intTypePromotion=1
ADSENSE

Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:31

9
lượt xem
0
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của luận án nhằm tạo cơ sở khoa học và thực nghiệm để biểu hiện các gen mã hoá kháng nguyên của chủng virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn đang lưu hành ở Việt Nam bằng phương pháp biểu hiện gen tạm thời trong thực vật phục vụ cho định hướng phát triển sản xuất vaccine thế hệ mới.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium

  1. VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH HẰNG  NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN (M, GP5,  GP5ectoM) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN  SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TRONG CÂY THUỐC LÁ  BẰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM LỌC NHỜ  AGROBACTERIUM Chuyên ngành: Hoá sinh học Mã số: 9420116 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
  2. HÀ NỘI – 2019
  3. Công trình được hoàn thành tại Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học:  1. TS. Nguyễn Trung Nam                  Viện Công nghệ sinh học             2. PGS. TS. Chu Hoàng Hà                  Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: PGS. TS. Đồng Huy Gới Phản biện 2: GS. TS. Đậu Ngọc Hào Phản biện 3: GS. TS. Chu Hoang Mậu Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án phiên chính  thức tại Viện Công nghệ sinh học Vào hồi ……giờ….., ngày…..tháng…..năm 2019. Có thể tìm hiểu luận án tại:
  4. ­ Thư viện Quốc gia Việt Nam ­ Thư viện Viện Công nghệ sinh học ­ Trang web của Bộ GD & ĐT NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ ̣ ương, Nguyên Thu Giang, Pham Bich ̀ , Hô Thi Th ̃ ̣ ́   ̣ ̀ 2017).  Tách dòng và đồng biểu  Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha ( ̃ ̀ hiện gen mã hóa hai loại kháng nguyên vỏ  GP5ecto (vùng ngoại bào) và M  của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn. Tap chi Khoa hoc ̣ ́ ̣   ̣ ự nhien va Cong ngh ĐHQGHN: Khoa hoc T ̂ ̀ ̂ ẹ, T ̂ ạp 33(1S): 150­158. ̂ 2. Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ ̣ ̀ , Hô Thi Th ương, Nguyên Thu Giang, Pham Thi ̃ ̣ ̣  ̣ ̣ ̀ 2017).   Biểu  Vân, Pham Bich Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha ( ́ ̃ ̀ hiện và tinh sạch protein M của virus PRRS gây bệnh lợn tai xanh bằng công  nghệ  biểu hiện tạm thời trong lá thuốc lá Nicotinana benthamiana. Tap chí ̣   Công nghệ Sinh hoc̣  15(3): 547­554. 3. Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ ̣ ương, Pham Bich Ngoc, Nguyên Trung ̀ , Hô Thi Th ̣ ́ ̣ ̃   ̀ 2018). Xác định khả năng kích thích tạo kháng thể đặc  Nam, Chu Hoang Ha ( ̀ hiệu của kháng nguyên tái tổ  hợp GP5­ELP của virus PRRS gây hội chứng  rối loạn sinh sản và hô hấp  ở  lợn trên động vật thí nghiệm. Tạp chí Khoa   học kỹ thuật thú y. Tập 25(5): 35­42. 4. Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ ̣ ương, Nguyễn Thu Giang, Pham Bich ̀ , Hô Thi Th ̣ ́   ̣ ̀ 2018).  Nghiên cứu tối  ưu các  Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha ( ̃ ̀ điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M của virus PRRS   trong lá cây thuốc lá  Nicotinana benthamiana.  Tap chí Công ngh ̣ ệ  Sinh hoc̣   16(2): 293­300. 5. Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̣ ́ ̣ ̀ , Pham Bich Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha ̃ ̀ ̀  (2018).  Đánh   giá   khả   năng   kích   thích   đáp   ứng   kháng   thể   đặc   hiệu   của   kháng  
  5. nguyên M và GP5ectom/PRRSV được sản xuất từ  thực vật trên chuột bạch. Hội   nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2018: 194­199. 6. Nguyên Thi Minh Hăng ̃ ̣ ̀ ̣ ương, Nguyên Thu Giang, Pham Bich ̀ , Hô Thi Th ̃ ̣ ́   ̣ ̀ 2016). Đánh giá sự biểu hiện tạm  Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha ( ̃ ̀ thời   kháng nguyên  GP5  tái  tổ  hợp của  virus  PRRS  trong mô   lá thuốc  lá  Nicotinana tabacum. Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc lần thứ IV, khu   vực phía nam, 2016: “Ứng dụng Công nghệ  sinh học vào thực tiễn”; P1­ 14:57. MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hội   chứng   rối   loạn   sinh   sản   và   hô   hấp   ở   lợn   (Porcine   reproductive   and   respiratory syndrome – PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hi ểm trên lợn do virus  gây ra. Ở Việt Nam, bệnh còn đượ c gọi là “Bệnh lợn tai xanh” (theo ngôn ngữ đại  chúng) do lợn mắc bệnh th ường b ị xung huy ết  ở tai, lúc đầu đỏ sẫm, sau tím xanh.  PRRS gây thiệt hại kinh t ế r ất l ớn  ở nh ững n ước có bệnh. PRRS đượ c phát hiện ở  Mỹ vào năm 1987. Hàng năm nướ c Mỹ phải chịu những thi ệt hại do b ệnh này ướ c  tính khoảng 664 tri ệu USD cho vi ệc tiêu huy l ̉ ợn chêt, l ́ ợ n ôm, chi phi chông dich ́ ́ ́ ̣   ̀ ử ly môi tr va x ́ ươ ̀ng. Ở  Việt Nam, dich PRRS do virus th ̣ ể độc lực cao xuất hiện lần đầu tiên vào   năm 2007. Từ đo đên nay, dich đa ́ ́ ̣ ́ ện  ở  hâu hêt cac đia ph ̃ xuât hi ̀ ́ ́ ̣ ươ ng trong cả  nươ ́c. Theo thống kê của Cục Thú y, từ  cuối tháng 4/2016 đến tháng 11/2016, đã  xuất hiện 14  ổ  dịch PRRS t ại 8 huy ện c ủa 4 t ỉnh là Quảng Trị, Hậu Giang, Ngh ệ  An và Hà Tĩnh, làm 3.433 con lợn mắc b ệnh, trong đó có 1.242 con lợn bị tiêu huỷ.  PRRS đã anh hủ ̛ở ng nặng nê t̀ ới nganh chan nuoi l ̀ ̆ ̂ ợn trong n ước. B ệnh v ẫn xu ất   hiện  ở  một số  địa phươ ng và có tính chất 2­3 năm một lần. Điều này cũng cho   thấy nguy cơ xuất hiện tr ở l ại c ủa d ịch b ệnh này trong thời gian tới. Hiện nay, các vaccine phòng PRRS chủ  yếu là vaccine vô hoạt và nhượ c   độc. Cac vaccine vô ho ́ ạt thươ ̀ng an toan nh ̀ ưng kh ả năng bao h ̉ ộ thâp. Cac vaccine ́ ́   nhượ c độc bao h ̉ ộ  tốt hơn nhưng còn nhiều lo ngại về  tính an toàn của các loaị  vaccine này. Vaccine nhược độc có thể  giam dân m ̉ ̀ ức bao h ̉ ộ  do giam m ̉ ưc t ́ ương   đông v ̀ ới chung m ̉ ới (nếu có) va ban thân virus vaccine sau nhiêu lân truyên nhi ̀ ̉ ̀ ̀ ̀ ễm   ́ ̉  đột biên tr cũng co thê ́ ở  thanh c ̀ ường độc. Mặc dù vậy, phòng chống PRRS tại   Việt Nam đã đạt hiệu quả  cao. Hiện nay, d ịch ch ỉ  xu ất hi ện l ẻ  t ẻ, trong nh ững   năm gần đây hầu như  không có dịch, một phần là nhờ  biện pháp chủ  động tiêm  phòng cho lợn. Virus gây Hội chứng rối loạn sinh s ản và hô hấp  ở  lợn  ở  nướ c ta hiện nay   được xác định là thể  độc lực cao và chưa có thuốc đặc trị. Việc phòng chống dịch  chủ  yếu vẫn là tiêm phòng vaccine kết hợp các biện pháp thú y (Tiêu độc khử  trùng, vệ  sinh tru ồng tr ại, cách ly và tiêu huỷ  lợn bệnh ...). Để  phòng chống virus  thể  độc lực cao đang lưu hành tại Việt Nam cần phải có thêm vaccine phù hợp.  
  6. Nhu cầu về  các loại vaccine PRRS th ế h ệ m ới trong đó có vaccine tiểu đơn vị, an  toàn và hiệu quả hơn là vấn đề cấp thiết.  Protein GP5 và M là những protein c ấu trúc chính của virus PRRS (PRRSV)  được lựa chọn là những ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine tiểu đơn vị chống   PRRSV. Các kháng thể  kháng GP5 và M  ở  lợn là các kháng thể  có khả  năng trung   hoà PRRSV. Sự  kết hợp đoạn peptit miền ngoài của  kháng nguyên GP5 (GP5ecto)  được cho là chứa các epitope trung hoà của GP5 với protein M với mong muốn sẽ tạo   được protein tái tổ  hợp heterodimer GP5ectoM có khả  năng kích thích tạo đáp  ứng  miễn dịch mạnh và trở  thành một trong những  ứng viên tiềm năng để  phát triển sản  xuất vaccine chống PRRSV. Kháng nguyên của virus PRRS có thể  đượ c sản xuất trong hệ  thống th ực   vật nhằm phát triển vaccine tiểu đơn vị  phòng PRRS thông qua phươ ng pháp biểu   hiện gen tạm thời. H ệ th ống bi ểu hi ện gen t ạm th ời  ở th ực v ật b ằng ph ương pháp   thẩm lọc nhờ   Agrobacterium nhằm sản xuất kháng nguyên có nhiều  ưu điểm như:   Mức độ  biểu hiện kháng nguyên cao, có thể  sản xuất  ở quy mô lớn, phươ ng pháp  thực hiện đơn giản, thời gian nhanh, không bị   ảnh hưở ng bởi vị  trí gắn gen đích  trong tế bào thực vật và có thể  tiến hành biểu hiện trong các mô đã biệt hóa hoàn  toàn như  lá, cung cấp kháng nguyên cho mục đích sản xuất vaccine chống ch ủng   virus mới xuất hiện một cách nhanh chóng khi dịch bệnh xảy ra. Căn cứ vào các luận cứ khoa học và tình hình thực tiễn nêu trên, luận án được   thực hiện với đề  tài “Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM)   của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp  ở  lợn trong cây thuốc lá  bằng phương pháp thẩm lọc nhờ  Agrobacterium” với mục đích tạo cơ  sở  khoa  học và thực nghiệm để  biểu hiện các  gen mã hoá kháng nguyên của chủng virus  PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp  ở  lợn đang lưu hành  ở  Việt Nam  bằng phương pháp biểu hiện gen tạm thời trong thực vật phục vụ  cho định hướng  phát triển sản xuất vaccine thế hệ mới. 2. Mục tiêu nghiên cứu  Mục tiêu chung Nghiên cứu cơ  sở  khoa học và thực nghiệm của việc sản xuất kháng nguyên  tái tổ  hợp M/GP5/GP5ectoM của chủng virus PRRS (PRRSV) đang gây bệnh lợn tai   xanh  ở Việt Nam bằng công nghệ  biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá phục vụ  cho  định hướng phát triển vaccine thế hệ mới. Mục tiêu cụ thể Thiết kế được 3 cấu trúc vector chuyển gen mang gen m, gp5optimize (gp5opt)  và gp5ecto­m của chủng virus thể độc lực cao gây Hội chứng rối loạn sinh sản   và hô hấp ở lợn dưới sự điều khiển biểu hiện bởi promoter CaMV 35S.  Tối  ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá 3 loại kháng nguyên M ,  GP5 và GP5ectoM của chủng PRRSV thể độc lực cao trong lá cây thuốc lá và   tinh sạch được kháng nguyên M, GP5 và GP5ectoM tái tổ hợp từ mô lá thuốc lá. Đánh giá được tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp M, GP5 và GP5ectoM  trên động vật thí nghiệm.    3. Nội dung nghiên cứu
  7. (1) Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang các  gen m/gp5opt/gp5ecto­m   mã   hoá  kháng   nguyên   M­ELP/   GP5­ELP   /GP5ectoM­ELP   và   tạo   chủng  Agrobacterium  mang vector tương  ứng; (2) Tối  ưu các điều kiện biểu hiện tạm   thời  gen  m/  gp5opt/ gp5ecto­m  ở  lá cây thuốc lá  N. benthamiana.  Biểu hiện tạm  thời và tinh sạch các kháng nguyên M­ELP/ GP5­ELP/ GP5ectoM­ELP tái tổ  hợp;  (3)  Đánh giá tính sinh miễn dịch dịch thể  của kháng nguyên  M­ELP/ GP5­ELP/  GP5ectoM­ELP tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm. 4. Đóng góp mới của luận án Luận án đã tiến hành thực hiện nghiên cứu một cách tổng thể, từ việc thiết kế  vector chuyển gen mang các gen mã hóa kháng nguyên của virus PRRS gây bệnh lợn  tai xanh, tối ưu các điều kiện biểu hiện gen tạm thời trong thực vật, biểu hiện và tinh  sạch kháng nguyên và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên tái tổ  hợp trên  động vật thí nghiệm.  Luận án là  công trình  nghiên cứu thành công đầu tiên tại Việt Nam về  việc   thiết kế  vector chuyển gen và biểu hiện tạm thời các gen  m/ gp5opt/ gp5ecto­m mã  hoá kháng nguyên tái tổ  hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP của chủng virus  PRRS gây bệnh lợn tai xanh đang lưu hành tại Việt Nam trong lá cây thuốc lá  N.   benthamiana bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium.  Kết quả của luận án cũng đã chứng minh được các kháng nguyên tái tổ hợp M­ ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP có khả  năng kích thích sinh kháng thể  đặc hiệu   kháng virus PRRS trên động vật thí nghiệm. Trong đó,  kháng nguyên GP5ecto (vùng  ngoại bào của GP5) dung hợp với kháng nguyên M (GP5ectoM­ELP) kích thích đáp  ứng kháng thể  đặc hiệu tốt hơn kháng nguyên M­ELP, GP5­ELP riêng lẻ. Kháng   nguyên GP5ectoM­ELP và GP5­ELP là hai  ứng viên tiềm năng để  sản xuất vaccine  tiểu đơn vị chống PRRSV thể độc lực cao đang gây bệnh ở Việt Nam. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 5.1. Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp cơ  sở khoa học quan trọng trong việc thiết kế các cấu trúc  vector chuyển gen mang gen m/gp5opt/gp5ecto­m mã hóa cho các kháng nguyên tái tổ  hợp M, GP5 và GP5ectoM của PRRSV dung hợp Elastin ­ like polypeptide (ELP); biểu  hiện tạm thời kháng nguyên tái tổ hợp trên cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc  nhờ  Agrobacterium;  tách chiết, tinh sạch và đánh giá khả  năng kích thích đáp  ứng  miễn dịch dịch thể của các kháng nguyên tái tổ hợp này trên động vật thí nghiệm. Kết  quả  đề  tài luận án là bằng chứng khoa học về  tiềm năng của việc sản xuất, phát   triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS trong thực vật.  5.2. Ý nghĩa thực tiễn Các cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen m/ gp5opt/ gp5ecto­m mã  hóa các kháng nguyên tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP của chủng virus   PRRS đang lưu hành ở Việt Nam và các chủng  A. tumefaciens mang các vector này có  thể được sử dụng để nghiên cứu biểu hiện, sản xuất và phát triển vaccine tiểu đơn vị  phòng PRRS. Quy trình biểu hiện gen tạm thời trên lá cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm   lọc nhờ  A. tumefaciens với các điều kiện tối  ưu của đề tài luận án có thể ứng dụng 
  8. để sản xuất các kháng nguyên tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP, GP5ectoM­ELP hoặc các  protein tái tổ hợp khác. Kháng nguyên tái tổ hợp GP5­ELP và GP5ectoM­ELP được tạo ra trong đề tài   luận án là hai ứng viên tiềm năng cho sản xuất vaccine tiểu đơn vị phòng bệnh lợn tai   xanh ở Việt Nam. 6. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 131 trang (Từ Mở đầu đến Kết luận và kiến nghị, không bao gồm   Danh mục các công trình công bố, Tóm tát luận án bằng Tiếng Anh, tài liệu tham   khảo và các phụ  lục), được chia thành các phần: Mở  đầu gồm 5 trang; Chương 1:   Tổng quan tài liệu, 37 trang; Chương 2: Vật liệu và phương pháp, 17 trang; Chương   3: Kết quả nghiên cứu, 47 trang; Chương 4: Bàn luận kết quả  nghiên cứu, 22 trang;   Kết luận và đề nghị: 2 trang; Các công trình đã công bố liên quan đến luận án: 1 trang;  Tóm tắt luận án bằng tiếng anh: 7 trang; Luận án có 7 bảng số liệu, 51 hình. Ngoài ra,   tài liệu tham khảo: 229 tài liệu tham khảo, trong đó 14 tài liệu tiếng Việt và 215 tài liệu   tiếng Anh; Phụ lục: 5 trang;  Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án đã tham khảo và tổng kết 16 tài liệu trong nước, 217 tài liệu nước ngoài  với các nội dung liên quan, bao gồm: (1) Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn,   như: Sơ  lược tình hình dịch bệnh; bệnh tích của PRRS; virus PRRS; (2) Vaccine   phòng PRRS: Vaccine sống ­ nhược độc; vaccine vô hoạt; các dạng vaccine thử nghiệm  dựa vào kháng nguyên GP5 và M chống PRRSV;  (3) Biểu hiện tạm thời kháng nguyên  của PRRSV ở thực vật bằng phương pháp thẩm lọc nhờ  Agrobacterium, như: Lợi thế  của phương pháp biểu hiện gen tạm thời nhờ  A. tumefaciens; quá trình thẩm lọc nhờ  A. tumefaciens; một số giải pháp tăng cường biểu hiện gen tạm thời ở thực vật.  Với các dẫn liệu thu thập được, kết quả phân tích cho thấy Hội chứng rối loạn sinh   sản và hô hấp  ở  lợn (PRRS) do virus PRRS (PRRSV) gây ra, là một bệnh truyền  nhiễm nguy hiểm  ở lợn, được phát hiện lần đầu tiên  ở  Mỹ  vào năm 1987 và đã lây  lan  ở  nhiều quốc gia trên thế  giới, gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi  lợn. PRRSV là loai virus RNA không ôn đinh, thay đôi nhanh chóng ca vê đ ̣ ̉ ̣ ̉ ̉ ̀ ặc tính di   truyêǹ  và kháng nguyên, có tốc độ tiến hóa nhanh nhất trong số các virus RNA. Điều   này, gây ra nhiều khó khăn cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine phòng PRRS. Hiện  nay, trên thế  giới đã có hơn 20 loại vaccine thương mại phòng PRRS. Các vaccine   được sản xuất từ các chủng virus dòng châu Âu và dòng Bắc Mỹ dưới hai dạng chủ  yếu là vaccine sống – nhược độc và vaccine vô hoạt. Vaccine vô hoạt thường an toàn,  có khả năng phòng ngừa các triệu chứng lâm sàng nhưng hiệu quả bảo hộ không cao.   Vaccine nhược độc tạo ra miễn dịch bảo hộ  tốt với các chủng tương đồng nhưng   mức bảo hộ có thể giảm dần do giảm mức tương đồng với các chủng mới, có nguy   cơ  phát triển độc tính trở  lại, bản thân virus vaccine sau nhiều lần truyền nhiễm có  thể đột biến trở thành cường độc. Ở Việt nam, phát hiện bệnh PRRS lần đầu tiên vào năm 1996 trên đàn lợn giống  51 con nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam và dịch bệnh nặng xuất hiện từ năm 2007  cho đến nay. Công ty  Hanvet đã nghiên cứu và sản xuất thành công vaccine PRRS 
  9. nhược độc chủng Hanvet 1.VN để phòng chống PRRS ở Việt Nam. Tuy nhiên, do sự  biến đổi di truyền phức tạp c ủa PRRSV, các loại vaccine đang lưu hành trên thực  địa hiện nay đang mất dần hiệu lưc. Virus gây dịch tai xanh  ở  nước ta hi ện nay   được xác định là thể  độc lực cao,  thuọc ch ̂ ủng PRRSV Băc My type II,  ́ ̃ tương đồng  với chủng virus gây bệnh thể  độc lực cao  ở  Trung Quốc nên việc phòng bệnh khó  khăn, dịch cũng nguy hiểm hơn và cần phải có vacxin phù hợp.  Để   nâng   cao   hiệu   quả   phòng   chống   PRRS,   việc   nghiên   cứu   sản   xuất   các   loại   vaccine thế hệ mới có sự bảo hộ cao với các biến chủng mới của PRRSV hiện nay   là rất cần thiết.   Vaccine tiểu đơn vị  được sản xuất trong thực vật phòng PRRS là  hướng nghiên cứu đã được đánh giá là có nhiều triển vọng và  ưu điểm như   ổn định  và bền vững, đảm bảo hoạt tính sinh học, dễ dàng sản xuất với khối lượng lớn, chi   phí sản xuất thấp.  Protein   GP5   và   M   là   những   protein  c ấu  trúc   chính  của   virus   PRRS được lựa chọn là những ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine tiểu đơn vị  chống virus PRRS. Nhi ều h ệ th ống bi ểu hi ện GP5 và M của PRRSV đã đượ c thử  nghiệm.   Biểu   hiện   gen   tạm   th ời   ở   th ực   v ật   b ằng   ph ương   pháp   thẩm   lọc   nhờ  Agrobacterium  là phươ ng pháp để  sản xuất kháng nguyên có nhiều  ưu điểm đã  được   chứng   minh,   như:   Hàm  lượ ng   kháng  nguyên  cao,   có  thể   sản   xuất   với   số  lượ ng lớn, chi phí thấp, thực hiện đơn giản, thời gian nhanh, không bị   ảnh hưởng   bởi vị  trí gắn gen đích trong tế  bào thực vật và có thể  tiến hành biểu hiện trong   các mô đã biệt hóa hoàn toàn như  mô lá.  Với sự hiểu rõ về cấu trúc phân tử hệ gen   và tính kháng nguyên của virus  PRRS gây bệnh lợn tai xanh   và các thành tựu đạt  được về  biểu hiện, sản xuất vaccine tiểu đơn vị  trong thực vật phòng chống bệnh   virus là căn cứ để chúng tôi thực hiện đề tài luận án này. Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Chủng vi khuẩn Chủng Escherichia coli DH5α; A. tumefaciens C58C1; chủng A.  tumefaciens C58C1  mang vector pIBT­35S­2bCMV/  pIBT­35S­HC­Pro PVY.  2.1.2. Các vector và vật liệu thực vật, động vật  Vector nhân dòng pRTRA chứa đoạn promoter 35S và đoạn 100xELP ( pRTRA  35S­H5­Histag­Cmyc­100xELP) (Scheller và đồng tác giả, 2006; Hoang, 2012). Vector   pCB301­Kan (Xiang  et al.,  1999); Plasmid pGEM­PRRS (VN07196) mang gen  m và   gp5  phân lập từ  virus PRRS chủng Việt Nam; vector pBSK mang  đoạn gen  gp5opt  (gp5  optimize)  đã được tối  ưu mã di truyền. Cây thuốc lá  Nicotiana benthamiana;  Chuột bạch chủng BALB/C;   Lợn con 20 ngày tuổi;   tế  bào MARC ­145 và chủng   virus PRRS 07196.  2.1.3. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu Cặp mồi nhân gen  gp5opt  là  GP5­optimize­BamHI F  và  GP5­optimize­BamHI R;  cặp mồi nhân gen gp5ecto­m là GP5ecto­ NcoI­F và GP5ecto­ pspOMI­R, M­pspOMI­F  và M­BamHI­R; cặp mồi nhân gen  m  là M­BamHI­F và M­BamHI­R; cặp mồi giải  trình tự vector là 35S­SQF và 35S­Term.
  10. 2.1.4. Hóa chất Kit tách chiết plasmid, kit thôi gel và kit tinh sạch DNA (QIAGEN), thang DNA 1   ̣ Kb, thang protein (Fermentas), cac loai enzyme c ́ ắt giới hạn cua Fermentas. ̉   Các hoá  chất   Yeast   extract,   Agarose,   Trypton,   v.v.   các   loại   kháng   sinh   kanamycin,   rifamycine và các hóa chất thông dụng khác của các hãng Merck, Sigma,v.v.  Kháng  thể  kháng Cmyc, kháng thể  anti­mouse IgG cộng hợp HRP (Promega ­ USA), kháng  nguyên scFv (50 ng/µl), kháng thể  rabit anti­pig  IgG  cộng hợp  Peroxidase,  hóa chất  hiện màu TMB, DAB, kit hiện phim (Thermo Scientific), Protein (H5­pII)3 v.v. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Nhân dòng gen m, gp5opt và gp5ecto­m và ghép nối vào vector pRTRA Đoạn gen m và gp5ecto­m được nhân dòng bằng PCR sử  dụng khuôn là plasmid  pGEM­PRRS (VN07196) và đoạn gen  gp5opt được nhân dòng từ  khuôn là plasmid  pBSK mang gen gp5opt với các mồi đặc hiệu tương ứng. Thành phần phản ứng PCR   bao gồm 0,3 μM primer, 0,2 μM dNTPs, 2,5U Pwo SuperYield DNA polymerase, 5 μl   đệm 10X Pwo SuperYield PC, 20 ng DNA khuôn trong tổng số  50 µl hỗn hợp. Chu  ̣ trình nhiêt nh ư  sau: 940C/ 3 phút; 32 chu kỳ với 940C/ 30 giây, 550C/ 50 giây, 720C/ 1  phút; tiếp đó là 720C/ 10 phút và sản phẩm được giữ   ở  40C. Sản phẩm PCR được  điện di trên gel agarose 0,8%, sau đó được tinh sạch và xử lý với enzyme cắt giới hạn   đã được thiết kế để ghép nối vào plasmid pRTRA 35S­Histag­Cmyc­100xELP và biến  nạp vào E. coli  theo phương pháp sốc nhiệt của Sambrook và đtg (2012).  Khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp được chọn lọc trên môi trường LB đặc bổ sung  kháng sinh 50 mg/l  kanamycin. Vector tái tổ  hợp được tách chiết từ  các khuẩn lạc   dương tính (Colony­PCR) được giải trình tự và phân tích kiểm tra tính chính xác bằng  phần mềm BioEdit 7.0 và Lasergen 7 (DNAstarinc, Madison, WI, USA). 2.2.2. Thiết kế cấu trúc vector pCB301 mang gen m/ gp5opt/ gp5ecto­m  Vector nhân dòng pRTRA tái tổ  hợp mang gen m, gp5opt và gp5ecto­m và vector  pCB301   cùng   được   phân   cắt   bằng   enzyme  HindIII.   Các   sản   phẩm   cắt   từ   vector  pRTRA  bao gồm  35S­m­Histag­Cmyc­100xELP;  35S­gp5opt­Histag­Cmyc­100xELP;  35S­gp5ecto­m­Histag­Cmyc­100xELP và được ghép nối vào vector pCB301 sử dụng   T4 DNA ligase và được biến nạp vào tế  bào  E. coli  DH5α  khả  biến bằng phương  pháp sốc nhiệt (Sambrook et al., 2012). Việc chọn các dòng khuẩn lạc mang vector tái  tổ  hợp được thực hiện trên môi trường LB đặc có chứa 50 mg/l kanamycin và bằng  phản ứng Colony­PCR. Các vector tái tổ hợp  pCB301 mang gen  m/ gp5opt/gp5ecto­m,  được tách chiết từ các dòng khuẩn lạc dương tính và kiểm tra bằng phản ứng cắt với  enzyme giới hạn HindIII và NcoI. Các vector chuyển gen sau đó được biến nạp vào  chủng A. tumefaciens C58C1 bằng phương pháp xung điện.  Tách chiết và tinh sạch plasmid: Plasmid được tách chiết theo phương pháp của  Sambrook và cộng sự  (2012).  Sử  dụng bộ  Kit do hãng Fermentas cung cấp để  tinh  sạch plasmid. Phương pháp xử lý DNA bằng enzyme cắt giới hạn:  Thành phần phản  ứng cắt được thực hiện theo sự hướng dẫn của  hãng sản xuất bộ Kit sử dụng enzyme. 2.2.3. Biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp trong lá thuốc lá 
  11. 2.2.3.1. Chuẩn bị dịch khuẩn Chủng  A.  tumefaciens  mang vector pCB301 35S­m­Histag­Cmyc­100xELP hoặc  pCB301   35S­gp5opt­Histag­Cmyc­100xELP   hoặc   pCB301   35S­gp5ecto­m­Histag­ Cmyc­100xELP và chủng A.  tumefaciens C58C1 mang vector pIBT­35S­2bCMV hoặc  vector  pIBT­35S­HC­Pro PVY  được nuôi trong môi trường YEB có bổ  sung kháng  sinh, nuôi lắc 200 v/ph, 12­18h  ở 280C cho đến khi mật độ  vi khuẩn OD600 đạt 0,5 ­  1,0.  Vi khuẩn được thu nhận sau khi ly tâm dịch nuôi  ở  tốc độ  5.000 v/ph trong 15   phút. Cặn khuẩn của 2 chủng được hòa tan trong đệm MES tới OD600  = 0,5 để  dùng  cho biến nạp. Dịch khuẩn có thể  dùng riêng rẽ  hay trộn với nhau theo tỷ lệ 1:1, tùy   theo mục đích của thí nghiệm.  2.2.3.2. Phương pháp biến nạp gen đích vào lá cây thuốc lá  Quá trình biến nạp được tiến hành với cây thuốc lá trồng từ 3 ­ 8 tuần. Cây được  úp ngược và nhấn chìm toàn bộ phần lá vào bình chứa dịch khuẩn đã được chuẩn bị ở  trên, tiếp theo chuyển hệ  thống này vào bình hút chân không. Áp suất bình hút chân   không được chỉnh tới tới 27 inches Hg, hút trong 1,5 phút, sau đó giảm áp suất bình về  áp suất không khí và mở nắp. Các cây thuốc lá sau khi biến nạp được tiếp tục nuôi và  chăm sóc trong buồng sinh trưởng.    2.2.4. Đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện biểu hiện gen tạm thời đến mức độ  biểu hiện protein tái tổ hợp trong lá cây thuốc lá 2.2.4.1. Đánh giá ảnh hưởng của vector hỗ trợ biểu hiện gen  Để đánh giá ảnh hưởng của vector hỗ trợ đến mức độ  biểu hiện của các gen m,  gp5opt và gp5ecto­m trong lá thuốc lá, dịch A. tumefaciens mang vector pCB301 chứa  gen m/ gp5opt/ gp5ecto­m được lây nhiễm vào lá hoặc dịch vi khuẩn này kết hợp với  dịch  A. tumefaciens  mang  vector hỗ  trợ  pIBT­35S­2bCMV/  pIBT­35S­HC­Pro PVY,  với lệ dịch (1:1) (xâm nhiễm kép). Mẫu lá được thu sau 3, 4, 5, 6 ngày sau biến nạp,   tách chiết protein tổng số  để  đánh giá mức độ  biểu hiện của gen chuyển. Mức độ  biểu hiện gen chuyển được đánh giá bằng phương pháp lai Western blot sử  dụng   kháng thể kháng Cmyc. 2.2.4.2. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ acetosyringone Thí nghiệm được bố trí với dịch A. tumefaciens mang vector chuyển gen mục tiêu  và A. tumefaciens chứa vector pIBT­35S­HC­Pro PVY, không được bổ sung AS và bổ  sung AS với nồng độ 450 µM và 600 µM.  2.2.4.3. Đánh giá ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn dùng cho biến nạp Thí nghiệm đánh giá mật độ khuẩn được tiến hành với với dịch khuẩn có giá trị OD600  từ    0,2; 0,5; 1,0 (gồm chủng   A. tumefaciens  mang vector chuyển gen mục tiêu và  chủng A. tumefaciens mang vector hỗ trợ pIBT­35S­HC­Pro PVY, lượng dịch 2 lít với   tỷ lệ 1:1) và bổ sung AS ở nồng độ 450 µM).  2.2.4.4. Đánh giá ảnh hưởng của tuổi của lá được xâm nhiễm Thí nghiệm: Lá non gồm các lá thứ 1, 2, 3  từ ngọn xuống; lá bánh tẻ gồm những   lá tại vị trí chính giữa của thân cây; lá già gồm những lá 1, 2, 3 từ gốc lên. 
  12. 2.2.4.5. Đánh giá ảnh hưởng của tuổi cây Cây thuốc lá 3, 4, 5, 6, 7 và 8 tuần tuổi ; các lá non và lá bánh tẻ được cho xâm  nhiễm với dịch khuẩn (gồm chủng A. tumefaciens mang vector chuyển gen mục tiêu  và chủng A. tumefaciens mang vector pIBT­35S­HC­Pro PVY, OD600 = 0,5) với nồng  độ AS 450 µM.  2.2.5. Tách chiết và xác định nồng độ protein tổng số   Protein tổng số  từ  mẫu lá được tách chiết bằng dịch chiết PBS  và bảo quản  ở  ­20 C. Hàm lượng protein tổng số  được đo  ở  bước sóng 595 nm theo phương pháp  o của Bradford (1976) với đường chuẩn được xây dựng dựa vào protein BSA chuẩn đã  biết trước nồng độ. 2.2.6. Điện di SDS­PAGE và lai Western blot Protein hòa tan tổng số  được phân tách trên gel polyacrylamide (10%) theo phương   pháp của Laemmli (1970).  Sau khi điện di protein tổng s ố  trên gel SDS­PAGE, sau đó đượ c chuyển lên   màng nitrocellulose bằng máy chuyển màng  ở  25V, 1.3A trong 20 phút. Màng chứa   kháng nguyên đượ c  phủ  bằng  sữa   tách  bơ   5%  (pha  trong  dung  d ịch  PBS  0,05%   Tween) trong 5h; màng đượ c  ủ  với kháng thể  kháng Cmyc qua đêm; sau đó, màng  được  ủ  với kháng thể  2 anti­mouse IgG có gắn HRP (đối với mẫu huyết thanh  chuột) hoặc anti­pig IgG g ắn peroxidase (đối với các mẫu huyết thanh lợn). Phát  hiện sự  có mặt của kháng nguyên tái tổ  hợp bằng cách ngâm màng lai trong dung  dịch hiện màu có chứa cơ chất DAB trong 15 phút (Phan, 2012).  2.2.7. Tinh sạch protein M, GP5 và GP5ectoM  2.2.7. 1. Tối ưu nồng độ PEG trong quá trình thu nhận protein đích Thí nghiệm: PEG 8000 được bổ  sung  ở  dải nồng độ  (2% ­ 10%) vào 2 ml dịch   chiết lá thực vật chuyển gen. Dịch chiết lá sau đó được ly tâm ở 13.000 v/p, trong 30   phút,  ở  4oC. Protein dịch được biến tính và kiểm tra mức độ  thu nhận protein đích  bằng lai Western blot.  2.2.7.2. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng phương pháp mITC  Protein tái tổ  hợp gắn ELP được tinh sạch bằng phương pháp mITC theo phương  pháp của Phan, 2012. 2.2.7.2. Phương pháp tính hiệu suất thu hồi protein tinh sạch Tính hiệu suất thu hồi protein tinh sạch dựa sử dụng protein chuẩn (ScFv­cmyc)   đã biết trước hàm lượng và đo bằng phương pháp Bradford. 2.2.8. Phương pháp đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên tái tổ hợp trên   động vật  thí nghiệm 2.2.8.1. Gây miễn dịch trên chuột Kháng nguyên tái tổ hợp sau khi tinh sạch được sử dụng để gây miễn dịch trên chuột  bạch 6 tuần tuổi với hàm lượng 5 µg/con chuột. Kháng nguyên được trộn đều, đồng nhất  với chất bổ  trợ  với tỷ  lệ  1:1 . Chuột được chia làm 5 nhóm. Nhóm 1: Tiêm vaccine  PRRS nhược độc (đối chứng dương); nhóm 2: Tiêm PBS (đối chứng âm), nhóm 3:  Tiêm kháng nguyên M­ELP; nhóm 4: Tiêm kháng nguyên GP5­ELP; nhóm 5: Tiêm  kháng nguyên GP5ectoM­ELP. Nhóm 1 được tiêm vaccine PRRS nhược độc chủng  
  13. Hanvet 1.VN một lần duy nhất. Các nhóm 2, 3, 4, 5 được tiêm nhắc lại 3 lần. Mẫu   máu được lấy để chiết huyết thanh tại ba thời điểm: Ngày 0 (Trước khi tiêm), 21 và   35.  Phân tích huyết thanh chuột sau 2 lần tiêm và sau 3 lần tiêm bằng ELISA và  Western blot.  2.2.8.2. Gây miễn dịch trên lợn Lợn con 3 tuần tuổi khỏe mạnh, âm tính với kháng thể  kháng PRRSV được chia   thành bốn nhóm, mỗi nhóm 3 con lợn. Nhóm 1: Tiêm vaccine PRRS nhược độc chủng   Hanvet 1.VN; nhóm 2: Tiêm dịch chiết lá thuốc lá không chuyển gen (WT); nhóm 3:  Tiêm dịch chiết thô chứa protein GP5­ELP (150 µg/ml); nhóm 4: Tiêm dịch chiết thô  chứa protein GP5ectoM­ELP (150 µg/ml).  Nhóm 1 được tiêm vaccine  PRRS nhược  độc một lần duy nhất. Các nhóm 2, 3 và 4 được tiêm nhắc lại 3 lần: ngày 0, 14 và 28. 2.2.8.3. Xác định kháng thể kháng GP5­ELP và GP5ectoM­ELP trong huyết thanh lợn Mẫu máu của lợn được lấy để  chiết huyết thanh tại bốn thời điểm: Ngày 0, 14,  28, 35 và 49. Các huyết thanh chiết từ các mẫu máu của lợn thí nghiệm được sử dụng   với vai trò là kháng thể  1 cho việc xác định kháng thể  IgG đặc hiệu bằng ELISA,  Western blot và phản  ứng IPMA. Tất cả  các huyết thanh lợn đã được pha loãng 20   lần. Khả  năng sản sinh kháng thể  IgG đặc hiệu của từng loại kháng nguyên tương   ứng được tính toán sau lần tiêm thứ 2 và thứ 3. Phương   pháp   ELISA:  Để   kiểm   tra   các   kháng   thể   có   mặt   trong   huyết   thanh   chuột/lợn, sử dụng các phiến ELISA giám sát dịch tễ  huyết thanh học của PRRS đã   được gắn sẵn các kháng nguyên của PRRSV tự  nhiên. Tiếp theo đĩa được phủ  với   huyết thanh (đã được pha loãng 100 lần), trong 2 giờ; rửa đĩa  5 lần với PBS 1X; phủ  đĩa với kháng thể anti­mouse IgG có gắn HRP (kháng thể 2) với độ pha loãng 500 lần,   trong 2 giờ; rửa lại bằng dung dịch PBS  1X 5 lần. Đĩa được hiện màu trong dung dịch  hiện màu có chứa cơ  chất TMB, 15 phút, sản phẩm phản  ứng cho màu xanh, sau đó  cố định màu bằng HCl 1N, màu của phản ứng được đo ở bước sóng 450 nm. Phương pháp Western blot: Phản ứng lai Western được thực hiện như mục 2.2.6.2  với thay đổi kháng thể thứ  nhất được dùng trong trường hợp này là kháng thể  trong   huyết thanh của chuột/lợn.  Lai miễn dịch chéo: Phản  ứng Western blot được thực hiện với kháng nguyên tái  tổ hợp; kháng thể sơ cấp là kháng huyết thanh của nhóm chuột/lợn được tiêm vaccine   PRRS nhược độc chủng Hanvet 1.VN; kháng thể thứ cấp là anti­mouse IgG gắn HRP   (Đối với huyết thanh chuột)/ anti­pig IgG gắn peroxidase (Đối với huyết thanh lợn).   Phương pháp miễn dịch có gắn enzyme trên thảm tế  bào một lớp (IPMA):   Phương pháp thực hiện theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400­21:2014 về Bệnh động   vật. Xử  lý và phân tích thống kê kết quả  thực nghiệm : Phân tích thống kê được thực  hiện trên chương trình Ecxel sử  dụng phương pháp Student’ t­test p ≤ 0,05 là có ý  nghĩa thống kê. 2.3. Địa điểm nghiên cứu:  Phòng Công nghệ  Tế  bào thực vật, Phòng thí nghiệm   trọng điểm Công nghệ gen, Phòng thử nghiệm sinh học ­ Viện Công nghệ sinh học và   Trung tâm chẩn đoán thú y TƯ.  Chương 3
  14. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thiết kế  vector chuyển gen thực vật mang gen   m,  gp5, gp5ecto­m  và tạo  chủng Agrobacterium mang vector  3.1.1. Vector pCB301 mang gen mã hoá kháng nguyên M dung hợp Elastin like  ­polypeptide (M­ELP) 3.1.1.1. Tạo vector pRTRA 35S­m­Histag­Cmyc­100xELP Gen m (528 bp) được khuếch bằng PCR và ghép nối thành công vào vector pRTRA  tạo thành vector tái tổ hợp pRTRA 35S­ m­Histag­Cmyc­100xELP; sau đó vector được  biến nạp tế bào E. coli. Kết quả đã được kiểm tra bằng kỹ thuật colony­PCR và bằng  cắt   enzyme   giới   hạn   (Hình   3.1).  Vector   pRTRA   35S­m­Histag­Cmyc­100xELP   và  vector chuyển gen pCB301 được xử  lý bằng cùng  HindIII; sản phẩm thu được là:  Đoạn DNA gồm cấu trúc 35S­m­Histag­Cmyc­100xELP có kích thước khoảng 3,0 kb  và khung vector pCB301 mở vòng có kích thước khoảng 5,5 kb. Hình 3.1. Tao vector tách dòng pRTRA 35S­m­Histag­Cmyc­100xELP. (A): Sản phẩm  PCR nhân gen  m; (B): Sản phẩm colony­PCR chọn dòng vi khuẩn; (C): Sản phẩm  cắt pRTRA tái tổ  hợp bằng BamHI.3.1.1.2. Thiết kế  vector pCB301 35S­ m­Histag­ Cmyc­100xELP  Khung vector pCB301 được ghép nối với cấu trúc cassette 35S­ m­Histag­Cmyc­ 100xELP   tạo   vector   chuyển   gen   pCB301   35S­m­Histag­Cmyc­100xELP.   Kết   quả  kiểm tra bằng kỹ  thuật colony­PCR và bằng cắt enzyme giới hạn (3.2) cho thấy đã   thiết kế  thành công vector pCB301 mang cassette 35S­m­Histag­Cmyc­100xELP đảo  chiều   với   cassete   gen   chọn   lọc   (Nos   pro­ nptIII­Nos   ter).  Vector   chuyển   gen   có  cassette đảo chiều này được dùng để  biến nạp vào  A. tumefacines phục vụ  cho thí  nghiệm biểu hiện tạm thời. Hình 3.2. Kết quả thiết kế vector pCB301 35S­m­Histag­Cmyc­100xELP . (A): Vector  chuyển gen pCB301 tái tổ hợp được cắt bằng HindIII; (B): Vector pCB301 tái tổ hợp  cắt   bằng  NcoI;   (C):   Sơ   đồ   vector  pCB301   mang  cassette  35S­m­Histag­Cmyc­ 100xELP đảo chiều với cassete Nos pro­nptIII­Nos ter. 
  15. Vector   chuyển   gen   pCB301   35S­m­Histag­Cmyc­100xELP   được   biến   nạp   vào  chủng A. tumefaciens C58C1. Kết quả đã tạo thành công chủng A. tumefaciens C58C1  mang vector chuyển gen pCB301 35S­m­Histag­Cmyc­100xELP.  3.1.2. Vector chuyển gen mã hoá kháng nguyên GP5­ELP 3.1.2.1. Tạo vector pRTRA 35S­gp5opt­Histag­Cmyc­100xELP Gen gp5opt (510 bp) được khuếch đại bằng PCR và ghép nối vào vector  pRTRA;  sau đó vector được biến nạp tế bào E. coli.  Hình 3.3. Thiết kế  vector tách dòng pRTRA 35S­gp5opt­Histag­Cmyc­100xELP. (A):  PCR nhân gen gp5opt; (B): Sản phẩm colony­PCR chọn dòng vi khuẩn mang pRTRA   tái tổ hợp; (C): Sản phẩm cắt pRTRA tái tổ hợp bằng BamHI.  Kết quả được kiểm tra bằng kỹ thuật colony­PCR và bằng cắt enzyme giới hạn cho   thấy đã tạo thành công pRTRA 35S­gp5opt­Histag­Cmyc­100xELP (Hình 3.3). 3.1.2.2. Thiết kế vector pCB301 35S­gp5opt­Histag­Cmyc­100xELP Kết quả  đã thiết kế  thành công  vector  pCB301có  cassette gen 35S­gp5opt­Histag­ Cmyc­100xELP đảo chiều so với cassette gen NOS pro­nptIII­NOS ter (Hình 3.4). Hình   3.4.  Kết   quả   thiết   kế   vector   chuyển   gen   pCB301   35S­gp5opt­Histag­Cmyc­ 100xELP.  (A): Vector chuyển gen pCB301 tái tổ  hợp được cắt bằng  HindIII;  (B):  Vector pCB301 tái tổ  hợp cắt bằng  NcoI; (C): Sơ  đồ  vector  pCB301 mang  cassette  35S­gp5opt­Histag­Cmyc­100xELP đảo chiều.  Đã tạo được chủng  A. tumefaciens  C58C1 mang  vector pCB301  35S­gp5opt­ Histag­Cmyc­100xELP. Kết quả được kiểm tra bằng kỹ thuật Colony – PCR. 3.1.3. Vector chuyển gen mã hoá hỗn hợp kháng nguyên GP5ectoM­ELP 3.1.3.1. Tạo vector pRTRA 35S­ gp5ecto­m­Histag­Cmyc­100xELP Đoạn gen gp5ecto (192 bp) mã hóa cho một đoạn protein GP5 vùng ngoại bào  (GP5 ectodomain) và gen  m  (528 bp)  mã hóa protein M đượ c khuếch đại đơn lẻ  bằng phản  ứng PCR v ới c ặp m ồi đặc hiệu tươ ng  ứng. Sản phẩm PCR nhân gen  
  16. gp5ecto đượ c cắt bằng  NcoI và  pspOMI; sản phẩm PCR nhân gen   m  đượ c cắt  bằng  pspOMI   và  BamHI   và   đồng   thời   cắt   vector   pRTRA   35S­Histag­Cmyc­ 100xELP bằng NcoI và BamHI; sau đó, ghép nối 3 sản phẩm cắt này với nhau đã   tạo  được   vector  tái  tổ   hợp   pRTRA 35S­gp5ecto­m­Histag­Cmyc­100xELP (Hình  3.5).  Hình 3.5. Thiết kế vector nhân dòng pRTRA 35S­gp5ecto­m­Histag­Cmyc­100xELP. 3.1.3.2. Thiết kế vector chuyển gen pCB301 35S­gp5ecto­m ­Histag­Cmyc­100xELP Kết   quả   cắt   vector   pRTRA­35S­gp5ecto­m­Histag­Cmyc­100xELP   và   vector  pCB301  bằng  HindIII,   sau   đó   ghép   nối  cassette  35S­gp5ecto­m­Histag­Cmyc­ 100xELP  với  khung vector pCB301 mở   vòng đã  tạo  được   vector     pCB301 mang  cassette 35S­gp5ecto­m­Histag­Cmyc­100xELP đảo chiều so với cassett e gen kháng  kháng sinh (NOS pro­nptIII­NOS ter) (Hình 3.6). Đã tạo được chủng A. tumefaciens  C58C1 mang  vector pCB301  35S­gp5ecto­m­Histag­Cmyc­100xELP. Kết quả  được  kiểm tra bằng kỹ thuật Colony – PCR. Hình 3.6. Kết quả phân tích kiểm tra vector pCB301 mang gen gp5ecto­m mã hóa   kháng nguyên GP5ecto­M dung hợp ELP. 3.2. Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M, GP5,   GP5ectoM dung hợp ELP trong cây thuốc lá  3.2.1. Anh h ̉ ưởng của vector hỗ trợ đến sự  biểu hiện tạm thời các gen mã hoá   các kháng nguyên M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP  Kết quả cho thấy, vector hỗ trợ pIBT­35S­HC­Pro PVY mang gen mã hóa protein  Hc­Pro   PVY   hỗ   trợ   tăng   cường   biểu   hiện   kháng   nguyên   M­ELP,   GP5­ELP   và  GP5ecto­M tốt hơn so vector hỗ  trợ pIBT­35S­2bCMV mang gen mã hóa protein 2b  CMV (Hình 3.7). Vì vậy, Hc­Pro PVY được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
  17. Hình 3.7. Ảnh hưởng của vector hỗ trợ pIBT­35S­2bCMV và pIBT­35S­HC­Pro PVY  đến mức độ biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp thông qua kế quả lai Western sử dụng   kháng thể kháng Cmyc. 3.2.2. Anh h ̉ ưởng của nồng độ AS đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các   kháng nguyên M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP Thí nghiệm với 2 nồng độ  AS là 450 µM và 600 µM; kết quả  cho thấy sử dụng   nồng độ AS 450 µM là phù hợp nhất cho biểu hiện tạm thời của các gen mã hoá các  protein tái tổ hợp ở lá thuốc lá (Hình 3.8). Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến sự biểu hiện của các gen mã hóa các   protein tái tổ hợp được xác định bằng lai Western blot sử dụng kháng thể kháng   Cmyc. 3.2.3. Anh h ̉ ưởng của mật độ  vi khuẩn đến sự  biểu hiện tạm thời các gen mã   hoá các protein tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP Hình 3.9. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn (OD600) đến sự biểu hiện tạm thời của các   gen mã hoá các kháng nguyên M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP được xác định bằng   lai Western.
  18. Thí nghiệm biến nạp được tiến hành với dịch khuẩn có các giá trị OD600 là 0,2; 0,5  và 1,0. Kết quả thu được cho thấy mật độ vi khuẩn với giá trị OD600 = 0,5 là phù hợp  nhất cho biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các protein tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP   và GP5ectoM­ELPở lá thuốc lá (Hình 3.9). 3.2.4. Anh h ̉ ưởng của tuổi sinh lý của lá đến sự  biểu hiện tạm thời các gen mã   hoá các protein tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP Kết quả thu được cho thấy tuổi sinh lý của lá ảnh hưởng rõ rệt đến hiểu quả biểu hiện   gen tạm thời. Lá non và lá bánh tẻ là thích hợp nhất cho biểu hiện của các gen mã hóa các  kháng nguyên M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP tái tổ hợp.  Hình 3.10. Ảnh hưởng của tuổi sinh lý của lá đến biểu hiện tạm thời các gen mã   hoá cho các protein tái tổ hợp được xác định bằng lai Western blot. 3.2.5. Anh h ̉ ưởng của tuổi cây đến  sự  biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các   protein tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP Kết quả thu được cho thấy, cây thuốc lá ở 4 ­ 6 tuần tuổi là thích hợp để sử dụng   cho biểu hiện tạm thời các gen mã hóa các kháng nguyên nghiên cứu. Hình 3.11. Ảnh hưởng của tuổi cây đến sự biểu hiện tạm thời  các gen mã hóa các  protein tái tổ hợp đượ c xác định bằng lai Western blot. 3.2.6. So sánh mức độ  biểu hiện các gen mã hoá các protein tái tổ  hợp (M­ELP,   GP5­ELP, GP5ectoM­ELP) trong điều kiện đã được tối ưu
  19. Hình 3.12. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các kháng   nguyên tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP bằng lai miễn dịch dựa vào   protein chuẩn đã được định lượng H5­pII. Kết quả  phân tích cho thấy mức độ  biểu hiện của các protein tái tổ  hợp M­ELP,   GP5­ELP và GP5ectoM­ELP, tương  ứng là 0,75%; 0,48% và 0,95 % protein hòa tan  tổng số, tương ứng là 52,4 mg/kg; 35 mg/kg và 66,8 mg/kg lá tươi (Hình 3.12). 3.3. Tinh sạch protein tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP 3.3.1. Tối ưu nồng độ PEG 8000 cho quá trình tinh sạch   Nồng độ  6% PEG 8000 bổ  sung vào dịch chiết thực vật trong quá trình tinh sạch   kháng nguyên M­ELP là tốt nhất (Hình 3.13).  Hình 3.13. Kết quả tối ưu nồng độ PEG 8000 cho tinh sạch kháng nguyên M­ELP. Kết quả  cho thấy, nồng độ  8% PEG 8000 bổ  sung vào dịch chiết thực vật trong quá   trình tinh sạch kháng nguyên GP5­ELP là tốt nhất (Hình 3.14).  Hình 3.14. Kết   quả tối ưu nồng   độ PEG 8000 cho  tinh sạch kháng nguyên GP5­ELP. Nồng độ  8% PEG 8000 bổ  sung vào dịch chiết thực vật trong quá trình tinh sạch  kháng nguyên GP5ectoM­ELP là tốt nhất (Hình 3.15).  Hình 3.15. Kết quả tối ưu nồng độ PEG8000 cho tinh sạch kháng nguyên GP5ectoM­ ELP. 3.3.2.   Tinh   sạch   protein   tái  tổ   hợp   M­ELP,   GP5­ELP   và   GP5ectoM­ELP  bằng   phương pháp mITC 3.3.2.1. Tinh sạch protein M­ELP
  20. Hình 3.16. Đánh giá sự  tinh sạch của protein M­ELP bằng SDS­PAGE và lai miễn   dịch. A, B: 1: Dịch chiết thô trước xử  lý; 2: Dịch chảy qua màng; 3: Protein M­ELP   tách rửa khỏi màng; (C): Protein M­ELP thu nhận được sau khi tinh sạch.  Kết quả thu được cho thấy, đã tinh sạch thành công protein M­ELP tái tổ hợp (66  kDa) bằng phương pháp mITC có độ tinh sạch cao (Hình 3.16).  Định lượng protein thu nhận được bằng phương pháp đo Bradford, lai miễn dịch   và phần mềm Image J, cho thấy đã tinh sạch và thu nhận đúng protein M­ELP (hình  3.17) với hiệu suất thu hồi là 86,5%, mức độ tinh sạch là 82,1%. Hình 3.17. Định lượng protein tái tổ hợp M­ELP bằng lai miễn dịch. ScFV-Cmyc (đối chứng dương) được đưa vào giếng với các nồng độ 50, 100, 150, 200 ng/giếng. 3.4.2.2. Tinh sạch protein tái tổ hợp GP5­ELP  Kết quả thu được cho thấy, đã tinh sạch thành công protein GP5­ELP tái tổ hợp bằng  phương pháp mITC có độ  tinh sạch cao (Hình 3.18). Hiệu suất thu hồi protein GP5­ ELP là 98%, mức độ tinh sạch là 81,1%. Hình 3.18. Đánh giá sự tinh sạch của protein GP5­ELP bằng lai Western blot và điện   di SDS­PAGE. 1 2 3 4 5 6
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2