Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá (Nicotiana Benthamiana) thông qua vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:50

Thêm vào BST

Báo xấu

44
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án nghiên cứu với mục tiêu tìm hiểu biểu hiện và xác định được đặc điểm cấu trúc của kháng nguyên HA trimeric và phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND. Đánh giá được hoạt tính sinh học, khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch trên động vật thí nghiệm của kháng nguyên tái tổ hợp HA trimeric và phức hệ HA trimeric:ND.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá (Nicotiana Benthamiana) thông qua vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÊ THỊ THỦY NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS GÂY BỆNH CÚM A/H7N9 BẰNG PHƯƠNG PHÁP BIỂU HIỆN TẠM THỜI TRONG CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana benthamiana) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Sinh lý thực vật Mã số: 9 42 01 12 LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC
Hà Nội, 2019
Công trình được hoàn thành tại Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS Phạm Bích Ngọc 2. PGS.TS Chu Hoàng Hà Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án Tiến sĩ phiên chính thức họp tại: Viện Công nghệ sinh học Vào hồi giờ ngày tháng năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc Gia Việt Nam Trang web: http: luanvan.moet.gov.vn Viện Công nghệ sinh học
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cúm A/H7N9 là chủng virus cúm gia cầm mới được phát hiện tại Trung Quốc vào năm 2013. Virus cúm A/H7N9 gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan nhanh với tỷ lệ gây chết cao trong đàn gia cầm bị bệnh. Virus cúm A/H7N9 là một phân type trong nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, có protein Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) trên bề mặt capsid của hạt virus mang tính kháng nguyên tham gia quá trình đáp ứng miễn dịch. Kháng nguyên HA có 16 type (ký hiệu từ H1 đến H16) và kháng nguyên NA có 9 type (ký hiệu từ N1 đến N9). Kháng nguyên HA được mã hóa bởi phân đoạn 4 của hệ gen virus cúm A, có đặc tính kết hợp với thụ thể đặc hiệu trên bề mặt màng của tế bào nhiễm. HA có khả năng đột biến trong gen tạo nên sự khác biệt làm thay đổi tính kháng nguyên, đặc biệt là điểm cắt của enzym protease ở vị trí có sự glycosyl hóa đã được xác định bao gồm Asn30, Asn46, Asn249 trên tiểu phần HA1 và Asn421, Asn493 trên tiểu phần HA2. Cả 5 vị trí này đều có tính bảo thủ cao trên kháng nguyên H7 của các chủng virus H7N9 gây bệnh trên người và gia cầm chuỗi nối giữa HA1 và HA), hoặc tái tổ hợp biến chủng làm thay đổi kháng nguyên bề mặt dẫn đến sự thay đổi tương quan đáp ứng miễn dịch. Kháng nguyên NA do phân đoạn 6 mã hóa, đây là một protein bề mặt làm nhiệm vụ enzym phân giải thụ thể tế bào và cắt liên kết glycosid của phân tử acid sialic (Nacetylneuramic acid) giải phóng virus trong quá trình lây nhiễm. Kháng nguyên NA do phân đoạn 6 mã hóa, đây là một protein bề mặt làm nhiệm vụ enzym phân giải thụ thể tế bào và cắt liên kết glycosid của phân tử acid sialic (Nacetylneuramic acid) giải phóng virus trong quá trình lây nhiễm. Trong đợt dịch cúm đầu tiên từ ngày 31/03/2013 có ba trường hợp nhiễm virus cúm gia cầm A/H7N9 trên người được phát hiện và công bố tại Thượng Hải và An Huy, Trung Quốc. Chỉ trong một thời gian ngắn, tính đến ngày 09/06/2013 loại virus nguy hiểm này đã lây lan ra 11 tỉnh thành của Trung Quốc, gây ra 131 trường hợp nhiễm bệnh, đa phần bị suy hô hấp nặng, trong đó 39 người đã tử vong (WHO, 2013). Trong đợt dịch cúm A/ H7N9 thứ 5 trên người tại Trung Quốc diễn ra từ 19/1/2017 đến 14/2/2017 đã khiến 36 người chết trên tổng số 304 người mắc bệnh (WHO, 2017). Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) nhận định đây là một tỷ lệ cao bất thường cho một sự lây nhiễm mới và xác định H7N9 là chủng virus rất nguy hiểm đối với con người. Các nghiên cứu về hệ gen, xác định các vùng biến đổi của virus cúm A/H7N9 đã cho thấy virus A/H7N9 tỏ ra thích ứng nhanh hơn và có độc lực cao hơn với tế bào của loài có vú (người, heo, ...) so với các chủng virus cúm gia cầm khác. Cho đến nay chưa có bằng chứng nào về việc virus cúm A/H7N9 lây truyền từ người sang người yếu tố cơ bản để A/H7N9 có thể biến chuyển thành một đại dịch cúm. Tuy nhiên, vì sự lan truyền giữa người và người đã từng xảy ra với virus H7 (dịch H7N7 ở Hà Lan năm 2003) nên cũng cần phải cảnh giác về khả năng lây truyền ngườingười của virus H7N9 hiện nay. Ở Việt Nam chưa ghi nhận trường hợp cúm A/H7N9 trên người cũng như trên gia cầm; tuy nhiên, nguy cơ xâm nhập, lan truyền và gây bùng phát dịch rất cao do Việt Nam có đường biên giới trải dài với Trung Quốc. Vấn đề cấp bách hiện nay ngoài việc triển khai các biện pháp phòng bệnh chủ động như sử dung trang thiêt bi cho viêc giám sát nh ̣ ́ ̣ ̣ ư máy đo thân nhiêṭ từ xa, các hê thông xét nghiêm xác đinh virus… c ̣ ́ ̣ ̣ ần thiết nghiên cứu chủ động sản xuất vacxin phòng bệnh. Trong những năm gần đây một hướng mới đã được ứng dụng để phát triển cac loai vacxin ́ ̣ cúm khac nhau, trong đó có h ́ ướng nghiên cứu tạo vacxin thực vật. Hệ thống biểu hiện ở thực vật rất hữu dụng vì vacxin được tạo ra hứa hẹn sẽ có giá thành thấp hơn từ 1020 lần so với phương pháp truyền thống. Tuy nhiên, protein tái tổ hợp được tích luỹ trong cây trồng chuyển gen lại không cao và thiếu một phương thức tinh sạch protein tái tổ hợp hiệu quả. Để khắc phục nhược điểm 1
này, hiện nay hệ thống biểu hiện tạm thời là phương pháp hữu ích để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp ở thực vật. Phương pháp này có ưu điểm nhanh, hàm lượng protein tái tổ hợp cao, không bị ảnh hưởng bởi vị trí gắn gen đích trong tế bào thực vật và có thể tiến hành biểu hiện trong các mô đã biệt hóa hoàn toàn như lá. Nhận thấy việc nghiên cứu biểu hiện các kháng nguyên của virus cúm A/H7N9 trong tế bào thực vật là rất cấp thiết. Hơn nữa mô hình sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp bằng phương pháp biểu hiện tạm thời ở thực vật có thể sản xuất vacxin với số lượng lớn và nhanh chóng (12 tháng) đáp ứng kịp thời khi dịch bệnh xảy ra. Việc kết hợp kháng nguyên tái tổ hợp với vật liệu nano (ND) nhằm sản xuất vacxin dạng như virus nhằm tăng cường hoạt tính kháng nguyên. Với cơ sở khoa học và ứng dụng như trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “ Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh cúm A/H7N9 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trong cây thuốc lá (Nicotiana benthamiana.) thông qua vi khuẩn Agrobacterium”. 2. Mục tiêu nghiên cứu  Biểu hiện và xác định được đặc điểm cấu trúc của kháng nguyên HA trimeric và phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND  Đánh giá được hoạt tính sinh học, khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch trên động vật thí nghiệm của kháng nguyên tái tổ hợp HA trimeric và phức hệ HA trimeric:ND 3. Nội dung nghiên cứu (1):Thu thập thông tin, tổng hợp gen mã hóa kháng nguyên và thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa kháng nguyên HA; (2) :Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên HA của virus H7N9 ở thuốc lá ;(3): Nghiên cứu tạo phức hệ và khả năng gây ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên HA và HA trimeric:ND (1:12); (4): Nghiên cứu khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA và phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND trên động vật thí nghiệm. 4. Đóng góp mới của luận án Đã thiết kế thành công 4 cấu trúc vector biểu hiện pCB301/HA mono_ELP pCB301/HA trimeric_ELP, pCB301/HA trimeric và pCB301/HA trimericIgMFc mang gen HA được tổng hợp nhân tạo từ gen HA của chủng virus cúm H7N9 và tạo chủng Agrobacterium mang vector tương ứng. Biểu hiện và tinh sạch thành công protein HA tái tổ hợp pCB301/HA mono_ELP, pCB301/HA trimeric_ELP, pCB301/HA trimeric và pCB301/HA trimericIgMFc trong cây thuốc lá bằng phương pháp mITC và IMAC. Đã xác định được cấu trúc trimeric của kháng nguyên HA và khả năng gây ngưng kết hồng cầu của protein HA với hiệu giá ngưng kết của HA trimeric_ELP và HA trimeric bằng 2 HAU, HA trimeric:ND (1:12) bằng 1024 HAU với lượng 5 µg tại giếng đầu tiên. Các kháng nguyên HA dạng HA trimeric và HAtrimeric:ND (1:12) đều gây đáp ứng miễn dịch ở chuột trong đó HA trimeric:ND (1:12) kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh hơn HA trimeric. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 5.1. Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp cơ sở khoa học quan trọng trong việc thiết kế các cấu trúc vector chuyển gen mang gen HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimericIgMFc mã hóa cho các kháng nguyên HA tái tổ hợp; biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp trên cây thuốc lá bằng phương pháp biểu hiện tạm thời; tách chiết, tinh sạch và đánh giá khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể của các kháng nguyên tái tổ hợp này trên động vật thí nghiệm. Kết quả đề tài luận án là bằng chứng khoa học về tiềm năng của việc sản xuất, phát triển vacxin tiểu đơn vị phòng virus cúm trong thực vật. 5.2. Ý nghĩa thực tiễn 2
Các cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen HA mã hóa các kháng nguyên tái tổ hợp HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimericIgMFc của chủng virus cúm đang lưu hành tai Trung Quốc và các chủng A. tumefaciens mang các vector này có thể được sử dụng để nghiên cứu biểu hiện, sản xuất và phát triển vacxin tiểu đơn vị phòng virus cúm. Quy trình biểu hiện gen HA trên lá cây thuốc lá bằng phương pháp biểu hiện tạm thời với các điều kiện tối ưu của đề tài luận án có thể ứng dụng để sản xuất các kháng nguyên tái tổ hợp HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric và HA trimericIgMFc hoặc các protein tái tổ hợp khác. Kháng nguyên tái tổ hợp HA trimeric : ND được tạo ra trong đề tài luận án là ứng viên tiềm năng cho sản xuất vacxin tiểu đơn vị phòng bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam. CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án đã tham khảo và tổng kết 19 tài liệu trong nước, 140 tài liệu nước ngoài với các nội dung liên quan bao gồm: (1) Đặc điểm cấu trúc của virus cúm A/ H7N9 như: nguồn gốc virus cúm A/H7N9, đặc điểm cấu trúc virus cúm A/H7N9, đa hợp tạo nên phân type A/H7N9, đặc điểm kháng nguyên bề mặt của virus cúm A/H7N9, tình hình dịch cúm A/H7N9; (2) Vacxin phòng chống bệnh cúm A như: Một số loại vacxin phòng bệnh cúm A hiện nay, vacxin tái tổ hợp từ thực vật, các nghiên cứu về vacxin cúm A/H7N9 trên thế giới, một số nghiên cứu vacxin cúm gia cầm ở Việt Nam hiện nay; (3) Biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp ở thực vật như: Hệ thống biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp ở thực vât, quá trình biểu hiện tạm thời thông qua Agrobacterium tumefaciens, các chiến lược tăng cường biểu hiện protein tái tổ hơp ở thực vật, sản xuất protein tái tổ hợp bằng phương pháp biểu hiện tạm thời, tinh sạch protein tái tổ hợp ở thực vật; (4) Nano kim cương (NDs) và những ứng dụng tiềm năng trong công nghệ sinh học như: giới thiệu chung về vật liệu nano kim cương, Ứng dụng của Nanodiamons trong khoa học sự sống và công nghệ sinh học. Với các tài liệu thu thập được cũng như kết quả phân tích cho thấy chủng virus cúm H7N9 trước đây đã từng xuất hiện nhưng chỉ gây ra dịch bệnh trên chim tại Hà Lan, Nhật Bản và Hoa Kỳ. Ba trường hợp nhiễm virus cúm gia cầm A/H7N9 đầu tiên trên người được phát hiện và công bố tại Thượng Hải và An Huy, Trung Quốc vào ngày 31/03/2013 (WHO, 2013). Đặc biệt, sự bùng phát dịch cúm H7N9 trên người gần đây nhất được ghi nhận tại Trung Quốc diễn ra từ 19/1/2017 đến 14/2/2017 được xem là đợt dịch thứ 5 đã khiến 36 người chết trên tổng số 304 người mắc bệnh (WHO, 2017). Dữ liệu theo dõi về mặt virus học đã phân tích trình tự genome của 83 chủng phân lập từ môi trường (2 trường hợp) và người bệnh (81 trường hợp) cho thấy các chủng gây bệnh trên người vẫn tương tự những chủng đã được phân tích năm 2013. Phân tích hiện đang được tiến hành để xác định xem các virus vacxin hiện có liên quan kháng nguyên với virus ở đợt dịch thứ năm hay không. Theo Tổ chức Y tế thế giới không loại trừ khả năng cúm gia cầm A/H7N9 lây từ người sang người trong những ổ dịch mới đây tại Trung Quốc. Mặc dù, cho đến nay chưa có bằng chứng nào về việc virus cúm A/H7N9 lây truyền từ người sang người yếu tố cơ bản để H7N9 có thể biến chuyển thành một đại dịch cúm. Tuy nhiên, vì sự lan truyền giữa người và người đã từng xảy ra với virus H7 (dịch H7N7 ở Hà Lan năm 2003) nên cũng cần phải cảnh giác về khả năng lây truyền ngườingười của virus H7N9 hiện nay. Điều này gây ra nhiều khó khắn cho việc nghiên cứu sản xuất vacxin phòng chống virus cúm A. Các vacxin được sản xuất từ các chủng virus dòng châu Âu và dòng Bắc Mỹ dưới hai dạng chủ yếu là vaccine sống – nhược độc và vacxin vô hoạt. Vacxin vô hoạt thường an toàn, có khả năng phòng ngừa các triệu 3
chứng lâm sang nhưng hiệu quả bảo hộ không cao. Vacxin nhược độc tạo ra miễn dịch nhược độc tốt hơn với các chủng tương đồng nhưng mức bảo hộ có thể giảm dần do giảm mức tương đồng với các chủng mới, có nguy cơ phát triển độc tính trở lại, bản thân của virus vacxin sau nhiều lần truyền nhiễm có thể đột biết trở thành cường độc. Để nâng cao hiệu quả phòng chống virus cúm A, việc nghiên cứu sản xuất các loại vacxin thế hệ mới có sự bảo hộ cao với các biến chủng mới hiện nay là rất cần thiết. Vacxin tiểu đơn vị được sản xuất trong thực vật phòng chống virus cúm là hướng nghiên cứu mới đã được đánh giá là có triển vọng và ưu điểm như ổn định và bền vững, đảm bảo hoạt tính sinh học, dễ dàng sản xuất với khối lượng lớn, chi phí sản xuất thấp. Protein HA là những protein kháng nguyên mang gen của chủng virus H7N9 được lựa chọn là những ứng viên có tiềm năng để sản xuất vacxin tiểu đơn vị phòng chống virus cúm A. Hiện này có rất nhiều hệ thống biểu hiện protein HA của virus cúm đã được thử nghiệm, trong những hệ thống đó chúng tôi đã sử dụng hệ thống biểu hiện gen tạm thời ở thực vật bằng phương pháp biểu hiện tạm thời nhờ Agrobacterrium là phương pháp để sản xuất kháng nguyên có nhiều ưu điểm đã được chứng minh như: Hàm lượng kháng nguyên cao, thời gian biểu hiện nhanh, không bị ảnh hưởng của vị trí gắn gen đích trong tế bào thực vật và có thể tiến hành biểu hiện trong các mô đã biệt hóa hoàn toàn như mô lá. Với sự hiểu rõ về cấu trúc phân tử hệ gen và tính kháng nguyên của virus cúm A gây bệnh trên gia cầm và các thành tựu đạt được về biểu hiện, sản xuất vacxin tiểu đơn vị trong thực vật phòng chống bệnh cúm là căn cứ để chúng tôi thực hiện đề tài luận án này. CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Chủng vi khuẩn Chủng Escherichia coli DH5α; Chủng A. tumefaciens C58C1; Chủng A. tumefaciens C58C1 mang vector pIBT35SHCPro PVY chứa gen mã hóa protein HcPro PVY. 2.1.2. Các vector và vật liệu thực vật, động vật Vector pUC/HA mang gen mã hóa cho kháng nguyên nhân tạo được tổng hợp bởi công ty SGIDNA của Thụy Điển; Vector tách dòng pBT (Phan và cs., 2005); Vector pRTRA35SHA histagcmyc100xELPKDEL và vector pRTRA35SH5pIIhistagcmycELPKDEL và Vector pRTRA_35S_SP_His_ H5_pII_IgMFc _cmyc_KDEL đã được thiết kế (Phan và cs., 2013); Các vector chuyển gen pCB301Kan (dựa vào pCB301 của Xiang và cs., 1999) và pBT/Hcpro PRSV; Cây thuốc lá N. benthamiana; Chuột bạch chủng BALB/C . 2.1.3. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu Các mồi sử dụng để khuếch đại vùng mang các gen mã hóa H7: cặp mồi nhân gen HA mono_ELP là H7BamHI_F, H7BamHI_R; cặp mồi nhân gen HA trimeric TrH7PspOMI_R, H7BamHI_F và H7BamHI_R; cặp mồi nhân gen HA trimericIgMFc là MBamHItrimer_R, H7BamHI_F; cặp Mồi giải trình tự gen H7 35SSQF và 35STerm. 2.1.4 Hóa chất Kit tách chiết RNA từ thực vật GenElute TM Total RNA Miniprep (Sigma), kit tách chiết plasmid QIAprep Spin Miniprep , kit thôi gel QIAquick Gel Extraction và kit tinh sạch DNA QIAamp DNA mini của hãng QIAGEN, thang DNA 1 Kb, protein (Fermentas), cac loai enzyme hań ̣ ̣ ́ ̉ chê cua Fermentas. Các hoá ch ất khác như: Yeast extract, NaCl, Agarose, Sucrose, Trypton, KCl, Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, Glycerol, CaCl2, Ethanol 70%, nước khử ion; các loại kháng sinh kanamycin, rifamycine, spectinomycin và các hóa chất thông dụng khác của các hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech… Kháng thể kháng cmyc được tổng hợp từ khuẩn bởi phòng thí nghiệm trọng điểmViện Công nghệ sinh học, kháng thể antimouse IgG cộng hợp HRP (Promega USA), kháng nguyên scFv (50 ng/µl) có trình tự cmyc 4
được tổng hợp bởi phòng thí nghiệm trọng điểmViện Công nghệ sinh học, hóa chất hiện màu TMB (3,3’,5,5’ tetramethylbenzidine), DAB (Diaminobenzidine). Kit hiện phim Super Signal West Pico Trial (Thermo Scientific). 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Các phương pháp thiết kế gen, thiết kế vector chuyển gen và tạo chủng A. tumefaciens cho biểu hiện tạm thời. Phân tích và tổng hợp thông tin về trình tự gen HA mã hóa cho kháng nguyên hemagglutinin của virus cúm A/H7N9 đang gây bệnh ở Trung Quốc trên Ngân hàng GenBank. Thu thập thông tin về các bộ mã phổ biến được ưu tiên sử dụng trong bộ máy sản xuất protein của thực vật. Lựa chọn các bộ mã ưu tiên tương thích để cải biến trình tự gen HA sao cho phù hợp với hệ biểu hiện thực vật, đồng thời bổ sung trình tự nhận biết của một số enzyme cắt hạn chế cho mục đích thiết kế vector chuyển gen. Đặt hàng công ty để tổng hợp nhân tạo đoạn gen HA đã đổi mã. Thành phần phản ứng PCR bao gồm : DNA khuôn 50 ng, Mồi xuôi 0,1 µM, Mồi ngược 0,1 µM, dNTPs 0,2 µM, Pfu DNA polymerase 2,5 U, 10X đệm Pfu DNA polymerase 5 µl, Tổng thể tích 50 µl. Chu trình nhiệt như sau: 94oC/3 phút; 30 chu kỳ lặp lại các bước 94oC/30 giây, 58oC/30 giây, 72oC/1 phút 30 giây; 72oC/5 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8% sau đó đưuọc tinh sahj và xử lý với enzyme cắt giới hạn đã được thiết kế để ghép nối vào plasmid pRTRA 35SHistagCmyc100xELP và biến nạp vào E.coli theo phương pháp sốc nhiệt của Sambrook và cộng sự (2012). Khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp đượ c chọn lọc trên môi trườ ng LB đặc bổ sung kháng sinh 50 mg/l kanamycin. Vector tái tổ hợp đượ c tách chiết từ các khuẩn lạc cho kết quả PCR dương tính (ColonyPCR) được giải trình tự, sử dụng các cặp mồi như trình bày trong Bảng 2.1 và phân tích kiểm tra tính chính xác bằng phần mềm BioEdit 7.0 và Lasergen 7 (DNAstarinc, Madison, WI, USA). 2.2.2. Thiết kế cấu trúc vector mang gen HA ph ục vụ chuy ển gen Vector nhân dòng pRTRA tái tổ hợp mang gen mã hóa kháng HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric, HA trimericIgFMc và vector chuyển gen thực vật pCB301 cùng được phân cắt bằng enzyme HindIII. Các sản phẩm cắt từ vector pRTRA bao pCB301 35SHA mono_ELP, pCB301 35SHA trimeric_ELP, pCB301 35SHA trimeric – KDE và pCB301 35S HA trimeric_ELP–KDE và được ghép nối vào khung vector pCB301 sử dụng T4 DNA ligase và được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt (Sambrook và cs., 2012). Việc chọn các dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp được thực hiện trên môi trường LB đặc có chứa 50 mg/l kanamycin và bằng phản ứng ColonyPCR. Các vector tái tổ hợp mang gen đích pCB301 35SHA mono_ELP, pCB301 35SHA trimeric_ELP, pCB301 35S HA trimeric – KDE và pCB301 35SHA trimeric_ELP–KDE, được tách chiết từ các dòng khuẩn lạc dương tính và kiểm tra bằng phản ứng cắt với enzyme giới hạn HindIII và NcoI. Các vector chuyển gen sau đó được biến nạp vào chủng A. tumefaciens C58C1 bằng phương pháp xung điện. Tách chiết và tinh sạch plasmid: Plasmid đượ c tinh sạch theo ph ương pháp của Sambrook và cộng sự (2012). Sử dụng bộ kít do hãng Fermentas cung cấp để tinh sạch plasmid. Phương pháp xử lý AND bằng enzyme cắt giới hạn: Thành phần phản ứng cắt được thực hiện theo sự hướng dẫn của hãng sản xuất bọ Kit sử dụng enzyme. 2.2.3. Các phương pháp trong biểu hiện tạm thời và đánh giá mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp trong lá thuốc lá. 2 . 2 . 5
3 . 1 . C h u ẩ n b ị d ị c h k h u ẩ n Các dòng khuẩn lạc của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58C1 mang vector đích chứa đoạn gen mã hóa protein HA và Agrobacterium tumefaciens C58C1 mang vector chứa gen mã hóa protein HcPro PRSV cũng được nuôi trong 5 ml môi trường YEB có bổ sung 50 µg/ml Rif và 100 µg/ml Spectinomycin (Spec) qua đêm. Sau đó 1 ml dịch nuôi được nuôi tiếp trong 50 ml YEB chứa 50 µg/ml Rif và 100µg/ml Spec qua đêm. Toàn bộ dịch nuôi này được dùng để nuôi chuyển tiếp trong 500 ml YEB bổ sung 50 µg/ml Rif và 100 µg/ml Spec qua đêm. Khuẩn được thu nhận bằng cách ly tâm 4000 v/p trong 10 phút ở 4oC. Cặn khuẩn của 2 chủng được hòa tan trong đệm MES (10 mM MgCl2; 10 mM MES; pH 5,6) tới OD600 = 0,5 để dùng cho biến nạp. Dịch khuẩn có thể dùng riêng rẽ hay trộn với nhau theo tỷ lệ 1:1, tùy theo mục đích của thí nghiệm. 2 . 2 . 3 . 2 . P h ư ơ n g 6
p h á p x â m n h i ễ m k h u ẩ n v à o c â y t h u ố c l á Cây Nicotiana benthamiana từ 48 tuần tuổi được dùng để biến nạp. Trước khi biến nạp, bọc giấy quanh bầu đất sau đó mới úp ngược cây xuống. Toàn bộ lá cây bị nhấn dìm trong bình chứa vi khuẩn bên trong bình hút chân không. Hút chân không ở 27 inches Hg, 2 phút. Xả không khí ra từ từ, mở nắp. Các cây thuốc lá sau khi biến nạp được tiếp tục nuôi và chăm sóc trong buồng sinh trưởng có điều kiện ánh sáng 5.000 – 7.000 Lux, nhiệt độ 25 ± 2oC, độ ẩm 60 70%. 2.2.3.3. Tách chiết protein tổng số Protein tổng số từ mẫu lá được tách bằng dịch chiết: PBS (Phosphatebuffered saline) 0 ,05% Tween theo tỉ lệ 1:2 (Trọng lượng mẫu lá g) : Thể tích dịch chiết ml) và bảo quản 20oC. Hàm lượng protein tổng số được đo ở bước sóng 595 nm theo phương pháp của Bradford năm (1976) với đường chuẩn được dựng bằng BSA (Bovine Serum Albumin) 7
2 . 2 . 3 . 4 . Đ i ệ n d i S D S P A G E v à l a i m i ễ n d ị c h W e s t e r n 8
b l o t Mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp trong mẫu protein tách chiết từ lá xâm nhiễm khuẩn được đánh giá bằng lai miễn dịch Western Blot theo phương pháp của Burnette và cs, 1981. Điện di SDSPAGE: Bản gel được chuẩn bị theo công thức của Laemmli, 1970. Western blot : Sau khi điện di biến tính protein trên gel polyacrylamideSDS, protein được chuyển qua màng bằng máy Pierce G2 Fast Blotter ở chế độ 25 V và 1,3 mA trong 20 phút. Màng chứa kháng nguyên được phủ bằng 5% sữa tách bơ pha trong dung dịch PBS 0,05% Tween trong 5 giờ. Rửa màng bằng dung dịch PBST 3 lần, mỗi lần 5 phút. 9
2.2.4. Tách chiết và tinh sạch protein tái tổ hợp 10
2 . 2 . 4 . 1 . P h ư ơ n g p h á p t i n h s ạ c h p r o t e i n d ự a v à o s ắ 11
c k ý i o n c ố đ ị n h k i m l o ạ i I M A C ( I m m o b i l i z e d M e t a 12
l i o n C h r o m a t o g r a p h y ) Lá thuốc lá biểu hiện protein tái tổ hợp được làm lạnh trong nitơ lỏng và nghiền thành dạng đồng nhất trong máy xay sinh tố. Protein tổng số được tách chiết trong đệm 50 mM Tris (pH 8,0). Dịch chiết được phân tách bằng ly tâm 2 lần (25,000 v/p, 30 phút, 4oC) và được trộn với agarose gắn NiNTA. Hỗn hợp được trộn đều trong 30 phút, 4oC và được đưa vào cột sắc ký. Rửa cột chứa hỗn hợp trên 2 lần với đệm rửa (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 30 mM Imidazole, pH 8,0). 13
2 . 2 . 4 . 2 . P h ư ơ n g p h á p t i n h s ạ c h p r o t e i n g ắ n E L P b ằ 14
n g m I T C ( m e m b r a n e b a s e d I n v e r s e T r a n s i t i o n C y c l 15
i n g ) Nghiền 100 g lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Bổ sung 200 ml TrisHCl 50 mM (pH 8.0) lạnh. Ly tâm 13000 v/p trong 30 phút ở 4oC. Bổ sung NaCl đến nồng độ 2 M. Ly tâm 13000 v/p trong 30 phút ở 4oC. Dung dịch được đưa qua màng polyethersulfone (PES) 0,22 µm ở 4oC để thu dịch chiết trước xử lý. Dịch chiết được làm ấm đến nhiệt độ phòng và lọc qua màng cellulose acetate 0,2 µm sử dụng máy bơm. Rửa màng 2 lần bằng NaCl 2M để loại protein lẫn. Nước MiliporeQ lạnh được chuyển qua màng lọc để thu hồi protein gắn ELP. 16
2.2.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học của protein kháng nguyên tinh sạch 17