Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực nhằm phát triển vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

17
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của Luận án nhằm xác định được cơ sở di truyền liên quan đến những biến đổi trình tự nucleotide trong các gen mã hóa protein độc tố (gen độc tố toxR, tdh, trh, tlh) và gen rpoB ở các dòng vi khuẩn Vibrio giảm độc lực. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực nhằm phát triển vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI VŨ THỊ BÍCH HUYỀN NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus ĐỘT BIẾN GIẢM ĐỘC LỰC NHẰM PHÁT TRIỂN VẮC-XIN PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN THẬN TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ BIỂN Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 9.42.01.21 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI- NĂM 2020
Công trình được hoàn thành tại: Phòng thí nghiệm bộ môn Di truyền – Hóa sinh, Khoa Sinh học, Đại học Sư phạm Hà Nội và Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Xuân Viết PGS.TS. Phạm Thị Tâm Phản biện 1: PGS.TS Khuất Hữu Thanh Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân Trường ĐHKHTN - ĐHQG Hà Nội Phản biện 3: PGS.TS Dương Minh Lam Trường ĐHSP Hà Nội Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp tại Trường Đại học Sư phạm Hà Nội vào hồi …..giờ … ngày … tháng… năm… Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Thư viện Quốc Gia, Hà Nội hoặc Thư viện Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ Bài báo đã công bố 1. Cao Thị Thanh Hương, Phạm Thị Tâm, Nguyễn Mạnh Hùng, Nguyễn Xuân Viết, Vũ Thị Bích Huyền (2015). Đặc tính sinh học của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus phân lập từ cá biển mắc bệnh hoại tử gan thận. Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển nông thôn 8/2015: 72-78. 2. Vũ Thị Bích Huyền, Nguyễn Xuân Viết, Phạm Thị Tâm, Mẫn Hồng Phước, Nguyễn Đăng Quang, Đỗ Thanh Vân, Đặng Thị Hồng Thắm,(2018). Tạo chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus giảm độc lực bằng phương pháp xử lý kháng sinh rifampicin, Báo cáo khoa học Hội nghị nghiên cứu và giảng dạy Sinh học toàn quốc lần thứ ba, tháng 5/2018: 1156-1163. 3. Vũ Thị Bích Huyền, Nguyễn Xuân Viết, Đặng Thị Hồng Thắm, Mẫn Hồng Phước, Phạm Thị Tâm (2018). Đánh giá tính ổn định và khả năng đáp ứng miễn dịch của chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus L4650 giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc - xin phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá biển. Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển nông thôn số 21/2018: 79-85. 4. Vũ Thị Bích Huyền, Nguyễn Xuân Viết, Huỳnh Việt Tùng, Phạm Thị Tâm, Mẫn Hồng Phước (2019). Đặc điểm sinh hóa và di truyền của chủng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận cho cá mú nuôi tại Cát Bà, Hải Phòng. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y tập 26 số 7/2019: 62-73. 5. Vu Thi Bich Huyen, Nguyen Xuan Viet, Pham Thi Tam, Man Hong Phuoc, Huynh Viet Tung, Nguyen Dang Quang, Do Thanh Van (2020). Development of attenuated Vibrio parahaemolyticus mutant strains as potential live vaccines. Asia Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 28(1): 52-67. Trình tự gen đã công bố trên NCBI: 02 trình tự (đã được trích dẫn trong bài tại tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y). - Gen toxR của chủng A3.3 với mã số (accession number) MH047286 - Gen tlh của chủng A3.3 với mã số (accession number) MH047289 Hội thảo Khoa học Quốc tế Vu Thi Bich Huyen, Chu Dinh Toi, Nguyen Xuan Viet, Man Hong Phuoc, Pham Thi Tam (2019). Isolation and evaluation the potential as live attenuated vaccine candidate of rifampicin-resistant Vibrio parahaemolyticus strains. 2019 International Academic Conference for Graduate Student of Nanjing Agricultural University in October 2019, Nanjing, China.
1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Với lợi thế bờ biển dài (3.260 km) trải suốt từ Bắc đến Nam, tiềm năng phát triển ngành nuôi trồng thủy sản là rất lớn. Theo Tổng cục Thống kê, năm 2018 GDP toàn ngành thủy sản đạt 190.123 tỷ đồng, chiếm 3,43% toàn nền kinh tế và 23,57% toàn ngành nông nghiệp, tăng trưởng 6,46% so với năm 2017, đạt tốc độ tăng trưởng cao nhất trong ngành nông nghiệp, đóng góp 0,22 điểm phần trăm vào tăng trưởng chung toàn ngành nông nghiệp và cả nước [187]. Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy sản Việt Nam cũng như trên thế giới luôn phải đối mặt với những khó khăn và thách thức, đặc biệt những tổn thất do bệnh dịch gây ra. Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), bệnh dịch gây thiệt hại cho ngành nuôi trồng thủy sản toàn cầu hơn 6 tỷ USD mỗi năm, xảy ra ở hầu hết các nước đang phát triển. Ở Việt Nam, ước tính mỗi năm ngành thủy sản thiệt hại gần 1 tỷ USD do bệnh dịch gây ra [22]. Bệnh hoại tử gan thận trên cá được phát hiện ở 14 quốc gia, trên 48 loài cá, được biết là do vi khuẩn Vibro parahaemotycus gây ra [112]. Cá bị bệnh có triệu chứng: xuất hiện các đốm đỏ, lở loét da, vẩy tróc, vây mòn cụt, nội quan xuất huyết, đặc biệt ở gan và thận, gan chuyển thành màu vàng, cá bị bệnh có thể chết hàng loạt, tỉ lệ chết lên đến 90% [112, 138]. V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận làm cá chết hàng loạt với số lượng lớn được báo cáo hằng niên các tỉnh Quảng Ninh, Hải Phòng, Quảng Ngãi, Phú Yên, Khánh Hòa, Bà Rịa-Vũng Tàu…[184, 185, 186]. Cho đến nay, việc kiểm soát và điều trị bệnh hoại tử gan thận cho cá nuôi của người nuôi cá chủ yếu là sử dụng kháng sinh để tiêu diệt vi khuẩn V. parahaemolyticus [34, 61]. Tuy nhiên, sử dụng kháng sinh một cách thường xuyên và thiếu sự kiểm soát chặt chẽ đã dẫn tới hiện tượng kháng thuốc ở nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh [26]. Mặt khác, dư lượng kháng sinh trong sản phẩm từ cá gây ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm cũng như sức khỏe của người tiêu thụ [107]. Do đó, sử dụng vắc-xin phòng bệnh là một giải pháp hiệu quả và mang đến sự phát bền vững cho ngành nuôi trồng thủy sản ở nước ta. Vắc-xin phòng bệnh do vi khuẩn gồm nhiều loại khác nhau: vắc-xin bất hoạt, vắc-xin nhược độc, vắc-xin tái tổ hợp, vắc-xin tiểu phần, vắc-xin DNA [125]. Hầu hết các vắc-xin phòng bệnh vi khuẩn cho cá đã được thương mại hóa trên thế giới là vắc-xin bất hoạt bởi tính an toàn cao của loại vắc-xin này. Tuy nhiên, vắc-xin bất hoạt được đánh giá là có thời gian bảo hộ không dài [152]. Mặc dù, đã có một vài nghiên cứu tạo vắc-xin bất hoạt, vắc- xin tái tổ hợp hoặc vắc-xin DNA phòng bệnh do vi khuẩn V. parahaemolyticus ở cá đã được công bố, nhưng cho đến nay các vắc-xin như thế được cấp phép thương mại hóa để sử dụng trên cá là chưa có. Vắc-xin nhược độc sử dụng vi khuẩn giảm độc lực đang là một hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng ứng dụng trong sản xuất vắc-xin thương mại cho cá nhờ khả năng cho tỉ lệ bảo hộ cao và thời gian bảo hộ dài.
2 Tạo được chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus giảm độc có khả năng gây đáp ứng miễn dịch cho cá do đó sẽ có ý nghĩa quan trọng và mang tính quyết định sự thành bại của việc phát triển loại vắc-xin nhược độc. Vì vậy, nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận là rất cần thiết, phù hợp với xu hướng và mang đến triển vọng ứng dụng cao trong phòng bệnh hoại tử gan thận ở cá biển nuôi lồng có giá trị kinh tế. Xuất phát từ cơ sở lý luận và thực tiễn trên, đề tài “Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đột biến giảm độc lực nhằm phát triển vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển” được tiến hành nhằm tạo làm cơ sở ban đầu cho việc hướng đến sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoạt tử gan thận ở cá biển. 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Mục tiêu chung Tạo được chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus đột biến giảm độc lực có khả năng gây đáp ứng miễn dịch cho cá làm ứng viên cho nghiên cứu sản xuất vắc-xin sống nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận cho một số loài cá biển nuôi lồng có giá trị kinh tế. 2.2. Mục tiêu cụ thể - Tạo được vi khuẩn V. parahaemolyticus giảm độc lực từ chủng vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan thận cá phân lập được bằng phương pháp xử lý với kháng sinh rifampicin. - Xác định được cơ sở di truyền liên quan đến những biến đổi trình tự nucleotide trong các gen mã hóa protein độc tố (gen độc tố toxR, tdh, trh, tlh) và gen rpoB ở các dòng vi khuẩn Vibrio giảm độc lực. - Đánh giá được khả năng bảo hộ của dòng vi khuẩn giảm độc lực đã tạo ra. 3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu phân lập và xác định các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận cho một số loài cá biển nuôi (cá mú, cá hồng, cá bớp) tại vùng biển miền Bắc Việt Nam. - Nghiên cứu tạo các dòng vi khuẩn V. parahaemolyticus giảm độc lực từ các chủng vi khuẩn gây bệnh bằng phương pháp xử lý các chủng gây bệnh với rifampicin và phân tích những sai khác về trình tự nucleotide của một số gen mã hoá protein độc tố (toxR, tdh, trh, tlh) và gen rpoB của các dòng V. parahaemolyticus giảm độc lực so với vi khuẩn dại. - Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của dòng V. parahaemolyticus trên loài cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) và chọn dòng V. parahaemolyticus làm ứng viên nghiên cứu tạo vaccine phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá biển nuôi. 4. Đối tượng nghiên cứu Chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận cho một số loài cá biển. 5. Phạm vi nghiên cứu Các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập từ cá biển nuôi tại các vùng biển quanh đảo Cát Bà, vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng); vùng biển Đồng Châu (Thái Bình); vùng biển Hải Thịnh (Nam Định) và các dòng đột biến giảm độc lực được tạo ra. 6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3 6. 1. Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp thêm cơ sở dữ liệu các chủng V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận cho cá nuôi ở một số vùng biển miền Bắc về các đặc điểm hình thái, hóa sinh và khả năng kháng kháng sinh, đồng thời, cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu dịch tễ và xây dựng các giải pháp chẩn đoán bệnh. Phát hiện những đột biến trong gen độc tố và gen ropB của các dòng V. parahaemolyticus kháng rifampicin, giảm độc lực là có ý nghĩa khoa học góp phần định hướng cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm phát triển vắc-xin sống nhược độc sử dụng trong phòng bệnh cho cá biển nuôi lồng. Kết quả đánh giá khả năng bảo hộ (RPS) của dòng V. parahaemolyticus giảm độc lực đối với bệnh hoại tử gan thận trên cá mú chấm cam (E. coioides) đã cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu miễn dịch và phòng bệnh cho cá biển nuôi lồng. 6.2. Ý nghĩa thực tiễn Vi khuẩn V. parahaemolyticus đột biến giảm độc lực có khả năng gây đáp ứng miễn dịch sẽ là ứng viên để sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận cho cá mú chấm cam cũng như một số loài cá biển khác. 7. Tính mới, tính độc đáo, tính khả thi của đề tài Luận án là một trong những công trình đầu tiên nghiên cứu tạo vi khuẩn V. parahaemolyticus giảm độc lực làm ứng viên cho sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận trên cá biển bằng phương pháp xử lý kháng sinh rifampicin. Lần đầu tiên kích thước đầy đủ của gen tlh ở vi khuẩn V. parahaemolyticus được nhân bản thành công. Phát hiện được các sai khác trình tự nucleotide trong các gen tlh và rpoB giữa các dòng giảm độc lực và chủng dại, cung cấp cơ sở di truyền chứng minh mối liên quan giữa các đột biến trong gen độc tố tlh và gen rpoB với tính giảm độc lực ở vi khuẩn V. paraheamolyticus. Chọn được dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực L4650 là ứng viên tiềm năng cho nghiên cứu phát triển vắc-xin sống nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận trên một số loài cá biển nuôi lồng. Dòng đột biến giảm độc lực L4650 biểu hiện ổn định về độc lực, tỉ lệ sống sót của cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) được tiêm liều 100 µl/con, 105 CFU/ml đạt 100%. Tỉ lệ bảo hộ (RPS) cho cá mú được tiêm chủng vi khuẩn L4650 đạt cao, từ 96,91 - 100% sau 15 ngày tiêm chủng và 93,33 - 100% sau 6 tháng tiêm chủng. 8. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Di truyền - Hóa sinh, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội và phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội. Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 11/2014 đến tháng 4/2019.
4 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận ở một số loài cá 1.1.1. Đặc điểm hình thái, sinh hóa và sinh trưởng của vi khuẩn Vibrio 1.1.2. Hệ gen của vi khuẩn V. parahaemolyticus 1.1.3. Độc tố và các gen quy định độc tố haemolysin Ba loại protein haemolysin: TDH (thermostable direct haemolysin), TRH (TDH- related haemolysin) và TLH (thermolabile haemolysin) được mã hóa bởi ba gen tdh, trh và tlh. Gen toxR mã hóa cho protein điều hòa có vai trò thiết yếu trong việc điều chỉnh sự tồn tại và độc lực của vi khuẩn. 1.1.4. Gen rpoB và tính kháng rifampicin Gen rpoB mã hóa tiểu đơn vị β của enzyme RNA polymerase. Rifampicin có khả năng liên kết với tiểu đơn vị β - protein được mã hóa bởi gen rpoB, gây cản trở sự khởi đầu phiên mã của vi khuẩn. 1.1.5. Kháng nguyên của vi khuẩn V. parahaemolyticus 1.2. Bệnh hoại tử gan thận trên cá biển 1.2.1. Triệu chứng 1.2.2. Chẩn đoán và điều trị 1.3. Vắc-xin và cơ chế miễn dịch chủ động 1.3.1. Vắc-xin và phân loại vắc-xin cho cá 1.3.2. Miễn dịch đặc hiệu ở cá xương 1.3.3. Phương thức đưa vắc-xin vào cơ thể cá 1.4. Nghiên cứu tạo vi khuẩn giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh cho cá 1.4.1. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng tác nhân vật lý 1.4.2. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng tác nhân hóa học 1.4.3. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng kĩ thuật gen 1.5. Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận do cho cá 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 1.5.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Những nghiên cứu tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận trên cá do vi khuẩn V. parahaemolyticus gây ra hiện nay đang tập trung vào hướng tạo vắc-xin bất hoạt, vắc- xin tái tổ hợp với sản phẩm là các protein màng ngoài, vắc-xin DNA. Tuy nhiên, vắc-xin thương mại được cấp phép sử dụng cho cá trong phòng chống V. parahaemolyticus đến nay vẫn chưa có, kể cả vắc-xin nhược độc phòng bệnh hoại tử gan thận trên cá. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tạo dòng vi khuẩn giảm độc lực và đánh giá tiềm năng của các dòng tạo ra nhằm chọn được một vài dòng để sử dụng như một nguyên liệu cho sản xuất vắc-xin nhược độc phòng chống vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh cho cá biển.
5 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Cá bệnh Cá biển (cá mú, cá hồng, cá chẽm, cá giò) có các triệu chứng mắc bệnh hoại tử gan thận thu thập ở vùng nuôi trồng thủy sản ven biển quanh đảo Cát Bà, khu vực vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng); vùng biển Đồng Châu (Thái Bình); vùng biển Hải Thịnh (Nam Định). Các mẫu được sử dụng để phân lập vi khuẩn trong 24 giờ kể từ thời điểm thu thập mẫu. 2.1.2. Cá thí nghiệm Cá ngựa vằn (Danio rerio) dài 3 - 3,5 cm và cá rô phi (Oreochromis niloticus) dài 6 - 6,5 cm do Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I (Từ Sơn, Bắc Ninh) cung cấp. Cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) dài 5,5 - 6 cm do Trung tâm Giống thủy sản (Hải Phòng) cung cấp. 2.1.3. Vi khuẩn Chủng V. parahaemolyticus VTCC 12233 được cung cấp từ Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội được sử dụng làm chủng đối chứng. 2.1.4. Hóa chất 2.1.5. Thiết bị 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ các bước thực hiện chính Cá biển nuôi lồng có biểu hiện đặc trưng của bệnh hoại tử gan thận Gây nhiễm vi khuẩn lại Phân lập cho cá mú chấm cam Các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập Xử lý rifampicin tử 5 μg/ml đến 250 μg/ml Các dòng vi khuẩn V. parahaemolyticus kháng rifampicin Đánh giá, chọn lọc Các dòng vi khuẩn V. parahaemolyticus giảm độc lực Chọn lọc chủng tiềm năng Đánh giá tính ổn định, khả năng tạo đáp ứng miễn dịch của chủng vi khuẩn giảm độc lực tiềm năng Hình 2.1. Sơ đồ các bước thực hiện chính 2.2.2. Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Vibrio từ cá nghi mắc bệnh Gan, thận, da, vây của cá nghi bị bệnh hoại tử gan thận được nghiền nhỏ trong dung dịch nước muối 1,5%, pha loãng dung dịch này, cấy trải đều lên bề mặt môi trường TCBS. Chọn lọc những khuẩn lạc có hình thái: tròn, bóng, lồi, có màu xanh đậm.
6 2.2.3. Phương pháp giữ giống chủng vi khuẩn 2.2.4. Phương pháp nhuộm Gram 2.2.5. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn 2.2.6. Phương pháp đánh giá đặc điểm hóa sinh, đặc tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn (a) Đánh giá đặc điểm sinh hóa: khả năng lên men, sinh khí, sinh H2S, sinh indol, sinh catalase, khả năng di động và khả năng gây dung huyết. (b) Xác định tính kháng kháng sinh: với kháng sinh ampicillin (25 µg), gentamycin (30 µg), norfloxacin (10 µg), enrofloxacin (5 µg) và erythromycin (15 µg). 2.2.7. Phương pháp đánh giá độc lực của vi khuẩn Cá mú chấm cam được tiêm gây nhiễm các chủng V. parahaemolyticus phân lập. Xác định tỉ lệ sống sót của cá sau 14 ngày. 2.2.8. Phương pháp xử lý vi khuẩn với rifampicin Nuôi cấy liên tục chủng vi khuẩn dại, gây bệnh trên môi trường chứa rifampicin với nồng độ tăng dần từ 10 đến 250 µg/ml. Chọn lọc các dòng vi khuẩn kháng rifampicin. 2.2.9. Phương pháp đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn kháng rifampicin (a) Tỉ lệ sống sót của cá sau gây nhiễm chủng/dòng vi khuẩn Các dòng vi khuẩn kháng rifampicin chọn lọc được đánh giá về độc lực bằng phương pháp gây nhiễm vi khuẩn trên cá ngựa vằn và cá rô phi. Xác định tỉ lệ sống sót của cá sau gây nhiễm. (b) Giá trị LD50 của chủng/dòng vi khuẩn Phương pháp xác định giá trị LD50 của chủng dại và các dòng vi khuẩn kháng rifampicin được tiến hành trên cá rô phi theo phương pháp của Reed và Muench (1938). 2.2.10. Nhóm phương pháp sinh học phân tử 2.2.10.1. Phương pháp thiết kế mồi Sử dụng phần mềm CLC Genomics Workbench 8.5 (QIAGEN Bioinformatics) để thiết kế các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại các gen độc tố toxR, tdh, trh, tlh của chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus. 2.2.10.2. Phương pháp tách DNA tổng số: DNA tổng được tách bằng kit i-genomic BYF DNA Extraction Mini (iNtRON, Hàn Quốc). 2.2.10.3. Phương pháp PCR khuếch đại gen, giải trình tự gen (a) PCR khuếch đại gen độc tố và rpoB Bảng 2.1: Trình tự và đặc điểm của các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR Gen Tm Kích thước sản Mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) Nguồn đích (℃) phẩm (bp) toxR-4 GTCTTCTGACGCAATCGTTG 54,1 Kim Y.B. &cs (1999) toxR 368 toxR-7 ATACGAGTGGTTGCTGTCATG 55,0 [69] toxR2 ACTCTACCCCCCTAAAAGCA 55,5 toxR 1070 Tự thiết kế toxR4 CTGCCCCAGTACAACCAACC 58,5 tlhF AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG 58,0 Bej A.K. &cs (1999) tlh 450 tlhR GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGCG 56,1 [29] tlh1 TGTCGTGGCCATTTTGCTT 55,7 tlh 1484 Tự thiết kế tlh3 CCGTGATGCCAAAATCAAAA 52,0
7 tdhF GTAAAGGTCTCTGACTTTTGGAC 53,3 Bej A.K. &cs (1999) tdh 269 tdhR TGGAATAGAACCTTCATCTTCACC 54,5 [29] tdh1 ACTGGACTGTGGTTGGT 56,7 tdh 865 Tự thiết kế tdh2 CCTCGAATTACGCAACAA 50,3 trhF TTGGCTTCGATATTTTCAGTATCT 52,2 Bej A.K. &cs (1999) trh 500 trhR TTGGCTTCGATATTTTCAGTATCT 52,8 [29] trh1 TCGCATTTTTTCACCATTCCC 54,2 trh 772 Tự thiết kế trh2 TAAGTTCACGCATTGAG 49,6 Tarr C.L. &cs (2007) 1110F GTAGAAATCTACCGCATGATG 54,1 [145] rpoB 984 Mollet C. & cs (1997) CM32b CGGAACGGCCTGACGTTGCAT 53,3 [105] (b) Phương pháp giải trình tự: Sản phẩm PCR gửi đi giải trình tự tại First BASE Laboratories, Malaysia. 2.2.11. Phương pháp tin sinh: Kết quả giải trình tự gen được phân tích với phần mềm BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast) CLC Genomics Workbench 8.5 Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index) Swiss model (https://swissmodel.expasy.org/interactive). 2.2.12. Phương pháp đánh giá tính ổn định về độc lực và độ an toàn của dòng vi khuẩn giảm độc lực trên cá mú chấm cam (a) Đánh giá tính ổn định của dòng giảm độc lực (b) Đánh giá mức độ an toàn của dòng giảm độc lực 2.2.13. Phương pháp đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của dòng giảm độc lực trên cá mú (a) Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch cho cá Tỉ lệ bảo hộ (RPS) của vắc-xin theo công thức của Amend (1981) [23]: RPS (%) = [1-(% cá được tiêm vắc-xin chết/% cá đối chứng chết)] x 100 (b) Đánh giá độ dài miễn dịch: đánh giá tỉ lệ bảo hộ sau 1, 2, 4, 6 tháng tiêm chủng cho cá 2.2.14. Phương pháp xử lý số liệu. Số liệu được xử lý thống kê trên Excel và phần mềm Stata 2.0. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Phân lập vi khuẩn từ mẫu cá biển nghi mắc bệnh hoại tử gan thận 3.1.1. Phân lập vi khuẩn Vibrio Phân lập được 26 mẫu vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio từ mẫu cá nghi mắc bệnh hoại tử gan thận. Sau đó, chọn lọc được 11 mẫu vi khuẩn: B3.13; B5M2; B5M3; B5M4; B13M1; B20M2; N9.2; N13.1.1; A3.3; HH3-34; LBT6 có đặc điểm khuẩn lạc của V. parahaemolyticus: màu xanh đậm, mặt bóng và có hình tròn đều, đường kính từ 2 - 3 mm. 3.1.2. Phân tích đặc điểm sinh hóa của các vi khuẩn phân lập Mười một mẫu vi khuẩn phân lập đều có các đặc điểm sinh hóa giống với chủng đối chứng dương V. parahaemolyticus VTCC 12233 và phù hợp với các đặc điểm của V. parahaemolyticus: lên men glucose, không lên men lactose, không sinh H2S, không sinh khí, sinh indol, khả năng di động, sinh catalase, gây tan huyết kiểu β.
8 Tính kháng một số loại kháng sinh của các mẫu phân lập được thể hiện trong bảng 3.3. Tính kháng kháng sinh ở chủng V. parahaemolyticus cũng được nhiều tác giả ghi nhận [167, 182]. Có thể nhận thấy, sử dụng kháng sinh một cách phổ biến và thiếu kiểm soát trong điều trị các bệnh thủy sản đang là một mối lo ngại rất lớn đối với ngành nuôi trong thủy sản. Sử dụng vắc-xin phòng bệnh một cách chủ động cho động vật thủy sản là giải pháp bền vững và rất cần thiết để giảm thiểu tình trạng kháng kháng sinh ở vi khuẩn gây bệnh do sử dụng quá thường xuyên và thiếu hợp lý hiện nay ở các trang trại nuôi thủy sản. Bảng 3.3. Đặc tính kháng 5 loại kháng sinh của 11 vi khuẩn phân lập Tính kháng kháng sinh Chủng STT Erythromycin Gentamycin Norfloxacin Ampicillin Enrofloxacin vi khuẩn (15 µg) (30 µg) (10 µg) (25 µg) (5 µg) 1 B3.13 R I R R R 2 B5M2 R R I R I 3 B5M3 R R S R I 4 B5M4 R R I R S 5 B13M1 R R I R S 6 B20M2 R R R R R 7 N9.2 S S R S R 8 N13.1.1 R R I R R 9 A3.3 I I I R I 10 HH3-34 R R S R R 11 LBT6 R R R R I Ghi chú: S - mẫn cảm; I - nhạy trung bình; R – kháng 3.1.3. Xác định chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus bằng phương pháp phân tử Các mẫu vi khuẩn phân lập (11 mẫu) và mẫu đối chứng dương VTCC 12233 đã được tách DNA tổng số và kiểm tra chất lượng trên gel điện di agarose. Kết quả cho thấy một băng điện di DNA tổng số trên gel agarose gọn và sắc nét (hình 3.6). Kết quả tỉ lệ OD260/OD280 của 12 mẫu DNA tổng số đều nằm trong khoảng 1,8 đến 2,0. Như vậy, những mẫu DNA tổng số này là tinh sạch, đủ tiêu chuẩn để dùng trong các phản ứng PCR. Hình 3.6. DNA tổng số của các mẫu vi khuẩn điện di trên gel agarose 1% Ghi chú: giếng 1-12: VTCC12233; B3.13; B5M2; B5M3; B5M4; B13M1; B20M2; N9.2; N13.1.1; A3.3; HH3-34; LBT6; M: Marker 1kb Gen độc tố toxR và tlh đã được khuếch đại từ DNA tổng số của 11 mẫu vi khuẩn nghiên cứu (hình 3.7; 3.8). Tuy nhiên, sản phẩm PCR với các cặp mồi đặc hiệu của 2 gen độc tố còn lại, tdh và trh, không quan sát thấy trên gel điện di. Có lẽ trong hệ gen của 11 mẫu V. parahaemolyticus phân lập được không mang 2 gen độc tố tdh và trh. Sự không có
9 mặt gen tdh và trh trong hệ gen của V. parahaemolyticus cũng đã được một số nhà khoa học báo cáo [60, 111]. Hình 3.7. Sản phẩm PCR khuếch đại gen toxR của các vi khuẩn với cặp mồi toxR-4, toxR-7 Ghi chú: giếng 1-12: VTCC 12233; B3.13; B5M2; B5M3; B5M4; B13M1; B20M2; N9.2; N13.1.1; A3.3; HH3-34; LBT6; M: Marker 100 bp Hình 3.8. Sản phẩm PCR (~450 bp) khuếch đại gen tlh của các mẫu vi khuẩn với cặp mồi tlhF-tlhR Ghi chú: giếng 1-12: VTCC 12233; B3.13; B5M2; B5M3; B5M4; B13M1; B20M2; N9.2; N13.1.1; A3.3; HH3-34; LBT6; M: Marker 100 bp, M1: Marker 1 kb 3.1.4. Đánh giá khả năng gây bệnh cho cá mú của các mẫu vi khuẩn phân lập Mười một chủng vi khuẩn phân lập được tiêm vào cá mú chấm cam với liều lượng 107 CFU/ml, 100 µl/con. Quan sát các triệu chứng của cá bị mắc bệnh và ghi nhận tỉ lệ sống sót của các cá mú sau 14 ngày tiêm với các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus phân lập cho thấy: 100% cá được gây nhiễm biểu hiện triệu chứng xuất huyết, gốc vây xuất huyết, tuột vẩy, tuột nhớt, loét da, vây cụt, vùng cơ quanh khu vực tiêm gây nhiễm và da đổi màu đậm hơn. Giải phẫu và quan sát các nội quan của cá thấy gan và thận cá bị hoại tử nghiêm trọng. Tỉ lệ sống sót của cá mú sau 14 ngày gây nhiễm (bảng 3.5) dao động từ 2,22% đến 22,22%, trong đó, cá gây nhiễm bằng chủng vi khuẩn B5M3 và N9.2 có tỉ lệ cá sống sót thấp nhất (2,22%) và tỉ lệ sống sót cao nhất ghi nhận ở cá được gây nhiễm chủng vi khuẩn B13M1 (22,22%). Tỉ lệ này ở cá gây nhiễm bằng chủng vi khuẩn LBT6, B3.13, A3.3, B5M2, B5M4 lần lượt tương ứng là là 13,33%; 6,67%; 10%; 18,9%; 18,9%. Tỉ lệ sống sót này 16,67% quan sát thấy ở cá gây nhiễm bằng một trong 3 chủng vi khuẩn B20M2, N13.1.1, HH3-34. Tỉ lệ cá chết cao thường ở tuần đầu tiên, nhất là ở ngày thứ 1 đến ngày
10 thứ 3 sau gây nhiễm. Ở tuần tiếp theo, tỉ lệ cá chết thấp dần và khoảng dao động cũng ít hơn giữa các ngày theo dõi. Kết quả này cũng phù hợp các báo cáo về đặc điểm gây bệnh của V. paraheomolyticus, nó có thể làm cá chết hàng loạt khi ở thể cấp tính hoặc chết rải rác khi cá ở thể thứ cấp tính. Bảng 3.5. Tỉ lệ sống sót của các mú khi gây nhiễm với 11 mẫu vi khuẩn Tỉ lệ sống sót của cá sau ngày gây nhiễm (%) Chủng Ngày 1 Ngày 3 Ngày 5 Ngày 7 Ngày 9 Ngày 11 Ngày 13 Ngày 14 82,22 ± 55,56 ± 28,89 ± 17,78 ± 13,33 ± 14,44 ± 13,33 ± 13,33ab ± LBT6 1,25 0,47 0,47 0,47 0,00 0,47 0,82 0,47 81,11 ± 53,33 ± 35,56 ± 14,44 ± 7,78 ± 6,67 ± 6,67 ± 6,67ab ± B3.13 1,70 1,24 0,47 0,47 0,47 0,00 0,00 0,00 78,89 ± 70,00 ± 48,89 ± 31,11 ± 13,33 ± 11,11 ± 11,11 ± 10,00ab ± A3.3 0,67 0,00 0,47 0,47 0,47 0,47 0,00 0,00 85,56 ± 67,78 ± 45,56 ± 33,33 ± 22,22 ± 20,00 ± 18,89 ± 18,89b ± B5M2 0,47 0,47 0,47 0,00 1,25 0,82 0,47 0,47 55,56 ± 27,78 ± 17,78 ± 8,89 ± 4,44 ± 2,22 ± 2,22 ± 2,22a ± B5M3 0,47 0,82 0,47 0,47 0,00 0,47 0,47 0,47 74,44 ± 47,78 ± 38,89 ± 26,67 ± 20,00 ± 18,89 ± 18,89 ± 18,89b ± B5M4 1,25 0,47 0,94 0,82 0,0 0,47 0,47 0,47 B13M 82,22 ± 55,56 ± 35,56 ± 25,56 ± 24,44 ± 22,22 ± 22,22 ± 22,22b ± 1 0,82 0,47 1,25 0,47 0,47 0,47 0,47 0,47 B20M 71,11 ± 55,56 ± 44,44 ± 30,00 ± 21,11 ± 18,89 ± 16,67 ± 16,67ab ± 2 0,47 2,05 2,05 1,63 0,47 0,47 0,00 0,00 55,56 ± 45,56 ± 35,56 ± 13,33 ± 4,44 ± 2,22 ± 2,22 ± 2,22a ± N9.2 0,47 0,47 0,47 0,82 0,47 0,47 0,47 0,47 N13.1 60,00 ± 48,89 ± 30,00 ± 23,33 ± 18,89 ± 17,78 ± 17,78 ± 16,67ab ± 1 1,41 1,25 0,82 1,41 0,94 0,47 0,47 0,00 HH3- 62,22 ± 48,89 ± 28,89 ± 23,33 ± 21,11 ± 20,00 ± 20,00 ± 20,00b ± 34 0,94 1,25 0,47 0,82 1,63 1,41 1,25 1,41 PBS 100 100 100 100 100 100 100 100c Ghi chú : chữ cái a, b, c thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với p
11 Hình 3.9. Cá mú chết ở ngày thứ 3 sau gây nhiễm chủng LBT6 (A) và ở ngày thứ 9 sau gây nhiễm chủng LBT6 với hiện tượng nội tạng bị tổn thương nghiêm trọng (B) 3.1.5. Phân lập, giải trình tự các gen độc tố toxR, tlh và gen rpoB các chủng vi khuẩn phân lập (a) Xác định trình tự hoàn chỉnh của gen toxR và tlh Gen toxR Sử dụng cặp mồi tự thiết kế toxR2-toxR4, khuếch đại được sản phẩm PCR có kích thước như dự kiến là ~1000 bp (hình 3.10) và gửi giải trình tự tại Malaysia. Số liệu trình tự gen toxR của 3 chủng B3.13; A3.3 và LBT6 đã được phân tích bằng công cụ BLAST. Mức độ tương đồng của các trình tự này với các trình tự gen này của các chủng V. parahaemolyticus công bố trên ngân hàng gen là 99%. Kết quả giải trình tự này một lần nữa cũng cố thêm cho nhận định rằng các chủng vi khuẩn phân lập: B3.13; A3.3 và LBT6 là thuộc loài V. parahaemolyticus và cặp mồi toxR2-toxR4 được thiết kế trong nghiên cứu này là đặc hiệu, khuếch đại chính xác gen toxR. Hình 3.10. Sản phẩm PCR (~1000 bp) khuếch đại gen toxR của các chủng vi khuẩn với cặp mồi toxR2, toxR4 Ghi chú: giếng 1-12: VTCC 12233; B3.13; B5M2; B5M3; B5M4; B13M1; B20M2; N9.2; N13.1.1; A3.3; HH3-34; LBT6; M: Marker 1 kb Phân tích dựa trên hệ gen hoàn chỉnh của vi khuẩn V. parahaemolyticus đã được công bố, nhận thấy trình tự gen hoàn chỉnh của gen này có kích thước 879 bp và sản phẩm có
12 kích thước ~368 bp trong báo cáo trước chỉ là một đoạn trong trình tự hoàn chỉnh của gen toxR. Với cặp mồi toxR2-toxR4 được chúng tôi thiết kế dựa trên trình tự hệ gen đầy đủ đã khuếch đại được sản phẩm PCR với kích thước khoảng ~1000 bp. Hình 3.11 minh họa kết quả so sánh trình tự của các sản phẩm khuếch đại gen toxR với hai cặp mồi khác nhau nêu trên bằng phần mềm CLC Genomics Workbench 8.5. Có thể nhận thấy trình tự gen toxR được khuếch đại với cặp mồi toxR2-toxR4 của chủng BLT6 đã bao phủ vùng trình tự của đoạn gen toxR khuếch đại với cặp mồi toxR-4, toxR-7. Đoạn gen được khuếch đại nhờ cặp mồi toxR-4, toxR-7 tương đồng hoàn toàn với đoạn trình tự nucleotide từ vị trí 453 đến vị trí nucleotide 810 của trình tự gen đầy đủ 879 bp. Hình 3.11. So sánh hai trình tự gen toxR của chủng LBT6 được khuếch đại bởi 2 cặp mồi toxR2- toxR4 (LBT6-toxR-seqA) và toxR-4, toxR-7 (LBT6-toxR-seqB) Chúng tôi cũng tiến hành so sánh các đoạn trình tự thuộc gen toxR được công bố trên NCBI với đoạn trình tự gen toxR của chủng LBT6 được khuếch đại bởi cặp mồi toxR2- toxR4. Mức độ tương đồng giữa trình tự gen toxR của LBT6 với các trình tự nêu trên là rất cao, 99%. Phân tích về chiều dài, độ bao phủ của các đoạn trình tự toxR của LBT6 cũng như 2 chủng còn lại (B3.13; A3.3) với các trình tự gen này trên ngân hàng gen thu được kết quả như minh họa ở hình 3.12. Kết quả so sánh cho chúng tôi kết luận rằng: 879 bp là kích thước đầy đủ của gen toxR hoàn chỉnh, từ mã mở đầu ATG đến mã kết thúc TAA của gen. Các trình tự đoạn gen toxR thu được do khuếch đại PCR đã được các tác giả khác công bố trước đây chỉ là một phần trong gen toxR hoàn chỉnh (hình 3.12). Trình tự gen toxR của chủng A3.3 đã được chúng tôi đăng kí trên Genbank với mã số MH047286. Phân tích trình tự chuỗi polypeptide suy diễn do trình tự gen toxR hoàn chỉnh mã hóa đã cho thấy chuỗi polypeptide suy diễn có kích thước 292 amino acid.
13 Hình 3.12. Sơ đồ minh họa các đoạn trình tự gen toxR của các chủng V. parahaemolyticus trên NCBI với trình tự tương ứng trên gen toxR hoàn chỉnh của chủng phân lập BLT6/A3.3/B3.13 (A) Gen toxR hoàn chỉnh của chủng A3.3/LBT6/B3.13 được khuếch đại bởi cặp mồi toxR2 và toxR4; (B) đoạn gen toxR và toxS của chủng KP34 với mã số DQ845170.1 và các đoạn gen toxR của (C) chủng CECT611 với mã số FM202714.1, (D) chủng ATCC 17802 với mã số GQ228073.1 [154], (E) chủng C1 với mã số JQ929913.1 và chủng A3.3/B3.13/LBT6 được khuếch đại bởi cặp mồi toxR-4, toxR-7. Gen tlh Với cặp mồi tlh1-tlh3, sản phẩm PCR của gen tlh ở 11 chủng vi khuẩn phân lập và chủng VTCC 12233 có kích thước như dự kiến ~1500 bp (hình 3.13). Sản phẩm PCR của 3 chủng B3.13; A3.3 và LBT6 được giải trình tự và phân tích trình tự. Mức độ tương đồng của trình tự gen tlh ở 03 chủng vi khuẩn so với các trình tự tlh của hàng chục chủng V. parahaemolyticus được công bố trên Genbank là 99%. Hình 3.13. Sản phẩm PCR (~1500 bp) khuếch đại gen tlh của các chủng vi khuẩn với cặp mồi tlh1- tlh3 Ghi chú: giếng 1-12: VTCC 12233; B3.13; B5M2; B5M3; B5M4; B13M1; B20M2; N9.2; N13.1.1; A3.3; HH3-34; LBT6; M: Marker 1 kb Phân tích về chiều dài, độ bao phủ của các đoạn trình tự tlh của 3 chủng phân lập với các trình tự gen này trên ngân hàng gen thu được kết quả như minh họa ở hình 3.15. Kết quả so sánh cho chúng tôi kết luận rằng: 1254 bp là kích thước đầy đủ của gen tlh hoàn chỉnh, từ mã mở đầu ATG đến mã kết thúc TAA của gen. Các trình tự đoạn gen tlh do khuếch đại PCR đã được các tác giả khác công bố trước đây chỉ là một phần trong gen tlh hoàn chỉnh (hình 3.15). Trình tự gen tlh của chủng A3.3 đã được chúng tôi đăng kí trên Genbank với mã số MH047289. Phân tích trình tự chuỗi polypeptide suy diễn do trình tự gen tlh hoàn chỉnh mã hóa đã cho thấy chuỗi polypeptide suy diễn có kích thước 417 amino acid.
14 Hình 3.15. Sơ đồ minh họa các đoạn trình tự gen tlh của các chủng V. parahaemolyticus trên NCBI vởi trình tự tương ứng trên gen tlh hoàn chỉnh của chủng phân lập BLT6/A3.3/B3.13 (A) gen tlh hoàn chỉnh của chủng A3.3/LBT6/B3.13 được khuếch đại bởi cặp mồi tlh1-tlh3 và đoạn gen tlh của (B) chủng C1 với mã số JQ929914.1 và chủng A3.3/B3.13/LBT6 khuếch đại bởi cặp mồi tlhF-tlhR (C) chủng VP với mã số AY829372.1 (D) chủng KVp5 với mã số HM195239.1. (b) Xác định trình tự gen rpoB của các chủng vi khuẩn phân lập Gen rpoB mã hóa tiểu đơn vị β của enzyme RNA polymerase có kích thước là 4029 bp. Chúng tôi sử dụng cặp mồi 1110F-CM32b khuếch đại một đoạn trình tự gen rpoB với sản phẩm PCR có kích thước ~984 bp ở 11 chủng vi khuẩn phân lập và chủng VTCC 12233 (hình 3.16). Sản phẩm PCR của 03 chủng vi khuẩn B3.13; A3.3 và LBT6 được giải trình tự và phân tích trình tự và cho kết quả trình tự từ vị trí nucleotide 1121 đến 2050. Hình 3.16. Sản phẩm PCR (~984 bp) gen rpoB của các chủng vi khuẩn với cặp mồi 1110F- CM32b Ghi chú: giếng 1-12: VTCC 12233; B3.13; B5M2; B5M3; B5M4; B13M1; B20M2; N9.2; N13.1.1; A3.3; HH3-34; LBT6; M: Marker 1 kb 3.2. Kết quả tạo dòng vi khuẩn V. parahaemolyticus giảm độc lực 3.2.1. Đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn kháng rifampicin Ba chủng vi khuẩn chọn được: LBT6, A3.3 và B3.13, chúng tôi tạm gọi chúng như là những chủng vi khuẩn dại vì được phân lập từ mô cá bệnh và có độc lực cao, được nuôi cấy và chọn dòng trên các môi trường BHI và TCBS agar có bổ sung nồng độ rifampicin tăng dần 10 µg/ml/lần nuôi cấy. Các dòng vi khuẩn kháng rifampicin được chọn ra từ các khuẩn lạc mọc được trên môi trường TCBS agar có 250 µg/ml rifampicin sẽ được xem là dòng kháng rifarmpicin. Tổng cộng đã chọn lọc được 13 dòng vi khuẩn kháng rifampicin từ 3 chủng vi khuẩn dại nuôi cấy: 3 dòng chọn được từ chủng dại A3.3 (kí hiệu A400, A500 và A650); 06 dòng (L1380, L2100, L3600, L3900, L4200, L4650) từ chủng dại LBT6 và 4 dòng (B7900, B7050, B5700, B5250) từ chủng dại B3.13.
15 (a) Đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn A400, A500, A650 Ba dòng vi khuẩn kháng rifampicin A400, A500, A650 được đánh giá độc lực thông qua thí nghiệm gây nhiễm khuẩn cho cá ngựa vằn và cá rô phi. Đối với cá ngựa vằn, kết quả về tỉ lệ sống sót của cá sau thời gian gây nhiễm được thể hiện tại hình 3.17. Cá ngựa vằn gây nhiễm bị chết do bị xuất huyết trên da và loét ở vị trí gây nhiễm. 100 90 Tỉ lệ sống sót của cá (%) 80 70 60 A3.3 50 A650 40 A500 30 A400 20 PBS 10 0 3 6 9 12 24 48 96 120 Thời gian sau gây nhiễm (giờ) Hình 3.17. Tỉ lệ sống sót của cá ngựa vằn sau gây nhiễm với các dòng vi khuẩn phát sinh từ chủng dại A3.3 Khi tiêm chủng A3.3 và dòng A500 vào cá ngựa vằn, tỉ lệ sống sót của cá giảm mạnh từ trong khoảng thời gian từ 3 giờ đến 24 giờ sau tiêm xuống. Sau 48 giờ tỉ lệ sống sót của cá được gây nhiễm với A3.3 và A500 được ghi nhận là 0%. Có thể nhận thấy dòng A500 không phải dòng giảm độc lực so với chủng dại A3.3. Ngược lại, hai dòng A650 và A400 được đánh giá là dòng giảm độc lực so với chủng dại A3.3. Với dòng vi khuẩn A650, sau tiêm 3 giờ tỉ lệ cá sống sót là 94,44%, giảm xuống 77,78% sau 24 giờ, từ 24 giờ đến 120 giờ sau tiêm không thấy hiện tượng cá chết. Dòng A400 cũng được ghi nhận là giảm độc lực so với chủng dại A3.3, tuy nhiên, độc lực của nó vẫn cao hơn dòng A650 vì tỉ lệ cá sống sót sau 120 giờ chỉ đạt 60%. Ở cá rô phi thí nghiệm, tỉ lệ sống sót của cá khi được gây nhiễm với A650 và A400 sau 14 ngày tương ứng lần lượt là 80% và 63,33% (hình 3.19). Tỉ lệ này ở cá được gây nhiễm bằng chủng vi khuẩn dại A3.3 và dòng A500 tại thời điểm 14 ngày sau tiêm là 10%. Cá rô phi bị bệnh sau khi bị lở loét ở vùng gây nhiễm, cụt vây, cụt đuôi và hoại tử các cơ quan như thận, gan. Tỉ lệ sống sót ở cá rô phi đối chứng được tiêm dung dịch PBS đều cho tỉ lệ sống sót là 100%. Kết quả này cho thấy dòng vi khuẩn A650 và A400 là những dòng giảm độc lực, trong đó dòng A650 là dòng giảm độc lực nhiều hơn. Từ kết quả thí nghiệm với cả cá ngựa vằn và cá rô phi có thể kết luận rằng các dòng vi khuẩn A650 và A400 phát sinh từ chủng vi khuẩn dại A3.3 là những dòng giảm độc lực, trong đó dòng A650 giảm độc lực hơn. Riêng với dòng A500 còn độc tính khá cao, gần tương đương với chủng dại A3.3.
16 100 90 80 Tỷ lệ sống sót của cá (%) 70 60 A3.3 50 A400 40 A500 A650 30 PBS 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Thời gian sau gây nhiễm (ngày) Hình 3.19. Tỉ lệ sống sót của rô phi sau gây nhiễm với các dòng vi khuẩn phát sinh từ chủng dại A3.3 Giá trị LD50 của chủng dại A3.3; dòng A650, A500, A400 tương ứng lần lượt là 104,03; 108,12; 104,06 và 107,32 CFU/ml. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu về tỉ lệ sống sót của cá sau khi lây nhiễm cùng nồng độ giữa các chủng. Thí nghiệm đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn trong nghiên cứu này đã cho kết quả tương tự nhau cả trong thí nghiệm với cá ngựa vằn và cá rô phi. Vì vậy, có thể nói được rằng cá rô phi - loài thủy sản nuôi là một đối tượng mô hình tiềm năng cho các nghiên cứu độc lực của V. parahaemolyticus. Cá ngựa vằn có kích thước nhỏ, do đó những thao tác gây nhiễm bằng phương pháp tiêm vi khuẩn vào phúc mạc dưới da của cá khá khó khăn. Sử dụng cá biển như cá mú với số lượng lớn cho thí nghiệm nghiên cứu đánh giá độc lực của nhiều dòng vi khuẩn Vibrio chọn lọc trong điều kiện phòng thí nghiệm là ít khả thi. Từ đó, trong các thí nghiệm tiếp theo về đánh giá độc lực của các chủng/dòng vi khuẩn chúng tôi lựa chọn tiến hành đánh giá trên đối tượng cá rô phi mà không tiến hành trên đối tượng cá ngựa vằn. (b) Đánh giá độc lực của vi khuẩn L1380, L2100, L3600, L3900, L4200, L4650 Theo số liệu tại hình 3.21, tỉ lệ sống sót của cá rô phi gây nhiễm dòng L4650 được đánh giá là cao nhất (85,56%). Tỉ lệ này ở cá được tiêm với dòng vi khuẩn L4200, L3900, L3600 lần lượt là 62,22%; 54,44% và 17,78% và chúng khác biệt có ý nghĩa (p
17 100 90 80 Tỉ lệ sống sót của cá (%) 70 LBT6 L1380 60 L2100 50 L3600 40 L4200 30 L3900 L4650 20 PBS 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Thời gian sau gây nhiễm (ngày) Hình 3.21. Tỉ lệ sống sót của rô phi sau gây nhiễm với các dòng vi khuẩn phát sinh từ chủng dại LBT6 Giá trị LD50 của các dòng vi khuẩn L4650, L4200, L3900, L3600, L2100, L1380 có giá trị lần lượt như sau 108,15; 108,09; 107,22; 105,03; 104,03 và 104,06 trong khi chủng dại LBT6 có giá trị 104,09. Kết quả này kết hợp với kết quả về tỉ lệ sống sót của cá sau khi gây nhiễm cùng nồng độ giữa các chủng nhận thấy: dòng L3600, L3900, L4200, L4650 là những dòng giảm độc lực trong khi dòng L1380 và L2100 không thay đổi về độc lực so với chủng dại. Trong đó, dòng L4200 và L4650 là những dòng được đánh giá là có độc lực giảm mạnh nhất so với chủng dại. Dòng L3600 có giảm độc lực nhưng không nhiều so với chủng dại, do đó, không được sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo. (c) Đánh giá độc lực của vi khuẩn B5250, B7050, B7900 và B5700 Bốn dòng vi khuẩn kháng rifampicin B5250, B7050, B7900 và B5700 được phát sinh từ chủng dại B3.13. Các dòng vi khuẩn này được tiêm vào cá rô phi với cùng nồng độ. Tỉ lệ sống sót của cá sau 14 ngày được tiêm với các dòng vi khuẩn B7050, B7900 và B5700 có giá trị lần lượt là 46,67%; 35,56% và 32,22% (hình 3.22). Trong khi, tỉ lệ sống sót của cá được tiêm với chủng dại B3.13 và dòng B5250 rất thấp, chỉ đạt 6,67% và 7,78%. Dòng B7900; B7050; B5700; B5250 có giá trị LD50 trên cá rô phi lần lượt tương ứng là 106,18; 106,25; 105,06; 104,06 CFU/ml; trong khi, giá trị LD50 của chủng dại B3.13 là 104,03. Kết quả này khẳng định một lần nữa rằng ba dòng vi khuẩn B7050, B7900 và B5700 là dòng giảm độc lực, được tuyển chọn sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.