Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen mã hóa yếu tố IX ở bệnh nhân Hemophilia B

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

9
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học "Nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen mã hóa yếu tố IX ở bệnh nhân Hemophilia B" trình bày các nội dung chính sau: Lập bản đồ đột biến gen mã hóa yếu tố IX của bệnh nhân Hemophilia B; Khảo sát để xác định các đa hình nucleotide có tỷ lệ dị hợp tử cao làm cơ sở để chẩn đoán người mang gen bằng phương pháp phân tích liên kết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen mã hóa yếu tố IX ở bệnh nhân Hemophilia B

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- VŨ THỊ BÍCH HƯỜNG NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN VÀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN TRÊN GEN MÃ HÓA YẾU TỐ IX Ở BỆNH NHÂN HEMOPHILIA B Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 9 42 01 21 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2022
Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học 1: TS. Dương Quốc Chính Viện Huyết học – Truyền máu TW Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS. Đồng Văn Quyền Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: PGS.TS. Vũ Minh Phương Phản biện 2: PGS.TS. Lương Thị Lan Anh Phản biện 3: PGS.TS. Vũ Thị Thơm Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ …. , ngày … tháng … năm ….. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
1 MỞ ĐẦU Hemophilia B là rối loạn chảy máu do thiếu hụt yếu tố IX (FIX). Đây là bệnh lý khó điều trị, để lại hậu quả quả nghiêm trọng và đe dọa tính mạng của người bệnh. Cơ chế sinh bệnh hemophilia B là do các đột biến trên gen mã hóa yếu tố IX (F9) làm giảm hoặc mất chức năng tổng hợp FIX của gen, dẫn đến thiếu hụt yếu tố IX gây ra hiện tượng chảy máu kéo dài. Gen F9 là gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể X nên có tính chất di truyền qua các thế hệ. Do đó, chẩn đoán người mang gen bệnh là cách tiếp cận duy nhất để kiểm soát nguồn gen bệnh, hạn chế tỷ lệ mắc bệnh mới thông qua chẩn đoán trước sinh, chẩn đoán trước chuyển phôi. Đột biến và đa hình nằm trên gen F9 là công cụ chủ đạo để chẩn đoán người mang gen bệnh hemophialia B. Các biến đổi di truyền này có tính quần thể, do đó việc khảo sát để tìm ra các đột biến và đa hình đặc trưng cho quần thể có vai trò quan trọng nhằm thiết lập được bộ công cụ chẩn đoán hiệu quả và phù hợp. Trên thế giới, các nghiên cứu về đột biến và đa hình nucleotde trên gen F9 gen hemophilia đã được thực hiện từ rất lâu. Nhiều quốc gia đã công bố đặc điểm đột biến và các đa hình nucleotide có giá trị thông tin trong quần thể mình, góp phần hiệu quả trong chăm sóc, kiểm soát và quản lý bệnh hemophilia B. Tại Việt Nam, hiện chưa có nghiên cứu khảo sát tìm hiểu về các đa hình nucleotide trên gen F9 đặc trưng cho người Việt Nam. Nghiên cứu về đột biến gen F9 liên quan đến bệnh hemophilia B chưa nhiều, tính đại diện chưa cao và chưa nghiên cứu đầy đủ trên toàn bộ gen F9. Trong khi đó, tỷ lệ bệnh nhân mới gia tăng hàng năm. Chính vì vậy, nghiên cứu tổng quát trên toàn bộ gen F9 với cỡ mẫu lớn để thiết lập được bộ công cụ chẩn đoán đặc trưng và hiệu quả cho người Việt Nam là nhiệm vụ quan trọng nhằm góp phần kiểm soát nguồn gen bệnh. Với những lý do đó, nghiên cứu sinh thực hiện đề tài “Nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen mã hóa yếu tố IX ở bệnh nhân hemophilia B”. Mục tiêu nghiên cứu luận án: (1) Lập bản đồ đột biến gen mã hóa yếu tố IX của bệnh nhân hemophilia B (2) Xác định các đa hình nucleotide có tỷ lệ dị hợp tử cao làm cơ sở để chẩn đoán người mang gen bằng phương pháp phân tích liên kết. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án: (1) Xây dựng quy trình giải trình tự gen F9 trên hệ thống giải trình tự NGS. (2) Giải trình tự và lập bản đồ đột biến gen F9 ở 100 bệnh nhân. Khảo sát mối tương quan kiểu gen đột biến và tình trạng bệnh. (3) Giải trình tự gen F9 ở 100 người phụ nữ bình thường. Xác định tần suất và tỷ lệ dị hợp tử các đa hình nucleotide trên gen F9.
2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về bệnh hemophilia B 1.1.1. Một số dấu mốc về lịch sử phát hiện và nghiên cứu bệnh hemophilia B Thế kỷ thứ hai sau công nguyên đã có những ghi nhận đầu tiên về bệnh máu khó đông. Năm 1928, thuật ngữ “hemophilia” được đề cập lần đầu tiên. Năm 1952, Rosemary Biggs phát hiện ra bệnh hemophilia B. Năm 1982-1983, gen F9 được tách dòng. Năm 1985, trình tự gen F9 được công bố. Từ đây, phân tích di truyền chẩn đoán tình trạng mang gen hemophilia B đã được thực hiện. 1.1.2. Khái quát về bệnh hemophilia B 1.1.2.1. Đặc điểm của bệnh Người khỏe mạnh bình thường có nồng độ FIX hoạt tính dao động từ 50- 150%. Người bệnh hemophilia B là những người bị mất khả năng kiểm soát quá trình đông máu do nồng độ yếu tố IX hoạt tính giảm dưới 40%, 1.1.2.2. Cơ chế di truyền của bệnh Hemophilia B là di truyền gen lặn liên kết với NST X. Khoảng 70% bệnh là do nhiễm sắc thể X đột biến di truyền qua nhiều thế hệ trong gia đình, 30% do các đột biến mới xuất hiện trong chính đời sống của cá thể mang bệnh. 1.1.2.3. Phương pháp chẩn đoán và điều trị bệnh a) Chẩn đoán xác định bệnh Dựa trên xét nghiệm định lượng yếu tố IX kết hợp xem xét các đặc điểm lâm sàng và khai thác tiền sử gia đình. b) Chẩn đoán mức độ bệnh Bệnh mức độ nặng (FIX < 1%), mức độ trung bình (FIX từ 1-5%), mức độ nhẹ (FIX từ 5 - 40%). c) Điều trị bệnh Chủ yếu là truyền bổ sung yếu tố IX ngoại sinh. Phương pháp điều trị mới là liệu pháp gen đang được thử nghiệm lâm sàng. 1.2. Cấu trúc và chức năng của FIX trong quá trình đông máu 1.2.1. Các yếu tố đông máu Các chất tham gia vào quá trình đông máu bao gồm các protein huyết thanh, yếu tố mô (TF), ion Ca2+, phospholipid màng và các tế bào tiểu cầu. Các chất thúc đẩy quá trình đông máu là các yếu tố đông máu, trong đó có yếu tố IX. 1.2.2. Vai trò của yếu tố IX trong quá trình đông máu Yếu tố IX có vai trò chủ đạo trong việc hoạt hóa yếu tố X để trở thành yếu tố Xa - mục tiêu cuối cùng của con đường đông máu. 1.2.3. Cấu trúc yếu tố IX và quá trình hoạt hóa yếu tố IX Gen F9 có xấp xỉ 34 kb, bao gồm 8 exon và 7 intron. Phân tử yếu tố IX được tổng hợp trong gan, có trọng lượng phân tử 57.000 Da, gồm 5 domain: GLA, EGF1, EGF2, peptid hoạt hóa và domain xúc tác. 1.2.4. Mối tương tác giữa FIX với các nhân tố hoạt hóa Domain SP là vị trí liên kết giữa yếu tố IXa với yếu tố VIIIa. Domain EGF (EGF1, EGF2) có vai trò quyết định trong mối tương tác giữa yếu tố IXa và VIIIa.
3 Domain GLA có vai trò hỗ trợ phân tử này liên kết với bề mặt phospholipid của các tiểu cầu đã hoạt hóa. 1.3. Phân tích di truyền bệnh hemophilia B 1.3.1. Vai trò của phân tích di truyền trong bệnh hemophilia B Phân tích di truyền để chẩn đoán tình trạng mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh, chẩn đoán trước chuyển phôi cho những người phụ nữ trong các gia đình hemophilia B là phương pháp hữu hiệu và duy nhất để kiểm soát nguồn gen bệnh. 1.3.2. Đặc điểm đột biến trên gen F9 1.3.2.1.Biến đổi đơn nucleotide Đột biến liên quan đến thay thế một nucleotide là loại phổ biến nhất trong các đột biến gây bệnh hemophilia B, chiếm 64%, trong đó bao gồm đột biến sai nghĩa, đột biến vô nghĩa hoặc các đột biến ở vị trí tái sắp xếp exon tạo ARN thông tin. 1.3.2.2. Đột biến theo hiệu ứng sáng lập (founder effect) Hiện tượng một số đột biến xảy ra với tần suất cao trong những quần thể nhất định, mang tính đặc trưng quần thể. Nguyên nhân có thể do hiệu ứng đảo CpG hoặc kết hôn cận huyết. 1.3.2.3. Đột biến dẫn tới thể bệnh hemophilia B Leyden Đột biến xảy ra trong vùng điều hòa hoạt động của gen. Trước tuổi dậy thì bệnh nhân có tình trạng giảm nồng độ FIX. Từ tuổi dậy thì, nồng độ yếu tố IX tăng dần đến mức gần như bình thường. 1.3.2.4. Các mất đoạn, chèn đoạn nhỏ Lỗi do enzym ADN polymerase tạo ra các đột biến điểm, đột biến thêm hoặc mất một vài nucleotide. Các đột biến này thường xảy ra trong các trình tự lặp 2 nucleotide, đặc biệt ở nhũng vị trí có các trình tự lặp liền kề nhau. 1.3.2.5. Các bất thường di truyền lớn Chiếm từ 3-5% số đột biến trong bệnh hemophilia B. Đó là các sắp xếp lại gen, mất đoạn gen lớn (mất một exon hoặc nhiều exon, thậm chí mất toàn bộ gen F9 1.3.3. Đặc điểm các đa hình nucleotide liên kết với gen F9 1.3.3.1. Khái quát về đa hình nucleotide Là những biến đổi nucleotide (SNP hoặc VNTR) có thể làm thay đổi hoặc không làm thay đổi bộ ba mã hóa nhưng không làm thay đổi cấu trúc, chức năng của gen và không phải đột biến nhưng có giá trị trong chẩn đoán bệnh. Đa hình có thông tin và đa hình không có thông tin Đa hình có thông tin là đa hình có 2 alen khác nhau (dị hợp tử) ở locus đa hình. Đa hình có 2 alen giống hệt nhau (đồng hợp tử) ở locus đa hình là đa hình không có thông tin, không có giá trị trong phân tích liên kết. Chỉ thị nội gen và ngoại gen Đa hình liên kết trên NST X và nằm trong gen F9 được gọi là chỉ thị nội gen. Đa hình nằm ngoài gen F9 được gọi là chỉ thị ngoại gen. Các chỉ thị đa hình
4 nội gen được khuyến cáo sử dụng trong chẩn đoán người mang gen bằng phương khi phân tích liên kết. Đa hình cân bằng liên kết (linkage equilibrium) và đa hình mất cân bằng liên kết (linkage disequilibrium) Hai đa hình luôn di truyền cùng nhau được gọi là mất cân bằng liên kết hoàn toàn.. Hai đa hình di truyền độc lập nhau được gọi là cân bằng liên kết. Sử dụng các đa hình cân bằng liên kết sẽ tăng hiệu quả chẩn đoán. 1.3.3.2. Đặc điểm đa hình trên gen F9 Gen F9 chứa chủ yếu đa hình đơn nucleotide, mới có hai đa hình lặp lại (RY)n ở intron 1 và exon 8 được phát hiện. Tần suất alen đa hình khác biệt theo quần thể người, những khác biệt này cần được nghiên cứu chi tiết để áp dụng phân tích liên kết một cách hiệu quả 1.3.3.3. Tần suất và tỷ lệ dị hợp tử của các đa hình Tần suất xuất hiện của mỗi alen đa hình ít khi có sự cân bằng mà thường sẽ có một alen chiếm ưu thế hơn alen còn lại. Các dữ liệu về tần suất alen sẽ cho phép tính toán các chỉ số đa hình di truyền như tỷ lệ dị hợp tử theo lý thuyết. 1.4. Các kỹ thuật phân tích di truyền trong bệnh hemophilia B 1.4.1. Kỹ thuật phân tích đột biến 1.4.1.1. Kỹ thuật lai Southern blot Là kỹ thuật đầu tiên được sử dụng trong phân tích đột biến gây bệnh hemophilia B. Tuy nhiên, do thao tác phức tạp, tốn nhiều thời gian, sử dụng các hóa chất độc hại nên hiện nay kỹ thuật này không được sử dụng nhiều. 1.4.1.2. Kỹ thuật phân tích dị sợi kép (heteroduplex) Sàng lọc đột biến dựa trên phân tích dị sợi kép được thực hiện để khu trú các vùng gen nghi ngờ xảy ra đột biến. Sau đó các vùng gen này được giải trình tự để xác định các biến đổi di truyền. 1.4.1.3. Kỹ thuật giải trình tự gen theo phương pháp Sanger Tập trung giải trình tự các exon, các vùng nối intron-exon, vùng 5’UTR và vùng 3’UTR của gen F9. Quy trình này đã được chuẩn hóa và áp dụng thường quy ở nhiều phòng xét nghiệm trên thế giới. 1.4.1.4. Kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) Là chiến lược mới trong phân tích đột biến gen hemophilia B. Kỹ thuật NGS có thể giải trình tự toàn bộ gen F9 bao gồm tất cả cả các exon và intron, vô cùng hữu ích cho mục tiêu phân tích đột biến gen và tìm kiếm các đa hình có giá trị thông tin trong quần thể 1.4.1.5. Kỹ thuật phát hiện các mất đoạn lớn Kỹ thuật MLPA được sử dụng để phát hiện các đột biến mất đoạn gen lớn, mất một phần exon, mất một vài exon hoặc mất toàn bộ gen F9. 1.4.2. Kỹ thuật phân tích liên kết Dựa vào các đa hình nucleotide nằm trong gen F9 để lần theo dấu vết của các alen đột biến trong các gia đình người bệnh. Phương pháp này không xác
5 định được cụ thể đột biến gây bệnh nhưng gián tiếp chẩn đoán được tình trạng mang gen bệnh. 1.5. Tình hình nghiên cứu về các biến đổi di truyền trên gen F9 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Hai cách tiếp cận chủ yếu để phân tích di truyền trong bệnh hemopilia B hiện nay là phân tích trực tiếp đột biến gen và phân tích gián tiếp thông qua các đa hình liên kết với gen F9. Các nghiên cứu về đột biến gây bệnh hemophilia B và đặc điểm các đa hình liên kết với gen F9 được triển khai mạnh mẽ. Nhiều quốc gia đã công bố đặc điểm đột biến và đa hình nucleotide ở các quần thể của nước mình. 1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Thống kê của Trung tâm hemophilia, Viện Huyết học – Truyền máu TW cho thấy mỗi năm có hàng trăm ca bệnh mới, số lượng người mang gen chưa thể kiểm soát được. Công tác chẩn đoán, quản lý và điều trị cho bệnh nhân còn gặp rất nhiều khó khăn, thiếu thốn về chế phẩm điều trị, chất lượng cuộc sống bệnh nhân giảm, tỷ lệ tàn tật cao do đó công tác phòng bệnh càng trở nên vô cùng quan trọng. Tuy nhiên, hiện nay ở nước ta chưa có một nghiên cứu nào về đa hình nucleotide trên gen F9, phân tích đột biến gen mới chỉ được thực hiện trong một vài nghiên cứu nhỏ, chính vì vậy chưa có đầy đủ cơ sở dữ liệu về các biến đổi di truyền ở người bệnh để phục vụ cho công tác tư vấn, chẩn đoán trước sinh, chẩn đoán trước chuyển phôi cho các thành viên trong gia đình để thực hiện mục tiêu phòng bệnh.
6 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Mẫu bệnh nhân: 100 bệnh nhân hemophilia B được chẩn đoán và điều trị tại Viện Huyết học –Truyền máu TW (ký hiệu mẫu: HB01-HB100) (phục vụ mục tiêu 1: Lập bản đồ đột biến gen F9). 2.1.2. Mẫu người khỏe mạnh: 100 phụ nữ khỏe mạnh tham gia hiến máu tại Viện Huyết học - Truyền máu TW (ký hiệu mẫu: NK01-NK100) (phục vụ mục tiêu 2: Khảo sát đa hình nucleotide trên F9) 2.1.3. Mẫu người mang gen bệnh: 23 phụ nữ mang gen bệnh (MG1-MG23) (phục vụ đánh giá hiệu quả bộ đa hình - kết quả thu được từ mục tiêu 2) - Mỗi đối tượng nghiên cứu được lấy 2 ml máu ngoại vi (chống đông EDTA). 2.2. Phương pháp nghiên cứu: 2.2.1.Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mô tả cắt ngang có phân tích. 2.2.2. Công thức tính cỡ mẫu trong nghiên cứu đa hình nucleotide Được tính toán theo công thức Leslie Kish: n = (Z1-α)2. [p. (1-p)/D2]) 2.2.3. Sơ đồ nghiên cứu 2.3. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 2.4. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 2.4.1. Thu thập mẫu nghiên cứu Mỗi mẫu nghiên cứu được lấy 2ml máu cho vào ống chống đông EDTA. Quy trình lấy máu đảm bảo vô trùng tuyệt đối. 2.4.2. Tách chiết ADN của các mẫu nghiên cứu Sử dụng bộ kit tách ADN của hãng Qiagen. 2.4.3. Thiết kế các trình tự mồi để khuếch đại gen F9 Sử dụng phần mềm Primer3 thiết kế các cặp mồi. Kiểm tra độ bao phủ gen F9 của các trình tự mồi trên phần mềm CLC Genomic Workbench.
7 2.4.4. Khuếch đại gen F9 bằng kỹ thuật Longrange PCR (LR-PCR) Tối ưu quy trình LR-PCR khuếch đại các vùng gen F9 sử dụng bộ sinh phẩm Q5 High-Fidelity 2x Mastermix. 2.4.5. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2.4.6. Tinh sạch sản phẩm PCR khuếch đại các vùng gen F9 Sử dụng bộ kit Agencourt Ampure XP 2.4.7. Giải trình tự gen F9 bằng kỹ thuật NGS 2.4.7.1. Chuẩn bị thư viện ADN: Sử dụng bộ kit Nextera XT Library Prep. 2.4.7.2. Tinh sạch thư viện sản phẩm PCR: Sử dụng bộ kit Agencourt Ampure XP, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 2.4.7.3. Chuẩn hóa mẫu: Đo nồng độ thư viện sử dụng bộ sinh phẩm QuBit dsDNA HS Assay, quy đổi nồng độ các mẫu từ đơn vị ng/µl sang đơn vị nM. 2.4.7.4. Thực hiện giải trình tự gen F9: Sử dụng bộ sinh phẩm Miseq Reagent. 2.4.8. Khẳng định kết quả giải trình tự gen F9 trên NGS bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger 2.4.8.1. Thực hiện phản ứng PCR-Bigdye: Sử dụng bộ sinh phẩm BigDye™ Terminator v3.1, theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 2.4.8.2. Tinh sạch sản phẩm PCR-Bigdye: Sử dụng bộ sinh phẩm Bigdye Xterminator và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất 2.4.8.3. Thực hiện phản ứng giải trình tự trên máy AB 3500 2.4.9. Khẳng định các mất đoạn/lặp đoạn gen F9 Sử dụng kỹ thuật MLPA để khẳng định các trường hợp nghi ngờ có mất đoạn lớn, sử dụng bộ kit SALSA MLPA P207 F9, MRC Holland. Quy trình thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 2.4.10. Phân tích đột biến gen từ dữ liệu giải trình tự Sử dụng phần mềm Miseq Reporter và CLC Genomics Workbench 9.5.2; gen tham chiếu là NG_007994.1 và NM_000133.3; cơ sở dữ liệu tham chiếu là của EAHAD (http://www.factorix.org), CDC (https://www.cdc.gov/ncbddd) và cơ sở dữ liệu SNP quốc tế (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp) - Sử dụng các phần mềm PolyPhen-2 và SIFT để dự đoán ảnh hưởng của các biến đổi mới tới cấu trúc và chức năng của gen F9. 2.4.11. Phân tích đa hình nucleotide trên gen F9 Sử dụng phần mềm CLC Genomic Workbench; gen tham chiếu là F9_NC000023.11; tham chiếu với cơ sở dữ liệu SNP quốc tế (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp). Tính toán chỉ số đa hình: Gồm tần số alen đa hình, tỷ lệ dị hợp tử của các đa hình, mối liên kết giữa các SNP (trên phàn mềm Haploview 4.2). Khẳng định hiệu quả của bộ đa hình: bằng cách áp dụng phân tích trên 23 phụ nữ mang gen sau đó tính số trường hợp mẫu dị hợp tử khi phối hợp bộ đa hình.
8 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 3.1.1. Thu thập mẫu nghiên cứu Thu thập mẫu từ 100 người khỏe mạnh, có độ tuổi trung bình là 24 ± 14, không có quan hệ huyết thống, không có tiền sử chảy máu lâu cầm; 100 mẫu bệnh nhân hemopphilia B với đặc điểm như Bảng 3.1 Bảng 3.1. Đặc điểm của các bệnh nhân nghiên cứu Bệnh nhân hemophilia B (n=100) Đặc điểm N Tỷ lệ (%) Nam 99 99 Giới tính Nữ 1 1 Nặng 79 79 Mức độ bệnh Trung bình 17 17 Nhẹ 4 4 Có 0 0 Tình trạng xuất hiện ức chế Không 100 100 Độ tuổi trung bình (x ± SD) 22 ±16 Bệnh nhân trong nghiên cứu chủ yếu là nam giới (99%). Có 79% bệnh nhân mức độ nặng (nồng độ FIX 100 ng/µl), băng ADN nguyên vẹn (Hình 3.1 và Bảng 3.2). Hình 3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số. HB1-HB6: 6 mẫu bệnh nhân (từ 1 đến 6) NK1-NK6:6 phụ nữ khỏe mạnh (từ 1 đến 6)M: thang ADN 1kb (Thermo Fisher) Bảng 3.2. Kết quả nồng độ và độ tinh sạch của một số mẫu ADN Tên Nồng độ Tên Nồng độ STT A260 /A280 STT A260 /A280 mẫu (ng/µl) mẫu (ng/µl) 1 HB1 108.8 1.9 7 NK1 90 1.95 2 HB2 94 1.91 8 NK2 93.6 1.94 3 HB3 150.1 1.91 9 NK3 111.7 1.9 4 HB4 108.1 1.9 10 NK4 119 1.88 5 HB5 93 1.91 11 NK5 207.5 1.9 6 HB6 225.6 1.88 12 NK6 207.5 1.91
9 3.2. Xây dựng quy trình giải trình tự gen F9 trên hệ thống NGS 3.2.1. Thiết kế bộ mồi khuếch đại toàn bộ gen F9 Để khuếch đại được toàn bộ gen F9 bằng phản ứng LR-PCR, chúng tôi đã phân đoạn gen F9 thành 8 vùng gen (a1-a8) có kích thước từ khoảng 4000 bp- 6000 bp. Sau đó thiết kế 16 trình tự mồi gối đầu nhau để khuếch đại 8 vùng gen này (Bảng 3.3). Bảng 3.3. Phân đoạn ADN và các trình tự mồi thiết kế Tên Vùng gen Kích thước Gối đầu Đoạn Trình tự (5'-3') mồi F9 (bp) (bp) F9-1F CCACAAGAGAAAGCAGGACG Đầu 5’ 4056 a1 F9-1R TGAAGAGAATGGGCAGTGGT F9-2F AAGAGGACAAAAGACAAGCTAGG exon 1 4560 375 a2 F9-2R TGCCTGCATCCATTTACAGTCG intron 1 F9-3F CACAGGTCTAGAGGAGGCAGAT exon 2- 5572 446 a3 F9-3R TGCCTATTCTCCCTCTTCTCTGTC intron 3 F9-4F TGCCTGAACCCAAAGTACACAC exon 4 5594 436 a4 F9-4R GGTGATTAGCTCTGGGTGGATGT intron 4 F9-5F TGCTTAACTTCCTGGGACTGTCTC exon 5 5724 314 a5 F9-5R CACAGCCATATTCACCAGGACC intron 5 F9-6F CTGCCTGGTTCTTCACATACACTG exon 6 4765 589 a6 F9-6R TGCCTTAGTCACAGCAGGTTTG F9-7F CACCACCTCCATCCAGTTCCTTAT Intron 6 5723 229 a7 F9-7R GCAGGGCTCATTCATTCTTTCCAC F9-8F TCAGCTTTGTAGGTCTCCAGGTAG exon 7 - 5305 582 a8 F9-8R GCCACAGAGAAGACCAATACAGG poly A Kết quả kiểm tra trên phần mềm CLC cho thấy các trình tự mồi thiết kế bao phủ hoàn toàn gen F9, đảm bảo quá trình khuếch đại sẽ thu được gen F9 hoàn chỉnh (Hình 3.2). Hình 3.2. Kết quả kiểm tra độ bao phủ gen F9 của các trình tự mồi 3.2.2. Kết quả tối ưu quy trình LR- PCR khuếch đại 8 vùng gen F9 Sử dụng bộ sinh phẩm Q5 High-Fidelity 2x Master Mix.. Với công cụ NEB Tm Calculator, chúng tôi đã xác định được nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mỗi cặp mồi và tính toán được nhiệt độ gắn mồi trung bình theo lý thuyết của cả 8 cặp mồi là 68,6oC. Từ đó, sử dụng dải nhiệt độ với biên độ ±2-3oC so với Tm trung bình để tối ưu phản ứng LR-PCR cho từng cặp mồi riêng biệt. Các nhiệt độ được lựa chọn cho bước gắn mồi trong phản ứng LR-PCR là 65oC, 66oC, 67oC, 68oC, 69oC, 70oC. Kết quả là nghiên cứu đã tìm ra được nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu cho đoạn a1, a2,a5, a6, a7 là 66oC (Hình 3.3, 3.5, 3.6), nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu cho đoạn a3, a4 là 68oC (Hình 3.4), riêng mồi để nhân đoạn a8 ở tất cả các dải nhiệt
10 độ 65oC-70oC đều không có sản phẩm (Hình 3.6). Mặc dù sau đó lặp lại thử nghiệm tối ưu đoạn a8 ở cùng điều kiện, ở điều kiện giảm Tm xuống 60oC, 62oC, 64oC, phản ứng LR-PCR vẫn không có sản phẩm, thử nghiệm thay thế bộ sinh phẩm Q5 High-Fidelity 2x Master Mix bằng bộ sinh phẩm Qiagen Longrange PCR Kit, phản ứng PCR khuếch đại đoạn a8 vẫn không thành công (Hình 3.7). Cuối cùng khi chúng tôi thiết kế lại cặp mồi nhân đoạn a8 với, mồi F9-8R được thiết kế lùi vào trong gen so với vị trí lần đầu 1274 nucleotide (F9-8R’: 5’- AGAACTAAAGGAACTAGCAAG-3’), mồi F9-8F được giữ nguyên thì mới tối ưu thành công phản ứng LR-PCR khuếch đại đoạn a8 với bộ sinh phẩm Q5 High- Fidelity 2x Master Mix (Hình 3.8). Hình 3.3. Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a1 và a2 Hình 3.4. Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a3 và a4 Giếng M: Thang ADN chuẩn 1 kb (Thermo Fisher); Giếng M: Thang ADN chuẩn 1 kb (Thermo Fisher);a1: phân a3: phân đoạn a3 (5572 bp); a4: phân đoạn a4 (5594 đoạn a1(4056 bp); a2: phân đoạn a2 (4560 bp bp) Hình 3.5. Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a5 và a6 Hình 3.6. Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a7 và a 8 Giếng M: Thang ADN chuẩn 1 kb (Thermo Fisher) a5: phân đoạn Giếng M: Thang ADN chuẩn 1 kb (Thermo Fisher); a7: a5 (5724 bp); a6: phân đoạn a6 (4765 bp) phân đoạn a7(5723 bp); a8: phân đoạn a8 (5305 bp) Hình 3.7. Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a8 (kit Qiagen Hình 3.8. Kết quả phản ứng LR-PCR tối ưu đoạn a8 (với Longrange PCR) cặp mồi F9-8F và F9-8R’). Giếng M: Thang ADN chuẩn 1 kb (Thermo Fisher); a8: phân đoạn a8 (5305 bp) Từ các kết quả trên, chúng tôi nhận thấy điều kiện tối ưu về thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho phản ứng LR-PCR khuếch đại các đoạn từ a1-a8 của gen F9 như sau:
11 Bảng 3.5. Chu trình nhiệt cho các Bảng 3.4. Thành phần phản ứng LR-PCR đoạn a1, a2, a5, a6, a7 Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) Nhiệt độ Thời gian S ố chu kỳ 0 Q5 High-Fidelity 2x 1X 12,5 97 C 3 phút 1 0 Primer F 10 pM 1 97 C 30 giây Primer R 10 pM 1 0 66 C 45 giây 35 ADN khuôn 100 ng 1 720C 5 phút H20 9,5 720C 10 phút 1 Tổng thể tích 25 150C ∞ 1 Bảng 3.6. Chu trình nhiệt đoạn a3 và a4 Bảng 3.7. Chu trình nhiệt độ cho đoạn a8 Nhiệt độ Thời gian S ố chu kỳ Nhiệt độ Thời gian S ố chu kỳ 970C 3 p hút 1 0 3 phút 1 97 C 0 0 97 C 30 giây 97 C 30 giây 0 0 68 C 45 giây 35 69 C 45 giây 35 720C 0 5 p hút 72 C 5 phút 720C 10 p hút 1 720C 10 phút 1 0 15 C ∞ 1 0 15 C ∞ 1 Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt tối ưu đã được khẳng định độ ổn định khi lặp lại phản ứng trên 10 bệnh nhân. Như vậy, bằng 8 phản ứng LR-PCR ở 3 chu trình nhiệt như trên, chúng tôi đã khuếch đại được toàn bộ gen F9 dài 35kb (Hình 3.9). Hình 3.9. Hình ảnh khuếch đại các phân đoạn a1-a8 ở các điều kiện Tm tối ưu. M: Thang ADN chuẩn 1 kb (Thermo Fisher) a1- a8: các phân đoạn a1 -a8 của gen F9 Quy trình LR-PCR với thành phần và các điều kiện đã tối ưu được sử dụng để khuếch đại các đoạn a1-a8 cho tất cả các mẫu nghiên cứu trong đề tài. Sản phẩm của phản ứng LR-PCR sau đó được tinh sạch và chuẩn bị thư viện ADN phục vụ bước giải trình tự gen F9 bằng kỹ thuật NGS. 3.2.3. Kết quả chuẩn bị thư viện ADN Sử dụng bộ kit Nextera XT DNA Library preparation, chúng tôi đã thu được thư viện gồm các đoạn ADN có kích thước chủ yếu khoảng 462 bp, nằm trong vùng tiêu chuẩn cho thư viện ADN là từ 300 bp đến 500 bp (Hình 3.10). Hình 3.10. Kết quả kiểm tra thư viện ADN trên hệ thống điện di mao quản BiOptic
12 3.2.4. Kết quả giải trình tự với quy trình NGS đã tối ưu Thư viện ADN được tinh sạch bằng Agencourt Ampure XP, sau đó thực hiện giải trình tự sử dụng bộ kit Miseq Reagent. Kết quả cho thấy chỉ số chất lượng của mẻ chạy đáp ứng các tiêu chí kỹ thuật với Q30 = 90,5%; density = 1153 K/mm2; Cluster passing filter = 88,2% (Hình 3.11a). Dữ liệu giải trình tự thu được bao phủ hoàn toàn gen F9 (35kb) (Hình 3.11 b). Coverage tối thiểu cho mỗi base là 100X. Hình 3.11a: Chất lượng giải trình tự NGS Hình 3.11b: Một số hình ảnh kết quả giải trình tự NGS Q30 = 93,8%; density = 896 K/mm2; Cluster passing filter = 91,7%. Hình 3.11b: Một số hình ảnh kết quả giải trình tự NGS 3.2.5. Khẳng định kết quả giải trình tự NGS Độ tin cậy của quy trình giải trình tự gen NGS đã được khẳng định khi kết quả giải trình tự song song 10 mẫu bệnh nhân với quy trình NGS và quy trình Sanger cho kết quả phân tích đột biến tương đồng 100% (Hình 3.12). Kết quả giải trình tự NGS Kết quả giải trình tự Sanger (1) Mẫu HB04 Bất thường c.128G>A Bất thường c.128G>A (2) Mẫu HB05 Bất thường c.382T>C Bất thường c.382T>C
13 (3) Mẫu HB06 Bất thường c.676C>T Bất thường c.676C>T (4) Mẫu HB08 Bất thường c.689G>T Bất thường c.689G>T (5) Mẫu HB12 Bất thường c.127C>T Bất thường c.127C>T (6) Mẫu HB15 Bất thường c.677G>A Bất thường c.677G>A (7) Mẫu HB18 Bất thường c.470G>T Bất thường c.470G>T (8) Mẫu HB19 Bất thường c.1135C>T Bất thường c.1135C>T (9) Mẫu HB22
14 Bất thường c.874C>T và c.933G>C Bất thường c.874C>T và c.933G>C (10) Mẫu HB25 Đột biến c.956T>C Đột biến c.956T>C Hình 3.12. Kết quả phân tích đột biến với quy trình NGS và Sanger 3.3. Kết quả giải trình tự gen F9 ở các mẫu nghiên cứu Áp dụng quy trình giải trình tự bằng NGS xây dựng ở trên, chúng tôi đã giải trình gen F9 thành công cho 200 mẫu nghiên cứu (100 bệnh nhân và 100 phụ nữ khỏe mạnh). Ngoại trừ dữ liệu của 3 bệnh nhân có mã số H14, H94, H97 thì dữ liệu giải trình tự thu được của 197 mẫu còn lại (97 bệnh nhân và 100 người khỏe mạnh) đều bao phủ hoàn toàn gen F9 (35 kb), đạt yêu cầu để phân tích các biến đổi di truyền (bao gồm đột biến và đa hình nucleotide) trên gen F9. Mẫu H14, H94, H97 là các mẫu bị khuyết sản phẩm Longrange PCR ở các phân đoạn a5 (H14), a2-a8 (H94), a4-a6 (H97) do có mất đoạn gen (Hình 3.13), nên chỉ thu được dữ liệu giải trình tự của các vùng gen còn lại (Hình 3.14). Cả 3 mẫu này đều đã được khẳng định có mất đoạn gen bằng kỹ thuật MLPA (Hình.3.15). Mẫu H14: không khuếch đại Mẫu H94: không khuếch đại được Mẫu H97: không khuếch đại được được đoạn a5 đoạn a2-a8 đoạn a4-a6 Hình 3.13. Kết quả Longrange PCR của các mẫu H14, H94, H97 Mẫu H14: Thiếu exon 5 Mẫu H94:Thiếu exon 1 - 8 Mẫu H97: Thiếu exon 4 -6 Hình 3.14. Kết quả giải trình tự gen NGS của các mẫu H14, H94, H97 Mẫu H14: Đột biến mất exon 5 Mẫu H94: Đột biến mất exon 1 - 8 Mẫu H97: Đột biến mất exon 4 -6 Hình 3.15. Kết quả phân tích MLPA của các mẫu H14, H94, H97
15 3.4. Kết quả phân tích đột biến gen ở 100 bệnh nhân nghiên cứu Kết quả phân tích dữ liệu NGS, cho thấy 100 % bệnh nhân đều mang đột biến gây bệnh (Phụ lục 01). Nghiên cứu phát hiện 58 đột biến gen khác nhau, trong đó có 16 đột biến mới (Bảng 3.8) Tỷ lệ đột biến mới là 27,59%. Danh sách 58 đột biến được trình bày ở Bảng 3.9. Bảng 3.8. Danh sách 16 đột biến mới phát hiện trong nghiên cứu . 3.5. Đặc điểm của các đột biến gen gặp trong nghiên cứu 3.5.1. Kiểu đột biến gen Nghiên cứu gặp 4 kiểu đột biến gen (đột biến điểm, đột biến chèn đoạn đột biến mất đoạn nhỏ, mất đoạn lớn). Nhiều nhất là đột biến điểm (91,38%). Bảng 3.10. Đặc điểm kiểu đột biến gen gặp trong nghiên cứu Kiểu đột biến Số lượng (n) Tỷ lệ (%) Đột biến điểm 53 91,38 Chèn đoạn 1 1,72 Mất đoạn nhỏ (50 bp) 3 5,17 Tổng số 58 100
16 Bảng 3.9. Danh sách 58 đột biến phát hiện trong nghiên cứu *: các đột biến được khẳng định bằng kỹ thuật MLPA
17 3.5.2. Tác động của các đột biến đến cấu trúc, hoạt động gen Đột biến gặp trong nghiên cứu đa dạng, tác động đến từ 01 đến nhiều nucleotide, có đột biến dẫn tới mất 1 exon, 2 exon, thậm chí mất toàn bộ 8 exon của gen F9. Đột biến điểm dẫn tới tạo axit amin mới chiếm tỷ lệ cao nhất với tỷ lệ 75,47%. Một số đột biến dẫn đến dịch khung đọc, tạo mã bộ ba vô nghĩa hay làm mất vị trí cắt nối (Bảng 3.11). Bảng 3.11. Tác động của các đột biến đến cấu trúc, hoạt động gen Kiểu đột biến Tác động Số lượng (n) Tỷ lệ (%) Sai nghĩa 40 75,47 Đột biến điểm 5 9,43 (n = 53) Vô nghĩa Vị trí cắt nối 5 9,43 Dịch khung đọc 2 3,77 Vùng promoter 1 1,89 Chèn đoạn (n = 1) Dịch khung đọc 1 - Mất đoạn lớn (n=3) Mất 1 exon 1 - Mất 3 exon 1 - Mất 8 exon 1 - Mất đoạn nhỏ (n = 1) Mất 1 codon 1 - 3.5.3. Đánh giá mức độ lặp lại của các đột biến ở các bệnh nhân nghiên cứu Nghiên cứu phát hiện 16/58 đột biến lặp lại ở từ 2 bệnh nhân trở lên. Nhiều nhất là đột biến c.881G>A, lặp lại 12 lần (Bảng 3.12). Bảng 3.12. Mức độ lặp lại của các đột biến ở các bệnh nhân nghiên cứu Biến đổi Biến đổi Số Loại Exon STT nucleotide axit amin Vị trí Domain trường đột biến intron (HGVS cDNA) (HGVS protein) hợp 1 c.881G>A p.Arg294Gln missense CpG exon 8 protease 12 2 c.1213G>A p.Asp405Asn missense - exon 8 protease 7 3 c.1135C>T p.Arg379* nonsense CpG exon 8 protease 5 4 c.127C>T p.Arg43Trp missense CpG exon 2 PRO 5 5 c.128G>A p.Arg43Gln missense CpG exon 2 PRO 3 6 c.1369A>T p.Lys457* nonsense - exon 8 protease 3 7 c.206G>A p.Cys69Tyr missense - exon 2 GLA 3 8 c.149G>A p.Gly50Asp missense - exon 2 GLA 3 9 c.676C>T p.Arg226Trp missense CpG exon 6 Activation 2 10 c.470G>T p.Cys157Phe missense - exon 5 EGF2 2 11 c.1243C>A p.His415Asn missense - exon 8 Protease 2 12 c.956T>C p.Leu319Pro missense - exon 8 protease 2 13 c.952delC p.Leu318Phefs*8 frameshift - exon 8 protease 2 14 c.223C>T p.Arg75* nonsense CpG exon 2 GLA 2 15 c.278-3A>G Splice site Splice site - intron 3 - 2 16 c.349T>A p.Cys117Ser missense - exon 4 EGF1 2 3.6. Đánh giá mối tương quan giữa kiểu đột biến gen và mức độ bệnh Trong nghiên cứu này, các tổn thương di truyền lớn như mất đoạn gen, đột biến vô nghĩa, đột biến dịch khung đọc chỉ gặp ở nhóm bệnh nhân mức độ nặng. Đột biến sai nghĩa gặp cả ở 3 nhóm mức độ bệnh bảng 3.13.
18 Bảng 3.13. Tương quan giữa kiểu đột biến gen và mức độ bệnh BN mức độ nặng BN mức độ TB BNmức độ nhẹ Đột biến (FIX 5 – 40%) n % n % N % Sai nghĩa 54 68,35 15 88,24 4 100 Dịch khung đọc 4 5,06 0 0 0 0 Vô nghĩa 12 15,19 0 0 0 0 Mất đoạn nhỏ 1 1,27 0 0 0 0 Mất đoạn lớn 3 3,80 0 0 0 0 Vị trí cắt nối 5 6,33 1 5,88 0 0 Vùng promoter 0 0 1 5,88 0 0 Tổng số (n = 100) 79 17 4 3.7. Lập bản đồ đột biến gen F9 ở bệnh nhân hemophilia B Việt Nam 3.7.1. Phân bố đột biến trên gen F9 Đột biến gen gặp trong nghiên cứu trải dài từ đầu đến cuối gen F9, nhiểu nhất là exon 8 (46,55%), tiếp đến là exon 2 (12,07%); exon không có đột biến là exon 3. Có 5 đột biến được phát hiện thấy trong vùng intron 2, 3,5,7. Tỷ lệ đột biến xảy ra trong exon là 89,66% (52/58 đột biến); intron và vùng 5’UTR là 10,34% (6/58 đột biến) (Hình 3.16) Hình 3.16. Phân bố đột biến trên gen F9 Hình 3.17. Phân bố đột biến trên domain của FIX 3.7.2. Phân bố của các đột biến trên các domain của FIX Đột biến phân bố chủ yếu trên domain SP (51,72%), tỷ lệ đột biến trên các domain còn lại từ 3,45 % đến 8,62%. Có 1 trường hợp (1,72%) đột biến làm mất 3 domain EGF1-EGF2-AP, 1 trường hợp đột biến mất toàn bộ các domain của phân tử FIX (Hình 3.17). 3.7.3 Bản đồ đột biến gen F9 của bệnh nhân hemophilia B Việt Nam Từ các dữ liệu đột biến gen thu được, chúng tôi đã lập bản đồ đột biến gen F9 ở các bệnh nhân hemophilia B nghiên cứu (Hình 3.18). Bản đồ hiển thị tất cả 58 đột biến phát hiện trong nghiên cứu. Vị trí phát sinh đột biến, tần suất xảy ra đột biến trong mỗi exon, intron của gen F9 hay trong các vùng domain của phân