Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Chuyển gen Bt2 vào một số dòng ngô trồng bằng sử dụng mô phân sinh và Agrobacterium tumefaciens

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:47

Thêm vào BST

Báo xấu

14
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài "Chuyển gen Bt2 vào một số dòng ngô trồng bằng sử dụng mô phân sinh và Agrobacterium tumefaciens" nhằm nghiên cứu chuyển vector mang gen Bt2 vào các dòng ngô bố mẹ nhằm tăng hàm lượng tinh bột trong cây.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Chuyển gen Bt2 vào một số dòng ngô trồng bằng sử dụng mô phân sinh và Agrobacterium tumefaciens

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -------- NGUYỄN THỊ THU CHUYỂN GEN BT2 VÀO MỘT SỐ DÕNG NGÔ TRỒNG BẰNG SỬ DỤNG MÔ PHÂN SINH VÀ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội, Tháng 11-2015 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -------- NGUYỄN THỊ THU CHUYỂN GEN BT2 VÀO MỘT SỐ DÕNG NGÔ TRỒNG BẰNG SỬ DỤNG MÔ PHÂN SINH VÀ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM MÃ NGÀNH: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS. Nguyễn Đức Thành Hà Nội, Tháng 11-2015 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả Nguyễn Thị Thu Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Đức Thành đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đặc biệt đến TS. Lê Thị Bích Thủy và tập thể cán bộ Phòng Di truyền tế bào thực vật đã giúp đỡ tôi về mặt tinh thần, cũng nhƣ tạo mọi điều kiện về vật chất, các phƣơng tiện kỹ thuật cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Ban Đào tạo Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành chƣơng trình đào tạo. Cuối cùng tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt thời gian làm luận văn. Tác giả Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT DNA : Deoxyribonucleic acid RNA : Ribonucleic acid bp : Cặp base (base pair) CTAB : Cetyltrimethyl amoniumbromide dNTP : Deoxynucleosid triphosphat EDTA : Ethylene diamin tetra acetate EtBr : Ethidium bromide kb : Kilo base PCR : Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction) Rnase : Ribonuclease TBE : Tris base, Boric acid, EDTA. TE : Tris EDTA MES : 2-morphlinoethanesulfonic acid PPT : L- Phosphinothricin AGPase : ADP-Glucose pyrophosphorylase MS : Murashige and Skoog Medium BSA : bovine serum albumin fraxtion BCIP/NBT : 5 – Bromo – 4 – Chloro – 3 – idolyl phosphate, p- toluidine salt/Nitro Blue Tetrazolium SDS : sodium dodecyl sulfat Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Kết quả chọn lọc các cây chuyển gen trong môi trƣờng chọn lọc ..... 24 Bảng 2: Số dòng cây chuyển gen và số bản sao gen chuyển thu đƣợc từ mỗi dòng ngô............................................................................................................ 29 Bảng 3: Số lƣợng dòng cây chuyển gen theo các khoảng thời gian gây nhiễm khác nhau .......................................................................................................... 30 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC HÌNH Hình 1: Một số enzyme quan trọng trong quá trình chuyển hóa sucrose thành tinh bột. ............................................................................................................... 7 Hình 2: Cấu trúc chuyển gen pCambia2300-Ubi-Bt2; ..................................... 15 Hình 3: Chuyển cấu trúc gen pCambia2300-Ubi-Bt2 vào mô phân sinh cây non một số dòng ngô………………………………………………………………23 Hình4: Kết quả tách DNA tổng số các dòng ngô sống sót sau chọn lọc cây chuyển gen………………… ………………………………………………...25 Hình 5: Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen Bt2 trong một số cây ngô chuyển gen bằng PCR với mồi đặc hiệu.. ..................................................................... 26 Hình 6: Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen Ubi trong một số cây ngô chuyển gen bằng PCR với mồi đặc hiệu. ...................................................................... 27 Hình 7: Kết quả kiểm tra Southern một số dòng ngô chuyển gen;................... 28 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 1. Đặt vấn đề .................................................................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu đề tài ........................................................................ 2 3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 2 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3 1.1 Đại cƣơng về cây ngô. ............................................................................... 3 1.2 Tinh bột và các gen điều khiển quá trình tổng hợp tinh bột ...................... 5 1.3 Các phƣơng pháp chuyển gen thƣờng sử dụng ........................................ 7 1.3.1 Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens ............. 8 1.3.2 Chuyển gen trực tiếp ................................................................................ 10 1.4 Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở ngô ................................................. 11 1.4.1 Các nghiên cứu chuyển gen trên thế giới ................................................. 11 1.4.2 Các nghiên cứu chuyển gen trong nƣớc ................................................... 14 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 15 2.1 Vật liệu và hóa chất nghiên cứu .............................................................. 15 2.1.1 Vật liệu ..................................................................................................... 15 2.1.2 Hóa chất .................................................................................................... 16 2.2.2 Đánh giá các cây chuyển gen bằng PCR .................................................. 19 2.2.3 Đánh giá các cây chuyển gen bằng lai Southern ...................................... 20 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 23 3.1 Chọn lọc các dòng ngô chuyển gen ......................................................... 23 3.2 Đánh giá các cây chuyển gen bằng PCR ................................................. 25 3.3 Đánh giá các cây chuyển gen bằng lai Southern ..................................... 28 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................. 32 4.1 Kết luận.................................................................................................... 32 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
4.2 Kiến nghị ................................................................................................. 32 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Ngô là cây lƣơng thực đứng thứ hai trên thế giới sau lúa. Nó đóng vai trò quan trọng đối với đời sống con ngƣời. Không chỉ cung cấp lƣơng thực cho con ngƣời, ngô còn đóng vai trò xóa đói giảm nghèo ở nhiều vùng kinh tế của nƣớc ta. Hiện nay dân số đang tăng cao dẫn đến áp lực về lƣơng thực càng trở nên nóng hơn bao giờ hết. Việc tăng năng suất cây trồng đặc biệt là các cây lƣơng thực nhƣ ngô, lúa, lúa mì ... đang là thách thức đối với các nhà chọn tạo giống cây trồng. Hiện nay có hai phƣơng pháp chủ yếu để tăng năng suất cây trồng đó là cải tiến phƣơng thức canh tác và sử dụng giống mới dựa vào nỗ lực của các nhà chọn giống. Cho đến nay, các nhà chọn giống thƣờng nghiên cứu tạo giống mới theo các hƣớng nhƣ: nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen, di truyền phân tử các tính trạng quan tâm, chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử và công nghệ gen. Cây ngô là cây trồng thu hạt nên tăng năng suất cây chủ yếu phụ thuộc vào các yếu tố nhƣ: chiều dài bắp, số lƣợng hạt, khối lƣợng của hạt… Để ứng dụng công nghệ gen vào việc tăng năng suất cây ngô chúng ta cần nghiên cứu các quá trình liên quan năng suất cây ngô nhƣ: quá trình quang hợp, quá trình tổng hợp tinh bột, hoạt động của các gen điều khiển quá trình tổng hợp sinh khối… Nhiều nghiên cứu hóa sinh và phân tử đã làm sáng tỏ vai trò của các enzyme trong quá trình tổng hợp tinh bột. Các nghiên cứu cho thấy ADP- glucose pyrophosphorylase (AGPase) là enzyme đóng vai trò chìa khóa trong quá trình điều khiển tổng hợp tinh bột ở hạt ngũ cốc. Enzyme AGPase có cấu trúc tứ phân gồm 2 tiểu phần nhỏ đƣợc mã hóa bởi gen Brittle 2 (Bt2) và 2 tiểu phẩn lớn đƣợc mã hóa bởi gen Shrunken 2 (Sh2). Chuyển gen Sh2 và Bt2 vào ngô là một trong những hƣớng nghiên cứu nhằm tăng khả năng tổng hợp tinh bột, tăng năng suất cây trồng. Ứng dụng công nghệ gen chúng tôi tiến hành nghiên cứu: Chuyển gen Bt2 vào một số dòng ngô trồng bằng sử dụng mô phân sinh và Agrobacterium tumefaciens. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu đề tài Chuyển vector mang gen Bt2 vào các dòng ngô bố mẹ nhằm tăng hàm lƣợng tinh bột trong cây. 3. Nội dung nghiên cứu - Chuyển gen Bt2 vào các dòng ngô trồng. - Đánh giá sự có mặt của gen Bt2 trong các dòng chuyển gen. 2
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cƣơng về cây ngô. Ngô (Zea mays L.) thuộc chi Maydeae, họ hòa thảo Gramineae, có nguồn gốc từ Trung Mỹ, là cây lƣơng thực quan trọng trên thế giới bên cạnh lúa mì và lúa gạo. Cấu tạo của cây ngô bao gồm: rễ, thân, lá, hoa (bông cờ), hạt. Rễ ngô là hệ rễ chùm tiêu biểu cho bộ rễ của các cây họ hòa thảo. Độ sâu và sự mở rộng của rễ phụ thuộc vào các giống, độ phì nhiêu và độ ẩm của đất. Ngô có 3 loại rễ chính: rễ mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng. Rễ mầm (còn gọi là rễ mộng, rễ tạm thời, rễ hạt) gồm có: rễ mầm sơ sinh và rễ mầm thứ sinh. Rễ mầm sơ sinh (rễ phôi): là cơ quan đầu tiên xuất hiện sau khi hạt ngô nảy mầm. Ngô có một rễ mầm sơ sinh duy nhất. Sau một thời gian ngắn xuất hiện, rễ mầm sơ sinh có thể ra nhiều lông hút và nhánh. Thƣờng thì rễ mầm sơ sinh ngừng phát triển, khô đi và biến mất sau một thời gian ngắn (sau khi ngô đƣợc 3 lá). Tuy nhiên cũng có khi rễ này tồn tại lâu hơn, đạt tới độ sâu lớn để cung cấp nƣớc cho cây (thƣờng gặp ở những giống chịu hạn). Rễ mầm thứ sinh: còn đƣợc gọi là rễ phụ hoặc rễ mầm phụ. Rễ này xuất hiện từ sau sự xuất hiện của rễ chính và có số lƣợng khoảng từ 3 đến 7. Tuy nhiên, đôi khi ở một số cây không xuất hiện lọai rễ này. Rễ mầm thứ sinh cùng với rễ mầm sơ sinh tạo thành hệ rễ tạm thời cung cấp nƣớc và các chất dinh dƣỡng cho cây trong khoảng thời gian 2 - 3 tuần đầu, sau đó vai trò này nhƣờng cho hệ rễ đốt. Rễ đốt (còn gọi là rễ phụ cố định) phát triển từ các đốt thấp của thân, mọc vòng quanh các đốt dƣới mặt đất bắt đầu lúc ngô đƣợc 3 - 4 lá. Số lƣợng rễ đốt ở mỗi đốt của ngô từ 8 – 16 rễ. Rễ đốt ăn sâu xuống đất và có thể đạt tới 2,5m, thậm chí tới 5m, nhƣng khối lƣợng chính của rễ đốt vẫn là ở lớp đất phía 3
trên. Rễ đốt làm nhiệm vụ cung cấp nƣớc và các chất dinh dƣỡng suốt thời kỳ sinh trƣởng và phát triển của cây ngô. Rễ chân kiềng (còn gọi là là rễ neo hay rễ chống) mọc quanh các đốt sát mặt đất. Rễ chân kiềng to, nhẵn, ít phân nhánh, không có rễ con và lông hút ở phần trên mặt đất. Ngoài chức năng chính là bám chặt vào đất giúp cây chống đỡ, rễ chân kiềng cũng tham gia hút nƣớc và thức ăn. Thân cây ngô đặc, khá chắc, có đƣờng kính tùy thuộc vào giống, điều kiện sinh thái và chăm sóc. Chiều cao của thân cây ngô khoảng 1,5 – 4 m. Thân chính của ngô có nguồn gốc từ chồi mầm. Lá ngô căn cứ vào vị trí trên thân và hình thái có thể chia lá ngô làm 4 loại: lá mầm, lá thân, lá ngọn, lá bi. Lá ngô có cấu tạo bởi bẹ lá, bản lá (phiến lá), lƣỡi lá (thìa lìa, tai lá). Tuy nhiên có loại không có thìa lìa làm cho lá bó, gần nhƣ thẳng đứng theo cây. Số lƣợng lá, chiều dài, độ rộng, độ dày, lông tơ, màu lá, góc lá và gân lá thay đổi tùy theo giống khác nhau. Số lá là đặc điểm khá ổn định ở cây ngô, có quan hệ chặt chẽ với số đốt và thời gian sinh trƣởng. Những giống ngô ngắn ngày thƣờng có 15 -16 lá, giống ngô trung bình: 18 – 20 lá, giống ngô dài ngày thƣờng có trên 20 lá. Ngô là loài cây có hoa khác tính cùng gốc. Hai cơ quan sinh sản: đực (bông cờ) và cái (bắp) nằm ở những vị trí khác nhau trên cùng một cây. Hoa đực nằm ở đỉnh cây, xếp theo chùm gồm một trục chính và nhiều nhánh. Hoa đực mọc thành bông nhỏ gọi là bông chét, bông con hoặc gié. Các gié mọc đối diện nhau trên trục chính hay trên các nhánh. Hoa tự cái (bắp ngô) phát sinh từ chồi nách các lá, song chỉ 1 - 3 chồi khoảng giữa thân mới tạo thành bắp. Hạt ngô là loại quả dính bao gồm 5 phần chính: vỏ hạt, lớp alơron, phôi, nội nhũ và chân hạt. Vỏ hạt là một màng nhẵn bao xung quanh hạt. Lớp alơron nằm dƣới vỏ hạt, bao lấy nội nhũ và phôi. Nội nhũ là phần chính của hạt chứa các tế bào dự trữ chất dinh dƣỡng. Nội nhũ có hai phần: nội nhũ bột và nội nhũ sừng. Tỷ lệ giữa nội nhũ bột và nội nhũ sừng tùy thuộc vào chủng ngô, giống ngô. Phôi ngô chiếm 1/3 thể tích của hạt và gồm có các phần: ngù, lá mầm, trụ dƣới lá mầm, rễ mầm và chồi mầm. 4
1.2 Tinh bột và các gen điều khiển quá trình tổng hợp tinh bột Tinh bột là hợp chất cacbon sinh học có nhiều trong các cơ quan dự trữ của thực vật [22]. Tinh bột ngoài việc đóng vai trò quan trọng trong khẩu phần ăn của con ngƣời còn có vai trò quan trọng trong chăn nuôi và trong các ngành công nghiệp... Cùng với sự gia tăng dân số nhƣ hiện nay tăng hàm lƣợng tinh bột trong cây trồng đang là vấn đề đƣợc các nhà khoa học quan tâm. Tinh bột là sản phẩm của quá trình quang hợp, đƣợc tổng hợp từ đƣờng đơn dƣới sự xúc tác của các enzyme khác nhau. Đã có nhiều nghiên cứu về sự ảnh hƣởng của các gen đến các enzyme xúc tác nói riêng và quá trình tổng hợp tinh bột nói chung. Ví dụ nhƣ: Các đột biến Sh2 đã đƣợc phát hiện vào năm 1949.Ảnh hƣởng của đột biến gen Sh2 tới việc thiếu tinh bột trong các hạt tạo thành đã đƣợc chứng minh vào năm 1953 và hoạt động của ADP-Glucose pyrophosphorylase (AGPase) bị mất đã đƣợc chứng minh vào năm 1966, trong khi sự phân lập của gen đột biến đã phải chờ đợi cho đến năm 1990 [7]. Ngoài ra có hàng chục đột biến liên quan đến tổng hợp tinh bột, nhiều đột biến đã đƣợc tạo dòng. Có thêm rất nhiều gen phiên mã trong hạt ngô đã đƣợc mô tả rất chi tiết. Hầu hết các gen liên quan đến các bƣớc chủ yếu trong tổng hợp tinh bột đã đƣợc xác định bằng cách phân tích đột biến. Dọc theo chuỗi phản ứng tổng hợp tinh bột thông qua sucrose, các yếu tố liên quan đã đƣợc nghiên cứu, Miniature1 (Mn1) mã hóa enzyme Invertase IncW2 ở thành tế bào, Shrunken1 (Sh1) và Synthase1 Sucrose (Sus1) mã hóa cho enzyme tổng hợp sucrose, Sh2 và Brittle2 (Bt2) mã hóa cho AGPase, Bt1 mã hóa cho một nhân tố vận chuyển ADP-Glucose, Waxy1 (WX1) mã hóa cho enzyme tạo liên kết hạt GBSSI (granule-bound starch synthase), trong tổng hợp tinh bột, Sugary2 (Su2) và Dull1 (Du1) tƣơng ứng mã hóa SSIIa và SSIIIa , amylose extender1 (Ae1) mã hóa cho enzyme phân nhánh BEIIb, và Su1 mã hóa cho enzyme phá hủy liên kết nhánh ISAI [12; 18]. Bƣớc đóng vai trò quan trọng trong tổng hợp tinh bột là sự tổng hợp của ADP-Glucose từ Glucose-1-P và ATP AGPase [29; 36]. Sự tăng cƣờng hoạt 5
động của AGPase trong hạt ngô chuyển gen Sh2 (12%) và Bt2 (17%) đã đƣợc chỉ ra đầu tiên cho các dòng ngô bổ sung các gen mã hóa AGPase trong hệ gen [10] và sau đó là sự phân lập của hai gen bổ sung từ thƣ viện cDNA phôi ngô [15]. Agp1 (tiểu đơn vị lớn) và Agp2 (tiểu đơn vị nhỏ) cho thấy biểu hiện chủ yếu trong các phôi qua phƣơng pháp nghiên cứu lai Nothern, ngƣợc lại, Sh2 và Bt2, đƣợc biểu hiện đặc hiệu trong nội nhũ [16]. Cuối cùng, một tiểu đơn vị nhỏ thứ ba gen L2, đã đƣợc xác định trong một thƣ viện cDNA từ lá [28]. Các gen Agp2 và L2 đã đƣợc đổi tên thành Agpsemzm và Agpslzm, tƣơng ứng, khi cấu trúc intron / exon của Agpslzm đƣợc xác định [17]. Mặc dù ba gen Agps rõ ràng có một nguồn gốc chung, vai trò sinh lý của chúng đã tách ra sau quá trình tái bản gen. Trong đó, Agpslzm chịu trách nhiệm về sự tích tụ tạm thời của tinh bột vào ban ngày trong lá, Agpsemzm và Bt2 chịu trách nhiệm trong các cơ quan tích trữ tinh bột, trong phôi và nội nhũ. 95% các hoạt động của AGPase ở nội nhũ các tế bào đƣợc tìm thấy trong các phần tế bào chất [9]. Tsai và Nelson [36] đã gây đột biến trên gen Sh2, và kết quả cho thấy trên các dòng đột biến, lƣợng tinh bột đƣợc tổng hợp chỉ bằng 20-30% so với dòng đối chứng. Đột biến này dẫn đến sự thiếu hoàn toàn hoạt tính của enzyme adenosine diphosphate glucose pyrophosphorylase (AGPase) trong cả nội nhũ và phôi hạt. Sự xác định ảnh hƣởng đột biến chỉ ra rằng phần lớn tinh bột trong các dòng ngô bình thƣờng đƣợc tổng hợp nhờ xúc tác của một hệ thống các enzyme sử dụng adenosine diphosphate glucose làm cơ chất, sau cùng đƣợc hình thành nhờ xúc tác của AGPase. Nghiên cứu của Hannah [19] cho thấy sự tăng cƣờng biểu hiện của gen Sh2 trong các dòng ngô chuyển gen ở điều kiện nhiệt độ cao (trung bình hàng ngày khoảng 330C) làm tăng sản lƣợng ngô tới 64% nhờ vào việc tăng xác suất phát triển của các hạt ngô dẫn đến tăng số lƣợng hạt ngô trên một bắp. Ở các loài hoang dại, tỷ lệ các hạt phát triển trên số lƣợng phôi thực tế chỉ đạt ~50%, vì vậy việc tăng tần số phát triển hạt là một mục tiêu khả thi trong nông nghiệp, đặc biệt trong điều kiện nhiệt độ cao… 6
Hình 1: Một số enzyme quan trọng trong quá trình chuyển hóa sucrose thành tinh bột [12] Tóm lại, thông qua các nghiên cứu chúng tôi nhận thấy: Một trong các enzyme đóng vai trò then chốt trong quá trình sinh tổng hợp tinh bột là ADP – glucose pyrophosphorylase (AGPase). Đặc điểm của các gen mã hóa AGPase trong các cơ quan tổng hợp cũng nhƣ tích trữ của ngô đã đƣợc nghiên cứu và cho thấy AGPase có cấu trúc tứ phân, gồm hai tiểu đơn vị nhỏ, mã hóa bởi gen Brittle2 (Bt2), và hai tiểu đơn vị lớn, mã hóa bởi gen Shrunken2 (Sh2) [20]. Dựa trên cơ sở này có thể tiến hành tạo ra dòng ngô tăng cƣờng khả năng tổng hợp tinh bột nhờ chuyển các bản copy của gen Sh2 và Bt2 vào ngô. 1.3 Các phƣơng pháp chuyển gen thƣờng sử dụng Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đƣa một gen lạ (một đoạn ADN, ARN) vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồn tại ở dạng plasmid trong tế bào chủ hoặc gắn bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen của tế bào chủ. Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu, gây biến đổi các đặc 7
điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của những cơ thể chuyển gen. Cây đƣợc chuyển nạp gen mục tiêu đƣợc gọi là “cây chuyển gen” có hai phƣơng pháp chuyển nạp gen: chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [33], và chuyển gen trực tiếp: theo phƣơng pháp vi tiêm (microinjection) [16], phƣơng pháp xung điện [23], phƣơng pháp bắn gen (biolistic) [32], phƣơng pháp chuyển qua ống hạt phấn [25] và một số kỹ thuật khác. 1.3.1 Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens [33] A. tumefacien (Agrobacterium tumefaciens) là loài vi khuẩn đất, có dạng hình gậy, kích thƣớc 2.5-3.0 x 0.7-0.8 mm, dạng đơn bào, không tạo ra bào tử, có vỏ và lông roi, là vi khuẩn hiếu khí, nhuộm gram (-) ,khuẩn lạc tròn và rìa nhẵn. Khuẩn lạc màu trắng kem, nhẵn, bóng, tròn, nhỏ, rìa đều đặn và có màu xanh da trời nhạt sau đó đậm dần trên môi trƣờng chỉ thị D2M. * Cơ chế xâm nhập của vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào thực vật. Cơ chế gây bệnh của các A. tumefaciens là sau khi xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối loạn các chất sinh trƣởng nội sinh, tạo ra khối u. Khả năng chuyển gen này đã đƣợc khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật theo ý muốn. Để gắn T-DNA vào tế bào thực vật, đầu tiên vi khuẩn A. tumefaciens phải tiếp xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thƣơng. Quá trình này đƣợc thực hiện nhờ các gen chvA và chvB. Gen chvB mã hóa một protein liên quan đến hình thành β-1,2 glucan mạch vòng, trong khi đó gen chvA xác định một protein vận chuyển, định vị ở màng trong của tế bào vi khuẩn. Protein vận chuyển giúp vận chuyển β-1,2 glucan nào khoảng giữa thành tế bào và màng sinh chất. β-1,2 glucan giữ vai trò quan trọng để vi khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với thành tế bào thực vật. Nếu không có sự tiếp xúc này, sẽ không có sự dẫn truyền T-DNA. 8
Các sản phẩm protein của vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T- DNA từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Các loại protein đó rất cần thiết cho quá trình cắt T-DNA khỏi Ti-plasmid, cảm ứng thay đổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia di chuyển phần T-DNA qua màng vi khuẩn tới tế bào chất của tế bào thực vật, vận chuyển tới nhân rồi cuối cùng xâm nhập vào gen của cây chủ. Thực chất chỉ riêng T-DNA của Ti-plasmid đƣợc chuyển vào gen tế bào thực vật. Quá trình dẫn truyền chỉ do sản phẩm của các gen vir (vùng vir) và gen chv quyết định mà không liên quan đến các gen khác trên T-DNA. Tuy nhiên, chuỗi DNA 25 bp (Right border (RB) và Left border (LB) của T-DNA) có vai trò là vị trí cảm ứng cho các sản phẩm của tổ hợp các gen vùng vir, đặc biệt là protein từ gen virE mang chúng dẫn truyền vào tế bào thực vật. Chúng hoạt động nhƣ các tín hiệu nhận biết và khởi động quá trình dẫn truyền. Trƣớc hết gen virA trong tổ hợp gen vùng vir đƣợc phosphoryl hóa nhờ tác động của các hợp chất phenol nhƣ acetosyringone giải phóng ra từ các tế bào thực vật tổn thƣơng. Sản phẩm của quá trình này lại tiếp tục phosphoryl hóa gen virG. Sản phẩm của gen virG liên tiếp làm hoạt hóa toàn bộ các gen vir còn lại, mà hai gen cuối cùng đƣợc hoạt hóa là gen virB và virE. Trƣớc đó, khi gen virD đƣợc hoạt hóa, sản phẩm của nó cảm ứng nhận biết RB và LB của T-DNA và làm đứt phần T-DNA ra khỏi DNA của Ti- plasmid thành các sợi đơn. Đồng thời quá trình phosphoryl hóa này cũng làm thay đổi áp suất thẩm thấu màng tế bào thực vật, màng tế bào bị mềm ra và bị thủng. Các sợi đơn T-DNA đƣợc gắn vào protein do gen virE tổng hợp và dịch chuyển về phía màng tế bào vi khuẩn. Ngay sau đó, sợi T-DNA đƣợc trƣợt từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Cầu nối chính là sự tiếp hợp giữa hai tế bào do cảm ứng sản phẩm gen virB mà thành. Khi T-DNA đã đƣợc chuyển giao vào tế bào thực vật, chúng nhanh chóng hợp nhất trong gen tế bào thực vật để ổn định và di truyền nhƣ các gen bình thƣờng khác. Ƣu điểm: chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium đơn giản, ít tốn kém, phù hợp với điều kiện nhiều phòng thí nghiệm ở Việt Nam. 9
1.3.2 Chuyển gen trực tiếp Chuyển gen bằng súng bắn gen [32] Ngâm những viên đạn nhỏ (vi đạn) bằng vàng hoặc tungsten có kích thƣớc cực nhỏ, đƣờng kính khoảng 0,5 - 1,5 m với dung dịch có chứa đoạn ADN ngoại lai cần chuyển vào tế bào thực vật. Các vi đạn này đƣợc làm khô trên một đĩa kim loại mỏng có kích thƣớc 0,5 - 0,9 cm. Đĩa kim loại này đƣợc gắn vào đầu một viên đạn lớn (macroprojectile) bằng nhựa, hoặc vật liệu nhẹ. Khi bắn, áp suất hơi sẽ đẩy viên đạn đi với tốc độ cao. Tới đầu nòng súng, viên đạn lớn sẽ bị cản lại bởi một lƣới thép mịn, còn các viên đạn nhỏ (vi đạn) vẫn tiếp tục di chuyển với tốc độ lớn tới 1300 m/giây đến đối tƣợng bắn rồi rồi xuyên vào tế bào. Sau khi bắn, tách các mô, tế bào và nuôi cấy invitro để tái sinh cây. Ngƣời ta thƣờng dùng khí nén là helium áp lực cao để bắn gen. Ƣu điểm: chuyển gen bằng phƣơng pháp sung bắn gen thao tác dễ dàng, bắn một lần đƣợc nhiều tế bào. Nguyên liệu để bắn đa dạng (hạt phấn, tế bào nuôi cấy, tế bào mô hóa và mô phân sinh) Nhƣợc điểm: phƣơng pháp chuyển gen bằng súng bắn gen có tần số biến nạp ổn định thấp vì nghiên cứu các gen tạm thời.3 Chuyển gen bằng kỹ thuật vi tiêm [16] Phƣơng pháp này sử dụng vi kim tiêm và kính hiển vi để đƣa ADN những tế bào nhất định, nhằm tạo ra các dòng biến nạp từ protoplast và cây biến nạp khảm từ phôi phát triển từ hạt phấn. Ƣu điểm: Phƣơng pháp chuyển gen bằng vi tiêm có thể tối ƣu lƣợng ADN đƣa vào tế bào. Phƣơng pháp này giúp quyết định đƣợc đƣa ADN vào loại tế bào nào. Có thể đƣa một cách chính xác thậm chí vào tận nhân và có thể quan sát đƣợc. Các tế bào có cấu trúc nhỏ nhƣ hạt phấn và tế bào tiền phôi mặc dù hạn chế về số lƣợng cũng có thể tiêm chính xác. Có thể nuôi riêng lẻ 3ác tế bào vi tiêm và biến nạp đƣợc vào mọi giống cây. Nhƣợc điểm: Trong phƣơng pháp này, mỗi lần tiêm chỉ với một tế bào, thao tác trong khi làm đòi hỏi độ chính xác cao. 10
Chuyển gen nhờ kỹ thuật xung điện [23] Kỹ thuật siêu âm dùng để chuyển gen vào tế bào trần protoplast. Sau khi tạo protoplast, tiến hành trộn protoplast với plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn để tạo hỗn hợp dạng huyền phù. Cắm đầu siêu âm của máy xung điện ngập trong hỗn hợp huyền phù sâu khoảng 3 mm. Cho máy phát xung điện với tần số 20 KHz theo từng nhịp ngắn, mỗi nhịp khoảng 100 mili giây. Số nhịp khoảng từ 6 - 9 nhịp với tổng thời gian tác động từ 600 - 900 mili giây. Sau khi siêu âm, đem protoplast nuôi trong các môi trƣờng thích hợp, chọn lọc để tách các protoplast đã đƣợc chuyển gen. Nuôi cấy invitro để tái sinh cây. Chọn lọc cây và đƣa ra trồng ở môi trƣờng ngoài. Ƣu điểm của phƣơng pháp: phƣơng pháp cho phép chuyển đƣợc lƣợng protoplast nhiều, không độc hại đối với tế bào. Nhƣợc điểm: phƣơng pháp này có giá thành thiết bị tƣơng đối cao, đồi hỏi kỹ thuật cao. Chuyển gen qua ống phấn [25] Phƣơng pháp chuyển gen qua ống phấn là phƣơng pháp chuyển gen không qua nuôi cấy mô invitro. Nguyên tắc của phƣơng pháp này là ADN ngoại lai chuyển vào cây theo đầu ống phấn, chui vào bầu nhụy cái. Thời gian chuyển gen vào lúc hạt phấn mọc qua vòi nhụy và lúc bắt đầu đƣa tinh tử vào thụ tinh, tốt nhất là sự chuyển gen xảy ra đúng khi quá trình thụ tinh ở noãn và cho tế bào hợp tử chƣa phân chia. Nhƣợc điểm: phƣơng pháp này đòi hỏi kỹ thuật cao, phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm của ngƣời tiến hành. 1.4 Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở ngô 1.4.1 Các nghiên cứu chuyển gen trên thế giới Hiện nay, có nhiều phƣơng pháp chuyển gen đƣợc các nhà khoa học sử dụng để chuyển gen vào thực vật trong đó phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens đem lại hiệu quả cao và ít tốn kém nhất. Đối với cây ngô, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu chuyển gen thông qua A. 11