Luận án Tiến sĩ ngành Nuôi trồng thủy sản: Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo (Pseudapocryptes elongatus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN THU DUNG

XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY

BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ BỐNG KÈO

(Pseudapocryptes elongatus)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

Cần Thơ, 2016

i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN THU DUNG

XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY

BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ BỐNG KÈO

(Pseudapocryptes elongatus)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN PGS.TS. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

Cần Thơ, 2016

ii

LỜI CẢM TẠ

Để hoàn thành các nội dung cơ bản trong luận văn tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng học hỏi của bản thân, tôi còn nhận được sự giúp đỡ không nhỏ từ nhiều tổ chức, cơ quan và cá nhân.

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và chân thành biết ơn tới Ban Giám hiệu, Ban lãnh đạo Khoa Sau đại học, Ban Chủ nhiệm Khoa Thủy sản, quý thầy, cô Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi học tập, nghiên cứu và nâng cao trình độ trong thời gian qua.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô PGS. TS Đặng Thị Hoàng Oanh đã trực tiếp, hướng dẫn, tận tình dìu dắt và đóng góp ý kiến quý báu để giúp tôi hoàn thành luận văn này.

Xin cảm ơn các cô và các em ở Bộ môn Bệnh học thủy sản đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập cũng như làm đề tài tại Bộ môn. Cám ơn các em học viên Cao học và các em sinh viên lớp Bệnh học thủy sản đã hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.

Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Sở Nông nghiệp & PTNT, Trung tâm Khuyến nông Khuyến ngư Bạc Liêu đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành chương trình học tại Trường Đại học Cần Thơ.

Nhân đây, tôi xin gửi lời cảm ơn tới tất cả bạn bè, các bạn đồng nghiệp những người đã góp ý, chia sẻ chân thành, hỗ trợ và động viên tôi trong suốt thời gian hoàn thành khóa học.

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã tạo mọi điều kiện để tôi vượt qua khó khăn, trở ngại trong suốt quá trình học tập và làm việc.

TÁC GIẢ

i

TÓM TẮT

Bệnh xuất huyết trên cá bống kèo (Pseudapocryptes elongatus) đã gây thiệt hại rất lớn cho người nuôi. Qua kết quả điều tra phỏng vấn trực tiếp 90 hộ nuôi ở Bạc Liêu cho thấy, mật độ nuôi cá bống kèo dao động từ 100 – 150 con/m2, trong suốt thời gian nuôi hầu hết các hộ nuôi không thay nước mà chỉ cấp thêm nước, xử lý hóa chất và vi sinh nhằm cải thiện môi trường nuôi. Cá tập trung bệnh ở giai đoạn 02 tháng tuổi với dấu hiệu bệnh lý là xuất huyết trên thân, tại các vi và hậu môn với tỉ lệ chết cao và trên diện rộng, ảnh hưởng đến năng suất và lợi nhuận của người nuôi.

Kết quả phân lập vi khuẩn sau 6 lần thu mẫu đã thu được 252 khuẩn lạc, tiến hành kiểm tra một số chỉ tiêu sinh hóa cơ bản của vi khuẩn cho thấy vi khuẩn thu được là vi khuẩn Gram (+), hình tròn, không di động, oxidase và catalase âm tính. Sau khi tiến hành định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep và phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA đã xác định vi khuẩn gây bệnh là Streptococcus dysgalactiae. Quy trình PCR sử dụng đoạn mồi STRD-DyI/dys-16S-23S-2 được chuẩn hóa để chẩn đoán nhanh S. dysgalactiae gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo.

Kết quả xác định liều lượng gây chết LD50 của vi khuẩn là 4,25 x 104 CFU/ml. Vi khuẩn S. dysgalactiae gây bệnh trên cá bống kèo nhạy cao với kháng sinh florfenicol và doxycycline. Kết quả điều trị trong phòng thí nghiệm cho thấy khi gây cảm nhiễm cá bống kèo bằng chủng vi khuẩn B1-6T với liều lượng vi khuẩn 4,25 x 104 CFU/cá, sử dụng 02 loại thuốc kháng sinh florfenicol và doxycycline ở liều lượng 20 mg thuốc/kg trọng lượng cá, sau 21 ngày theo dõi cả hai loại kháng sinh trên (ở dạng nguyên liệu và thành phẩm) đều cho tỷ lệ điều trị đạt cao, tỉ lệ sống của cá đạt từ 65,56 % – 71,11 %, giá trị RPS (%) đạt từ 45,27% – 61,16 %.

ii

ABSTRACT

Hemorrhagic disease has caused huge losses in the cultured mudskipper (Pseudapocryptes elongates). Result interviewed 90 farmers in Bac Lieu province showed that the farmers culture mudskipper density from 100-150 fish/m2, almost no change water but they add water in the pond, they use chemical processing and microbiology for improving farming environment. Fish concentrate disease stage 02 months old with clinical signs of hemorrhage in the body, at the fin and anal with a high mortality rate and widespread, affecting the productivity and profitability of farmers.

Results were obtained sampling 252 colonies after 6 times collecting bacteria sample, examined some basic biochemical indicators of bacteria showed that bacterial is Gram (+), cocci, non-motile, oxidase and catalase-negative. After conducting identification of bacteria by API 20 Strep kit and method of 16S rRNA gene sequence analysis has identified the bacteria is Streptococcus dysgalactiae. PCR using primers STRD-DYI/dys-16S-23S-2 is standardized to provide rapid diagnosis pathogenic S. dysgalactiae in hemorrhage mudskipper.

The results determine the LD50 in lethal doses of bacteria is 4.25 x 104 CFU/ml. S. dysgalactiae bacteria were sensitized with florfenicol and doxycycline. The results of treatment in the laboratory showed that when the mudskippers are causing susceptibility by strain B1-6T with dose 4.25 x 104 CFU/fish, use florfenicol and doxycycline in dose 20 mg/kg fish, after 21 days, the result of the experiment showed that two kinds of antibiotics (materials and products) are for reaching higher treatment rates, survival rate is from 65.56% - 71.11%, the value RPS (%) was from 45.27% - 61.16%.

iii

CAM KẾT KẾT QUẢ

Tôi xin cam kết luận án này được hoàn thành dựa trên kết quả nghiên cứu của tôi trong khuôn khổ của đề tài ‟Nghiên cứu bệnh xuất huyết trên cá bống kèo (Pseudapocryptes lanceolatus) nuôi thương phẩm và đề xuất giải pháp phòng, trị” (Mã số: B2013- 16-29) do Bộ Giáo dục và Đào tạo tài trợ. Đề tài có quyền sử dụng kết quả luận án này để phục vụ cho đề tài.

Cần Thơ, ngày tháng năm 2016

Tác giả

Nguyễn Thu Dung

iv

MỤC LỤC

Trang Lời cảm tạ ............................................................................................................... i Tóm tắt ................................................................................................................... ii Abstract ................................................................................................................. iii Cam kết kết quả .................................................................................................... iv Chƣơng I: Giới thiệu ........................................................................................... 1 1.1 Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2 1.2 Phạm vi nghiên cứu ......................................................................................... 2 1.3 Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 2 1.4 Giới hạn nghiên cứu ......................................................................................... 3 1.5 Ý nghĩa nghiên cứu .......................................................................................... 3 1.6 Điểm mới của luận án ...................................................................................... 3 Chƣơng II: Tổng quan tài liệu ............................................................................ 4 2.1 Phân loại cá bống kèo ...................................................................................... 4 2.2 Tình hình nuôi cá bống kèo trên thế giới và trong nước ................................. 4 2.2.1 Tình hình nuôi cá bống kèo trên thế giới ...................................................... 4 2.2.2 Tình hình nuôi cá bống kèo trong nước ........................................................ 5 2.3 Tình hình xuất hiện bệnh trên cá bống kèo...................................................... 5 2.4 Bệnh xuất huyết ở cá........................................................................................ 6 2.4.1 Dấu hiệu bệnh lý ........................................................................................... 6 2.4.2 Đặc điểm mô bệnh học ................................................................................. 6 2.4.3 Đặc điểm huyết học ...................................................................................... 7 2.5 Tổng quan về đặc điểm vi khuẩn gây bệnh trên cá ......................................... 8 2.5.1 Bệnh do vi khuẩn Vibrio ............................................................................... 8 2.5.2 Bệnh do vi khuẩn Pseudomonas ................................................................. 10 2.5.3 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus ................................................................. 11 2.5.4 Bệnh do vi khuẩn Flexibacter ..................................................................... 12 2.5.5 Bệnh do vi khuẩn Aeromonas ..................................................................... 13 2.5.6 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ................................................................. 15 2.6 Tổng quan về bệnh do vi khuẩn Streptococcus trên cá nước lợ, mặn ........... 16 2.6.1 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae........................................................ 17 2.6.2 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae ............................................... 18 2.6.3 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus dysgalactiae ........................................... 19 2.6.4 Cơ chế gây bệnh.......................................................................................... 20 2.6.5 Phương thức lây truyền bệnh trong môi trường nuôi ................................. 20 2.6.6 Phương thức chẩn đoán .............................................................................. 21 2.7 Xác định độc lực của một số chủng vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá ... 21 v

2.8 Chẩn đoán bệnh xuất huyết ở cá .................................................................... 22 2.9 Phòng và trị bệnh xuất huyết ở cá .................................................................. 23 2.9.1 Hóa chất ...................................................................................................... 23 2.9.2 Thuốc kháng sinh ........................................................................................ 23 2.9.3 Vắc xin ........................................................................................................ 25 Chƣơng III: Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................ 27 3.1 Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 27 3.1.1 Dụng cụ ....................................................................................................... 27 3.1.2 Hóa chất ...................................................................................................... 27 3.1.3 Môi trường .................................................................................................. 27 3.1.4 Thuốc kháng sinh ........................................................................................ 28 3.1.5 Địa điểm và thời gian thực hiện .................................................................. 28 3.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 28 3.2.1 Điều tra phỏng vấn ...................................................................................... 28 3.2.2 Phương pháp thu mẫu cá............................................................................. 29 3.2.3 Phương pháp kiểm tra ký sinh trùng ........................................................... 29 3.2.4 Phương pháp phân tích mẫu vi khuẩn ........................................................ 29 3.2.5 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự ................................. 32 3.2.6 Phương pháp mô bệnh học ......................................................................... 33 3.2.7 Phương pháp huyết học .............................................................................. 33 3.2.8 Phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh xuất huyết ........................................ 34 3.2.9 Phương pháp lập kháng sinh đồ .................................................................. 37 3.2.10 Phương pháp bố trí thí nghiệm ................................................................. 38 3.3 Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................. 41 Chƣơng IV: Kết quả và thảo luận .................................................................... 42 4.1 Khảo sát tình hình nuôi cá bống kèo ............................................................. 42 4.1.1 Kỹ thuật nuôi cá bống kèo .......................................................................... 42 4.1.2 Tình hình bệnh trên cá bống kèo nuôi thương phẩm .................................. 49 4.2 Kết quả kiểm tra ký sinh trùng trên cá bống kèo ........................................... 50 4.3 Phân lập và định danh vi khuẩn trên cá bống kèo bệnh xuất huyết .............. 51 4.3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn .......................................................................... 51 4.3.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa vi khuẩn gây bệnh

trên cá bống kèo .......................................................................................... 52 4.3.3 Kết quả định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep .................................... 53 4.3.4 Kết quả định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự ..................... 53 4.4 Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết ở cá bống kèo................... 55 4.4.1 Xác định đặc điểm bệnh học bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ................ 55 4.4.2 Đặc điểm mô bệnh học bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ......................... 58 4.4.3 Đặc điểm huyết học trên cá bống kèo bệnh ................................................ 63 vi

4.5 Phát triển quy trình chẩn đoán bệnh xuất huyết ở cá bống kèo

bằng phương pháp sinh học phân tử ............................................................. 69 4.5.1 Kết quả chiết tách DNA trực tiếp từ mô thận cá ........................................ 69 4.5.2 Kết quả chiết tách DNA vi khuẩn ............................................................... 69 4.5.3 Kết quả khảo sát cặp mồi cho qui trình PCR phát hiện

Streptococcus dysgalactiae ......................................................................... 69

4.5.4 Kiểm tra tính đặc hiệu và độ nhạy của qui trình PCR

phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae .............................................................. 70

4.5.5 Kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình PCR

phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae .............................................................. 71

4.6 Phương pháp điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo

ở qui mô phòng thí nghiệm ........................................................................... 72

4.6.1 Lập kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của

thuốc kháng sinh lên vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ....... 72 4.6.2 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm ................................................................... 77 4.6.3 Kết quả thí nghiệm xác định giá trị LD50 ................................................... 80 4.6.4 Kết quả thí nghiệm điều trị bệnh ở qui mô phòng thí nghiệm .................... 82 Chƣơng 5: Kết luận và đề xuất ......................................................................... 86 5.1 Kết luận .......................................................................................................... 86 5.1.1 Kết quả điều tra ........................................................................................... 86 5.1.2 Kết quả nghiên cứu ..................................................................................... 86 5.2 Đề xuất ........................................................................................................... 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 88 1. Tài liệu tiếng Anh ............................................................................................ 88 2. Tài liệu tiếng Việt .......................................................................................... 100 PHỤ LỤC .......................................................................................................... 106 Phụ lục A: Phiếu điều tra ao nuôi ...................................................................... 106 Phụ lục B: Hóa chất và phương pháp phân tích mẫu......................................... 108 Phụ lục B.1: Phương pháp xác định khả năng tan huyết của vi khuẩn .............. 108 Phụ lục B.2: Phương pháp định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep ............. 108 Phụ lục B.3: Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu của

thuốc kháng sinh .......................................................................... 109 Phụ lục C: Số liệu nghiên cứu ........................................................................... 112 Phụ lục C.1: Kết quả điều tra ............................................................................. 112 Phụ lục C.2: Kết quả thu mẫu và phân lập vi khuẩn ......................................... 121 Phụ lục C.3: Định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep ................................... 141 Phụ lục C.4: Kết quả giải mã gen và định danh vi khuẩn .................................. 142 Phụ lục C.5: Kết quả quan sát mẫu mô cá bống kèo ......................................... 154 Phụ lục C.6: Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm ..................................................... 157 vii

Phụ lục C.7: Kết quả thí nghiệm LD50 ............................................................... 158 Phụ lục C.8: Kết quả thí nghiệm điều trị ........................................................... 160

viii

DANH SÁCH BẢNG

Trang Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hóa của một số loài vi khuẩn Vibrio ............................. 9 Bảng 2.2 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Pseudomonas .............................. 10 Bảng 2.3 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Streptococcus ............................... 12 Bảng 2.4 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Flexibacter ................................... 13 Bảng 2.5 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Aeromonas ................................... 14 Bảng 2.6 Đặc điểm sinh hóa của E. tarda và E. ictaluri ..................................... 15 Bảng 3.1 Thuốc thử và cách đọc kết quả phản ứng test API 20 Strep ................ 32 Bảng 3.2 Đường kính vô trùng của một số kháng sinh ....................................... 38 Bảng 4.1 Kinh nghiệm của người nuôi cá bống kèo ........................................... 42 Bảng 4.2 Diện tích nuôi cá bống kèo ................................................................... 43 Bảng 4.3 Các bước chuẩn bị ao ........................................................................... 45 Bảng 4.4 Mật độ thả giống .................................................................................. 46 Bảng 4.5 Tỷ lệ cá chết ......................................................................................... 50 Bảng 4.6 Cường độ và tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng trên cá bống kèo ................... 51 Bảng 4.7 Số lượng vi khuẩn phân lập từ các cơ quan qua các đợt thu mẫu ........ 52 Bảng 4.8 Kết quả so sánh mức độ tương đồng trình tự vi khuẩn phân lập trên cá

bệnh xuất huyết với vi khuẩn trong ngân hàng dữ liệu gen của NCBI ..... 54 Bảng 4.9 Mật độ hồng cầu ở cá bống kèo khỏe và cá bệnh xuất huyết ............... 65 Bảng 4.10 Số lượng bạch cầu trên cá bống kèo ................................................... 67 Bảng 4.11 Kết quả so sánh các loại bạch cầu ở cá bống kèo .............................. 67 Bảng 4.12 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ .......................................................... 74 Bảng 4.13 Kết quả MIC của 4 dòng vi khuẩn S. dysgalactiae

trên 3 loại kháng sinh FFC, DO và AML ........................................... 77

Bảng 4.14 Tỉ lệ chết của 4 chủng vi khuẩn S. dysgalactiae

ở thí nghiệm cảm nhiễm ..................................................................... 77

Bảng 4.15 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn phân lập

từ cá bống kèo gây cảm nhiễm ........................................................... 79 Bảng 4.16 Kết quả xác định tỉ lệ gây chết của hai chủng B1-6T và B2-5G ........ 81 Bảng 4.17 Tỷ lệ sống (%) của cá ở thí nghiệm điều trị ....................................... 84

ix

DANH SÁCH HÌNH

Trang Hình 2.1 Cá bống kèo ............................................................................................ 4 Hình 4.1 Tần suất cho ăn ..................................................................................... 47 Hình 4.2 Tình hình sử dụng kháng sinh trong nuôi cá bống kèo ở Bạc Liêu ...... 48 Hình 4.3 Cá bống kèo bị bệnh ............................................................................. 49 Hình 4.4 Tỷ lệ xuất hiện bệnh trong ao nuôi cá bống kèo thương phẩm ............ 49 Hình 4.5 Hình dạng vi khuẩn Gram (+) hình liên cầu (100X) ............................ 52 Hình 4.6 Kết quả kiểm tra tan huyết và khả năng phát triển

trong môi trường TSB (+6,5%NaCl) ...................................................... 53 Hình 4.7 Kết quả test API 20Strep 02 chủng vi khuẩn B1-6T và B2-5G ........... 53 Hình 4.8 Dấu hiệu bệnh lý bên ngoài của cá bống kèo bệnh xuất huyết ............. 56 Hình 4.9 Dấu hiệu bệnh lý bên trong của cá bống kèo bệnh xuất huyết ............. 56 Hình 4.10 Mẫu thận cá bống kèo phết kính (Wright & Giemsa, 100X) ............. 58 Hình 4.11 Mô mang cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X) ..................... 59 Hình 4.12 Mô thận cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X) ....................... 61 Hình 4.13 Mô gan cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X) ........................ 63 Hình 4.14 Hình dạng tế bào máu ở cá bống kèo (100X) ..................................... 64 Hình 4.15 Máu cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (100X) ..................................... 64 Hình 4.16 Các loại bạch cầu (100X) ................................................................... 66 Hình 4.17 Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện Streptococcus dysgalactiae

bằng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 .......................................... 69 Hình 4.18 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra tính đặc hiệu của qui trình .. 70 Hình 4.19 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra độ nhạy của qui trình .......... 71 Hình 4.20 Kết quả PCR 10 chủng vi khuẩn......................................................... 71 Hình 4.21 Kết quả PCR từ mẫu thận cá bống kèo bệnh xuất huyết .................... 72 Hình 4.22 Kết quả tách ròng và nhuộm gram các chủng vi khuẩn sử dụng trong

thí nghiệm kháng sinh đồ ................................................................... 73 Hình 4.23 Kết quả kháng sinh đồ với vi khuẩn S. dysgalactiae .......................... 73 Hình 4.24 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm ........................................................... 78 Hình 4.25 Kết quả PCR 4 chủng vi khuẩn........................................................... 80 Hình 4.26 Kết quả thí nghiệm LD50 của vi khuẩn B1-6T và B2-5G ................... 81 Hình 4.27 Dấu hiệu bệnh lý của cá trong thí nghiệm điều trị .............................. 82 Hình 4.28 Kết quả định danh chủng vi khuẩn tái phân lập

từ thí nghiệm điều trị .......................................................................... 83 Hình 4.29 Tỷ lệ sống của cá ở thí nghiệm điều trị............................................... 84

x

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ĐBSCL

Đồng Bằng Sông Cửu Long

Sở NN&PTNT Sở Nông nghiệp và phát triển nông thôn

National Center for Biotechnology Information

NCBI

TSA

Tryptic Soy Agar

TSB

Tryptic Soy Broth

NB

Nutrient Broth

NA

Nutrient Agar

TCBS

Thiosulphate Citrate Bile Salt Agar

BHIA

Brain Heart Infusion Agar

MHA

Mueller Hinton Agar

TH-CR

Todd Hewitt – Congo Red

Lethal Dose 50

LD50 RPS

Relative Percent Survival

O/F

Oxidation – Fermentation

PCR

Polymerase Chain Reaction

dNTPs

Deoxynucleoside Triphosphates

EDTA

Ethylendiamin Tetraacetic Acid

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

DNA

Deoxyribonucleic Acid

GCS

Group C Streptococci

GLS

Group L Streptococci

GCSD

Group C Streptococcus dysgalactiae

MIC

Minimum Inhibitory Concentration

N

Neomycin

FFC

Florfenicol

CIP

Cirprofloxacin

GM

Gentamicin

DO

Doxycycline

CZ

Cefazolin

AMP

Ampicillin

AML

Amoxicillin

xi

Trimethoprim + sulfamethoxazole

SXT

TE

Tetracycline

NOR

Norfloxacin

ENR

Enrofloxacin

RBC

Red Blood Cell

NT

Nghiệm thức

BC

Bạch cầu

xii

Chƣơng I: GIỚI THIỆU

Cá bống kèo (Pseudapocryptes elongates) là một loài cá bản địa với nguồn giống tự nhiên phong phú và là nguồn thực phẩm được nhiều người ưa chuộng. Hiện nay, cá bống kèo là loài thủy đặc sản có giá trị kinh tế cao, được tiêu thụ rộng rãi trong nước và có giá trị xuất khẩu. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, nghề nuôi cá bống kèo gặp trở ngại lớn do bệnh xuất hiện và lây lan trên diện rộng làm ảnh hưởng đến sản lượng nuôi trồng và thu nhập của người dân.

Cá bống kèo được nuôi tập trung ở một số tỉnh vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) như Cà Mau, Bạc Liêu và Sóc Trăng, trong đó Bạc Liêu là tỉnh có diện tích nuôi khá lớn, diện tích nuôi đạt 405 ha vào năm 2011 (Sở Nông nghiệp & PTNT tỉnh Bạc Liêu, 2012). Tuy nhiên từ năm 2007 đến nay cá bống kèo nuôi thương phẩm bị bệnh với dấu hiệu bệnh lý là xuất huyết trên thân, tại các vi và hậu môn với tỉ lệ chết cao và chết trên diện rộng. Xuất huyết là dấu hiệu bệnh lý do nhiều tác nhân gây ra như virus, vi khuẩn và do môi trường.

Tác nhân gây xuất huyết được mô tả nhiều nhất là do vi khuẩn. Điển hình như tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá rô phi (Oreochromis spp.) ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam được Phạm Hồng Quân và ctv., 2013 xác định là do vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây ra. Vi khuẩn này cũng gây bệnh xuất huyết ở cá điêu hồng (Oreochromis spp.) (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012). Bệnh xuất huyết còn do tác nhân là vi khuẩn S. iniae, theo kết quả nghiên cứu của Trần Vĩ Hích và Nguyễn Hữu Dũng (2011) thì tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá chẽm (Latex calcarifer) là vi khuẩn S. iniae, vi khuẩn này còn là tác nhân gây bệnh trên cá bơn Nhật Bản (Paralichthys olivaceus), cá đù đỏ (Sciaenops ocellates) (Eldar et al., 1999). Ngoài ra, bệnh xuất huyết trên cá còn do vi khuẩn S. dysgalactiae, vi khuẩn này gây hội chứng xuất huyết, bơi xoắn, mất phương hướng ở cá đối (Liza alata, Liza haemotocheila) (Qi et al., 2013), cá tầm (Acipencer schrenckii) (Yang và Li, 2009), cá nâu (Mugil cephalus) và cá bớp (Rachycentron canadum) (Abdelsalam et al., 2009).

Tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá còn được tìm thấy do nhiều loài vi khuẩn khác như Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra (Loan và ctv., 2009), Vibrio parahaemolyticus và V. alginolyticus gây bệnh trên cá mú giống và cá mú thịt, (Leong tak Seng, 1994; Somkiat Kanchanakhan, 1996; Nguyễn Thị Thanh Thùy và ctv., 2009 được trích dẫn bởi Võ Văn Nha, 2012).

1

Do tác nhân gây bệnh đa dạng, nên việc phòng trị bệnh xuất huyết ở động vật thủy sản chỉ có hiệu quả khi tác nhân và nguyên nhân gây bệnh được xác định chính xác. Hiện nay, chưa có một nghiên cứu chính thức nào về bệnh xuất huyết ở cá bống kèo, nhằm cung cấp thông tin cho các đơn vị quản lý, các nhà chuyên môn khuyến cáo người nuôi phòng, trị bệnh một cách hiệu quả. Vì thế, đề tài “Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo (Pseudapocryptes elongatus)” sẽ góp phần vào việc kiểm soát dịch bệnh ở cá bống kèo nói riêng và ở thủy sản nuôi trong vùng nói chung ngày càng hiệu quả hơn.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu trƣớc mắt: Khảo sát và đánh giá tình hình xuất hiện bệnh xuất huyết trên cá bống kèo nuôi tại tỉnh Bạc Liêu. Xác định đặc điểm bệnh học của tác nhân gây bệnh ở cá bống kèo từ đó đề xuất giải pháp phòng và trị bệnh hiệu quả.

Mục tiêu lâu dài: Cung cấp thông tin làm cơ sở cho các giải pháp phòng

trị bệnh ở cá bống kèo hướng đến nghề nuôi cá bống kèo bền vững.

1.2 Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu tập trung vào phân lập, định danh, xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh trên cá bống kèo nuôi. Đồng thời phát triển qui trình chẩn đoán bệnh và thử nghiệm phòng trị bệnh xuất huyết ở cá bống kèo ở qui mô phòng thí nghiệm.

1.3. Nội dung nghiên cứu

Luận án tập trung nghiên cứu các nội dung sau: 1. Phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo

nuôi thương phẩm.

1.1 Điều tra, khảo sát hiện trạng bệnh trên cá bống kèo nuôi. 1.2 Phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống

kèo.

2. Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết ở cá bống kèo. 2.1 Xác định đặc điểm bệnh học. 2.2 Xác định đặc điểm mô học. 2.3 Xác định đặc điểm huyết học. 3. Phát triển qui trình chẩn đoán bệnh xuất huyết ở cá bống kèo bằng

4. Phương pháp điều trị bệnh xuất huyết ở cá bống kèo ở qui mô phòng

phương pháp sinh học phân tử. thí nghiệm.

4.1 Lập kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của

thuốc kháng sinh lên vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo.

2

4.2 Bố trí thí nghiệm điều trị bệnh ở qui mô phòng thí nghiệm.

1.4 Giới hạn nghiên cứu

Nghiên cứu tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo nuôi

thương phẩm tại tỉnh Bạc Liêu.

1.5 Ý nghĩa nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu nhằm đáp ứng cho quá trình đa dạng vật nuôi thủy sản và góp phần gia tăng sản lượng động vật thủy sản. Thông tin từ kết quả khảo sát hiện trạng bệnh trên cá bống kèo và qui trình phòng trị bệnh sẽ góp phần hạn chế thiệt hại trong quá trình nuôi cá bống kèo mang lại hiệu quả về năng suất và kinh tế, tăng thu nhập cho người nuôi.

1.6. Điểm mới của luận án

Lần đầu tiên xác định được tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo là vi khuẩn Streptococcus dysagalactiae và các thời điểm bệnh thường xuất hiện ở cá bống kèo nuôi trong ao.

Hoàn chỉnh qui trình phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae để ứng dụng chẩn đoán sớm, nhanh và đặc hiệu tác nhân gây bệnh xuất huyết ở cá bống kèo bằng phương pháp PCR.

Đề xuất một số loại kháng sinh điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo.

3

Chƣơng II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Phân loại cá bống kèo

Hiện nay cá bống kèo được gọi phổ biến là Pseudapocryptes elongatus. Tên tiếng Việt là cá bống kèo hay cá bống kèo vẩy nhỏ. Tên tiếng Anh là Lanceolate goby. Theo Cuveir (1816), cá bống kèo được phân loại:

Bộ: Perciformes

Họ: Gobiidae

Giống: Pseudapocryptes

Loài: Pseudapoccryptes lanceolatus (Bloch & Schneider, 1801)

Pseudapocryptes elongatus (Cuveir, 1816)

Hình 2.1: Cá bống kèo

2.2. Tình hình nuôi cá bống kèo trên thế giới và trong nƣớc

2.2.1. Tình hình nuôi cá bống kèo trên thế giới

Cá bống kèo là loài cá phân bố rộng ở những vùng cửa sông hay trong hệ sinh thái rừng ngập mặn và bãi bùn ở Ấn Độ, Banglades, Campuchia, Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam…(Abid et al., 2014). Đây cũng là một trong những đối tượng được quan tâm phát triển nghề nuôi trên thế giới do cá dễ nuôi và có giá trị dinh dưỡng cao, có 34 giống cá bống thuộc họ Gobiiidae được tập trung nuôi ở các nước như Banglades, Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan, Philippines và Việt Nam (Polgar và Lim, 2011).

Theo Hong và Zhang (2004) thì Trung Quốc đã sinh sản nhân tạo thành công một loài cá bống có tên khoa học là Boleophthalmus pectinirostris và đã phát triển nuôi đối tượng này với mật độ nuôi từ 4,5 – 7,5 con/m2, năng suất trung bình đạt từ 750 đến 975 kg/ha. Diện tích nuôi loài cá này ở Trung Quốc đạt khoảng 13.000 ha ở (Hong et al., 2007). Đây cũng là loài cá bống được nuôi phổ biến ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan (Takeshi, 2008).

Một loài cá bống khác là cá bống kèo Pseudapocryptes elongates cũng được phát triển mạnh ở một số nước Châu Á, điển hình như Đài Loan và Việt

4

Nam, đây là loài cá được nuôi ở dạng mô hình nuôi thâm canh và bán thâm canh (Dinh et al., 2007) với năng suất nuôi đạt bình quân 0,8 tấn/ha ở mật độ thấp và 6,4 tấn/ha ở mật độ nuôi cao (Trương Hoàng Minh và Nguyễn Thanh Phương, 2011)

2.2.2 Tình hình nuôi cá bống kèo trong nƣớc

Cá bống kèo là một trong những đối tượng thủy sản được các tỉnh vùng ven biển ĐBSCL quan tâm phát triển nuôi trong những năm gần đây. Cá bống kèo (Pseudapoccryptes elongatus) là loài cá bản địa, đây là một đối tượng nuôi còn khá mới, diện tích nuôi đối tượng này không đáng kể, ở những năm đầu 2000 diện tích nuôi dối tượng này chỉ vài ha, tuy nhiên vào những năm 2011, 2012 diện tích nuôi đối tượng này đã tăng 105 ha ở Cà Mau (Sở Nông nghiệp & PTNT tỉnh Cà Mau, 2013) và 445 ha ở tỉnh Bạc Liêu (Sở Nông nghiệp & PTNT tỉnh Bạc Liêu, 2013), diện tích nuôi cá bống kèo ở tỉnh Bạc Liêu tập trung ở 03 huyện trọng điểm đó là thành phố Bạc Liêu, huyện Hòa Bình và huyện Đông Hải.

Theo Trung tâm Khuyến nông – khuyến ngư Bạc Liêu (2013) thì cá bống kèo được nuôi ở quy mô thâm canh với diện tích ao nuôi từ 3.000 m2 đến 5.000 m2. Mật độ thả giống cao, trung bình thả nuôi 100 con/m2, thời gian nuôi từ 4 – 6 tháng cá đạt trung bình từ 40 – 50 con/kg, năng suất ước đạt từ 10 – 15 tấn/ha, một số hộ nuôi có thể đạt năng suất 20 tấn/ha, lợi nhuận bình quân từ 100 triệu – 150 triệu đồng/ha. Công trình phục vụ cho quá trình nuôi đối tượng này khá đơn giản, người nuôi ít tốn công chăm sóc, chủ yếu tập trung chủ yếu ở giai đoạn cải tạo ao và xử lý nước đầu vụ nuôi còn trong suốt thời gian nuôi, người nuôi không có hoạt động thay nước trong ao, chỉ cung cấp thêm nước khi cần thiết và cho cá ăn liên tục trong ngày. Chính những hoạt động này đã góp phần làm cho môi trường ao nuôi ngày càng xấu đi do các chất cặn bã tích tụ dưới đáy ao và cũng là nguyên nhân gây ra bệnh trên cá ảnh hưởng đến năng suất nuôi cũng như lợi nhuận của người sản xuất.

2.3. Tình hình xuất hiện bệnh trên cá bống kèo

Do tốc độ phát triển của nghề nuôi cá bống kèo phát triển nhanh chóng, cá được nuôi dưới hình thức công nghiệp – bán công nghiệp với mật độ nuôi cao, lên đến 100 con/m2 (Trung tâm Khuyến nông – khuyến ngư Bạc Liêu, 2013), nhưng kỹ thuật nuôi đối tượng này vẫn chưa hoàn chỉnh, người dân chưa được trang bị đầy đủ kiến thức về phương pháp quản lý, chăm sóc cũng như phòng và trị bệnh về cá nuôi. Cá bống kèo được nuôi trong điều kiện ao nuôi không thay nước, lượng thức ăn được cung cấp liên tục trong ngày tạo ra một lượng thức ăn dư thừa tích tụ dưới đáy ao, nhưng trong quản lý môi

5

trường ao nuôi người dân ít sử dụng các loại vi sinh cải thiện điều kiện sống của cá nuôi, kết hợp những yếu tố trên đã làm cho chất lượng môi trường nuôi ngày càng bị ô nhiễm ảnh hưởng đến sức khỏe của cá, tạo điều kiện cho mầm bệnh bộc phát.

Mô hình nuôi cá bống kèo thương phẩm là mô hình nuôi mới, diện tích nuôi của mô hình nhỏ so với tổng diện tích nuôi thủy sản của các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu và Sóc Trăng, nên không có số liệu thống kê diện tích cá bị thiệt hại và tỷ lệ thiệt hại chính thức từ các cơ quan chức năng, nhưng những năm 2007, 2008 và 2009 là năm mà nghề nuôi cá bống kèo của tỉnh Bạc Liêu và các tỉnh lân cận như Sóc Trăng và Cà Mau gặp rất nhiều khó khăn do phát sinh dịch bệnh, cá bị chết hàng loạt có những ao tỷ lệ chết lên đến 90%, cá biệt có những ao tỷ lệ cá chết “trắng”, mỗi ngày người nuôi vớt từ 200 – 300 con cá bống kèo chết trong một ao với dấu hiệu thường thấy là xuất huyết, chướng bụng, nổ mắt và lở loét (http://vasep.com.vn).

2.4 Bệnh xuất huyết ở cá

2.4.1 Dấu hiệu bệnh lý

Cá bệnh xuất huyết có dấu hiệu bệnh lý như xuất huyết từng mảng đỏ trên cơ thể, xuất huyết khắp trên da cá, tập trung nhiều ở gốc vây và đuôi, hậu môn bị viêm hoặc xuất huyết. Hoại tử đuôi, vây, xuất hiện các vết thương trên lưng, mắt lồi, mờ đục và phù ra. Bụng sưng to, xoang bụng chứa dịch, nội tạng hoại tử, thận và tỳ tạng sưng to (Từ Thanh Dung và ctv., 2005).

Kết quả nghiên cứu trên cá điêu hồng bị bệnh xuất huyết cho thấy, cá bệnh có dấu hiệu bệnh lý như bơi lờ đờ, hoạt động chậm chạp, kém linh hoạt, bơi lội mất phương hướng, mắt lồi và đục, trên thân có những đốm xuất huyết ở vây ngực và vây bụng, mang tái nhạt, bụng trương to, xoang bụng có chứa dịch màu vàng, nội tạng bị xuất huyết, mềm nhũn (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012). Kết quả tương tự khi nghiên cứu trên một số loài cá bị bệnh xuất huyết như cá tầm (Wunging và Aihua Li, 2009), cá đối (Qi et al., 2013) và cá rô phi (Phạm Hồng Quân và ctv., 2013).

2.4.2 Đặc điểm mô bệnh học

Kết quả nghiên cứu của Trương Đình Hoài và ctv. (2012) trên cá rô phi (Oreochromis niloticus) bị bệnh xuất huyết cho thấy, mang cá xuất huyết, phù nề và tăng sinh biểu mô. Mô não bị sung huyết, viêm và thoái hóa ở nhu mô não. Mô thận cá xuất hiện nhiều vùng bị sung huyết, tụ huyết và thoái hóa, ống thận bị hoại tử và mất cấu trúc. Mô gan cá xuất hiện nhiều tế bào đại thực bào, đảo tụy tăng sinh, xuất hiện nhiều vùng sung huyết, tụ máu, thoái hóa và

6

giảm số lượng tế bào gan. Ở mô ruột của cá bị sung huyết, xuất huyết, thoái hóa nội mạc.

Tương tự khi nghiên cứu trên cá điêu hồng (Oreochromis spp.) bị bệnh xuất huyết cho thấy có những biến đổi về mô học như bị xuất huyết, có chất dịch tế bào trên da. Gan, tụy và thận sưng to có hiện tượng sung huyết, xuất huyết (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012). Những biến đổi ở mô mang cá bệnh xuất huyết như các sợi mang bị dính lại, phình to hoặc mất cấu trúc mang cản trở hô hấp nếu tình trạng bệnh nặng sẽ gây chết cá (Đặng Thụy Mai Thy và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011; Trương Đình Hoài và ctv., 2014).

Kết quả nghiên cứu của Đặng Thụy Mai Thy và ctv. (2012) cho thấy mô thận cá rô (Anabas testudineus) bệnh xuất huyết bị sung huyết, xuất huyết gây hoại tử, ống thận bị xơ hóa, quản cầu thận bị biến đổi cấu trúc ảnh hưởng đến chức năng hoạt động của thận.

Ở cá bệnh xuất huyết, khi quan sát mô gan kết quả cho thấy gan cá bị sung huyết, xuất huyết gây hoại tử. Mô gan bị nhiễm khuẩn, sự xuất hiện của các không bào lipid to bất thường, tế bào lympho và tế bào hồng cầu hiện diện nhiều dẫn đến vùng mô bị xơ hóa nhẹ nếu nặng sẽ hình thành u nang hoặc vôi hóa cuối cùng gây hoại tử (John và Patricia, 2007).

2.4.3 Đặc điểm huyết học

Tế bào hồng cầu có dạng hình oval hay elip và nhân hình tròn ở giữa. Số lượng hồng cầu ở cá nước mặn dao động từ 0,9 - 4 triệu tế bào hồng cầu/ml. Số lượng tế bào hồng cầu trong cơ thể cá bị ảnh hưởng do nhiều nguyên nhân như tập tính sống của từng loài, cá sống ở tầng mặt sẽ có số lượng hồng cầu thấp hơn so với các loài cá sống ở tầng giữa và tầng đáy; ở cá đực có số lượng hồng cầu cao hơn con cái, ngoài ra số lượng hồng cầu còn phụ thuộc vào chất lượng thức ăn và nhất là khi cơ thể cá bị nhiễm bệnh sẽ làm thay đổi đáng kể số lượng hồng cầu trong cơ thể cá (Phạm Tân Tiến, 2010).

Bạch cầu là thành phần cơ bản của hệ thống miễn dịch, với chức năng bảo vệ giúp cơ thể chống lại các tác nhân ảnh hưởng của các yếu tố bên trong và bên ngoài môi trường sống. Quá trình tạo bạch cầu trong cơ thể được đáp ứng cho việc bảo vệ cơ thể trong suốt thời kỳ cơ thể gặp tình trạng sốc hoặc nhiễm bệnh. Bạch cầu là những tế bào máu có nhân, kích thước khác nhau tùy thuộc vào từng loại bạch cầu. Các loại bạch cầu thường được tìm thấy gồm tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính và tiểu cầu (Mostafa et al., 2000).

7

Bạch cầu đơn nhân là tế bào bạch cầu tham gia vào hệ thống miễn dịch không đặc hiệu với vai trò thực bào, tiêu diệt kháng nguyên và đặc biệt là khả năng trình diện kháng nguyên và để thực hiện bước khởi đầu của quá trình đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Bạch cầu trung tính có khả năng thực bào các vật có kích thước nhỏ như vi khuẩn và có khả năng di chuyển xuyên qua các mao mạch có chuyển động định hướng đến những nơi bị viêm nhiễm, những nơi bị viêm có bạch cầu tập trung nhiều nhất (Phạm Tân Tiến, 2010). Sự gia tăng về tỉ lệ và số lượng bạch cầu trung tính cho thấy hoạt động của hệ bạch huyết gia tăng để tiêu diệt các vi sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể (Ellis, 1988).

Các tế bào lympho là những tế bào có khả năng miễn dịch. Các bạch cầu không hạt sản xuất ra các kháng thể β-globulin và nhất là γ-globulin, đây là kháng thể chống vi trùng rất mạnh. Tế bào lympho có thể sinh ra mọi loại kháng thể để chống lại mọi kẻ thù (Phạm Tân Tiến, 2010).

Chức năng chính của tiểu cầu là giải phóng chất thromboplastin để gây đông máu, đặc biệt trong tình trạng viêm nhiễm. Tiểu cầu còn có đặc tính kết dính nhờ vậy mà góp phần đóng miệng các vết thương. Ngoài ra tiểu cầu còn tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch (Houston, 1990; Chinabut và ctv., 1991).

Các chỉ tiêu huyết học ở cá bị bệnh xuất huyết có những thay đổi đáng kể như số lượng tế bào hồng cầu giảm do bị vi khuẩn phá hủy, số lượng tế bào bạch cầu tăng đáng kể (Martins et al., 2008), số lượng bạch cầu trung tính ở cá bệnh tăng cao (Pathiratne và Rajapakshe, 1998) và sự hiện diện của tiểu cầu và sự gia tăng của tế bào lympho nhằm tăng cường cơ chế phòng vệ của cá bị nhiễm bệnh (Martins et al., 2008).

2.5. Tổng quan về đặc điểm vi khuẩn gây bệnh trên cá

2.5.1 Bệnh do vi khuẩn Vibrio

Theo Austin (2010), Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, là vi khuẩn Gram (-), có dạng hình que, chuyển động nhờ tiên mao, phản ứng oxydase và catalase dương tính, có khả năng oxy hóa và lên men trong môi trường O/F. Kích thước tế bào 0,3 - 0,5 x 1,4 - 2,6µm. Hầu hết Vibrio spp. phân bố trong môi trường nước mặn, thích hợp ở 20 - 40‰, có loài còn có thể phát triển ở độ mặn 70‰, nên Vibrio luôn là mối đe dọa cho nghề nuôi động vật thủy sản.

Vi khuẩn Vibrio có thể phân lập bằng phương pháp vi sinh vật học trên môi trường nuôi cấy chọn lọc TCBS, ở môi trường này, vi khuẩn Vibrio phát triển rất nhanh, sau 15-18 giờ, ở nhiệt độ 30-35oC các khuẩn lạc của Virio đã lớn và phân biệt rõ ràng trên môi trường nuôi cấy (Đỗ Thị Hòa và ctv., 2004).

8

Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hóa của một số loài vi khuẩn Vibrio (Inglis et al., 1994)

Đặc điểm sinh hóa Phát triển ở nhiệt độ 4oC Phát triển ở nhiệt độ 37oC Phát triển ở 0%NaCl Phát triển ở 3%NaCl Phát triển ở 7%NaCl Nhạy cảm 0/129 (10µg) Phát triển trên TCBS Β- galactosidase Arginine dihydrolase Lysine decarboxylase Orinithine decarboxylase Phản ứng citrate Sinh H2S Phản ứng urease Indole Voges – Proskauer Thủy phân gelatin Axit hóa glucose Axit hóa mannitol Axit hóa inositol Axit hóa sorbitol Axit hóa sucrose Axit hóa arabinose

1 - + - + - S Y + + - - + - - + + + + + - + + +

3 + - - + - S O - - - - - - - - - - + D - - - -

4 - + + + - S Y + - + - + - - + + + + + - - + -

5 - + - + - S G + - + - + - - - - + + - - - - -

6 - + - + + R Y - - + + D - - + + + + + - - + -

2 - - - + - S - - - - - - - - - - + + + - - + -

Ghi chú: 1. V. anguillarum; 2. V. ordalii; 3. V. salmonicida; 4. V.cholerae; 5. V. vulnificus; 6. V. alginolyticus. G: màu xanh; Y: màu vàng; D: có phản ứng; O: không biết

Cá khi bị nhiễm khuẩn Vibrio spp. thường có những dấu hiệu điển hình như xuất huyết trên các vây và mắt lồi, mờ đục giác mạc. Cá lờ đờ biếng ăn, mang có màu nhợt nhạt do thiếu máu nặng (Toranzo et al., 2005).

Trong họ Vibrionaceae, các loài vi khuẩn gây ra bệnh nghiêm trọng nhất trên cá biển là V. anguillarum, V. ordalii, V. salmonicida. Vi khuẩn V. anguillarum phân bố rộng rãi trong môi trường, chúng gây nhiễm trùng huyết điển hình là bệnh xuất huyết ở các loài cá nước ấm và lạnh có kinh tế quan trọng, bao gồm cá hồi Thái Bình Dương và Đại Tây Dương (Oncorhynchus spp. và Salmo salar), cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss), cá bơn (Scophthalmus maximus), cá chẽm (Dicentrarchus labrax), cá tráp (Sparus aurata), cá vược (Morone saxatilis), cá tuyết (Gadus morhua), cá chình Nhật Bản và Châu Âu (Anguilla japonica và Anguilla anguilla), và cá Ayu (Plecoglossus altivelis) (Toranzo và Barja, 1993; Actis et al., 1999). Vibrio đã gây thiệt hại trên mô hình nuôi tôm công nghiệp ở Philippin, Ấn Độ và Indonesia (Austin, 2010).

9

2.5.2. Bệnh do vi khuẩn Pseudomonas

Vi khuẩn Pseudomonas thuộc họ Pseudomonadeceae, Gram (-), có dạng hình que, không sinh bào tử, kích thước tế bào khoảng 0,5 – 1,0 x 1,5 – 5,0 µm, chuyển động nhờ tiên mao. Pseudomonas phát triển trong môi trường đơn giản và hiếu khí. Đa số loài Pseudomonas có phản ứng oxy hóa, một số ít không có phản ứng oxy hóa và không lên men trong môi trường O/F. Giới hạn nhiệt độ phát triển rộng từ 4 – 43oC. Chúng phân bố rộng khắp trong môi trường, đất và nước, chúng có thể gây bệnh cho người, động vật và thực vật. Pseudomonas thường gây bệnh xuất huyết trên cá, nhưng gây bệnh chủ yếu ở cá nước ngọt. Tác nhân gây bệnh ở cá gồm một số loài: P. fluorescens, P. chlororaphis, P. anguilliseptica, P. dermoalba, P. putida. (Inglis et al., 1994).

Bảng 2.2 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Pseudomonas (Buller, 2004)

Chỉ tiêu

Gram Di động Phát triển ở 37oC Oxidase Catalase Lysine decarboxylase Arginine dihydrolase Indole Voges - Proskauer Thủy phân aesculin Thủy phân gelatin O/F Arabinose Glucose Inositol Lactose Mannitol Sorbitol Sucrose Trehalose

P. anguilliseptica - + - + + - - - - - + - - - - - - - +

P. chlororaphis - + - + + v + - v + O + + - + - + +

P. fluorescens - + - + + - + - - - + O + + v - + v v v

P. putida - + - + + - + - - - O + + - - + - + -

Ghi chú: (+) phản ứng dương; (-) phản ứng âm.v: phản ứng xảy ra chậm.

Trong số các loài Pseudomonas được phát hiện từ cá bệnh gồm: P. chlororaphis, P. anguilliseptica, P. fluorescens, P. putida, và P. plecoglossicida, trong đó vi khuẩn P. anguilliseptica được coi là tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất cho cá nuôi (Toranzo và Barja, 1993; Austin và Austin, 1999). P. anguilliseptica gây tỉ lệ chết cao trong các ao nuôi lươn ở Nhật Bản (Wakabayashi và Egusa, 1972). Sau đó là những trại lươn ở Châu Âu, Đài Loan, Scotland và Đan Mạch (Stewart et al., 1983). Vi khuẩn này cũng được phân lập từ các loài cá khác như cá tráp đen và cá Ayu ở Nhật Bản (Nakai et

10

al., 1985), cá hồi ở Phần Lan (Wiklund và Bylund, 1990), cá bơn và cá tráp đen (Lo'pez - Romalde et al., 2009).

Theo Nguyễn Văn Hảo và Nguyễn Ngọc Du (2009), P. anguilliseptica được xem là tác nhân gây bệnh quan trọng nhất. Bệnh xảy ra ở nhiệt độ thấp (dưới 16oC) vào những tháng mùa đông với biểu hiện là chướng bụng, có những đốm xuất huyết ở da và nội quan. Ở cá mú, thân bị lở loét, xuất huyết da, vây và đuôi, mắt lồi và đục. Bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết do Pseudomonas spp. gây ra và tác động lên cá ở mọi giai đoạn, tỷ lệ cá chết từ 20 – 60%.

2.5.3. Bệnh do vi khuẩn Streptococcus

Vi khuẩn Streptococcus là vi khuẩn hình cầu hoặc liên cầu, Gram (+), không có khả năng di động trong môi trường lỏng, phản ứng oxidase và catalase âm tính, không có khả năng lên men glucose trong cả hai điều kiện hiếu khí và kỵ khí, mọc trên môi trường thạch máu (Barrow và Feltham, 1993). Streptococcus sinh trưởng tốt trên môi trường Tryptic soy agar (TSA) có thêm 0,5% Glucose, môi trường BHIA (Brain heart infusion agar), môi trường THBA (Todd hewitt broth agar), môi trường thạch máu ngựa (Horse blood agar). Nuôi cấy ở 20 – 30oC, sau 24 - 48 giờ hình thành khuẩn lạc nhỏ đường kính 0,5 – 1,0 mm; màu hơi vàng, hình tròn, hơi lồi. Các tế bào vi khuẩn Streptococcus thường ghép với nhau thành từng chuỗi dài, nên được gọi là liên cầu khuẩn (Buller, 2004; Salvador et al., 2005).

Dấu hiệu chung khi cá bị nhiễm vi khuẩn Streptococcus là màu sắc đen tối, bơi lội không bình thường, mắt cá bị phù mắt hoặc lồi mắt và đục, xuất huyết trên thân (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012). Các vết xuất huyết lan rộng thành lở loét, cá bị bệnh vận động khó khăn, không định hướng, cá bệnh có hình thức bơi xoắn, thận và lá lách tăng lên về thể tích do phù nề. Sự thương tổn nội quan là lý do gây chết cá (Bùi Quang Tề và cvt., 2004).

11

Bảng 2.3 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Streptococcus (Buller, 2004)

Chỉ tiêu

Gram Di động Phát triển ở 37oC Oxidase Catalase Lysine decarboxylase Arginine dihydrolase Indole Voges - Proskauer Thủy phân aesculin Thủy phân gelatin O/F Arabinose Glucose Inositol Lactose Mannitol Sorbitol Sucrose Trehalose Ribose Glycogen α-galactosidase β- galactosidase β-glucuronidase Alkaline phosphatase

S. agalactiae + - + - - - + - + - - F - + - - - - + + + + - - - +

S. dysgalactiae + - - - + - - F - + + - - + + + - - - +

S. iniae + - + - - - + - - + - F - + - - + - + + + + - - + +

S. phocae + - + - - - - - F - + - - - - - - + - - - - +

2.5.4. Bệnh do vi khuẩn Flexibacter

Vi khuẩn Flexibacter spp. thuộc họ Cytophagacae. Vi khuẩn có dạng hình que, dài khoảng 0,3 - 0,7 x 4 - 8 µm, bắt màu Gram (-). Vi khuẩn phát triển trên môi trường Cytophaga agar có khuẩn lạc màu vàng, mép không đều và dính vào môi trường như khuẩn lạc của nấm. Dưới kính soi nổi (40 lần), mép khuẩn lạc có dạng rễ cây. Trong môi trường lỏng (Cytophaga Broth) vi khuẩn phát triển thành chùm hoặc màng mỏng trên bề mặt của môi trường. Khi lắc nhẹ chúng phát triển đồng nhất (Inglish et al., 1993).

Theo Bùi Quang Tề và ctv. (2004), Flexibacter spp. gây bệnh ở cá nuôi thường do hai loài: F. columnaris gây bệnh ở cá nước ngọt và gây bệnh trên cá nước mặn lợ là loài F. maritimus.

Flexibacter được phát hiện trong cá bơn, cá tráp, cá chẽm, cá tráp đỏ, cá tráp đen (Acanthopagrus schlegeli) và cá hồi. Bệnh tác động ở tất cả các giai đoạn phát triển từ giai đoạn giống đến giai đoạn thương phẩm nhưng cá nhỏ bị

12

ảnh hưởng nặng hơn. Cá bệnh có dấu hiệu lở loét, xuất huyết miệng, loét và tổn thương da, vây và đuôi bị cụt và thối (Toranzo, 2004).

Dấu hiệu bệnh đầu tiên xuất hiện các đốm trắng trên thân, đầu, vây, mang. Các đốm lan rộng thành các vết loét, xung quanh có viền màu đỏ, ở phần giữa màu vàng hoặc xám, da và vẩy cá có thể bị lột rồi rụng đi, tạo ra vết loét lan rộng. Các mép vây xơ mòn cụt. Trên mang xuất hiện các vết loét, tơ mang bị phá hủy làm cá ngạt thở. Bệnh không gây thương tích trong các cơ quan nội tạng, nhưng độc lực vi khuẩn vẫn có thể làm chết cá (Đỗ Thị Hòa và ctv., 2004).

Bảng 2.4 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Flexibacter (Buller, 2004)

F. columnare

Chỉ tiêu

Gram Di động Phát triển ở 37oC Oxidase Catalase β-haemolysis Lysine decarboxylase Arginine dihydrolase Indole Voges - Proskauer Thủy phân aesculin Thủy phân gelatin O/F Arabinose Glucose Inositol Lactose Mannitol Sorbitol Sucrose Trehalose

F. maritimus - - - + + - - - + - - - - - - - -

F. flexilis - - - + - - - - + O - + - - + -

F. canadensis - - + + + - - - - - + F + + - -

- - + + + - - - - - - + O - - - - - - -

2.5.5. Bệnh do vi khuẩn Aeromonas

Theo Barrow và Feltham (1993), Aeromonas được chia thành 2 nhóm dựa trên khả năng di động và ngưỡng nhiệt độ phát triển của chúng. Nhóm thứ nhất gồm những loài Aeromonas có tiên mao và có khả năng di động, bao gồm A. hydrophila, A. caviae, A. sorbia. Các vi khuẩn có dạng hình que ngắn, kích thước 0,5 x 1,0 - 1,5 µm, 2 đầu hơi tròn. Mỗi tế bào vi khuẩn có một tiên mao, nhờ đó có khả năng di động, có phản ứng cytochrom oxidase dương tính, có khả năng khử nitrate.

13

Vi khuẩn Aeromonas có khả năng vận động, là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng máu, xuất huyết. Cá bị bệnh thường kém ăn hoặc bỏ ăn, nổi lờ đờ trên tầng mặt. Da cá thường đổi màu tối không có ánh bạc, cá mất nhớt, khô ráp, rụng vẩy để lộ da bị xuất huyết. Các đốm xuất huyết màu đỏ xuất hiện trên thân, các gốc vây, quanh miệng, râu xuất huyết hoặc bạc trắng. Có thể xuất hiện các vết loét ăn sâu vào cơ, có mùi hôi thối, trên vết loét thường có nấm và ký sinh trùng ký sinh. Mắt cá bị lồi đục, hậu môn viêm xuất huyết, bụng có thể chướng to, trên bề mặt nội quan có xuất huyết, xoang cơ thể và ruột tích dịch, các vây xơ rách, tia vây cụt dần (Barrow và Feltham, 1993).

Bảng 2.5. Đặc điểm sinh hóa của một số loài Aeromonas (Inglis et al., 1994)

Đặc điểm sinh hóa A. hydrophyla A. Caviae A. Sorbia A. salmonicida Di động Phát triển ở 370C β-galactosidase Arginine dihydrolase Lysine decarboxylase Tạo H2S Indole Voges-Proskauer Thủy phân Gelatin Thủy phân Aesculin Acid hóa: Glucose Mannitol Inositol Sorbitol Sucrose Arabinose

+ + + + d - + - + + + + - d + +

- - + + d - - - + + + + - - - +

+ + + + d + + + + + + + - d + +

+ + + + d + + d + - + + - d + +

Nhóm thứ hai là các loài vi khuẩn Aeromonas không di động gây bệnh ở cá thường gặp là A. Salmonicida (3 loài phụ gồm: A. salmonicida, A. achromogenes và A. nova). Vi khuẩn có dạng hình que ngắn, không có tiên mao nên không có khả năng di động và phát triển tốt nhất ở 22°C hoặc thấp hơn (Barrow và Feltham, 1993).

Vi khuẩn A. salmonicida gây ra bệnh xuất huyết, bệnh lở loét trên một số loài cá và bệnh Furunculosis ở cá hồi. Cá bệnh thường có dấu hiệu chậm chạp, kém ăn, thường bơi trên tầng nước mặt, hô hấp khó khăn, trên thân có các vùng áp xe sâu, xuất huyết trên da và ở các gốc vây, mắt cá bệnh thường bị lồi. Bệnh có nguy cơ lây nhiễm rất cao, theo nhiều con đường khác nhau, nếu vi khuẩn tồn tại trong nước, chúng xâm nhập vào cơ thể cá khỏe theo miệng, da và mang. Sự nhạy cảm của cá với tác nhân sẽ tăng lên khi lớp nhầy trên da cá bị thương tổn do tác động cơ học hay do ký sinh trùng ký sinh (Toranzo et al., 1991).

14

2.5.6. Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella

Vi khuẩn Edwardsiella thuộc họ Enterobacteriaceae, vi khuẩn có dạng hình que mảnh, Gram (-), kích thước biến đổi, di động hoặc di động yếu, phản ứng lên men, phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, phản ứng indole và H2S âm tính. (Từ Thanh Dung và ctv., 2005).

Dựa vào dấu hiệu bệnh và phân lập mẫu bệnh phẩm từ gan tụy cá bệnh trên một số môi trường thông thường như: BHIA (Brain heart infusion agar), TSA (tryptic soy agar). Trên các môi trường này, khuẩn lạc của Edwardsiella spp. thường nhỏ, phát triển sau khi nuôi cấy 24 - 48 giờ ở nhiệt độ 30 – 35oC. Nhiệt độ thích hợp để nghiên cứu đặc điểm sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn này là 28-30oC. E. ictaluri cho các phản ứng sinh lý, sinh hóa yếu hơn các loài Edwardsiella khác (Waltman et al., 1986).

Bảng 2.6. Đặc điểm sinh hóa của E. tarda và E. ictaluri (Inglis et al., 1994)

Edwardsiella ictaluri Edwardsiella tarda

Đặc điểm sinh hóa Di động ở 25oC Di động ở 35oC β-galactosidase Arginine dihydrolase Lysine decarboxylase Ornithine decarboxylase Tạo H2S Indole Voges-Proskauer Thủy phân Gelatin Acid hóa: Glucose Mannitol Inositol Sorbitol Rhamnose Sucrose Melibiose Arabinose

+ - - - + + - - - - + - - - - - - -

+ + - - + + + + - - + - - - - - - -

Họ Enterobacteriaceae gây bệnh trên cá thường gặp hai loài: E. tarda và E. ictaluri. Cá bị nhiễm E. tarda có dấu hiệu các vết thương tổn nhỏ 3 – 5 mm trên da, nằm ở mặt lưng và hai bên cơ thể, các vết thương tổn phát triển thành các vùng bị áp xe, sưng lên rất dễ nhận biết, da cá mất đi sắc tố bình thường. Cá có mùi hôi thối do các vết thương tổn chứa mô bị hoại tử. Quan sát mô bệnh học cho thấy các vết thương tổn được đặc trưng bởi sự hoại tử, thường phát triển ở mô cơ, mô tạo máu và mô gan (Austin và Austin, 1993).

Cá bệnh do nhiễm E. ictaluri thường kém ăn hoặc bỏ ăn, bụng thường chướng to, xung quanh miệng thường có các đốm xuất huyết, gốc vây xuất

15

huyết, mắt lồi. Giải phẫu bên trong, một số cơ quan nội tạng như gan, lá lách, thận bị hoại tử, tạo thành những đốm màu trắng đục đường kính 0,5 – 2,5 mm. Vi khuẩn E. ictaluri được phân lập lần đầu tiên trên cá nheo. Loài vi khuẩn này cũng là nguyên nhân gây bệnh nhiễm trùng máu cấp tính (enteric septicemia of catfish – ESC) trên cá nheo Mỹ với tỷ lệ hao hụt rất cao (Austin và Austin, 1993).

Hiện nay, hầu như chưa có công trình nghiên cứu nào ở nước ngoài về bệnh trên cá bống kèo, đặc biệt là bệnh xuất huyết được công bố. Tuy nhiên, đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh xuất huyết trên các đối tượng nuôi thủy sản như cá chép, cá nheo mỹ, cá tra, cá rô phi, cá điêu hồng hay lươn đồng. Tác nhân gây bệnh chủ yếu gây bệnh xuất huyết ở động vật thủy sản được công bố nhiều nhất là vi khuẩn thuộc giống Aeromonas và Streptococcus.

2.6 Tổng quan về bệnh do vi khuẩn Streptococcus trên cá nƣớc lợ,

mặn

Bệnh do vi khuẩn Streptococcus là bệnh nguy hiểm thường gặp ở người, động vật trên cạn và ở động vật thủy sản. Bệnh được phát hiện xảy ra đầu tiên vào năm 1956 trên cá hồi Oncorhynchus mykiss tại Nhật Bản (Hoshina et al., 1958). Từ đó, bệnh đã không ngừng lan rộng và trở thành một bệnh vi khuẩn gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho nghề nuôi trồng thủy sản trên thế giới.

Nhiễm khuẩn liên cầu ở cá được coi là một vấn đề nghiêm trọng do tác động gây chết hàng loạt cá nuôi trên khắp thế giới (Kitao, 1993; Bercovier, 1997; Romalde và Toranzo, 1999a).

Khi tiến hành định danh cầu khuẩn dựa vào DNA bằng cách giải trình tự gen 16S rRNA đã xác định một số loài vi khuẩn được xem là tác nhân gây bệnh: Lactococcus garvieae (syn. Enterococcus seriolicida), Lactococccus piscium, S. iniae (syn. S. shiloi), S. agalactiae (syn. S. difficile), S. parauberis và Vagococcus salmoninarum. Vì vậy, streptococcosis trên cá được coi là một bệnh phức tạp, vi khuẩn có khả năng gây ra tác động lên thần kinh trung ương gây mủ và viêm màng não (Toranzo et al., 2005).

Trong số các liên cầu khuẩn gây bệnh trên cá, L. garvieae, S. iniae và S. parauberis có thể được coi là tác nhân chính gây bệnh ở cá biển. L. garvieae lây nhiễm trên các loài cá nước mặn như cá chỉ vàng tại Nhật Bản và các loài nước ngọt như cá hồi vân chủ yếu ở Ý, Tây Ban Nha, Pháp, Anh và Úc (Bercovier et al., 1997). Gần đây, một trường hợp gây nhiễm của L. garvieae cũng đã được phát hiện ở loài cá biển (Coris aygula) (Colorni et al., 2003).

16

Các chủng vi khuẩn gây bệnh này được phân chia làm 3 nhóm dựa vào đặc điểm dung huyết: dung huyết α, dung huyết β và dung huyết γ (Baya et al., 1990). Ngày nay, người ta chia những vi khuẩn này thành hai nhóm dựa vào độc lực của vi khuẩn theo nhiệt độ. Trong đó, S. parauberis, S. iniae, S. agalactiae được xem là tác nhân gây bệnh Streptococcosis cho các loài cá nước ấm ở nhiệt độ trên 15oC. Các vi khuẩn gây bệnh ở vùng nước ấm được xem là những tác nhân có khả năng gây bệnh cho người (Toranzo et al., 2004).

Khi nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh xuất huyết ở cá rô phi nuôi (Oreochromis spp.) tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam của Phạm Hồng Quân và ctv. (2013) đã tiến hành thu được 60 mẫu cá bệnh có dấu hiệu xuất huyết, nhóm nghiên cứu đã phát hiện được có 52/60 mẫu cá bệnh do vi khuẩn S. agalactiae gây ra.

Ngoài ra, khi tiến hành nghiên cứu trên cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa bị bệnh xuất huyết đã phân lập được vi khuẩn S. iniae (Trần Vĩ Hích và Nguyễn Hữu Dũng, 2011).

Streptoccosis cũng có thể lây nhiễm sang động vật có vú. Kết quả nghiên cứu của Toranzo đã xác định Streptoccosis trong cá bơn đã lây sang người đầu tiên ở phía Tây Bắc của Tây Ban Nha, xảy ra vào năm 1993 (Toranzo et al., 1994). Trong 02 năm (1995 và 1996), đã có bốn trường hợp nhiễm liên cầu khuẩn ở con người được xác định trong số các bệnh nhân tại một bệnh viện ở Ontario (Weinstein et al., 1996). S. iniae, một tác nhân gây bệnh trên cá lại là nguyên nhân gây ra bệnh ở con người (Eldar et al., 1994; Eldar et al., 1995; Perera et al., 1995) được phân lập từ cả bốn bệnh nhân trên. Tất cả bệnh nhân đều có nguồn gốc Trung Quốc và có liên quan đến cá sống, ba trong số các loài cá liên quan đến bốn bệnh nhân trên là cá rô phi và họ đã bị lây nhiễm khi tiếp xúc trực tiếp với cá (Weinstein et al., 1996).

2.6.1 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae

Vi khuẩn S. iniae là vi khuẩn hình cầu, có đường kính lên đến 1,5 µm, các tế bào ghép với nhau tạo thành chuỗi liên cầu. Vi khuẩn phát triển trong các môi trường tổng hợp như TSA, BHIA, hình thành các khuẩn lạc nhỏ có đường kính 1-2 mm sau 24 – 48 giờ nuôi cấy ở 15-37oC, trong môi trường TSB kéo dài thành chuỗi (Bromage et al., 1999). Nuôi cấy trên môi trường thạch có bổ sung 5% máu cừu cho phản ứng dung huyết dạng α hay β (Eldar et al., 1995; Bromage et al., 1999).

Tác nhân S. iniae gây bệnh chủ yếu trên các loài cá nước ấm như ở cá rô phi Oreochromis niloticus x O. Aureus (Al-Harbi, 1994); cá vược sọc lai Morone saxatilis, cá hồi Oncorhynchus mykis (Evans et al., 2000). Ngoài ra, 17

một số loài cá biển như cá trác sọc vàng Seriola spp. (Kitao, 1982), cá bơn Nhật Bản (Paralichthys olivaceus), cá chẽm Châu Âu (Dicentrarchus labrax) và cá đù đỏ (Sciaenops ocellates) (Eldar et al., 1999) ở Israel, cá chẽm (Latex calcarifer) ở Australia (Bromage et al., 1999) cũng đã phân lập được vi khuẩn này.

Những loài cá khi bị nhiễm vi khuẩn S. iniae có những dấu hiệu biểu hiện khác nhau, tuy nhiên chúng đều xuất hiện những dấu hiệu chung bao gồm: màu sắc đen tối, mắt cá lồi và đục, xuất huyết ở các gốc vây và xương nắp mang, cá mất thăng bằng, bơi lội không bình thường (Bromage et al., 1999; Eldar et al., 1999; Colorni et al., 2002). Dấu hiệu điển hình của bệnh là cá bơi lội bất thường, bơi xoắn, không định hướng, xoang bụng chứa dịch, xuất huyết các cơ quan nội tạng, thận và lá lách sưng to (Bromage et al., 1999; Suanyuk et al., 2011).

Kiểm tra mô học cho thấy các biến đổi rõ rệt trong gan, thận, tỳ tạng, tim, mắt và não. Các cơ quan như gan, thận và tim thể hiện bị viêm nghiêm trọng. Trong mô gan, các mao mạch gia tăng về kích thước, xuất hiện các tế bào lympho, các tế bào gan xuất hiện nhiều không bào, thoái hóa và hoại tử (Suanyuk et al., 2011). Màng tim trương to với sự xuất hiện nhiều tế bào lympho và các trung tâm đại thực bào chứa melanin. Tỳ tạng và não tập trung các tế bào lympho cao và sự tắc nghẽn nội mạch thường xuyên chứng tỏ sự suy giảm các sợi fibrin trong các mao mạch (Bromage và Owen, 1999).

Vi khuẩn S.iniae còn được xác định là tác nhân gây bệnh trên cá và động

vật có vú, kể cả con người (Austin và Austin, 1999).

2.6.2 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae

Vi khuẩn S. agalactiae được gọi là Streptococcus nhóm B là một trong bốn bêta tán huyết liên cầu khuẩn. Vi khuẩn thuộc nhóm Gram (+), không di động, sinh trưởng trong các môi trường tổng hợp như TSA, BHIA hình thành các khuẩn lạc nhỏ có đường kính 1 – 2 mm sau 24 – 48 giờ nuôi cấy ở 15 – 37oC, trong môi trường TSB kéo dài thành chuỗi (Bromage et al., 1999; Romalde et al., 2009).

Mặt khác vi khuẩn S. agalactiae cho phản ứng voges - proskauer, alkaline phosphatase và leucine aminopeptidase dương tính nhưng âm tính với các loại đường, pyrrolidonyl arylamidase, α - galactosidase và nhất là âm tính với bileesculin. Các đặc tính sinh hóa này giúp phân biệt vi khuẩn S. agalactiae với các nhóm cầu khuẩn khác và nhất là trong nhóm Streptococcus (Buller, 2004; Salvador et al., 2005).

18

Bệnh do S. agalactiae gây ra có các dấu hiệu bệnh lý đặc trưng như bỏ ăn, bơi lội lờ đờ trên mặt nước, mắt lồi và đục, xuất huyết ở các vây và xương nắp mang. Quan sát mô gan của cá bị nhiễm bệnh có một số biến đổi như cấu trúc tế bào gan bị phá hủy, nhiều vùng tế bào có hiện tượng xuất huyết, bị biến đổi cấu trúc và hoại tử. Tỳ tạng xuất hiện những dịch viêm và mất cấu trúc. Mô thận cá điêu hồng có nhiều vùng bị biến đổi cấu trúc, ống thận bị hoại tử (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012).

Hiện tượng xuất huyết, bị biến đổi cấu trúc, hoại tử và xuất hiện dịch viêm ở gan, thận và tỳ tạng cho thấy khả năng gây bệnh ở mức tế bào của vi khuẩn S. agalactiae. Ngành công nghiệp nuôi cá rô phi ở Bazil đã bị thiệt hại nghiêm trọng do vi khuẩn S. agalactiae vì vi khuẩn này có xu hướng tấn công cá vào giai đoạn thương phẩm, tỷ lệ chết ở một trang trại nuôi cá có thể lên đến 90% (Salvador et al., 2005).

2.6.3 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus dysgalactiae

Vi khuẩn S. dysgalactiae thuộc nhóm C Lancefield là vi khuẩn Gram (+), hình cầu, phản ứng catalase và oxidase âm tính (Buller, 2004). Nhiệt độ tốt nhất để vi khuẩn S. dysgalactiae phát triển là 37oC, ở nhiệt độ dưới 10oC và trên 45oC vi khuẩn không phát triển (Abdelsalma et al., 2013). Cũng với kết quả nghiên cứu của Abdelsalma et al. (2013) cho thấy vi khuẩn S. dysgalactiae có phản ứng catalase âm tính nhưng dương tính với oxidase.

S. dysgalactiae được phân thành 02 loài phụ: Streptococcus dysgalactiae subsp dysgalactiae tác nhân gây bệnh trực tiếp trên động vật và Streptococcus dysgalactiae subsp equisimilis là tác nhân quan trọng gây bệnh trên người (Suzuki et al., 2011). Sự phân chia này được Vandamme et al. (1996) dựa vào quá trình điện di vách tế bào và các kết quả kiểm tra sinh lý, theo đó vi khuẩn S. dysgalactiae subsp dysgalactiae gây bệnh trên động vật gồm Lancefield nhóm C Streptococcus (GCS) và nhóm L (GLS).

Theo Nomoto et al. (2004), Lancefield nhóm C S. dysgalactiae (GCSD) gây bệnh trên cá đầu tiên vào năm 2002 tại Nhật. Vi khuẩn này còn gây bệnh trên cá bò biển (amberjack Seriola dumerili) và cá chỉ vàng (yellowtail Seriola quinqueradiata) (Nomoto et al., 2004). Bên cạnh đó, S. dysgalactiae cũng được tìm thấy là tác nhân gây bệnh trên một số loài cá như: kingfish (Seriola lalandi), cá đối nâu (Mugil cephalus), cá đối (Liza alata, Liza haemotocheila) và cá bớp (Rachycentron canadum) (Nomoto et al., 2006; Abdelsalam et al., 2009; Yang và Li, 2009; Qi et al., 2013).

GCSD gây bệnh trên cá được xác định dựa vào quá trình giải mã trình tự gen 16S rDNA, phân tích trình tự gen sodA và tuf, điện di và sự tạo nhóm 19

Lancefield. S. dysgalactiae subsp dysgalactiae và S. dysgalactiae subsp equisimilis là vi khuẩn có thể gây bệnh trên cá và động vật có vú (Nomoto et al., 2008; Nishiki et al., 2010).

Với kết quả nghiên cứu thành công của Netto et al. (2010) khi xác định được tác nhân gây bệnh trên cá rô phi Nile là do vi khuẩn S. dysgalactiae và đây cũng là nghiên cứu đầu tiên phát hiện S. dysgalactiae nhóm C gây bệnh trên cá nước ngọt.

Ngoài ra, đây cũng là vi khuẩn gây bệnh trên người và một số động vật

khác như ngựa, bò, chó và heo (Anders và Morgens, 2011).

2.6.4 Cơ chế gây bệnh

Vi khuẩn S. agalactiae, S. dysgalactiae và S. iniae xâm nhập vào cơ thể cá thông qua nguồn nước, qua các vết thương trên cơ thể cá (Romalde và Toranzo, 1999a). Vi khuẩn khi xâm nhập vào cơ thể cá đã gia tăng số lượng và bị thực bào bởi các đại thực bào. Đại thực bào mang vi khuẩn theo máu trở về thận và tỳ tạng. Vi khuẩn không bị tiêu diệt bởi đại thực bào gia tăng số lượng tại hai cơ quan trên và khi vượt quá sức chống chịu của cơ thể cá, vi khuẩn sẽ tiếp tục nhiễm vào máu, sau đó được di chuyển đến khắp nơi trong cơ thể gây nhiễm khuẩn toàn thân (Romalde và Toranzo, 1999a).

2.6.5 Phƣơng thức lây truyền bệnh trong môi trƣờng nuôi

Bệnh do S. agalactiae, S. dysgalactiae và S. iniae lây truyền có thể xảy ra thông qua nguồn nước hay thông qua thức ăn chứa mầm bệnh. Bệnh cũng có thể lây truyền khi nuôi chung cá khỏe với cá bệnh, cá mang vi khuẩn trong tự nhiên vào ao nuôi (Perera et al., 1997).

Một số yếu tố bao gồm nhiệt độ nước cao, mật độ nuôi cao và chất lượng nước kém như nồng độ amoniac cao hoặc nitrite cao đều liên quan đến việc bùng phát dịch Streptoccosis trong ao nuôi (Yanong và Francis-Floyd, 2002). Streptoccosis ảnh hưởng đến các giai đoạn phát triển của cá. Streptococcus có thể tồn tại hơn 6 tháng trong ao nuôi (Romalde và Toranzo, 1999a).

Theo Pereral et al., 1997 cá có thể bị nhiễm bệnh thông qua phương pháp tiêm, ngâm hay cho ăn sống với những sinh vật mang mầm bệnh. Các cơ quan mang, da, hệ thống tiêu hóa, hệ thống khứu giác là những vị trí xâm nhập của Streptococcus spp.. Tuy nhiên, con đường xâm nhiễm, phát triển và lây lan bệnh khác nhau tùy theo phương pháp cảm nhiễm và loài cá cảm nhiễm. Streptococcus có thể gây bệnh trên cá rô phi thông qua phương pháp ngâm hay cho ăn (Pereral et al., 1997).

20

Nghiên cứu của Evans et al. (2004) về đường lây nhiễm của vi khuẩn S. agalactiae đã cho thấy, mang là vị trí xâm nhập, vi khuẩn phát triển rất nhanh sau khi xâm nhập, vi khuẩn xuất hiện trong máu, não và thận của vật chủ sau 12 giờ. Trên cá chẽm, Bromage và Owen (1999) đã tiến hành cảm nhiễm S. iniae bằng phương pháp ngâm và cho ăn, cá nhiễm bệnh và chết với tỷ lệ cao, tuy nhiên ở phương pháp ngâm bệnh xảy ra ở dạng cấp tính, phương pháp cho ăn gây bệnh ở dạng mãn tính.

2.6.6 Phƣơng thức chẩn đoán

Streptococcus là vi khuẩn hình cầu, Gram (+) rất đa dạng về thành phần loài và kiểu huyết thanh nên dễ nhầm lẫn với những nhóm cầu khuẩn khác về kiểu hình và đặc tính sinh lý, sinh hóa. Do đó, việc chẩn đoán phát hiện bệnh nhằm xác định tác nhân gây bệnh xuất huyết ở cá phải dựa vào dấu hiệu bệnh lý bên ngoài và kết hợp với những xét nghiệm đặc hiệu như phương pháp định danh vi khuẩn, dựa vào hình dạng, kích thước, các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa; phương pháp ngưng kết miễn dịch để xác định kiểu huyết thanh; phương pháp mô bệnh học và sử dụng phương pháp phân tử để xác định chính xác tác nhân gây bệnh trên cá (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012).

Rất dễ sai lầm trong nhận dạng vi khuẩn giữa 02 loài S. iniae với S. uberis (Ravelo et al., 2001). Bên cạnh đó, việc xác định một số loài vẫn còn khó khăn, nếu chỉ dựa trên kiểu hình và đặc điểm. Gần đây, kỹ thuật phân tử đã được áp dụng một cách hữu ích trong nghiên cứu dịch tễ học một số tác nhân gây bệnh Streptoccosis trên cá. Phương pháp sinh học phân tử được áp dụng để xác định vi khuẩn Streptococcus spp. là Polymerase Chain Reaction (PCR), Random Amplified đa hình DNA (RAPD), và Ribotyping (RT), và RAPD được coi là một phương pháp tốt hơn để phân biệt giữa các chủng Streptococcus (Romalde et al., 1999c).

2.7 Xác định độc lực của một số chủng vi khuẩn gây bệnh xuất huyết

trên cá

Theo Payne et al. (1977) phát hiện các chủng vi khuẩn độc lực và không độc lực dựa vào sự thay đổi màu sắc trên môi trường thạch Congo red. Một số vi khuẩn có khả năng hấp thu Congo red. Congo red (C32H22N6Na2O6S2) là một loại phẩm màu có chứa diazonium, có thể tan trong nước tạo dung dịch keo màu đỏ hay tan trong dung môi hữu cơ như ethanol. Trong nghiên cứu dịch tể học, Congo red giúp phát hiện nhanh sự hiện diện độc lực kiểu huyết thanh 2a của vi khuẩn Shigella flexneri do khả năng kết hợp của Congo red với lipopolysaccharide của vi khuẩn. Nghiên cứu được thực hiện trên các loài vi

21

khuẩn Shigella, Vibrio cholera, Escherichia coli và Neisseria meningitides cho thấy các chủng độc lực có khả năng hấp thu Congo red và cho các khuẩn lạc màu đỏ. Ngược lại, các chủng không hấp thu Congo red và có khuẩn lạc không màu thì không có độc lực (Payne et al., 1977).

Khi nghiên cứu sự khác nhau giữa các chủng vi khuẩn Yersinia enterocolitica độc lực và không độc lực của Payne et al., 1977 cho kết quả tương tự. Vi khuẩn hình thành các khuẩn lạc có màu trên môi trường thạch Congo red được xác định là vi khuẩn có độc lực.

Độc lực của một số loài vi khuẩn gây bệnh có liên quan đến khả năng hấp thu Congo red. Theo nghiên cứu của Statner và George (1987) khi tiến hành thí nghiệm cấy 50 chủng vi khuẩn Aeromonas trên môi trường có chứa 50µg/ml Congo red kết quả cho thấy tất cả các chủng đều phát triển. Mức độ hấp thu khác nhau giữa các chủng vi khuẩn phụ thuộc vào nhiệt độ ủ, nhiều nhất ở 37°C và thấp nhất ở 22°C.

Kết quả nghiên cứu của Abdelsalam et al. (2009) cho thấy vi khuẩn S. dysgalactiae nhóm C phát triển trong môi trường TH-CR agar (môi trường Todd-Hewitt agar có 30µg/ml Congo red) với các khuẩn lạc có màu cam, trong khi đó vi khuẩn Lactococcus garvieae phát triển trong môi trường TH- CR với khuẩn lạc màu trắng hoặc màu cam nhạt. Môi trường TH-CR có thể sử dụng để phân lập vi khuẩn từ cá bệnh và nhận dạng khuẩn lạc để chẩn đoán vi khuẩn S. dysgalactiae nhóm C gây bệnh trên cá (Abdelsalm et al., 2009).

2.8 Chẩn đoán bệnh xuất huyết ở cá

Các phương pháp nuôi cấy truyền thống dùng trong chẩn đoán bệnh vi khuẩn ở cá khi có kết quả thường phải mất vài ngày và không đáp ứng được tính khẩn cấp trong việc đề xuất giải pháp đối phó với sự lây lan của bệnh. Một trong những phương pháp kỹ thuật phân tử được sử dụng phổ biến hiện nay để phát hiện sớm các mầm bệnh ở thủy sản là kỹ thuật PCR. PCR là phương pháp cho phép phát hiện mầm bệnh vi khuẩn nhanh, chính xác và độ nhạy cao, có thể phát hiện mầm bệnh vi khuẩn với mật độ rất thấp. Do có tính chính xác và tính đặc hiệu cao, nên phương pháp PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phát hiện mầm bệnh vi sinh vật nói chung và mầm bệnh vi khuẩn nói riêng (Vantarakis et al., 2000; Del Cero et al., 2002; Bader et al., 2003). Vì vậy có thể phát triển và sử dụng phương pháp PCR để phát hiện các mầm bệnh vi khuẩn trong thủy sản.

Khi có nhiều mầm bệnh xuất hiện trong môi trường nuôi thủy sản thì khả năng phát hiện đồng thời các mầm bệnh này được thực hiện nhờ vào một dạng biến hóa của PCR là kỹ thuật phức hợp PCR (mPCR) (Del Cero et al., 2002; 22

Panicker et al., 2004). Sử dụng kỹ thuật mPCR còn giảm được chi phí và thời gian phân tích mẫu. Công bố khoa học gần đây cho biết sử dụng kỹ thuật mPCR có thể phát hiện đồng thời 3 loài vi khuẩn gây bệnh quan trọng ở cá là E. ictaluri, A. hydrophila và F. columnare (Panangala et al., 2007).

Ở Việt Nam việc sử dụng phương pháp PCR và mPCR phát hiện các mầm bệnh gây bệnh trên động vật thủy sản cũng được phát triển và ứng dụng, các qui trình được phát triển và chuẩn hóa với thời gian chẩn đoán ngắn và chi phí phân tích thấp góp phần cho việc phát hiện sớm mầm bệnh ở cá nuôi (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Trúc Phương, 2010; Đặng Thị Hoàng Oanh và Đặng Thụy Mai Thy, 2009; Nguyễn Hà Giang và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2010; Nguyễn Hà Giang và ctv., 2010).

Ngoài ra, các kỹ thuật ly trích DNA hiện đại cho phép ly trích DNA của vi khuẩn trực tiếp mô cá nhiễm bệnh mà không cần phải phân lập và nuôi cấy vi khuẩn theo phương pháp phân lập truyền thống (Nguyễn Hà Giang và ctv., 2011).

2.9 Phòng và trị bệnh xuất huyết ở cá

2.9.1 Hóa chất

Các hóa chất có thể dùng để phòng trị bệnh xuất huyết do vi khuẩn gây ra như: thuốc tím (KMnO4), muối, formalin, sunfat đồng (CuSO4) và iodine. Thuốc tím (KMnO4) thuận lợi cho việc sử dụng và đồng thời điều trị bệnh có hiệu quả cao, tuy nhiên hóa chất này không có hiệu quả khi cá nhiễm bệnh ở dạng cấp tính (Từ Thanh Dung, 2012).

2.9.2 Thuốc kháng sinh

Thuốc kháng sinh là biện pháp thường được áp dụng nhiều nhất để kiểm soát bệnh xuất huyết nhất là bệnh do vi khuẩn (Fang et al., 2004). Những loại thuốc kháng sinh đã được sử dụng để trị bệnh có hiệu quả là furance (Mitchell và Plumb, 1980), sulfonamide (Bowser et al., 1987), chloramphenicol, neomycin, sulfamethoxazole-trimethoprim, streptomycin, oxolinic acid, sarafloxacin (Dixon et al., 1990), rifampicin (Ansary et al., 1992), oxytetracycline, cephamycin, ciprofloxacin, amoxycillin và enrofloxacin (Ilhan et al., 2006).

Vi khuẩn Gram (+) rất nhạy cảm với erythromycin (Yanong và Francis- Floyd, 2002). Bên cạnh đó, phần lớn các chủng Streptococcus spp. cũng rất nhạy cảm với tetracycline, ampicillin, doxycycline, josamycin (Romalde và Toranzo, 1999). Kết quả nghiên cứu của Darwish và Griffin (2002) cho thấy

23

khi sử dụng kháng sinh oxytetracycline với hàm lượng 75 – 100 mg/kg cá đã khống chế được bệnh do vi khuẩn S. iniae gây ra trên cá rô phi.

tarda

Kháng sinh rất cần thiết trong điều trị bệnh do vi khuẩn Vibrio vulnificus gây ra, các kháng sinh dùng điều trị gồm tetracycline, cephalosporin thế hệ thứ ba và imipenem (Dijkstra et al., 2009). Kháng sinh được đề nghị để điều trị là gentamycin, amoxicillin, bệnh do vi khuẩn Edwardsiella trimethoprim – sulfamethoxazole, cephalosporins và oxyquinolones (Lehane và Rawlin, 2000).

erythromycin,

gentamicin,

penicillin,

ormetoprim-sulfadimethoxine

và

Việc sử dụng thuốc kháng sinh quá liều và sử dụng trong thời gian dài đã dẫn đến hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc và sự tồn tại dư lượng thuốc trong sản phẩm thủy sản (Mitchell và Plumb, 1980; Vivekanandhan et al., 2005). Một số chủng vi khuẩn đã được ghi nhận là kháng với ampicillin, carbenicillin, tetracycline, sulfamethoxazole- nitrofuradantoin, trimethoprim (Dixon et al., 1990; Ansary et al., 1992; Dixon và Issvoran., 1993; Ilhan et al., 2006).

Kết quả nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) của Từ Thanh Dung (2012) cho thấy, đa số vi khuẩn gây bệnh xuất huyết cá tra (hơn 87% số chủng vi khuẩn) nhóm vi khuẩn Aeromonas spp. nhạy với florfenicol. Hơn 81% số chủng vi khuẩn Aeromonas spp. nhạy với doxycycline. So với doxycycline, tetracycline đã giảm tác dụng chỉ còn 58% số chủng vi khuẩn nhạy. Cũng qua kết quả nghiên cứu này của Từ Thanh Dung (2012) đã xác định đa số vi khuẩn Aeromonas spp. gây bệnh trên cá tra kháng với kháng sinh ampicillin, cefazoline và cefalexine. Thậm chí, vi khuẩn Aeromonas spp. gây bệnh trên cá tra đã kháng tự nhiên (kháng bẩm sinh) với ampicillin (kháng 100%).

Thuốc kháng sinh được sử dụng rất phổ biến bằng cách trộn vào thức ăn và người nuôi cá tra thường sử dụng kết hợp nhiều loại kháng sinh và hóa chất để trị bệnh. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc và hóa chất không đúng qui định và lặp đi lặp lại trong thời gian dài sẽ dẫn đến tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn làm cho việc điều trị ngày càng kém hiệu quả (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv., 2005; Từ Thanh Dung và ctv., 2008). Bên cạnh sự kháng thuốc thì vấn đề dư lượng thuốc và hóa chất trong sản phẩm thủy sản còn gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng và điều này gây nhiều trở ngại cho việc xuất khẩu. Hiện nay việc sử dụng thuốc kháng sinh trong thủy sản phải tuân thủ theo Thông tư số 15/2009/TT-BNN ngày 17 tháng 3 năm 2009 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp & PTNT (Bộ Nông nghiệp & PTNT, 2014), thông tư này đã

24

quy định chặt chẽ những loại kháng sinh cấm sử dụng cũng như hạn chế sử dụng trong nuôi trồng thủy sản nhằm tạo sản phẩm sạch bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

2.9.3 Vắc xin

Nghiên cứu vắc xin phòng bệnh do vi khuẩn S. agalactiae gây ra trên cá rô phi ở Bazil, kết quả cho thấy việc sử dụng vắc xin đã kiểm soát được mầm bệnh do vi khuẩn này gây ra, kết quả sau khi sử dụng vắc xin này đạt hiệu quả khá cao (Salvador et al., 2005). Vắc xin L. Garvieae và S. iniae thử nghiệm đạt hiệu quả cao trong việc bảo vệ trong cá hồi vân trong thời gian từ 3 - 6 tháng (Eldar et al., 1997; Romalde et al., 2005), nhưng vắc xin cho L. garvieae và S. parauberis hiển thị mức độ bảo hộ cao khi sử dụng cho cá chỉ vàng và cá bơn (Toranzo et al., 1995; Romalde et al., 1999b). Tuy nhiên khi thử nghiệm ngoài thực tế ao nuôi, cả hai loại vắc xin này được cấp phép sử dụng cho cá hồi ngừa chủng lactococcosis nhưng kết quả vẫn gây thiệt hại nặng nề cho trang trại nuôi cá (Bachrach et al., 2001).

Một số vắc xin được sử dụng nhằm phòng bệnh do vi khuẩn S. iniae, S. agalactiae và S. dysgalactiae được nghiên cứu và phát triển. Điển hình như nghiên cứu của Bercovier et al. (1997), thực hiện tiêm vắc xin bất hoạt formaline dẫn truyền bằng phương pháp tiêm xoang bụng phòng bệnh do vi khuẩn S. iniae gây ra trên cá rô phi, đạt hiệu quả bảo vệ cao với RPS đạt 80 - 90%. Kết quả được áp dụng từ năm 1995 đến 1997 khi cá rô phi nuôi đạt 50 g/con tiến hành chủng ngừa bằng vắc xin bất hoạt formaline cho hiệu quả bảo vệ hơn bốn tháng, với tỷ lệ chết hàng năm gây ra bởi S. iniae đã giảm từ 50% đến ít hơn 5% (Bercovier et al., 1997).

Trên cá chẽm, vắc xin phòng bệnh S.iniae được nghiên cứu đầu tiên ở Australia vào năm 2006 với các nghiên cứu của Creeper và Buller (2006), Delamare - Deboutteville et al. (2006). Các nghiên cứu này đã đạt được kết quả rất khả quan về khả năng đáp ứng miễn dịch dịch thể trên cá chẽm khi sử dụng phương pháp tiêm vắc xin bất hoạt ở xoang bụng với một lượng lớn kháng thể đặc hiệu được tìm thấy trong cả dịch nhầy và huyết thanh sau 21 ngày, ở phương pháp ngâm đáp ứng miễn dịch dịch thể mạnh mẽ được tìm thấy trong dịch nhầy. Tuy nhiên khi sử dụng vắc xin này vào thực tế ao nuôi thì gặp một số hạn chế đó là sau khi sử dụng vắc xin phòng bệnh cho cá vài tuần thì cá bị cảm nhiễm bệnh mà nguyên nhân vẫn chưa xác định được (Agnew và Barnes, 2007).

25

Đối với bệnh xuất huyết trên cá phi do tác nhân S. agalactiae gây ra, khi sử dụng vắc xin phòng bệnh do vi khuẩn S. agalactiae gây ra đã được thử nghiệm cho kết quả với tỷ lệ bảo hộ lên đến 60% (Manjaiang et al., 2007)

Kết quả thí nghiệm nghiên cứu sử dụng formalin bất hoạt nhằm phòng bệnh do vi khuẩn S. dysgalactiae gây ra trên cá đối (Liza Haematocheila) của Qi et al. (2012) cho thấy formalin bất hoạt đã bảo hộ thành công trên đối tượng này, tuy nhiên thí nghiệm còn phải kiểm chứng ngoài hiện trường mới xác định được tác dụng của formalin bất hoạt với vi khuẩn S. dysgalactiae.

Do vậy, để việc phòng và trị bệnh xuất huyết ở cá nói chung và ở cá bống kèo nói riêng có hiệu quả cần phải có những nghiên cứu bài bản về tác nhân và nguyên nhân gây bệnh để phát triển qui trình chẩn đoán sớm rồi từ đó có biện pháp phòng trị thích hợp.

26

Chƣơng III: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

- Phiếu điều tra: Sử dụng phiếu điều tra để tiến hành điều tra, thu thập

thông tin từ nông hộ (Phụ lục A).

- Nguồn cá thí nghiệm:

+ Cá thu ngoài hiện trường: Thu cá sống trong 34 ao, mỗi ao thu 10 con.

+ Cá thí nghiệm: Cá khỏe từ các ao nuôi ở Bạc Liêu.

- Nguồn vi khuẩn: vi khuẩn trong bộ sưu tập được phân lập qua 06 đợt thu mẫu để gây cảm nhiễm gồm 4 chủng có ký hiệu là: B1-6T; B2-5G; B2- 3TT; B6-9TT.

3.1.1 Dụng cụ

- Bộ tiểu phẫu, lame, lamen, kính hiển vi.

- Viết lông dầu, viết chì, bình xịt cồn, que cấy, đèn cồn, bật lửa, ống nghiệm, đĩa Petri thủy tinh, micropipet 1ml, 5ml. Hộp đầu col 1ml, 5ml, cân điện tử, chai thủy tinh, ống chích, Eppendorf (1,5ml).

- Máy ủ nhiệt, máy ly tâm, máy so màu quang phổ, máy đọc gel Vilber

Lourmat. Máy so màu quang phổ.

- Bể nhựa 60L, hệ thống sục khí.

3.1.2 Hóa chất

- Dung dịch Wright, dung dịch pH 6,2 - 6,8; dung dịch Giemsa.

- Cồn, nước muối sinh lý, nước cất, oxidase, catalase, parafine, dầu xem kính, crystal violet, ethanol 95%, ammonium oxalate, nước cất; iodine, potassium iodide, % acetone; safranin, NaCl, chlorine, methanol,

- Ethanol, dung dịch lysis buffer, cồn 70%, TE buffer, MgCl2, dNTPs,

Taq DNA polymerase, mồi xuôi, mồi ngược, gel 1,5% agarose.

- Bộ Kit API 20 Strep (BioMerieux, Pháp).

3.1.3 Môi trƣờng

- Tryptic soy agar (TSA) + 1,5% NaCl; tryptic soy broth (TSB) + 1,5%

NaCl; nitrate broth (NB) thêm 1,5% NaCl.

- Môi trường OF (oxidation-fermentation medium).

- Môi trường máu cừu (bổ sung 1,5% NaCl),.

27

3.1.4 Thuốc kháng sinh

Trimethoprim

(AML/25

µg),

+

Neomycin (N/30µg), Florfenicol (FFC/30 µg), Gentamicin (GM/10 µg), Doxycycline (DO/30 µg), Cefazolin (CZ/30 µg), Ampicillin (AMP/25 µg), Amoxicillin sulfamethoxazole (SXT/1,25/23,75 µg), Tetracycline (TE/30 µg), Norfloxacin (NOR/5 µg), Cirprofloxacin (CIP/5 µg), Enrofloxacine (ENR/5 µg).

3.1.5 Địa điểm và thời gian thực hiện

- Địa điểm điều tra và thu mẫu: thành phố Bạc Liêu, huyện Hòa Bình và

huyện Đông Hải, tỉnh Bạc Liêu.

- Thời gian điều tra nông hộ: từ tháng 9 đến 12 năm 2011.

- Thời gian thu mẫu: từ tháng 10/2011 đến 2014.

- Địa điểm phân tích mẫu và bố trí thí nghiệm: Bộ môn Bệnh Học Thủy

Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ.

3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu

3.2.1 Điều tra phỏng vấn

3.2.1.1. Số liệu thứ cấp

Dựa vào báo cáo năm 2009, 2010, 2011 của Sở Nông nghiệp & PTNT tỉnh Bạc Liêu. Số liệu báo cáo của các phòng Nông nghiệp của các huyện, thành phố và các trạm Khuyến nông – Khuyến ngư tỉnh Bạc Liêu về tình hình nuôi cá bống kèo thương phẩm trong tỉnh. Số liệu thứ cấp gồm: Tình hình nuôi trồng thủy sản ở tỉnh Bạc Liêu và tình hình nuôi thương phẩm cá bống kèo toàn tỉnh và các huyện, thành phố ở tỉnh Bạc Liêu.

3.2.1.2. Số liệu sơ cấp

Tiến hành điều tra 90 hộ nuôi cá bống kèo thương phẩm ở thành phố Bạc

Liêu, huyện Hòa Bình và huyện Đông Hải (Phụ lục A). Số liệu sơ cấp gồm:

Thông tin cơ bản và kinh nghiệm của người nuôi.

Thông tin về kỹ thuật nuôi cá bống kèo gồm: Công trình ao nuôi, cải tạo và xử lý chuẩn bị môi trường ao nuôi; Nguồn giống, thời gian thả nuôi, mật độ nuôi; Cách quản lý chăm sóc ao nuôi: cho ăn, quản lý môi trường ao nuôi; Tình hình sử dụng hóa chất và thuốc kháng sinh trong thời gian nuôi.

Thông tin về bệnh trên cá nuôi: Dấu hiệu bệnh và tỷ lệ thiệt hại; Cách

phòng và trị khi cá bống kèo xuất hiện bệnh.

28

3.2.2 Phƣơng pháp thu mẫu cá

Mẫu cá: thu 254 con cá bống kèo còn sống trong 34 ao nuôi (trong đó: 11 ao cá khỏe, 23 ao cá đang có biểu hiện cá bị xuất huyết). Quan sát ao cá khỏe là ao có cá biểu hiện bình thường, màu sắc sáng, nhanh nhẹn, ao không xuất hiện cá chết. Ao cá bệnh là ao cá biểu hiện lờ đờ, phản ứng chậm, cá có biểu hiện xuất huyết trên da và các vây cá, đang xuất hiện cá chết.

Điều kiện thu mẫu: thu mẫu ao cá bống kèo nuôi thương phẩm giai đoạn cá nuôi được 2 - 3 tháng tuổi, cá đạt từ 15 – 25 g/con. Thời gian thu mẫu là 7 - 8 giờ sáng.

3.2.3 Phƣơng pháp kiểm tra ký sinh trùng

Quan sát và ghi nhận các dấu hiệu bên ngoài, màu sắc cơ thể cá. Số lượng mẫu kiểm tra ký sinh trùng là 120 mẫu cá ở 12 ao gồm 04 đợt thu mẫu, mỗi đợt 03 ao, mỗi ao 10 con.

Kiểm tra trên da và mang: Dùng lame cạo nhẹ lớp nhớt đậy lamen lại và

quan sát dưới kính hiển vi quang học với vật kính có độ phóng đại 10X, 40X.

Kiểm tra ở ruột cá: Cắt đoạn ruột sau, đặt lên lame, lamen lại và quan sát dưới kính hiển vi quang học với vật kính có độ phóng đại 10X, 40X. Mổ hết ruột cá để tìm kí sinh trùng có kích thước lớn.

Mức độ cảm nhiễm của ký sinh trùng đặc trưng bằng hai đại lượng là

cường độ nhiễm và tỷ lệ nhiễm:

Số mẫu nhiễm KST

Tỉ lệ nhiễm (%) =

x 100

Tổng số mẫu đã kiểm tra

Số trùng

Cường độ nhiễm =

Con cá/cơ quan/lame/thị trường

3.2.4 Phƣơng pháp phân tích mẫu vi khuẩn

3.2.4.1 Phƣơng pháp nhuộm Giemsa

Mẫu phết: phết mẫu thận lên lame. Mẫu được cố định qua dung dịch Methanol trong 1 phút. Phương pháp nhuộm mẫu theo Humason, 1979 (trích dẫn bởi Rowley, 1990). Đặt lame mẫu vào dung dịch Wright trong 5 phút. Chuyển mẫu sang dung dịch pH 6,2 – 6,8 trong 5 phút. Sau đó cho vào dung dịch Giemsa trong 30 phút. Cho mẫu vào dung dịch pH 6,2 trong 30 phút. Rửa sạch mẫu bằng nước cất, để khô tự nhiên. Đọc kết quả dưới kính hiển vi ở vật kính 100X có giọt dầu.

29

3.2.4.2 Phƣơng pháp phân lập và định danh vi khuẩn

a. Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn

Khử trùng mặt ngoài cơ thể cá bằng cồn 70º. Sau khi mổ cá, khử trùng cơ quan, dùng dao mổ tiệt trùng rạch một đường trên thận. Đặt que cấy vào nơi vừa rạch, xoay nhẹ để lấy mẫu bệnh phẩm và cấy trên đĩa agar. Ủ các đĩa môi trường này trong tủ ấm ở nhiệt độ 28°C. Sau 48 giờ, quan sát và ghi nhận kết quả.

b. Xác định đặc điểm hình thái vi khuẩn

Sau 48 giờ ở 28ºC, tiến hành quan sát hình dạng, màu sắc của khuẩn lạc

để xác định tính ròng của mẻ cấy.

Quan sát hình dạng khuẩn lạc: Một khuẩn lạc do nhiều tế bào vi khuẩn hợp thành và có đặc điểm hình thái khác nhau tùy theo từng loài vi khuẩn. Khuẩn lạc có thể có các hình dạng như to, nhỏ, nhỏ li ti, trên mặt agar thì khuẩn lạc có thể nổi, bằng, khuyết xuống.

Quan sát màu sắc khuẩn lạc: màu trắng trong, trắng đục, kem, vàng …

Quan sát tính di động: Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý lên lame, tiệt trùng que cấy, lấy một ít vi khuẩn trải đều lên giọt nước. Đậy lamen lại, quan sát ở vật kính 100X có giọt dầu.

Tiến hành nhuộm Gram: Nhỏ 1 giọt nước cất lên lame, tiệt trùng que cấy, lấy 1 ít vi khuần trải đều lên giọt nước. Để khô tự nhiên, hơ lướt lame trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn. Tiến hành nhuộm Gram: Nhỏ dung dịch Crystal violet lên lame, để yên 1 phút. Sau đó rửa lại bằng nước cất. Nhỏ dung dịch Iodine lên lame, để yên 1 phút. Tẩy màu bằng aceton: nhỏ từ từ aceton lên lame cho đến khi giọt nuớc trên lame không còn màu tím, rồi rửa lame lại bằng nước cất. Nhỏ dung dịch Safranin lên lame, để 2 phút. Sau đó rửa lại bằng nước cất, để khô. Quan sát hình dạng và kích thước ở vật kính 100X có giọt dầu.

c. Xác định đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn

Kiểm tra tính ròng của vi khuẩn: kiểm tra các khuẩn lạc trên đĩa cấy có cùng nằm trên đường cấy, đồng nhất về màu sắc và hình dạng. Quan sát tiêu bản vi khuẩn nhuộm Gram, xem các tế bào vi khuẩn có đồng nhất về kích thước, hình dạng, màu sắc (tím/hồng).

Phản ứng Oxidase: dùng que cấy nhặt một khuẩn lạc cho tiếp xúc trên

que thử oxidase. Quan sát trong 30 giây và ghi nhận sự thay đổi màu sắc.

30

Phản ứng Catalase: nhỏ 1 giọt dung dịch 3% H2O2 lên lame. Dùng que

cấy tiệt trùng lấy 1 ít vi khuẩn cho vào dung dịch 3% H2O2.

Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (Phản ứng O/F): Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít vi khuẩn trên đĩa agar và cấy thẳng vào 2 ống nghiệm chứa môi trường O/F, sau đó phủ 0,5 - 1 ml dầu parafine tiệt trùng vào 01 ống nghiệm tạo điều kiện yếm khí trong ống nghiệm (kiểm tra khả năng lên men glucose: F), ống còn lại sẽ kiểm tra tính hiếu khí của vi khuẩn (khả năng oxy hóa: O) và ủ trong tủ ấm 28oC. Đọc kết quả sau 48 giờ.

Khả năng phát triển của vi khuẩn trong môi trường TSB (+ 6,5%NaCl): Hòa tan môi trường TSB (theo nhãn hướng dẫn) thêm 6,5% NaCl, cho 5ml vào ống nghiệm, thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Dùng pipet cho 3 giọt dung dịch vi khuẩn vào ống nghiệm TSB có 6,5% muối ủ trong tủ ấm sau 48 giờ. Vi khuẩn phát triển cho phản ứng (+) với một màu trắng đục và cho phản ứng (-) khi ống nghiệm trong suốt.

Phản ứng tạo nitrit từ nitrate: Hòa tan môi trường nitrate broth (theo nhãn hướng dẫn) thêm 1,5% NaCl, cho 5ml vào ống nghiệm, thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Dùng pipet cho 3 giọt dung dịch vi khuẩn vào ống nghiệm. Ủ trong tủ ấm ở 28oC sau 2 ngày nhỏ 1 ml thuốc thử A và thuốc thử B vào ống nghiệm. Phản ứng (+) khi màu đỏ xuất hiện trong khoảng 1 – 2 phút và ngược lại. (Thuốc thử A: Hòa tan 0,8% Sulphanilic acid trong 5 N- axit acetic và thuốc thử B: Hòa tan 0,5% α-naphthylamine trong 5N- axit acetic).

Khả năng tan huyết: Xác định khả năng tan huyết của vi khuẩn trên đĩa

môi trường máu cừu (bổ sung 1,5% NaCl) dạng α, β hay γ (Phụ lục B.1).

d. Phƣơng pháp định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep

(Biomérieux, Pháp)

Định danh ngẫu nhiên 32 chủng vi khuẩn trong bộ sưu tập vi khuẩn được thu qua 06 lần thu mẫu bằng kit API 20 Strep. Phương pháp định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep (Biomérieux, Pháp) (Phụ lục B.2), đọc kết quả theo Bảng 3.1.

31

Bảng 3.1: Thuốc thử và cách đọc kết quả phản ứng test API 20 Strep

Kết quả

Test

Âm tính (-)

Dƣơng tính (+)

VP1+VP2 / đọc sau 10 phút

VP

Không màu

Đỏ hồng

NIN / đọc sau 10 phút

HIP

Không màu / Xanh nhạt/ Xám nhạt

4 giờ

Xanh sẫm / Tím 4 giờ Đen / Xám

ESC

Không màu/Vàng nhạt

24 giờ Đen

24 giờ Không màu/Vàng nhạt/ Xám nhạt ZYM A + ZYM B / đọc sau 10 phút (PYRA đến LAP)

Không màu / Cam rất nhạt Không màu Không màu Không màu / Tím rất nhạt Không màu / Tím rất nhạt Không màu Không màu

Cam Tím Xanh Tím Tím Cam Đỏ

PYRA αGAL βGUR βGAL PAL LAP ADH

4 giờ Đỏ Đỏ Đỏ Đỏ Đỏ Đỏ Đỏ Đỏ Đỏ

24 giờ Cam / Đỏ Cam / Đỏ Cam / Đỏ Cam / Đỏ Cam / Đỏ Cam / Đỏ Cam / Đỏ Cam / Đỏ Cam / Đỏ

24 giờ Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng Vàng

4 giờ Cam / Vàng Cam / Vàng Cam / Vàng Cam / Vàng Cam / Vàng Cam / Vàng Cam / Vàng Cam / Vàng Cam / Vàng

RIB ARA MAN SOR LAC TRE INU RAF AMD GLYG

Cam / Đỏ

Vàng

3.2.5 Định danh vi khuẩn bằng phƣơng pháp giải trình tự

3.2.5.1 Phƣơng pháp chiết tách DNA vi khuẩn

Qui trình chiết tách DNA từ vi khuẩn áp dụng theo phương pháp của

Bartie et al. (2006).

Vi khuẩn được nuôi tăng sinh 18 giờ trong 5 ml môi trường Nutrient Broth (có bổ sung 1,5% NaCl) ở nhiệt độ 28ºC, sau đó được sử dụng để ly trích DNA bằng cách cho 1,5 ml dung dịch vi khuẩn vào ống ly tâm cùng với 100 µl 10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, pH 8.0 (TE). Hỗn hợp được đun nóng ở 95ºC trong 15 phút, rồi được làm lạnh trong nước đá và ly tâm 2 phút ở vận tốc 14.000 vòng/phút để tách dung dịch DNA và trữ ở -20ºC.

3.2.5.2 Phƣơng pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA của vi khuẩn

Vi khuẩn sau khi được tách ròng đem nuôi tăng sinh trong môi trường Brain Heat Infusion Broth có bổ sung 1,5% NaCl (BHIB+). 10 mẫu vi khuẩn

32

được chọn từ kết quả phân lập được định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA gồm: B1-6T; B2-5G; B2-3TT; B6-9TT; A1F1; A1F2; A1F4; A1F6; A1F9; A5F4. Sản phẩm PCR mẫu được gởi đến phòng thí nghiệm NK- Biotek và đơn vị R&D của công ty Nam Khoa giải trình tự gen 16S rRNA Sản phẩm giải trình tự được chạy điện di giải trình tự trên máy giải trình tự ABI 3130XL 16 capillar. Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S được so chuỗi bằng chương trình Blast search trên cơ sở dữ liệu ngân hàng gen của NCBI. So sánh kết quả sản phẩm giải trình tự đoạn gen 16S định danh loài và giải mã trình tự của bộ gen vi khuẩn được phân lập.

3.2.6 Phƣơng pháp mô bệnh học

Số lượng mẫu phân tích mô học gồm 127 mẫu cá. Đợt 1 gồm 35 con ở ao số 1, 2, 3 và 4. Đợt 2 gồm 21 mẫu ở ao 1, 2, 3 và 4. Đợt 3 gồm 24 con ở ao số 1, 2 và 3. Đợt 4 gồm 47 con ở ao số 1, 2, 3, 4, 5 và 6.

Lấy mẫu mô ở mang, gan, thận của cá bệnh và cá khỏe. Mẫu được thu và cố định trong dung dịch formalin trung tính (10%). Mẫu cố định sau 24 giờ và chuyển sang cồn 70º.

Mẫu được cắt tỉa với độ dày từ 5 mm, sau đó được xử lý bằng máy xử lý tự động qua các giai đoạn loại nước, làm trong mẫu và tẩm paraffin. Sau đó đúc khối mẫu bằng paraffin và sáp ong nóng chảy (1:1), sử dụng máy cắt microtome để cắt mẫu với độ dày 5 μm và nhuộm mẫu bằng dung dịch Haematocyline và Eosin (H&E). Tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi lần lượt ở vật kính 10X, 40X, 100X có nhỏ giọt dầu soi kính và chụp lại hình tiêu bản đặc trưng. Đọc kết quả dựa theo tài liệu của Ferguson (2006) (trích dẫn bởi Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011).

3.2.7 Phƣơng pháp huyết học

3.2.7.1 Phƣơng pháp phân tích mẫu máu cá

Số lượng mẫu phân tích huyết học gồm 102 mẫu cá. Đợt 1 gồm 30 con ở ao số 1, 2 và 3. Đợt 2 gồm 19 mẫu ở ao 1 và 2. Đợt 3 gồm 20 con ở ao số 1 và 2. Đợt 4 gồm 33 con ở ao số 1, 2, 3 và 4.

Dùng cồn 70% sát trùng quanh khu vực lấy máu, máu được lấy ở động mạch chủ ở đuôi cá (Houston, 1990). Phết mẫu máu. Mẫu máu sau khi khô được cố định bằng cách ngâm trong methanol 2 phút (Rowley, 1990).

3.2.7.2 Định lƣợng hồng cầu

Mẫu cá được pha loãng 200 lần và nhuộm trong dung dịch Natt-Herrick với 10 µl máu và 1990 µl dung dịch nhuộm hồng cầu trong 3 phút (Natt và

33

Herrick, 1952). Hồng cầu được đếm qua buồng đếm hồng cầu ở vật kính 40X. Đếm 4 ô lớn (1 ô lớn có 25 ô nhỏ) ở 4 góc của buồng đếm và 1 ô ở trung tâm buồng đếm.

Công thức tính mật độ hồng cầu:

R = C x 10 x 5 x 200

Trong đó: R: mật độ hồng cầu (tb/mm3)

C: tổng số hồng cầu trên 5 vùng đếm 10: khoảng cách giữa lamelle và buồng đếm là 0,1mm 5: diện tích của mỗi vùng đếm là 0,2 mm2 200: độ pha loãng hồng cầu.

3.2.7.3 Định tính và định lƣợng bạch cầu

Phương pháp nhuộm mẫu: mẫu được nhuộm theo phương pháp Wright’s & Giemsa (Humason, 1997 trích dẫn bởi Rowley, 1990). Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X và các loại tế bào bạch cầu sẽ được xác định (theo Supranee et al., 1991). Phương pháp định lượng các tế bào bạch cầu:

Tổng bạch cầu (TBC): đếm tổng số hồng cầu và bạch cầu là 1500 tế bào

trên mẫu nhuộm:

số bạch cầu trong 1500 tế bào x mật độ hồng cầu trên buồng đếm

TBC (tb/mm3) =

Số hồng cầu trong 1500 tế bào trên mẫu nhuộm

Từng loại bạch cầu: đếm tổng số bạch cầu bằng 200 tế bào.

Số lượng mỗi loại bạch cầu x mật độ TBC

Mật độ từng loại (tb/mm3) =

200

3.2.8 Phƣơng pháp chẩn đoán nhanh bệnh xuất huyết

3.2.8.1 Phƣơng pháp chiết tách DNA từ vi khuẩn: (giống 3.2.5.1)

3.2.8.2 Phƣơng pháp chiết tách DNA từ mô thận cá

Dựa trên phương pháp chiết tách Phenol chloroform của Taggart et al. (1992) (được điều chỉnh bởi Đặng Thị Hoàng Oanh và Đặng Thụy Mai Thy, 2009) để chiết tách DNA thận cá.

Lấy không quá 10% mẫu thận cá/dung dịch chiết tách được trữ trong ethanol 100% chuyển sang ống eppendorf (1,5ml) có chứa 600µl dung dịch Lysis buffer (0,5M NaCl, 0,001M EDTA, 1% SDS, 0,8% Triton, 0,1M Tris-

34

HCl), 40µl SDS 10% và 2,5µl Proteinase K (40µg/µl) và được nghiền nát, lắc ống 25 lần rồi ủ ở nhiệt độ 37oC trong 15 phút.

Cho vào 2,5µl Rnase (2µg/µl), lắc ống 25 lần và tiếp tục ủ dung dịch ở nhiệt độ 37oC trong 30 phút. Cho 600µl Chloroform – Isoamyl (24:1), ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút. Protein sẽ lắng xuống thành 1 lớp nhỏ giữa 2 pha. Hút dung dịch phía trên cho vào ống eppendorf 1,5ml mới.

Cho vào 600µl Phenol – Chloroform – Isoamyl (25:24:1), đảo ngược ống và ly tâm 13.000 vòng/phút ở nhiệt độ 4oC. Hút dung dịch phía trên cho vào ống eppendorf 1,5ml mới. Cho vào 600 µl isopropanol lạnh, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. DNA lắng ở đáy ống, nhẹ nhàng loại bỏ dung dịch phía trên.

Cho vào 600µl cồn 70% lạnh, đánh nhẹ eppendorf để rửa DNA. Loại bỏ

cồn phía trên.

Lặp lại bước trên 1 lần nữa. Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng, hòa tan với 50µl TE buffer (10mM

Tris, 1mM EDTA, pH=7), bảo quản ở -20oC.

3.2.8.3 Phƣơng pháp khuếch đại DNA

Phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA được thực hiện dựa theo qui trình của Nunan et al. (2003). Tổng thể tích phản ứng 50 µl gồm 1X dung dịch đệm; 2 mM MgCl2; 200 µM dNTPs; 2.5 UI Taq DNA polymerase; 0.22 µM mồi xuôi (7611F); 0.22 µM mồi ngược (7611R) và 20 ng mẫu DNA. Chu kỳ nhiệt thực hiện phản ứng là 95ºC trong 2 phút; 95ºC trong 30 giây, 45ºC trong 30 giây, 72ºC trong 2 phút; lặp lại chu kì trên 30 lần; 45ºC trong 1 phút; 72ºC trong 2 phút. Trọng lượng phân tử đoạn DNA của S. dysgalactiae cần phát hiện là 1500 bp. Đoạn mồi sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA được thiết kế bởi Zinniel et al., (2002) có trình tự:

mồi 1: p515FPL 5’-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA- 3’,

mồi 2: p13B 5’AGGCCCGGGAACGTATTCAC-3’.

3.2.8.4 Phƣơng pháp PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae

Sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 cho phản ứng PCR theo

Hassan et al. (2003).

STRD-DyI:

“5′ TGGAACACGTTAGGGTCG 3′”

dys-16S–23S-2:

“5′ CTTAACTAGAAAAACTCTTGATTATTC 3′”

Thực hiện qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae dựa trên phương pháp của Hassan et al. (2003), đối chứng dương sử dụng trong phản

35

ứng PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae là vi khuẩn đã được giải mã định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S là vi khuẩn có ký hiệu B2-5G.

Thành phần hóa chất phản ứng PCR phát hiện S. dysgalactiae: Tổng thể tích phản ứng 30 µl, gồm: 1,0 µl mồi xuôi STRD-DyI (10 pmol/l); 1,0 µl mồi ngược dys-16S–23S-2 (10 pmol/l); 0,6 µl dNTP (10 mmol); 3,0 µl thermophilic-buffer (10X); 1,8 µl MgCl2 (25 mmol); 0,2 µl Taq DNA polymerase (5 U/ µl) và 19,9 µl nước cất. Chu kỳ nhiệt thực hiện phản ứng là 94ºC trong 4 phút; 94ºC trong 30 giây, 50ºC trong 60 giây, 72ºC trong 30 giây; lặp lại chu kì trên 30 lần; 72ºC trong 5 phút; giữ ở 20ºC. Trọng lượng phân tử đoạn DNA của S. dysgalactiae cần phát hiện là 259 bp.

3.2.8.5 Phƣơng pháp điện di

Sử dụng 10 l sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel 1.5% agarose (ABgene, UK) trong dung dịch đệm  1 TAE (10 mM Tris, 5 mM acetate, 0,1 mM EDTA). Kết quả điện di được ghi nhận bằng máy đọc gel Vilber Lourmat (Pháp). Thang DNA 1 kb plus (Invitrogen) được chạy chung với mẫu để xác định kích thước của các vạch DNA.

3.2.8.6 Phƣơng pháp xác định độ nhạy của phản ứng PCR phát hiện

S. dysgalactiae

Độ nhạy của qui trình là giới hạn thấp nhất (nồng độ DNA thấp nhất) để phát hiện được S. dysgalactiae, độ nhạy của phản ứng PCR phát hiện S. dysgalactiae.

Lấy 0,5 g mô thận cá trộn với các mật độ vi khuẩn 25 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng, 400 ng, 800 ng, 1.600 ng và 3.200 ng được dùng cho phản ứng PCR phát hiện S. dysgalactiae để xác định độ nhạy của qui trình.

3.2.8.7 Phƣơng pháp xác định tính đặc hiệu của qui trình PCR phát

hiện S. dysgalactiae

Tính đặc hiệu của qui trình PCR chính là độ đặc hiệu của các cặp mồi sử dụng. Cặp mồi được lựa chọn có khả năng bắt cặp tốt với trình tự ở 2 đầu của đoạn gen mục tiêu và không phát hiện DNA của các chủng vi khuẩn khác.

Dùng cặp mồi trong phản ứng PCR phát hiện S. dysgalactiae để phát hiện 5 loại vi khuẩn khác bao gồm: Vibrio parahaemolyticus, Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophilla, Streptococcus agalactiae, Flavobacterium columnare. Trong phản ứng sử dụng 1 đối chứng dương, đối chứng dương là vi khuẩn S. dysgalactiae đã được giải mã định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S là vi khuẩn có ký hiệu B2-5G.

36

3.2.8.8 Khả năng ứng dụng của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S.

dysgalactiae

Kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình ở 10 dòng vi khuẩn S.

dysgalactiae khác nhau.

Kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình trên 10 mẫu cá (A1F1, A1F2, A1F4, A1F6, A1F9, A5F4, B1-6, B2-3, B2-5 và B6-9) đã được phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh nhằm xác định khả năng ứng dụng của qui trình.

3.2.9 Phƣơng pháp lập kháng sinh đồ

Phương pháp lập kháng sinh đồ theo phương pháp của Geert Huy, 2002.

3.2.9.1 Phƣơng pháp phục hồi vi khuẩn

Vi khuẩn trữ ở -80oC được phục hồi trên môi trường TSA có bổ sung

1,5% NaCl và ủ sau 24 giờ ở 30oC.

Vi khuẩn được phục hồi, kiểm tra tính thuần bằng cách quan sát sự đồng nhất về hình đạng, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc và nhuộm Gram, các chỉ tiêu sinh hóa cơ bản (oxidase, catalase, tính di động, khả năng lên men và oxy hóa đường glucose) và chạy PCR xác định vi khuẩn.

3.2.9.2 Phƣơng pháp lập kháng sinh đồ

Dùng que cấy lấy khuẩn lạc trên đĩa vi khuẩn cho vào ống nghiệm có chứa 5 ml dung dịch NaCl 0,85% đã tiệt trùng, trộn đều và so sánh độ đục dung dịch chuẩn 1.0 McFarland (9,7 ml 1% H2SO4 và 0,3 ml 1% BaCl2), xác định mật độ dựa vào máy so màu quang phổ, ở bước sóng 610 nm với giá trị OD = 1 thì mật độ vi khuẩn là 109 tế bào/ml, điều chỉnh cho đến khi độ đục ngang bằng với ống chuẩn Mcfarland.

Dùng pipet hút lần lượt 0,1 ml dung dịch vi khuẩn cho lên môi trường thạch MHA (+ 1,5% NaCl) và trãi đều. Sau đó để yên khoảng 1 phút rồi dùng pen tiệt trùng lấy đĩa kháng sinh đặt vào đĩa petri sao cho khoảng cách giữa hai tâm của đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24 mm và khoảng cách giữa tâm đĩa kháng sinh với mép đĩa petri khoảng 10 – 15 mm. Mỗi đĩa petri dán 4 đĩa kháng sinh.

Đặt đĩa vào tủ ấm ở 30oC. Đọc kết quả sau 48 giờ.

Cách đọc: Đo đường kính vô trùng (mm) và dựa vào chuẩn đường kính

vô trùng của nhà sản xuất để xác định độ nhạy, trung bình nhạy và kháng.

37

Bảng 3.2 Đường kính vô trùng của một số kháng sinh

Kháng sinh (Công ty Biorad & Oxoid)

sulfamethoxazole

Neomycin (N/30µg) Florfenicol (FFC/30 µg) Cirprofloxacin (CIP/5 µg) Gentamicin (GM/10 µg) Doxycycline (DO/30 µg) Cefazolin (CZ/30 µg) Ampicillin (AMP/25 µg) Amoxicillin (AML/25 µg) + Trimethoprim (SXT/1,25/23,75 µg) Tetracycline (TE/30 µg) Norfloxacin (NOR/5 µg) Enrofloxacine (ENR/5 µg)

Chuẩn đường kính vô trùng Trung bình 13-16 17-19 16-20 13-14 13-15 15-17 14-17 14-17 11-15 15-18 13-16 17-22

Kháng ≤12 ≤16 ≤15 ≤12 ≤12 ≤14 ≤13 ≤13 ≤10 ≤14 ≤12 ≤16

Nhạy ≥17 ≥20 ≥21 ≥15 ≥16 ≥18 ≥18 ≥18 ≥16 ≥19 ≥17 ≥23

(Nguồn: Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2011)

3.2.9.3 Phƣơng pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của

thuốc kháng sinh

Phương pháp xác định MIC dựa trên thủ thuật nuôi cấy một chủng vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy lỏng với các độ pha loãng khác nhau của một loại thuốc kháng sinh. Giá trị MIC được xác định là hàm lượng thuốc trong ống nghiệm đầu tiên không có vi khuẩn phát triển. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn được xác định theo phương pháp của Geert Huys (2002) (Phụ lục B.3).

3.2.10 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm

3.2.10.1 Chuẩn bị bể thí nghiệm Bể nhựa 500 L được vệ sinh kỹ bằng xà phòng và chlorine 200 ppm, phơi khô. Sau đó cấp nước vào khoảng 2/3 bể, có sục khí. Xô nhựa 60 lít cấp nước khoảng 1/3 bể được đặt trong phòng. Nguồn nước sử dụng là nước máy có độ mặn 10‰. Các dụng cụ thí nghiệm như: xô, ống sụt khí, vợt, đá bọt... cũng được vệ sinh kỹ.

3.2.10.2 Nguồn cá thí nghiệm Cá bống kèo có trọng lượng khoảng 15 - 20 g/con. Cá đồng cỡ, khỏe mạnh, linh hoạt, da sáng. Cá sau khi mua về được nuôi dưỡng trong bể nhựa 500 L, có sục khí khoảng 1 tuần. Kiểm tra sức khỏe của cá (chọn ngẫu nhiên 5 con) trước khi tiến hành bố trí thí nghiệm.

3.2.10.3 Chuẩn bị vi khuẩn gây cảm nhiễm Vi khuẩn trữ được phục hồi trên môi trường TSA bổ sung 1,5% NaCl (TSA+), ủ ở 28oC. Sau 48 giờ quan sát hình dạng và màu sắc của khuẩn lạc và

38

kiểm tra tính thuần thông qua các đặc điểm màu sắc, hình dạng và kích thước của vi khuẩn (bằng phương pháp nhuộm Gram).

Chọn 2 khuẩn lạc đồng nhất để nuôi tăng sinh trong 100 ml môi trường TSB bổ sung 1,5% NaCl (TSB+), ủ trong tủ ấm ở 28oC trong 48 giờ. Sau đó, vi khuẩn được ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút để thu phần viên. Vi khuẩn được rửa sạch 2 lần trong nước muối sinh lý và đếm mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610 nm (OD = 1 tương đương với mật độ vi khuẩn 1 x 109 CFU/ml). Dung dịch vi khuẩn được pha loãng 10 lần (1ml dung dịch vi khuẩn 1 x 109 CFU/ml + 9 ml nước muối sinh lý) để được các mật độ 108, 107, 106, 105, 104, 103 CFU/ml.

Mật độ vi khuẩn cũng được xác định bằng cách nhỏ 100 µl (lặp lại 3 lần) dung dịch vi khuẩn lên đĩa TSA+, cho vi khuẩn phát triển trong 48 giờ ở điều kiện 28oC. Đếm số lượng khuẩn lạc, xác định mật độ vi khuẩn bằng công thức: Tế bào vi khuẩn (CFU/ml) = Số khuẩn lạc trên đĩa x 10 x Hệ số pha loãng

3.2.10.4 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm cảm nhiễm Thí nghiệm cảm nhiễm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức là 4 chủng vi khuẩn B1-6T, B2-3TT, B2-5G, B6-9TT với mật độ vi khuẩn tiêm là 108 CFU/cá và nghiệm thức đối chứng cá được tiêm nước muối sinh lý. Cá thí nghiệm được tiêm 0,1 ml/cá tại gốc vi ngực. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần với mật độ 10 con cá/bể.

Sau khi tiêm, biểu hiện của cá được theo dõi liên tục trong 7 ngày. Những cá có dấu hiệu lờ đờ, bơi lội kém linh hoạt được thu để giải phẫu quan sát dấu hiệu bệnh xuất huyết và tái phân lập vi khuẩn từ gan, thận và tỳ tạng để xác định các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa (tái phân lập).

Phương pháp kính phết cũng được phân tích ngay sau khi thu mẫu, cắt

lấy phần thận phết lên lame, nhuộm và quan sát vi khuẩn.

Kết thúc thí nghiệm, ở mỗi nghiệm thức tiến hành thu mẫu mô (3

con/nghiệm thức) ở các cơ quan mang, gan và thận.

Sau khi bố trí thí nghiệm cảm nhiễm tiếp tục tiến hành chọn 2 chủng vi

khuẩn có độc lực cao nhất để bố trí thí nghiệm xác định giá trị LD50. 3.2.10.5 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm xác định LD50 Thí nghiệm xác định LD50 được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên sử dụng 02 chủng vi khuẩn B1-6T và B2-5G với 7 nghiệm thức ở các mật độ vi khuẩn lần lượt là 102, 103,104, 105, 106, 107, 108 CFU/cá và nghiệm thức đối chứng tiêm nước muối sinh lý. Cá thí nghiệm được tiêm 0,1 ml/cá tại gốc vi ngực. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần với mật độ 20 con cá/bể.

Nghiệm thức đối chứng: tiêm nước muối sinh lý. Nghiệm thức 1: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 102 CFU/cá). Nghiệm thức 2: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 103 CFU/cá).

39

Nghiệm thức 3: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 104 CFU/cá). Nghiệm thức 4: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 105 CFU/cá). Nghiệm thức 5: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 106 CFU/cá). Nghiệm thức 6: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 107 CFU/cá). Nghiệm thức 7: cá được tiêm vi khuẩn (mật độ 108 CFU/cá). Nghiệm thức 8: đối chứng cá tiêm nước muối sinh lý. Sau khi tiêm, biểu hiện của cá được theo dõi liên tục trong 14 ngày. Những cá có dấu hiệu lờ đờ, bơi lội kém linh hoạt được thu để giải phẫu quan sát dấu hiệu bệnh xuất huyết và tái phân lập vi khuẩn từ gan, thận và tỳ tạng để xác định các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa. Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn được thực hiện lặp lại 3 lần, kết quả được ghi nhận là kết quả có ít nhất 2 lần lặp lại.

Nồng độ vi khuẩn gây chết 50% cá thí nghiệm (LD50) được xác định theo

công thức của Reed và Muench (1938):

LD50 = 10 a – p.d

Trong đó:

p.d = (L% - 50%) / (L% - H%)

a: Số lũy thừa mà tại đó vi khuẩn gây chết cá thấp nhất (trên 50%) H%: Tỷ lệ cá chết cao nhất (dưới 50%) L%: Tỷ lệ cá chết thấp nhất (trên 50%).

3.2.10.6 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm điều trị bệnh xuất huyết ở

qui mô phòng thí nghiệm

Vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm là chủng B1-6T, mật độ vi khuẩn

tiêm cảm nhiễm là 104 CFU/cá.

Thuốc kháng sinh: DO và FFC sử dụng trong thí nghiệm là thuốc kháng sinh của công ty UV trong đó: DO và FFC nguyên liệu. DO thành phẩm có tên thương mại là Rydoxyne. FFC thành phẩm có tên thương mại là UV-Flo.

Thuốc được trộn vào thức ăn cho cá ăn, hàm lượng 20 mg thuốc/kg trọng

lượng cá. Cho cá ăn theo nhu cầu.

Thí nghiệm phòng trị gồm 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức bố trí 30

con, lặp lại 3 lần:

Nghiệm thức 1: dùng thuốc kháng sinh DO ở dạng nguyên liệu, cá được gây bệnh ngày 1 và cho ăn thức ăn trộn thuốc vào ngày 3. Cho ăn thức ăn trộn thuốc liên tục trong 5 ngày.

40

Nghiệm thức 2: dùng thuốc kháng sinh DO ở dạng thành phẩm, cá được gây bệnh ngày 1 và cho ăn thức ăn trộn thuốc vào ngày 3. Cho ăn thức ăn trộn thuốc liên tục trong 5 ngày

Nghiệm thức 3: dùng thuốc kháng sinh FFC ở dạng nguyên liệu, cá được gây bệnh ngày 1 và cho ăn thức ăn trộn thuốc vào ngày 3. Cho ăn thức ăn trộn thuốc liên tục trong 5 ngày

Nghiệm thức 4: dùng thuốc kháng sinh FFC ở dạng thành phẩm, cá được gây bệnh ngày 1 và cho ăn thức ăn trộn thuốc vào ngày 3. Cho ăn thức ăn trộn thuốc liên tục trong 5 ngày

Nghiệm thức 5: đối chứng 1: cá được gây bệnh ngày 1 và cho ăn thức ăn

không trộn thuốc.

Nghiệm thức 6: đối chứng 2: cá được tiêm muối sinh lý và cho ăn thức

ăn không trộn thuốc.

Nghiệm thức 7: đối chứng 3: cá không được gây bệnh, không tiêm nước

muối sinh lý, cho ăn thức ăn không trộn thuốc.

Thời gian thí nghiệm là 21 ngày. Theo dõi tỷ lệ cá chết hàng ngày, ghi nhận và chụp hình dấu hiệu bệnh lý bên ngoài và bên trong. Cá bệnh (còn sống) được tái phân lập và thu mẫu mô 2 ngày/lần. Cuối thí nghiệm thu mẫu phân lập vi khuẩn, mô học (3 cá/nghiệm thức).

Hiệu quả điều trị bệnh trong phòng thí nghiệm được đánh giá bằng tỉ lệ

sinh tồn tương đối (RPS) (%) theo công thức (Ellis, 1996):

% cá chết ở nghiệm thức sử dụng thuốc

1-

x 100

Giá trị RPS (%) =

% cá chết ở nghiệm thức đối chứng dương

3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu:

Số liệu điều tra của luận án được thu thập, tổng hợp và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel. Số liệu huyết học, kết quả thí nghiệm LD50, thí nghiệm điều trị được xử lý bằng phần mềm thống kê SPSS version 20. Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S được so chuỗi bằng chương trình Blast search trên cơ sở dữ liệu ngân hàng gen của NCBI trực tuyến. Luận án được trình bày bằng phần mềm Microsoft Word.

41

Chƣơng IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Khảo sát tình hình nuôi cá bống kèo

4.1.1 Kỹ thuật nuôi cá bống kèo

Tình hình quản lý dịch bệnh trên cá bống kèo nuôi tại tỉnh Bạc Liêu được ghi nhận qua kết quả điều tra 90 hộ nuôi cá bống kèo thương phẩm. Phần lớn các hộ được điều tra có kinh nghiệm nuôi từ 2 - 4 năm. Diện tích nuôi cá bống kèo tập trung từ 1.000 - 5.000 m2. Nguồn giống thả phụ thuộc vào tự nhiên với mật độ phổ biến từ 100 - 150 con/m2. Vụ nuôi bắt đầu từ tháng 6 - 9 dương lịch. Các hộ được phỏng vấn không sử dụng ao lắng, lọc mà lấy nước trực tiếp từ sông và kênh thủy lợi. Trong quá trình nuôi, hầu hết các hộ nuôi không thay nước mà chỉ cấp thêm nước, xử lý hóa chất và vi sinh nhằm cải thiện môi trường nuôi. Bệnh thường xuất hiện trong ao nuôi cá bống kèo thương phẩm là bệnh xuất huyết (chiếm 78,9%), bệnh lở loét (50%) và bệnh chướng bụng (50%) đã làm ảnh hưởng đến năng suất nuôi và lợi nhuận của người nuôi. Giai đoạn cá bị bệnh tập trung nhiều khi cá nuôi được khoảng 2 tháng tuổi và amoxicillin là loại kháng sinh được người nuôi sử dụng rộng rãi để phòng và trị bệnh cho cá.

4.1.1.1 Kinh nghiệm của ngƣời nuôi cá bống kèo

Cá bống kèo được người dân chú ý phát triển nuôi từ những năm 2000 nên hầu hết những hộ nuôi đã tích lũy được kinh nghiệm nuôi qua các năm. Các hộ nuôi được điều tra có kinh nghiệm nuôi cá bống kèo thương phẩm tập trung ở 2 năm (23,3%) và 3, 4 năm (20%) kinh nghiệm nuôi. Tổng số hộ được điều tra có kinh nghiệm nuôi từ 5-7 năm chiếm tỷ lệ 27,8% (Bảng 4.1).

Bảng 4.1 Kinh nghiệm của người nuôi cá bống kèo

Kinh nghiệm nuôi (năm) 1 2 3 4 5 6 7 Tổng cộng

Số hộ 8 21 18 18 12 11 2 90

Tỷ lệ (%) 8,9 23,3 20 20 13,3 12,2 2,3 100

Điều này cho thấy nghề nuôi cá bống kèo ngày càng được người dân chú ý và phát triển, kết quả điều tra phù hợp với số liệu thống kê của Sở NN&PTNT tỉnh Bạc Liêu, diện tích nuôi cá bống kèo ngày càng mở rộng. Điển hình là cuối năm 2011, diện tích nuôi cá bống kèo đạt 342,22 ha thì đến cuối năm 2012 diện tích nuôi đã đạt đến 490 ha, tuy nhiên đến cuối năm 2013

42

diện tích nuôi cá bống kèo lại giảm còn 249,3 ha do tình hình dịch bệnh và giá cá thương phẩm giảm làm ảnh hưởng đến diện tích và tâm lý người nuôi. Cá bống kèo là đối tượng nuôi mới, qui trình kỹ thuật nuôi chưa được nghiên cứu hoàn chỉnh cùng với sự tích lũy kinh nghiệm nuôi còn ít nên rất ít hộ có kiến thức về nuôi cá bống kèo, điều này ảnh hưởng không nhỏ đến năng suất và lợi nhuận từ nghề nuôi cá bống kèo thương phẩm.

4.1.1.2 Diện tích nuôi

Diện tích nuôi cá bống kèo phổ biến từ 1.000 – 5.000 m2 (chiếm 34,5%), diện tích nuôi trung bình 10.850 m2 (±8.220m2). Số hộ nuôi có diện tích lớn chiếm tỷ lệ khá cao cho thấy người nuôi có xu hướng đầu tư lớn (Bảng 4.2). Tuy qui mô nuôi không đồng đều nhưng nhìn chung kết cấu, qui mô công trình nuôi đều được người dân thiết kế khá giống nhau, phù hợp với qui mô nuôi cá bống kèo thương phẩm.

Bảng 4.2 Diện tích nuôi cá bống kèo

Diện tích nuôi (m2)

≤ 5.000 ≤ 10.000 ≤ 15.000 ≤ 20.000 > 20.000 Tổng cộng

Số hộ 31 25 12 11 11 90

Tỷ lệ (%) 34,5 27,8 13,3 12,2 12,2 100

4.1.1.3 Mùa vụ nuôi và thời gian nuôi

Mùa vụ nuôi cá bống kèo thương phẩm bắt đầu từ tháng 6 kéo dài đến tháng 2, 3 dương lịch. Người dân có thể thả nuôi 2 vụ/năm. Trước đây khi nuôi luân canh tôm – cá, thì một năm cá bống kèo chỉ được nuôi 1 vụ. Hiện nay có hộ nuôi chuyên canh cá bống kèo 2 vụ/năm (22,2%) nhưng phần lớn chỉ nuôi 1 vụ/năm (77,8%).

Vụ 1 (vụ thuận) (từ tháng 6 – 9 và 10 dương lịch) là những tháng mưa nên độ mặn trong ao nuôi giảm dần cá lớn khá nhanh, khoảng 3 – 4 tháng cá có thể đạt được trọng lượng 50 con/kg, cá giống ít hao hụt. Điều này phù hợp với nhận định của Trương Hoàng Minh và Nguyễn Thanh Phương (2011) tháng 6 – 9 là mùa vụ thả nuôi cá bống kèo thích hợp là mùa mưa vì nguồn cá bống kèo giống tự nhiên phong phú, độ mặn thấp (14 – 18‰ vào tháng 5 và 5 – 8‰ vào tháng 8). Vụ 2 (từ tháng 11 – 2 và 3 dương lịch) lúc này độ mặn của nước tăng dần nên cá lớn chậm thường phải nuôi trong 5 – 6 tháng, cá giống dễ hao hụt.

Thời gian nuôi cá bống kèo thương phẩm trung bình là 4 tháng (chiếm 91,1%) nhưng có hộ nuôi đến 5 tháng (chiếm 2,2%). Số lượng vụ nuôi và thời 43

gian nuôi bị ảnh hưởng bởi giá cá thương phẩm. Trong những năm gần đây, giá cá bống kèo thương phẩm không ổn định, nên người nuôi thường căn cứ vào giá cả cũng như nhu cầu thị trường để quyết định số vụ nuôi trong năm cũng như thời gian thu hoạch cá nuôi.

4.1.1.4 Kỹ thuật nuôi

a. Chuẩn bị và cải tạo ao

Cá bống kèo là loài có tính ăn thiên về thực vật, cá sống trong môi trường giàu tảo khuê và mùn bã hữu cơ, nền đáy là bùn hay bùn cát (Trần Đắc Định và ctv., 2002) vì thế trong quá trình chuẩn bị ao nuôi, cần tiến hành gây màu nước tạo nguồn thức ăn tự nhiên cho cá giống khi thả nuôi.

Hầu hết các hộ nuôi đều có cải tạo ao trước mỗi vụ nuôi, tùy theo kinh nghiệm và đặc điểm của từng vùng mà người dân lựa chọn hình thức cải tạo khô hay ướt. Đa số người nuôi chọn hình thức cải tạo ao bằng cách phơi khô ao (86,7%) với thời gian phơi ao vài ngày hoặc vài tuần tùy điều kiện thời tiết, nhưng nhìn chung các hộ đều phơi ao đến khi đáy ao nứt chân chim thì bắt đầu tiến hành các bước kế tiếp. Một số hộ nuôi chọn cách cải tạo ao bằng cách để một ít nước trong ao khoảng 10 cm và tiến hành bón vôi (13,3%).

Bón phân gây màu bằng phân hữu cơ hoặc vô cơ để gây màu nước nhằm tạo nguồn thức ăn tự nhiên cho cá nuôi trong giai đoạn vừa thả giống là cần thiết, nhưng người nuôi chưa chú trọng đến việc bón phân gây màu trong ao nuôi cá bống kèo. Có 7 hộ được phỏng vấn (chiếm 7,8%) có bón phân gây màu cho ao (chủ yếu là NPK với liều 3 kg NPK/1.000 m2), còn lại 83 hộ nuôi được phỏng vấn không bón phân gây màu nước cho ao nuôi (92,2%). Điều này là do người dân khi tiến hành nuôi cá với mật độ cao, chủ động cho cá ăn ngay từ đầu nên không chú trọng đến việc gây màu. Mặt khác, khi bắt đầu nuôi, mực nước trong ao thấp, các hộ cho cá ăn cám mịn hay thức ăn tự chế, các loại thức ăn này cũng trở thành nguồn phân bón gây màu nước trong ao.

Diệt tạp và diệt cá dữ cũng được người nuôi rất chú ý. Số hộ sử dụng các loại thuốc, hóa chất chiếm 61,1% và 16,7% hộ lọc nước để diệt tạp và diệt cá dữ (Bảng 4.3). Có 50% các hộ được phỏng vấn có tiến hành diệt khuẩn trước khi bắt đầu vụ nuôi và trong quá trình nuôi nhằm tạo môi trường thuận lợi cho cá phát triển tốt và 50% hộ có xử lý nước trước khi thả giống bằng một số hóa chất như iodine, dây thuốc cá, saponin hay BKC.

44

Bảng 4.3 Các bước chuẩn bị ao

Các bước chuẩn bị ao

Phơi ao

Bón vôi

Bón phân

Diệt cá dữ

Diệt khuẩn

Lọc nước

Số hộ 78 12 64 26 7 83 55 35 45 45 15 75

Tỷ lệ (%) 86,67 23,33 71,11 28,89 7,78 92,22 61,11 38,89 50 50 16,67 83,33

Có Không Có Không Có Không Có Không Có Không Có Không

Trong quá trình chuẩn bị ao nuôi, người dân rất lưu ý khâu trị mọi trong ao. Theo Trần Đắc Định và ctv. (2011), cá bống kèo di cư ra biển mỗi tháng 2 lần tương ứng với 2 kỳ triều trong tháng đó là con nước ròng (ngày 15 âm lịch) và kỳ con nước rong (ngày 30 âm lịch), khi đó cá di cư với số lượng lớn và thường xuyên hơn trong thời kỳ con nước rong. Chính vì vậy, theo kinh nghiệm, các hộ nuôi rất chú trọng đến khâu tu sửa bờ ao, trị mọi trong ao để đảm bảo rằng công trình ao nuôi đã chắc chắn không còn lỗ mọi, không bị rò rỉ nhằm tránh thất thoát cá do lỗ mọi. Bên cạnh đó người nuôi cũng rất chú trọng việc dùng lưới bao quanh bờ ao và giăng lưới hay giăng móc câu để phòng ngừa hao hụt do thiên địch. Nhìn chung, công tác cải tạo và chuẩn bị ao của các hộ nuôi thương phẩm cá bống kèo tương đối phù hợp với yêu cầu kỹ thuật nuôi.

b. Nguồn giống và mật độ thả nuôi

Nguồn giống là vấn đề chủ yếu quyết định thành công của vụ nuôi. Nguồn cá bống kèo giống hiện nay phụ thuộc hoàn toàn vào nguồn cá giống tự nhiên do đó mùa vụ nuôi cá bống kèo cũng chính là mùa xuất hiện con giống tự nhiên. Cá giống tự nhiên được khai thác từ tháng 4 – 11 và tập trung vào 2 mùa chính là tháng 4 – 5 và các tháng 9 – 11 âm lịch. Cá bống kèo giống xuất hiện trong mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 11 theo những con nước rong hàng tháng (15 và 30 âm lịch) (Trương Hoàng Minh, 2009).

Do cá giống thả nuôi có kích cỡ nhỏ nên ảnh hưởng rất nhiều đến tỷ lệ sống, để bù vào lượng cá giống bị hao hụt khi thả, người nuôi luôn có xu hướng thả cá giống với mật độ cao để bù lại. Kết quả phỏng vấn 90 hộ dân ghi nhận được mật độ thả nuôi cá bống kèo dao động từ 50 – 200 con/m2, đa số

45

các hộ thả nuôi ở mật độ từ 100 – 150 con/m2 (chiếm 82,2%) (Bảng 4.4). Mật độ khuyến cáo khi nuôi cá bống kèo thương phẩm là 50 – 80 con/m2, nhưng nếu có điều kiện thuận lợi mật độ nuôi có thể tăng đến 100 con/m2 (Trung tâm Khuyến nông Quốc gia, 2009). Như vậy với mật độ nuôi được ghi nhận qua khảo sát (126,5±31,2 con/m2) và cách chọn cá bống kèo giống như hiện nay đòi hỏi người nuôi phải có chế độ theo dõi, chăm sóc và quản lý ao nuôi một cách chặt chẽ để ao nuôi không phát sinh dịch bệnh ảnh hưởng đến năng suất nuôi.

Bảng 4.4 Mật độ thả giống

Mật độ nuôi (con/m2) < 100 100 – 150 > 150 Tổng cộng

Số hộ 5 74 11 90

Tỷ lệ (%) 5,56 82,22 12,22 100

Chất lượng con giống là một vấn đề đáng được quan tâm, do hiện nay chưa có qui trình kiểm tra chất lượng con giống cá bống kèo nên người nuôi chủ yếu chọn giống theo cảm quan, kinh nghiệm và chủ yếu dựa vào uy tín của người bán. 100% người nuôi chọn cá giống bằng cảm quan với một số dấu hiệu như cá có màu đen, có bụng, có sọc và hoạt động nhanh nhẹn.

Tuy cá bống kèo được thả nuôi với mật độ cao nhưng hệ thống sục khí không được sử dụng trong suốt quá trình nuôi do cá bống kèo có thể hô hấp tự nhiên trong nước và ngoài không khí (Ishimatsu et al., 1998, trích dẫn bởi Trương Hoàng Minh và Nguyễn Thanh Phương, 2011). Khi môi trường thiếu oxy, cá sẽ gia tăng tần suất trao đổi khí qua mô và giảm tần suất trao đối khí ngoài mô (Martin và Bridges, 1999).

c. Thức ăn và cách cho ăn

Thức ăn sử dụng cho cá bống kèo nuôi hiện nay chủ yếu là thức ăn công nghiệp từ các cửa hàng (58,89%) và đại lý bán thức ăn (41,1%). Có hai dạng thức ăn công nghiệp được người nuôi sử dụng là dạng chìm và dạng nổi. Do tập tính bắt mồi của cá bống kèo nên tháng đầu tiên sau khi thả giống, người nuôi sử dụng thức ăn chìm, sau một tháng thì đổi sang thức ăn nổi.

Tần suất cho ăn dao động từ 2 – 5 lần/ngày. Có 56,7% hộ điều tra cho cá ăn 2 lần/ngày vào lúc sáng sớm và chiều mát. Lượng thức ăn cho cá ăn còn phụ thuộc vào nhu cầu của cá, nên có hộ cho cá ăn liên tục trong ngày (cách khoảng 2 đến 3 giờ cho ăn một lần) (chiếm 8,89%). Tần suất cho ăn được trình bày ở Hình 4.1.

46

Hình 4.1. Tần suất cho ăn

Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều loại thức ăn với nhiều kích cỡ khác nhau được sử dụng nuôi cá bống kèo. Các hộ nuôi lựa chọn loại thức ăn tùy theo giá cả và nguồn cung cấp. Thức ăn công nghiệp cho loài cá này chưa được nghiên cứu, nhưng theo khuyến cáo của Trung tâm Khuyến nông Quốc gia (2009) thì thức ăn công nghiệp sử dụng nuôi cá bống kèo nên có độ đạm từ 25 – 28%. Khối lượng thức ăn mà người nuôi cho cá ăn dao động từ 15 – 70 kg/ngày/ao. Trung bình mỗi ngày người nuôi cho cá ăn 35,06±13,99 kg/ngày/ao. Số hộ nuôi cung cấp thức ăn > 30 kg/ngày chiếm tỷ lệ khá lớn (45,6%).

Lượng thức ăn được cung cấp liên tục trong ngày đã gây nên tình trạng ao nuôi tích lũy một lượng lớn thức ăn dư thừa, gây nên tình trạng ô nhiễm ngày càng tăng trong ao nuôi, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn tồn tại và phát triển, là một trong những nguyên nhân gây ra tình trạng bệnh trên cá bống kèo nuôi.

d. Quản lý chất lƣợng nƣớc trong ao nuôi cá bống kèo

Tất cả (100%) các hộ nuôi cá bống kèo được phỏng vấn không sử dụng hệ thống ao lắng, lọc mà lấy nước trực tiếp từ sông và kênh thủy lợi. Trong quá trình nuôi, hầu hết các hộ nuôi không thay nước mà chỉ cấp thêm nước (96,7%), xử lý hóa chất và vi sinh nhằm cải thiện môi trường nuôi. Một số ít hộ không thay nước và cũng không cấp thêm nước vào ao nuôi (3,3%). Nguồn nước cấp thêm có thể từ sông và kênh thủy lợi (92,2%) hay từ nguồn nước bơm hoặc nước mưa (chiếm 7,8%). Nguồn nước bơm hay nước mưa thường được sử dụng khi ao nuôi có hiện tượng mực nước trong ao nuôi giảm thấp, độ mặn trong ao tăng cao nhưng nguồn nước từ sông hoặc kênh thủy lợi không đủ cấp hoặc không đảm bảo chất lượng. Mực nước trong ao nuôi ở thời điểm thả giống thường dao động từ 15 – 30 cm, đến khoảng 0,5 – 1 tháng khi cá bắt đầu nổi thì người dân nâng dần mực nước. Đến khi cá đạt 2 tháng thì mực nước trong ao đạt mức tối đa là 1-1,5m. Nguồn nước cung cấp vào ao nuôi không đảm bảo chất lượng và số lượng yêu cầu, kết hợp với việc không thay nước 47

suốt vụ nuôi đã làm cho chất lượng nước trong ao nuôi ngày càng ô nhiễm, ảnh hưởng lớn đến sức khỏe cá nuôi, tạo điều kiện tốt cho mầm bệnh phát triển và gây ra tình trạng cá nuôi bị bệnh, ảnh hưởng đến tỷ lệ sống và năng suất của cá nuôi.

e. Quản lý sức khỏe cá nuôi

Đa số các hộ nuôi được phỏng vấn đã được tập huấn về kỹ thuật nuôi cá bống kèo do các cơ quan có chức năng tổ chức. Tuy nhiên, phần lớn các hộ xử lý các tình huống xảy ra trong quá trình nuôi, sử dụng thuốc, hóa chất và kháng sinh dựa trên kinh nghiệm và học tập trao đổi lẫn nhau. Do ao cá không được thay nước và lượng thức ăn dư thừa tồn đọng trong ao đã làm cho chất lượng môi trường nuôi ngày càng xấu đi và là điều kiện tốt cho mầm bệnh xuất hiện và lây lan trong ao nuôi. Để phòng ngừa dịch bệnh xảy ra trong ao nuôi, các hộ nuôi đã chủ động phòng bệnh bằng cách sử dụng thuốc và hóa chất ngay trong tháng đầu tiên sau khi thả giống. Kết quả điều tra cho thấy số hộ sử dụng kháng sinh dạng nguyên liệu hay dạng thuốc phòng trị bệnh cho cá bằng cách trộn vào thức ăn và cho cá ăn liên tục trong suốt thời gian nuôi (chiếm 84,4%). Trong đó số hộ nuôi sử dụng thuốc kháng sinh amoxicillin chiếm 81,1%, các hộ còn lại (3,3%) sử dụng các loại kháng sinh khác như ampicillin, tetracycline, enrofloxacin, cotrim, ciprofloxacin… Số hộ không sử dụng kháng sinh trong suốt thời gian nuôi chiếm 15,6% (Hình 4.2). Bên cạnh việc trộn kháng sinh vào thức ăn cho cá nhằm mục đích phòng trị bệnh thì có hộ nuôi trộn Vitamin C vào thức ăn cho cá nhằm tăng sức đề kháng (chiếm 48,9%). Ngoài ra, các hộ nuôi còn sử dụng men tiêu hóa, B Complex, diệp hạ châu và một số loại thuốc hỗ trợ gan.

Hình 4.2. Tình hình sử dụng kháng sinh trong nuôi cá bống kèo ở Bạc Liêu

Nhìn chung, nghề nuôi cá bống kèo thương phẩm hiện nay phụ thuộc nhiều vào nguồn cá giống tự nhiên nên việc chọn giống có chất lượng tốt khi thả nuôi bị hạn chế, người dân lại thả nuôi với mật độ nuôi khá cao trung bình 126,5±31,2 con/m2, trong quá trình nuôi hầu như các hộ nuôi không thay nước

48

ao mà chỉ cấp thêm nước vào ao nuôi khi mực nước trong ao thấp dưới 100cm. Việc không thay nước nhằm không xáo trộn các yếu tố môi trường trong ao nuôi giảm mức độ ảnh hưởng đến cá nuôi, tuy nhiên càng về sau ao nuôi ngày càng bị ô nhiễm do lượng thức ăn thừa cũng như lượng chất bẩn trong ao tăng cao, các khí độc ngày càng tích tụ tạo điều kiện cho các mầm bệnh phát triển, trong điều kiện này chỉ cần cá nuôi sức khỏe bị suy giảm hay bị một tác động nhỏ sẽ dễ dàng xảy ra dịch bệnh trong ao cá nuôi.

4.1.2 Tình hình bệnh trên cá bống kèo nuôi thƣơng phẩm

Bệnh ở cá bống kèo đã xảy ra vào những năm 2007, 2008 và 2009. Kết quả điều tra cho thấy 100% số hộ nuôi cá bống kèo gặp trở ngại do bệnh trong suốt thời gian nuôi, dấu hiệu cá bệnh thường gặp là cá bị cong thân, chướng bụng, lở loét và bị bệnh đường ruột (Hình 4.3).

Hình 4.3 Cá bống kèo bị bệnh A: Cá bị cong thân; B: Cá bị chướng bụng; C: Cá bị lở loét; D: Cá bị bệnh đường ruột.

Cá bị bệnh nhiều nhất là các bệnh xuất huyết (chiếm 78,9%), lở loét và chướng bụng (hay người dân thường gọi là sình bụng, chiếm 50%), gan (chiếm 25,6%). Bên cạnh đó cá bống kèo trong ao nuôi còn xuất hiện một số bệnh như tuột nhớt, đường ruột, cong thân (Hình 4.4).

Hình 4.4. Tỷ lệ xuất hiện bệnh trong ao nuôi cá bống kèo thương phẩm

49

Tình trạng bệnh thường xuất hiện khi cá nuôi đạt 2 tháng tuổi (giai đoạn cá chuyển từ ăn thức ăn chìm sang ăn thức ăn nổi). Tuy nhiên, bệnh cũng xuất hiện khi cá mới thả được 15 ngày. Những năm trước năm 2007 cá bống kèo có tỷ lệ chết khi mắc bệnh lên đến 100%. Những năm gần đây, nhất là mùa vụ năm 2011, tỷ lệ chết đã giảm xuống, trung bình tỷ lệ chết là 18,04±12,17 (%), (Bảng 4.5).

Bảng 4.5. Tỷ lệ cá chết

Tỷ lệ cá chết (%) ≤ 10 10 – 20 20 – 30 ≥30 Không xác định Tổng cộng

Số hộ 25 35 17 12 1 90

Tỷ lệ (%) 27,78 38,89 18,89 13,33 1,11 100

Kết quả điều tra cho thấy đa phần cá chết tập trung ở tỷ lệ từ 10% - 20% (chiếm 38,9% số hộ điều tra), tuy nhiên tỷ lệ cá chết trên 30% cũng chiếm tỷ lệ khá cao, chiếm 13,33% số hộ điều tra. Hầu hết các hộ nuôi không biết rõ nguyên nhân cá bệnh cũng như cách phòng và trị bệnh cho cá nuôi. Quá trình sử dụng kháng sinh để phòng và trị bệnh người nuôi sử dụng theo kinh nghiệm và trao đổi với những người cùng nuôi cá bống kèo thương phẩm lân cận. Kháng sinh được sử dụng là dạng nguyên liệu hoặc thành phẩm trộn vào thức ăn cho cá ăn định kỳ. Có 81,1% các hộ điều tra chọn kháng sinh amoxicillin trộn vào thức ăn (2 – 4 g/kg thức ăn) cho cá ăn định kỳ. Khi cá phát bệnh thì tăng lượng thuốc (3 – 5 g/kg thức ăn) cho ăn liên tục từ 3-5 ngày, sau đó giảm lượng thuốc kết hợp với giảm lượng thức ăn. Nếu cá không hết bệnh thì tiếp tục điều trị.

Hiện nay chưa có những nghiên cứu chuyên sâu về bệnh trên cá bống kèo nên người nuôi chưa được hướng dẫn cụ thể về phương pháp phòng trị bệnh hiệu quả cho cá bống kèo nuôi thương phẩm. Việc phòng trị bệnh cho cá bống kèo theo kinh nghiệm và việc sử dụng thuốc kháng sinh tùy tiện như hiện nay của người nuôi là vấn đề đáng được quan tâm. Việc sử dụng thuốc và hóa chất không đúng qui định và lặp đi lặp lại trong thời gian dài sẽ dẫn đến tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn làm cho việc điều trị ngày càng kém hiệu quả (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv., 2005).

4.2 Kết quả kiểm tra ký sinh trùng trên cá bống kèo

Ký sinh trùng là một trong những tác nhân gây bệnh truyền nhiễm trong ao nuôi, tiến hành kiểm tra ký sinh trùng trên cá bống kèo nuôi thương phẩm nhằm xác định sự hiện diện cũng như khả năng gây bệnh của ký sinh trùng

50

ảnh hưởng đến sức khỏe và tỷ lệ sống của cá bống kèo. Qua các đợt thu mẫu cho thấy thành phần giống loài ký sinh trùng xuất hiện trên cá bống kèo tương đối ít, chủ yếu là các ký sinh trùng thuộc ngoại ký sinh (Bảng 4.6). Bảng 4.6 Cường độ và tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng trên cá bống kèo

Da

Mang

Ký Sinh Trùng

CĐN (Trùng/lame)

TLN (%)

CĐN (Trùng/lame)

TLN (%)

Chilodonella Epistylis Trichodina Ergasilus

8 8 2

27,24 33,33 20

6 2

33,81 20

Kết quả Bảng 4.6 cho thấy, không tìm thấy ký sinh trùng trong ruột của cá bống kèo nuôi thương phẩm. Trên da và mang cá tìm thấy 04 loài ký sinh trùng có hình thái, cấu tạo phù hợp với mô tả của Hà Ký và Bùi Quang Tề (2007) đó là Chilodonella, Epistylis, Trichodina và Ergasilus. Các loài ký sinh trùng này hiện diện trên cơ thể cá với cường độ cảm nhiễm thấp (từ 2 – 8 trùng/lame) vả tỷ lệ cảm nhiễm rất thấp (từ 20% – 33,81%). Theo Nguyễn Thị Thu Hằng (2009), nếu tỷ lệ cảm nhiễm 90-100%, cường độ cảm nhiễm 20 – 30 trùng/10X là gây nguy hiểm cho cá và cá phát bệnh khi cường độ cảm nhiễm đạt 50 – 100 trùng/10X (được trích bởi Từ Thanh Dung và ctv., 2014), với kết quả này chứng tỏ sự hiện diện của ký sinh trùng không ảnh hưởng đến tình hình sức khỏe cá trong ao nuôi, điều này có thể lý giải do mô hình nuôi cá bống kèo thâm canh, nuôi với mật độ cao, người nuôi thường xuyên sử dụng các loại vi sinh và hóa chất xử lý môi trường ao nuôi cũng như sử dụng thuốc kháng sinh trong thức ăn của cá nên đã khống chế sự hiện diện của ký sinh trùng trong ao nuôi.

4.3 Phân lập và định danh vi khuẩn trên cá bống kèo bệnh xuất

huyết

4.3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn

Tiến hành thu mẫu cá bống kèo tại 3 điểm gồm: Thành phố Bạc Liêu, huyện Đông Hải và huyện Hòa Bình, tỉnh Bạc Liêu. Qua 06 đợt, đã thu mẫu cá ở 34 ao gồm có 23 ao nuôi đang có dấu hiệu bệnh và 11 ao nuôi không có dấu hiệu bệnh. Khi tiến hành thu mẫu ngẫu nhiên cá lờ đờ, tấp mé, có biểu hiện bất thường và mẫu cá khỏe đã phân tích được 254 mẫu cá, trong đó có 128 mẫu cá bệnh. Các mẫu cá được tiến hành phân lập vi sinh trên gan, thận và tỳ tạng. Sau 48 giờ để ở 28oC kết quả phân lập đã thu được số mẫu khuẩn lạc trong

51

những lần phân lập là 252, tỷ lệ khuẩn lạc thu được từ các cơ quan tập trung nhiều ở cơ quan thận của cá chiếm 38,1% (Bảng 4.7; Phụ lục C.2)

Bảng 4.7 Số lượng vi khuẩn phân lập từ các cơ quan qua các đợt thu mẫu

Thu mẫu

Tổng cộng

Đợt 1

Đợt 2

Đợt 3

Đợt 4

Đợt 5

Đợt 6

Số lượng

Tỷ lệ (%)

Cơ quan Thận Gan Tỳ tạng Tổng cộng

13 15 6 34

13 17 12 42

6 5 6 17

11 0 0 11

26 30 6 62

27 23 36 86

96 90 66 252

38,1 35,7 26,2 100

4.3.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa vi khuẩn gây bệnh trên

cá bống kèo

Các chủng vi khuẩn được cấy trên môi trường TSA+ có hình thái khuẩn lạc nhỏ, hình tròn có màu trắng đục, kích thước dao động từ 0,4 – 0,8 µm/khuẩn lạc.

Kết quả nhuộm Gram cho thấy đa số các chủng vi khuẩn bắt màu Gram (+), có dạng hình cầu, ghép với nhau tạo thành chuỗi dài có dạng song cầu, liên cầu (Hình 4.5).

Hình 4.5 Hình dạng vi khuẩn Gram (+) hình liên cầu (100X)

Trong 252 chủng vi khuẩn thu được có 249 chủng vi khuẩn có hình cầu, gram (+), không di động, đa số vi khuẩn âm tính với oxidase (231/249 chủng) và catalase (174/249 chủng). Có 03 chủng vi khuẩn hình que, gram (-), di động, dương tính với oxidase và catalase. Khi tiến hành kiểm tra chỉ tiêu O/F của 190 chủng có 179/190 chủng đều cho kết quả (-/-), còn lại có 11 chủng vi khuẩn cho kết quả O/F là (+/+) (Phụ lục C.2).

Kết quả tiến hành kiểm tra khả năng tan huyết của 15 chủng vi khuẩn cho thấy 100% các vi khuẩn đều có khả năng phát triển trong môi trường có chứa 5% máu cừu nhưng không gây tan huyết. Ngoài ra, 15/15 chủng vi khuẩn đều không phát triển trong môi trường TSB có bổ sung 6,5% NaCl (Hình 4.6).

52

Hình 4.6 Kết quả kiểm tra tan huyết và khả năng phát triển trong môi trường TSB (+6,5%NaCl)

(A): Vi khuẩn không gây tan huyết trên môi trường chứa 5% máu cừu. (B): Vi khuẩn không phát triển trong môi trường TSB (+6,5%NaCl).

4.3.3 Kết quả định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep

Dựa trên đặc tính sinh hóa vi khuẩn của Buller (2004), kết quả định danh ngẫu nhiên 32 chủng vi khuẩn bằng kit API 20 Strep cho thấy các chủng dương tính với phản ứng Alkaline phosphatase (chiếm 100%), Leucine AminoPeptidase (chiếm 100%), Ribose (chiếm 100%), Trehalose (chiếm 100%), hầu hết dương tính với Amygdalin (90,6%), Arginine Dihydrolase (chiếm 93,7%), β-glucuronidase (chiếm 93,7%). Các chủng phản ứng âm tính với các chỉ tiêu còn lại (Hình 4.7 và Phụ lục C.3).

Hình 4.7 Kết quả test API 20Strep 02 chủng vi khuẩn B1-6T và B2-5G

Khi so sánh kết quả test API 20Strep của các chủng vi khuẩn thu được với kết quả nghiên cứu của Nomoto et al. (2004) và Buller (2004) cho thấy có sự sai khác từ 2 - 4 chỉ tiêu và mức độ tương đồng 80 - 90% với chủng định danh là Streptococcus dysgalactiae (Phụ lục C.3). Kết quả này phù hợp với đặc điểm sinh hóa quan trọng của chủng S. dysgalactiae như: dương tính với alkaline phosphatase, leucine arylamidase, ribose, trehalose, lactose và âm tính với voges-proskauer, glycogen.

4.3.4 Kết quả định danh vi khuẩn bằng phƣơng pháp giải trình tự

Để xác định danh pháp đến mức loài của các chủng vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo, tiến hành giải trình tự nucleotide ở đoạn gen 16S rRNA của 10 chủng vi khuẩn gồm A1F1, A1F2, A1F4, A1F6, A1F9, A5F4,

53

B1-6T, B2-3TT, B2-5G và B6-9TT. Trình tự nucleotide của 10 chủng vi khuẩn được chọn sau khi giải mã tiến hành so sánh với các loài vi khuẩn được lưu trữ từ ngân hàng dữ liệu gen của NCBI với tỉ lệ nucleotide tương đồng lần lượt là 1003/1004; 1005/1005; 996/997; 971/972; 618/624; 537/546; 608/612; 597/602; 573/575 và 336/345 (Bảng 4.8).

Bảng 4.8 Kết quả so sánh mức độ tương đồng trình tự vi khuẩn phân lập trên cá bệnh xuất huyết với vi khuẩn trong ngân hàng dữ liệu gen của NCBI STT Kí hiệu chủng

Các loài vi khuẩn từ ngân hàng dữ liệu gen của NCBI S. dysgalactiae B1-6T B2-5G S. dysgalactiae B6-9TT S. dysgalactiae S. dysgalactiae B2-3TT S. dysgalactiae A1F1 S. dysgalactiae A1F2 S. dysgalactiae A1F4 S. dysgalactiae A1F6 S. dysgalactiae A1F9 S. dysgalactiae A5F4

Mã số lưu trữ trong ngân hàng dữ liệu gen KM077497.1 KM077497.1 KM077497.1 KM077497.1 NR043661.1 NR043661.1 NR043661.1 HE858529.1 NR043661.1 NR043661.1

Mức độ tương đồng 99% 100% 99% 99% 99% 98% 99% 99% 99% 97%

Tỉ lệ nucleotide tương đồng 1003/1004 1005/1005 996/997 971/972 618/624 537/546 608/612 597/602 573/575 336/345

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)

Kết quả tìm kiếm so sánh trình tự nucleotide đoạn gen 16S rRNA trên cơ sở dữ liệu (NCBI) ngân hàng gen bằng chương trình trực tuyến BLAST SEARCH cho thấy, chủng B2-5G với chiều dài đoạn gen 16S rRNA được khuếch đại gồm 1.005 nucleotide tương đồng 100% với đoạn 16S rRNA của chủng vi khuẩn Streptococcus dysgalactiae được lưu trữ trong dữ liệu ngân hàng gen với mã số lưu trữ là KM077497.1 (Phụ lục C.4). Tương tự đối với các chủng còn lại sau khi giải trình tự gen 16S rRNA, kết quả tìm kiếm so sánh trình tự nucleotide đoạn gen 16S rRNA trên cơ sở dữ liệu (NCBI) ngân hàng gen bằng chương trình trực tuyến Blast Search, các chủng đều tương đồng 99% với đoạn 16S rRNA của chủng vi khuẩn Streptococcus dysgalactiae (Phụ lục C.4).

Theo Janda và Abbott (2007) đề nghị độ dài trình tự gen 16S khi giải mã để định danh loài cần ít nhất từ 500 đến 525 bp và lý tưởng nhất khi độ dài đạt 1300 đến 1500 bp và theo Bosshard et al. (1990) thì mức độ tương đồng khi so sánh trình tự đoạn gen với mức độ tương đồng đạt ≥99% thì xác định chính xác đến mức độ loài, khi mức độ tương đồng nằm trong khoảng ≥95% và <99% thì xác định được ở mức độ chi, như vậy với kết quả giải trình tự gen của 9 chủng với trình tự độ dài gen trên 525 bp và tỉ lệ tương đồng đạt từ 99%

54

trở lên đủ tin cậy cho việc định danh loài vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo.

Với kết quả tra cứu trên NCBI, dựa vào mức độ tương đồng trình tự đoạn gen 16S rRNA ở các chủng được giải trình tự so sánh trên hệ thống ngân hàng gen cho thấy, cả 10 chủng vi khuẩn khi giải trình tự và so sánh với ngân hàng dữ liệu gen NCBI đều trùng khớp với các chủng vi khuẩn được xác định là S. dysgalactiae với mức độ tương đồng trên 97% (Phụ lục C.4), kết quả này nằm trong khoảng cho phép và chấp nhận, nhất là chủng vi khuẩn B2-5G mức độ tương đồng với vi khuẩn S. dysgalactiae (ký hiệu KM077497.1) đạt 100%.

Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu giải trình tự gen 16S rRNA của Streptococcus spp. (Nomoto R. et al., 2004; Nomoto R. et al., 2008; Abdelsalam et al., 2013) và kết quả định danh vi khuẩn S. dysgalactiae gây bệnh trên cá rô phi Nile của Costa et al. (2013).

4.4 Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết ở cá bống kèo

4.4.1 Xác định đặc điểm bệnh học bệnh xuất huyết trên cá bống kèo

4.4.1.1 Dấu hiệu bệnh lý

Bệnh xuất huyết trên cá bống kèo nuôi thương phẩm xuất hiện tập trung khi cá nuôi đạt 2 tháng tuổi. Cá bị xuất huyết có dấu hiệu bệnh lý bất thường như bơi lờ đờ, tấp mé, bỏ ăn, không phản ứng hoặc phản ứng rất chậm với tiếng động.

Dấu hiệu bệnh lý biểu hiện bên ngoài của cá bệnh xuất huyết như màu sắc nhợt nhạt, xuất huyết trên thân, trên bụng, nắp mang và thường xuất huyết ở các vi như vi ngực, vi bụng, vi lưng, vi hậu môn, các khối u trên bề mặt cơ thể, mắt lồi, mờ đục và phù ra. (Hình 4.8).

55

Hình 4.8. Dấu hiệu bệnh lý bên ngoài của cá bống kèo bệnh xuất huyết

(A): Cá bống kèo tấp mé (B), (C): Cá bống kèo bị xuất huyết trên các vây và toàn thân

Dấu hiệu bệnh lý bên trong được ghi nhận là xoang bụng cá chứa đầy dịch nhờn, gan bị xuất huyết hoặc tái nhạt, tỳ tạng bị sưng to hoặc teo nhỏ và xuất huyết, thận xuất huyết và bị nhũn (Hình 4.9).

Hình 4.9: Dấu hiệu bệnh lý bên trong của cá bống kèo bệnh xuất huyết (A) Cá bống kèo khỏe; (B) Tỳ tạng sưng to và xuất huyết; (C) Gan cá sưng to và xuất huyết; (D) Gan cá xuất huyết, tỳ tạng sưng to, thận bị nhũn.

56

Dấu hiệu bệnh lý biểu hiện bên ngoài và bên trong khi cá bống kèo bị bệnh xuất huyết tương tự như mô tả của Wunging Yang và Aihua Li (2009) khi quan sát cá tầm A. Schrenckii bị xuất huyết do vi khuẩn S. dysgalactiae gây ra, cá tầm cũng có những dấu hiệu bệnh lý như cá bị chướng bụng, xuất huyết trên thân, trên các vây và xuất huyết trên gan, thận. Các dấu hiệu tương tự cũng được mô tả trên cá đối Liza Haematocheila khi cá nhiễm S. dysgalactiae cá bơi lờ đờ, tấp mé và có những biểu hiện bệnh tương tự như xuất huyết trên thân và xuất huyết ở gan và thận (Qi et al., 2013).

Dấu hiệu tương tự như ở một số loài cá khác khi bị bệnh xuất huyết như cá điêu hồng khi bị nhiễm vi khuẩn S. agalactiae (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương., 2012), cá rô phi bị nhiễm vi khuẩn S. agalactiae (Phạm Hồng Quân và ctv., 2013), cá bớp bị nhiễm vi khuẩn Vibrio alginolyticus và V. parahaemolyticus (Nguyễn Thị Thúy An và ctv., 2013).

4.4.1.2 Kết quả quan sát tiêu bản mẫu tƣơi thận phết kính

Quan sát 150 tiêu bản phết kính mẫu tươi mô thận cá bống kèo kết quả cho thấy, đối với những mẫu cá có dấu hiệu bệnh xuất huyết phát hiện thấy sự xuất hiện nhiều cụm vi khuẩn hình cầu (150/150 mẫu), Gram (+) nằm rải rác hoặc tập trung thành từng cụm trên vùng mô phết. (Hình 4.10)

Kết quả quan sát cũng cho thấy vi khuẩn tấn công phá vỡ màng tế bào hồng cầu, tạo ra nhiều khoảng trống trên tế bào chất, vi khuẩn còn tập trung chung quanh vách tế bào hồng cầu tạo thành một vòng tròn. Ở mẫu cá bệnh tìm thấy nhiều loại tế bào bạch cầu, đồng thời cũng tìm thấy rất nhiều đại thực bào, chúng tạo ra nhiều khoảng trống trên tế bào chất của tế bào bạch cầu và tế bào bạch cầu bị vi khuẩn phá vỡ màng tế bào (Hình 4.10).

57

Hình 4.10. Mẫu thận cá bống kèo phết kính (Wright & Giemsa, 100X) (A): Mẫu thận cá khỏe; (B): Vi khuẩn phá vở tế bào, tập trung thành cụm; (C): Mẫu đại thực bào; (D): Vi khuẩn bao quanh và phá vỡ màng tế bào hồng cầu.

Sự hiện diện cầu khuẩn Gram (+) nằm rải rác hoặc tập trung thành từng đám trên vùng mô thận phết khi nhuộm Wright và Giemsa cũng được Abdelsalam et al. (2013) mô tả ở cá hồi khi gây nhiễm bằng vi khuẩn S. dysgalactiae trong phòng thí nghiệm. Tương tự cũng được mô tả ở cá chim bạc Pampus argenteus và cá điêu hồng khi nhiễm S. agalactiae (Duremdez et al., 2004). Hiện tượng xuất huyết, tế bào bị biến đổi cấu trúc, hoại tử và xuất dịch viêm ở gan, thận và tỳ tạng cho thấy khả năng gây bệnh ở mức tế bào của vi khuẩn S. dysgalactiae. Theo Robert (1989), biểu hiện của sự xuất huyết là khi cơ quan bị viêm, lúc này cơ thể sẽ huy động một lượng lớn các tế bào hồng cầu vùng bị viêm, khi quá trình này diễn ra quá mức dẫn đến các mao mạch bị vỡ, các tế bào máu thoát ra ngoài xen lẫn với các tế bào của cơ quan, quá trình này kéo dài dẫn đến hoại tử mất cấu trúc.

Trên mẫu cá khỏe không có hoặc có rất ít vi khuẩn khi tiến hành quan sát

mẫu thận phết kính.

4.4.2 Đặc điểm mô bệnh học bệnh xuất huyết trên cá bống kèo

Tác nhân gây bệnh bắt đầu xâm nhập vào cơ thể vật chủ sẽ làm biến đổi các cấu trúc về mô của các cơ quan như mang, gan và thận ở giai đoạn sớm, quá trình phân tích mô bệnh học là một phương pháp kiểm soát mầm bệnh hữu hiệu trước khi thiệt hại xảy ra nghiêm trọng (Jiraungkoorskul et al., 2006).

58

Kết quả phân tích mô bệnh học trên cá bống kèo cho thấy cấu trúc của các cơ quan mang, thận và gan của cá bệnh xuất huyết có nhiều biến đổi về cấu trúc, bị hoại tử, có hiện tượng sung huyết và xuất huyết trên vùng mô của các cơ quan. Kết quả được thể hiện trong Phụ lục C.5.

4.4.2.1 Biến đổi cấu trúc mô học ở mang

Mang cá đóng vai trò quan trọng trong quá trình hô hấp, trao đổi khí, bài tiết (CO2, NH3 và Ure), cân bằng acid base, điều tiết ion và điều hòa áp suất thẩm thấu (Steve F. Perry và Pierre Laurent, 1993; Evans et al., 1999). Vòm mang được cấu tạo từ nhiều cung mang, mỗi cung mang có nhiều tơ mang.

Kết quả quan sát cho thấy có 127/127 mẫu mang cá bống kèo bị bệnh xuất huyết có hiện tượng phình to tơ mang và sự dính lại của các sợi mang (Hình 4.11 B và C). Tơ mang phình to và bị xuất huyết, các sợi mang bị dính lại hoặc mất cấu trúc cả phiến mang. Theo Robert (1989) thì hiện tượng sưng phồng và dính lại của mang là do khi bị vi khuẩn tấn công tạo nên phản ứng miễn nhiễm làm cho các tế bào mang sưng lên và khi tế bào mang càng sưng to sẽ dẫn đến sự tiếp xúc giữa các sợi mang. Từ đó làm suy giảm chức năng hô hấp và khi bệnh xảy ra, cấu trúc mang bị hủy hoại nghiêm trọng.

Hình 4.11 Mô mang cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X). (A) Mang cá bống kèo khỏe: tơ mang (), sợi mang (); (B) Sợi mang phình to, có hiện tượng tăng sinh biểu mô (), động mạch vào sợi mang bị nhiễm khuẩn (); (C) Sợi mang dính lại và mất cấu trúc phiến mang (), các tế bào biểu mô tăng kích thước (); (D) Mang bị mất cấu trúc.

Kết quả quan sát cho thấy có sự tăng kích thước và sinh khối các tế bào biểu mô làm màng tế bào biểu mô dày lên, sợi mang ngắn lại hoặc thoái hóa, động mạch vào mang bị xuất huyết và có hiện tượng bị nhiễm khuẩn (Hình 4.11). Hiện tượng các sợi mang bị dính lại do quá trình thực bào của tế bào bạch cầu khi có vi khuẩn xâm nhập, chúng tiết ra nhiều enzym làm cho các tế bào giữa các sợi mang sưng lên dẫn đến tiếp xúc nhau, đồng thời mang tiết

59

dịch nhầy do phản ứng tự vệ của các tế bào miễn dịch không đặc hiệu dẫn đến các sợi mang dính lại. Khi xảy ra tổn thương nặng mang bị mất cấu trúc cả phiến mang, làm giảm diện tích tiếp xúc của mang với môi trường, ngăn cản quá trình hô hấp của cá (Hibiya, 1982).

Những biến đổi ở mô mang cá bị bệnh xuất huyết như các sợi mang bị dính lại, phình to hoặc mất cấu trúc, có hiện tượng tăng sinh phù hợp với mô tả về biến đổi ở mô mang của cá điêu hồng bị nhiễm vi khuẩn S. agalactiae (Đặng Thụy Mai Thy và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011), cá rô phi nhiễm Streptococcus spp. (Trương Đình Hoài và ctv., 2014).

4.4.2.2 Biến đổi cấu trúc mô học ở thận

Thận cá bống kèo nằm dọc sống lưng trong xoang cơ thể, thận có màu đỏ sẫm bao gồm thận trước và thận sau phân chia không rõ ràng. Thận trước đóng vai trò như cơ quan tạo máu bao gồm các tế bào lympho, tế bào kẻ (mô tạo máu) và mô nội tiết. Thận sau có chức năng lọc máu, duy trì và tái hấp thu nước, kích thích tố, chất dinh dưỡng đồng thời bài tiết chất thải (Galit và Dina, 2012). Đồng thời thận còn có chức năng điều hòa áp suất thẩm thấu. Tùy theo môi trường sống mà mỗi loài cá có cơ chế hấp thu hoặc loại bỏ nước và ion khác nhau (Sonia et al., 2007). Cá bống kèo là loài rộng muối nên có khả năng tự điều hòa áp suất thẩm thấu theo môi trường sống.

Quan sát mô thận cá bệnh cho thấy chủ yếu là hiện tượng xuất huyết, sung huyết các mao mạch và tĩnh mạch, ống thận xơ hóa và lòng ống giãn nở, quản cầu thận phình to kèm theo biến đổi cấu trúc, và hoại tử (Hình 4.12). Theo Đỗ Thị Hòa và ctv. (2004) hiện tượng sung huyết xảy ra là do kích thích đặc biệt làm cho mao mạch nở ra một lượng máu lớn hơn bình thường được đưa đến gần ổ viêm. Hiện tượng sung huyết được xem là phản ứng đầu tiên của cơ thể đối với tác nhân gây bệnh (Đặng Thụy Mai Thy và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011). Hiện tượng sung huyết ở mô thận cá được ghi nhận ở hầu hết các mẫu cá bị bệnh, ngoài ra hiện tượng xuất huyết và hoại tử hạt hay hoại tử hóa lỏng cũng được tìm thấy trên mẫu mô thận của cá bệnh.

Biểu hiện của sự xuất huyết trên mô chính là khi cơ quan bị viêm nhiễm. Lúc này cơ thể sẽ huy động một lượng lớn các tế bào hồng cầu vùng bị viêm và khi quá trình này diễn ra quá giới hạn chịu đựng sẽ dẫn đến các mao mạch bị vỡ làm cho các tế bào máu chảy ra ngoài cùng với các tế bào của cơ quan, quá trình này kéo dài sẽ dẫn đến hoại tử mất cấu trúc (Robert, 1989).

Mô thận của cá bệnh bị sung huyết, xuất huyết dẫn đến hoại tử và biến đổi cấu trúc, khi thận bị biến đổi cấu trúc sẽ ảnh hưởng đến chức năng hoạt động của thận cá. Thận bị hoại tử làm mất những chức năng quan trọng của 60

thận như điều hòa áp suất thẩm thấu, bài tiết, sản xuất hồng cầu cũng như tiết hormone điều hòa các quá trình sinh lý của cơ thể. Đối với những mẫu cá bống kèo khỏe, không tìm thấy sự biến đổi cấu trúc mô thận.

Hình 4.12 Mô thận cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X) (A): Thận cá bống kèo khỏe, ống thận (↓); (B) Mô thận bị xuất huyết (↓), trung tâm đại thực bào sắc tố (↓); (C): Mô thận bị hoại tử (↓), biến đổi cấu trúc; (D): Mô thận bị nhiễm khuẩn (↓); (E): Quản cầu thận phình to và biến đổi cấu trúc (↓) (100X); (F): Mô thận có hiện tượng sung huyết (↓), Quản cầu thận phình to và biến đổi cấu trúc (↓).

Biến đổi cấu trúc mô thận của cá bống kèo bị xuất huyết do vi khuẩn S. dysgalactiae cũng tương tự như sự biến đổi cấu trúc mô thận của cá điêu hồng (Oreochromis spp.) khi nhiễm vi khuẩn S. agalactiae (Đặng Thụy Mai Thy và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011) hay như cá rô đồng (Anabas testudineus) bị nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila và Streptococcus spp. (Đặng Thụy Mai Thy và ctv., 2012).

4.4.2.3 Biến đổi cấu trúc mô học ở gan

Theo Hibiya (1982), gan là một trong những tuyến tiêu hóa được phát triển từ ruột nguyên thủ, nó có cấu tạo từ các tế bào gan và lớp mạng giữ chức năng nâng đỡ gan. Gan của động vật có xương sống đóng vai trò quan trọng 61

trong quá trình chuyển hóa và dự trữ glycogen, là nơi giải độc cho cơ thể và sản xuất ra kháng thể đồng thời cũng là nơi tiết ra dịch mật, một dịch thể quan trọng trong quá trình tiêu hóa. Ngoài ra, gan còn đảm nhiệm việc tạo máu khi cá còn nhỏ (Hibiya, 1982). Gan cá bống kèo là một dạng mô mỡ (Hình 4.13A). Cấu tạo của mô mỡ gồm có các không bào lipid có kích thước tương đồng, các mao mạch máu và mô liên kết (John và Patricia, 2007).

Kết quả quan sát các mẫu mô gan cá bống kèo bị bệnh xuất huyết cho thấy gan có hiện tượng bị nhiễm khuẩn (Hình 4.13E), tĩnh mạch gan bị sung huyết (Hình 4.13C), không bào lipid phình to, không đồng nhất tạo nên vùng mô gan bị biến đổi cấu trúc (Hình 4.13E & F), sự xuất hiện của các không bào lipid to bất thường, tế bào lympho và tế bào hồng cầu hiện diện nhiều trong mô mỡ dẫn đến vùng mô bị xơ hóa nhẹ nếu nặng sẽ hình thành u nang hoặc vôi hóa cuối cùng gây hoại tử (John và Patricia, 2007).

Hiện tượng hoại tử xuất hiện nhiều trên tế bào gan, gan hoại tử gần như hóa lỏng, những vùng sung huyết tế bào máu phân hủy thành dịch viêm, tế bào hồng cầu bị hủy hoại, nhân tan, tế bào chất trở nên đồng nhất bắt màu Eosin (Hình 4.13B & D). Hiện tượng sung huyết kéo dài sẽ làm vỡ mạch máu, giải thoát nhiều enzym tiêu hóa từ các bạch cầu làm cho tế bào ở vùng viêm bị hủy hoại dẫn đến hoại tử. Những tổn thương diễn ra làm cho gan không còn chức năng khử độc, lọc máu, chuyển hóa protein, lipid, glucid, tiết dịch mật, làm cho chất độc không được loại bỏ sẽ tích lũy trong cơ thể kết hợp với những yếu tố khác làm chết cá (Robert, 1989).

Biến đổi mô học ở gan cũng được tìm thấy ở cá rô phi khi tiến hành gây cảm nhiễm với vi khuẩn S. dysgalactiae (Nehal et al., 2014), kết quả tác giả cũng đã phát hiện gan cá xuất hiện tình trạng sung huyết, xuất huyết gây hoại tử các tế bào gan. Ngoài ra, các hiện tượng biến đổi mô học trên gan cũng được mô tả nhiều ở các loài cá khác khi bị bệnh xuất huyết như cá đối Liza Haematocheila bị nhiễm vi khuẩn S. dysgalactiae (Qi et al., 2013); cá điêu hồng khi bị nhiễm vi khuẩn S. agalactiae (Đặng Thụy Mai Thy và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011), cá rô phi nhiễm Streptococcus sp. (Trương Đình Hoài và ctv., 2014).

62

Hình 4.13 Mô gan cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X) (A): Gan cá khỏe, tĩnh mạch gan (↓), không bào lipid (↓); (B) Dịch viêm giữa các tế bào (↓); (C): Tĩnh mạch gan bị sung huyết (↓); (D): Vùng tế bào gan bị sung huyết (↓); (E): Gan bị nhiễm khuẩn (↓), không bào lipid phình to (↓), biến đổi cấu trúc tế bào gan (↓); (F): Vùng mô gan bị biến đổi cấu trúc (↓).

4.4.3 Đặc điểm huyết học trên cá bống kèo bệnh

4.4.3.1 Hình thái tế bào

Quan sát máu cá bống kèo cho thấy tế bào hồng cầu có dạng hình oval hay elip và nhân hình tròn ở giữa. Số lượng tế bào hồng cầu chiếm nhiều nhất trong tất cả các tế bào máu. Bốn loại bạch cầu cũng được tìm thấy gồm tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính và tiểu cầu. Tế bào lympho có kích thước nhỏ hơn hồng cầu, nhân chiếm gần hết tế bào có hình tròn hoặc hình oval, tế bào chất rất ít và bắt màu xanh đậm. Bạch cầu đơn nhân có kích thước lớn hơn hồng cầu có nhân bắt màu tím nằm lệch về một phía của tế bào và tế bào chất có màu xanh, một số tế bào có thể quan sát được không bào trong tế bào chất. Bạch cầu trung tính có hình tròn hay oval, nhân nằm lệch và có thể quan sát thấy 2 nhân. Tiểu cầu có hình tròn hay hình thon dài, nhân bắt màu xanh đậm hay tím đậm, tế bào chất rất ít và bắt màu xanh nhạt khi nhuộm Giemsa (Hình 4.14).

63

Hình 4.14. Hình dạng tế bào máu ở cá bống kèo (100X) (A): Hồng cầu (↓); (B): Tiểu cầu (↓); (C): Bạch cầu đơn nhân (↓), Tiểu cầu (↓), Bạch cầu trung tính (↓), Tế bào lympho (↓); (D): Bạch cầu đơn nhân (↓).

Kết quả quan sát tế bào máu trên mẫu phết kính ở cá bống kèo bị bệnh xuất huyết cho thấy xuất hiện nhiều cụm vi khuẩn trong máu cá và tế bào máu bị biến đổi hình dạng (Hình 4.15). Vi khuẩn tấn công làm màng tế bào hồng cầu bị phá vỡ, bên trong tế bào chất có nhiều khoảng không bào hay không còn tế bào chất. Bên cạnh đó các loại tế bào bạch cầu cũng thay đổi hình dạng, cá bệnh cũng tìm thấy bốn loại tế bào bạch cầu.

Hình 4.15 Máu cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (100X)

(A): Vi khuẩn hình cầu tấn công màng tế bào hồng cầu (↓); (B): vi khuẩn tấn công

màng tế bào (↓) và tạo khoảng không bào trong tế bào chất (↓).

Quan sát hình dạng cho thấy màng bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính và tiểu cầu bị biến đổi, xuất hiện nhiều khoảng trống ở tế bào chất của bạch cầu đơn nhân. Không quan sát thấy sự biến đổi này ở tế bào lympho (Hình 4.15).Theo Hibiya (1982), máu rất nhạy với các chức năng sinh lý của cơ thể cũng như các thay đổi bệnh lý ở cá và các thay đổi này khác nhau tùy loài. Ở cá bệnh số lượng hồng cầu bị giảm dẫn đến hiện tượng thiếu máu được chứng minh trên cá hồi, cá vàng phản ứng chống lại vi khuẩn A. hydrophila và bệnh EUS (Rehulka, 1998; Brenden N.B và H.W Huizinga, 1986).

64

Theo Ainsworth (1992), bạch cầu giúp bảo vệ cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh do vi khuẩn và các yếu tố hóa học. Ngoài đại thực bào thì chức năng chính của bạch cầu trung tính là thực bào vi khuẩn vì vậy khi vi khuẩn tấn công thì số lượng tế bào này gia tăng phản ứng lại tác nhân gây bệnh nhằm bảo vệ cơ thể.

4.4.3.2 Huyết học

Hồng cầu là loại huyết cầu có số lượng nhiều nhất trong các tế bào máu. Hồng cầu có hình tròn hay hình oval, có một nhân tròn nằm giữa tế bào chất, nhân bắt màu tím đậm, tế bào chất rất lớn so với nhân và có màu xám xanh, phân chia rõ ràng với nhân (Hình 4.14A). Do có nhân nên hồng cầu của cá có mức trao đổi chất cao, tiêu hao lượng oxygen lớn. Đây là dạng hồng cầu trưởng thành phù hợp với các miêu tả của Hibiya (1982), Chinabut et al. (1991).

Số lượng hồng cầu trong máu cá dao động từ 6,8 x 106 CFU/ml đến 28,6 x 106 CFU/ml, có sự khác biệt về số lượng hồng cầu ở cá bống kèo khỏe và cá bệnh xuất huyết (Bảng 4.9).

Bảng 4.9 Mật độ hồng cầu ở cá bống kèo khỏe và cá bệnh xuất huyết

Ao

Ao cá bình thường

Ao cá bệnh

Ao 4 Ao 5 Ao 8 Ao 1 Ao 2 Ao 3 Ao 6 Ao 7 Ao 9 Ao 10 Ao 11

Mật độ hồng cầu (tế bào x 106/ml) 21,45±2,79b 19,49±0,56b 19,80±0,37b 17,06±4,49ab 14,89±1,57a 16,99±3,04ab 14,42±1,74a 12,73±3,21a 13,16± 2,93a 14,23±1,92a 16,23±3,61a

Các giá trị trong cùng một cột (a, b) có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê

(P<0,05) và ngược lại.

Kết quả thu mẫu cho thấy có sự khác biệt rõ rệt giữa các ao nuôi (Bảng 4.9), ở những mẫu cá bệnh số lượng hồng cầu giảm so với những mẫu cá khỏe, khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05). Ở cá bệnh, số lượng hồng cầu giảm là phản ứng chống lại vi khuẩn xâm nhập cơ thể, điều này cũng đã được phát hiện ở cá hồi và cá vàng khi cơ thể bị nhiễm khuẩn, số lượng hồng cầu trong cơ thể cá giảm đáng kể dẫn đến hiện tượng thiếu máu ở cá bệnh, đây là phản ứng chống lại vi khuẩn của cơ thể (Rehulka, 1998; Brenden và Huizinga, 1986). Khi cá bệnh hồng cầu có một số thay đổi ở quá trình trực phân, phân chia nhân làm nhân tế bào có 2 thùy hay quá trình phân chia không đều nên

65

nhân có 2-3 phần và xuất hiện hồng cầu không nhân (Hibiya, 1982). Tuy nhiên, trong quá trình quan sát không thấy xuất hiện tế bào hồng cầu không nhân, hồng cầu đa nhân và rất ít thấy hồng cầu tiền trưởng thành. Bên cạnh đó khi quan sát tế bào hồng cầu ở cá bệnh thấy xuất hiện nhiều cụm vi khuẩn và tế bào hồng cầu bị phá vỡ làm cho số lượng hồng cầu giảm (Hình 4.13).

4.4.3.3 Bạch cầu

Kết quả quan sát được 4 loại tế bào bạch cầu ở cá bống kèo là tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính và tiểu cầu (Hình 4.16). Không có sự khác biệt về hình dạng của các loại bạch cầu giữa cá khỏe và cá bệnh. Tương tự như kết quả nghiên cứu của Martins et al. (2008) khi gây cảm nhiễm cá rô phi với vi khuẩn Enterococcus spp. chỉ phát hiện được 4 loại tế bào bạch cầu trong máu cá rô phi đó là tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính và tiểu cầu, ngoài ra khi nghiên cứu biến đổi thành phần huyết học trong cá chép khi bị nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila, Mostafa et al. (2000) cũng chỉ tìm thấy 4 loại bạch cầu như trên, tương tự với kết quả của Đặng Thụy Mai Thy (2010) khi nghiên cứu trên cá tra bị nhiễm Edwardsiella ictaluri cũng chỉ tìm được 4 loại bạch cầu trong máu cá mà không thấy bạch cầu có hạt ưa bazơ và bạch cầu có hạt ưa acid.

Hình 4.16 Các loại bạch cầu (100X) (A): Tiểu cầu (↓); (B): Bạch cầu trung tính (↓); (C): Bạch cầu đơn nhân (↓), Tế bào lympho (↓).

a. Số lƣợng tổng bạch cầu

Kết quả phân tích mẫu cho thấy, số lượng bạch cầu trong máu cá dao động từ 290.000 – 990.000 tế bào/ml. Đối với ao cá khỏe có tổng số lượng bạch cầu trung bình 34,2 x 104 tế bào/ml thấp so với các ao nuôi cá đang có dấu hiệu bệnh xuất huyết có tổng lượng bạch cầu cao trung bình 81,8 x 104 tế bào/ml. Số lượng bạch cầu ở các ao nuôi cá có dấu hiệu bệnh xuất huyết khác biệt mang ý nghĩa thống kê (P<0,05) (Bảng 4.10).

66

Bảng 4.10 Số lượng bạch cầu trên cá bống kèo

Ao

Ao cá bình thường

Ao cá bệnh xuất huyết

Ao 4 Ao 5 Ao 8 Ao 1 Ao 2 Ao 3 Ao 6 Ao 7 Ao 9 Ao 10 Ao 11

Mật độ bạch cầu (tế bào x 104/ml) 45,80±8,97c 50,25±6,27c 34,28±5,05d 82,50±7,25ae 73,40±11,64b 76,70±9,09ab 82,90±5,93ae 84,90±6,33e 85,42±5,74e 84,40±6,39e 85,50±7,42e

Các giá trị trong cùng một cột (a, b, c, d) có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống

kê (P<0,05) và ngược lại.

Theo Houston (1990) bạch cầu có vai trò thực bào và đáp ứng miễn dịch chống lại mầm bệnh xâm nhập và các nhân tố bất lợi khác. Sự gia tăng mật độ bạch cầu trong máu là cơ chế để vật chủ chống lại tác nhân bên ngoài xâm nhập (Benli và Yildiz, 2004), bạch cầu của cá luôn tăng lên ở cá nhiễm bệnh, nhiễm độc ở giai đoạn đầu và giảm dần ở thời điểm về sau do sự suy yếu miễn dịch. Do đó, sự tăng lên của tế bào bạch cầu trên cá bống kèo bị xuất huyết là một trong những đặc điểm sinh học bệnh lý và báo động tình trạng sức khỏe của cá trong ao nuôi.

b. Bạch cầu đơn nhân

Kết quả định lượng cho thấy, bạch cầu đơn nhân trong các ao nuôi cá bống kèo dao động từ 10.800 – 211.500 tế bào/ml. Số lượng bạch cầu đơn nhân ớ các ao nuôi có dấu hiệu bệnh cao hơn so với ao nuôi cá khỏe và có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê (P<0,05) (Bảng 4.11).

Bảng 4.11 Kết quả so sánh các loại bạch cầu ở cá bống kèo

Mật độ các loại bạch cầu (tế bào x 104/ml)

Ao

Ao cá bình thường

Ao cá bệnh

BC Đơn nhân 6,18±2,66cd 8,21±4,61abcd 3,16±1,07d 13,25±4,53a 8,94±6,35abcd 9,84±7,05abcd 15,29±5,26a 12,06±2,75a 10,79±2,97ac 8,80±2,98ac 10,43±3,92ac

4 5 8 1 2 3 6 7 9 10 11

BC Trung tính 11,23±6,11bc 7,80±4,38b 3,28± 4,31b 36,27±5,22a 27,7±13,35acd 19,07±11,88bd 27,74±7,12ad 30,54±6,43ad 23,14±6,34cd 24,89±6,53d 24,39±11,86d

Tiểu cầu 15,98±3,47b 14,61±2,32b 11,25±1,21ab 17,32±7,94ab 12,85±4,13ab 13,50±6,73ab 16,62±4,52b 9,81±1,65a 11,04±1,12a 11,09±4,08ab 14,50±5,96ab

Lympho 12,40±8,51a 19,61±7,06ac 16,58±2,43a 15,66±6,90a 23,88±14,87ab 34,28±10,91bc 23,23±7,58ad 32,47±5,37bd 40,44±5,75b 39,60±6,46b 36,15±6,46b

Các giá trị trong cùng một cột (a, b, c, d) có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống

kê (P<0,05) và ngược lại.

67

Qua kết quả Bảng 4.11 cho thấy, số lượng bạch cầu đơn nhân ở ao cá khỏe khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với ao cá bệnh (trừ ao 5). Mật độ bạch cầu đơn nhân ở ao cá khỏe thấp hơn mật độ bạch cầu đơn nhân ở ao có dấu hiệu bệnh lý.

c. Bạch cầu trung tính

Kết quả phân tích, mật độ bạch cầu trung tính của cá bống kèo dao động khoảng 0,61x104 tb/ml đến 54 x104 tb/ml. Số lượng bạch cầu trung tính ở ao cá khỏe khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) so với ao cá bệnh (Bảng 4.11).

d. Tế bào lympho

Qua Bảng 4.11 cho thấy, tế bào lympho ở các ao dao động từ 2,2 x 104 đến 47,5 x 104 tế bào/ml, mật độ trung bình cao nhất ở ao cá bệnh số 9 (40,44 ± 5,75 x 104 tế bào/ml) và thấp nhất là ở ao cá khỏe số 4 ở mức tế bào lympho trung bình là (12,40±8,51 x 104 tế bào/ml), kết quả các tế bào lympho ở các ao cá khỏe (4,5 và 8) khác biệt so với các ao cá bệnh (3, 7, 9, 10 và 11) ở mức ý nghĩa P<0,05.

e. Tiểu cầu

Kết quả định lượng cho thấy, hai ao cá khỏe 4 và 5 khác biệt so với hai ao cá bệnh 7 và 9 (P <0,05) (Bảng 4.11). Ở ao cá khỏe có mật độ tế bào tiểu cầu thấp hơn so với mật độ tế bào tiểu cầu ở các ao cá có dấu hiệu bệnh lý.

Nhìn chung, số lượng các loại tế bào bạch cầu ở những ao cá có dấu hiệu bệnh xuất huyết gia tăng so với những ao cá khỏe, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (P <0,05). Tương tự như kết quả nghiên cứu của Martins et al. (2008) trên cá rô phi nhiễm vi khuẩn Enterococcus spp. đã tìm thấy số lượng của các loại tế bào bạch cầu như lympho, bạch cầu trung tính, bạch cầu dơn nhân và tiểu cầu đều cao hơn so với cá rô phi khỏe.

Toida et al. (2003) cho rằng do sự tập trung nhanh chóng tế bào lympho ở những vùng bị viêm làm cho quá trình cung cấp bổ sung tế bào này ở vùng ngoại vi của máu bị giảm. Bạch cầu gia tăng số lượng trong 24 giờ và đại thực bào trong vòng 3 ngày và có vai trò quan trọng trong việc hình thành hàng rào bảo vệ chống lại các tác nhân cơ hội gây bệnh. Ngoài ra sự thay đổi số lượng bạch cầu trong máu cho thấy phần lớn đại thực bào ở những vùng bị viêm di chuyển từ mạch máu đến phản ứng với tác nhân gây bệnh mặc dù đại thực bào phân bố khắp cơ thể (Suzuki và Iida, 1992).

68

4.5 Phát triển qui trình chẩn đoán bệnh xuất huyết ở cá bống kèo

bằng phƣơng pháp sinh học phân tử

4.5.1 Kết quả chiết tách DNA trực tiếp từ mô thận cá

Kết quả chiết tách, đo hàm lượng DNA và độ tinh sạch DNA từ 16 mẫu thận cá cho thấy độ tinh sạch ở bước sóng 260 nm là 1,57 – 1,78 và hàm lượng DNA thận cá nằm trong khoảng 1.675 – 3385 ng/µl.

4.5.2 Kết quả chiết tách DNA vi khuẩn

Kết quả chiết tách từ 49 chủng vi khuẩn phân lập có độ tinh sạch ở bước sóng 260 nm là 1,3 - 1,9 và hàm lượng DNA khoảng 2.500 – 5000 ng/µl. Từ kết quả chiết tách cho thấy hàm lượng DNA chiết tách từ vi khuẩn dao động từ 2.765 - 4.855 ng/µl và độ tinh sạch dao động từ 1,7 ng/µl đến 2 ng/µl.

4.5.3 Kết quả khảo sát cặp mồi cho qui trình PCR phát hiện

Streptococcus dysgalactiae

Sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 đặc hiệu phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae dựa theo phương pháp của Hassan et al. (2003), đối chứng dương sử dụng trong phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae là vi khuẩn đã được giải mã định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S là vi khuẩn có ký hiệu B2-5G. Kết quả điện di sản phẩm PCR dương tính, phát hiện S. dysgalactiae khi sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 ở vị trí 259 bp thể hiện qua Hình 4.17.

Hình 4.17 Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện Streptococcus dysgalactiae bằng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 (M): thang DNA; 1: B1-6T; (+): đối chứng dương (B2-5G); (-): đối chứng âm. Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm PCR hiện vạch DNA đặc hiệu của vi khuẩn S. dysgalactiae ở vị trí 259 bp. Tương tự với kết quả nghiên cứu của Nomoto et al. (2004) khi sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 theo phương pháp của Hassan et al. (2003) cũng đã phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae ở 259 bp là vi khuẩn gây bệnh trên cá trác sọc vàng (amberjack Seriola quinqueradiata, Seriola dumerili).

69

4.5.4 Kiểm tra tính đặc hiệu và độ nhạy của qui trình PCR phát hiện

vi khuẩn S. dysgalactiae

4.5.4.1 Kiểm tra tính đặc hiệu của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn

S. dysgalactiae

Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của qui trình PCR phát hiện S.

dysgalactiae thể hiện qua Hình 4.18.

Hình 4.18 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra tính đặc hiệu của qui trình (M): thang DNA; (1): Vibrio parahaemolyticus; (2): Streptococcus dysgalactiae; (3): Edwardsiella ictaluri; (4): Aeromonas hydrophilla; (5): Streptococcus agalactiae; (6): Flavobacterium columnare.

Kết quả điện di (Hình 4.18) cho thấy, qui trình khuếch đại chỉ hiện vạch đặc hiệu ở 259 bp của vi khuẩn S. dysgalactiae mà không hiện vạch sản phẩm đối với các chủng vi khuẩn khác. Điều này đã xác định được tính đặc hiệu của qui trình khi chỉ phát hiện được vi khuẩn S. dysgalactiae mà không phát hiện được các loài vi khuẩn khác khi sử dụng mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Hassan et al. (2003) và Nomoto et al. (2004) khi sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 đã phát hiện chính xác 100% S. dysgalactiae và qui trình cũng chỉ phát hiện được vi khuẩn S. dysgalactiae ở vạch 259 bp mà không hiện vạch sản phẩm đối với các chủng vi khuẩn khác.

4.5.4.2 Kiểm tra độ nhạy của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S.

dysgalactiae

Kết quả điện di cho thấy, độ nhạy của qui trình có thể phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae ở mật độ thấp nhất là 50 ng vi khuẩn và vạch AND xuất hiện rõ dần ở các mật độ cao thể hiện phản ứng ngày càng rõ hơn. Kết quả xác định độ nhạy của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae là 50 ng DNA vi khuẩn/0,5g mô thận (Hình 4.19).

70

Hình 4.19 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra độ nhạy của qui trình (M): thang DNA; (1): 25 ng; (2): 50 ng; (3): 100 ng; (4): 200 ng; (5): 400 ng; (6): 800 ng; (7): 1.600 ng; (8): 3.200 ng.

4.5.5 Kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình PCR phát hiện vi

khuẩn S. dysgalactiae

4.5.5.1 Kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình từ mẫu vi khuẩn

Sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae dựa theo phương pháp của Hassan et al. (2003) để xác định ngẫu nhiên 10/250 chủng vi khuẩn còn lại bằng phương pháp PCR, kết quả cho thấy cả 10/10 chủng (100%) nhạy với cặp mồi STRD-DyI/ dys-16S–23S-2 ở 259 bp (Hình 4.20).

Hình 4.20 Kết quả PCR 10 chủng vi khuẩn M: thang DNA; (+): đối chứng dương (B2-5G); (1): A1F1-T; (2): A2F3-G; (3): B3K1F2-T; (4): B1K2F1-G; (5): B3F2-T; (6): F7-T; (7): B1-10TT; (8): B5-8T; (9): B4-6G; (10): B5-3T; (-): đối chứng âm.

Qua kết quả trên cho thấy cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 đã phát hiện chính xác vi khuẩn S. dysgalactiae gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo, khẳng định khả năng ứng dụng qui trình này trong thực tế.

4.5.5.2 Kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình từ mẫu thận cá

bống kèo bệnh

Tiến hành kiểm tra ứng dụng qui trình chẩn đoán trên 10 mẫu cá bống kèo có kí hiệu A1F1, A1F2, A1F4, A1F6, A1F9, A5F4, B1-6, B2-3, B2-5 và B6-9. Tất cả 10 mẫu này đều có dấu hiệu bệnh lý xuất huyết như xuất huyết ở các vây, xuất huyết ở gan, thận và tỳ tạng. Trên thận của 10 mẫu cá này đều

71

xuất hiện tình trạng xuất huyết, sung huyết các mao mạch và tĩnh mạch, ống thận xơ hóa, biến đổi cấu trúc và hoại tử.

Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm khuếch đại đặc hiệu cho vi khuẩn S. dysgalactiae có kích thước 259 bp không xuất hiện ở các mẫu DNA thận cá (Hình 4.21).

Hình 4.21 Kết quả PCR từ mẫu thận cá bống kèo bệnh xuất huyết M: thang DNA; (-): đối chứng âm; (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9): mẫu thận cá; (+): đối chứng dương.

Như vậy, qui trình PCR chẩn đoán S. dysgalactiae chưa thể ứng dụng để phát hiện trực tiếp loài vi khuẩn này trên mẫu cá bệnh. Trong một số kết quả nghiên cứu của Nomoto et al. (2004), Nomoto et al. (2008) và Abdelsalam et al. (2009) khi sử dụng phương pháp PCR phát hiện tác nhân vi khuẩn gây bệnh là S. dysgalactiae đều sử dụng trực tiếp DNA của vi khuẩn phân lập được, chưa có kết quả nào được đưa ra về khả năng phát hiện vi khuẩn này trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm. Điều này có thể do trong quá trình chiết tách DNA mẫu thận cá, không định lượng được DNA vi khuẩn trong mẫu đủ để phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae. Tuy nhiên với kết quả đã xác định ở độ nhạy của qui trình, sản phẩm PCR sẽ hiện vạch sản phẩm trong kết quả điện di ở vị trí 259 bp khi hàm lượng vi khuẩn đạt 50 ng.

4.6 Phƣơng pháp điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ở qui mô

phòng thí nghiệm

4.6.1 Lập kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo

4.6.1.1 Kết quả kháng sinh đồ

Phục hồi 4 chủng vi khuẩn B1-6T, B2-3TT, B2-5G, B6-9TT. Quan sát thấy cả 4 chủng vi khuẩn đều có cùng đặc điểm đồng nhất về hình dạng, là khuẩn lạc nhỏ tròn, trắng đục (Hình 4.22A) và hình cầu, Gram (+) (Hình 4.22B), không di động, âm tính với oxidase, catalase.

72

Hình 4.22 Kết quả tách ròng và nhuộm gram các chủng vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm kháng sinh đồ (A): Kết quả tách ròng vi khuẩn; (B): Kết quả nhuộm gram.

Kết quả kháng sinh đồ của 4 chủng vi khuẩn với 12 loại kháng sinh được

thể hiện qua Hình 4.23 và Bảng 4.12.

Hình 4.23 Kết quả kháng sinh đồ với vi khuẩn S. dysgalactiae

Các chủng vi khuẩn S. dysgalactiae trong thí nghiệm có tính nhạy cao đối với nhóm fenicol, nhóm tetracyclin (3/4 chủng), và giảm tính nhạy xuống đối với kháng sinh nhóm Aminoglycosides: Neomycin (2/4 chủng), Gentamycin (0 chủng). Bên cạnh đó nhóm Quinolone, thí nghiệm có sử dụng kháng sinh Norfloxacin để thử tính nhạy tuy nhiên, ở kháng sinh này cho kết quả thấp chỉ có 1/4 chủng nhạy với kháng sinh này.

73

Bảng 4.12 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ

Kháng sinh

B6-9TT

B2-3TT

Neomycin (N, 30µg)

Florfenicol (FFC, 30µg)

Doxycycline (DO, 30µg)

Gentamicin (GM, 10µg)

Cefazolin (CZ, 30µg)

Ampicillin (AMP, 25µg)

Amoxicillin (AML, 25µg)

Tetracycline (TE, 30µg)

Trimethoprim + sulfamethoxazole (SXT,1.25/23.75µg)

Norfloxacin (NOR, 5µg)

Ciprofloxacin (CIP, 5µg)

Enrofloxacin (ENR, 5µg)

S I R S I R S I R S I R S I R S I R S I R S I R S I R S I R S I R S I R

Đường kính trung bình vòng vô trùng (mm) B1-6T 17,5 25,5 25,5 10,5 17,5 12,5 12 25,5 18 13 24,5 24

B2-5G 17 12 15,5 18 23,5 13 13,5 24 11 15,5 18 13,5

11,5 25,5 26 8,5 17,5 12 11 26,5 19 20,5 24 20

16 23,5 18 16 13,5 17 17 12 21 13 14 20

Ghi chú: S: Nhạy; I: trung bình; R: kháng

Từ kết quả Bảng 4.12 cho thấy, 8/12 loại kháng sinh nhạy với 4 chủng vi khuẩn khảo sát, trong đó có 4 loại kháng sinh có tính nhạy cao gồm có FFC, DO, TE và SXT với tỷ lệ 75%. Tuy nhiên FFC, TE và SXT đều có tỷ lệ kháng là 25%, còn DO không có tỷ lệ kháng ở 4 chủng khảo sát. Tương tự với kết quả nghiên cứu của Wuming Yang và Aihua Li (2009) cho thấy vi khuẩn S. dysgalactiae được phân lập từ cá tầm Acipenser schrenckii có tính nhạy cao

74

với DO và chloramphenicol. Ngoài ra, kết quả khảo sát của Francis P. M et al. (2014) khi lập kháng sinh đồ đối với chủng S. iniae cho thấy FFC, DO, TE là những kháng sinh có độ nhạy cao với S. iniae.

Bên cạnh đó, kháng sinh AML có tỷ lệ kháng cao, kháng với 3/4 chủng nghiên cứu chiếm tỷ lệ 75%. Theo kết quả khảo sát, do trong quá trình nuôi người dân có sử dụng kháng sinh AML định kỳ để phòng trị bệnh, đây có thể là nguyên nhân gây nên hiện tượng kháng AML ở vi khuẩn này. Điều này xảy ra tương tự kết quả của Phạm Thanh Hương và ctv. (2011) khi nghiên cứu sự kháng kháng sinh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra, kết quả cho thấy AML và AMP đã bị hai chủng vi khuẩn này kháng hoàn toàn.

Ngoài ra, giữa các chủng vi khuẩn thí nghiệm còn xuất hiện hiện tượng đa kháng thuốc như: chủng B1-6T kháng với 3 loại kháng sinh đó là GM, AML và AMP; chủng kháng nhiều loại kháng sinh nhất là chủng B2-5G kháng 4 loại gồm FFC, SXT, AML và AMP.

Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh hay cụ thể là hiện tượng đa kháng thuốc hiện nay trong nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam nói riêng hay trên thế giới nói chung đã không còn xa lạ và rất phổ biến trong hiện tại. Qua kết quả kháng sinh đồ trên cho thấy, việc kháng thuốc của vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản là một vấn đề cần phải quan tâm. Bởi cùng một loại kháng sinh nhưng lại cho kết quả kháng sinh đồ khác nhau rất nhiều trong cùng một loài cũng như trong các nghiên cứu với nhau. Sự khác biệt trên có thể do phương thức và mức độ sử dụng thuốc trong quá trình nuôi của người dân giữa các vùng là khác nhau. Việc kháng thuốc của vi khuẩn là do người nuôi sử dụng thuốc không đúng qui tắc sử dụng thuốc an toàn và chưa hiểu hết những tác hại của việc phối hợp thuốc không đúng cách trong điều trị.

FFC là kháng sinh thuộc nhóm fenicol, có phổ kháng khuẩn rộng, là kháng sinh được dùng để đặc trị bệnh gan thận mủ trong nhiều năm qua, theo những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy tỷ lệ kháng FFC của vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ là 73% (Phạm Thanh Hương và ctv., 2011). Theo Keyes et al. (2000), thì FFC được ứng dụng rộng rãi trong ngành thú y và trong nuôi trồng thủy sản ở châu Á từ những thập niên 1980. Sự gia tăng tính kháng trên kháng sinh nhóm Fenicol là do vi khuẩn đề kháng thông qua nhiều cơ chế khác nhau như: đào thải thuốc kháng sinh ra khỏi tế bào thông qua kênh protein (efflux protein) có trên thành tế bào vi khuẩn (Cloeckaert et al., 2000); mã hóa gen liên qua đến integron và thông qua plasmid (Keys et al., 2000).

75

Đối với nhóm tetracycline, vi khuẩn kháng với TE chủ yếu qua hai cơ chế: qua các protein bảo vệ ribosome (RPPs-ribosomal protection proteins) và hệ thống bơm thải tetracyclin phụ thuộc năng lượng (energy-dependent efflux pumps) (Roberts, 1996). Hai cơ chế khác cũng được phát hiện là bất hoạt kháng sinh bởi enzyme (Yang et al., 2004) và thay đổi vị trí đích (target site) tác dụng của kháng sinh bằng đột biến vùng 16S rRNA (Ross et al., 1998). DO là kháng sinh thuộc thế hệ mới nhất của nhóm Tetracyclin. Kết quả nghiên cứu này cho thấy 3/4 các chủng vi khuẩn Streptococcus sp. nhạy với kháng sinh DO. Sự tác động mạnh mẽ và tiêu diệt vi khuẩn của nhóm kháng sinh này vẫn còn rất cao. Theo Bùi Kim Tùng (2001), TE là nhóm kháng sinh thường dùng để trị các bệnh hô hấp ở người, brucella, mycolasma.

Với kết quả trên có thể sử dụng FFC, DO, TE để trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo nhưng chỉ nên sử dụng khi thật cần thiết để hạn chế tình trạng kháng thuốc và điều đáng lưu ý cho các nhà quản lý cũng như người nuôi vì đây là những kháng sinh được khuyến cáo là hạn chế sử dụng theo Thông tư số 15/2009/TT-BNN ngày 17 tháng 3 năm 2009 của Bộ Trưởng Bộ Nông nghiệp & PTNT (Bộ Nông nghiệp & PTNT, 2014), nên trong quá trình sử dụng cần được quản lý chặt chẽ và ngừng sử dụng trước khi thu hoạch để tránh tình trạng tồn dư kháng sinh trong sản phẩm.

4.6.1.2 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

Qua kết quả kháng sinh đồ chọn ra 02 loại kháng sinh mà vi khuẩn mẫn cảm gồm FFC, DO và 01 loại kháng sinh có tỷ lệ kháng cao là AML để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh với 4 chủng vi khuẩn B1- 6T, B2-3TT, B2-5G, B6-9TT. Xác định MIC đối với các chủng vi khuẩn trên để tìm ra nồng độ thấp nhất mà kháng sinh có hiệu lực ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Từ đây giúp cho việc sử dụng thuốc với liều lượng thấp nhất nhưng vẫn có hiệu quả, hạn chế khả năng kháng thuốc của vi khuẩn. Trong 4 chủng, có 2 chủng B1-6T và B6-9TT thể hiện tính kháng mạnh với AML (256 ppm). Riêng B1-6T kháng với FFC (4 ppm), DO với nồng độ (4 ppm) đã ức chế được vi khuẩn nhưng với chủng B6-9TT DO phải ở nồng độ (8 ppm) mới ức chế được, cho thấy chủng B6-9TT có xu hướng kháng với kháng sinh DO. Kết quả MIC được trình bày ở Bảng 4.13.

76

Kết quả MIC (ppm)

Bảng 4.13 Kết quả MIC của 4 dòng vi khuẩn S.dysgalactiae trên 3 loại kháng sinh FFC, DO và AML Vi khuẩn

Điểm tới hạn CLSI, 2012 (M100-S22)

B1.6T B6.9TT B2.5G B2.3TT

256 4 8

256 4 4

128 4 4

S ≤ 8 ≤ 2 ≤ 4

R ≥ 32 ≥ 8 ≥ 16

Kháng sinh 128 AML 4 FFC DO 4 Ghi chú: S: Nhạy; I: trung bình; R: kháng

Kết quả cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu của AML cao nhất và dao động từ 128 ppm - 256 ppm. Kế đó là DO có nồng độ thấp hơn (4 ppm - 8 ppm) và cuối cùng là FFC có nồng độ thấp nhất (4 ppm) tương ứng khả năng kháng khuẩn của FFC mạnh nhất trong 3 loại kháng sinh và yếu nhất là AML.

So sánh với kết quả nghiên cứu của Ellen Portis et al. (2012) cho thấy, MIC của kháng sinh FFC đối với vi khuẩn Streptococcus spp. là 8 ppm cao hơn so với nghiên cứu (4 ppm) và nghiên cứu của Aoki T. et al. (1983) thì MIC của DO là 2 ppm thấp hơn so với kết quả nghiên cứu (4 – 8 ppm), qua so sánh trên cho thấy, vi khuẩn S. dysgalactiae gây bệnh trên cá bống kèo nuôi trong thời điểm hiện nay vẫn nhạy với FFC và đã có xu hướng kháng với DO.

4.6.2 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm

Tiến hành thí nghiệm cảm nhiễm cá bống kèo khỏe với 4 nghiệm thức là 4 chủng vi khuẩn B1-6T; B2-3TT; B2-5G; B6-9TT và nghiệm thức đối chứng là nước muối sinh lý để xác định tác nhân gây bệnh. Sau 7 ngày theo dõi kết quả cho thấy, ở tất cả các nghiệm thức tiêm vi khuẩn đều xuất hiện cá chết, có dấu hiệu xuất huyết ở các vây và xuất huyết ở gan, thận, tỳ tạng giống với những biểu hiện của cá bệnh thu ở ao nuôi. Chủng vi khuẩn B2-5G cho tỷ lệ cá chết cao nhất là 86,7%; kế đến là chủng B1-6T có tỷ lệ cá chết là 76,7%; chủng B2-3TT và chủng B6-9TT có tỷ lệ chết bằng nhau 73,3%; ở bể đối chứng tiêm nước muối sinh lý có tỉ lệ chết 13,3% (Bảng 4.14).

Bảng 4.14: Tỉ lệ chết của 4 chủng vi khuẩn S. dysgalactiae ở thí nghiệm cảm nhiễm

STT

Chủng vi khuẩn

Tỉ lệ chết (%)

1 2 3 4 5

B1-6T B2-3TT B2-5G B6-9TT ĐC

76,7 73,3 86,7 73,3 13,3

77

Trong quá trình thí nghiệm, ở nghiệm thức đối chứng có xuất hiện cá chết ở ngày đầu tiên sau khi bố trí thí nghiệm với tỷ lệ chết là 13,3% và những ngày tiếp theo không xuất hiện cá chết, khi tiến hành phân lập mẫu cá không có vi khuẩn xuất hiện, như vậy cá chết ở nghiệm thức này có thể là do bị sốc vì thao tác tiêm nước muối sinh lý và tỷ lệ chết này không đáng kể so với các nghiệm thức còn lại. Còn ở những nghiệm thức tiêm vi khuẩn, cá bắt đầu chết từ ngày thứ 2 sau khi cảm nhiễm và tình trạng cá chết kéo dài đến khi kết thúc thí nghiệm. (Hình 4.24).

Hình 4.24 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm

Tiến hành theo dõi các biểu hiện của cá trong thí nghiệm cho thấy cá lờ đờ, bơi lội kém linh hoạt, xuất huyết dưới da vào ngày thứ 2 và 3. Đây là dấu hiệu đặc trưng của bệnh do nhóm vi khuẩn Streptococcus gây ra đã được miêu tả bởi nhiều tác giả như Bromage (1999); Buller (2006).

Quan sát dấu hiệu bệnh lý bên ngoài và bên trong của mẫu bệnh phẩm và tái phân lập vi khuẩn từ gan, thận và tỳ tạng để xác định các chỉ tiêu sinh hóa. Từ kết quả quan sát và phân tích cho thấy chúng là vi khuẩn hình tròn, màu trắng đục, kích thước < 1µm, Gram (+), hình cầu hay liên cầu, không di động, phản ứng âm tính với oxidase và catalase, không có khả năng lên men glucose trong cả hai điều kiện hiếu khí và kị khí. Vi khuẩn có khả năng phát triển trong môi trường có chứa 5% máu cừu nhưng không có khả năng gây tan huyết. Kết quả quan sát và phân tích các đặc điểm hình thái và sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá bống kèo gây cảm nhiễm được trình bày ở Bảng 4.15.

Kết quả định danh bằng kit API 20 Strep cho thấy tất cả các chủng cho phản ứng dương tính với β-glucuronidase, alkaline phosphatase, leucine amino peptidase, ribose, trehalose, sorbitol, lactose, amygdaline. Và âm tính với các

78

chỉ tiêu còn lại. Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của các chủng vi khuẩn trong nghiên cứu này, giống với vi khuẩn S. dysgalactiae (Buller, 2004 và Nomoto et al., 2004).

Bảng 4.15 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn phân lập từ cá bống kèo gây cảm nhiễm.

Chủng vi khuẩn

Chỉ tiêu

1

2

3

4

+ cầu - - - - - + γ - - - - - + - + + -

+ cầu - - - - - + γ - - - - - + - + + -

+ cầu - - - - - + γ - - - - - + - + + -

+ cầu - - - - - + γ - - - - - + - + + -

Nomoto et al. (2004) + cầu - - - - - + γ - - - - - + - + + -

Buller (2004) + cầu - - - - - + γ - - v v - + - + + +

Nhuộm Gram Hình dạng Di động Sinh catalaza Sinh oxidaza Phản ứng lên men yếm khí Phản ứng lên men hiếu khí Mọc trên môi trường máu Gây tan huyết Phản ứng Voges-Proskauer Hippurate hydrolysis Bile-esculin tolerance Pyrrolidonyl arylamidase Sinh α-galactosidase Sinh β-glucuronidase Sinh β-galactosidase Alkaline phosphatase Leucine AminoPeptidase Arginine Dihydrolase Sử dụng đƣờng

Ribose Arabinose Manitol Sorbitol Lactose Trehalose Inulin Raffinose Amygdaline Glycogen

+ - - + + + - - + -

+ - - + + + - - + -

+ - - + + + - - + -

+ - - + + + - - + -

+ - - - + + v - v +

+ - - + + + - - + -

Ghi chú: (1): chủng B1-6T; (2): chủng B2-3TT; (3): chủng B2-5G; (4): chủng B6-9TT; (+): dương tính; (-): âm tính; v: không xác định.

Bên cạnh đó, khi sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 đặc hiệu cho phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae dựa theo phương pháp của Hassan et al. (2003) để xác định 4 chủng vi khuẩn trên bằng phương pháp PCR, kết quả cho thấy cả 4/4 chủng (100%) đều dương tính với sản phẩm PCR, cho vạch sáng ở vị trí 259 bp. (Hình 4.25).

79

Hình 4.25 Kết quả PCR 4 chủng vi khuẩn Giếng M: thang; (+): đối chứng dương; (-): đối chứng âm; (1): chủng B1-6T; (2): chủng B2- 3TT; (3): chủng B2-5G; (4): chủng B6-9TT.

Kết quả trên cho phép xác định vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo chính là vi khuẩn Streptococcus dysgalactiae. Vi khuẩn này cũng đã được xác định là tác nhân gây bệnh xuất huyết trên một số loài cá nước lợ mặn như cá trác sọc vàng yellowtail Seriola quinqueradiata, cá bò biển amberjack Seriola demerili (Nomoto et al., 2004), cá chim vây vàng Trachinotus ovatus (Zhou et al., 2007), cá tầm Acipencer schrenckii (Yang và Li, 2009), cá đối xám Mugil cephalus (Abdelsalam et al., 2009), và cá đối Liza Haematocheila (Qi et al., 2013).

4.6.3 Kết quả thí nghiệm xác định giá trị LD50

Kết quả theo dõi tình trạng sức khỏe cá trong thí nghiệm cho thấy cá ở lô đối chứng vẫn hoạt động bình thường, đối với các nghiệm thức tiêm vi khuẩn thì cá bị nhiễm bệnh và chết với những dấu hiệu bệnh lý bên ngoài như xuất huyết ở các vây, trên thân và bên trong gan, thận và tỳ tạng của cá bị xuất huyết và sưng to. Qua những dấu hiệu trên cho thấy, khi cảm nhiễm 02 chủng vi khuẩn B1-6T và B2-5G thì cá có dấu hiệu bệnh lâm sàng giống với dấu hiệu cá bệnh xuất huyết thu ngoài ao nuôi.

Sau khi cảm nhiễm cá đến ngày thứ 2 cá bắt đầu chết kéo dài đến ngày thứ 8 và sau đó cá ngưng chết đến khi kết thúc thí nghiệm. Kết quả thí nghiệm cho thấy, vi khuẩn B1-6T gây tỉ lệ chết thấp nhất (38,3%) ở mật độ vi khuẩn 4,25 x 102 CFU/ml và gây tỉ lệ chết cao nhất (88,3%) ở mật độ vi khuẩn 4,25 x 108 CFU/ml. Tương tự ở chủng B2-5G, tỷ lệ gây chết thấp nhất ở mật độ vi khuẩn 3,5 x 102 CFU/ml là 48,3% và 3,5 x 108 CFU/ml là 90%. Cá ở nghiệm thức tiêm nước muối sinh lý cũng bị chết trong vòng từ 2 – 4 ngày sau khi tiêm nhưng sau đó không có cá chết, tỷ lệ chết thấp 11,67%, tiến hành phân lập không có vi khuẩn. Như vậy, cá ở nghiệm thức này chết có thể do bị sốc vì thao tác tiêm nước muối sinh lý và tỷ lệ chết này không đáng kể so với các nghiệm thức còn lại (Bảng 4.16).

80

Bảng 4.16 Kết quả xác định tỉ lệ gây chết của hai chủng B1-6T và B2-5G

Tỉ lệ gây chết (%) Chủng B1-6T Chủng B2-5G Đối chứng

11,67

48,3 58,3 63,3 71,7 75 81,7 88,3 3,5 x 103,17

Mật độ Vi khuẩn vi khuẩn (CFU/ml) 102 103 104 105 106 107 108 LD50

38,3 48,3 50 73,3 78,3 81,7 90 4,25 x 104 Ở cùng nồng độ 102 CFU/ml vi khuẩn B1-6T gây tỉ lệ chết (38,3%) thấp hơn chủng B2-5G (48,3%), ngược lại ở mật độ vi khuẩn 108 CFU/ml thì tỉ lệ gây chết của vi khuẩn B1-6T (90%) cao hơn so với tỉ lệ gây chết của vi khuẩn B2-5G (88,3%). Như vậy, mật độ vi khuẩn khác nhau tỉ lệ chết của cá trong thí nghiệm khác nhau theo chiều hướng mật độ vi khuẩn tăng thì tỉ lệ cá chết tăng (Hình 4.26).

Hình 4.26 Kết quả thí nghiệm LD50 của vi khuẩn B1-6T và B2-5G

Qua kết quả thí nghiệm xác định được nồng độ gây chết của chủng vi khuẩn B1-6T là LD50 = 4,25 x 104 CFU/ml và chủng B2-5G = 3,5 x 103,71CFU/ml.

Nồng độ gây chết của vi khuẩn tùy thuộc vào sự mẫn cảm khác nhau của từng loài cá (Agnew và Barnes, 2007). Khi tiến hành nghiên cứu nồng độ gây chết của vi khuẩn S. dysgalactiae trên cá tầm (Acipenser schrenckii) của Yang và Li (2009) đã xác định LD50 = 4 x 108 CFU/ml, tương tự với kết quả nghiên cứu của Pan et al., (2009) khi xác định LD50 trên cá tầm Siberian (Acipenser baerii) cũng xác định được là 3 x 108 CFU/ml. Tuy nhiên, đối với cá đối (Liza Haematocheila), khi Z.T. Qi et al., (2013) nghiên cứu nồng độ gây chết của vi khuẩn S. dysgalactiae trên cá đối này đã xác định LD50 = 5,4 x 106 CFU/ml. Và trong kết quả của thí nghiệm xác định LD50 của S. dysgalactiae trên cá 81

bống kèo là dao động 3,5 x 10 3,71 đến 4,25 x 104 CFU/ml. Điều này xác định tùy thuộc vào từng loài cá mà nồng độ gây chết của cùng một vi khuẩn khác nhau. Kết quả LD50 của S. dysgalactiae trên cá bống kèo dao động 3,5 x 10 3,71 đến 4,25 x 104 CFU/ml cũng khá phù hợp với nồng độ gây chết của một số loài vi khuẩn Streptococcus spp. khác như LD50 của vi khuẩn S. agalactiae trên cá điêu hồng là 4,89 x 104 CFU/ml (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012), vi khuẩn S. iniae trên cá chẽm nuôi ở Úc là 3,2 x 104 CFU/cá (Bromage et al., 1999).

4.6.4 Kết quả thí nghiệm điều trị bệnh ở qui mô phòng thí nghiệm

Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm thăm dò xác định được liều LD50 của chủng S. dysgalactiae B1-6T là 4,25 x 104 CFU/ml. Do đó cá ở các nghiệm thức 1, 2, 3, 4, 5 được gây cảm nhiễm liều LD50 bằng phương pháp tiêm với mật độ vi khuẩn là 104 CFU/ml.

Kết quả cho thấy, cá ở nghiệm thức 1, 2, 3, 4 và 5 có dấu hiệu bệnh lý như cá bơi lờ đờ, da cá nhợt nhạt, một số cá xuất hiện tình trạng xuất huyết ở các gốc vây và chết từ ngày thứ 3 sau khi gây cảm nhiễm (Hình 4.27A và B).

Tiến hành giải phẫu, quan sát bên trong các cơ quan nội tạng cho thấy gan bị xuất huyết, thận và tỳ tạng bị sưng to, mềm nhũn (Hình 4.27C và D), một số con bên trong xoang bụng có dịch hôi, tương tự như dấu hiệu bệnh lý của những mẫu cá bống kèo bệnh thu được ngoài hiện trường và giống như một số loài cá bị bệnh xuất huyết khác như cá rô phi khi bị bệnh xuất huyết có các dấu hiệu như xuất huyết ở vây ngực và vây bụng, xoang bụng chứa dịch hôi và nội tạng bị xuất huyết và mềm nhũn (Phạm Hồng Quân, 2013). Dấu hiệu bệnh lý được mô tả tương tự trong nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương (2012) ở cá điêu hồng bị bệnh xuất huyết.

Hình 4.27 Dấu hiệu bệnh lý của cá trong thí nghiệm điều trị (A): Cá bị xuất huyết ở vây (↓); (B): Cá bị xuất huyết trên thân (↓); (C): Cá bị xuất huyết ở gan (↓); (D): Tỳ tạng sưng to, xuất huyết (↓), thận bị nhũn (↓)

82

Kết quả tái phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh ở các nghiệm thức 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 cho thấy ở nghiệm thức 1, 2, 3, 4, 5 khuẩn lạc có kích thước nhỏ, hình tròn, màu trắng đục trên môi trường TSA (+1,5% NaCl). Ở nghiệm thức 6 và 7 không có vi khuẩn phát triển. Tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý của vi khuẩn thu được ở các nghiệm thức 1, 2, 3, 4 và 5 cho thấy chúng là vi khuẩn hình cầu, gram dương, không di động, tất cả đều cho phản ứng âm tính với oxidase, catalase.

Định danh vi khuẩn bằng phương pháp PCR theo phương pháp của Hassan et al. (2003) trên chủng vi khuẩn cảm nhiễm B1-6T và chủng vi khuẩn phân lập từ cá bệnh ở các nghiệm thức 1, 2, 3, 4, 5 cho kết quả định danh vi khuẩn gây bệnh là vi khuẩn S. dysgalactiae (Hình 4.28).

Hình 4.28 Kết quả định danh vi khuẩn tái phân lập từ thí nghiệm điều trị (1), (2), (3), (4), (5): vi khuẩn ở nghiệm thức 1, 2, 3, 4, 5; (6): chủng B1-6T; M: thang DNA; (-): đối chứng âm; (+): đối chứng dương.

Kết quả theo dõi cho thấy, cá bắt đầu chết từ ngày thứ 3 sau khi gây cảm nhiễm, đến ngày thứ 13 sau khi tiêm cảm nhiễm vi khuẩn cá ở các nghiệm thức ngừng chết và tỉ lệ sống của các nghiệm thức lần lượt là 65,56%; 71,11%; 67,78% và 70%. Trong khi đó, ở nghiệm thức đối chứng 6 và 7 tỷ lệ sống là 96,67% và 97,78% (Hình 4.29). Giá trị RPS (%) được xác định lần lượt là 45,27%; 61,16%; 56,72% và 59,7%.

83

Hình 4.29: Tỷ lệ sống của cá ở thí nghiệm điều trị NT1: nghiệm thức dùng thuốc DO nguyên liệu; NT2: nghiệm thức dùng thuốc DO thành phẩm; NT3: nghiệm thức dùng thuốc FFC nguyên liệu; NT4: nghiệm thức dùng thuốc FFC thành phẩm; NT5: Đối chứng 1, cá cảm nhiễm, không dùng thuốc; NT6: Đối chứng 2, cá được tiêm muối sinh lý và cho ăn thức ăn không trộn thuốc; NT7: Đối chứng 3: cá không được gây bệnh, không tiêm nước muối sinh lý, cho ăn thức ăn không trộn thuốc.

Khi tiến hành so sánh tỷ lệ sống của cá ở các nghiệm thức cho thấy sự sai

khác mang ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức (Bảng 4.17).

Bảng 4.17: Tỷ lệ sống (%) của cá ở thí nghiệm điều trị

Stt 1 2 3 4 5 6 7

Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7

Tỷ lệ sống (%) 65,56±1,93a 71,11±1,93b 67,78±1,93ab 70 ±3,33b 25,55±3,85c 96,67±0,00d 97,78±1,93d

Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái khác nhau (a, b, c, d) thì khác biệt có ý nghĩa thống

kê (P<0,05) và ngược lại.

Kết quả so sánh thống kê ở Bảng 4.17 cho thấy, đối với các nghiệm thức cá được gây cảm nhiễm, tỷ lệ sống của cá ở nghiệm thức cá được cho thức ăn không trộn thuốc khác biệt mang ý nghĩa thống kê (P<0,05) đối với tỷ lệ sống ở các nghiệm thức cá được cho ăn thức ăn có trộn thuốc kháng sinh, thể hiện hiệu quả của việc sử dụng thuốc kháng sinh trong việc điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo trong điều kiện phòng thí nghiệm. Điều này phù hợp với nhận định của Kitao và Aoki (1979), DO là kháng sinh đã được sử dụng đề điều trị bệnh do vi khuẩn Streptococcus spp. gây ra ở các trang trại nuôi cá trác sọc vàng ở Nhật Bản. Với liều lượng DO 20 - 50 mg/kg trọng lượng thân được sử dụng điều trị thành công bệnh do Streptococcus spp. gây ra trên cá

84

trác sọc vàng (Nakamura, 1982). Như vậy với kết quả thử nghiệm thành công trong thí nghiệm đã xác định được DO và FFC điều trị thành công bệnh xuất huyết trên cá bống kèo trong điều kiện phòng thí nghiệm.

85

Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

5.1 Kết luận

5.1.1 Kết quả điều tra

Thời gian cá bống kèo xuất hiện bệnh tập trung ở giai đoạn cá đạt 2 tháng tuổi. Một số bệnh xuất hiện trên cá bống kèo nuôi thương phẩm là bệnh xuất huyết (chiếm 78,89%), bệnh lở loét (50%), bệnh chướng bụng (50%), bệnh gan (25,56%), tuột nhớt (18,89%), đường ruột (15,56%) và bệnh cong thân (4,44%). Amoxicillin là loại kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong các ao nuôi cá bống kèo.

5.1.2 Kết quả nghiên cứu

Vi khuẩn gây ra bệnh xuất huyết trên cá bống kèo nuôi thương phẩm là vi khuẩn Streptococcus dysgalactiae với đặc điểm bệnh lý là cá bị xuất huyết trên thân và các vi; nội quan của cá với tình trạng gan, thận và tỳ tạng bị sưng to, xuất huyết đôi khi xuất hiện tình trạng dịch hôi trong xoang bụng và thận bị nhũn.

Tế bào mô gan, mang và thận của cá khi bệnh xuất huyết có nhiều biến

đổi cấu trúc, xuất hiện nhiều vùng sung huyết và hoại tử.

Tế bào hồng cầu ở cá bống kèo có dấu hiệu bệnh lý có biến động theo chiều hướng giảm so với cá khỏe. Ngược lại, các loại tế bào bạch cầu ở cá bệnh lại có chiều hướng biến động tăng so với cá khỏe.

Sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 đã phát hiện chính xác 100% vi khuẩn Streptococcus dysgalactiae gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo thương phẩm.

Kết quả LD50 của 2 chủng vi khuẩn B1-6T và B2-5G với giá trị lần lượt

là 4,25 x 104 CFU/ml và 3,5 x 103,17 CFU/ml.

Vi khuẩn gây bệnh trên cá bống kèo nhạy với các loại kháng sinh như FFC, DO và kháng cao với kháng sinh AML và AMP. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của AML cao nhất và dao động từ 128 ppm – 256 ppm và FFC có nồng độ thấp nhất (4 ppm).

Kết quả điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo bằng FFC và DO cả với dạng nguyên liệu và thành phẩm cho tỷ lệ điều trị đạt cao, tỷ lệ sống đạt dao động từ 65,56% - 71,11%. Giá trị RPS (%) dao động từ 45,27% - 61,16%.

86

5.2 Đề xuất

- Nghiên cứu chuẩn hóa qui trình chẩn đoán phát hiện vi khuẩn

Streptococcus dysgalactiae trực tiếp trên mẫu cá.

- Tiếp tục nghiên cứu điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ngoài ao nuôi thương phẩm bằng kháng sinh DO và FFC với thời gian sử dụng thức ăn được trộn thuốc kháng sinh liên tục 5 ngày khi phát hiện cá có dấu hiệu bệnh xuất huyết.

87

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Tài liệu tiếng Anh

Abdelsalam M., Asheg A. and Eissa A. E. (2013). Streptococcus dysgalactiae: An emerging pathogen of fishes and mammals. International Journal of Veterinary Science and Medicine (2013) 1, 1-6.

Abdelsalam M., Chen S. C. and Yoshida T. (2009). Surface properties of Streptococcus dysgalactiae strains isolated from marine fish. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists, 29(1) 2009, 16-24. Journal of Applied Ichthyology, 25 (2009), 443-446.

Abid A. Ansari, Subrata Trivedi, Shalini Saggu, Hasibur Rehman (2014). Mudskipper: A biological indicator for environmental monitoring and assessment of coastal waters. Journal of Entomology and Zoology Studies 2014; 2(6): 22-33.

Actis, L.A., Tolmasky, M.E., Crosa, J.H. (1999). Vibriosis. In: Woo, P.T.K., Bruno, D.W. (Eds.), Fish Diseases and Disorders, vol. 3 CAB International Publishing, Wallingford, United Kingdom, pp. 523– 558.

Ahmed H. Al-Harbi. (1994). First isolation of Streptococcus sp. from hybrid tilapia (Oreochromis niloticus × O. aureus) in Saudi Arabia. Aquaculture. Volume 128:195-201.

Ainsworth, A.J. (1992). Fish granulocytes: morphology, distribution and

function. Annual Review of Fish Diseases. 123-148.

Ambak M.A., Dinh. T.D, Hassan A. (2007). Reproductive biology of the goby Pseudapocryptes lanceolatus in the coastal mud flat areas of the Mekong Deltal. Journal of Sustainability Science and Management, 2(2): 21-30.

in puppies due

Ana I. Vela, Enevold Falsen, Isabel Simarro, Eduardo Rollan, Matthew D. Collins, Lucas Domínguez and Jose F. Fernandez – Garayzabal. (2006). to Bacteremia by Streptococcus Neonatal Mortality dysgalactiae surbp. Dysgalactiae. Journal of Clinical Microbiology, Feb, 2006, p. 666-668.

Anders Jensen and Morgens Kilian. (2011). Delineation of Streptococcus dysgalactiae, Its Subspecies, and Its Clinical and Phylogenetic relationship to Streptococcus pyogenes. Journal of Clinical Microbiology, p 113-126.

Ansary, A., Haneef, R.M., Torres J.L. and Yadav, M. (1992). Plasmids and antibiotic resistance in Aeromonas hydrophila isolated in Malaysia from healthy and diseased fish. Journal of Fish Diseases 15, 191-196.

Austin, B. (2010). Vibrios as causal agents of zoonoses. Veterinary

Microbiology, Elsevier, 2010, 140 (3-4), pp.310.

Austin, B. and Austin, D.A. (1987). Motile aeromonads In Bacterial Fish

Pathogens, 1st edn. pp. 171–177. Chichester, UK: Ellis Horwood.

88

Austin, B. and Austin, D.A. (1993). Bacterial fish pathogens: Disease in

farmed and wild fish, 2nd edn. Ellis Horwood Ltd., Chichester. 384pp.

Austin, B. and C. Adams. (1996). Fish pathogens. In: The genus Aeromonas. Edited by B. Austin, M. Alwegg, P.J. Gosling and S. Joseph. John Wiley & Sons Ltd.

Austin, B.; Austin, D. A. (2007). Bacterial fish pathogens: diseases of

farmed and wild fish. 4th ed. Chichester: Springer, 2007. 552 p

Bachrach, G., Zlotkin, A., Hurvitz, A., Evans, D.L. and Eldar, A. (2001). Recovery of Streptococcus iniae from diseased fish previously vaccinated with a streptococcus vaccine. Applied Environmental Microbiology 67: 3756- 3758

Bader, J.A., Shoemaker, C.A., Klesius, P.H. (2003) Rapid detection of columnaris disease in channel catfish (Ictalurus punctatus) with a new species-specific 16S rRNA gene-based PCR primer for Flavobacterium columnare. Journal of Microbiological Methods 52:209–220

Barrow, G.I. and R.K.A. Feltham. (1993). Covan and Steel's manual for the identification of medical bacteria, 3nd edn. Cambridge University Press, Cambridge.

Benli, C. K. A and H. Y. Yildiz. (2004). Blood parameters in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) spontaneuosly infect with Edwardsiella tarda. Aquaculture Research. 35: 1388-1390.

Bercovier, H., Ghittino, C., and Eldar, A. (1997). Immunization with bacterial antigens: infections with streptococci and related organisms. In: Gudding, R., Lillehaug, A., Midtlyng, P.J., Brown, F. (Eds.), Fish Vaccinology. Karger, Basel, Switzeland, pp. 153– 160

Bin, P., Guang-you, Y., Xiao-li, C., Ai-si2, Z. and Ming-li, H. E. (2010). Isolation and identification on pathogenic bacteria of hemorrhagic septicemia disease in rice field eels (Monopterus albus). Freshwater Fisheries. 2011-03

Bondad-Reantaso, M.G., R.P. Subasinghe, J.R. Arthur, K. Ogawa, Chinabut. S, R. Adlard, Z. Tan, M. Shariff. (2005). Disease and health management in Asian Aquaculture. Veterinary Parasitol. 132: 249-272.

Bosshard, P.P., Abels, S., Zbinden. R., Böttger, E.C. and Altwegg, M. (2003). Ribosomal DNA sequensing for identification of Aerobic Gram- Positive rods in the clinical laboratory (an 18-month evaluation). Journal of Clinical Microbiology, september. 2003. Vol. 41, No. 9, p. 4134-4140.

Bowser, P.R., Falls, W.W. and Maestrone, G. (1987). Potentiated sulfonamide therapy of Aeromonas hydrophila infection in channel catfish. Progressive Fish-Culturist 49, 188-191.

Brenden SA. and H.W. Huizinga.

(1986). Pathophysiology of experimental Aeromonas hydrophila infection in goldfish, Carassius auratus. Journal of Fish Diseases 9:163-167.

89

Bromage, E.S., Thomas, A., and Owens, L.. (1999). Streptococcus iniae a bacterial infection in barramundi Lates calcarifer. Disease of Aquatic Organisms. 36, 177– 181

Buller, N. B. (2004). Bacteria from fish and other aquatic animal: a

practice indentification manual, 361pp.

Cees S, Nukul R, Michel H, Sumalika P, Somporn P, Itsara I, Witool C, Pun Y, Phusit H, Samart D. (1995) The five sympatric mudskippers (Teleostei: Gobioidea) of Patta Cees S, Nukul R, Michel H, Sumalika P, Somporn P, Itsara I, Witool C, Pun Y, Phusit H, Samart D. (1995) The five sympatric mudskippers (Teleostei: Gobioidea) of Patta.

Chinabut, S., C. Limsuwan and P. Kitsawat. (1991). Histology of the

walking catfish, Clarias batrachus. 96pp.

Chowdhury, Md.B.R, (1998). Bacteria in fish disease in Bangladesh. Department of aquaculture, Facculy of Fisheries. Bangladesh Agriculture University, Mymensingh, 2002, Bangladesh. 247 pp.

Cipriano, R. C., G. L. Bullock and S. W. Pyle. (2001). Aeromonas hydrophila and motile Aeromonad septicemias of fish. Revision of Fish Disease Leaflet 68 (1984).

Clinical and Laboratory Standards

Institute

(CLSI).

(2011). Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement, M100-S21 (ISBN 1-56238-742-1). Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087 USA.

Colorni, A., Diamant, A., Eldar, A., Kvitt, H., and Zlotkin, A., (2002). Streptococcus iniae infections in red seacage-cultured and wild fishes. Disease of Aquatic Organisms. 49, 165– 170

Colorni, A., Ravelo, C., Romalde, J.L., Toranzo, A.E., and Diamant, A. (2003). Lactococcus garvieae in wild red sea wrasse Coris aygula (Labriidae). Disease of Aquatic Organisms. 56, 275– 278.

Creeper, H.J and N. B. Buller. (2006). An outbreak of Streptococcus iniae in barramundi (Lates calcarifera) in freshwater cage culture. Australian Veterinary Jounal. 84: 408-411

Darwish, A.M., and Griffin, B.R. (2002). Study shows oxyetracycline

controls Streptococcus in tilapia. Global Aquaculture Advocate, 5, 34-35.

Del Cero A, Marquez I, Guijarro JA. (2002). Simultaneous detection of Aeromonas salmonicida, Flavobacterium psychrophilum and Yersinia ruckeri, 3 major fish pathogens by multiplex PCR. Appllied and Environmental Microbiology 68:5177–5180

Delamare-Deboutteville J, Wood D, and Barnes AC. (2006). Response and function of cutaneous mucosal and serum antibodies in barramundi (Lates

90

in seawater and freshwater. Fish & Shellfish

calcarifer) acclimated Immunology. Volume 21, Issue 1, July 2006; 21(1): 92-101.

Dijkstra A., Van Ingen J., Lubbert P.H.W., Haenen O.L.M and Möller A.V.M. (2009). Fasciitis necroticans ten gevolge van een Vibrio vulnificus infective in een palingkwekerij [in Dutch]. Nederlands Tijdschrift voor Geneeskunde, 153 (2009), 408-411.

Dinh T. D, Ambak M. A., Hassan A. and Phuong N. T. (2007). Biology and population dynamis of the goby Pseudapocryptes elongatus in the coastal mud flat areas of the Mekong Delta, Vietnam. Pakistan Journal of Biologycal Sciences, 10 (19): 3284-3294.

Dixon, B.A. and Issvoran, G. (1993). Antibacterial drug resistance in Aeromonas spp. isolated from domestic goldfish and koi from California. Journal of the World Aquaculture Society 24, 102-104.

Dixon, B.A., Yamashita, J. and Evelyn, F. (1990). Antibiotic resistance of Aeromonas spp. isolated from tropical fish imported from Singapore. Journal of Aquatic Animal Health 2, 295-297.

Duremdez, R., Al-Marzouk, A., Qasem, J.A., Al-Harbi, A. and Gharabally, H. (2004). Isolation of Streptococcus agalactiae from cultured silver pomfet, Pampus argenteus (Euphrasen) in Kuwait. Journal of Fish Diseases 27, 307–310.

Eldar A, Bejerano Y and Bercovier H (1994). Streptococcus shiloi and causing

streptococcal

difficile:

species

new

two

Streptococcus meningoencephalitis in fish. Current Microbiology, 28: 139-143.

Eldar A, Frelier PF, Assenta L, Varner PW, Lawhon S and Bercovier H (1995). Streptococcus shiloi, the name for an agent causing septicemic infection in fish, is a junior synonym of Streptococcus iniae. International Journal of Systematic Bacteriology, 45: 840-842

Eldar, A. and Ghittino, C. (1999). Lactococcus garvieae and Streptococcus iniae infections in rainbow trout Oncorhynchus mykiss: similar, but different diseases. Disease of Aquatic Organisms. 36, 227– 231

Eldar, A., Horovit CZ, A. and Bercovier, H., (1997). Development and efficacy of a vắc-xin against Streeptococcus iniae infection in farmed rainbow trout. Veterinary Immunology and Immunopathology 56: 175-183.

Elina Reinoso, Susana Bettera, Liliana Odierno and Cristina Bogni. (2007). REP-PCR of Staphylococcus aureus strains isolated from bovina mastitis in Argentina. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v.44, suplemento, p. 115-121.

Ellis, A. E. (1988). General principles of fish vaccination. In Fish

vaccination. A.E. Ellis, editor. Academic Press. San Diego, p. 1-19.

Ellis, A.E (1985). Fish and Shellfish Pathology. Academic press. Lon

don.

91

Esteve, C., Amaro, C., Garay, E., Santos, Y. and Toranzo, A.E. (1995). Pathogenicity of live bacteria and extracellular products of motile Aeromonas isolated from eels. Journal of Applied Bacteriology 78, 555–562.

Evan, J.J., Shoemaker, C.A and Klesius P.H. (2000). Experimental Streptococcus iniae infection of hybir striped bass (Morone chrysops x Morone saxatilis) and tilapia (Oreochromis niloticus) by nares inoculation. Aquaculture, v. 189, p.197-210.

Evans, D.H, Claiborne,

and Kormanik, G.A.

(1999). J.B. Osmoregulation, Acid-Base Regulation and Nitrogen Excretion. In: Life in Two Worlds: Ecology, Behavior and Physiology of Intertidal Fishes, ed. Horn, M.H., Martin, K.L.M., and Chotkowski, M.A., Academic Press, pp. 79-96.

Fang, H.M., Ge, R. and Sin, Y.M. (2004). Cloning, characterisation and expression of Aeromonas hydrophila major adhesin. Fish & Shellfish Immunology 16, 645-658.

Francis Pius Mmanda, Suming Zhou, Jiting Zhang, Xiaoye Zheng, Shuwei An and Guoliang Wang. (2014). Massive mortality associated with Streptococcus iniae infection in cage-cultured red drum (Sciaenops ocellatus) in Eastern China. African Journal of Microbiology Research. Vol. 8(16), pp. 1722-1729, 16 April 2014.

Galit Sharon and Dina Zilberg. (2012). Atlas of Fish Histology and Histopathology. Funded by JCA Charitable Foundation, Ramat Negev and Central and Northen Arava Research and Development Centers.

Geert Huy. (2002). Antibiotic susceptibility testing of aquaculture associated bacteria with the broth macrodilution method (MIC Determination), Laboratory of Microbiology, K.L.Ledeganckstr. 35 B-9000 Gent (BELGIUM)

Grizzle, J.M. and W.A. Rogers. (1976). Anatomy and histology of the ch annel catfis.Department of Fisheries and Allied Aquacuture, Auburn Universit y. 94p.

Herrera, A.A.

(1996). Histology of tilapia Oreochromis niloticus. Published by Bureau of Fisheries and Aquatic Resources, Department of Agriculture.

Hibiya, T. (1982). An atlas of Fish Histology - Normal and Pathological Features. College of Agriculture and Veterinary Medicine, Nihon Univ. Tokyo, Japan, 147pp.

Hong, W.S., Q. Zhang and Shixi Chen. (2007). Farming and fry production of mudskipper Boleophthalmus pectinirostris in China. Book of abstract. Asian Pacific Aquaculture, 2007.

Hong, W.S. and Q. Zhang. (2003). Induced nest spawning and artificial hatching of the fertilized eggs of mudskipper, Boleophthalmus pectinirostris. Journal of Oceanology and Limnology 22:408-413.

92

Hoshina, T., Sano, T. and Morimoto, Y. (1958). A Streptococcus

pathogenic to fish. Journal of Tokyo University Fisheries 44, 57–58.

Houston, H.A. (1990). Blood and circulation. In: C.B. Schreek and P.B. Moley. Method for biology. American Fish society Bethesda, Maryland, USA. 665: 273-322.

Hugenholtz, P., Goebel, B. M. and Pace, N. R. (1998). Impact of culture- independent studies on the emerging phylogenetic view of bacterial diversity. Journal of Bacteriology, 180, 4765–4774; erratum, 6793.

Huys, G., Coopman, R., Janssen, P. and Kersters, K. (1996). Highresolution genotypic analysis of the genus Aeromonas by AFLP finger printing. International Journal of Systematic Bacteriology 46, 572–580.

Ilhan Z., Gulhan T. and Aksakal A. (2006). Aeromonas hydrophila

associated with ovine abortion. Small Ruminant Research 61, 73-78.

Inglis, V., R. J. Roberts and N. R. Bromage. (1993). Bacterial diseases of

fish. Institute of aquaculture, Univesity Press, Cambridge. 312 pp.

Inglis V., Ronald J. Roberts and Niall R. Bromage. (1994). Bacterial

diseases of fish. pp 272-277.

Janda, J.M and Abbott, S.L. (2007). 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, Peril and Pitfalls. Journal of Clinical Microbiology, Sept. 2007, Vol 45, No 9, p. 2761-2764.

Janda, J.M., S.L. Abbott, S. Kroske-bystrom, W.K.W. Cheung, C. Powers R.P. Kokka and K. Tamura. (1991). Pathogenic properties of Edwarsiella species. Journal of Clinical Microbiology 29:1997-2001.

Jeney, G., D.T.H Oanh, T.T. Dung, Z. Jeney, and N.A. Tuan. (1998). Asocio-economic survey: Fish health management in the Mekong Delta. Aquaculture Asia. 2: 35-40.

Jiménez, A., Tibatá, V., Junca, H., Ariza, F., Verjan, N. and Iregui, C. (2011). Evaluating nested-PCR assay for detecting Streptococcus agalactiae in red tilapia (Oreochromis sp.) tissue. Aquaculture 321, 203–206.

Jiraungkoorskul, W., S. Sahaphong, N. Kangwanrangsan and M.H. Kim. (2006). Histopathological study: The effect of ascorbic acid on cadmium exposure in fish (Puntius altus). Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 1: 191-199.

John, S.J.B. and M.P. Patricia. (2007). Adipose Tissue. In: Mills, Stacey E (Editors). Histology for Pathologists, 3rd Edition. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, C2007. United States. Page 13.

Kaper JB, Lockman H, Colwell RR and Joseph SW. (1981). Aeromonas hydrophila ecology and cytocity of isolation from an estuary. J. Appl. Bacteriol. 50: 359-377

Khardori, N. and Fainstein, V. (1988). Aeromonas and Plesiomonas as

etiological agents. Annual Review of Microbiology 42, 395–419.

93

Kitao T. and Aoki T.. (1979). Therapeutic studies of doxycycline of streptococcus of culture yellowtail Seriola sp.. Distribution in seawater and muds around yellowtail farms. Bulletin of the Japanese Society for Scientific Fisheries 45:567-572.

Kitao. (1993). Streptococcus infections. Bacterial Disease of Fish.

Chapter 12: 196-210.

Lee, K. K. (1995). Pathogenesis studies on Vibrio alginolyticus in the grouper, Epinephelus malabaricus, Bloch Schneider. Microbial Pathogenesis 19, 39–48.

Lehane, L. and Rawlin, G.T. (2000). Topically acquired bacterial zoonoses from fish: a review. The Medical Journal of Australia, 173 (5), 256- 259.

Loan T. T. L., D. N. Nguyen, P. H. Vo and C. V. Doan. (2009). Hemorrhage Disease of Cultured Tra Catfish (Pangasianodon hypophthalmus) in Mekong Delta (Vietnam). The Israeli Journal of Aquaculture - Bamidgeh 61(3).

Lom, J. (1970). Protozoa causing diseases in marine fishes. In S. F. snieszko (Ed), A Symposium on Diseases of Fishes and Shellfishes. Journal of the American Fisheries Society, Special Publication 5, 101-123.

Lo´pez-Romalde, S., Magarin˜os, B., Ravelo, C., Toranzo, A.E. and Romalde, J.L. (2009). Existence of two O-serotypes in the emerging fish pathogen Pseudomonas anguilliseptica. Veterinary. Microbiology. 94, 325– 333.

Ly, T.T.L., D.N. Nguyen, P.H. Vo and Cuong, V.D. (2009). Hemorrhage Disease of Cultured Tra Catfish (Pangasianodon hypophthalmus) in Mekong Delta (Vietnam). The Israeli Journal of Aquaculture - Bamidgeh 61(3).

Manjaiang P, Areechon N, Srisapoome P and Mahasawas S. (2007). Application of vaccine to prevent disease caused by Streptococcus agalactiae in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Proceedings of the 45th Kasetsart University Annual Conference 2007; 174-82.

Martin, K. L. M., and C. R. Bridges. (1999). Respiration in water and air. In M. H. Horn, K. L. M. Martin, and M. A. Chotkowski (editors), Intertidal Fishes: Life in Two Worlds. Academic Press, San Diego. p. 54-78

Martins, ML., Mouriño, JLP., Amaral, GV., Vieira, FN., Dotta, G., Jatobá, AMB., Pedrotti, FS., Jerônimo, GT., Buglione-Neto, CC. and Pereira- Jr, G.. (2008). Haematological changes in Nile tilapia experimentally infected with Enterococcus sp. Brazilian Journal of Biology., 68(3): 657-661, 2008.

Milton Fingerman and Rachakonda Nagabhushanam. (2000). Marine

biotechnology.

94

Mitchell A.J. and Plumb J.A. (1980). Toxicity and efficacy of Furanace on channel catfish Ictalurus punctatus (Rafinesque) infected experimentally with Aeromonas hydrophila. Journal of Fish Diseases 3, 93-99.

Mostafa A. El-Feki, Hanaa E. Fahim, Mamoon M. Gad and Fatehy A. Abdel-Ghaffar. (2000). Changes in the Haematological parameters Carp Cyprinus carpio L., induced by Laminarin and Nigella sativa oil during the motile Aeromonas septicemia disease. Egyptian Journal of Aquatic Biology and Fisheries, Vol 4, No.2: 43-93 (2000).

Murdy, E.O. (1989). A taxonomic revision and cladistic analysis of the Oxudercine Gobies (Gobiidae: Oxudercinae). Records of the Australian Museum (1989) Supplement, 11:1-93.

Nakamura, Y. (1982). Doxycycline. Fish Pathology, 17, 67-76.

Nakai, T., Muroga, K. and Wakabayashi, H. (1985). First record of Pseudomonas anguilliseptica infection in cultured ayu, Pleco glossus altivelis. Fish Pathology. 20, 481– 484.

Natt, M.P. and C.A. Herrick. (1952). A new blood diluent for counting

the erythrocytes and leucocytes of the chicken. Poultry Science 31,735-738.

picture

in

Nehal Mohamed Fawzy, Kamelia Mahmoud Osman, Mai El-Desoky El- Sayed Ibrahim, Mohamed Naguib, Mohamed Ali and SaharS. Abd-Elrahman. (2014). Streptococcosis of tilapia: Clinic-pathological experimentally infected tilpia. Life Science Journal 2014; 11(9).

Nielsen, M. E., L. Hui, A. S. Schmidt, D. Qian, T. Shimada, J. Y. Shen and J. L. Larsen. (2001). Is Aeromonas hydrophila the dominant motile Aeromonas species that causes disease outbreaks in aquaculture production in the Zhejiang Province of China. Diseases of aquatic oraganism. Vol.46: 23-29.

Nishiki, I.; Masahiro, N.; Itami, T. et al. (2010). Homogeneity of Streptococcus dysgalactiae from farmed amberjack Seriola dumerili in Japan. Fisheries Science., volume 76, p.661–8, 2010.

Noga, E.J. (1999). Fish Disease: Diagnosis and Treatment.

Nomoto R, Munasinghe LI, Jin DH, Shimahara Y, Yasuda H, Nakamura A, Misawa N, Itami T and Yoshida T. (2004). Lancefield group C Streptococcus dysgalactiae infection responsible for fish mortalities in Japan. Journal of Fish Diseases, 27: 679-686.

its application

Nomoto, H. Kagawa and T. Yoshida. (2008). Partial sequencing identification of Streptococcus to isolated from farmed fish. Applied

of sodA gene and dysgalactiae subsp. dysgalactiae Microbiology, 1: 95-100.

Nunan L.M., Poulos B., Redman R., Le Groumellec M. and Lightner D.V. (2003). Molecular detection methods developed for a systemic rickettsia-like bacterium (RLB) in Penaeus monodon (Decapoda: Crustacea). Disease of Aquatic Organisms, 53:15–23

95

OIE (2006). Manual of Diagnostic Test of Aquatic Animals.

Panangala, V.S., Craig, A.S., Vicky, L.V.S., Kevin, D. and Phillip, H.K. (2007). Multiplex-PCR for simultaneous detection of 3 bacterial fish pathogens, Flavobacterium columnare, Edwardsiella ictaluri, and Aeromonas hydrophila. Diseases of Aquatic Organisms 74: 199–208

Panicker, G., Vickery, M.C.L. and Bej, A.K. (2004). Multiplex PCR detection of clinical and environmental strains of Vibrio vulnificus in shellfish. Canadian Journal of Microbiology 50:911–922.

Pathiratne, A. and W. Rajapakshe. (1998). Hematological changes associated with Epizootic Ulcerative Syndrome in Asian cichlid fish, Etroplus suratensis. Asian Fisheries Science 11:203-211.

Payne, S.M. and R.A. Finkelstein. (1977). Detection and differentiation of ironresponsive avirulent mutants on congo red agar. Infection and Immunity 18:94-98.

Perera R.P., Johnson S.K and Lewis D.H. (1997). Epizootiological aspects of Streptococcus iniae affecting tilapia in Texas. Aquaculture 152. 25- 33.

Perera RP, Johnson SK, Collins MD and Lewis DH (1995). Streptococcus iniae associated with mortality of Tilapia nilotica x T. aurea hybrids. Journal of Aquatic Animal Health, 6: 335-340

Perera, R.P., Johnson, S.K., Collins, M.D., Lewis, D.H. (1994). Streptococcus iniae associated with mortality of Tilapia nilotica aurea hybrids. J. Aquat. Anim. Health 6, 335–340.

Philip Hugenholtz. (2002). Exploring prokaryotic diversity in the genomicera. Genome Biology 2002. © BioMed Central Ltd (Print ISSN 1465- 6906; Online ISSN 1465-6914).

Phuong, D.N. (2007). Non-specific immune responses towards ascorbic acid supplementation in hybrid catfish (Clarias macrocephalus x C. garieinus) feed. Master Thesis, University Malaysia Terengganu, Malaysia.

Pillay, T.V.R (1990). Aquaculture, principles and practices.

Polgar G. and Lim R. (2011) Mudskippers: human use, ecotoxicology and biomonitoring of mangrove and other soft bottom intertidal ecosystems. pp. 51-86. In: Metras J.N. (ed) Mangroves: Ecology, Biology and Taxonomy. Nova Science Publishers, Hauppauge. ISBN: 978-1-61728-991-0.

Portis E, Lindeman C and Johansen L. (2013). Antimicrobial susceptibility of porcine Pasteurella multocida, Streptococcus suis, and Actinobacillus pleuropneumoniae from the United States and Canada, 2001 to 2010. Jouranl of Swine Health and Production. 2013; 21(1):30-41.

Prpic, J.K., R.M. Robins-Browne and R.B. Davey. (1983). Differentation between virulent and avirulent Yersinia enterocolitica isolates by using congo red agar. Journal of Clinical Microbiology 18:486-490.

96

Qadri, F., S.A. Hossain, I. Ciznaz, K. Haider, A. Ljungh, T. Wadstrom and D. A. Sack. (1988). Congo red binding and salt aggregation as indicators of virulence in Shigella species. Journal of Clinical Microbiology 26:1343- 1348.

Qi ZT, JY Tian, QH Zhang, R Shao, M Qiu, ZS Wang, QJ Wei and JT Huang. (2013). Susceptibility of Soiny Mullet (Liza Haematocheila) to Streptococcus dysgalactiae and Physiological response to fomalin inactivated S.dysgalactiae. The Pakistan Veterinary Journal, 33(2): 234-237.

Rainboth W.J. (1996). Fishes of The Cambodian Mekong, FAO species

identification field guide for fishery purposes, FAO, Rome, page 265.

Ravelo, C., Magariños, B., Toranzo, A.E. and Romalde, J.L. (2001). Conventional versus miniaturized systems for the phenotypiccharacterization of Lactococcus garvieae. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists. 21, 136–144

Rehulka J. (1998). Blood indices of the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum) in Aeromonas-induced ulcerous dermatitis. Journal of the University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences in Brno, Czech 67:317- 322.

Robert R. Sttickney (2000). Encyclopedia of Aquaculture.

Robert, R.J. (1989). Fish Pathology. Instituteof Aquaculture, University

of Striling, Bailliere Tindall, London. 2nd edition

Robinson, J.A. and Meyer, F.P. (1966). Streptococcal fish pathogen.

Journal of Bacterriology, 92-512.

Romalde JL, Magarinos B, Villar C, Barja JL and Toranzo A.E. (1999c). Genetic analysis of turbot pathogenic Streptococcus parauberis strains by ribotyping and random amplified polymorphic DNA. FEMS Microbiol Lett, 179: 297-304

Romalde, J.L., Magariños, B. and Toranzo, A.E. (1999b). Prevention of streptococcosis in turbot by intraperitoneal vaccination: a review. Journal of Applied Ichthyology. 15, 153–158.

Romalde, J.L., Ravelo, C., Lo´pez-Romalde, S., Avendan˜o-Herrera, R., Magariños, B. and Toranzo, A.E. (2005). Vaccination strategies to prevent important emerging diseases for Spanish aquaculture. In: Midtlyng, P.J. (Ed.), Fish vaccinology. Karger, Switzerland, pp. 85– 95.

Romalde, J.L. and Toranzo, A.E. (1999a). Streptococcosis of marine fish. In: Olivier, G. (Ed.), ICES Identification Leaflets for Diseases and Parasites of Fish and Shellfish. No. 56. International Council for the Exploration of the Sea. Copenhagen, Denmark, pp. 1 –8.

Rowley, A.F. (1990). Collection, separation and identification of fish leucocytes. In: Techniques in Fish Immunology. 2nd Eds.: J.S. Stolen,

97

T.C.Fletcher, D.P. Anderson, B.S. Roberson, W.B. Van Muiswinkel, SOS Publication, 113-136.

Salvador, R., Muller, E. E., De Freitas, J.C., Leonhad, J.H., Pretto- Giurdano, L.G. and Dias, J.A. (2005). Isolation and characterization of Streptococcus spp. Group B in Nile tilapias (Oreochromis niloticus) reared in hapas nets and earth nurseries in the northern region of Parana State, Brazil. Ciencia Rural, Santa Maria, 35 (6): 1374-1378.

Seham Ahmed Ibrahim. (2013). Hematological and histopathological studies on tilapia fish (Oreochromis niloticus) living in the water of Rosetta branch, River Nile, Egypt. Global Veterinaria 11 (5): 485-496, 2013.

Sindermann, C. J. (1970). Disease and parasite problems in marine aquaculture. In W. J. McNeil (Ed.), Marine Aquaculture. Oregon State University Press, Oregon, pp. 103-134.

Sonia Mumford, Jerry Heidel, Charlie Smith, John Morrison, Beth MacConnell and Vicki Blazer. (2007). Fish Histology and Histopathology. U.S. Fish & Wildlife Service.

Statner, B. and W.L. George. (1987). Congo red uptake by motile

Aeromonas species. Journal of Clinical Microbiology. 876-878.

Steve F. Perry and Pierre Laurent. (1993). Environmental effects on fish gill structure and function. Fish Ecophysiology. Chapman & Hall Fish and Fisheries series. Volume 9, 1993, pp 231-264.

Stewart, D.J., Woldemariam, K., Dear, G. and Mochaba, F.M. (1983). An outbreak of bsekiten-byoQ among cultured European eels, Anguilla anguilla L., in Scotland. J. Fish Dis. 6, 75–76.

Suanyuk, N. and Itsaro, A. (2011). Efficacy of inactivated Streptococcus iniae vaccine and protective effect of β-(1,3/1,6) - glucan on the effectiveness of Streptococcus iniae vaccine in red tilapia Oreochromis niloticus x O. Journal of Science and Technology. Mossambicus. Songklanakarin Songklanakarin Journal of Science and Technology. 33, 143-149.

Sugita, H., Nakamura, T., Tanaka, K. and Deguchi, Y. (1994). Identification of Aeromonas species isolated from freshwater fish with the microplate hybridization method. Applied and Environmental Microbiology 60, 3036–3038.

Supranee Chinabut, Chalor Limsuwan and Praveena Kitsawat. (1991). the walking catfish, Clarias Batrachus. Enternational

Histology of development research centre Canada.

Suzuki, Y. and T. Iida. (1992). Fish granulocytes in the process of

inflammation. Annual Review of Fish Diseases. 149-160.

Takashi Aoki, Sunao Takeshita and Tadatoshi Kitao.

(1983). Antibacterial action of chemotherapeutic agents against non-hemolytic Streptococcus sp. isolated from culture marine fish, yellowtail Seriola

98

quinqueradiata. Bullentin of Japanese Society of Scientific Fisheries. 49 (11), 1673-1677 (1983).

Takeshi Takegaki.

fishes of

the world: (2008). Threatened Boleophthlmus pectinirostris (Linnaeus, 1758). Environmental Biology of Fishes, 81 (4), 373 - 374

Toida, S., K. Kanai and K. Yoshikoshi (2003). The kenetics of leukocytes and histopathology of red sea bream in artificial infection of Edwardsiella tarda. Fish Pathologists 38:137-142.

Toranzo, A.E. (2004). Development and validation of a PCR-based protocol for the detection of Pseudomonas anguilliseptica. Fish Pathologists. 39, 33– 41.

Toranzo, A.E. and Barja, J.L. (1990). A review of the taxonomy and seroepizootiology of Vibrio anguillarum, with special reference to aquaculture in the northwest of The Spain Diseases of Aquatic Oraganism 9, 73– 82.

Toranzo, A.E. and Barja, J.L. (1993). Virulence factors of bacteria

pathogenic for cold water fish. Annual Review of Fish Disease. 3, 5– 36.

Toranzo AE., Santos Y., Núñez S. and Braja JL. (1991). Biochemical and serological characteristics, drug resistance, and plasmid profiles of Spanish isolates of Aeromonas salmonicida. Fish Pathologists. 26, 55-60.

Toranzo AE, Devesa S, Heinen P, A., R, Núñez S and Barja JL (1994). Stretococcosis in cultured turbot caused by an Enterococcus-like bacterium. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists, 14: 19-23

Toranzo, A.E., Beatriz Magarinos and Jesús L. Romalde. (2005). A review of the main bacterial fish diseases in mariculture systems. Aquaculture 246 (2005) 37-61.

Toranzo, A.E., Devesa, S., Romalde, J.L., Lamas, J., Riaza, A., Leiro, J. and Barja, J.L. (1995) Efficacy of intraperitoneal vaccination and immersion vaccination against Enterococcus sp. infections in turbot. Aquaculture 134, 17–27.

Torres, J.L., Tajima, K. and Shariff, M. (1993). Numerical taxonomy and virulence screening of Aeromonas spp. isolated from healthy and epizootic ulcerative syndrome-positive fishes. Asian Fisheries Sciences 6, 11–16.

Trần Vĩ Hích và Nguyễn Hữu Dũng. (2011). Experimental Streptococcus iniae infection in barramundi (Lates calcarifer). Book of abstracts symposium on diseases in Asia Aquaculture 8 (96).

Truong Hoang Minh. (2009). Life history, fisheries and aquaculture of Mudskipper (Pseudapocryptes elongatus, Cuvier 1816) in the coastal zone of the Meking delta, VietNam.

Vantarakis A, Komininou G, Venieri D and Papapetropoulou M. (2000). Development of a multiplex PCR for detection of Salmonella spp., and Shigella spp. in mussels. Letter of Appllied Microbiology 31:105–109

99

Vivekanandhan G., Hatha A.A.M. and Lakshmanaperumalsamy P. (2005) Prevalence of Aeromonas hydrophila in fish and prawns from the seafood market of Coimbatore, South India. Food Microbiology 22, 133-137.

Wakabayashi, H. and Egusa, S.

(1972). Characteristics of a Pseudomonas sp. from an epizootic of pond-cultured eels (Anguilla japonica). Bulletin of the Japanese Society for Scientific Fisheries. 38, 577–587.

Waltman, W. D., E. B. Shotts and T. C. Hsu. (1986). Biochemical ictaluri. Applied and Enviromental

characteristics of Edwardsiella Microbiology 51(1): 101 – 104

Weinstein M, Low D and McGeer A (1996). Invasive infection due to Streptococcus iniae: a new or previously unrecognised disease - Ontario1995- 1996. In: Invasive infection due to Streptococcus iniae: a new or previously unrecognised disease - Ontario1995-1996. Publisher, 129-132.

Wiklund, T. and Bylund, G. (1990). Pseudomonas anguilliseptica as a pathogen of salmonid fish in Finland. Disease of Aquatic Organisms. 8, 13– 19.

Wuming Yang and Aihua Li. (2009). Isolation and characterization of Streptococcus dysgalactiae from diseased Acipencer schrenckii. Aquaculture 294 (2009) 14-17.

Yang, K.Y., Lee, S.Y. and Williams, G.A. (2003). Selective feeding by the mudskipper (Boleophthalmus pectinirostris) on the microalgal assemblage of a tropical mudfat. Marine Biology 143:245-256

Yanong RPE and Francis-Floyd R (2002). Streptococcal infections of

fish. Report from University of Florida.

Yii, K.C., Yang, T.I. and Lee, K.K. (1997). Isolation and characterization of Vibrio carchariae, a causative agent of gastroenteritis in the groupers, Epinephelus coioides. Current Microbiology 35, 109–115.

Zinniel, D. K., P. Lambrecht, N. B. Harris, Z. Feng, D. Kuezmarski, P. Highley, C. Ishimaru, A. Arunakumari, G. R. Barletta and A. K. Vidaver. (2002). Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and prairie plants. Applied and Environmental Microbiology. 59, 2198-2208.

2. Tài liệu tiếng Việt

Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2014. Thông tư Ban hành Danh mục thuốc và hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng, hạn chế sử dụng. Văn bản hợp nhất Số 08/VBHN-BNNPTNT ngày 25 tháng 02 năm 2014.

Bùi Kim Tùng, Bùi Kim Hoàng và Bùi Kim Tân. (2001). Thuốc kháng sinh. Sở Khoa học Công nghệ và Môi trường tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu. 255 trang.

Bùi Quang Tề (2006). Bệnh học Thủy sản.

Bùi Quang Tề và Vũ Thị Tám. (2000). Những bệnh thường gặp ở tôm cá

và biện pháp phòng trị. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh. 100

Bùi Quang Tề, Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội

(2004). Bệnh học thủy sản. Nhà xuất bản Nông nghiệp – Tp. Hồ Chí Minh.

Bùi Thị Mỹ Duyên, Lê Xuân Sinh và Trương Hoàng Minh. (2010). Phân tích chuỗi giá trị cá bống kèo (Pseudapocrytes elongatus) ở tỉnh Sóc Trăng và Bạc Liêu. Tạp chí khoa học 2010, 13: 401 – 412.

Bùi Thị Tho. (2003). Thuốc kháng sinh và nguyên tắc sử dụng trong

chăn nuôi. Nhà xuất bản Hà Nội, 323 trang

Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Thanh Phương, Temdoung Somsiri, Supranee Chinabut, Fatinah Yussoff, Mohamed Shariff, Kerry Bartie, Geert Huys, Mauro Giacomini, Stefania Berton, Jean Swings và Alan Teale. (2005). Xác định tính kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ các hộ nuôi thủy sản ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, Việt Nam. Tạp chí Nghiên Cứu Khoa Học - Đại học Cần Thơ. 4: 2005, 136-144.

Đặng Thị Hoàng Oanh (2011). Nguyên lý và kỹ thuật chuẩn đoán bệnh

thủy sản. Nhà xuất bản Nông nghiệp – Tp. Hồ Chí Minh.

Đặng Thị Hoàng Oanh và Đặng Thụy Mai Thy. (2009). Nghiên cứu ứng dụng qui trình PCR chuẩn đoán vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên thận cá tra (Pangasianodon hypopthalmus). Báo cáo hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc. Công nghệ sinh học phục vụ Nông – Lâm nghiệp, Thủy sản, Công nghiệp, Y-dược và bảo vệ môi trường. Thái Nguyên, ngày 26-27 tháng 11, 2009. Mã số 04-09/ĐHTN – 2009. 289-292.

Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Đức Hiền. (2012). Phân lập và xác định khả năng gây bệnh xuất huyết trên lươn đồng (Monopterus albus) của vi khuẩn A. hydrophila. Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ, 2012:22c 173-182

Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương, Nguyễn Thị Thu Hằng và Nguyễn Thanh Phương. (2006). Xác định vị trí phân loại và khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon). Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ 4/2006: 42-52. 300 trang.

Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, (2012). Phân lập và xác định đặc điểm của vi khuẩn Streptococcus agalactiae từ cá điêu hồng (Oreochromis sp.) bệnh phù mắt và xuất huyết. Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ 2012: 22c 203-212.

Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Thị Thu Hằng và Nguyễn Thanh Phương. (2006). Sưu tập và phân lập vi khuẩn từ mẫu thủy sản nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ 4/2006 (2): 53-61. 300 trang.

Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Trúc Phương (2010). Phát hiện vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bằng phương pháp PCR. Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ, 13: 151-159.

101

Đặng Thụy Mai Thy và Đặng Thị Hoàng Oanh (2011). Đặc điểm mô bệnh học ở cá điêu hồng (Oreochromis sp) nhiễm vi khuẩn Streptococcus agalactiae trong điều kiện thực nghiệm.Kỷ yếu Hội nghị Khoa học thủy sản lần 4 trường Đại học Cần Thơ năm 2011, 289-301.

Đặng Thụy Mai Thy, Trần Thị Thủy Cúc, Nguyễn Châu Phương Lam, Nguyễn Đức Hiền và Đặng Thị Hoàng Oanh. (2012). Đặc điểm mô bệnh học cá rô (Anabas testudineus) nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila và Streptococcus sp. trong điều kiện thực nghiệm. Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ, 2012: 22c 183-193.

Đặng Thụy Mai Thy. (2010). Nghiên cứu đặc tính gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Luận văn thạc sĩ khoa học – Đại học Cần Thơ.

Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội. (2004). Giáo trình bệnh học thủy sản. Khoa nuôi trồng thủy sản - Đại học Thủy sản Nha trang. 346 trang.

Hà Ký và Bùi Quang Tề, 2007. Ký sinh trùng cá nước ngọt Việt Nam.

Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.

Hứa Thị Phượng Liên. (1998). Luận án Thạc sĩ Ngành Nuôi trồng thủy sản. Nghiên cứu bệnh xuất huyết trên vi, xoang miệng cá Basa (Pangasius bocourti) nuôi bè tại An Giang. Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ.

Nguyễn Chính. (2005). Đánh giá tình hình sử dụng thuốc, hóa chất trong nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh ở An Giang và Cần Thơ. Luận văn thạc sĩ khoa học. Khoa Thủy sản, Trường Đại Học Cần Thơ.

Nguyễn Hà Giang và Đặng Thị Hoàng Oanh. (2010). Phân lập và xác định khả năng gây bệnh trắng da trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) của vi khuẩn Flavobacterium columnare. Tạp chí khoa học 14:211-220. Đại học Cần Thơ.

Nguyễn Hà Giang, Trần Việt Tiên và Đặng Thị Hoàng Oanh. (2011). Ứng dụng qui trình PCR đa mồi phát hiện đồng thời ba loài vi khuẩn Edwardsiella, Aeromonas hydrophila và Flavobacterium columnare. Kỷ yếu Hội nghị Khoa học thủy sản lần 4, Trường Đại học Cần Thơ (2011): 241-249.

thận cá

tra

Nguyễn Hà Giang, Trương Quỳnh Như, Lê Hữu Thôi và Đặng Thị Hoàng Oanh. (2010). Nghiên cứu ứng dụng qui trình PCR chẩn đoán vi (Pangasianodon trên khuẩn Aeromonas hydrophila hypopthalmus) bệnh xuất huyết. Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ. 16a: 136- 142.

Nguyễn Khang. (2005). Kháng sinh học ứng dụng. Nhà xuất bản y học,

Hà Nội. Trang 1-116

Nguyễn Thanh Phương, Trần Thị Tuyết Hoa, Vũ Ngọc Út, Huỳnh Trường Giang, Cao Tuấn Anh, Nguyễn Thị Thu Hằng, Phạm Trần Nguyên Thảo, Đặng Thụy Mai Thy, Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Minh Hậu, Nguyễn Quốc Thịnh và Đoàn Nhật Phương. (2007). Báo cáo tổng kết đề tài 102

cấp tỉnh: Quan trắc môi trường và xác định tác nhân gây bệnh trên cá da trơn (cá tra-Pangasius hypophthalmus và basa - P. bocourti) và tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) ở tỉnh An Giang, 125 trang. Khoa thủy sản, Trường Đại Học Cần Thơ.

Nguyễn Thị Thúy An, Trần Ngọc Hải và Từ Thanh Dung. (2013). Phân lập vi khuẩn Vibrio trên cá bớp (Rachycentron canadum) bị lở loét. Tuyển tập Hội nghị Khoa học trẻ ngành Thủy sản toàn quốc lần thứ IV, 2013: 407-411.

Phạm Hồng Quân, Hồ Thu Thủy, Nguyễn Hữu Vũ, Huỳnh Thị Mỹ Lệ và Lê Văn Khoa. (2013). Một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Streptococcus spp. gây bệnh xuất huyết ở cá rô phi nuôi tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam. Tạp chí Khoa học và Phát triển Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội năm 2013, tập 11, số 4: 506-513.

Phạm Tân Tiến. (2010). Cơ sở sinh lý cá và những ứng dụng vào thực tế

sản xuất. Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam, 2010.

Phạm Thanh Hương, Nguyễn Thiện Nam, Từ Thanh Dung và Nguyễn Anh Tuấn. (2011). Sự kháng kháng sinh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra (Pangsianodon hypophthalmus) ở đồng bằng sông Cửu Long. Kỷ yếu hội nghị khoa học thủy sản lần IV, 2011. Trường Đại học Cần Thơ.

Phạm Thanh Liêm, Ambok Bolong Abol-Munafi, Mohd Azmi Ambak, Siti Shapor Siraj và Đoàn Nhật Phương. (2008). Khả năng kháng bệnh của cá trê lai (Clarias macrocephalus x C. gariepinus) thế hệ F1 và con lai sau F1 với vi khuẩn Aeromonas hydrophila. Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ, 2008 (1): 195-203.

Sở Nông nghiệp & PTNT Bạc Liêu. (2012). Báo cáo của Sở Nông nghiệp & PTNT Bạc Liêu Số 02/BC-SNN ngày 04 tháng 01 năm 2012 về Kết quả thực hiện kế hoạch năm 2011 và kế hoạch phát triển nông nghiệp, nông thôn năm 2012 tỉnh Bạc Liêu.

Sở Nông nghiệp & PTNT Bạc Liêu. (2013). Báo cáo của Sở Nông nghiệp & PTNT Bạc Liêu Số 22/BC-SNN ngày 25 tháng 01 năm 2013 về Kết quả thực hiện kế hoạch năm 2012 và kế hoạch phát triển nông nghiệp, nông thôn năm 2013.

Sở Nông nghiệp & PTNT Cà Mau. (2013). Báo cáo của Sở Nông nghiệp & PTNT Cà Mau Số 77/BC-SNN ngày 28 tháng 02 năm 2013 về Tổng kết thực hiện kế hoạch năm 2012 và triển khai phương hướng, nhiệm vụ năm 2013.

Trần Đắc Định, Hà Phước Hùng, Nguyễn Trọng Hồ và Nguyễn Văn Lành. (2002). Nghiên cứu đặc điểm sinh học của cá bống kèo Pseudapocryptes elongatus (Cuvier, 18160) phân bố ở vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long. Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học, Trường Đại Học Cần Thơ, 15 trang.

103

Trần Đắc Định, Võ Thành Toàn và Trần Thị Thanh Lý (2011). Tập tính di cư của cá bống kèo (Pseudapocryptes elongatus) phân bố ở khu vực ven biển ĐBSCL. Tạp chí Khoa học 2011:18a 56-64.

Trung tâm Khuyến nông – Khuyến ngư Bạc Liêu, 2013. Báo cáo của Trung tâm Khuyến nông – Khuyến ngư Số 103/BC-KNKN ngày 26 tháng 12 năm 2013 về Báo cáo các mô hình sản xuất có hiệu quả năm 2013 - Phương hướng, giải pháp nhân rộng các mô hình hiệu quả năm 2014.

Trương Đình Hoài, Nguyễn Vũ Sơn, Nguyễn Thị Hoài, Nguyễn Thị Mai Phương và Nguyễn Thị Hậu. (2014). Đặc điểm mô bệnh học trên cá rô phi (Oreochromis niloticus) nhiễm Streptococcus sp. nuôi tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam. Tạp chí Khoa học và Phát triển Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội năm 2014, tập 12, số 3: 360-371.

Trương Hoàng Minh và Nguyễn Thanh Phương (2011). Tổng quan nuôi cá bống kèo (Pseudapocryptes elongatus, Cuvier 1816) ở tỉnh Sóc Trăng và Bạc Liêu. Tạp chí khoa học trường ĐHCT 2011:18b 219-227.

Trương Hoàng Minh, Trương Quốc Phú, Wenresti G. Gallardo và Kou Ikejma. (2009). Sự phân bố và cường lực khai thác cá bống kèo giống (Pseudapocryptes elongatus, Cuvier 1816) ở vùng ven biển tỉnh Sóc Trăng và Bạc liêu. Kỷ yếu hội nghị khoa học thủy sản toàn quốc 19/11/2009, 19: 405- 415.

Từ Thanh Dung (2010). Nghiên cứu về huyết học cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bệnh trắng gan, trắng mang. Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ năm 2010: 15b 81-90.

Từ Thanh Dung (2012). Sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá tra nuôi thâm canh ở đồng bằng sông Cửu Long. UV – Việt Nam. Quyển 1. Nhà xuất bản Nông nghiệp, 2012.

Từ Thanh Dung, M.Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh và Đặng Thụy Mai Thy. (2004). Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra (Pangasius hypophthalmus). Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ, 2004: 137-142. 373 trang.

Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa. (2005).

Giáo trình Bệnh học thủy sản. Đại học Cần Thơ. 151 trang.

Từ Thanh Dung, Nguyễn Thị Tiên và Nguyễn Anh Tuấn (2012). Nghiên cứu tác nhân gây bệnh trắng đuôi trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) và giải pháp điều trị. Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ 2012: 22c 136-145.

Từ Thanh Dung, Lý Văn Khánh và Trần Ngọc Hải. (2014). Xác định một số mầm bệnh trên cá chình bông (Anguilla marmorata) nuôi trong bể. Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ, số chuyên đề: Thủy sản (2014) (2): 177- 183.

Võ Văn Nha, (2012). Bệnh do vi khuẩn Vibrio sp. trong nuôi cá mú thương

phẩm. UV – Việt Nam. Quyển 1. Nhà xuất bản Nông nghiệp, 2012.

104

Website tham khảo:

1. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

2. http://training.fws.gov/resources/course-resources/fish-histology

3. http://www.moprn.org/moprn2012/fish/fish1.pdf

4. http://vasep.com.vn/Tin-Tuc/666_15515/Bac-Lieu-ca-keo-no-bung-

chet-hang-loat.htm (truy cập ngày 28/9/2011)

105

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC A: PHIẾU ĐIỀU TRA AO NUÔI

Kích cỡ (cm) ............................................................................................. Kiểm tra con giống ...................................................................................

Mật độ thả giống (con/m2) ....................................................................... Tỷ lệ hao hụt (con) ...................................................................................

Mực nước trong ao từ .................................... cm đến .............................. Số lần thay nước ....................................................................................... Định kỳ bón phân ..................................................................................... Kiểm tra pH .............................................................................................. Kiểm tra độ mặn ....................................................................................... Sử dụng hóa chất quản lý môi trường ......................................................

1. Thông tin cá nhân: - Họ và tên: ............................................................................................................ - Địa chỉ: ............................................................................................................... 2. Thông tin chung về tình hình nuôi cá bống kèo: 2.1 Thông tin chung về sản xuất: - Quy mô: ............................................................................................................. - Số ao nuôi: ......................................................................................................... - Diện tích ao nuôi (ha): ....................................................................................... - Mật độ nuôi: ....................................................................................................... - Cỡ giống: ........................................................................................................... - Số vụ nuôi/năm: ................................................................................................. - Năng suất bình quân .......................................................................................... - Số lần cho ăn/ngày: ............................................................................................ - Kinh nghiệm nuôi (năm): ................................................................................... 2.2 Thông tin về quy trình nuôi: - Nguồn nước: ...................................................................................................... - Chuẩn bị ao nuôi: ............................................................................................... Phơi ao ..................................................................................................... Bón vôi ..................................................................................................... Diệt tạp ..................................................................................................... Bón phân .................................................................................................. Mực nước ao nuôi: ................................................................................... - Nguồn giống: - Thả giống: - Quản lý chất lượng nước trong ao nuôi: - Quản lý thức ăn:

Các chất thường trộn vào thức ăn ............................................................ Số lần cho ăn trong ngày .......................................................................... 106

2.3 Thông tin về tình hình xuất hiện bệnh trên cá bống kèo nuôi: - Thời gian xuất hiện bệnh ................................................................................... - Kích cỡ cá khi xuất hiện bệnh ............................................................................ - Biểu hiện bệnh ................................................................................................... - Tỷ lệ hao hụt ...................................................................................................... - Các yếu tố môi trường khi xuất hiện bệnh: Nhiệt độ ................................................................................................................ pH ......................................................................................................................... Oxy ....................................................................................................................... - Quản lý sức khỏe cá nuôi (Phương pháp điều trị): ............................................ - Kết quả điều trị: ................................................................................................. - Cách xử lý khi ao bị nhiễm bệnh .......................................................................

107

PHỤ LỤC B

HÓA CHẤT VÀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MẪU

Phụ lục B.1: Phƣơng pháp xác định khả năng tan huyết của vi

khuẩn

Vi khuẩn được phân lập trên mẫu cá bệnh, phải được xác định là loài vi khuẩn gram dương, hình cầu, vi khuẩn nuôi trên đĩa TSA (+1,5%NaCl). Khi vi khuẩn đã thuần, dùng que cấy nhặt một khuẩn lạc và cấy lên đĩa môi trường Blood (1,5%NaCl). Sau 48 giờ ở 30 – 320C vi khuẩn phát triển và đọc kết quả.

Đọc kết quả: - Dạng alpha (α): Streptococcus Pneumoniae và một nhóm liên cầu khuẩn (Streptococcus viridans hoặc Viridans streptococci) sẽ cho ra kết quả alpha là tán huyết không hoàn toàn. Nhóm vi khuẩn này làm thay đổi màu sắc trong môi trường thạch nhưng tán huyết không đầy đủ và tán huyết một phần. Tán huyết alpha được gây ra do vi khuẩn có khả năng sản xuất ra hydrogen peroxide làm oxi hóa hemoglobin trong môi trường Blood.

- Dạng beta (β): còn được gọi là tán huyết đầy đủ, dùng để nhận biết Streptococcus pyogenes hoặc nhóm strep (GAS), nó có khả năng tiết ra enzyme streptolysin có khả năng gây ra sự tán huyết đầy đủ, làm xuất hiện một khu vực sáng trên môi trường Blood.

- Dạng gama (γ): khi vi khuẩn không gây ra hiện tượng tán huyết cũng như môi trường thạch không có gì thay đổi, thường là vi khuẩn Enterococcus (nhóm D strep) hiển thị sự tán huyết gama.

Phụ lục B.2: Phƣơng pháp định danh vi khuẩn bằng kit API 20

Strep (Biomérieux, Pháp)

- Chuẩn bị: + Cho 5 ml nước cất vào trong khuôn nhựa để giữ ẩm khi ủ mẫu và sau

đó đặt kit API 20 Strep vào khuôn nhựa.

+ Dùng que cấy tiệt trùng lấy một lượng nhỏ vi khuẩn cho vào ống chứa 2ml API Suspension Medium (dung dịch gốc). So màu độ đục của vi khuẩn trong ống API Suspension Medium sao cho tương đồng độ đục ống vi khuẩn McFacland số 4.

+ Dùng pipet tiệt trùng hút 100 μl dung dịch vi khuẩn của API Suspension Medium cho đầy vào các ô VP, HIP, ESC, PYRA, αGAL, βGUR, βGAL, PAL, LAP và 150 μl cho vào đầy nữa giếng ADH.

+ Dùng pipet hút 500 μl dung dịch vi khuẩn từ dung dịch gốc cho vào

dung dịch API GP Medium (dung dịch 1), lắc đều.

108

+ Sau đó hút 150 μl dung dịch vi khuẩn từ dung dịch API GP Medium

cho đầy các ô còn lại (từ ô RIB đến GLYG).

+ Tiếp tục phủ dầu (mineral oil) vào các ô từ ADH → GLYG. + Đậy nắp khuôn nhựa, ủ mẫu ở nhiệt độ 36oC+2oC. - Sau 4 giờ cho thuốc thử vào và đọc kết quả lần 1 sau 10 phút (Bảng

3.1)

+ Giếng VP: nhỏ vào một giọt VP1 + 1 giọt VP2. + Giếng HIP: nhỏ 2 giọt NIN. + Giếng PYRA, αGAL, βGUR, βGAL, PAL và LAP: nhỏ một giọt ZYM

A và một giọt ZYM B,.

- Đem ủ kit thêm đủ 24 giờ, đọc kết quả lần 2 ở các giếng ô ESC, ADH, RIB → GLYG. Không đọc lại kết quả các ô HIP, PYRA, αGAL, βGUR, βGAL, PAL, LAP.

Phụ lục B.3: Phƣơng pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu của

thuốc kháng sinh

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn được xác định theo phương pháp của Geert Huys (2002), các bước tiến hành như sau:

Ngày thứ nhất và thứ hai - Chuẩn bị: Đĩa TSA (Tryptic soya agar) + 1,5% NaCl, ống nghiệm 10 ml TSB (Tryptic soy broth) + 1,5% NaCl, chai 50 ml TSB + 1,5% NaCl, nước muối sinh lý (dung dịch 0,85%NaCl).

- Nuôi vi khuẩn trên môi trường TSA + 1,5% NaCl 24 giờ ở nhiệt độ 30oC bao gồm vi khuẩn cần xác định MIC và vi khuẩn đối chứng (E.coli LMG 8223)

- Kiểm tra sự thuần chủng của vi khuẩn bằng cách quan sát sự đồng nhất

về hình dạng, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc và nhuộm Gram.

- Chọn 5 khuẩn lạc riêng lẻ trên đĩa TSA + 1,5% NaCl cho vào ống nghiệm chứa 10 ml TSB + 1,5% NaCl, ủ ở 28oC, 24h (có thể ủ lâu hơn nếu khuẩn lạc chưa phát triển).

- Mỗi lần xác định MIC chỉ làm tối đa 10 chủng vi khuẩn trong đó có

chủng đối chứng. Ngày thứ ba Pha thuốc - Pha 02 ống nghiệm thuốc gốc, mỗi ống 50 ml (là kháng sinh hay thuốc cần khảo nghiệm), ống thứ nhất có hàm lượng thuốc là 1024 ppm và ống thứ hai có hàm lượng thuốc là 256 ppm. Thuốc phải được pha bằng dung môi phù hợp (theo hướng dẫn của nhà sản xuất).

109

- Pha loãng thuốc với độ pha loãng 2 lần từ 3 – 1024 ppm trong ống nghiệm 50 ml. Hàm lượng thuốc 512 và 256 ppm phải được pha từ ống thuốc gốc thứ nhất (1024 ppm) bằng cách thêm nước muối sinh lý. Hàm lượng thuốc 128, 64, 32, 16, 8 và 4 ppm được pha từ ống thuốc gốc thứ hai (256 ppm).

Bảng 1. Thao tác pha loãng kháng sinh (thể tích dùng cho 10 chủng vi khuẩn)

Thể tích của dung dịch kháng sinh

Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Nồng độ cần đạt (ppm) 1024 512 256 128 64 32 16 8 4

25 ml (dung dịch thuốc gốc 1) 25 ml (1024 ppm) 25 ml (512 ppm) 25 ml (dung dịch thuốc gốc 2) 25 ml (128 ppm) 25 ml (64 ppm) 25 ml (32 ppm) 25 ml (16 ppm) 25 ml (8 ppm)

Thể tích nước muối sinh lý - 25 ml 25 ml 25 ml 25 ml 25 ml 25 ml 25 ml 25 ml

Ghi chú: dung dịch thuốc gốc 1 = 1024 ppm, dung dịch thuốc gốc 2 = 256 ppm.

Phải lắc đều dung dịch trước khi pha loãng ở nồng độ tiếp theo. Chú ý ở mỗi độ pha loãng, hàm lượng thuốc sẽ giảm đi phân nửa sau khi cho dung dịch vi khuẩn vào (Bảng 1).

Bảng 2: Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc khác nhau (cho 01 chủng)

Số MIC

Thể tích dung dịch thuốc

Hàm lượng cuối cùng (ppm) 512 256 128 64 32 16 8 4 2

1 2 3 4 5 6 7 8 9

2 ml (1024 ppm, ống 1) 2 ml (512 ppm, ống 2) 2 ml (256 ppm, ống 3) 2 ml (128 ppm, ống 4) 2 ml (64 ppm, ống 5) 2 ml (32 ppm, ống 6) 2 ml (16 ppm, ống 7) 2 ml (8 ppm, ống 8) 2 ml (4 ppm, ống 9)

Thể tích vi khuẩn 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Đo mật độ vi khuẩn - Đo mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 590 nm và điều chỉnh mật độ vi khuẩn bằng môi trường TSB + 1,5% NaCl cho đạt OD = 0,1 ± 0,02 (khoảng 108 cfu/ml).

- Đối chứng khi sử dụng so màu là môi trường TSB + 1,5% NaCl không dùng nước cất và không nên cho vi khuẩn vào thuốc lâu hơn 1 giờ sau khi đo mật độ.

- Cho 2 ml vi khuẩn đã điều chỉnh mật độ vào mỗi ống nghiệm có hàm lượng thuốc từ 4 – 1024 ppm (bảng 3.9). Lắc đều dung dịch vi khuẩn trước khi cho vào các ống nghiệm có thuốc.

- Mỗi lần xác định MIC cần phải có: đối chứng âm (2 ml TSB + 1,5%

NaCl + 2 ml nước cất); đối chứng dương (2 ml vi khuẩn + 2 ml nước cất).

110

- Tất cả các ống nghiệm được ủ ở 280C trong 24 giờ (hoặc lâu hơn đến

khi thấy vi khuẩn trong ống đối chứng dương phát triển).

Mỗi chủng vi khuẩn sau khi điều chỉnh mật độ phải được cấy lên môi trường TSA + 1,5% NaCl để kiểm tra sự thuần chủng và phải được ủ trong cùng điều kiện với các ống MIC.

Ngày thứ tƣ Đọc kết quả - Kiểm tra sự thuần chủng của chủng vi khuẩn xét nghiệm trên đĩa TSA + 1,5% NaCl. Nếu thấy phát hiện có sự tạp nhiễm thì không đọc kết quả MIC. - Sự phát triển của vi khuẩn được xác định bằng cách so sánh độ đục của

mỗi ống MIC với ống đối chứng âm và dương.

- Loại ống nghiệm của chủng vi khuẩn nào phát triển không liên tục phải

bị loại.

- Giá trị MIC được xác định là hàm lượng thuốc trong ống nghiệm đầu tiên không có vi khuẩn phát triển. Trường hợp vi khuẩn phát triển ở tất cả các nồng độ thì giá trị MIC được xác định ở ống nghiệm có hàm lượng thuốc mà sự phát triển của vi khuẩn giảm khoảng 80% so với ống trước đó.

111

PHỤ LỤC C

SỐ LIỆU NGHIÊN CỨU

Phụ lục C.1: Kết quả điều tra

Giai đoạn

Tỷ lệ

bệnh

Stt

Họ và tên

Xử lý nƣớc

Tên bệnh

Xử lý

chết

Mật độ (con/m2)

Thức ăn (kg/ngày)

(tháng

Diện tích (m2)

(%)

nuôi)

Amoxicillin, Vitamin C

1 Dương Hoàng Giáp

2.000 Iodine

130

50

2

10

Đường ruột Xuất huyết

Men tiêu hóa

Amoxicillin, Ampicillin

2 Trần Văn Đức

2.500 BZT

150

30

Xuất huyết

2

30

Vitamin C, Men tiêu hóa

Amoxicillin, Vi sinh, BZT

3 Trần Hữu Tạo

2.000 Diệt khuẩn

70

20

2

Diệt khuẩn BKC, Vitamin

10

Lở loét Xuất huyết Cong thân

C, men tiêu hóa

Virkon, Amoxicillin

4 Võ Văn Tây

1.500 Không

20

Xuất huyết

2,5

130

30

Vitamin C, men tiêu hóa

Amoxicillin, Vitamin C

5 Trần Hữu Tường

7.000 Không

130

50

2

30

Men tiêu hóa

Amoxicillin

6 Đỗ Minh Toàn

10.000 Saponin

150

50

2

Ampicillin

30

Gentamox

Vitamin C, men tiêu hóa

7 Thạch Len

4.000 Iodine, Virkon A

100

20

2,5 - 3

20

Amoxicillin, Iodine

Vitamin C, men tiêu hóa

8 Quách Thành Khánh

4.000 Dây thuốc cá

160

25

2

35

Amoxicillin

Vitamin C, men tiêu hóa

9 Quách Thành Thi

3.000 Dạy thuốc cá

140

20

2-2,5

10

Amoxicillin, Iodine

Amoxicillin, BKC

10 Quách Thanh Cần

8.000 Dây thuốc cá

200

20

1,5-2

15

Vitamin C, men tiêu hóa

Vitamin C, men tiêu hóa

11 Huỳnh Dũng Phong

1.000 Saponin

150

20

1,5-2

10

Amoxicillin

BZT

12 Trần Văn Hưng

11.000 Saponin

110

20

1-2

5

BKC

Vitamin C

13 Vũ Văn Hoạt

10.000 Dây thuốc cá

130

50

1,5-2

5

Amoxicillin

Vitamin C, Amoxicillin,

14 Nguyễn Văn Hiếu

10.000 Dây thuốc cá

100

50

1,5 - 3

8

BZT

Vitamin C, Amoxicillin

15 Cao Trung Tính

7.000 Dây thuốc cá

100

40

1-3

20

BZT, Iodine

150

50

5

16 Phạm Văn Vượng

7.000 Saponin

0,5-2

BKC, BZT, Vitamin C

17 Phạm Bình Lạc

100

30

Xuất huyết Đường ruột Lở loét Xuất huyết Đường ruột Cong thân Xuất huyết Lở loét Xuất huyết Đường ruột Cong thân Xuất huyết Cong thân Lở loét Xuất huyết bụng Lở loét Xuất huyết Lở loét Xuất huyết Đường ruột Lở loét Lở loét Gan Xuất huyết Lở loét Gan Xuất huyết Xuất huyết Lở loét Gan Lở loét

1

Virkon

2

35.000 Virkon 112

Vi sinh EM

Virkon

18 Trần Quốc Đạt

10.000 Dây thuốc cá

140

Vi sinh EM

1,5

5

50

Vitamin C

Virkon

19 Lê Tuyên Phuông

4.000 Dây thuốc cá

80

1,5

10

35

Vitamin C

BKC

20 Ngô Yến Sự

14.000 Dây thuốc cá

80

1

5

50

Vitamin C

Virkon, Vitamin C, men vi

21 Nguyễn Hoàng Thiên

5.000 Dây thuốc cá

100

0,5-3

sinh, Amoxicillin,

5

50

Tetracycline

Vitamin C

22 Trần Văn Do

4.000 Saponin

130

Men tiêu hóa

2

20

25

BKC

Men tiêu hóa

23 Lữ Văn Công

30.000 Saponin, Chlorine

120

Amoxicillin

0,5

5

20

Vitamin C

24 Dương Quốc Việt

2.500 Dây thuốc cá

100

3

BKC

5

35

Vitamin C

25 Huỳnh Văn Tháo

20.000 Chlorine

140

Men vi sinh

2,5-3

30

30

Tetracycline

Vitamin C

26 Tô Thanh Thảo

18.000 Dây thuốc cá

120

2

30

20

Virkon

Vitamin C

27 Lê Văn Hường

12.000 Saponin

130

Virkon

3

15

20

Men tiêu hóa

Vitamin C

28 Lê Văn Cum

11.000 Dây thuốc cá

100

2

15

50

BKC

Vitamin C

29 Trương Anh Cẩm

18.000 Dây thuốc cá

100

1

15

50

Virkon

Chlorine

30 Lâm Thanh Nhàn

12.000 Saponin

100

1,5

5

50

Gan Bể bụng Lở loét Xuất huyết Bể bụng Gan Gan Xuất huyết Lở loét Đường ruột Xuất huyết Lở loét Xuất huyết Gan Bể bụng Lở loét Xuất huyết Bể bụng Bể bụng Lở loét Xuất huyết Bể bụng Gan Bể bụng Gan Xuất huyết Bể bụng Lở loét Bể bụng Lở loét Lở loét Gan xuất huyết

Vi sinh EM

Vitamin C, Tetracycline

31 Phạm Văn Soạn

10.000 Dây thuốc cá

130

Gan xuất huyết

1,5

5

50

BKC, EM

Vitamin C, Amoxicillin

Men vi sinh

32 Nguyễn Thanh Phương

25.000 Lọc nước, Iodine

150

60

20

50

Vitamin C, BZT,

33 Nguyễn Văn Thương

8.000

150

1,5

10

25

Lọc nước, diệt khuẩn

Amoxicillin, Enrofloxacin

B complex, Amoxicillin

34 Châu Chí Nhi

9.000

180

1

5

30

Dây thuốc cá Iodine, Vi sinh

Iodine

Men vi sinh, Vitamin C

35 Dương Tấn Trọng Hảo

20.000

150

2

10

60

Lọc nước, Iodine, BZT

Amoxicillin, BZT

1

Iodine

5

36 Nguyễn Thanh Liêm 37 Tạ Hùng Cường

10.000 Lọc nước 25.000 Lọc nước, Iodine

100 130

Lở loét Gan xuất huyết Đường ruột Phù mắt Chướng bụng, lồi mắt Gan xuất huyết Lở loét Xuất huyết Xuất huyết Phù mắt Đường ruột Gan Xuất huyết Gan xuất huyết

2

Amoxicillin

20

50 20

113

Men tiêu hóa

38 Mã Hữu Công

30.000 Lọc nước, Iodine

150

20

2

4

Amoxicillin

Men tiêu hóa

39 Phan Long Thiên

5.000 Lọc nước, Iodine

180

25

2

4

Lở loét Đường ruột Xuất huyết Chướng bụng Xuất huyết

Amoxicillin

Amoxicillin, Methionin

40 Tạ Thu Sương

17.000 Lọc nước, Iodine

170

40

Xuất huyết

2

10

Sorbitol

Diệt khuẩn, Vitamin C

Amoxicillin,Enrofloxacin

41 Tạ Hiền Nhân

8.000

150

20

2

25

Lọc nước, diệt khuẩn

Men đường ruột

Cotrim

42 Hồng Vũ Kỳ

20.000 Lọc nước

110

50

1

Amoxicillin

25

43 Quách Văn Duôn

12.000 Lọc nước

120

50

1,5-2

Amoxicillin

5

Amoxicillin

44 Nguyễn Văn Út

12.000 Iodine

150

20

2

5

Men đường ruột

45 Hồng Văn Vũ

25.000 Lọc nước, Iodine

140

50

2

Amoxicillin

5

Amoxicillin

46 Lê Hồng Hoàng

5.000 Không

100

20

2

Men đường ruột

Vitamin C, Enrofloxacin

Oxytetracycline

47 Phan Long Hữu

25.000 Không

120

50

2

5

Chướng bụng Lồi mắt Gan Đường ruột Xuất huyết Trắng đuôi Tuột nhớt Chướng bụng Xuất huyết Gan Gan Đường ruột Chướng bụng Cá xoay vòng Chướng bụng Xuất huyết Gan Chướng bụng Gan Xuất huyết Tuột nhớt Lở loét Xuất huyết Chướng bụng Xuất huyết

Amoxicillin

Amoxicillin, men đường

48 Tạ Kim Gấu

16.000

150

50

Xuất huyết

2

5

Lọc nước, diệt khuẩn

ruột, Vitamin C, Cotrim

Amoxicillin

49 Trần Việt Tân

6.000 Lọc nước

120

20

2

15

Men tiêu hóa

Iodine

50 Lê Văn Nhừng

20.000 DAP

150

20

2

Vi sinh

35

Amoxicillin

B Complex

51 Nguyễn Văn Đảnh

4.000

150

20

1,5

Amoxicillin

30

Dây thuốc cá Iodine, vi sinh

Vitamin C

100

30

15

52 Trần Tuyết Giang

9.000 Vi sinh, BZT

1,5

Amoxicillin

Amoxicillin

53 Phan Long Lực

15.000 Không

100

60

1

10

Baymet

Kháng sinh

54 Huỳnh Tấn Phát

5.000

120

20

2

40

Dây thuốc cá Diệt giáp xác,

Chướng bụng Xuất huyết Tuột nhớt Lở loét Xuất huyết Tuột nhớt Lở loét Gan Chướng bụng Lở loét Xuất huyết Chướng bụng Xuất huyết Chướng bụng Xuất huyết

114

BKC

Amoxicillin

55 Đỗ Văn Nơi

6.000

100

25

2

20

Phân 3 màu Vi sinh

Super VS

56 Lê Văn Hột

30.000 Dây thuốc cá

150

20-25

1

Amoxicillin

20

Amoxicillin

57 Phạm Ngoan Cường

15.000 Không

180

2

Sorbitol

45

40

58 Đặng Thanh Hùng

16.000 Không

170

2

Amoxicillin

60

5

Amoxicillin

59 Đặng Văn Muộn

25.000 Túi lọc

160

1,5

50

10

Vitamin C

Amoxicillin

Sorbitol

60 Đặng Văn Hạnh

15.000 Không

200

2

60

55

Oxytetracycline

Vitamin C

61 Lê Thế Vinh

15.000 Không

180

2

60

20

Amoxicillin

Amoxicillin, Sorbitol

62 Lê Minh Tân

3.000

130

2,5-3

15

40

Xuất huyết Lở loét Gan xuất huyết Ruột Lở loét Xuất huyết Lở loét Xuất huyết Gan Chướng bụng Chướng bụng Xuất huyết Xuất huyết Gan Lở loét Đường ruột Chướng bụng Xuất huyết Lở loét Xuất huyết

Oxytetracycline

Amoxicillin

63 Lê Thanh Bình

2.000

125

2,5-3

Ciprofloxacin

20

15

Chướng bụng Xuất huyết

Amoxicillin

64 Cao Thanh Xuân

4.000

100

2,5-3

Ciprofloxacin

25

15

Chướng bụng Xuất huyết

Amoxicillin

100

20

65 Cao Văn Yên

10.000

50

Chướng bụng

2,5-3

Dây thuốc cá Iodine, Vi sinh Dây thuốc cá, Zeolite, Iodine, Vi sinh Dây thuốc cá, Zeolite, Iodine, Vi sinh Iodine, Vi sinh, Zeolite

Ciprofloxacin

Methionin

Amoxicillin

40

66 Trần Thanh Quang

8.000

80 - 100

70

1,5-2

Dây thuốc cá, Saponin, NPK, Iodine, BZT

Biosubtyl

Chướng bụng Tuột nhớt Lở loét Xuất huyết

Methionin

Amoxicillin

25

67 Phạm Công Quẩn

5.000

80

30

Chướng bụng

1,5

Vi sinh, Yucca Canximax

Men tiêu hóa

Methionin

68 Nguyễn Văn Lắm

21.000

120

1,5-2

Amoxicillin

50

5

Biosubtyl

Saponin, NPK Dây thuốc cá KMnO4, Vi sinh

Methionin

6.000

69 Nguyễn Văn Kết

150

2

Amoxicillin

45

30

Dây thuốc cá Saponin, Vi sinh

Biosubtyl

Methionin

2.000

70 Lê Thanh Ngoan

100

2

Amoxicillin

20

10

Dây thuốc cá Vi sinh, Iodine

Men tiêu hóa

Methionin

4.000

71 Hồ Văn Nhiều

100

1,5

Amoxicillin

30

30

Saponin, Iodine Decide, Vi sinh

Biosubtyl

72 Nguyễn Hồng Khang

2.000 Dây thuốc cá

115

Chướng bụng Tuột nhớt Lở loét Xuất huyết Tuột nhớt Lở loét Xuất huyết Tuột nhớt Lở loét Tuột nhớt Lở loét Chướng bụng Tuột nhớt

2-2,5

Methionin

20

20

115

Amoxicillin

Vi sinh, Iodine

Lở loét Chướng bụng

Men tiêu hóa

Methionin

73 Nguyễn Tuấn Khanh

4.000

140

25

2

Amoxicillin

5

Lở loét Chướng bụng

Biosubtyl

Amoxicillin

Tetracycline

74 Nguyễn Tuấn An

3.000

130

25

2-2,5

15

Lở loét Chướng bụng

Vitamin C

Methionin

Amoxicillin

75 Nguyễn Văn Kiệt

4.000

125

25

2

10

Biosubtyl

Lở loét Chướng bụng Xuất huyết

Methionin

Amoxicillin

76 Trịnh Phương Đông

6.000

100

30

1,5

15

Biosubtyl

Lở loét Chướng bụng Xuất huyết

Methionin

Amoxicillin

77 Trịnh Minh Mẫn

2.500

80

20

2-2,5

10

Biosubtyl

Tuột nhớt Lở loét Xuất huyết

Amoxicillin

78 Cao Chí Nguyện

2.000

150

40

2-2,5

25

Tuột nhớt Lở loét

Vitamin C

Methionin

79 Nguyễn Văn Chính

3.000

125

20

2

Amoxicillin

25

Tuột nhớt Lở loét Chướng bụng

Biosubtyl

Methionin

80 Hồ Văn Khởi

8.000

150

50

3

Amoxicillin

20

Lở loét Chướng bụng Xuất huyết

Biosubtyl

Saponin, Dolomite Dây thuốc cá Vi sinh, Iodine Dây thuốc cá Saponin, CaCO3 Dolomite, Iodine, Yucca, Vi sinh Saponin, Dolomite Dây thuốc cá Vi sinh, Iodine Dây thuốc cá, Iodine, Saponin, Phân lân, Dolomite, Vi sinh Dây thuốc cá Saponin, Iodine Yucca, Zeolite Vi sinh Dây thuốc cá Iodine, Vi sinh KMnO4, Zeolite Xanh Malachite Dolomite Saponin, Iodine Vi sinh, Vitamin C Saponin, phân 3 màu, dây thuốc cá KMnO4, Vi sinh Xanh Malachite Dolomite, Diamitine

Amoxicillin

2

Men tiêu hóa

81 Huỳnh Văn Phương

3.000 Dây thuốc cá

50

30

30

Hỗ trợ gan, ruột

Amoxicillin, Ciprofloxacin

2

82 Nguyễn Trường Thẳng

20.000

100-120

35

Vitamin C, Men tiêu hóa

40

Dây thuốc cá Iodine, Vi sinh

Diệp hạ châu

Vitamin C

2

Amoxicillin

83 Giảng Văn Tới

20.000

100

30

25

Dây thuốc cá KMnO4

Ampicillin

Men tiêu hóa

Amoxicillin

84 Nguyễn Văn Đời

10.000

100

30 - 40

2 – 2,5

30

Dây thuốc cá Iodine, Vi sinh

Lypsin

Nổi đầu Chướng bụng Quay vòng Lật bụng Chướng bụng Đốm đỏ Xuất huyết Chướng bụng Tuột nhớt Xuất huyết Chướng bụng Tuột nhớt Xuất huyết Chướng bụng

85 Trương Thị Duy

10.000 Dây thuốc cá

80

30

2 – 2,5 Men tiêu hóa, Amoxicillin

35

116

Iodine, Vi sinh

Lypsin, Ciprofloxacin

Cotrim, Vitamin C

Men tiêu hóa, Amoxicillin

86 Nguyễn Văn Thắng

30.000

2 - 3

Lypsin, Ciprofloxacin

120

20

15

Dây thuốc cá Iodine, Vi sinh

Cotrim, Vitamin C

Amoxicillin, Ciprofloxacin

100

35

1-2

40

87 Trần Thanh Hùng

10.000

Vitamin C

Men tiêu hóa,

100

40

1,5 - 2

35

88 Giang Bé Em

4.000

Amoxicillin Vitamin C

Không xác

Vitamin C, Cotrim

120

30

89 Trịnh Văn Minh

10.000

định

Diệp hạ châu

CuSO4, Men tiêu hóa

150

30

3

40

90 Phùng Văn Thùy

15.000

Dây thuốc cá Iodine, Vi sinh Dây thuốc cá Iodine, Vi sinh Dây thuốc cá Iodine, Vi sinh Dây thuốc cá Iodine, Vi sinh

Tuột nhớt Xuất huyết Chướng bụng Tuột nhớt Xuất huyết Xuất huyết dưới da Xuất huyết dưới da Không Xuất huyết Đốm đỏ Xuất huyết

Ciprofloxacin, Amoxicillin

117

Phụ lục C.2: Kết quả thu mẫu và phân lập vi khuẩn

34 chủng vi khuẩn

42 chủng vi khuẩn

17 chủng vi khuẩn

11 chủng vi khuẩn

62 chủng vi khuẩn

86 chủng vi khuẩn

Tổng cộng:

Đợt 1: 07 ao: Đợt 2: 10 ao Đợt 3: 01 ao Đợt 4: 05 ao Đợt 5: 05 ao Đợt 6: 06 ao 6 đợt: 34 ao

6 ao bệnh – 1 ao khỏe 7 ao bệnh – 3 ao khỏe 01 ao bệnh 3 ao bệnh – 2 ao khỏe 3 ao bệnh – 2 ao khỏe 3 ao bệnh – 3 ao khỏe 23 ao bệnh – 11 ao khỏe

23 mẫu cá 41 mẫu cá 10 mẫu cá 50 mẫu cá 50 mẫu cá 60 mẫu cá 254 mẫu cá

252 chủng vi khuẩn

Thu Đợt I (10/2011)

Oxydase Catalase O F KSD MIC GTT API 20 PCR TT Dấu Hiệu Bệnh Lý Hình Dạng khuẩn Lạc Nhuộm Gram và hình dạng Di động Strep 16S HỘ SỐ I

Ao Số 1

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) + (-) + + Cá số 1: Tuột nhớt, bụng trương to. Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) Cá số 2: Cong thân. Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-) A1F1-T: nhỏ li ti, trắng trong. A1F1-G: nhỏ li ti, trắng trong. A1F2-T: nhỏ li ti, trắng trong. A1F2-G: nhỏ li ti, trắng trong.

Ao Số 2

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) + (-) + + Cá số 1: Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-) Xuất huyết vây bụng, nắp mang, vây hậu môn. Gan hơi nhạt.

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) Cá số 2: Xây hậu môn xuất huyết nhẹ, gan xuất huyết. Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) + (-) + + A2F1-G: nhỏ tròn, trắng đục. A2F1-T: nhỏ tròn, trắng đục. A2F2-G: nhỏ li ti, trắng trong. A2F2-T: nhỏ li ti, trắng trong.

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) A2F3-G: nhỏ tròn, trắng đục. Cá số 3:

Xuất huyết ở vây hậu môn, vây bụng. Gan nhạt màu. Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) A2F3-T: nhỏ tròn, trắng đục.

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) A2F4-G: nhỏ tròn, trắng đục. Cá số 4:

Xuất huyết nhẹ vây hậu môn, hậu môn, bụng. Thân có đốm trắng. Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) A2F4-T: nhỏ tròn, trắng đục.

Ao Số 3

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)

Cá số 1: Gram (-), hình que (+) (+) (+) (+) (+) Xuất huyết vây bụng, tuột nhớt.

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) A3F1-G: nhỏ tròn, trắng đục. A3F1-T: to tròn, vàng kem. A3F1-TT: nhỏ tròn, trắng đục.

118

(+) (+) (+) (+) Gram (-), hình que (+) Cá số 2: (+) (+) (+) (+) Gram (-), hình que (+) Xuất huyết vây hậu môn, hậu môn, ruột xuất huyết.

(-) (-) (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu

Cá số 3: (-) (-) (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu

Xuất huyêt nhiều ở vây bụng, bụng, nấp hầu. Gan bị bầm. (-) (-) (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu A3F2-G1: to tròn, vàng kem. A3F2-G2: to tròn, vàng kem. A3F3-G: nhỏ li ti, trắng trong. A3F3-T: nhỏ li ti, trắng trong. A3F3-TT: nhỏ li ti, trắng trong.

HỘ SỐ II

Khu I

Ao số 3

(-) (-) (+) (-) (-) Gram (+), hình cầu

Cá Số 2: (-) (-) + (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu + + Xuất huyết các vây

(-) (-) (+) (-) (-) Gram (+), hình cầu B3K1F2-G: nhỏ tròn, trắng đục. B3K1F2-T: nhỏ tròn, trắng đục. B3K1F2-TT: nhỏ tròn, trắng đục.

Khu II

Ao số 1

+ + (-) (-) + (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu Cá số 1: Gan bị bầm. (-) (-) (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu

(-) (-) (-) (-) (-) Cá số 2: Gram (+), hình cầu Gan nhợt nhạt, gan xuất huyết.

(-) (-) (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu

(-) (-) (-) (-) (-) Cá số 3: Gram (+), hình cầu Gan nhợt nhạt, gan xuất huyết.

(-) (-) (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu B1K2F1-G: nhỏ tròn, trắng đục. B1K2F1-T: nhỏ tròn, trắng đục. B1K2F2-G: nhỏ tròn, trắng đục. B1K2F3-G: nhỏ tròn, trắng đục. B1K2F3-T: nhỏ tròn, trắng đục. B1K2F3-TT: nhỏ tròn, trắng đục.

Gan Không có

Cá Số 4: (-) (-) (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu

Xuất huyết da, các vây, hậu môn, bụng. Gan xuất huyết nhẹ. (-) (-) (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu

(-) (-) (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu

(-) (-) (-) (-) (-) Cá Số 5: Gram (+), hình cầu Xuất huyết vây hậu môn, da.

(-) (-) (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu

B1K2F4-T: nhỏ tròn, trắng đục. B1K2F4-TT: nhỏ tròn, trắng đục. B1K2F5-G: nhỏ tròn, trắng đục. B1K2F5-T: nhỏ tròn, trắng đục. B1K2F5-TT: nhỏ tròn, trắng đục. 34 chủng

Tổng Kết: Thu Đợt II (12/2011)

TT Dạng Khuẩn Lạc Nhuộm Gram Oxydase Catalase O F KSD MIC GTT API 20 PCR Dấu Hiệu Bệnh Lý Di Động Strep 16S HỘ SỐ I

119

Ao số 1

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) Cá số 1: + + Xuất huyết vây bụng, nắp mang, gan. Gram (+), hình cầu (-) (-) + (-) (-) (-)

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) Cá số 2: Xuất huyết vây bụng, đuôi. Gan tái nhợt. Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) A1F1-G: nhỏ tròn, trắng đục A1F1-T: nhỏ tròn, trắng đục A1F2-TT: nhỏ tròn, trắng đục A1F2-G: nhỏ li ti, trắng trong.

Ao số 2

(-) Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) Cá số 1: (-) Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-)

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) A2F1-G: nhỏ tròn, trắng đục A2F1-T: nhỏ tròn, trắng đục A2F2-G: nhỏ tròn, trắng đục

Cá số 2:

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) A2F2-T: nhỏ tròn, trắng đục Xuất huyết vây bụng, cong thân. Gan xuất huyết. Xuất huyết các vây, hậu môn, bụng, thân. Xoang bụng chúa dịch, gan xuất huyết. + + (-) (-) + (-) Gram (+), hình cầu (-) (-) Cá số 3: Xuất huyết vây bụng, vây đuôi, hậu môn. (-) Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-)

(-) Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) A2F3-T: nhỏ tròn, trắng đục. A2F3-G: nhỏ li ti, trắng trong A2F4-T: nhỏ tròn, trắng đục

Cá số 4:

(-) Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) A2F4-G: nhỏ tròn, trắng đục

Cá số 6: Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) A2F6-G: nhỏ li ti, trắng trong

(-) (-) Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) + + + Cá số 7:

(-) (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu (-) Xuất huyết vây ngực, vây hậu môn, vây bụng. Xoang bụng có dịch nhầy, gan sẫm màu. Xuất huyết vây bụng, vây ngực, bụng, thân. Có dịch nhầy xoang bụng, gan xuất huyết. Mắt lồi, xuất huyết vây bụng, hậu môn. Gan xuất huyết. A2F7-T: nhỏ tròn, trắng đục A2F7-TT: nhỏ li ti, trắng trong

Ao số 3

(-) Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) A3F1-G: nhỏ tròn, trắng đục

Cá số 1:

(-) Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) A3F1-TT: nhỏ tròn, trắng đục Có khối u trên thân, xuất huyết nhẹ trên thân và vây hậu môn. Tỳ tạng sưng to, bầm.

(-) (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu (-) Cá số 2: Cong thân, xuất huyết các vây, ruột. (-) (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu (-)

(-) (-) (-) (-) Cá số 3: Gram (+), hình cầu (-) A3F2-G: nhỏ li ti, trắng trong A3F2-TT: nhỏ li ti, trắng trong A3F3-TT: nhỏ tròn, trắng đục Xuất huyết vây bụng, hậu môn,

120

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)

thân. U nhọt trên gốc vây lưng. Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)

Cá số 4: Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) Xuất huyết các vây, xuất huyết gan. Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)

Cá số 5: Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)

Xuất huyết vây bụng, u nhọt nấp mang, mang nhợt nhạt, gan xuất huyết. Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) A3F3-G: nhỏ tròn, trắng đục A3F3-T: nhỏ tròn, trắng đục A3F4-TT: nhỏ tròn, trắng đục A3F4-G: nhỏ tròn, trắng đục A3F4-T: nhỏ tròn, trắng đục A3F5-T: nhỏ tròn, trắng đục. A3F5-TT: nhỏ li ti, trắng trong A3F5-G: nhỏ tròn, trắng đục

HỘ SỐ II

Ao số 1

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)

Cá số 1: Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) Xuất huyết, mật và gan nhợt màu. Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) B1F1-TT: nhỏ tròn, trắng đục B1F1-G: nhỏ li ti, trắng trong B1F1-T: nhỏ li ti, trắng trong

Ao số 2

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)

Gram (+), hình cầu Cá số 2: (-) (-) (-) (-) (-)

Da nhợt nhạt, mật nhợt màu, trong xoang có dịch. Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) B2F2-T: nhỏ tròn, trắng đục B2F2-G: nhỏ tròn, trắng đục B2F2-TT: nhỏ tròn, trắng đục

Ao số 3

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)

Cá số 1: Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) Thân nhợt nhạt, gan tái nhạt.

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)

+ + Cá số 2: Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) +

Xuất huyết vây bụng, vây ngực, vây hậu môn, vây đuôi, cuống đuôi. Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) B3F1-G: nhỏ tròn, trắng đục B3F1-TT: nhỏ tròn, trắng đục B3F1-T: nhỏ tròn, trắng đục B3F2-TT: nhỏ tròn, trắng đục B3F2-T: nhỏ tròn, trắng đục B3F2-G: nhỏ tròn, trắng đục

HỘ SỐ IV

Ao số 1

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) Cá số 1: Cong thân, xoang chứa dịch. Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) D1F1-G: nhỏ tròn, trắng đục D1F1-TT: nhỏ tròn, trắng đục.

42 chủng Tổng kết :

121

76 chủng Năm 2011

Thu Đợt III (02/2012)

Dạng Khuẩn Lạc Nhuộm Gram Oxydase Catalase O F KSD MIC GTT API 20 PCR TT Di Động Strep 16S

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) 1

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) 2

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) 3

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) 4

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) 5

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) 6

+ Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) + (-) (-) 7

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) 8

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) 9

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) 10

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) 11

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) 12

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) 13

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) 14

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) 15

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) 16

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) 17 F5-G: nhỏ tròn trắng đục. F5-T: nhỏ tròn trắng đục. F5-TT: nhỏ tròn trắng đục. F6-T: nhỏ tròn trắng đục. F6-TT: nhỏ tròn trắng đục. F7-G: nhỏ tròn trắng đục. F7-T: nhỏ tròn trắng đục. F7-TT: nhỏ tròn trắng đục. F8-G: nhỏ tròn trắng đục. F8-T: nhỏ tròn trắng đục. F8-TT: nhỏ tròn, trắng đục. F9-G: nhỏ tròn trắng đục. F9-T: nhỏ tròn trắng đục. F9-TT: nhỏ tròn trắng đục. F10-G: nhỏ tròn trắng đục. F10-T: nhỏ tròn trắng đục. F10-TT: nhỏ tròn trắng đục. Dấu Hiệu Bệnh Lý Cong thân, xuất huyết nặng Cong thân, xuất huyết nặng Cong thân, xuất huyết nặng Cong thân, xuất huyết nặng Cong thân, xuất huyết nặng Cong thân, xuất huyết nặng Cong thân, xuất huyết nặng Cong thân, xuất huyết nặng Cong thân, xuất huyết nặng Cong thân, xuất huyết nặng Cong thân, xuất huyết nặng Cong thân, xuất huyết nặng Cong thân, xuất huyết nặng Cong thân, xuất huyết nặng Cong thân, xuất huyết nặng Cong thân, xuất huyết nặng Cong thân, xuất huyết nặng Tổng kết 17 chủng

Thu đợt IV (11/2012)

TT Dạng Khuẩn Lạc Nhuộm Gram Oxydase Catalase O F KSD MIC GTT API 20 PCR Dấu Hiệu Bệnh Lý Di Động Strep 16S

(-) (-) + Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) + 1 + A1F1: tròn nhỏ, trắng đục Xuất huyết thân, gan xuất huyết

Gan xuất huyết (-) (-) Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) + 2 + +

Gan xuất huyết (-) (-) Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) + 3 + + A1F2: tròn nhỏ, trắng đục A1F3: tròn nhỏ, trắng đục

122

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) 4 + + + A1F4: tròn nhỏ, trắng đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) 5 + + + Xuất huyết thân, gan xuất huyết Cong thân, gan xuất huyết

Gan xuất huyết Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) 6 + + +

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (+) (+) 7 + + + Xuất huyết các vây

Gan xuất huyết Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) 8 + + +

Gan xuất huyết Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) 9 + + +

Gan xuất huyết Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) 10 + + +

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) 11 + + + Xuất huyết da, gan xuất huyết A1F6: tròn nhỏ, trắng đục A1F7:tròn to, vàng kem A1F8: tròn nhỏ, trắng đục A1F9: tròn nhỏ, trắng đục A1F10: tròn nhỏ, trắng đục A2F3: tròn nhỏ, trắng đục A5F4: tròn nhỏ, trắng đục

Tổng cộng 11 chủng

Năm 2012 28 chủng

Thu đợt V (11/12/2013)

Dạng Khuẩn Lạc Nhuộm Gram Oxydase Catalase O F PCR 16S KSD MIC GTT API 20 TT Di Động Strep Dấu Hiệu Bệnh Lý

Ao 1 A 1-1

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) A1-1G: tròn, trắng đục A1-1T: tròn, trắng đục

A 1-2

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) Cá bị xuất huyết ở vây hậu môn. Gan cá bị sưng và xuất huyết nặng Cá bị xuất huyết trên thân. Gan bị sưng

A 1-5

A1-2G: tròn, trắng đục A1-2T: tròn, trắng đục A1-6G: tròn, trắng đục A1-6T: tròn, trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 1-9

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 1-10 A1-9G: tròn, trắng đục A1-9T: tròn, trắng đục A1-9TT: tròn, trắng đục A1-10T: tròn, trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

Cá bị xuất huyết ở vây ngực, vây hậu môn, xung quanh phần đầu ngực. Gan bình thường, tỳ tạng sưng to Cá bị xuất huyết ở vây lưng, vây bụng, vây hậu môn. Gan bị sưng và xuất huyết Cá bị xuất huyết tòan thân, lở loét ở vây bụng và

123

hàm dưới. Gan bị xuất huyết AO 2

A 2-1 A2-1T: tròn, trắng đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 2-2

A2-2G: tròn, trắng đục A2-2T: tròn, trắng đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 2-3

A2-3G: tròn, trắng đục A2-3T: tròn, trắng đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 2-4

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) A2-4G: tròn, trắng đục A2-4T: tròn, trắng đục

A 2-5

A2-5G: tròn, trắng đục A2-5T: tròn, trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 2-6

A2-6G: tròn, trắng đục A2-6T: tròn, trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 2-7

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) A2-7G: tròn, trắng đục A2-7T: tròn, trắng đục

Bụng cá sưng to, xuất huyết ở vây hậu môn. Gan bị teo và có màu trắng bệch Xuất huyết ở vây ngược, cuống đuôi, vây hậu môn, bụng cá trương to. Trong xoang bụng có dịch, gan trắng bệch, ruột cá sưng to Xuất huyết ở vây ngược, cuống đuôi, vây hậu môn, bụng cá trương to. Trong xoang bụng có dịch, gan trắng bệch, ruột cá sưng to Xuất huyết ở vây bụng, cuống đuôi, vây hậu môn. Gan trắng bệch và thận sưng to Bụng trương to. Có dịch nhầy trong xoang bụng và bóng hơi. Gan trắng bệch và tỳ tạng sưng to. Bụng trương to. Có dịch nhầy trong xoang bụng và bóng hơi. Gan trắng bệch và tỳ tạng sưng to. Cá bị xuất huyết ở vây bụng, vây hậu môn, cá bị lở loét. Gan có màu trắng

124

A 2-8 Bình thường

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 2-9

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) Cá bị xuất huyết ở các vây. Gan có màu trắng

A 2-10 Bình thường

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A2-8G: tròn, trắng đục A2-8T: tròn, trắng đục A2-9G: tròn, trắng đục A2-9T: tròn, trắng đục A2-9TT: tròn, trắng đục A2-10T: tròn, trắng đục A2-10TT: tròn, trắng đục AO 3 A 3-1

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 3-2

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 3-3

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 3-7 A3-1G: tròn, trắng đục A3-1T: tròn, trắng đục A3-2G: tròn, trắng đục A3-2T: tròn, trắng đục A3-3G: tròn, trắng đục A3-3T: tròn, trắng đục A3-7G: tròn, trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 3-8 A3-8G: tròn, trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 3-10

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A3-10G: tròn, trắng đục A3-10TT: tròn, trắng đục Cá bị xuất huyết ở thân. Gan cá bị xuất huyết Bụng cá trương to. Gan trắng. Gan và tỳ tạng sưng to Bụng cá trương to. Gan trắng. Gan và tỳ tạng sưng to Bình thường. Gan bị xuất huyết. Cá xuất bị huyết ở vây bụng. Gan bị xuất huyết Cá bị xuất huyết ở vây bụng. Gan bị xuất huyết AO 4 A 4-1 A4-1G: tròn, trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 4-2

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 4-3 A4-2G: tròn, trắng đục A4-2T: tròn, trắng đục A4-3G: tròn, trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 4-4

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) A4-4G: tròn, trắng đục A4-4T: tròn, trắng đục Cá bị cong thân và xuất huyết trên thân Cá xuất bị huyết trên thân và vây bụng. Cá bị cong thân trương Cá bị bụng. Trong xoang bụng có dịch Cá xuất bị huyết toàn thân . Có dịch trong xoang bụng, tỳ ruột tạng và

125

sưng to

A 4-5

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) thường. Bình Gan bị xuất huyết

A 4-6

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) thường. Bình Gan bị xuất huyết

A 4-7 Bình thường

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 4-9 A4-5G: tròn, trắng đục A4-5T: tròn, trắng đục A4-6G: tròn, trắng đục A4-6T: tròn, trắng đục A4-7G: tròn, trắng đục A4-7T: tròn, trắng đục A4-9G: tròn, trắng đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

Cá bị xuất huyết trên thân. Có dịch trong xoang bụng, gan bị xuất huyết AO 5 A 5-3

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) A5-3G: tròn, trắng đục A5-3T: tròn, trắng đục

A 5-4 A5-4G: tròn, trắng đục

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 5-7

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

A 5-8

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-)

Cá bị xuất huyết trên thân. Trong xoang bụng có dịch, gan sưng to và xuất huyết Cá bị xuất huyết trên thân. Trong xoang bụng có dịch, gan sưng to và xuất huyết Cá bị xuất huyết trên thân. Trong xoang bụng có dịch, gan sưng to và xuất huyết Cá bị xuất huyết trên thân. Trong xoang bụng có dịch, gan sưng to và xuất huyết Tổng kết A5-7G: tròn, trắng đục A5-7T: tròn, trắng đục Ạ5-7TT: tròn, trắng đục A5-8G: tròn, trắng đục A5-8T: tròn, trắng đục A5-8TT: tròn, trắng đục 62 chủng

Thu đợt VI (/2/2014)

TT Dạng Khuẩn Lạc Nhuộm Gram Oxydase Catalase O F KSD MIC GTT API 20 PCR Strep 16S Di Động B1-6 (-) (+) (-) (-) (-)

Gram (+), đơn cầu, song cầu, liên cầu, tụ cầu khuẩn (-) (+) (-) (-) + + + + + (-) Dấu Hiệu Bệnh Lý Bụng cá sưng to. Bên trong xoang bụng có dịch, gan và tỳ B1-6G: tròn, trắng đục B1-6T: tròn, trắng đục

126

tạng sưng to (-) (-) (-) + (+) (-)

B 1-7 Gram (+), hình cầu (-) (+) (-) (-) (-)

Gan cá bị xuất huyết, gan và tỳ tạng sưng to Gram (+), hình cầu (-) (+) (-) (-) (-) +

Gram (+), hình cầu (-) (+) (-) (-) (-)

B 1-10 (-) (+) (-) (-) (-)

Gan bị teo nhỏ có màu trắng bệch (-) (+) (-) (-) (-) + Gram (+), đơn cầu, song cầu, liên cầu, tụ cầu khuẩn (-) (+) (-) (-) (-)

B 2-1 Gram (+), hình cầu (-) (+) (-) (-) (-)

Gram (+), hình cầu (-) (+) (-) (-) (-) + B1-6TT: tròn, trắng đục B1-7G: tròn, trắng đục B1-7T: tròn, trắng đục B1-7TT: tròn, trắng đục B1-10G: tròn, trắng đục B1-10T: tròn, trắng đục B1-10TT: tròn, trắng đục B2-1G: tròn, trắng đục B2-1T: tròn, trắng đục

B 2-3 Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) +

(-) + Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) + + + + B2-3G: tròn, trắng đục B2-3T: tròn, trắng đục B2-3TT: tròn, trắng đục

B 2-4 Gram (+), hình cầu (-) (+) (-) (-) (-)

(-) (+) (-) (-) (-) + Gram (+), hình cầu

(-) (+) (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu

B2-5 (-) + Gram (+), hình cầu (-) (+) (-) (-) + + + +

(-) (+) (-) (-) (-) + Gram (+), hình cầu

(-) (+) (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu B2-4G: tròn, trắng đục B2-4T: tròn, trắng đục B2-4TT: tròn, trắng đục B2-5G: tròn, trắng đục B2-5T: tròn, trắng đục B2-5TT: tròn, trắng đục

B2-6 Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) + (-) (-)

(-) (-) (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu

(-) (-) (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu

B 2-7 Gram (+), hình cầu (-) (+) (-) (-) (-)

(-) (+) (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu Bụng cá sưng to, xuất huyết ở vây hậu môn. Bụng cá sưng to, xuất huyết ở vây hậu môn Xuất huyết ở vây ngược, cuống đuôi, vây hậu môn, bụng cá trương to. Trong xoang bụng có dịch, gan trắng bệch Xuất huyết ở bụng, vây cuống đuôi, vây hậu môn. Gan bị xuất huyết Bụng trương to, mang trắng. Có dịch nhầy trong xoang bụng và bóng hơi. Gan trắng bệch và tỳ tạng sưng to, thận có màu trắng Có dịch nhầy trong xoang bụng và bóng hơi. Gan trắng bệch và tỳ tạng sưng to, thận có màu trắng Cá bị xuất huyết ở vây bụng, vây hậu môn, cá bị lở B2-6G: tròn, trắng đục B2-6T: tròn, trắng đục B2-6TT: tròn, trắng đục B2-7G: tròn, trắng đục B2-7T: tròn, trắng đục

127

(-) (-) (-) (-) + (+) Gram (+), hình cầu

B 2-8 Gram (+), hình cầu (-) (+) (+) (-) (-) loét. Gan có màu trắng Xuất huyết trên thân

(-) (+) (+) (-) (-) Gram (+), hình cầu

(-) (+) (+) (-) (-) Gram (+), hình cầu

B 2-9 Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

Gram (+), hình cầu (-) (+) (-) (-) (-)

B 2-10 Cá bị xuất huyết ở các vây. Gan có màu trắng Bình thường (-) (+) (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu

(-) (+) (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu

(-) (+) (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu

B 3-1 B2-7TT: tròn, trắng đục B2-8G: tròn, trắng đục B2-8T: tròn, trắng đục B2-8TT: tròn, trắng đục B2-9G: tròn, trắng đục B2-9TT: tròn, trắng đục B2-10G: tròn, trắng đục B2-10T: tròn, trắng đục B2-10TT: tròn, trắng đục B3-1TT: tròn, trắng đục Gram (+), hình cầu (-) (+) (-) (-) (-)

B 3-2 Gram (+), hình cầu (+) (-) (-) + (-) (-)

(-) (-) (+) Gram (+), hình cầu (+) (+) Cá bị xuất huyết ở thân, lở loét. Gan cá bị xuất huyết Bụng cá trương to. Gan trắng. Gan và tỳ tạng sưng to

(-) (-) Gram (+), hình cầu (+) (+) (+)

B 3-3 (-) (-) Gram (+), hình cầu (+) (+) (+)

(-) (-) + Gram (+), hình cầu (+) (+) (+) Bụng cá trương to. Gan trắng. Gan và tỳ tạng sưng to

(-) (-) Gram (+), hình cầu (+) (+) (+)

B 3-4 Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (+) (+)

(-) (-) Gram (+), hình cầu (+) (+) (+)

Cá bị xuất huyết ở vây bụng. Có dịch trong xoang bụng (-) (-) (-) (-) Gram (+), hình cầu (+)

B 4-1 Bình thường Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

B 4-2 Bình thường Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-) +

Gram (+), hình cầu (-)

B 4-5 Bình thường (-) (-) (+) (-) (-) + Gram (+), hình cầu

(-) (-) (+) (-) (-) Gram (+), hình cầu

B 4-6 Bình thường Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

(-) (-) (+) (-) (-) + Gram (+), hình cầu B3-2G: tròn, trắng đục B3-2T: tròn, trắng đục B3-2TT: tròn, trắng đục B3-3G: tròn, trắng đục B3-3T: tròn, trắng đục B3-3TT: tròn, trắng đục B3-4G: tròn, trắng đục B3-4T: tròn, trắng đục B3-4TT: tròn, trắng đục B4-1TT: tròn, trắng đục B4-2T: tròn, trắng đục B4-2TT: tròn, trắng đục B4-5T: tròn, trắng đục B4-5TT: tròn, trắng đục B4-6G: tròn, trắng đục B4-6T: tròn, trắng đục

128

(-) (-) (+) (-) (-) Gram (+), hình cầu

B 4-7 Bình thường Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

(-) (-) (+) (-) (-) + Gram (+), hình cầu

(-) (-) (+) (-) (-) Gram (+), hình cầu

B 4-10 Bình thường Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

(-) (-) (+) (-) (-) Gram (+), hình cầu

(-) (-) (+) (-) (-) Gram (+), hình cầu

B 5-1 Bình thường Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

B 5-2 Bình thường Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

B 5-3 Bình thường (-) (-) (+) (-) (-) + Gram (+), hình cầu

(-) (-) (+) (-) (-) Gram (+), hình cầu

B 5-4 Bình thường

B 5-5 Bình thường Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

B 5-6 Bình thường Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-) +

Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

B 5-7 Bình thường Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

B 5-8 Bình thường Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

B 5-9 Bình thường Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

B 5-10 Bình thường Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

B 6-3 Bình thường Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

B 6-4 Bình thường Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

(-) (-) (+) (-) (-) + Gram (+), hình cầu

(-) (-) (+) (-) (-) Gram (+), hình cầu B4-6TT: tròn, trắng đục B4-7G: tròn, trắng đục B4-7T: tròn, trắng đục B4-7TT: tròn, trắng đục B4-10G: tròn, trắng đục B4-10T: tròn, trắng đục B4-10TT: tròn, trắng đục B5-1G: tròn, trắng đục B5-2TT: tròn, trắng đục B5-3T: tròn, trắng đục B5-3TT: tròn, trắng đục B5-4TT: tròn, trắng đục B5-5TT: tròn, trắng đục B5-6T: tròn, trắng đục B5-6TT: tròn, trắng đục B5-7T: tròn, trắng đục B5-7TT: tròn, trắng đục B5-8T: tròn, trắng đục B5-8TT: tròn, trắng đục B5-9T: tròn, trắng đục B5-9TT: tròn, trắng đục B5-10TT: tròn, trắng đục B6-3G: tròn, trắng đục B6-3TT: tròn, trắng đục B6-4G: tròn, trắng đục B6-4T: tròn, trắng đục B6-4TT: tròn, trắng đục

129

B 6-5 Bình thường Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

B 6-6 Bình thường B6-5T: tròn, trắng đục B6-5TT: tròn, trắng đục B6-6TT Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-) B 6-9 Bình thường Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-)

Gram (+), hình cầu (-) (-) (-) (-) (-) + +

B 6-10 Bình thường Gram (+), hình cầu (-) (-) (+) (-) (-)

(-) (-) (+) (-) (-) Gram (+), hình cầu

(-) (-) (+) (-) (-) Gram (+), hình cầu

Tổng kết B6-9G: tròn, trắng đục B6-9TT: tròn, trắng đục B6-10G: tròn, trắng đục B6-10T: tròn, trắng đục B6-10TT: tròn, trắng đục 86 chủng

G: gan; T: Thận; TT: tỳ tạng; KSD: kháng sinh đồ; GTT: giải trình tự

130

Phụ lục C.3. Kết quả định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep

NHÓM

TT CHỈ TIÊU

2 + Cầu - - - -/+

3 + Cầu - - - -/+

4 + Cầu - - - -/+

1 Nhuộm Gram 2 Hình dạng 3 Di động 4 Sinh oxidaza 5 Sinh catalaza 6 Test O-F Test API strep 7 Voges-Proskauer 8 Hippurate hydrolysis 9 Bile-esculin tolerance 10 Pyrrolidonyl arylamidase 11 Sinh α-galactosidase 12 Sinh β-glucuronidase 13 Sinh β-galactosidase 14 Alkaline phosphatase 15 Leucine AminoPeptidase 16 Arginine Dihydrolase 17 Sử dụng đƣờng Ribose Arabinose Manitol Sorbitol Lactose Trehalose Inulin Raffinose Amygdalin Glycogen

- - - - - + - + + - + - - - - + - - + -

- - - - - + - + + - + - - - - + - - - -

- - - - - - - + + + + - - - + + - - + -

1 + Cầu - - - -/+ - - - - - + - + + - + - - + + + - - + -

Nhóm 1: Gồm 21 chủng: A1F1-T; A2F1-G; A2F2-T; B3K1F2-T; B1K2F1-G;

A1F1-T; A2F3-T; A1F3; A1F4; A1F6; A1F8; A1F9; A5F4; B1-6T; B1-6TT; B2-

3TT; B2-5G; B2-6G; B2-7TT; B4-6T; B6-9TT.

Nhóm 2: Gồm 6 chủng: A2F7-T; B3F2-T; F7-T; A1F1; A1F2; B3-2G.

Nhóm 3: Gồm 3 chủng: A1F10; A2F3; B3-3T.

Nhóm 4: Gồm 2 chủng: A1F7; B2-3T

131

Phụ lục C.4 Kết quả giải mã gen và định danh vi khuẩn

1. Vi khuẩn B1-6T

Kết quả giải trình tự gen 16S

TAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCG TAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGACA ATGGAGGACTCATGTCTTTCATTTAAAAGGTGCAATTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGT TGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGA GGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGG GAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTC GAATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGA CGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTC CCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGAAGT TAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTACGCTTTGGAAACTGGAGAACTTGAGTGCAGAAGGGG AGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGA AAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATT AGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGGCCCTTTCCGGGGCT TAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACT CAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGC GAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCCTGACCGGTCTAGAGATAGGCTTTCCCTTCGGG GCAGGAGTGACAGGTGGTGCATGG Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae strain TSOD1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Sequence ID: gb|KM077497.1|Length: 1426Number of Matches: 1 Range 1: 12 to 1015GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match

Alig nment statistics fo r matc h #1

Expect 0.0

Strand Plus/Plus

Gaps 0/1004(0%)

Identities 1003/1004(99%)

Score 1849 bits(1001) Query 1 TAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGC 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 12 TAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGC 71 Query 61 GTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGA 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 72 GTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGA 131 Query 121 CAATGGAGGACTCATGTCTTTCATTTAAAAGGTGCAATTGCATCACTATGAGATGGACCT 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 132 CAATGGAGGACTCATGTCTTTCATTTAAAAGGTGCAATTGCATCACTATGAGATGGACCT 191 Query 181 GCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACC 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 192 GCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACC 251 Query 241 TGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 252 TGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC 311 Query 301 AGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAA 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 312 AGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAA 371 Query 361 GGTTTTCGAATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCA 420 |||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 372 GGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCA 431 Query 421 CCATGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 432 CCATGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT 491 Query 481 ACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTT 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 492 ACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTT 551 132

Query 541 AAGTCTGAAGTTAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTACGCTTTGGAAACTGGAGAACTTGA 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 552 AAGTCTGAAGTTAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTACGCTTTGGAAACTGGAGAACTTGA 611 Query 601 GTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGA 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 612 GTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGA 671 Query 661 ACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGG 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 672 ACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGG 731 Query 721 GAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTA 780 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 732 GAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTA 791 Query 781 GGCCCTTTCCGGGGCTTAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACG 840 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 792 GGCCCTTTCCGGGGCTTAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACG 851 Query 841 ACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGG 900 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 852 ACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGG 911 Query 901 TTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCCTGACCGGTCTAG 960 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 912 TTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCCTGACCGGTCTAG 971 Query 961 AGATAGGCTTTCCCTTCGGGGCAGGAGTGACAGGTGGTGCATGG 1004 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 972 AGATAGGCTTTCCCTTCGGGGCAGGAGTGACAGGTGGTGCATGG 1015 2. Vi khuẩn B2-5G

Kết quả giải trình tự gen 16S

AGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACG CGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATGAC AATGGAGGACTCATGTCTTTCATTTAAAAGGTGCAATTGCATCACTATGAGATGGACCTGCG TTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGA GGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGG GAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTC GGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGA CGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTC CCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGAAGT TAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTACGCTTTGGAAACTGGAGAACTTGAGTGCAGAAGGGG AGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGA AAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATT AGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGGCCCTTTCCGGGGCT TAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACT CAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGC GAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCCTGACCGGTCTAGAGATAGGCTTTCCCTTCGGG GCAGGAGTGACAGGTGGTGCATG Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae strain TSOD1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Sequence ID: gb|KM077497.1|Length: 1426Number of Matches: 1 Range 1: 10 to 1014GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match

Alig nment statistics fo r matc h #1

Identities 1005/1005(100%)

Gaps 0/1005(0%)

Expect 0.0

Strand Score 1857 bits(1005) Plus/Plus Query 1 AGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAAC 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 10 AGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAAC 69

133

Query 61 GCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCAT 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 70 GCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCAT 129 Query 121 GACAATGGAGGACTCATGTCTTTCATTTAAAAGGTGCAATTGCATCACTATGAGATGGAC 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 130 GACAATGGAGGACTCATGTCTTTCATTTAAAAGGTGCAATTGCATCACTATGAGATGGAC 189 Query 181 CTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGA 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 190 CTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGA 249 Query 241 CCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCA 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 250 CCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCA 309 Query 301 GCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAG 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 310 GCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAG 369 Query 361 AAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATC 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 370 AAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATC 429 Query 421 CACCATGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTA 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 430 CACCATGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTA 489 Query 481 ATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCT 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 490 ATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCT 549 Query 541 TTAAGTCTGAAGTTAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTACGCTTTGGAAACTGGAGAACTT 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 550 TTAAGTCTGAAGTTAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTACGCTTTGGAAACTGGAGAACTT 609 Query 601 GAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAG 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 610 GAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAG 669 Query 661 GAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTG 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 670 GAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTG 729 Query 721 GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGT 780 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 730 GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGT 789 Query 781 TAGGCCCTTTCCGGGGCTTAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTA 840 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 790 TAGGCCCTTTCCGGGGCTTAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTA 849 Query 841 CGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGT 900 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 850 CGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGT 909 Query 901 GGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCCTGACCGGTCT 960 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 910 GGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCCTGACCGGTCT 969 Query 961 AGAGATAGGCTTTCCCTTCGGGGCAGGAGTGACAGGTGGTGCATG 1005 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 970 AGAGATAGGCTTTCCCTTCGGGGCAGGAGTGACAGGTGGTGCATG 1014

134

3. Vi khuẩn B2-3TT

Kết quả giải trình tự gen 16S

AGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAG

GCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGT

AGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGATTGGCTTTAAAAGATTAGCTTGCCGTCACC

GGCTTGCGACTCGTTGTACCAACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATG

ATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATTACCGGCAGTCTCGCTAGAGTGCCCAA

CTTAATGATGGCAACTAACAATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCAC

GACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCCTGCCCCGAAGGGAAAGCCTATCT

CTAGACCGGTCAGGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACC

ACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTAC

TCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTAAGCCCCGGAAAGGGCCTAACACC

TAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTT

CGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCTTTCGCCACCGGTGTTCCTCCATATAT

CTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCCCTTCTGCACTCAAGTTCTCCAGTT

TCCAAAGCGTACAATGGTTGAGCCACTGCCTTTAACTTCAGACTTAAAGAACCGCCTGCGCT

CGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTCGGGACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCA

CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTGGTTAGTTACCGTCACA

Alig nment statistics fo r matc h #1

Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae strain TSOD1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Sequence ID: gb|KM077497.1|Length: 1426Number of Matches: 1 Range 1: 435 to 1406GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match

Strand Plus/Minus

Expect 0.0

Gaps 0/972(0%)

Identities 971/972(99%)

Score 1790 bits(969) Query 1 AGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACA 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1406 AGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACA 1347 Query 61 AGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTC 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1346 AGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTC 1287 Query 121 ATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGATTGGCTTTAAAAGATTAGCTTGCC 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||| Sbjct 1286 ATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGATTGGCTTTAAGAGATTAGCTTGCC 1227 Query 181 GTCACCGGCTTGCGACTCGTTGTACCAACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAA 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1226 GTCACCGGCTTGCGACTCGTTGTACCAACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAA 1167 Query 241 GGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATTACCGGCAGTCTCGCT 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1166 GGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATTACCGGCAGTCTCGCT 1107 Query 301 AGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAACAATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAA 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1106 AGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAACAATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAA 1047 Query 361 CCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCCTGCCCCGA 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1046 CCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCCTGCCCCGA 987 Query 421 AGGGAAAGCCTATCTCTAGACCGGTCAGGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCG 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 986 AGGGAAAGCCTATCTCTAGACCGGTCAGGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCG 927

135

Query 481 TTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAG 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 926 TTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAG 867 Query 541 TTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTAA 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 866 TTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTAA 807 Query 601 GCCCCGGAAAGGGCCTAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATC 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 806 GCCCCGGAAAGGGCCTAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATC 747 Query 661 TAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGC 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 746 TAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGC 687 Query 721 TTTCGCCACCGGTGTTCCTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCAC 780 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 686 TTTCGCCACCGGTGTTCCTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCAC 627 Query 781 TCTCCCCTTCTGCACTCAAGTTCTCCAGTTTCCAAAGCGTACAATGGTTGAGCCACTGCC 840 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 626 TCTCCCCTTCTGCACTCAAGTTCTCCAGTTTCCAAAGCGTACAATGGTTGAGCCACTGCC 567 Query 841 TTTAACTTCAGACTTAAAGAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAAC 900 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 566 TTTAACTTCAGACTTAAAGAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAAC 507 Query 901 GCTCGGGACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTGGTTA 960 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 506 GCTCGGGACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTGGTTA 447 Query 961 GTTACCGTCACA 972 |||||||||||| Sbjct 446 GTTACCGTCACA 435 4. Vi khuẩn B6-9TT

Kết quả giải trình tự gen 16S

AAGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTA

ACGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCG

CATGACAATGGAGGACTCATGTCTTTCATTTAAAAGGTGCAATTGCATCACTATGAGATG

GACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGC

CGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGA

GGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAG

TGAAGAAGGTTTTCGAATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGG

AAAATCCACCATGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGC

CGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAG

GCGGTTCTTTAAGTCTGAAGTTAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTACGCTTTGGAAACTG

GAGAACTTGAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA

TATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTC

GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAG

TGCTAGGTGTTAGGCCCTTTCCGGGGCTTAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGC

CTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG

GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTC

CTGACCGGTCTAGAGATAGGCTTTCCCTTCGGGGCAGGAGTGACAGG

136

Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae strain TSOD1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Sequence ID: gb|KM077497.1|Length: 1426Number of Matches: 1 Range 1: 9 to 1005GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match

Alig nment statistics fo r matc h #1

Expect 0.0

Gaps 0/997(0%)

Strand Identities Score 1836 bits(994) Plus/Plus 996/997(99%) Query 1 AAGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAA 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 9 AAGTAGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAA 68 Query 61 CGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCA 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 69 CGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCA 128 Query 121 TGACAATGGAGGACTCATGTCTTTCATTTAAAAGGTGCAATTGCATCACTATGAGATGGA 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 129 TGACAATGGAGGACTCATGTCTTTCATTTAAAAGGTGCAATTGCATCACTATGAGATGGA 188 Query 181 CCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCG 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 189 CCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCG 248 Query 241 ACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGC 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 249 ACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGC 308 Query 301 AGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAA 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 309 AGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAA 368 Query 361 GAAGGTTTTCGAATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAAT 420 ||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 369 GAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAAT 428 Query 421 CCACCATGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGT 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 429 CCACCATGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGT 488 Query 481 AATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTC 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 489 AATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTC 548 Query 541 TTTAAGTCTGAAGTTAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTACGCTTTGGAAACTGGAGAACT 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 549 TTTAAGTCTGAAGTTAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTACGCTTTGGAAACTGGAGAACT 608 Query 601 TGAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGA 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 609 TGAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGA 668 Query 661 GGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGT 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 669 GGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGT 728 Query 721 GGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTG 780 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 729 GGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTG 788 Query 781 TTAGGCCCTTTCCGGGGCTTAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGT 840 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 789 TTAGGCCCTTTCCGGGGCTTAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGT 848 Query 841 ACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATG 900 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 849 ACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATG 908

137

Query 901 TGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCCTGACCGGTC 960 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 909 TGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCCTGACCGGTC 968 Query 961 TAGAGATAGGCTTTCCCTTCGGGGCAGGAGTGACAGG 997 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 969 TAGAGATAGGCTTTCCCTTCGGGGCAGGAGTGACAGG 1005 5. Vi khuẩn A1F1 Kết quả giải trình tự gen 16S TAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATCAAGTA GAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGTGTGAGTAAC GCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACC GCATAAAAGTGTTTAACCCATGTTAAACATTTAACAGGTGCAACTGCATCACTATG AGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACG ATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCA GACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACC GAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTCTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAG AAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGACGGTAAATAACCAGAAAGG GACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGGGGTAATACGTAGGTCCCGAGCTTTGTCCG GATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGAAGTTAAAGGCA GTGGCT CAAC

Strand Plus/Plus

Expect 0.0

Gaps 0/613(0%)

Streptococcus dysgalactiae 16S ribosomal RNA, partial sequence Sequence ID: gb|AF433167.1|AF433167Length: 1466Number of Matches: 1 Identities Score 1099 bits(595) 607/613(99%) Query 12 CCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACT 71 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1 CCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACT 60 Query 72 GGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGTGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTC 131 |||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 61 GGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTC 120 Query 132 ATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGTGTTTAACCCATG 191 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 121 ATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGTGTTTAACCCATG 180 Query 192 TTAAACATTTAACAGGTGCAACTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAG 251 |||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 181 TTAAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAG 240 Query 252 TTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGC 311 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 241 TTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGC 300 Query 312 CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGG 371 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 301 CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGG 360 Query 372 CAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTCTCGGATCGTAA 431 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| Sbjct 361 CAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAA 420 Query 432 AGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGACGGTAAAT 491 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| | Sbjct 421 AGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGACGGTAACT 480 Query 492 AACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGGGGTAATACGTAGGTCCCGAGCT 551 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| Sbjct 481 AACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCG 540

138

Query 552 TTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGAAGTTAAAG 611 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 541 TTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGAAGTTAAAG 600 Query 612 GCAGTGGCTCAAC 624 ||||||||||||| Sbjct 601 GCAGTGGCTCAAC 613

Strand Plus/Plus

Expect 0.0

Gaps 0/535(0%)

6. Vi khuẩn A1F2 Kết quả giải trình tự gen 16S TAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGT AGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTTA CGCGTAGGTAACCTACCTCATACCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATAC CGCATAGAAGTGTTTAACCCATGTTAAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTAT GAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGAC GATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC AGACT CCTACGGGAG GCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGAC CGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGA GAAG AATGAAGGTG GGATTGGAAA ATCCACCATG TGACGGTAACTTACCAGAAA GGGAGGGCTA ACTACGTGCC AGCAACCGCG GTTATACGTA GGTCCC Streptococcus dysgalactiae 16S ribosomal RNA, partial sequence Sequence ID: gb|AF433167.1|AF433167Length: 1466Number of Matches: 1 Identities Score 939 bits(508) 526/535(98%) Query 12 CCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACT 71 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1 CCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACT 60 Query 72 GGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTTACGCGTAGGTAACCTACCTC 131 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||| Sbjct 61 GGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTC 120 Query 132 ATACCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAGAAGTGTTTAACCCATG 191 ||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||| Sbjct 121 ATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGTGTTTAACCCATG 180 Query 192 TTAAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAG 251 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 181 TTAAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAG 240 Query 252 TTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGC 311 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 241 TTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGC 300 Query 312 CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGG 371 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 301 CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGG 360 Query 372 CAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAA 431 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 361 CAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAA 420 Query 432 AGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGAAGGTGGGATTGGAAAATCCACCATGTGACGGTAACT 491 |||||||||||||||||||||||| ||||||| ||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 421 AGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGACGGTAACT 480 Query 492 TACCAGAAAGGGAGGGCTAACTACGTGCCAGCAACCGCGGTTATACGTAGGTCCC 546 |||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||| ||||||||||||| Sbjct 481 AACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCC 535

139

Expect 0.0

Strand Plus/Plus

Gaps 0/601(0%)

Identities 597/601(99%)

7. Vi khuẩn A1F4 Kết quả giải trình tự gen 16S TAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGT AGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTA ACGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATA CCGCATAAAAGTGTTTAACCAATGTTTAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTAT GAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGAC GATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC AGACTCCTACGGAAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGAC CGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGA GAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGACGGTAACTAACCAGAAAG GGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCGGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCC GGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGAAGTTAAAGG Streptococcus dysgalactiae 16S ribosomal RNA, partial sequence Sequence ID: gb|AF433167.1|AF433167Length: 1466Number of Matches: 1 Score 1088 bits(589) Query 12 CCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACT 71 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1 CCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACT 60 Query 72 GGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTC 131 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 61 GGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTC 120 Query 132 ATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGTGTTTAACCAATG 191 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||| Sbjct 121 ATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGTGTTTAACCCATG 180 Query 192 TTTAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAG 251 || ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 181 TTAAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAG 240 Query 252 TTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGC 311 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 241 TTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGC 300 Query 312 CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGAAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGG 371 |||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||| Sbjct 301 CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGG 360 Query 372 CAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAA 431 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 361 CAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAA 420 Query 432 AGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGACGGTAACT 491 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 421 AGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGACGGTAACT 480 Query 492 AACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCGGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCG 551 ||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||| Sbjct 481 AACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCG 540 Query 552 TTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGAAGTTAAAG 611 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 541 TTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGAAGTTAAAG 600 Query 612 G 612 | Sbjct 601 G 601

140

Expect 0.0

Strand Plus/Plus

Gaps 0/602(0%)

Identities 597/602(99%)

8. Vi khuẩn A1F6 Kết quả giải trình tự gen 16S CATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGTGTTTAAC CCATGTTAAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGTTGT ATTAGCTAGTTAGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGA GAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCA GCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGTGTGAGT GAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGT GGAAAATCCACCATGTGACGGTAACTAACCAGAAAGGGACAGCTAACTACGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAG CGAGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGAAGTTAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTAC GCTCTGGAAACTGGAGAACTTGAGTGCAGAAGGAGAGAGTGGAATTCCATGTGTA GCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAA GC Streptococcus dysgalactiae 16S ribosomal RNA, partial sequence Sequence ID: gb|AF433167.1|AF433167Length: 1466Number of Matches: 1 Score 1085 bits(587) Query 1 CATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGTGTTTAACCCAT 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 120 CATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGTGTTTAACCCAT 179 Query 61 GTTAAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTA 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 180 GTTAAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTA 239 Query 121 GTTAGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGG 180 ||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 240 GTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGG 299 Query 181 CCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCG 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 300 CCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCG 359 Query 241 GCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGTGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTA 300 |||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 360 GCAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTA 419 Query 301 AAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGACGGTAAC 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 420 AAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGACGGTAAC 479 Query 361 TAACCAGAAAGGGACAGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGC 420 ||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 480 TAACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGC 539 Query 421 GTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGAAGTTAAA 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 540 GTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTCTTTAAGTCTGAAGTTAAA 599 Query 481 GGCAGTGGCTCAACCATTGTACGCTCTGGAAACTGGAGAACTTGAGTGCAGAAGGAGAGA 540 ||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| |||| Sbjct 600 GGCAGTGGCTCAACCATTGTACGCTTTGGAAACTGGAGAACTTGAGTGCAGAAGGGGAGA 659 Query 541 GTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAA 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 660 GTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAA 719 Query 601 GC 602 || Sbjct 720 GC 721

141

Expect 0.0

Strand Plus/Plus

Gaps 0/564(0%)

Identities 562/564(99%)

9. Vi khuẩn A1F9 Kết quả giải trình tự gen 16S TAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGT AGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTA ACGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATA CCGCATAAAAGTGTTTAACCCATGTTAAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTA TGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGA CGAAACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCC CAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGATTCTTCGGCAATGGACGGAAGTCTGAC CGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGA GAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGACGGTAACTAACCAGAAAG GGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCC GGA TTTATTGGGC GTAAA Streptococcus dysgalactiae 16S ribosomal RNA, partial sequence Sequence ID: gb|AF433167.1|AF433167Length: 1466Number of Matches: 1 Score 1031 bits(558) Query 12 CCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACT 71 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1 CCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACT 60 Query 72 GGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTC 131 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 61 GGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTC 120 Query 132 ATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGTGTTTAACCCATG 191 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 121 ATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGTGTTTAACCCATG 180 Query 192 TTAAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAG 251 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 181 TTAAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAG 240 Query 252 TTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGAAACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGC 311 ||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 241 TTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGC 300 Query 312 CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGATTCTTCGG 371 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||| Sbjct 301 CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGG 360 Query 372 CAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAA 431 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 361 CAATGGACGGAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAA 420 Query 432 AGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGACGGTAACT 491 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 421 AGCTCTGTTGTTAGAGAAGAATGATGGTGGGAGTGGAAAATCCACCATGTGACGGTAACT 480 Query 492 AACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCG 551 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 481 AACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCG 540 Query 552 TTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAA 575 |||||||||||||||||||||||| Sbjct 541 TTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAA 564

142

Expect 3e-158

Gaps 0/334(0%)

Strand Plus/Plus

10. Vi khuẩn A5F4 Kết quả giải trình tự gen 16S TAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGT AGAACGCTGAGGACTGGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGGACGGGTGAGTAC CGCGTAGGTAACCTACCTCATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATAC CGCATAAAAGTGTTTAACCCATGTTAAACATTTACAAGGTGCAACTGCATCACTAT GAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAAGTAACGGCTCACCAAGGTGAC GATACATAGCCGACCTGAGAGAGTGATCGGCCAAACTGGGACTGAAACACGGCCC AGCCT CCTAC Streptococcus dysgalactiae 16S ribosomal RNA, partial sequence Sequence ID: gb|AF433167.1|AF433167Length: 1466Number of Matches: 1 Identities Score 568 bits(307) 325/334(97%) Query 12 CCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACT 71 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1 CCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAGGACT 60 Query 72 GGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGGACGGGTGAGTACCGCGTAGGTAACCTACCTC 131 |||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| ||||||||||||||||||| Sbjct 61 GGTGCTTGCACCGGTCCAAGGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTACCTC 120 Query 132 ATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGTGTTTAACCCATG 191 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 121 ATAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAAAAGTGTTTAACCCATG 180 Query 192 TTAAACATTTACAAGGTGCAACTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAG 251 ||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 181 TTAAACATTTAAAAGGTGCAACTGCATCACTATGAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAG 240 Query 252 TTGGTGAAGTAACGGCTCACCAAGGTGACGATACATAGCCGACCTGAGAGAGTGATCGGC 311 ||||||| ||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||| ||||||||| Sbjct 241 TTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGC 300 Query 312 CAAACTGGGACTGAAACACGGCCCAGCCTCCTAC 345 || ||||||||||| ||||||||||| ||||||| Sbjct 301 CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTAC 334

143

Phụ lục C.5 Kết quả quan sát mẫu mô cá bống kèo

Cá

Mang

Gan

Thận

Ao ĐỢT 1 1

Sung huyết tĩnh mạch gan, biến đổi cấu trúc mô

Sung huyết và xuất huyết vùng mô, quản cầu thận biến đổi cấu trúc, phình to hoặc teo nhỏ và nhiễm khuẩn

A1F1 A1F2 A1F3 A1F4 A1F5

2

Sợi mang thứ cấp dính lại, biến đổi cấu trúc phiến mang, tăng sinh tế bào biểu mô, có hiện tượng nhiễm khuẩn, động mạch vào sợi mang thứ cấp bị sung huyết Sợi mang thứ cấp dính lại, sợi mang thứ cấp phình to hoặc thoái hóa và ngắn lại

Sung huyết tĩnh mạch gan, biến đổi cấu trúc mô

Sung huyết và xuất huyết vùng mô, quản cầu thận biến đổi cấu trúc, phình to hoặc teo nhỏ và nhiễm khuẩn

3

Biến đổi cấu trúc mô

Sợi mang thứ cấp dính lại, sợi mang thứ cấp phình to hoặc thoái hóa và ngắn lại

Sung huyết và xuất huyết vùng mô, quản cầu thận biến đổi cấu trúc, phình to hoặc teo nhỏ và nhiễm khuẩn

4

Biến đổi cấu trúc mô

Sung huyết và xuất huyết vùng mô.

Sợi mang thứ cấp dính lại, sợi mang thứ cấp phình to hoặc thoái hóa và ngắn lại

Sợi mang thứ cấp dính lại

Biến đổi cấu trúc mô

Sung huyết và xuất huyết vùng mô.

A2F1 A2F2 A2F3 A2F4 A2F5 A2F6 A2F7 A2F8 A2F9 A2F10 A3F1 A3F2 A3F3 A3F4 A3F5 A3F6 A3F7 A3F8 A3F9 A3F10 A4F1 A4F2 A4F3 A4F4 A4F5 A4F6 A4F8 A4F9 A4F10

ĐỢT 2 1

Sợi mang thứ cấp dính lại

Biến đổi cấu trúc mô

Sung huyết và xuất huyết vùng mô.

Sợi mang thứ cấp dính lại

Biến đổi cấu trúc mô

Sung huyết và xuất huyết vùng mô.

A6F1 A6F2 A6F3 A6F4 A6F6 A6F7 A6F8

144

2

Sung huyết tĩnh mạch gan, biến đổi cấu trúc mô

Sung huyết và xuất huyết vùng mô, quản cầu thận biến đổi cấu trúc, phình to hoặc teo nhỏ và nhiễm khuẩn

Sợi mang thứ cấp dính lại, biến đổi cấu trúc phiến mang, tăng sinh tế bào biểu mô, có hiện tượng nhiễm khuẩn, động mạch vào sợi mang thứ cấp bị sung huyết

A6F9 A6F10 A7F1 A7F2 A7F3 A7F4 A7F5 A7F6 A7F7 A7F8 A7F9 A7F10 A8F5

3

A9F4

4

Sợi mang thứ cấp dính lại Sợi mang thứ cấp dính lại

Biến đổi cấu trúc mô Biến đổi cấu trúc mô

Sung huyết và xuất huyết vùng mô. Sung huyết và xuất huyết vùng mô.

ĐỢT 3 1

Sợi mang thứ cấp dính lại

Biến đổi cấu trúc mô

Sung huyết và xuất huyết vùng mô.

Sợi mang thứ cấp dính lại

A10-1 A10-2 A10-3 A10-6 A10-7 A10-10 Sợi mang thứ cấp dính

2

A11-1

lại Sợi mang thứ cấp dính lại

Biến đổi cấu trúc mô Biến đổi cấu trúc mô Biến đổi cấu trúc mô

Sung huyết và xuất huyết vùng mô. Sung huyết và xuất huyết vùng mô. Sung huyết và xuất huyết vùng mô.

Sợi mang thứ cấp dính lại

Biến đổi cấu trúc mô

Sung huyết và xuất huyết vùng mô.

3

Sợi mang thứ cấp dính lại

Biến đổi cấu trúc mô

Sung huyết và xuất huyết vùng mô.

Sợi mang thứ cấp dính lại

Biến đổi cấu trúc mô

Sung huyết và xuất huyết vùng mô.

A11-3 A11-4 A11-5 A11-6 A11-7 A11-8 A11-9 A11-10 A12-1 A12-2 A12-3 A12-4 A12-6 A12-7 A12-8 A12-9 A12-10

ĐỢT 4 1

Sợi mang thứ cấp dính lại, biến đổi cấu trúc phiến mang, tăng sinh tế bào biểu mô, có hiện

Sung huyết tĩnh mạch gan, biến đổi cấu trúc mô

Sung huyết và xuất huyết vùng mô, quản cầu thận biến đổi cấu trúc, phình to hoặc teo

B1-1 B1-2 B1-3 B1-4

145

nhỏ và nhiễm khuẩn

tượng nhiễm khuẩn, động mạch vào sợi mang thứ cấp bị sung huyết

B1-5 B1-6 B1-7 B1-8 B1-9 B1-10 B2-1

2

Biến đổi cấu trúc mô Biến đổi cấu trúc mô

Sung huyết và xuất huyết vùng mô. Sung huyết và xuất huyết vùng mô.

Sợi mang thứ cấp dính lại Sợi mang thứ cấp dính lại, sợi mang thứ cấp phình to hoặc thoái hóa và ngắn lại

3

Biến đổi cấu trúc mô

Sung huyết và xuất huyết vùng mô.

Sợi mang thứ cấp dính lại, sợi mang thứ cấp phình to

4

Biến đổi cấu trúc mô

Sung huyết và xuất huyết vùng mô.

Sợi mang thứ cấp dính lại, sợi mang thứ cấp phình to

5

Sung huyết tĩnh mạch gan, biến đổi cấu trúc mô

Sung huyết và xuất huyết vùng mô, quản cầu thận biến đổi cấu trúc, phình to hoặc teo nhỏ và nhiễm khuẩn

Sợi mang thứ cấp dính lại, biến đổi cấu trúc phiến mang, tăng sinh tế bào biểu mô, có hiện tượng nhiễm khuẩn, động mạch vào sợi mang thứ cấp bị sung huyết

6

Biến đổi cấu trúc mô

Sung huyết và xuất huyết vùng mô.

Sợi mang thứ cấp dính lại, sợi mang thứ cấp phình to

Biến đổi cấu trúc mô

Sung huyết và xuất huyết vùng mô.

B2-3 B2-4 B2-5 B2-6 B2-7 B2-8 B2-9 B2-10 B3-1 B3-2 B3-3 B3-4 B4-1 B4-2 B4-3 B4-4 B4-5 B4-6 B4-7 B5-1 B5-2 B5-3 B5-4 B5-5 B5-6 B5-7 B5-8 B5-9 B5-10 B6-3 B6-4 B6-5 B6-6 B6-9 B6-10

Sợi mang thứ cấp dính lại, sợi mang thứ cấp phình to

Ký hiệu: A: ao cá bệnh, F: cá; T: Thận, G: gan; TT: tỳ tạng ; K: ao cá khỏe

146

Phụ lục C.6 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm

B6-9TT

Đối chứng L2

L3

L1

B1-6T L2

L3

L1

L3

L1

B2-3TT L2

L1

B2-5G L2

L3

L1

L2

L3

Ngày

10

10

10

10

10

0

0

0

0

0

1

0

0

0

0

4

1

2

1

1

6

2

6

5

3

8

6

7

6

4

9

7

8

7

8

1 2 3 4 5 6 7

10 1 1 1 1 1 1 1

10 2 2 2 2 2 2 2

10 0 1 3 5 6 7 7

10 0 0 2 4 5 7 8

10 0 0 1 4 6 7 7

10 0 0 2 4 7 8 8

10 0 0 3 5 7 9 9

9

7

8

7

8

22

Tổng cá chết Tỷ lệ (%)

10 1 1 1 1 1 1 1 4 13,3

10 0 0 2 4 5 7 8 23 76,7

10 0 0 1 3 5 6 7 22 73,3

26 86,7

73,3

147

Phụ lục C.7 Kết quả thí nghiệm LD50

Số liệu cá thí nghiệm LD50 với chủng vi khuẩn B1-6T

Ngiệm thức 1 Ngiệm thức 2 Ngiệm thức 3 Ngiệm thức 4 Ngiệm thức 5 Ngiệm thức 6 Ngiệm thức 7 Đối chứng

L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3

Ngày 20 20 20 20 20 20 20 20

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 3 1 1 1 1

3 1 3 6 3 2 1 2

5 4 6 11 10 3 2 2

9 7 12 16 15 3 2 2

11 13 14 18 19 3 2 2

12 14 16 18 19 3 2 2

14 15 17 18 19 3 2 2

15 16 17 18 19 3 2 2

15 16 17 18 19 3 2 2

15 16 17 18 19 3 2 2

15 16 17 18 19 3 2 2

15 16 17 18 19 3 2 2

20 0 0 1 3 5 6 7 7 7 7 7 7 7 7 20 0 1 2 4 5 6 8 9 9 9 9 9 9 9 20 0 0 1 3 4 5 6 7 7 7 7 7 7 7 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 20 0 1 2 5 7 11 13 13 13 13 13 13 13 13 20 0 0 1 1 2 5 8 8 8 8 8 8 8 8 20 0 1 2 3 4 8 8 8 8 8 8 8 8 8 20 0 0 2 5 8 11 12 13 13 13 13 13 13 13 20 0 1 4 6 8 9 9 9 9 9 9 9 9 9 20 0 0 2 4 5 7 8 8 8 8 8 8 8 8 20 0 1 2 7 13 14 16 16 16 16 16 16 16 16 20 0 1 3 5 10 13 15 16 16 16 16 16 16 16 20 0 0 2 5 7 10 11 12 12 12 12 12 12 12 20 0 1 6 11 15 16 16 16 16 16 16 16 16 16 20 0 4 6 9 12 13 15 15 15 15 15 15 15 15 20 0 4 5 10 13 15 16 16 16 16 16 16 16 16 20 0 2 5 10 14 17 18 18 18 18 18 18 18 18 15 16 17 18 19 3 2 2

29 30 44 47 Tổng cá chết 23 49 54 7

50 48,3 38,3 73,3 78,3 81,7 90 11,67

Tỷ lệ (%) Nghiệm thức 1: 4,25 x 102 CFU/ml; Nghiệm thức 2: 4,25 x 103 CFU/ml; Nghiệm thức 3: 4,25 x 104 CFU/ml; Nghiệm thức 4: 4,25 x 105 CFU/ml; Nghiệm thức 5: 4,25 x 106 CFU/ml; Nghiệm thức 6: 4,25 x 107 CFU/ml; Nghiệm thức 7: 4,25 x 108 CFU/ml; Nghiệm thức đối chứng: cá tiêm nước muối sinh lý. Số liệu cá thí nghiệm LD50 với chủng vi khuẩn B2-5G

Ngiệm thức 1 Ngiệm thức 2 Ngiệm thức 3 Ngiệm thức 5 Ngiệm thức 6 Ngiệm thức 7 Đối chứng Ngiệm thức 4

L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3

Ngày 20 20 20 20 20 20 20 20

0 0 0 0 0 0 0 0

2 0 1 0 1 1 1 1

4 2 3 4 2 1 2 2

8 4 7 10 6 2 2 3

13 8 9 14 9 2 2 3

16 11 15 16 12 2 2 3

18 15 16 19 16 2 2 3

19 16 17 20 16 2 2 3

19 16 17 20 16 2 2 3

19 16 17 20 16 2 2 3

20 0 0 2 3 4 6 11 12 12 12 12 20 0 0 2 3 4 7 9 9 9 9 9 20 0 0 1 3 6 8 8 8 8 8 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 20 1 1 2 2 3 5 7 10 10 10 10 20 0 1 2 5 7 9 12 13 13 13 13 20 0 0 1 2 3 6 10 12 12 12 12 20 1 1 2 4 7 9 11 11 11 11 11 20 0 2 2 3 6 8 12 14 14 14 14 20 0 3 8 10 11 12 13 13 13 13 13 20 0 1 2 6 10 12 14 16 16 16 16 20 0 0 2 3 7 8 10 11 13 13 13 20 0 1 2 2 4 7 10 12 13 13 13 20 0 0 5 8 8 9 9 10 11 14 15 20 0 0 4 6 8 9 13 13 13 13 13 20 0 2 4 8 12 14 15 15 15 15 15 20 0 0 1 4 7 9 13 14 14 14 14 19 16 17 20 16 2 2 3

148

16 17 16 2 19 20 3 2

16 17 16 2 19 20 3 2

12 13 14 12 12 12 9 9 9 8 8 8 10 10 10 13 13 13 14 14 14 13 13 13 12 12 12 11 11 11 13 13 13 16 16 16 13 14 14 16 17 17 15 15 15 14 14 14 16 17 16 2 19 20 3 2 13 13 13

29 35 38 43 49 53 7 45

48,33 58,33 63,33 71,67 81,67 88,33 11,67 75 Tổng cá chết Tỷ lệ chết (%)

Nghiệm thức 1: 3,5 x 102 CFU/ml; Nghiệm thức 2: 3,5 x 103 CFU/ml; Nghiệm thức 3: 3,5 x 104 CFU/ml; Nghiệm thức 4: 3,5 x 105 CFU/ml; Nghiệm thức 5: 3,5 x 106 CFU/ml; Nghiệm thức 6: 3,5 x 107 CFU/ml; Nghiệm thức 7: 3,5 x 108 CFU/ml; Nghiệm thức đối chứng: cá tiêm nước muối sinh lý. Phụ lục C.8. Kết quả thí nghiệm điều trị

NT1

NT2

NT3

NT4

NT5

NT6

NT7

Ngày thí nghiệm

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

2

0

0

0

1

1

0

0

1

1

1

0

0

0

0

0

0

1

0

1

1

0

3

1

1

3

2

2

3

2

5

4

4

0

1

0

1

0

0

2

2

3

4

3

4

2

4

3

2

3

3

3

4

5

4

1

0

0

0

1

0

3

4

2

2

3

5

3

2

2

2

2

1

2

4

3

4

0

0

1

0

0

0

1

2

1

1

2

6

1

1

0

1

1

2

1

2

3

2

0

0

0

0

0

0

1

0

1

0

1

7

1

1

0

1

0

1

0

1

2

2

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

8

0

0

0

0

0

0

0

1

1

1

0

0

0

0

0

0

1

1

0

1

0

9

0

0

1

0

0

0

0

1

0

2

0

0

0

0

0

0

0

1

1

0

0

10

0

0

0

0

0

0

0

1

2

0

0

0

0

0

0

0

1

0

0

0

0

11

0

0

1

0

0

0

0

0

0

1

0

0

0

0

0

0

0

1

0

0

0

12

0

0

0

1

0

0

0

1

0

1

0

0

0

0

0

0

0

0

1

0

0

13

0

0

0

0

0

0

0

0

1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

14

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

15

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

16

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

17

0

0

0

0

0

0

0

0

1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

18

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

19

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

20

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

21

0

0

1

1

1

1

1

0

10

9

9

8

9

8 21

23

23

10

11

10

10

9

10

20

19

20

20 21

20

20 21 21

22 21

22

9

7

7

29

29

29

29

29

30

Tổng cộng cá chết Số cá còn lại Tỉ lệ cá chết %

33,33 36,67 33,33 30 30

26,67 30 33,33 33,33 30 33,33 26,67 70

76,67

76,67

3,33

3,33

3,33

3,33

3,33

0

149

66,67 63,33 66,67 70 70

73,33 70 66,67 66,67 70 66,67 73,33 30

23,33

23,33 96,67 96,67 96,67

96,67

96,67

100

Tỉ lệ cá sống (%)

NT1: cá được gây cảm nhiễm và cho ăn thức ăn trộn kháng sinh DO nguyên liệu từ ngày thứ 3 và cho ăn liên tục trong 05 ngày NT2: cá được gây cảm nhiễm và cho ăn thức ăn trộn kháng sinh DO thành phẩm từ ngày thứ 3 và cho ăn liên tục trong 05 ngày NT3: cá được gây cảm nhiễm và cho ăn thức ăn trộn kháng sinh FFC nguyên liệu từ ngày thứ 3 và cho ăn liên tục trong 05 ngày NT4: cá được gây cảm nhiễm và cho ăn thức ăn trộn kháng sinh FFC thành phẩm từ ngày thứ 3 và cho ăn liên tục trong 05 ngày NT5: cá được gây cảm nhiễm và cho ăn thức ăn không trộn thuốc NT6: cá được tiêm nước muối sinh lý và cho ăn thức ăn không trộn thuốc NT7: cá không được gây cảm nhiễm, không tiêm nước muối sinh lý và cho ăn thức ăn không trộn kháng sinh

150