Bài giảng Xu hướng phát triển thực phẩm: Các kỹ thuật gen sử dụng trong tạo sinh vật biến đổi gen

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:24

Thêm vào BST

Báo xấu

16
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng "Xu hướng phát triển thực phẩm: Các kỹ thuật gen sử dụng trong tạo sinh vật biến đổi gen" trình bày các nội dung chính sau: Các bước chính tạo GMO; Các kỹ thuật gen cơ bản; Chọn gen mục tiêu và sinh vật cho gen;... Mời quý thầy cô và các em cùng tham khảo bài giảng!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Xu hướng phát triển thực phẩm: Các kỹ thuật gen sử dụng trong tạo sinh vật biến đổi gen

Các kỹ thuật gen sử dụng trong tạo sinh vật biến đổi gen THỰC PHẨM BIẾN ĐỔI GEN Nguyễn Tiến Thành - HUST
Làm thế nào tạo ra GMO Gen Tế bào sinh vật Tế bào sinh vật mang gen chuyển bình thường (GMO)
Các bước chính tạo GMO Lựa chọn gen tách gen từ sinh Thiết kế cấu trúc và sinh vật cho vật cho gen, biểu hiện gen gen “tách dòng” kháng sâu đục thân cry Promoter-cry-Terminator cry từ Bacillus Sàng lọc tế bào Đưa gen lên các Chuyển gen vào đạt yêu cầu phương tiên tế bào đích chuyển Chọn cá thể ngô có Sún g bắn gen vào hạt vàn g đặc điểm khán g sâu ngô
Các kỹ thuật cơ bản u Tách chiết, tinh sạch DNA hệ gen u Khuếch đại DNA u Cắt và ghép nối DNA u Chuyển (Biến nạp) DNA vào tế bào vật chủ u Các phương pháp đánh giá kết quả chuyển gen
Chọn gen mục tiêu và sinh vật cho gen u Thường là các gen tạo cho sinh vật nhận các đặc tính mới : u Kháng sâu đục thân: cry từ Bacillus thurigensis u Kháng thuốc trừ cỏ: bar từ Streptomyces, espsp từ Agrobacterium… u Hormon sinh trưởng: từ cá hồi Chinok u Etc.. u Cần rõ trình tự DNA, đặc biệt là vùng mã hóa cho protein ̀ tương ứng
Tách gen từ sinh vật cho u Phương pháp chủ đạo là ”câu” và nhân gen (khuếch đại gen) từ DNA hệ gen của sinh vật cho gen: u Tách chiết DNA hệ gen từ sinh vật cho gen. Trường hợp sinh vật cho gen là virus thì cần tạo cDNA từ RNA của virus u Nhân gen từ DNA hệ gen đã tách chiết được Phương pháp tách chiết DNA hệ gen từ sinh vật cho gen Phương pháp nhân gen
Phương pháp tách/tinh sạch DNA hệ gen u Mục đích: thu DNA nguyên vẹn (không bị cắt đoạn, gẫy), không lẫn các thành phần khác (protein…), hiệu suất thu hồi cao u Nguyên tắc chính: u Phá màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA u Tách DNA ra khỏi các thành phần khác u Thu nhận DNA
Phương pháp tách chiết/tinh sạch DNA u Phá màng tế bào, màng nhân: kết hợp 2 phương pháp u Cơ học: nghiền trong Ni tơ lỏng, siêu âm, rung lắc với bi thuỷ tinh u Hoá học: lyzozyme (enzyme phân giải màng peptidoglycan), SDS (giãn mạch protein), proteinase (thuỷ phân protein, tách DNA khỏi protein), Rnase (phân giải RNA) u Tách DNA khỏi thành phần khác: 1 trong 2 phương pháp u Trích ly bằng phenol – chloroform để thu protein, DNA trong pha nước u Sử dụng cột silica, bám đặc hiệu DNA u Thu nhận DNA u Kết tủa bằng isopropanol, ly tâm thu kết tủa u Rửa giải DNA trên màng silica thu DNA
Tách chiết DNA
Phương pháp nhân gen u PCR: polymerase chain reaction: phản ứng chuỗi trùng hợp, dựa trên đặc tính của DNA và khả năng tổng hợp chuỗi của DNA polymerase trên chuỗi khuôn từ các mồi bổ sung ban đầu (xem tái bản gen) u Cần có: u Đoạn DNA gốc cần nhân lên u Các nucleotide A, T, G, C tự do u Enzyme DNA polymerase u Các mồi: 2 mồi: xuôi và ngược ứng với 2 mạch đơn DNA u Thiết bị luân nhiệt u Kết quả: từ 1 đoạn DNA kép gốc tạo ra số lượng vô cùng lớn các đoạn DNA kép giống với DNA gốc
Phương pháp nhân gen Nguyên tắc phản ứng PCR Đoạn DNA ban đầu Mồi Các nucleotide Biến tính tại 94 –96oC Bắt cặp tại 55 - 65oC Kéo dài tại 72oC
Phương pháp nhân gen PCR u Thiết kế mồi: u Mồi quyết định sản phẩm PCR u Để thu đúng sản phẩm, mồi cần được thiết kế dựa trên đoạn gen cần ”câu” và nhân lên từ DNA à cần trình tự của đoạn gen cần “câu” ra u Mồi cần có chiều dài đủ để sự bắt cặp mồi với DNA đích đúng: 20 -25 nt u Tỷ lệ GC tốt nhất là 50%. u Tổng hợp mồi: công ty bên ngoài thực hiện
Phương pháp nhân gen PCR u Thực hiện trong các thiết bị luân nhiệt: ở các nhiệt độ khác nhau (95oC, 60oC, 72oC), trong thời gian khác nhau, lặp lại chu trình nhiều lần
Phương pháp nhân gen PCR u Kiểm tra sản phẩm nhân gen: sử dụng điện di trên agarose u Sản phẩm nhân gen được đưa vào agarose, đặt trong điện trường, DNA sẽ di chuyển tùy thuộc và kích thước của nó (nhỏ thì nhanh, lớn thì chậm) à nếu là hỗn hợp nhiều DNA kích thước khác nhau, sau một thời gian sẽ phân tách được chúng. u Quan sát sự phân bố các sản phẩm DNA dưới tia UV với sự hỗ trợ của ethidium bromide (EtBr)
Kiểm tra sản phẩm nhân gen bằng điện di trên agarose Điện trường Điện tích âm DNA từ DNA phản phân ứng tách nhân theo Chất gen kích hiện Đưa vào các đường thước màu chạy trên Agarose, có kèm DNA chuẩn Điện tích dương biết kích thước Hiện sản phẩm dưới UV So sánh kích thước
“Tách dòng” gen u “Tách dòng”: Là thuật ngữ thể hiện công việc sau khi đã thu được gen đích, chuyển vào một “phương tiện” để giữ gen, đồng thời có thể tạo ra số lượng gen lớn khi cần u “phương tiện” giữ gen thường là các vec tơ trong các vi sinh vật trung gian giữ vector đó, loại vector phổ biến nhất là các plasmid u Plasmid giữ gen thường có kích thước nhỏ, có thể tồn tại ở số lượng lớn (vài trăm plasmid) trong 1 tế bào giữ plasmid. u Plasmid cần tương thích (không bị đào thải) với tế bào giữ plasmid u “Phương tiện” phổ biến: thường là vi khuẩn E.coli, nấm men… và các plasmid tương ứng với nó
“Tách dòng” gen u Cấu trúc chung của plasmid dùng để “tách dòng”: • Gen chọn lọc: gen kháng kháng sinh • Tín hiệu khởi đầu tái bản: cần phù hợp với tế bào mang plasmid (cho phép plasmid có thể nhân lên trong tế bào) và quyết định số lượng bản sao plasmid trong tế bào • Vùng MCS: cho phép có thể mở vòng plasmid để gắn thêm gen đích vào Gen khung Gen chọn chọn lọc lọc Vùng MCS Vùng MCS Gen đích Tín hiệu Tín hiệu khởi đầu tái khởi đầu tái bản bản
Plasmid tách dòng pJET (E.coli)