Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen của 15 locus gen hệ Identifiler từ quần thể người dân tộc Dao ứng dụng trong giám định ADN

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:71

Thêm vào BST

Báo xấu

34
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài đã khảo sát tần suất alen ở 15 locus gen (hệ Identifiler) từ 120 người thuộc dân tộc Dao khỏe mạnh, không có quan hệ huyết thống với nhau, sinh sống ở khu vực các tỉnh vùng núi phía bắc Việt Nam. Các tần suất này được kiểm định phù hợp ngẫu nhiên theo định luật cân bằng Hardy - Weinberg, đảm bảo tính chính xác, khách quan để sử dụng trong kết luận giám định. Ngoài ra, đề tài còn hướng tới mục tiêu bổ sung dữ liệu gen của người Dao vào trong hệ thống dữ liệu gen các dân tộc của Viện Khoa học hình sự.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen của 15 locus gen hệ Identifiler từ quần thể người dân tộc Dao ứng dụng trong giám định ADN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT HÀ ĐẠI DƯƠNG KHẢO SÁT VÀ XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU TẦN SUẤT CÁC ALEN CỦA 15 LOCUS GEN HỆ IDENTIFILER TỪ QUẦN THỂ NGƯỜI DÂN TỘC DAO ỨNG DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH ADN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2017
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT HÀ ĐẠI DƯƠNG Tên đề tài: KHẢO SÁT VÀ XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU TẦN SUẤT CÁC ALEN CỦA 15 LOCUS GEN HỆ IDENTIFILER TỪ QUẦN THỂ NGƯỜI DÂN TỘC DAO ỨNG DỤNG TRONG GIÁM ĐỊNH ADN Học viên: Hà Đại Dương Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.01.14 Người hướng dẫn: Đại tá. PGS. TS. Nguyễn Văn Hà Hà Nội - 2017
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt luận văn này tôi xin gửi tới đồng chí Đại tá.PGS.TS Nguyễn Văn Hà - Phó Giám đốc Trung tâm giám định Sinh học pháp lý - Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an với lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành, người đã nhiệt tình hướng dẫn, dạy bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt luận văn này. Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo và tập thể cán bộ chiến sỹ Trung tâm giám định sinh học pháp lý - Viện Khoa học hình sự đã tạo điều kiện cho tôi được tham gia học tập thực nghiệm tại phòng thí nghiệm để hoàn thành luận văn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt nam nói chung, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật nói riêng đã tham gia tổ chức, quản lý, giảng dạy lớp cao học K19 hướng dẫn, trang bị kiến thức cho tôi là cơ sở tạo tiền đề giúp tôi hoàn thành bản luận văn này. Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn ủng hộ và động viên tinh thần, giúp tôi vượt qua những khó khăn, trở ngại trong quá trình học tập và nghiên cứu. Một lần nữa, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc với sự giúp đỡ nhiệt tình, quý báu đó! Hà Nội, ngày ... tháng ... năm 2017 Học viên Hà Đại Dương
MỤC LỤC MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1 1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................ 1 2. Mục tiêu của đề tài ........................................................................................ 3 3. Bố cục của luận văn ...................................................................................... 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 4 1.1. Tổng quan về người dân tộc Dao ở Việt Nam ........................................... 4 1.2. Giám định gen trong khoa học hình sự ...................................................... 6 1.2.1. Lịch sử ra đời của giám định gen ........................................................ 6 1.2.2. Khái quát trình tự STR (Sort Tandem Repeats).................................. 8 1.2.3. Phân loại chỉ thị STR và sử dụng STR trong giám định gen .............. 9 1.2.4. Các locus STR trong bộ kit Identifler ................................................. 9 1.2.5. Ưu điểm và hạn chế của bộ kit Identifiler trong công tác giám định...... 11 1.3. Xây dựng cơ sở dữ liệu gen người phục vụ công tác giám định ............. 11 1.3.1. Mục đích xây dựng cơ sở dữ liệu gen ............................................... 11 1.3.2. Quy trình xây dựng cơ sở dữ liệu gen ............................................... 12 1.3.3. Số lượng mẫu tính toán tần suất alen ................................................ 13 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về khảo sát tần suất các alen của các locus gen sử dụng trong giám định gen ................................................. 13 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .................................................... 13 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước...................................................... 14 CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 16 2.1. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 16 2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 16 2.2.1. Thu mẫu ............................................................................................ 16 2.2.2. Phân tích mẫu .................................................................................... 17 2.2.3. Xử lý số liệu thống kê và tính tần suất các locus gen ....................... 19
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ............................ 22 3.1. Kết quả thu, bảo quản mẫu và tách chiết ADN........................................ 22 3.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR, điện di và phân tích kiểu gen ............. 22 3.3. Kết quả xử lý số liệu thống kê ................................................................. 25 3.3.1. Kết quả tính toán tần suất các alen .................................................... 25 3.3.2. Kết quả quan sát kiểu gen ở từng locus và tính toán chỉ số kiểm định 2.................................................................................................................. 28 3.3.3. So sánh chỉ số kiểm định 2 giữa tính toán (2tt) với lý thuyết (2lt) và đánh giá sự phù hợp với định luật Hardy - Weinberg................................. 35 3.3.4. So sánh tần suất alen của người Dao với một số dân tộc.................. 36 3.4 Một số ví dụ về ứng dụng kết quả của đề tài trong công tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an .................................................. 48 KẾT LUẬN ........................................................................................................ 51 KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 53 PHỤ LỤC ........................................................................................................... 56
DANH MỤC MỘT SỐ KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ADN - Axit Deoxyribo Nucleic ARN - Axít ribonucleic A - Adenine T - Thymine G - Guanine C - Cytosine NST - Nhiễm sắc thể VNTR - Variable Number of Tandem Repeat - Các trình tự lặp ngắn STR - Short Tandem Repeat - Các trình tự lặp ngắn ID - Identifiler/Identify definition PCR - Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp FTA - Giấy thu mẫu máu phục vụ giám định ADN bp - Base pair ANTT - An ninh trật tự KHHS - Khoa học hình sự BCA - Bộ Công an CE - Điện di mao dẫn
DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1. Sơ đồ các bước chính xây dựng cơ sở dữ liệu gen ............................. 12 Hình 3.1. Hình ảnh kiểu gen dạng peak từ mẫu ký hiệu D96 ............................ 23 Hình 3.2. Hình ảnh kiểu gen dạng peak từ mẫu ký hiệu D39 ............................. 24 Hình 3.3. Hình ảnh kiểu gen dạng peak từ mẫu ký hiệu D68 ............................. 25 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Các locus STR và đơn vị lặp trong bộ kit Identifiler ......................... 10 Bảng 3.1: Kết quả định lượng ADN ................................................................... 22 Bảng 3.2: Tần suất xuất hiện của các alen trên 15 locus hệ Identifiler với quần thể người dân tộc Dao………………………………………………………….27 Bảng 3.3: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus D8S1179 ........................... 28 Bảng 3.4: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus D21S11 ............................. 28 Bảng 3.5: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus D7S820 ............................. 29 Bảng 3.6: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus CSF1PO............................ 29 Bảng 3.7: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus D3S1358 ........................... 30 Bảng 3.8: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus TH01 ................................ 30 Bảng 3.9: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus D13S317 ........................... 30 Bảng 3.10: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus D16S539......................... 31 Bảng 3.11: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus TPOX ............................. 31 Bảng 3.12: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus D16S539......................... 32 Bảng 3.13: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus vWA ............................... 32 Bảng 3.14: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus D19S433......................... 33 Bảng 3.15: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus D18S51 ........................... 33 Bảng 3.16: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus FGA ................................ 34 Bảng 3.17: Số lượng kiểu gen quan sát được ở locus D18S51 ........................... 34 Bảng 3.18: So sánh 2TT và 2LT .......................................................................... 35 Bảng 3.19: Tần suất alen (%) của các locus gen hệ Identifiler của dân tộc Dao, Kinh và người gốc Mỹ [17]................................................................................. 36
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Viện Khoa học hình sự được thành lập vào ngày 19 tháng 5 năm 1978 theo Quyết định 78/QĐ-BNV do Bộ trưởng Bộ Nội vụ Trần Quốc Hoàn ký. Trải qua gần 40 năm xây dựng và trưởng thành, Viện đã trở thành một cơ quan đầu ngành của lực lượng kỹ thuật hình sự trong cả nước. Cho đến nay, Viện Khoa học hình sự đã hình thành được đội ngũ giám định viên có chuyên môn nghiệp vụ, đã làm chủ được nhiều trang thiết bị máy móc hiện đại, đảm bảo công tác giám định chính xác khách quan. Trong các lĩnh vực giám định kỹ thuật hình sự và pháp y của Viện Khoa học hình sự, thì giám định gen là một trong những lĩnh vực giám định đã tạo dựng được nhiều “tiếng vang” nhất trong công tác phòng, chống tội phạm giữ gìn an ninh chính trị, trật tự an toàn xã hội. Từ tháng 4 năm 1999, Viện Khoa học hình sự đã triển khai lĩnh vực giám định gen với toàn bộ quy trình được chuyển giao từ Viện Khoa học hình sự bang Victoria - Úc, ban đầu sử dụng hệ NinePlex II (gồm 09 locus). Đến năm 2006 Viện Khoa học hình sự đã đưa vào ứng dụng hệ Identifiler (gồm 15 locus STR) trong giám định gen. Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật nói chung, giám định gen nói riêng, những kết luận giám định gen từ những dấu vết sinh vật như: máu, tinh dịch, lông tóc… là những dấu vết quan trọng thường xuất hiện ở hầu hết các vụ án, nhất là những vụ án hình sự nghiêm trọng như giết người, hiếp dâm…trở thành nguồn chứng cứ vật chất vô cùng quan trọng để đấu tranh với tội phạm. Tuy nhiên, từ thực tiễn cho thấy, kết luận giám định gen thường là so sánh kiểu gen phân tích từ các dấu vết tại hiện trường với đối tượng hay nạn nhân hoặc xác định quan hệ huyết thống cha, mẹ đẻ - con đẻ. Nếu như các kiểu gen phân tích từ các dấu vết hiện trường không trùng với đối tượng hay nạn nhân, hoặc kiểu gen của người con không phù hợp di truyền với bố mẹ giả định thì có thể kết luận loại trừ ngay. Nhưng khi các kiểu gen phân tích được đưa ra so sánh hoàn toàn phù hợp, thì bài toán đặt ra là khả năng có một người nào khác trong
2 quần thể cũng có kiểu gen đó hoặc cũng có sự phù hợp di truyền với người con đó không? Thực tế, chúng ta không thể có một cơ sở dữ liệu gen đầy đủ từng người trong một quần thể, do đó việc khảo sát một số lượng người nhất định đại diện cho quần thể là cơ sở khoa học để ước lượng được tần suất kiểu gen. Nhận được sự quan tâm, chỉ đạo của Chính phủ, Bộ Công an, Viện Khoa học hình sự đang xây dựng cơ sở dữ liệu gen của các quần thể dân tộc người trong khắp cả nước, đặc biệt là những nơi có nhiều tội phạm nguy hiểm, diễn biến phạm tội phức tạp để phục vụ công tác giám định và xây dựng Tàng thư gen. Đến nay, Viện đã xây dựng được một trung tâm dữ liệu gen với số lượng hàng chục nghìn mẫu, với các quần thể người: Kinh, Khmer, Mông, Tày...Tuy nhiên, chưa có dữ liệu của người Dao. Người Dao ở Việt Nam có dân số 751.067 người, cư trú tại 61 trên tổng số 63 tỉnh, thành phố. Người Dao cư trú tập trung tại các tỉnh miền núi phía Bắc nước ta. Thời gian gần đây những khu vực người Dao sinh sống thường là các điểm phức tạp về an ninh chính trị, trật tự an toàn xã hội, thường xuyên có những đối tượng phạm tội chính trị, tội phạm là người nước ngoài, tội phạm ma túy kết cấu với người dân tộc Dao để thực hiện các hành vi phạm tội như gây rối trật tự, buôn bán phụ nữ trẻ em, buôn bán sử dụng ma túy...Số vụ việc cần giám định ADN liên quan tới người dân tộc Dao có chiều hướng gia tăng. Nên việc thu thập các thông tin về dân số trong đó có dữ liệu gen phục vụ quản lý nhân khẩu, phòng chống tội phạm là công việc rất cần thiết. Hiện nay chưa có đề tài nào nghiên cứu về ADN của người Dao phục vụ giám định gen. Chính vì những lí do trên, tôi chọn đề tài nghiên cứu “Khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen của 15 locus gen hệ Identifiler từ quần thể người dân tộc Dao ứng dụng trong giám định ADN” làm đề tài luận văn Thạc sỹ. Đề tài được hoàn thiện sẽ đóng góp cơ sở khoa học vào công tác giám định gen và bổ sung dữ liệu người Dao vào cơ sở dữ liệu gen mà Viện Khoa học hình sự đang xây dựng.
3 2. Mục tiêu của đề tài Đề tài hướng tới mục tiêu: - Khảo sát tần suất alen ở 15 locus gen (hệ Identifiler) từ 120 người thuộc dân tộc Dao khỏe mạnh, không có quan hệ huyết thống với nhau, sinh sống ở khu vực các tỉnh vùng núi phía bắc Việt Nam. Các tần suất này được kiểm định phù hợp ngẫu nhiên theo định luật cân bằng Hardy - Weinberg, đảm bảo tính chính xác, khách quan để sử dụng trong kết luận giám định. Ngoài ra, đề tài còn hướng tới mục tiêu bổ sung dữ liệu gen của người Dao vào trong hệ thống dữ liệu gen các dân tộc của Viện Khoa học hình sự. - Ứng dụng bảng tần suất xây dựng được vào việc tính toán tần suất alen trong các vụ án cụ thể mà mẫu thu được từ người Dao. 3. Bố cục của luận văn Luận văn được trình bày theo quy định tiêu chuẩn luận văn Thạc sỹ của Bộ Giáo dục đào tạo. Ngoài phần mở đầu, kết luận, các danh mục tài liệu tham khảo và phụ lục, luận văn được cấu trúc gồm 3 chương: - Chương 1: Tổng quan tài liệu. - Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu. - Chương 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận.
4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về người dân tộc Dao ở Việt Nam Người Dao ở Việt Nam có dân số 751.067 người, cư trú tại 61 trên tổng số 63 tỉnh, thành phố. Người Dao cư trú tập trung tại các tỉnh: Hà Giang (109.708 người, chiếm 15,1% dân số toàn tỉnh và 14,6% Việt Nam), Tuyên Quang (90.618 người, chiếm 12,5% dân số toàn tỉnh và chiếm 12,1% tổng số người Dao tại Việt Nam), Lào Cai (88.379 người, chiếm 14,4% dân số toàn tỉnh và 11,8% tổng số người Dao tại Việt Nam), Yên Bái (83.888 người, chiếm 11,3% dân số toàn tỉnh và 11,2% tổng dân số người Dao tại Việt Nam), Quảng Ninh (59.156 người, chiếm 5,2% dân số toàn tỉnh), Bắc Kạn (51.801 người, chiếm 17,6% dân số toàn tỉnh), Lai Châu (48.745 người, chiếm 13,2% dân số toàn tỉnh), Lạng Sơn (25.666 người), Thái Nguyên (25.360 người) [1]. Tết: Tết cổ truyền của người Dao diễn ra cùng dịp với Tết Nguyên đán của người Việt, thường sớm hơn nửa tháng và kết thúc tương tự. Vào những ngày giáp Tết (tháng 12 âm lịch), dân bản tập trung tại nhà trưởng bản hoặc một nhà nào đó theo phiên để cùng nhau tiến hành "Tết Nhảy". Trong một năm, theo phong tục của người Dao có 3 cái Tết quan trọng là tết Thanh minh, rằm tháng Bảy và Tết năm cùng nhưng quan trọng nhất vẫn là Tết năm cùng. Vì đây là dịp báo cáo với ông bà tổ tiên về một năm lao động của gia đình, dòng họ. Lịch sử: Người Dao có nguồn gốc xa xưa ở đảo Hải Nam (Trung Quốc) gồm 7 nhóm. Người Dao ở Việt Nam và ở Lào Cai có 3 nhóm: Dao Tuyển, Dao Nga Hoàng và Dao Làn Tẻn (còn gọi là Dao Chàm) họ bắt đầu di cư sang Việt Nam vào thời Lê (vào khoảng cuối thế kỷ 17). Để đến được đất Việt, sống ở vùng núi như ngày nay, người Dao đã phải trải qua cuộc hành trình muôn phần gian khổ vượt biển, vượt núi, vượt sông. Điều này phản ánh rõ trong nhiều phong tục, nghi lễ của người Dao và được ghi lại rất tỉ mỉ trong sách cổ. Người
5 Dao di cư sang Việt Nam theo nhiều đợt từ đảo Hải Nam, qua Phòng Thành, tới Bắc Giang. Tới đây, họ di chuyển theo các hướng khác nhau là: - Theo sông Lô tới Hà Giang hình thành nên người Dao áo dài. - Theo sông Chảy tới Lào Cai, hậu duệ ngày nay gọi là Dao Tuyển. - Nhóm ở lại vùng Nga Hoàng thuộc Yên Lập, Yên Phúc một thời gian, sau đó di chuyển tới Văn Chấn (Yên Bái), rồi Văn Bàn (Lào Cai) là tổ tiên người Dao quần chẹt ngày nay. Văn hóa: Dân tộc Dao có một nền văn hóa rất phong phú và đậm đà bản sắc thể hiện qua nhiều phong tục, nhiều điệu múa đẹp, nhiều bài hát hay, kho tàng truyện cổ tích, thần thoại, ngụ ngôn, ca dao, thành ngữ, chiêm tinh, tướng số, câu đố... Nhưng cũng giống các dân tộc thiểu số khác chủ yếu tồn tại dưới dạng truyền khẩu, vốn này ngày nay cũng bị mai một, thất truyền với những lý do khách quan cũng như chủ quan. Hoạt động sản xuất: Người Dao sống chủ yếu bằng nghề trồng trọt trên nương và ruộng nước. Ngoài lúa họ còn trồng màu. Nông cụ sản xuất thô sơ nhưng kỹ thuật canh tác đã có nhiều tiến bộ. Một số nghề thủ công đã phát triển như dệt vải, rèn, mộc, làm giấy, ép dầu... Họ nuôi nhiều lợn, gà, nhưng chủ yếu dùng trong những ngày ma chay, cưới xin, lễ tết. Nhà ở có 3 loại khác nhau: nhà sàn, nhà nửa sàn nửa đất, nhà đất (nhà trệt). Đàn ông Dao trước đây để tóc dài búi sau gáy, hoặc để chỏm tóc trên đỉnh đầu. Ngày nay, hầu hết đã cắt tóc ngắn. Y phục thường gồm quần và áo ngắn, áo dài. Trang phục của phụ nữ phong phú hơn, giữ được nhiều nét trang trí hoa văn truyền thống. Phụ nữ Dao để tóc dài. Cô dâu trong ngày cưới đội mũ. Dưới chế độ cũ, cưới xin gồm nhiều nghi lễ phức tạp. Có hai hình thức ở rể: có thời hạn và vĩnh viễn. Tuy nhiên phổ biến là sau lễ cưới, vợ về nhà chồng. Ma chay phản ánh nhiều tục lệ xa xưa. Ở một vài vùng có tục hoả táng cho người chết từ 12 tuổi trở lên. Người Dao có nhiều tín ngưỡng về thần linh, ma quỷ, có một số tục lệ thờ cúng phức tạp và tốn kém. Người Dao có quan hệ họ hàng chặt chẽ và thông qua tên đệm để xác định dòng
6 họ, vai vế của người đó trong quan hệ dòng họ. Người Dao có nền văn hóa và lịch sử lâu đời. Mặc dù cơ sở kinh tế nói chung còn thấp kém, nhưng tri thức dân gian rất phong phú, đặc biệt là y học dân tộc cổ truyền. Tiếng nói thuộc nhóm ngôn ngữ Hmông - Dao, không có văn tự riêng mà sử dụng chữ Hán đã được Dao hoá, gọi là chữ Nôm Dao. Như vậy, người Dao tuy là dân tộc thiểu số nhưng phân bố rộng rãi cư trú tại 61 trên tổng số 63 tỉnh, thành phố. Người Dao cư trú chủ yếu ở biên giới Việt - Trung, Việt - Lào và một số tỉnh trung du và ven biển Bắc Bộ Việt Nam gần đây có một nhóm nhỏ chuyển vào sinh sống ở khu vực Tây Nguyên. Cụ thể, ở tại các miền rừng núi phía bắc (Hà Giang, Tuyên Quang, Lào Cai, Yên Bái, Cao Bằng, Bắc Kạn, Lai Châu…) đến một số tỉnh trung du như (Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Thái Nguyên…) và miền biển như Quảng Ninh... Đây là các tỉnh nằm dọc biên giới Việt - Trung. 1.2. Giám định gen trong khoa học hình sự Giám định gen là nghiên cứu, phân tích ADN so sánh từ các dấu vết, vật chứng có nguồn gốc sinh vật bằng kỹ thuật gen. Hiện nay Viện KHHS mới chỉ thực hiện giám định ADN người. Thông qua phân tích ADN để xác định truy nguyên, nhận dạng cá thể trong các vụ án hình sự, tìm tung tích nạn nhân, người mất tích trong các vụ cháy, vụ tai nạn, thảm họa… hoặc xác định quan hệ huyết thống [7]. 1.2.1. Lịch sử ra đời của giám định gen Thuật ngữ “DNA fingerprinting” hay “DNA typing” được mô tả lần đầu tiên vào năm 1985 bởi nhà di truyền học là tiến sỹ Alec Jeffreys. Ông đã phát hiện ra rằng trong chuỗi ADN có các trình tự bazơnitơ lặp lại nhiều lần và số lượng các trình tự lặp lại này khác nhau với từng cá thể. Bằng cách phát triển kỹ thuật để kiểm tra sự biến đổi độ dài của các trình tự ADN lặp lại này, Tiến sỹ Jeffreys đã thực hiện các thí nghiệm để nhận dạng người [29].
7 Các vùng trình tự ADN lặp lại này gọi là VNTRs (viết tắt của cụm từ variable number of tandem repeats). Các vùng VNTRs được Jeffreys sử dụng kỹ thuật đa hình độ dài giới hạn (restriction fragment length polymorphism - RFLP) để phân tích. Ông đã sử dụng một enzyme giới hạn để cắt các vùng ADN xung quanh VNTR. Phương pháp RFLP lần đầu tiên được sử dụng để truy nguyên tội phạm trong vụ án xảy ra tại nước Anh: vụ hai cô gái là Lynda Mann và Dawn Ashworth bị tấn công tình dục và sau đó đều bị sát hại vào năm 1986. Cả hai vụ giết người này xảy ra gần ngôi làng Narborough ở Leicestershire, Anh. Một người đàn ông ở địa phương đã bị nghi ngờ giết chết một trong hai cô gái, nhưng khi phân tích kiểu gen từ mẫu máu của ông này với kiểu gen phân tích được từ mẫu tinh dịch của nghi phạm để lại trên hai nạn nhân thì không trùng khớp. Đây là lần đầu tiên một phân tích ADN đã chứng minh được một người vô tội. Sau đó, người ta đã thu thập một lượng mẫu lớn từ những người đàn ông sống trong 3 làng gần đó, nhưng cũng không có người nào trùng khớp. Một năm sau, một phụ nữ đã tố giác một người đàn ông tên là Colin Pitchfork đã thực hiện vụ án, cảnh sát đã thu mẫu máu của người này và phân tích ADN thì thấy trùng khớp với mẫu tinh dịch để lại trên hai nạn nhân kia. Người này đã bị kết tội. Kể từ đó, việc giám định gen để truy nguyên con người trong các vụ án hình sự được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm khoa học hình sự trên thế giới [28,29]. Tuy nhiên kỹ thuật phân tích vùng VNTRs có nhiều hạn chế, đó là thời gian phân tích lâu (từ 6 - 8 tuần), nhiều công đoạn, chỉ phân tích được từng locus đơn lẻ mà không phân tích được các locus cùng lúc (multiplex), không phân tích được khi gặp các dấu vết ít, dấu vết bị biến tính. Các hạn chế này được khắc phục bởi kỹ thuật phân tích các đoạn lặp ngắn song song (Short Tandem Repeat - STR). Khi phân tích STR, có thể phân tích nhiều locus cùng lúc, có tính đa hình và khả năng truy nguyên cá thể cao, thời gian phân tích ngắn (chỉ 4-8 tiếng) và phân tích được các dấu vết ít, dấu vết bị
8 phân hủy, dấu vết bị lẫn (mixture). Chính vì vậy kỹ thuật phân tích STR trở nên phổ biến và là công cụ hữu ích cho giám định gen hình sự. Đây cũng là cơ sở để các hãng thương mại có thể sản xuất nhiều bộ kit phân tích gen có độ nhậy, chính xác và có khả năng tự động hóa các quy trình phân tích. Trong những năm gần đây, đã có những nghiên cứu ứng dụng các công nghệ kỹ thuật mới trong phân tích ADN hình sự, như kỹ thuật Next-Generation Sequencing (NGS) đang được nghiên cứu của công ty Illumina (miseq). Tuy nhiên, kỹ thuật phân tích STR bằng công nghệ điện di mao dẫn CE vẫn được sử dụng rộng rãi cho các phòng thí nghiệm giám định gen hình sự trên thế giới, trong đó có Viện Khoa học hình sự Việt Nam. Viện KHHS -Việt Nam được trang bị nhiều bộ kit thương mại như: bộ kit Identifler, Identifiler plus, Identifiler Direct, Globalfiler, Yfiler và Yfiler plus. Các bộ kit này được sử dụng tại các phòng thí nghiệm tiên tiến như ở FBI (Mỹ) hay Interpol. Các hệ thống cơ sở dữ liệu gen lớn đều sử dụng các chỉ thị di truyền (marker) cơ bản có trong các bộ kit này để xây dựng. 1.2.2. Khái quát trình tự STR (Sort Tandem Repeats) Bộ gen người có đến 99,7% là giống nhau, chỉ có 0,3% còn lại là khác nhau giữa các cá thể. Trong đó người ta phát hiện thấy có rất nhiều trình tự ADN lặp lại nằm rải rác khắp bộ gen người. Các đoạn lặp lại này thường nằm giữa trình tự gen, kích thước khác nhau và không ảnh hưởng đến biểu hiện kiểu hình của cá thể [28]. Bộ gen Eukaryote có đầy đủ chuỗi ADN lặp đi lặp lại, những chuỗi này có kích thước, chiều dài của đơn vị lặp đặc trưng. Các trình tự lặp có thể chứa vài trăm đến vài nghìn nucleotide. Các vùng này được phát hiện thấy xung quanh tâm động của nhiễm sắc thể [28]. Đơn vị lặp là một trình tự bazơ có độ dài trung bình gọi là các “minisatellite” hoặc VNTRs từ khoảng 8 đến 100 bp. Có những trình tự ADN có các đơn vị lặp từ 2 đến 7 bp được gọi là các
9 “microsatellites” hay các chuỗi lặp đơn giản (SSRs) hoặc là các đoạn lặp ngắn phổ biến STR (Short Tandem Repeats). STR là chỉ thị di truyền phổ biến vì chúng dễ dàng được khuếch đại bởi những cặp mồi đặc hiệu. Do số lần lặp lại STR khác nhau giữa từng cá thể nên có tính đa hình cao và có hiệu quả cho việc truy nguyên cá thể. Thực tế thì trong 0,3% bộ gen người kể trên có tới hơn một triệu trình tự STR, nằm rải rác trong toàn bộ hệ gen [28]. Các trình tự STR được đặt tên theo độ dài đơn vị lặp lại. Dinucleotide có hai nucleotide lặp lại, trinucleotides có ba nucleotide trong đơn vị lặp, tetranucleotide có bốn, pentanucleotide có 5 và hexanucleotide có sáu nucleotide. Các trình tự STR không chỉ khác nhau về độ dài, số lần lặp lại mà còn khác nhau về cách thức lặp [25, 26, 27, 28, 29]. 1.2.3. Phân loại chỉ thị STR và sử dụng STR trong giám định gen Giám định gen truy nguyên cá thể phải sử dụng các chỉ thị di truyền STR có tính đa hình cao nhất hoặc có thể kết hợp nhiều các chỉ thị di truyền với nhau. Vì kích thước của các trình tự STR nhỏ (khoảng 100 ÷ 400 bp) nên dễ dàng khuếch đại, kể cả từ các dấu vết hình sự với lượng ít hoặc bị phân hủy. Trong giám định gen hình sự, người ta thường sử dụng các trình tự STR có đơn vị lặp tetranucleotide hơn là dinucleotide và trinucleotides do hiện tượng “stutter” thường ít hơn 15% với alen thật khi thực hiện phản ứng khuếch đại với trình tự STR có đơn vị lặp là tetranucleotide. Trình tự STR được đặt tên dựa vào cấu trúc của chuỗi là đơn vị và số đơn vị lặp lại [28]. 1.2.4. Các locus STR trong bộ kit Identifler Các công ty thương mại như Applied Biosystems và the Promega đã phát triển mạnh mẽ những bộ kít sử dụng các STR có độ nhạy cao, có khả năng phân tích nhiều locus gen cùng lúc, đã đáp ứng được những ưu cầu thực tiễn của giám định gen ADN hình sự. Những bộ kit này được các tổ chức khoa học hình sự của thế giới chứng nhận.
10 Năm 1996, phòng thí nghiệm FBI của Mỹ thiết lập một bộ STR cốt lõi để đưa vào cơ sở dữ liệu quốc gia. Quá trình nghiên cứu, họ đã chọn ra 13 locus STR gồm: CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1189, D13S317, D16S539, D18S51 và D21S11 để thành lập một cơ sở dữ liệu gen CODIS [28]. Năm 2006, Viện Khoa học hình sự đã ứng dụng bộ kit Identifler (gồm 15 locus STR và 1 locus giới tính) vào công tác giám định gen. Qua quá trình đánh giá nội bộ và thực tiễn nhận thấy bộ kit đã đáp ứng tốt cho công tác giám định gen tại Việt Nam. Bảng 1.1. Các locus STR và đơn vị lặp trong bộ kit Identifiler Tên locus Vị trí trên NST Trình tự đoạn lặp Các alen D8S1179 8q24.13 phức hợp TCTA/TCTG 6 - 20 D21S11 21q21.1 phức hợp TCTA/TCTG 12 - 43.2 D7S820 7q21.11 GATA 5 - 16 CSF1PO 5q33.3-34 AGAT 5 - 17 D3S1358 3p21.31 phức hợp TCTA/TCTG 6 - 26 TH01 11p15.5 TCAT 3 - 14 D13S317 13q22-31 TATC 5 - 17 D16S539 16q24.1 GATA 4 - 17 D2S1338 2q35 phức hợp TGCC/TTCC 10 - 31 D19S433 19q12 phức hợp AAGG/TAGG 5.2 - 20 vWA 12p12-pter phức hợp TCTA/TCTG 10 - 25 TPOX 2p23-2per AATG 4 - 16 D18S51 18q21.3 AGAA 5.3 - 40 Amelogenin X: p22.1-22.3 X, Y Y: p11.2
11 D5S818 5q21-31 AGAT 4 - 29 FGA 4q28 phức hợp CTTT/TTCC 12.2 - 51.2 1.2.5. Ưu điểm và hạn chế của bộ kit Identifiler trong công tác giám định Quá trình ứng dụng bộ kit Identifiler vào công tác giám định gen tại Trung tâm giám định Sinh học pháp lý, chúng tôi nhận thấy bộ kit đã đáp ứng được các yêu cầu đặt ra đối với giám định gen phục vụ công tác điều tra các vụ việc hình sự, cũng như phục vụ giải quyết các vụ án dân sự. Bộ kít có những ưu điểm và hạn chế sau: a. Ưu điểm - Thời gian phân tích nhanh (từ 4 - 8 tiếng). - Thao tác đơn giản, ít các bước, hạn chế nhiễm. - Độ nhạy cao, có khả năng phân tích được từ dấu vết it, dấu vết bị phân hủy mạnh cho kết quả đáng tin cậy. - Có khả năng truy nguyên được cá thể, phù hợp khi phân tích gen tại các quần thể người của Việt Nam. - Được sử dụng ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới, tiêu chuẩn hóa định tên alen, nên thuận lợi trong trao đổi thông tin tội phạm trên toàn cầu. b. Hạn chế - Không đánh giá được khi gặp trường hợp đột biến gen. - Có nhiều khả năng nhiễm khi thao tác. - Giá thành cao. 1.3. Xây dựng cơ sở dữ liệu gen người phục vụ công tác giám định 1.3.1. Mục đích xây dựng cơ sở dữ liệu gen Để đánh giá mức độ hiếm hoặc phổ biến của alen thì phải thu thập dữ liệu từ nhóm người đại diện cho quần thể. Từ dữ liệu của nhóm người đại diện này dự đoán được độ tin cậy của tần suất alen và tần suất kiểu gen trong toàn bộ quần thể. Muốn vậy, trong thu mẫu nghiên cứu phải đạt được độ tin cậy về cả số
12 lượng mẫu và cả sự đại diện của mẫu. Mục tiêu chính của xây dựng cơ sở dữ liệu gen là tìm được những alen có mức độ phổ biến, hoặc những alen biến thể hoặc alen hiếm [27, 28]. 1.3.2. Quy trình xây dựng cơ sở dữ liệu gen Quyết định số lượng mẫu và nhóm dân Thường >110 cho mỗi tôc nghiên cứu nhóm Thu mẫu Thông thường thu mẫu máu trên FTA card (120 mẫu) Phân tích ADN Tổng quát Xác định tần suất alen cho mỗi locus Kiểm định cân bằng Hardy-Weinberg Kiểm định thống kê cho các alen độc lập, cân bằng liên kết cho mỗi locus độc lập Dân tộc 1 Dân tộc 2 Sử dụng cơ sở dữ liệu để ước lượng tần suất kiểu gen quan sát được Hình 1.1. Sơ đồ các bước chính xây dựng cơ sở dữ liệu gen Các phòng thí nghiệm phải lựa chọn quần thể tạo trong cơ sở dữ liệu, quyết định số mẫu được lựa chọn. Các mẫu được chọn là những người khỏe mạnh, không có quan hệ huyết thống với nhau và đại diện cho quần thể nghiên cứu. Mẫu sau khi thu thập được phân tích ADN bằng các bộ kit thương mại có tiêu chuẩn định danh alen thống nhất ở các cơ sở dữ liệu gen. Sau đó tính toán tần suất alen bằng phương pháp đếm. Tần suất alen được kiểm định cân bằng
13 Hardy - Weinberg, thông thường tần suất alen được so sánh với các quần thể khác [28]. 1.3.3. Số lượng mẫu tính toán tần suất alen Hầu hết các cơ sở dữ liệu gen STR đã công bố với số lượng mẫu từ 100 đến 200 người. Năm 1992, trong một bài báo tựa đề tiếng anh “Sample size requirement for addressing the population genetic issues of forensic use of DNA Typing” Ranajit Chakraborty nhận định từ 100 đến 150 người của mỗi quần thể là đủ cho ước lượng tần suất alen trong quần thể. Một số nghiên cứu khác cho rằng chỉ cần 100 đến 120 người là đủ để ước lượng tần suất, việc tăng thêm mẫu nghiên cứu chỉ tăng thêm khả năng quan sát alen hiếm [28]. Thông thường các phòng thí nghiệm lấy số lượng mẫu nghiên cứu là 200 người. Tuy nhiên đây cũng là số lượng được áp dụng phổ biến chứ không phải là một số lượng chính xác bản chất thống kê [30]. 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về khảo sát tần suất các alen của các locus gen sử dụng trong giám định gen 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Tổ chức Cảnh sát hình sự quốc tế (Interpol) có hiệp hội giám định ADN và rất nhiều quốc gia đã có phòng thí nghiệm giám định ADN hình sự. Mỗi phòng thí nghiệm giám định gen (ADN) đều phải đạt những chỉ tiêu chất lượng trang thiết bị máy móc cũng như con người và đều phải có các nghiên cứu, khảo sát và công bố kết quả của mình về tần suất các alen trong hệ locus gen của từng quần thể người để ứng dụng trong giám định truy nguyên cá thể hay xác định quan hệ huyết thống. Để đảm bảo tính chính xác, các phòng thí nghiệm giám định gen thường dùng hệ thống phân tích 15 locus gen như hệ Identifiler hoặc hệ Power Plex 16. Tại Mỹ, cảnh sát liên bang Mỹ đã khảo sát và sử dụng tần suất dữ liệu ADN theo hệ Identifiler của nhiều chủng tộc người khác nhau: 191 người gốc Mỹ, 290 người Mỹ gốc Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha, 349 người Mỹ da trắng và