Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá tình trạng nhiễm khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong nước uống đóng bình loại 19,5 lít

Chia sẻ: Trần Trung Hiếu | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:91

Thêm vào BST

Báo xấu

67
lượt xem 18
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Việc đánh giá tình hình vệ sinh nước uống và mức độ nhạy cảm với kháng sinh của P. aeruginosa trong nước uống là việc làm rất cần thiết, nhằm mục đích phòng ngừa sự lan truyền của vi khuẩn này qua đường uống; cảnh báo về việc sử dụng tràn lan nước uống không hợp vệ sinh của người dân, đồng thời khuyến cáo việc sử dụng kháng sinh một cách hợp lý, hiệu quả.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá tình trạng nhiễm khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong nước uống đóng bình loại 19,5 lít

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆTNAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Phạm Thị Oanh Oanh ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM KHUẨN PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRONG NƢỚC UỐNG ĐÓNG BÌNH LOẠI 19,5 LÍT LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Chuyên ngành động vật học Hà Nội – 2019
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆTNAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Phạm Thị Oanh Oanh ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM KHUẨN PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRONG NƢỚC UỐNG ĐÓNG BÌNH LOẠI 19,5 LÍT Chuyên ngành: Động vật học Mã số: 8420103 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC 1. TS. Phạm Thị Hằng 2. TS. Lê Thị Nhi Công Hà Nội - 2019
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn tốt nghiệp với đề tài “Đánh giá tình trạng nhiễm khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong nƣớc uống đóng bình loại 19,5 lít” là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc công bố trong các công trình khoa học khác. Nếu nhƣ không đúng nhƣ nêu trên tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về đề tài của mình. Ngƣời cam đoan Phạm Thị Oanh Oanh
LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập, nghiên cứu. Để hoàn thành luận văn này tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới: – TS. Phạm Thị Hằng, Khoa Ký sinh trùng, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ƣơng, TS. Lê Thị Nhi Công, Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã trực tiếp chỉ bảo và hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu để tôi hoàn thiện luận văn này; – Xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong Học viện Khoa học và công nghệ, những ngƣời đã truyền đạt kiến thức quý báu cho em trong thời gian học tập tại Học viện; - Xin cảm ơn ban Giám hiệu trƣờng Cao đẳng y tế Đặng Văn Ngữ, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ƣơng đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập; – Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn Đỗ Trung Hà, Trịnh Thị Tuyết, Vũ Thị Thu Trang tổ Vi sinh, khoa Ký sinh trùng, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ƣơng đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu; – Bên cạnh đó tôi xin đƣợc bày tỏ sự cảm ơn đến sự giúp đỡ của gia đình, bạn bè và ngƣời thân đã luôn ủng hộ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể tập trung nghiên cứu và hoàn thành đề tài này. Do về mặt kiến thức và thời gian còn hạn chế, luận văn còn nhiều khiếm khuyết. Tôi mong đƣợc sự đóng góp ý kiến của các thầy, cô và mọi ngƣời để luận văn hoàn thiện hơn. Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ CFU Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) MIC Minimum Inhibitory Concentration (nồng độ ức chế tối thiểu) NA Nutrien agar PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) PCN Pseudomonas cetrimide nalidixic acid SEM Scaning Electron Microscope (kính hiển vi điện tử quét) TCCP Tiêu chuẩn cho phép TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam CLSI Clinical and Laboratory Standards Insitute (Viện Tiêu Chuẩn Lâm sàng và Xét ngiệm) CDC Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật
DANH MỤC SƠ ĐỒ BẢNG Bảng 1.1. Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với nƣớc khoáng thiên nhiên và nƣớc uống đóng chai ...................................................................................... 17 Bảng 1.2. Phân nhóm kháng sinh và tiêu chuẩn đọc kết quả đƣờng kính vùng ức chế đối với P. aeruginosa của các kháng sinh đƣợc quy định theo tài liệu hƣớng dẫn của CLSI và Bộ Y tế .................................................................... 21 Bảng 2.1. Các xét nghiệm xác định P. aeruginosa từ các dạng khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng chọn lọc PCN ........................................................................ 33 Bảng 2.2. Yêu cầu về chỉ tiêu P. aeruginosa trong mẫu nƣớc ....................... 36 Bảng 2.3. Đọc kết quả của các phản ứng sinh hóa của kít API 20NE ........... 38 Bảng 2.4. Các kháng sinh đƣợc thử nghiệm và giới hạn đƣờng kính vùng ức chế .................................................................................................................. 41 Bảng 3.1. Thông tin chung về mẫu nƣớc sử dụng phân tích chỉ tiêu P. aeruginosa .................................................................................................. 43 Bảng 3.2. Kết quả xét nghiệm chỉ tiêu P. aeruginosa trong các mẫu nƣớc bình uống liền bằng phƣơng pháp lọc màng ........................................................... 47 Bảng 3.3. Kết quả test thử sinh hóa API 20 NE đối với một số chủng vi khuẩn phân lập trong mẫu nghiên cứu sau 24 giờ nuôi cấy ...................................... 58 Bảng 3.4. Các mức độ nhạy cảm với kháng sinh của 32 chủng P. aeruginosa phân lập từ các mẫu nƣớc xét nghiệm............................................................. 63 Bảng 3.5. Mức độ đa kháng kháng sinh của các chủng P. Aeruginosa phân lập trong các mẫu nƣớc xét nghiệm ................................................................ 66
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. P. aeruginosa dƣới kính hiển vi điện tử quét (SEM) ..................... 10 Hình 3.1. Mẫu nƣớc xét nghiệm trên địa bàn khu vực quận Thanh Xuân ..... 46 Hình 3.2. Kiểm tra sự phát huỳnh quang của các khuẩn lạc P. aeruginosa dƣới đèn UV .................................................................................................... 51 Hình 3.3. Vi khuẩn P. aeruginosa phân lập trong các mẫu nƣớc dƣới kính hiển vi quang học (1.000 X) ........................................................... 52 Hình 3.4. Số lƣợng mẫu phân tích và số mẫu nhiễm vi khuẩn ...................... 53 Hình 3.5. Tỷ lệ các mẫu nƣớc bị nhiễm P. aeruginosa .................................. 53 Hình 3.6. Số lƣợng vi khuẩn P. aeruginosa và so sánh với yêu cầu về chỉ tiêu P. aeruginosa trong mẫu nƣớc ........................................................................ 54 Hình 3.7. Kết quả đánh giá chất lƣợng các mẫu nƣớc xét nghiệm đối với chỉ tiêu P. aeruginosa ........................................................................................... 55 Hình 3.8. Test API 20 NE xác định tính chất sinh hóa của chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu xét nghiệm (mẫu 15, mẫu 46) .............................................. 57 Hình 3.9. Test phản ứng thử oxidase (chủng phân lập từ mẫu 16) ................ 59 Hình 3.10. Hình thái chủng vi khuẩn 16 trên môi trƣờng NA ....................... 60 Hình 3.11. Hình thái chủng vi khuẩn 46 trên môi trƣờng NA ....................... 60 Hình 3.12. So sánh mức độ tƣơng đồng của chủng 16 với những chủng có họ hàng gần đã đƣợc công bố trên Genbank ........................................................ 61 Hình 3.13. So sánh mức độ tƣơng đồng của hai chủng 16 và 46 với những chủng có họ hàng gần đã đƣợc công bố .......................................................... 62 Hình 3.14. Đĩa thạch có khảm P. aeruginosa đƣợc đặt khoanh giấy kháng sinh sau 20 giờ nuôi cấy ở 360C ± 10C............................................................ 64 Hình 3.15. Các mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các chủng P. eruginosa phân lập từ các mẫu nƣớc xét nghiệm............................................................. 64 Hình 3.16. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng P. aeruginosa phân lập trong các mẫu nƣớc xét nghiệm ....................................................... 65 Hình 3.17. Tỷ lệ các mức độ kháng kháng sinh của P.aeruginosa ................ 66
1 MỤC LỤC MỤC LỤC ......................................................................................................... 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 4 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 6 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN PSEUDOMONAS AERUGINOSA..................................6 1.2. ĐẶC ĐIỂM SINH VẬT HỌC CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA.........................9 1.2.1. Hình thái, cấu tạo ............................................................................ 9 1.2.2. Cấu trúc tế bào .............................................................................. 10 1.3. ĐỘC LỰC VÀ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA11 1.3.1. Độc lực .......................................................................................... 11 1.3.2. Khả năng gây bệnh của Pseudomonas aeruginosa ....................... 12 1.4. TÌNH HÌNH Ô NHIỄM PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRONG NƢỚC KHOÁNG THIÊN NHIÊN ĐÓNG CHAI VÀ NƢỚC UỐNG ĐÓNG CHAI ...................14 1.4.1. Các nghiên cứu trên thế giới ......................................................... 14 1.4.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam .......................................................... 16 1.5. QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA ĐỐI VỚI NƢỚC KHOÁNG THIÊN NHIÊN VÀ NƢỚC UỐNG ĐÓNG CHAI ......................................................................................16 1.6. KỸ THUẬT KHÁNG SINH ĐỒ KHOANH GIẤY KHUẾCH TÁN............................18 1.6.1. Nguyên lý ...................................................................................... 18 1.6.2. Giải thích thuật ngữ ....................................................................... 19 1.7. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA P. AERUGINOSA.............23 1.7.1. Các nghiên cứu trên thế giới ......................................................... 23 1.7.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam ........................................................ 25 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 28 2.1. NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU.................................................................................................28 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................... 28 2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................. 28 2.1.3. Trang thiết bị và dụng cụ .............................................................. 28
2 2.1.4. Môi trƣờng, hóa chất, thuốc thử, dung dịch.................................. 29 2.1.5. Thuốc thử, hóa chất và kít thử khác .............................................. 30 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................................................................................30 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu....................................................................... 30 2.2.2. Hoạt hóa chủng chuẩn ................................................................... 31 2.2.3. Thu mẫu ........................................................................................ 31 2.2.4. Bảo quản và vận chuyển mẫu ....................................................... 31 2.2.5. Lọc mẫu ......................................................................................... 32 2.2.6. Pha loãng mẫu ............................................................................... 32 2.2.7. Ủ mẫu ............................................................................................ 32 2.2.8. Đếm khuẩn lạc............................................................................... 32 2.2.9. Các xét nghiệm để khẳng định kết quả ......................................... 33 2.2.10. Phƣơng pháp xử lý và phân tích số liệu ...................................... 35 2.2.11. Đánh giá kết quả.......................................................................... 36 2.2.12. Định danh vi khuẩn bằng kit API 20NE ..................................... 37 2.2.13. Định danh vi khuẩn bằng giải trình tự gen 16S RNA ................. 40 2.2.14. Kháng sinh đồ bằng phƣơng pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán....... 41 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 43 3.1. THÔNG TIN CHUNG VỀ MẪU NƢỚC XÉT NGHIỆM P. AERUGINOSA............43 3.2. KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM CHỈ TIÊU P. AERUGINOSA TRONG MẪU NƢỚC.....46 3.1. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH BẰNG API 20NE .......................................................................57 3.3. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16s RNA...........................................................................59 3.4. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ NHẠY CẢM VỚI KHÁNG SINH CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA PHÂN LẬP TỪ CÁC MẪU NƢỚC UỐNG...............62 3.4.1. Đánh giá về mức độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn P. aeruginosa phân lập đƣợc................................................................... 62 3.4.2. Mức độ đa kháng kháng sinh của P. aeruginosa phân lập đƣợc trong mẫu nƣớc ....................................................................................... 65 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 69
3 4.1. KẾT LUẬN.........................................................................................................................................69 4.1.1. Số lƣợng và tỷ lệ nhiễm P. aeruginosa trong các mẫu nƣớc ........ 69 4.1.2. Đánh giá mức độ nhạy cảm với kháng sinh của P. aeruginosa .... 69 4.2. KIẾN NGHỊ ........................................................................................................................................69 TÀI LIỆU THAM KHẢO
4 MỞ ĐẦU Nƣớc uống đóng chai, đóng bình là một sản phẩm đƣợc sử dụng phổ biến trong cuộc sống hàng ngày. Ta có thể dễ dàng bắt gặp các sản phẩm nƣớc uống đóng chai, đóng bình ở khắp mọi nơi, từ gia đình, trƣờng học, cơ quan hay các nhà hàng... do nhu cầu sử dụng của ngƣời dân và sự tiện lợi của những sản phẩm này nên thị trƣờng xuất hiện ngày càng nhiều thƣơng hiệu nƣớc uống đóng chai khác nhau. Hiện nay, Bộ Y tế đã có các bộ quy chuẩn khá chặt chẽ về chất lƣợng nƣớc uống đóng chai, đóng bình. Tuy nhiên, một số cơ sở sản xuất vì nhiều lí do đã không tuân thủ quy trình sản xuất cho nên tình trạng ô nhiễm vi sinh vật trong nƣớc uống đóng chai còn khá cao, đặc biệt là Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) [1]. P. aeruginosa đƣợc biết đến là vi khuẩn nhiễm trùng cơ hội đối với những ngƣời có sức đề kháng kém. Nhiễm trùng do P. aeruginosa gây ra điển hình là nhiễm trùng da (nhiễm trùng vết thƣơng, vết bỏng…), nhiễm trùng đƣờng hô hấp (viêm phổi, viêm phế quản…), nhiễm trùng đƣờng tiểu và nặng hơn là gây nhiễm trùng huyết. Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các cơ quan trong cơ thể nhƣ phổi, đƣờng tiết niệu, thận, sẽ gây ra những hậu quả nặng nề vì vi khuẩn này có khả năng phát triển trên các niêm mạc bên trong cơ thể [2],[3],[4]. Mặt khác, P. aeruginosa còn có khả năng kháng lại nhiều loại kháng sinh. Việc sử dụng kháng sinh không đúng cách trong cộng đồng và chƣa hợp lý trong bệnh viện đã dẫn đến mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn nói chung và P. aeruginosa nói riêng ngày một tăng cao. Nhiều phác đồ điều trị kháng sinh đã bị thất bại do quá trình thích nghi và kháng lại kháng sinh của vi khuẩn. Tháng 2/2017, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã công bố danh sách gồm 12 nhóm vi khuẩn nguy hiểm cần nhanh chóng nghiên cứu các loại thuốc kháng sinh mới để đối phó, vì chúng là những vi khuẩn đa kháng, có khả năng đề kháng mạnh các liệu pháp điều trị hiện nay. Trong số đó, P. aeruginosa
5 đƣợc WHO xếp vào nhóm 1, nhóm đặc biệt nguy hiểm vì vi khuẩn này có khả năng kháng với carbapenem, kháng sinh đạt hiệu quả cao nhất trong điều trị vi khuẩn kháng thuốc [5]. Chƣa có nhiều bằng chứng về khả năng nƣớc uống là nguồn gây nhiễm P. aeruginosa đối với cộng đồng. Tuy nhiên sự hiện diện của P. aeruginosa trong nƣớc uống đóng chai, đóng bình chứng tỏ mẫu nƣớc đó chƣa đƣợc tiệt trùng thích hợp, hoặc sự nhiễm bẩn từ đƣờng ống, thiết bị lọc hay từ chai, bình chứa không đƣợc rửa sạch, hong khô, tiệt khuẩn đúng thời gian quy định hoặc do quá trình bảo quản sau lọc không tốt. Việc đánh giá tình hình vệ sinh nƣớc uống và mức độ nhạy cảm với kháng sinh của P. aeruginosa trong nƣớc uống là việc làm rất cần thiết, nhằm mục đích phòng ngừa sự lan truyền của vi khuẩn này qua đƣờng uống; cảnh báo về việc sử dụng tràn lan nƣớc uống không hợp vệ sinh của ngƣời dân, đồng thời khuyến cáo việc sử dụng kháng sinh một cách hợp lý, hiệu quả. Trƣớc yêu cầu của thực tiễn, tôi thực hiện đề tài “Đánh giá tình trạng nhiễm khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong nƣớc uống đóng bình loại 19,5 lít” với đối tƣợng nghiên cứu là các mẫu nƣớc đƣợc thu tại địa bàn quận Thanh Xuân, Hà Nội với các mục tiêu nhƣ sau: - Định lƣợng P. aeruginosa trong nƣớc uống đóng bình loại 19,5 lít tại khu vực quận Thanh Xuân, Hà Nội và định danh vi khuẩn phân lập đƣợc. - Đánh giá mức độ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn P. aeruginosa phân lập đƣợc.
6 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN PSEUDOMONAS AERUGINOSA Vi khuẩn P. aeruginosa trƣớc đây đƣợc gọi là Bacterium aeruginosa do Schroeter mô tả vào năm 1872. Đến năm 1900, Migula chuyển chúng sang giống Pseudomonas và từ đó vi khuẩn mang tên Pseudomonas aeruginosa (Pseudo là tiếng Hy Lạp có nghĩa “giả”; monas trong tiếng Hy Lạp nghĩa là “đơn vị”; aeruginosa nghĩa là “gỉ đồng”). Ở Việt Nam thƣờng đƣợc gọi là trực khuẩn mủ xanh [6]. P. aeruginosa có khả năng tạo thành các khuẩn lạc có sắc tố màu lục và sinh sắc tố huỳnh quang ở 42oC, vi khuẩn còn sinh mùi thơm đặc trƣng (giống nhƣ nho chín), điều này giúp cho việc nhận biết vi khuẩn này trên môi trƣờng rắn trong phòng thí nghiệm [7]. P. aeruginosa là vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, hình que, di động, không tạo bào tử, có khả năng oxy hóa các chất chống oxy hóa. P. aeruginosa là một thành viên của chi Pseudomonas, thông thƣờng đƣợc gọi là pseudomonads. Vi khuẩn có thể sinh các sắc tố hòa tan trong nƣớc pyocyanin và pyoverdin, làm cho các khuẩn lạc P. aeruginosa có màu xanh lam đặc trƣng trên môi trƣờng rắn. P. aeruginosa có khả năng sinh tổng hợp indophenol oxyase, một loại enzyme làm cho vi khuẩn dƣơng tính trong xét nghiệm oxidase, giúp phân biệt chúng với các vi khuẩn Gram âm khác. Sự có mặt của flagella và pili tại hai đầu cực tế bào giúp vi khuẩn có khả năng di động mạnh. Giống nhƣ một số loại vi khuẩn khác, P. aeruginosa có khả năng hình thành màng sinh học, tồn tại trong các mô và thiết bị y tế của con ngƣời. Việc vi khuẩn liên kết với nhau tạo thành màng sinh học giúp vi khuẩn chống lại một cách khá hiệu quả sự tiêu diệt của các kháng thể và thực bào của sinh vật chủ, điều đó góp phần giúp vi khuẩn này tăng khả năng đề kháng với các kháng sinh
7 trong quá trình điều trị. Các vi khuẩn P. aeruginosa phát triển mạnh trong môi trƣờng ẩm ƣớt nhƣ đất và nƣớc. Nó có thể đƣợc tìm thấy với số lƣợng lớn trên trái cây và rau quả tƣơi. Xâm nhập cơ thể ngƣời bắt đầu từ đƣờng tiêu hóa, sau đó có thể di chuyển đến các vị trí da ẩm nhƣ vùng mông, bẹn và nách…[8]. P. aeruginosa có mặt phổ biến trong tự nhiên. Nó có thể đƣợc tìm thấy trong môi trƣờng nƣớc ngọt (suối, hồ và sông), cũng nhƣ bồn rửa, vòi hoa sen, thiết bị hô hấp, thậm chí trong nƣớc cất [9]. Nó đƣợc tìm thấy trong đất, nƣớc, hệ vi sinh vật trên da và đặc biệt khá phổ biến trong các bệnh viện. Chúng là loại vi khuẩn gây bệnh có điều kiện nhƣ khi cơ thể suy giảm miễn dịch, bị bệnh ác tính hoặc mãn tính, khi dùng corticoid kéo dài, việc sử dụng kháng sinh tùy tiện, việc sử dụng các dụng cụ thăm khám không đảm bảo vô khuẩn hoặc các vết bỏng, các vết thƣơng hở… [8]. P. aeruginosa là một trong những mầm bệnh cơ hội quan trọng nhất liên quan đến nhiễm trùng bệnh viện trên toàn thế giới. P. aeruginosa có thể tồn tại trong nhiều điều kiện. Ổ chứa vi khuẩn thƣờng liên quan đến nhiễm trùng nhƣ thiết bị y tế, môi trƣờng bị ô nhiễm (bồn rửa, vòi, v.v.), nƣớc đóng chai bị ô nhiễm…[10], [11]. Trong những năm gần đây, P. aeruginosa là một trong những căn nguyên gây bệnh rất phổ biến và kháng lại nhiều kháng sinh hiện đang đƣợc sử dụng. Vì vậy, nó thu hút rất nhiều đề tài nghiên cứu của các nhà khoa học và các y bác sĩ trong nƣớc cũng nhƣ ngoài nƣớc. - Nghiên cứu nhiễm khuẩn huyết bỏng do P. aeruginosa gây ra tại Viện Bỏng Quốc gia (6/1996 - 12/1998) đã cho thấy P. aeruginosa là vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết bỏng hàng đầu (chiếm khoảng 66,7%) [12]. - Năm 2002, Chu Anh Tuấn, Nguyễn Văn Huệ, Lê Đức Mẫn nghiên cứu căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết và yếu tố bệnh lý liên quan tại Viện Bỏng Quốc gia đã cho thấy P. aeruginosa là căn nguyên gây nhiễm hàng đầu
8 (74,3%) [4]. - Năm 2003, Lê Đăng Hà, Nguyễn Đức Hiền nghiên cứu tình hình kháng thuốc kháng sinh năm 2003 của một số vi khuẩn gây bệnh về các vi khuẩn gây bệnh thƣờng gặp ở Việt Nam thì P. aeruginosa là vi khuẩn đứng đầu trong số các vi khuẩn đó chiếm tỷ lệ 22,3% [13]. - Hoàng Kim Tuyến và cộng sự nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh phân lập tại bệnh viện Thống Nhất (8/2002 - 8/2005) đã chứng minh đƣợc P. aeruginosa là nguyên nhân hàng đầu gây viêm phổi tại bệnh viện với tỷ lệ kháng thuốc khá cao (> 60%) [14]. - Lê Thu Hồng, Hoàng Ngọc Hiện (bộ môn vi sinh - Học viện Quân y) đã nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng P. aeruginosa đa giá, tinh chế và đánh giá hiệu quả điều trị tại chỗ của chế phẩm trên động vật và bệnh nhân bỏng [15]. - Trần Văn Ngọc và cộng sự khảo sát đặc điểm kháng thuốc của P.aeruginosa và A. baumanni gây viêm phổi bệnh viện tại bệnh viện Chợ Rẫy từ 2013- 2014 thấy P. aeruginosa có tỉ lệ đề kháng cao với nhóm carbapenem (imipenem 72 % và meropenem 74 %), nhóm fluoroquinolone (levofloxacin 50 % và ciprofloxacin 50 %) và betalactam ± ức chế betalactamase (ceftazidim 46 %, piperacillin/ tazobactam 20 % và cefoperazone/sulbactam 72 %) [3]. - Yang và cộng sự (2015) đã nghiên cứu Tỷ lệ nhiễm và sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn P. aeruginosa tại bệnh viện Nam Trung Quốc. Kết quả cho thấy Polymyxin B có tỷ lệ mẫn cảm cao nhất (98,8 %), trong khi độ mẫn cảm của piperacillin, piperacillin / tazobactam, ceftazidime, amikacin và ciprofloxacin là khoảng 70,0 % -80,0 %. Ở các chủng phân lập khi sử dụng ticarcillin / axit clavulanic, cefoperazone/ sulbactam, cefepime, imipenem, gentamicin, moxifloxacin. Độ nhạy cảm với kháng sinh của levofloxacin là từ 60,0 % đến 70,0 %. Dƣới 30 % các chủng phân lập đƣợc kháng với cefoperazon và aztreonam. Ngƣợc lại, nhiều chủng đã đƣợc tìm thấy kháng với ampicillin/ sulbactam, amoxicillin/ axit clavulanic, ceftriaxone và
9 cefoxitin, với ít hơn 10 % đƣợc phát hiện [16]. - Năm 2006, Nguyễn Văn Kính và cộng sự phân tích tình hình sử dụng kháng sinh và kháng thuốc tại Việt Nam từ năm 2003 - 2006. Kết quả báo cáo cho thấy tỉ lệ đề kháng đối với các kháng sinh cephalosporins thế hệ 3, thế hệ 4, fluoroquinolon và aminosid của Pseudomonas spp. từ > 40% trong năm 2004 lên > 50% trong năm 2006. Trong khi imipenem/cilastatin, carbapenem đƣợc đƣa vào thị trƣờng Việt Nam mới gần đƣợc 10 năm, cũng đã giảm nhạy cảm đối với các trực khuẩn Gram âm. Tỷ lệ đề kháng imipenem/cilastatin của Pseudomonas spp. Cũng tăng dần qua các năm 12,5 % (2003), 15,5 % (2005) và 18,4 % (2006) [17]. - P. aeruginosa là vi khuẩn gây bệnh thƣờng xuyên nhất trong môi trƣờng bệnh viện và khả năng kháng thuốc cao với nhiều loại kháng sinh và có tỉ lệ tử vong cao. Trong công trình nghiên cứu năm 2004 về tỉ lệ tử vong của 314 bệnh nhân nhiễm trùng huyết do S. aureus hay P. aeruginosa, Osmon và cộng sự nhận thấy, bệnh nhân tử vong do nhiễm trùng huyết bởi P. aeruginosa vẫn cao hơn so với S. aureus (bao gồm cả nhóm nhạy methicillin và kháng methicillin) mặc dù các trƣờng hợp đều đƣợc điều trị kháng sinh đầy đủ [18]. 1.2. ĐẶC ĐIỂM SINH VẬT HỌC CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA 1.2.1. Hình thái, cấu tạo Là trực khuẩn Gram âm, hình que, thẳng hoặc hơi cong, hai đầu tròn, chiều dài 1 - 1,5 μm, rộng 0,5 - 1μm, đứng một mình hoặc thành đôi. P. aeruginosa không sinh bào tử, có khả năng di động nhờ một tiên mao đơn cực [19].
10 Hình 1.1. P. aeruginosa dƣới kính hiển vi điện tử quét (SEM) (Nguồn https://erj.ersjournals.com/content/21/3/401) 1.2.2. Cấu trúc tế bào - Vỏ polysaccaride: P. aeruginosa tiết ra chất nhầy có cấu tạo là polysaccharide gồm nhiều tiểu phần mannuronic acid và glucuronic acid hay còn đƣợc gọi là alginate. Các dạng alginate này kết hợp với nhau tạo thành dạng cấu trúc biofilm giúp bảo vệ che chở vi khuẩn tồn tại đƣợc trong môi trƣờng tự nhiên cũng nhƣ tránh đƣợc hệ miễn dịch của cơ thể vật chủ [19]. - Màng sinh chất: Hầu hết các chủng P. aeruginosa có khả năng tổng hợp một loại protein trên bề mặt gắn trên màng sinh chất (pr F). Protein F vận chuyển có chọn lọc các chất qua lại màng trong giới hạn khoảng 500 Da. Vì vậy, nó làm giảm tính thấm của màng, ngăn không cho các chất có hại đi vào bên trong tế bào giúp cho P. aeruginosa có khả năng đề kháng cao với nhiều loại kháng sinh [19]. - Tiên mao và tiêm mao: P. aeruginosa có một tiên mao (flagella) duy nhất ở một cực, tiên mao giúp cho vi khuẩn di động. Về cấu tạo hoá học, tiên mao đƣợc cấu tạo bởi các protein gọi là flagellin. Các flagellin mang tính chất kháng nguyên, đƣợc gọi là kháng nguyên lông H. Tiêm mao (pili): là những sợi lông rất mảnh, dài khoảng 6 nm, mọc quanh bề mặt tế bào. Tiêm mao giúp vi khuẩn bám vào môi trƣờng lỏng hay bề mặt biểu mô của tế bào vật chủ trong quá trình lây nhiễm. - Vật chất di truyền: Vật chất di truyền của P. aeruginosa là một phân
11 tử DNA trần, dạng vòng, tồn tại trong nguyên sinh chất. Kích thƣớc DNA từ 5,2 - 7 triệu cặp base chứa khoảng 65% là guanine + cytosine. Ngoài ra, P. aeruginosa còn có vật chất di truyền ngoài nhân là các plasmid. Các plasmid chứa các đoạn gen TEM, OXA, PSE mã hóa sinh enzyme betalactamase làm phá huỷ vòng betalactam của kháng sinh giúp P. aeruginosa kháng lại hầu hết các kháng sinh thuộc nhóm này. Do vậy một số trƣờng hợp có thể gây khó khăn trong việc lựa chọn thuốc điều trị nhiễm khuẩn do P. aeruginosa [20]. 1.3. ĐỘC LỰC VÀ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA 1.3.1. Độc lực P. aeruginosa là vi khuẩn gây bệnh cơ hội, nhƣng vi khuẩn có nhiều yếu tố độc lực tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình xâm nhập, lan truyền, phát triển và gây bệnh của vi khuẩn. 1.3.1.1. Nội độc tố (endotoxin): Là thành phần vách tế bào của vi khuẩn. Nội độc tố gồm 2 thành phần chủ yếu là lipolysaccaride (LPS) và một lƣợng nhỏ protein. Hoạt tính của nội độc tố chủ yếu do LPS đảm nhiệm. Nội độc tố của P. aeruginosa tác động tới bạch cầu, tiểu cầu, kích hoạt hệ nội tiết enzyme và hệ thầnh kinh giao cảm. Nội độc tố còn hoạt hoá hệ kallikreinogen-kinin gây rối loạn vi tuần hoàn, đông máu, ức chế miễn dịch và sốc. Ngoài ra, nội độc tố của vi khuẩn P. aeruginosa còn gắn lên thụ thể CD4 trên bề mặt monocyte và macrophage, kích thích chúng sinh ra chất hoại tử tổ chức, mô liên kết của sinh vật chủ. 1.3.1.2. Ngoại độc tố: P. aeruginosa sản xuất 2 loại ngoại độc tố, bản chất là protein ngoại tế bào: Exoenzyme S và Exotoxin A (ETA). Exoenzyme S có 2 dạng: dạng không hoạt động, không có hoạt tính enzyme, ít độc lực và dạng hoạt động, có hoạt tính enzyme, có độc lực cao hơn [19]. ETA gồm hai thành phần: mảnh A phần enzyme của độc tố bên trong tế bào và mảnh B là thành phần cần thiết
12 cho sự di chuyển của độc tố trong tế bào. Vai trò sinh bệnh học của ETA có tác động giống nhƣ ngoại độc tố của Corynebacterium diphteria (vi khuẩn bạch hầu). Do ETA có khả năng khuếch tán và ức chế tổng hợp protein của tế bào, là yếu tố động lực mạnh nhất của P. aeruginosa. Nhiều tác giả đã khẳng định, khoảng 90% số chủng P. aeruginosa gây bệnh nhiễm trùng bệnh viện mang yếu tố độc lực ETA. Ngoài các nội độc tố và ngoại độc tố nêu trên, P. aeruginosa còn một số yếu tố hỗ trợ khác nhƣ cytotoxin (leucocidin) là yếu tố diệt bạch cầu; glycocalyx là một loại polysaccharide tạo thành lớp vỏ nhày (capsule) bao quanh vi khuẩn, đƣợc chúng sinh tổng hợp trong một số điều kiện thích hợp. Vỏ nhày giúp bảo vệ vi khuẩn và giúp vi khuẩn bám trên bề mặt tế bào vật chủ. Pili của P. aeruginosa cũng giúp vi khuẩn bám vào tế bào vật chủ một cach thuận lợi hơn [19]. 1.3.2. Khả năng gây bệnh của Pseudomonas aeruginosa P. aeruginosa tuy là vi khuẩn gây bệnh cơ hội nhƣng nó cũng có độc lực khá cao. Khi tuyến phòng thủ đầu tiên của cơ thể (hàng rào bảo vệ không đặc hiệu ở da, niêm mạc) bị phá vỡ (vết thƣơng) hoặc vi khuẩn đƣợc đƣa vào cơ thể tắt qua hàng rào này (theo dụng cụ nội soi hoặc ống thông khí quản…) sẽ gây ra nhiễm khuẩn. Đầu tiên vi khuẩn bám dính vào bề mặt tế bào biểu mô, giai đoạn này cần đến vai trò của pili và polisaccharide ngoại bào. Một số chủng P. aeruginosa phân lập từ bệnh nhân bị xơ phế nang sinh polisaccharide làm tăng sự kết dính của vi khuẩn với biểu mô đƣờng hô hấp và giúp chúng chống lại thực bào. Sau một thời gian, vi khuẩn tiếp tục sản sinh collagenase, elastase, pyocyanin…làm phá hủy tổ chức cục bộ và lan truyền. Ngoại độc tố ETA (mảnh A) gây tổn thƣơng tổ chức và lan tỏa nhiễm khuẩn. Sắc tố pyocyanin ức chế sự sản sinh superoxide của bạch cầu đa nhân. Các yếu tố này làm hỗ trợ cho việc hình thành, lan tỏa và kéo dài các nhiễm khuẩn do P. aeruginosa [8]. Nhiễm khuẩn thƣờng xảy ra ở những ngƣời có cơ chế bảo vệ bị tổn thƣơng nhƣ sử dụng corticoid, dùng kháng sinh dài ngày, bỏng nặng hoặc
13 tiêm ma túy… Vị trí nhiễm trùng thông thƣờng là đƣờng tiểu và vết thƣơng hở (nhất là vết bỏng). Tại chỗ gây viêm có mủ màu xanh, ở những cơ thể suy giảm sức đề kháng, vi khuẩn có thể xâm nhập vào sâu hơn bên trong và gây viêm các phủ tạng, tạo thành các áp xe bên trong cơ thể. Những trƣờng hợp viêm màng trong tim, viêm phổi, viêm màng não hiếm gặp, những trƣờng hợp nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn ở trẻ sơ sinh thƣờng rất trầm trọng. Nhiễm khuẩn huyết có thể dẫn đến tử vong ở những cơ thể suy nhƣợc [14]. P. aeruginosa có liên quan đến một loạt các bệnh nhiễm trùng ở ngƣời, từ nhiễm trùng sơ sinh, đến nhiễm trùng huyết, và nhiễm trùng phổi cấp tính và mãn tính. Trong một nghiên cứu với 24.179 ngƣời trƣởng thành bị nhiễm trùng máu bệnh viện ở Hoa Kỳ từ năm 1995 đến 2002, P. aeruginosa chiếm 4% các trƣờng hợp và là nguyên nhân thứ ba gây nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram âm [21]. Ở trẻ em đƣợc chăm sóc đặc biệt về nhi khoa (PICU), tỷ lệ nhiễm trùng bệnh viện là 1,5% bệnh nhân/ngày. Bệnh nhân phẫu thuật tim có tỷ lệ nhiễm trùng bệnh viện cao nhất, 2,3% bệnh nhân/ngày. Những bệnh nhiễm khuẩn bệnh viện thƣờng gặp nhất là nhiễm trùng máu (51,7%), nhiễm trùng đƣờng hô hấp (19,0%) và nhiễm trùng đƣờng tiết niệu (17,2%). Các bệnh nhiễm trùng này thƣờng liên quan đến việc sử dụng các thiết bị xâm lấn và nguyên nhân thƣờng gặp nhất là do Staphylococci âm tính coagulase (39%) và P. aeruginosa (24%) [22]. P. aeruginosa còn là tác nhân gây viêm tai ngoài, thƣờng gặp ở những ngƣời hay đi bơi. Vi khuẩn này có thể xâm nhập vào mắt (qua chấn thƣơng hoặc do đƣa thuốc bị nhiễm khuẩn vào) gây viêm màng kết mạc mắt, viêm giác mạc mắt hoặc viêm nội nhãn cầu [19]. Ngoài ra P. aeruginosa còn là tác nhân chính gây nhiễm trùng bệnh viện nhƣ nhiễm trùng sau mổ, bỏng nặng… 1.3.3. Điều kiện phát triển và sức đề kháng của Pseudomonas aeruginosa P. aeruginosa phát triển dễ dàng trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng, là vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối. Nhiệt độ phát triển tối ƣu là 37ºC, phát triển đƣợc ở nhiệt độ từ 5 - 42ºC, pH thích hợp là 7,2 - 7,5 (có thể chịu đƣợc pH từ 4,5 - 9). P. aeruginosa bị tiêu diệt ở 100ºC. Trong môi trƣờng ẩm,