zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Khoa Học Tự Nhiên

Bài giảng Xu hướng phát triển thực phẩm: Các phương pháp xác định GMO/GMF

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:25

Báo xấu

5
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng "Xu hướng phát triển thực phẩm: Các phương pháp xác định GMO/GMF" trình bày các nội dung chính sau: Các phương pháp xác định GMO/GMF; Cơ sở xác định GMO/GMF; Các bước phân tích GMO/GMF;... Mời quý thầy cô và các em cùng tham khảo bài giảng!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Xu hướng phát triển thực phẩm: Các phương pháp xác định GMO/GMF

5/13/2016 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH GMO/GMF Nguyễn Tiến Thành April, 2015 Nội dung chính 1. Tại sao phải xác định/phát hiện GMO 2. Xác định GMO dựa trên cơ sở nào? 3. Các phương pháp xác định 1
5/13/2016 TẠI SAO PHẢI PHÁT HIỆN GMO TẠI SAO? • Xem sự kiện được chứng nhận hay chưa ở nước sở tại • Xác nhận sản phẩm hữu cơ/GMF • Liên quan tới dán nhãn • Liên quan tới việc nghiên cứu phát triển giống mới: tính ổn định di truyền, đánh giá khả năng phát tán gen vào môi trường… 2
5/13/2016 Sự khác biệt về mặt di truyền giữa GMO và đối chứng non-GMO • GMO = non GMO + đoạn gen được chuyển vào (chèn vào) Đoạn chèn nguyên vẹn (giữ chức Đoạn chèn có thể bị biến đổi  mất năng dự kiến) nhưng có thể chèn tại chức năng dự kiến, ví dụ kháng nhiều vị trí khác nhau thuốc trừ cỏ) 1 cá thể được chọn cuối cùng (dựa trên các Các cá thể mang những đoạn ưu thế) để phát triển tiếp. Trong cá thể này, chèn này sẽ bị loại bỏ (môi vị trí chèn của đoạn chèn là cụ thể và đặc trường chọn lọc…) trưng (sự kiện chuyển gen). Đoạn gen chuyển trong GMO hoạt động/biến đổi như thế nào Đoạn ADN chuyển lai tạo, sinh sản thành thế hệ con cái và sản phẩm (mang đoạn chèn nguyên vẹn hoặc protein biểu hiện có thể bị biến đổi) tương ứng Thức ăn trực tiếp cho sinh vật khác: chuột, động vật, sâu bọ (ADN, protein bị biến đổi?) Sản phẩm chế biến  ADN, Phát tán ra môi trường, protein bị biến đổi, có mặt trong sang sinh vật khác (ví dụ sản phẩm cuối hay không? phấn hoa sang cây trồng khác) Sản phẩm không qua chế biến (có mặt ADN, protein) 3
5/13/2016 Sự biến đổi đoạn AND chuyển chèn và protein tương ứng • Trong GMO: • ADN đoạn chèn tồn tại ở mọi tế bào trên mọi bộ phận • Protein tương ứng được biểu hiện không đồng đều và phụ thuộc tác động bên ngoài (môi trường, điều kiện dinh dưỡng) • Từ GMO khi qua quá trình chế biến, ADN và protein có thể giữ nguyên, bị biến đổi hoặc phân giải hoàn toàn tới sản phẩm cuối cùng. Trong GMO và các sản phẩm có chứa GMO có thể còn tồn tại ADN ngoại lai chèn vào và sản phẩm protein tương ứng của nó  phát hiện GMO/sản phẩm chứa GMO thông qua sự có mặt của 2 đối tượng này Tại sao phải kiểm tra GMO ? • Đánh giá sự di truyền qua các thế hệ: ổn định hay không? • Đánh giá khả năng phát tán gen trôi gen? • Kiểm tra xem trong lô sản phẩm có mang sự kiện được chứng nhận an toàn ở nước sở tại hay chưa. • Dán nhãn sản phẩm 4
5/13/2016 Các bước phân tích GMO Sản phẩm nghi Không được sử dụng chứa GMO? tại nước sở tại Chưa Không Kiểm tra GMO hay không phải GMO? Sự kiện được Có chứng nhận AT chưa? Rồi Định lượng Dán nhãn hay không? Quy trình quyết định dán nhãn sản phẩm hay không? (ví dụ ở ÚC) 5
5/13/2016 Các vấn đề cần quan tâm với một phương pháp kiểm tra GMO/GMF • Mục đích phép kiểm tra: định tính hay định lượng? • Chi phí: tăng lên khi độ chính xác yêu cầu tăng • Sản phẩm ở dạng gì: nguyên liệu, sản phẩm trung gian, hay sản phẩm cuối: • Sản phẩm là đồng nhất hay không? Sản phẩm đồng nhất cho phép độ chính xác cao hơn, quyết định cỡ mẫu… Phân loại nhóm phương pháp • Theo mục đích • Định tính: sàng lọc GMO, xác định gen chuyển và sự kiện chuyển gen là gì? • Định lượng • Theo đối tượng xác định • Dựa trên protein • Dựa trên DNA 6
5/13/2016 Phương pháp định tính sàng lọc • Trả lời câu hỏi: YES /NO • Xác định phổ các sự kiện biến đổi gen nhưng không xác định cụ thể được gen chuyển sử dụng và sự kiện. • Thường dựa trên các trình tự phổ biến cùng được dùng trong các sự kiện chuyển gen như promoter 35S, trình tự kết thúc Nos 3. 80% các sự kiện chuyển gen sử dụng 2 trình tự này. Phương pháp định tính xác định • Gen chuyển là gì: Dựa trên gen chính được chuyển vào cây trồng chủ: ví dụ gen cry1b (tạo δ-endotoxin) từ vi khuẩn Bt đưa vào ngô kháng sâu cánh vẩy  xác định qua ADN là gen cry1b hoặc qua protein là δ- endotoxin (B) • Cấu trúc đoạn chèn: thường dựa trên ADN là vùng giữa promoter hoặc Terminator với gen chuyển (B) • Xác định sự kiện chuyển gen: dựa trên ADN vùng tiếp giáp giữa đoạn chèn và hệ gen sinh vật chủ (C) 7
5/13/2016 Phương pháp định lượng • Xác định số lương tuyệt đối GMO có mặt trong sản phẩm hoặc tỷ lệ tương đối GMO trong tổng số lượng sản phẩm (để dán nhãn). • Các phương pháp có thể dựa trên ADN hay protein Giới hạn phát hiện (LOD) • Thể hiện độ nhạy của phương pháp xác định • Là ngưỡng mà phương pháp sử dụng có thể phát hiện được: ví dụ LOD 1%, trên 1% mới có thể phát hiện được. • Xác định LOD cho sản phẩm chứa nhiều thành phần khác nhau sẽ phức tạp hơn: • tỷ lệ GMO sử dụng thấp hơn rất nhiều, ví dụ bánh sử dụng bột đậu nành 1%, trong đó có 1% trong lượng bột đậu nành là đậu nành chuyển gen  0.01 % trong khối lượng bánh. • Sử dụng thông qua ADN, protein: khi tách chiết từ mẫu, sẽ có ADN và protein từ thành phần khác không phải là cùng loại nguyên liệu: ví dụ từ ngô, đậu nành, bột mì, ADN tổng từ 3 nguồn khác nhau 8
5/13/2016 Giới hạn phát hiện (LOD) • Ở Úc: mặc dù luật dán nhãn là ngưỡng tính theo từng thành phần, nhưng có thể thông qua tỷ lệ/tổng số để quyết định dán nhãn hay không? • Ví dụ: nếu đặt ngưỡng dán nhãn là 1% trên tổng sản phẩm thì nếu 1 nguyên liệu GM dưới 1% tổng sản phẩm  không cần kiểm tra. • Và LOD của phương pháp cần đảm bảo ít nhất là 0.01% Giới hạn phát hiện (LOD) • Ở Nhật: ngưỡng dán nhãn là 5% trên tổng sản phẩm • Đậu tương: sản phẩm dạng bột đậu tương ; nếu chiếm 5% trong số đậu tương hạt là GM  dán nhãn • Bột Đậu tương làm bánh (bao gồm cả bột nguyên liệu khác): tính trên tổng khối lượng bánh: nếu lượng đậu tương chuyển gen dưới chiếm dưới 5% không phải dán nhãn (mặc dù có thể sử dụng toàn bộ là đậu tương chuyển gen). • Nếu ngưỡng dán nhãn 5% trong tổng số sản phẩm, và lượng nguyên liệu sử dụng là 5% trong tổng số sản phẩm, thì LOD yêu cầu ít nhất = 0.25%. 9
5/13/2016 Nhóm các phương pháp dựa trên protein • Xác định dựa trên đặc tính kích thước, pH: chạy điện di SDS 1 chiều, 2 chiều để phân tách protein thành các băng riêng biệt, sau đó có thể xác định tiếp bằng cách phương pháp khác • Nhóm phương pháp sử dụng phản ứng miễn dịch bằng kháng thể (antibody) • ELISA • Sắc ký miễn dịch ELISA – nguyên tắc • Mỗi protein thường có các kháng thể đặc hiệu cho nó (liên kết với protein) do đó có thể sử dụng các kháng thể đặc hiệu để phát hiện protein đó. • Enzyme Linked Immunosorbent Assay: phản ứng miễn dịch liên kết enzyme 10
5/13/2016 ELISA - kết quả Cơ chất S được chuyển hoá bởi Enzyme tạo ra các sản phẩm có màu (hấp phụ UV vis)  định lượng sản phẩm  lượng protein ELISA – ưu điểm • Chuẩn bị mẫu không phức tạp Nhanh (2-4 tiếng, bao gồm chuẩn bị mẫu) • Sử dụng tốt cho định tính và bán định lượng • Chi phí rẻ (AUS$10-50) • Phương pháp thực hiện đơn giản • Có tính kinh tế hơn sơ với pp dựa trên ADN • Cần ít kỹ năng hơn so với pp dựa trên ADN • Thiết bị đơn giản, rẻ tiền hơn 11
5/13/2016 ELISA –nhược điểm • Độ nhạy thấp hơn phương pháp dựa trên ADN, chỉ khoảng 0.5%-1% • ELISA Kit cần bảo quản tốt 4°C • Chi phí thiết bị ở mức trung bình (máy đọc vi phiến ELISA) • Cần kháng thể đặc hiệu: không có, hoặc mất thời gian mới tạo ra kháng thể đặc hiệu cho nó • Định lượng dựa trên protein đôi khi không chính xác bởi sự biến thiên hàm lượng này do tác động bên ngoài như thời tiết, điều kiện dinh dưỡng • Chỉ áp dụng cho trưòng hợp protein biểu hiện được tạo ra lượng đủ phát hiện, không áp dụng được với truờng hợp có protein nội sinh giống protein mới đưa vào • Yêu cầu cao về cấu trúc protein: không biến tính, không bị gắn thêm các đoạn protein hay polysacharite khác Sắc ký miễn dịch – Nguyên tắc 12
5/13/2016 Sắc ký miễn dịch – Kết quả Sắc ký miễn dịch – Ưu điểm • Đơn giản, sử dụng trên thực địa • Không cần đào tạo • Chuẩn bị mẫu nhanh đơn giản • Phép thử định tính nhanh (5-10 minutes) • Rẻ (AUS$5-20) • Bảo quản que thử ở nhiệt độ thường • Không cần thiết bị đắt tiền 13
5/13/2016 Sắc ký miễn dịch – Nhược điểm • Độ nhạy thấp (~1% (w/w) GM protein) • Cần kháng thể đặc hiệu và thời gian tạo kháng thể thường kéo dài vài tháng, vài năm • Mỗi que thử chỉ được 1 phép kiểm tra • Nhiều GMO không biểu hiện đủ lượng protein tái tổ hợp cho phép thử • Chỉ phù hợp cho phép thử nhanh, trên các đối tượng chưa qua các công đoạn chế biến Phương pháp khác • Sử dụng trong ống nghiệm: kháng thể được cố định trên chất mang, ví dụ hạt nano carbon, phản ứng miễn dịch tốt hơn do có sự di chuyển của hạt chất mang kháng thể 14
5/13/2016 Phương pháp dựa trên protein – Ưu điểm chung • Rẻ tiền, đơn giản • Chuẩn bị mẫu đơn giản • Không đòi hỏi kỹ năng cao • Phù hợp cho các sản phẩm chưa qua chế biến (đặc biệt là tác động làm biến tính protein) • Nhanh Phương pháp dựa trên protein – nhược điểm chung • Sản xuất kháng thể đặc hiệu • Sự tương tác giữa kháng thể với protein khác có cấu trúc tương tự • Không phù hợp để sử dụng cho phép thử sàng lọc bởi tính đặc hiệu của kháng thể • Hàm lượng protein trong các tế bào (từ các phần của sinh vật) khác nhau, chỉ áp dụng khi protein mới biểu hiện. • Thường cho con số tuyệt đối về lượng protein, thực tế để quyết định sản phẩm có phải dán nhãn hay không, cần tỷ lệ tương đối • Không phù hợp sử dụng để kiểm soát sự trôi gen bởi protein có thể bị thay đổi từ khi gen được chuyển từ cá thể này sang cá thể khác 15
5/13/2016 Các phương pháp dựa trên DNA • Sử dụng các trình tự ADN đặc trưng cho GMO trong các thành phần khác của thực phẩm • ADN có thể được khuyếch đại về số lượng = PCR, do vậy các phương pháp dựa trên DNA có độ nhạy cao. Tách chiết ADN từ mẫu • Công đoạn tốn thời gian nhất, nhưng quyết định chất lượng ADN và có thể ảnh hưởng tới công đoạn tiếp theo: sự có mặt các thành phần khác như lipid, protein, polysacharide có thể ảnh hưởng tới phản ứng khuếch đại ADN • 1st: bổ sung hoá chất để phá tế bào giải phóng ADN (thường là chất tẩy rửa anion, lysozyme) • 2nd: loại protein (kết tủa protein) và các thành phần khác . • 3rd: kết tủa chọn lọc ADN bằng alcohol. Sau đó có thể tiếp tục tinh sạch bằng nhựa liên kết AND (tuy nhiên có thể làm tổn thất ADN). 16
5/13/2016 Khuếch đại ADN bằng PCR • Sử dụng mồi đặc hiệu để khuếch đại vùng nào đó, sự tạo thành sản phẩm có kích thước dự kiến • Tuỳ thuộc thông tin về sự kiện cụ thể, dựa trên trình tự đoạn chèn và vùng kế cận, mồi sử dụng trong các phản ứng nhân gen PCR sẽ được thiết kế Khuếch đại bằng PCR • Vùng A: sàng lọc • Vùng B: đặc trưng cấu trúc, nhưng có thể trong nhiều cây trồng khác nhau, sử dụng để định tính • Vùng C: đặc trưng cho sự kiện chuyển gen cụ thể, có thể sử dụng định tính và định lượng 17
5/13/2016 Phương pháp PCR để sàng lọc • Dưa trên các trình tự phổ biến, sử dụng trong cây trồng GM, qua đó có thể sàng lọc. 80% cây GM sử dụng 2 trình tự sau: • Promoter CaMV 35S (A.tumefaciens) • NOS terminator (A.tumefaciens) • Thông thường cần kết quả PCR dương tính với cả 2 trình tự P35S và NOS (tạo ra 2 băng sản phẩm tương ứng) • Định tính cho nhiều loại GMO (nếu sử dụng cùng các trình tự này) • Độ nhạy 0.1% GMO Phương pháp PCR định tính xác định cấu trúc đoạn chèn (gen chuyển) • Dựa trên trình tự vùng tiếp giáp giữa promoter và gen mã hoá vốn không có sẵn trong tự nhiên • Định tính • Độ nhạy 0.1% GMO • Xác định được gen sử dụng cụ thể • Có thể sử dụng để phát hiện sự trôi gen vào cây trồng khác. • Không xác định được sự kiện chuyển gen cụ thể 18
5/13/2016 Phương pháp PCR định tính, xác định sự kiện chuyển gen cụ thể • Dựa trên vùng tiếp giáp giữa hệ gen cây chủ và đoạn chèn vào. • Vùng tiếp giáp đoạn chèn vào hệ gen cây chủ đặc trưng cho sự kiện chuyển gen. • Ví dụ: • Một quốc gia chỉ cho chấp thuận sự kiện Bông biến đổi gen A, nhưng không chấp thuận sự kiện bông biến đôi gen B  xác định bằng phương pháp nào? • Nếu quốc gia đó không chấp nhận bông biến đổi gen, phương pháp có thể sử dụng là gì GM? Phương pháp PCR định lượng • Bắt buộc định lượng để dán nhãn • Định lượng tương đối: tỷ lệ lượng ADN đặc trưng cho GMO/lượng ADN đặc trưng cho non-GMO. Tỷ lệ này không thể xác định trực tiếp từ mẫu ban đầu mà phải nhân lên bằng phương pháp PCR (realtime PCR), tính toán tỷ lệ sản phẩm sau khuếch đại  tính toán ngược lại tỷ lệ ban đầu. • Đoạn ADN đặc trưng cho GMO nên là vùng tiếp giáp để đảm bảo độ chính xác để định lượng • Đoạn ADN đặc trưng cho non-GMO nên từ một gen nào hoạt động ổn định trong mọi điều kiện, có mặt trong mọi giống. • Chi phí đắt: thiết bị và hoá chất phát quang • Đòi hỏi kỹ năng cao 19
5/13/2016 Ưu điểm chung của các phương pháp sử dụng PCR • Định tính  định lượng • sàng lọc GMO đặc trưng sự kiện • Dựa trên ADN, tất cả tế bào đều có như nhau. • Có thể định lượng tương đối • Độ nhạy cao Nhược điểm chung của các phương pháp sử dụng PCR • Cần thời gian, kỹ năng • ADN có thể bị biến đổi, phân giải sau quá trình chế biến • Phản ứng PCR có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố bên ngoài • Dễ bị ảnh hưởng của sự nhiễm tạp • Yêu cầu về trình tự của đoạn ADN đích. 20

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.