến thể 2988G>A (intron 6), c) biến thể 3157G>T (exon 7), d) biến thể 3851G>A (exon 8- sử dụng mồi ngược cho giải trình tự). Các vị trí nucleotide bị biến đổi được đánh dấu bằng mũi tên. Các biến thể trên đều được xác định ở trạng thái dị hợp tử. Kết quả phân tích số bản sao bằng MLPA cho thấy có 12 kiểu tập hợp số bản sao của CYP2D6. Một số mẫu cho thấy bị mất 1 bản sao của CYP2D6 được kiểm tra lại ngẫu nhiên bằng LR-PCR và kết quả phù hợp 100% với dữ liệu thu được từ MLPA (Hình 3.15). Ngoài ra, không có mẫu nào trong số 136 mẫu nghiên cứu xuất hiện biến thể tăng số bản sao của CYP2D6. 12
  15. a) b) Hình.3.15. LR-PCR kiểm tra allele CYP2D6*5. a) Sơ đồ vị trí các cặp mồi sử dụng cho LR-PCR tương ứng với các allele CYP2D6*1 và CYP2D6*5. Đột biến mất 1 allele CYP2D6 sẽ tạo sản phẩm là 2 đoạn có kích thước 3,2kb-allele *5 (cặp mồi Dup và Dlow) và 5,1kb-allele kiểu dại *1(cặp mồi DPKup và DPKlow). Các mẫu đồng hợp tử kiểu dại chỉ xuất hiện 1 sản phẩm có kích thước 5,1kb. b) Giếng 1: Thang DNA chuẩn, giếng 2-3: các mẫu đồng hợp tử kiểu dại CYP2D6*1/*1, giếng 4-5: các mẫu mất 1 bản sao CYP2D6 có kiểu gen dị hợp tử CYP2D6*1/*5. Các dữ liệu thu được từ giải trình tự và phân tích số bản sao bằng MLPA được kết hợp để đưa ra kiểu gen cuối cùng ở mỗi mẫu nghiên cứu. Trong số 136 mẫu nghiên cứu, có 29 kiểu gen khác nhau đã được xác định với tần số dao động từ 0,7% đến 22,8%. Trong số đó, những kiểu gen chiếm tỉ lệ nhiều nhất đó là CYP2D6*10/*10 (22,8%), tiếp theo là dị hợp tử CYP2D6*1/*10 (15,4%) và CYP2D6*10/*36-*10 (11%). Từ số liệu về kiểu gen của136 mẫu Kinh, nghiên cứu đã xác định được 9 kiểu allele CYP2D6 đã được báo cáo trong cơ sở dữ liệu PharmVar (75,37%), 8 biến thể cấu trúc (Structual vriant-SV) (3 biến thể dạng hybrid, 5 biến thể dạng tandem arrangements) trên locus CYP2D6 (16,54%) và 01 CNV (mất 1 allele) của gen này (8,09%) (Bảng 3.11). Trong số 9 kiểu allele của CYP2D6, allele CYP2D6*10 (gây giảm chức năng của enzyme) chiếm tỉ lệ cao nhất là 43,75%, trong khi đó các allele 13
  16. CYP2D6*1 và *2 (kiểu hình bình thường) lần lượt chiếm tỉ lệ là 18,75% và 7,35%. Ngoài ra, nghiên cứu này cũng xác định được 5 allele không chức năng của CYP2D6 chiếm tỉ lệ từ 0,37% đến 8,09% (*4, *5, *14, *15 và *36). Bên cạnh đó, có 3 allele với chức năng chưa rõ cũng được xác định đó là *60 (0,74%), *65 (2,94%) và *86 (0,37%). Trong số những biến thể dạng tandem rearrangements, CYP2D6*36-*10 là biến thể chiếm tỉ lệ lớn nhất (12,13%). Bảng 3.11. Tần số allele của CYP2D6 trong quần thể người Kinh Việt Nam Loại biến thể/Allele STT Biến Tần số (%) Chức năng 1 *1thể/Allele 18,75 (Theo Bình CPIC) thường 2 *2 7,35 Bình thường 3 *4 0,74 Không 4 *10 43,75 Giảm SNP/indel 5 *14 0,37 Không 6 *15 0,37 Không 7 *60 0,74 Chưa biết 8 *65 2,94 Chưa biết 9 *86 0,37 Chưa biết CNV 1 *5 8,09 Không 2 *13 1,547 Không Hybrid 3 *36 0,37 Không 4 *67 0,37 Chưa biết Cấu trúc 5 *13-*1 0,74 Bình thường (SV) 6 *13-*2 0,74 Bình thường Tandem 7 *36-*36-*10 0,37 Giảm arrangements 8 *36-*10 12,13 Giảm 9 *68-*4 0,37 Không 14
  17. Chi tiết của các biến thể SV của CYP2D6 trong nghiên cứu này được thể hiện trong Hình 3.16. Hình 3.16. Các SV của CYP2D6 được xác định trên các mẫu người Kinh a) Locus gen tham chiếu CYP2D6 (màu đỏ) và các gen giả CYP2D7 (màu xanh) và CYP2D8 (màu ghi). REP6 (màu tím) và REP7 (màu đen) là các trình tự lặp lại nằm xuôi chiều CYP2D6 và CYP2D7. b) Đột biến mất toàn bộ CYP2D6. c) Các cấu trúc lai của CYP2D6 bao gồm các dạng lai CYP2D6-2D7 (vùng 5’ có nguồn gốc từ CYP2D6 và vùng 3’ có nguồn gốc từ CYP2D7) và CYP2D7-2D6 (vùng 5’ có nguồn gốc từ CYP2D7 và vùng 3’ có nguồn gốc từ CYP2D6). d) Biến thể về sắp xếp của CYP2D6, biến thể dạng này bao gồm 2 hoặc nhiều hơn 2 bản sao của CYP2D6 nằm cạnh nhau trên cùng 1 allele và các bản sao này không giống nhau. Biến thể dạng này được phân biệt với loại biến thể tăng số lượng bản sao của CYP2D6 là duplication và multiplication. #Thông tin chi tiết về các SV của CYP2D6 được báo cáo trong cơ sở dữ liệu PharmVar (https://www.pharmvar.org/gene/CYP2D6). ∆Chi tiết của các SV này được báo cáo trong nghiên cứu của Gaedik và cộng sự. 15
  18. 3.3.4. Đa hình/đột biến của gen CYP3A5 Kết quả nghiên cứu không xác định được sự tồn tại của CYP3A5*6, *8 và *9 trên các mẫu nghiên cứu. Đối với biến thể CYP3A5*3, kết quả giải trình tự 100 mẫu nghiên cứu xác định được sự tồn tại của allele này ở trạng thái dị hợp tử *1/*3 và đồng hợp tử *3/*3 (Hình 3.17). Cụ thể, có 90% số người trong nghiên cứu mang ít nhất một allele CYP3A5*3 (*1/*3 và *3/*3, N=90) trong khi đó chỉ 10% số người mang kiểu gen đồng hợp tử kiểu dại CYP3A5*1/*1. Hình 3.17. Kết quả giải trình tự của CYP3A5*3. a) Đồng hợp tử kiểu dại CYP3A5 *1/*1 (AA), b) Dị hợp tử CYP3A5 *1/*3 (AG), c) Đồng hợp tử đột biến CYP3A5 *3/*3 (GG). Vị trí nucleotide bị biến đổi đánh dấu bằng mũi tên. Tần số allele kiểu dại CYP3A5*1 được xác định là 32,5% còn tần số allele CYP3A5*3 (6986A>G) là 67,5% (Bảng 3.12). Với tần số kiểu gen và allele như vậy, quần thể nghiên cứu xấp xỉ đạt trạng thái cân bằng Hardy- Weinberg (p=0,9677). Bảng 3.12. Tần số kiểu gen và tần số allele CYP3A5 trên người Kinh Việt Nam Tần số Kiểu gen (N=100) Allele (n=200) *1/*1 *1/*3 *3/*3 *1 *3 Nghiên cứu này 10 45 45 65 135 Hardy-Weinberg 10,56% (10%) 43,88% (45%) 45,56% (45%) (32,5%) (67,5%) p= 0,9677 N: Tổng số mẫu nghiên cứu, n: Tổng số allele của quần thể nghiên cứu 16
  19. Phân tích MLPA cho thấy không có biến thể số bản sao nào của CYP3A5 được xác định ở 100 mẫu nghiên cứu. Tất cả các mẫu nghiên cứu đều cho tỉ lệ của các đầu dò sau chuẩn hóa nằm trong khoảng 0,8-1,2. 3.4. Phân tích liên kết giữa các biến thể trên CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6 Phân tích liên kết các biến thể (Linkage disequilibrium-LD) được tiến hành nhằm xác định mối liên hệ giữa các SNP sử dụng phần mềm Haploview 4.2 và giá trị D’. Đối với các biến thể của CYP2C9, phân tích Haploview cho thấy có 2 block thể hiện 2 nhóm liên kết. Những marker trong 2 block này không thể hiện độ liên kết chặt chẽ với giá trị LODC) đến 87106 ở intron 7 (marker 87106T>C). Đối với CYP2D6, Nghiên cứu này đã xác định được 1 LD block kéo dài từ vị trí 214 ở intron 1 (marker 214G>C) đến vị trí 245 ở intron 1 (marker 245G>C). Các marker trong block này có mối liên kết chặt với LOD # 2 và D’=1. 3.5. Dự đoán chức năng in silico của các biến thể mới tìm thấy trên CYP2C9, CYP2C19 và CYP2D6 *Dự đoán chức năng của các biến thể mới thuộc CYP2C9 Đối với gen CYP2C9, 2 mô hình HumDiv và HumVar của Polyphen- 2 đều đưa ra kết quả dự đoán chức năng của biến thể 42627C>A (p.Pro363His) có khả năng gây hại đến protein được mã hóa với Score = 1. Tương tự, công cụ PROVEAN cũng cho thấy sự kiện thay thế proline bằng histidin tại vị trí 363 trên chuỗi polypeptide có khả năng gây hại đến protein này với Score = -8.373 (Hình 3.21). Khi tiến hành so sánh trình tự amino acid trên các loài động vật có xương sống, dữ liệu đưa ra cho thấy vị trí amino acid 363-Proline trên CYP2C9 có tính bảo thủ cao giữa các loài (Hình 3.22). Phân tích bằng Human Splicing Finder cho thấy cả 5 biến thể mới trong intron của CYP2C9 đều không gây ảnh hưởng tiêu cực đến cắt nối tự nhiên của mRNA. 17
  20. Hình 3.21. Dự đoán chức năng biến thể CYP2C9 42627C>A bằng Polyphen 2 (a) và PROVEAN (b) Hình 3.22. Tính bảo thủ của vị trí amino acid Proline 363 trên protein CYP2C9 Vị trí amino acid Proline 363 trên CYP2C9 được đánh dấu với nét đứt màu đỏ. *Dự đoán chức năng của các biến thể mới thuộc CYP2C19 Đối với các biến thể mới của CYP2C19, dự đoán bằng Human Splicing Finder cho thấy cả 3 biến thể mới trong intron của CYP2C19 đều không làm thay đổi mô hình cắt nối tự nhiên của mRNA của gen này. *Dự đoán chức năng của các biến thể mới thuộc CYP2D6 Để đánh giá ảnh hưởng lên quá trình điều hòa phiên mã của 3 biến thể mới này, công cụ MATCH được sử dụng để phân tích vùng trình tự mang các biến thể -498C>A, -184A>T và -175A>T. Tuy nhiên, kết quả phân tích cho thấy những biến thể này không nằm ở những vị trí kết hợp với các yếu tố phiên mã trong promoter của CYP2D6. 18
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
4=>1