Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tái sinh đa chồi in vitro cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:55

Thêm vào BST

Báo xấu

30
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài đã nghiên cứu khử trùng hạt; nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ và kết hợp của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin và auxin đến sự phát sinh chồi, sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên, nách lá mầm;... Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tái sinh đa chồi in vitro cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHẠM THỊ HỒNG LOAN NGHIÊN CỨU TÁI SINH ĐA CHỒI IN VITRO CÂY DIỆP HẠ CHÂU (PHYLLANTHUS URINARIA L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2018
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHẠM THỊ HỒNG LOAN NGHIÊN CỨU TÁI SINH ĐA CHỒI IN VITRO CÂY DIỆP HẠ CHÂU (PHYLLANTHUS URINARIA L.) Ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 8.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN THỊ TÂM THÁI NGUYÊN - 2018
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố. Thái Nguyên, tháng 9 năm 2018 Tác giả Phạm Thị Hồng Loan i
LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận văn, em nhận được sự quan tâm giúp đỡ của nhiều cá nhân và cơ quan đơn vị. Nay luận văn đã hoàn thành, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Trong quá trình nghiên cứu, em đã nhận được sự giúp đỡ của kĩ thuật viên Trần Thị Hồng (Phòng Công nghệ tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên). Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Em xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em thực hiện quá trình nghiên cứu. Em xin bày tỏ lòng biết ơn Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giảng dạy, tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong quá trình học tập và thực hiện luận văn. Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian học tập. Thái Nguyên, tháng 9 năm 2018 Tác giả Phạm Thị Hồng Loan ii
MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii MỤC LỤC ...........................................................................................................iii DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ........................................................... iv DANH MỤC BẢNG ............................................................................................ v DANH MỤC HÌNH............................................................................................. vi MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1 1. Đặt vấn đề ......................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................ 4 1.1. Giới thiệu chung về cây Diệp hạ châu........................................................... 4 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại .................................................................................. 4 1.1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố sinh thái của cây Diệp hạ châu ................. 4 1.1.3. Kỹ thuật trồng Diệp hạ châu ....................................................................... 5 1.1.4. Tác dụng của một số thành phần hóa học trong cây Diệp hạ châu ............ 7 1.1.5. Một số bài thuốc dân gian từ cây Diệp hạ châu ......................................... 9 1.2. Quy trình nhân giống in vitro ........................................................................ 9 1.3. Chất điều hòa sinh trưởng sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật ................. 11 1.3.1. Auxin ........................................................................................................ 12 1.3.2. Cytokinin .................................................................................................. 13 1.4. Một số nghiên cứu nuôi cấy cây dược liệu bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro ....... 14 1.4.1. Tình hình nuôi cấy in vitro cây dược liệu trên thế giới ............................ 14 1.4.2. Tình hình nuôi cấy in vitro cây dược liệu ở Việt Nam............................. 16 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 19 2.1. Vật liệu, hoá chất ......................................................................................... 19 iii
2.1.1. Vật liệu thực vật........................................................................................ 19 2.1.2. Hóa chất, thiết bị ....................................................................................... 19 2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 19 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 19 2.2.1. Pha môi trường nuôi cấy........................................................................... 19 2.2.2. Khử trùng hạt ............................................................................................ 20 2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ và kết hợp của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin và auxin đến sự phát sinh chồi, sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên ..................................................... 20 2.2.4. Nghiên cứu môi trường tạo rễ .................................................................. 21 2.2.5. Nghiên cứu giá thể đưa cây ra tự nhiên .................................................... 22 2.2.6. Xử lí và tính toán số liệu .......................................................................... 23 2.3. Điều kiện thí nghiệm ................................................................................... 23 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 24 3.1. Kết quả khử trùng hạt .................................................................................. 24 3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin đến sự phát sinh chồi, sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên .............................................................................................. 26 3.2.1. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi và sinh trưởng của chồi từ đọan thân mang mắt chồi bên ............................................................................. 26 3.2.2. Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên ......................................................................... 28 3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và NAA, BAP và IBA đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên ............................................................................................................... 30 3.3.1. Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và NAA đến phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ đoạn thân mang mắt chồi bên.................................. 31 iv
3.3.2. Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ mắt chồi bên ..................................................... 33 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA, IBA đến khả năng ra rễ của chồi Diệp hạ châu trong ống nghiệm ................................................... 34 3.4.1. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của chồi Diệp hạ châu ............ 35 3.4.2. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi Diệp hạ châu .............. 36 3.5. Kết quả ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh trưởng của cây con trong vườn ươm ........................................................................................... 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................. 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................ 40 PHỤ LỤC v
DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid BAP : 6-Benzylaminopurine CS : Cộng sự CT : Công thức ĐC : Đối chứng DNA : Deoxyribonucleic acid IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid Kinetin : 6-furfurylaminopurine MS : Murashige và Skoog, 1962 NAA : Naphthalene acetic acid iv
DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt (sau 10 ngày) ................................................. 24 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên ............................................... 27 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên ............................................... 29 Bảng 3.4. Ảnh hưởng kết hợp của BAP 1,0mg/l và NAA đến sự phát sinh chồi và sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên......... 31 Bảng 3.5. Ảnh hưởng kết hợp của BAP 1,0mg/l và IBA đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên .... 33 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ (sau 8 tuần)...................... 35 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ (sau 8 tuần)...................... 37 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sinh trưởng của Diệp hạ châu (sau 45 ngày) ............................................................................. 39 v
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây Diệp hạ châu ................................................................................. 5 Hình 3.1. Ảnh hưởng của BAP 1,0mg/l đến phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên (sau 8 tuần)................ 28 Hình 3.2. Ảnh hưởng của kinetin 1,0mg/l đến phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên (sau 8 tuần) ................ 30 Hình 3.3. Ảnh hưởng kết hợp của BAP 1,0mg/l và NAA 0,8mg/l đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên (sau 8 tuần) ......................................................................... 32 Hình 3.4. Ảnh hưởng kết hợp của BAP 1,0mg/l và IBA 0,8mg/l đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi của từ đoạn thân mang mắt chồi bên (sau 8 tuần) ................................................................................. 34 Hình 3.5. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ (sau 8 tuần) ...................... 36 Hình 3.6. Rễ Diệp hạ châu trong môi trường bổ sung IBA 0.5mg/l (sau 8 tuần) ...... 38 Hình 3.7. Cây Diệp hạ châu trong chậu (45 ngày) ............................................ 39 vi
MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Viêm gan B là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến trên thế giới, một trong những nguyên nhân gây tử vong nhiều nhất. Hiện nay, trên toàn cầu có ít nhất 2 tỷ người đang mang trên người virus viêm gan B, khoảng 400 triệu người đang bị viêm gan B mãn tính và sẽ có ít nhất 250 ngàn người thiệt mạng mỗi năm. Việt Nam là thuộc các nước với tỷ lệ viêm gan B cao nhất thế giới. Cứ 6 đến 7 người Việt Nam thì có 1 người đang bị nhiễm virus viêm gan B. Căn bệnh này nếu được phát hiện ở giai đoạn đầu điều trị khỏi bệnh là rất lớn. Hiện nay nhu cầu thuốc chữa viêm gan B và các loại bệnh khác rất cao đặc biệt các chế phẩm thuốc từ cây dược liệu [5]. Trong tài liệu “Chiến lược quốc gia phát triển ngành dược Việt Nam giai đoạn đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030” (được ban hành theo quyết định số 68/QĐ -TTg ngày 10/01/2014 của Thủ tướng Chính phủ) đã đưa ra mục tiêu cụ thể, đến năm 2020 Việt Nam phấn đấu sản xuất được 20% nhu cầu nguyên liệu cho sản xuất thuốc trong nước. Thuốc được sản xuất trong nước chiếm 80% tổng giá trị thuốc tiêu thụ trong năm. Trong đó, thuốc từ dược liệu chiếm 30%. Để thực hiện một trong các trọng điểm của định hướng chiến lược phát triển của ngành Y - Dược là đẩy mạnh công tác trồng trọt cây thuốc trên quy mô lớn, phát triển nguồn dược liệu hàng hoá phục vụ cho việc điều trị trong nước và xuất khẩu, mở ra cơ hội lớn cho việc giao thương, tham gia thị trường quốc tế về dược liệu và dược phẩm có nguồn gốc tự nhiên. Vì thế, việc trồng và bảo tồn cây dược liệu rất cần thiết. Đẩy mạnh nghiên cứu, ứng dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật để tạo ra các loại giống dược liệu có năng suất, chất lượng đáp ứng yêu cầu sản xuất [26]. Diệp hạ châu là cây thuốc có dược tính sử dụng để chữa nhiều bệnh ở người. Vùng phân bố của Diệp hạ châu khá rộng, cây mọc hoang tại Việt Nam 1
và nhiều nước khác trên thế giới, như Ấn Độ, Trung Quốc, Cu Ba, Peru, Nigeria, Malaysia, Philippines, Guam, Brazil... [2], [3], [27]. Cây Diệp hạ châu có nhiều tác dụng trong việc điều trị viêm gan B. Trong cây Diệp hạ châu có chứa phyllathin, hypophyllanthin, triacontanal có nhiều tác dụng chữa bệnh, đặc biệt là khả năng giải độc, khôi phục chức năng bình thường của gan, tốt trong các trường hợp suy giảm chức năng gan do sử dụng nhiều bia rượu. Các chất này làm gia tăng lượng glutathione - chất bảo vệ gan thường bị thiếu trầm trọng ở những người thường xuyên sử dụng bia rượu. Năm 1995, các nhà khoa học Brazil cũng phát hiện tác dụng giảm đau mạnh và bền vững của loài cây này. Tác dụng này là do gallic acid, có khả năng bảo vệ khi gan bị viêm, tổn thương gan do bia rượu. Theo y học cổ truyền, Diệp hạ châu vị đắng hơi ngọt, tính mát, quy kinh vào can, đởm nên có tác dụng kích thích tiêu hóa, tăng tiết mật, giải độc [13], [28], [29]. Hàm lượng các dược chất trong Diệp hạ châu tự nhiên rất thấp, lá khô chứa các chất đắng hypophylathin (0,05%), phylanthin (0,35%) [29]. Một trong những biện pháp tăng lượng phyllathin, hypophyllanthin, triacontanal trong diệp hạ châu là phương pháp chuyển gen tăng hoạt tính của enzyme xúc tác các phản ứng tạo dược chất. Tuy nhiên, để chuyển gen thành công điều kiện tiên quyết là phải xây dựng hệ thống tái sinh phù hợp. Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài luận văn: “Nghiên cứu tái sinh đa chồi in vitro cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Tối ưu được môi trường tái sinh đa chồi cây Diệp hạ châu. Xác định được giá thể phù hợp để đưa cây ra ngoài tự nhiên. 3. Nội dung nghiên cứu (1) Nghiên cứu khử trùng hạt. (2) Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ và kết hợp của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin và auxin đến sự phát sinh chồi, sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên, nách lá mầm. 2
(3) Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA, IBA đến khả năng ra rễ của Diệp hạ châu trong ống nghiệm. (4) Xác định loại giá thể thích hợp để đưa cây ra ngoài tự nhiên. 3
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cây Diệp hạ châu 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại Tên gọi: Tên Việt Nam: Diệp hạ châu Tên khoa học: Phyllanthus urinaria L. Tên khác: Chó đẻ răng cưa, cây Cau trời, Diệp hậu châu, nhật khai dạ bế, Diệp hòe thái, Lão nha châu. Phân loại: Diệp hạ châu thuộc giới thực vật (Plantae). Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta). Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida). Bộ Sơ ri (Malpighiales). Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). Chi Phyllanthus [2], [3], [15]. 1.1.2. Đặc điểm hình thái và phân bố sinh thái của cây Diệp hạ Châu Cây Diệp hạ châu là một loại cỏ mọc hằng năm, cao chừng 30cm, thân gần như nhẵn, mọc thẳng đứng, mang cành. Lá mọc so le, phiến lá thuôn, dài từ 5 đến 15 mm, rộng từ 2-5 mm, đầu nhọn hay hơi tù, mép nguyên hơi có răng cưa rất nhỏ, mặt dưới lá trắng xanh, không cuống hay có cuống rất ngắn. Hoa mọc ở kẽ lá, nhỏ, màu đỏ nâu, đơn tính, hoa đực ở đầu cành hoa, cái ở dưới. Hoa có cuống rất ngắn. Quả nang, hình cầu, hơi dẹt, mọc rủ xuống ở dưới lá, có khía mờ và có gai, hạt hình 3 cạnh. Đường kính quả có thể đạt tới 2 mm, treo dưới lá (Diệp hạ châu nghĩa là hạt dưới mặt lá). Hạt ba cạnh, hình trứng, màu nâu nhạt, có vân ngang. Mùa hoa: tháng 4 – 6. Mùa quả: tháng 7 – 9 [32]. Diệp hạ châu phân bố trên các cánh đồng khô, ven đường, vùng đất bỏ hoang, bìa rừng; dưới độ cao 100 – 600m tại Ấn Độ, Đài Loan, Indonesia, Lào, Malaysia, Myanma, Nepal, Nhật Bản, Sri Lanka, Thái Lan, Trung Quốc (các tỉnh An Huy, Phúc Kiến, Quảng Đông, Quảng Tây, Quý Châu, Hải Nam, Hà Bắc, Hà Nam, Hồ Bắc, Hồ Nam, Giang Tô, Giang Tây, 4
Thiểm Tây, Sơn Đông, Sơn Tây, Tứ Xuyên, Tây Tạng, Vân Nam, Chiết Giang), Việt Nam và Nam Mỹ [2], [3]. Hình 1.1. Cây Diệp hạ châu 1.1.3. Kỹ thuật trồng Diệp hạ châu Cách làm đất trồng cây: Cây có thể phát triển trên mọi loại đất, trừ đất trũng, nơi úng ngập. Tốt nhất là đất pha cát và đặc biệt đất phải đủ ẩm. Có thể trồng riêng rẽ hoặc xen canh trong vườn cây ăn quả chưa khép tán. Diệp hạ châu trồng trên đất pha cát hay đất cát pha và đất bạc màu,được cày bừa kỹ, trừ hết cỏ dại. Nếu đất có pH dưới 5, cần bón lót tới 1 tấn vôi bột/ha. Để thuận lợi cho việc chăm sóc, đất trồng diệp hạ châu cần lên luống rộng 1-1,5m, cao 20-25cm và rãnh rộng 30cm. Cách chọn hạt giống: 5
Đảm bảo việc chọn lựa hạt giống chất lượng. Việc lựa chọn hạt giống rất quan trọng vì nó sẽ giúp cây phát triển tốt, chọn giống tốt, thuần chủng thì dược liệu sẽ có năng suất và hiệu quả chữa bệnh cao. Sau 2 tuần gieo hạt: Đất vườn ươm được cày bừa kỹ, vơ hết cỏ, bón lót phân quy ra 1 ha: phân chuồng 30 tấn, phân vi sinh 10 tấn; vôi bột 500kg. Đất vườn ươm lên luống rộng 1m, cao 20 - 25cm. Lượng hạt giống gieo trong vườn ươm 3g/m2 đất (Nếu gieo thẳng vào luống thì lượng hạt giống là 1g hạt giống/10m2 đất). Trước khi gieo cần xử lý bằng Atonik với tỷ lệ 1 gói Atonik 10g pha với 40 lít nước cho 8 kg hạt giống. Hạt ngâm trong dung dịch này 4 giờ, sau vớt ra để ráo nước, trộn với cát ẩm ủ 3-4 ngày cho đến khi thấy nứt nanh thì đem gieo. Đề phòng kiến ăn hạt, sau khi gieo cần phun thuốc basudin (theo liều lượng được nhà sản xuất ghi trên bao bì). Gieo vãi đều trên mặt luống, xoa nhẹ mặt luống cho lấp hạt, dùng rơm rạ che phủ rồi tưới nước cho ướt rơm rạ để giữ ẩm cho đất. Sau 10 ngày có thể bỏ vật che phủ. Hạt Diệp hạ châu sẽ mọc sau 5-7 ngày. Khi câu con có 3-4 lá thật cần tỉa bỏ những cây yếu, chỉ để lại mật độ 2x2 cm/cây. Quá trình chăm sóc cây con ở vườn ươm đơn giản, luôn tưới nước cho đất ẩm, sau 20-25 ngày nhổ đi trồng. Lúc này cây giống cao 10cm, thân mập, có bộ rễ phát triển thì chúng ta tiến hành đánh cây đi trồng ra hốc. - Chăm sóc cây trồng: Để thuận lợi cho việc chăm sóc, đất trồng Diệp hạ châu cần lên luống rộng 1-1,5m, cao 20-25cm và rãnh rộng 30cm. Khi cây cao 10-15cm thì chúng ta có thể tiến hành trồng ra hốc. Với khoảng cách cây cách cây 20×20cm. Cây trồng xong, tưới nước ngay, sau 3 ngày dùng dung dịch Atonik 0,1% (1 gói 10g pha với 10 lít nước) phun vào luống cho cây mau bén rễ, 6
sau 7 ngày xới đất phá váng lần 1, sau 10 ngày phun dung dịch Atonik lần 2, cây trồng cần làm cỏ và xới đất 1 lần nữa trước khi tán lá giao nhau. Lưu ý: do trồng vào mùa khô nên thường xuyên phải tưới nước. Thời gian tưới nước tốt nhất là lúc chiều tối hoặc trước 9h sán - Thu hoạch quả: Chọn cành có nhiều quả già. Diệp hạ châu thu hoạch lứa đầu tiên khi 3/4 số cây có hoa quả.Thu hoạch cây: Cắt cây, chừa khoảng 20cm gốc (để các cành ngủ mau tái sinh). - Bảo quản phơi khô: Khi phơi phải trải mỏng, dưới lót tấm vải nhựa để tránh rơi mất hạt, sau 3 ngày phơi nắng trực tiếp hoặc hong gió, quả già sẽ tách vỏ hết. Để kiểm tra độ khô thì ta tiến hành bẻ thân, thấy cây khô giòn là được. Thu lấy hạt và cành lá rụng để bảo quản. Hạt để làm giống (thu lấy hạt, loại bỏ tạp chất, phơi lại 1-2 nắng cho khô), lá và cành khô làm thuốc. Để hạt khô trong chai, lọ sạch khô kín. Cành và lá diệp hạ châu- cây chó đẻ sau khi thu hạt cho vào túi khô, sạch kín và đây là dược liệu chính phẩm [33]. 1.1.4. Tác dụng của một số thành phần hóa học trong cây Diệp hạ châu Các hợp chất có hoạt tính trong Diệp hạ châu là ligan (phyllanthin, hypophyllanthin, nirurin niranthin, phytetralin, niranthine…), flavonoids, amariinn, furosin, amariinn acid, amarulone, triterpenes, sterol, alkaloids… Nirtetralin, niranthin và phyltetralin ức chế carrageenan tạo ra trong quá trình viêm và sự lan tràn bạch cầu trung tính. Trong vai trò kháng virus viêm gan, niranthin cũng thể hiện hoạt tính chống HBsAg còn henokinin thể hiện hoạt tính chống HBeAg. Ellagitanins garaniin và corilagin được chứng minh là chất trung gian có tiềm năng kháng lại sự nhân lên của HIV-1 trong tế bào Hela CD4+. Các phức chất phenol trong dịch chiết với nước của Diệp hạ châu có hoạt tính chống oxi hóa mạnh nhất là phyllanthin, amriin, repandusinic acid và phyllanthin D. Hoạt tính chống ung thư được thử nghiệm trên chuột với hỗn hợp phyllanthin và hypophyllathin (1:1). Phyllanthin được chứng minh vai trò bảo vệ tế bào gan chuột gây đọc với ethanol hoặc CCl4 [21], [30]. 7
Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng bảo vệ gan của chất chiết Diệp hạ châu hoặc những hoạt chất từ Diệp hạ châu. Chirdchupunseree và Pramyothin (2010) chứng minh vai trò của phyllanthin trong việc bảo vệ tế bào gan do đối kháng với những ảnh hưởng gây độc gan của cồn ethanol. Chất này cũng phục hồi lại khả năng chống oxy hóa của tế bào gan chuột, bao gồm glutathione tổng số, hoạt tính của glutathione tổng số và hoạt tính của glutathione reductase [20], [21]. Theo nghiên cứu của Raphael và Khutan (2003), dịch chiết thân và rễ Diệp hạ châu trong methanol với liều 50, 200 và 1000 mg/kg thể trọng dùng theo đường uống đã ức chế loét dạ dày của chuột Wistar gây bệnh thực nghiệm bằng ethanol tuyệt đối. Các thông số gồm hệ số loét, chảy máu giảm đáng kể khi dùng Diệp hạ châu đắng. Một nghiên cứu khác của Odetola và Akojenu (2000), dịch chiết diệp hạ châu đắng thử nghiệm có khả năng trì hoãn thời gian bắt đầu tiêu chảy, giảm tần số đi phân dẫn đến ức chế nhu động ruột 79,9% so với 86,9% do tác động của morphine được dùng như đối chứng [30]. Theo bài tổng hợp năm 2011, Patel và cộng sự đã tóm lược nhiều kết quả nghiên cứu chứng minh quan trọng cả về cơ bản và ứng dụng của chất chiết Diệp hạ châu hoặc các hoạt chất với nhiều tác dụng khác như chống ung thư, chống sốt rét, lợi tiểu, hạ đường huyết và giảm cholesterol trong máu, điều hòa miễn dịch bảo vệ thận. Ngoài ra, bài báo này cũng cho biết rằng sau nhiều năm nghiên cứu, người ta chưa phát hiện ra tác dụng phụ hay độc tính của Diệp hạ châu [30]. Tại Việt Nam, nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng điều trị viêm gan của Diệp hạ châu đã được tiến hành. Nhóm nghiên cứu của Lê Võ Định Tường (Học Viện Quân Y) đã thành công với chế phẩm Hepamarin từ Phyllanthus amarus. Nhóm nghiên cứu của Trần Danh Việt, Nguyễn Thượng Dong (Viện Dược Liệu) với bột Phyllanthin (2001) [31]. 8
Đã có một số công trình nghiên cứu về tác dụng điều trị viêm gan của Diệp hạ châu. Song các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào chiết xuất các chất có dược tính và ứng dụng trong điều trị bệnh. 1.1.5. Một số bài thuốc dân gian từ cây Diệp hạ châu Tác dụng chữa viêm gan siêu vi B, cách làm: 30g cây Diệp hạ châu,12g nhân trần,12g sài hồ,8g chi từ,12g hạ khô tảo.Tất cả sấy khô dùng để sắc lấy nước uống ngày 1 tháng. Chữa viêm gan do virus: Diệp hạ châu sao khô 20 g, sắc nước 3 lần. Trộn chung các nước sắc, thêm 50g đường đun sôi cho tan, chia làm 4 lần uống trong ngày. Khi kết quả xét nghiệm HBsAg (-) thì ngừng thuốc. Chữa suy gan (do sốt rét, sán lá, lỵ amip, ứ mật, nhiễm độc): Cây Diệp hạ châu sao khô 20g, cam thảo đất sao khô 20g. Sắc nước uống hằng ngày. Chữa nhọt độc sưng đau: Dùng một nắm cây Diệp hạ châu với một ít muối giã nhỏ, chế nước chín vào, vắt lấy nước cốt uống, dùng bã đắp chỗ đau. Chữa bị thương ứ máu: Dùng lá, cành Diệp hạ châu và Mần tưới, mỗi thứ một nắm, giã nhỏ chế nước đồng tiện vào, vắt lấy nước uống, bã thì đắp hoặc hòa thêm bột Ðại hoàng 8-12g càng tốt (Hoạt nhân toát yếu). Chữa xơ gan cổ trướng: Cây Diệp hạ châu sao khô 100g sắc nước 3 lần. Trộn chung nước sắc, thêm 150g đường, đun sôi cho tan đường, chia nhiều lần uống trong ngày (thuốc rất đắng), liệu trình 30 – 40 ngày. Khẩu phần hằng ngày phải hạn chế muối, tăng đạm (thịt, cá, trứng, đậu phụ). Chữa ăn không ngon miệng, đau bụng, sốt, nước tiểu màu sẫm: Dùng cây Diệp hạ châu 1g, nhọ nồi 2g, xuyên tâm liên 1g. Tất cả các vị thuốc trên phơi khô trong bóng râm và tán bột. Sắc bột thuốc này và uống hết ngay một lúc. Uống mỗi ngày 3 lần (y học dân gian Ấn Độ) [2], [3]. 1.2. Quy trình nhân giống in vitro Quy trình nhân giống in vitro gồm các giai đoạn sau: Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc Vì trong nuôi cấy in vitro cây con sẽ mang những đặc tính và tính trạng cây mẹ ban đầu nên trong giai đoạn này cần chọn cây mẹ cẩn thận, cây mẹ 9
thường là cây khỏe, có giá trị kinh tế cao. Sau đó chọn cơ quan để lấy mẫu thường là mô non, đoạn thân có chồi ngủ, lá non, hoa non. Mô chọn để nuôi cấy thường là mô có khả năng tái sinh cao trong môi trường nuôi cấy sạch bệnh, giữ được các đặc điểm sinh học quý của cây, ít nguy cơ biến dị. Tùy theo điều kiện giai đoạn này có thể kéo dài 3 – 6 tháng [9], [18]. Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống cấy vô trùng Là giai đoạn chuyển mẫu vật từ ngoài môi trường vào nuôi cấy để tạo nguyên liệu sạch bệnh cho nhân giống, giai đoạn này được tiến hành theo các bước: (1) Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị các môi trường nuôi cấy. (2) Cấy mẫu vật vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn môi trường nhân tạo (giai đoạn này gọi là giai đoạn cấy mẫu in vitro). Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm, virus sẽ được nuôi trong phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp. Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy đã bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào, hoặc các cơ quan, hoặc các phôi vô tính. Giai đoạn này phụ thuộc vào đặc điểm sinh lý sinh thái của từng đối tượng đem nhân giống. Thông thường kéo dài từ 2 – 12 tháng hoặc ít nhất 4 lần cấy chuyển [18]. Giai đoạn 3: Giai đoạn nhân nhanh chồi Đây là giai đoạn quyết định hiệu quả của quá trình nuôi cấy mô, cây được nhân nhanh theo nhu cầu của người nuôi cấy. Khi mẫu sạch đã được tạo ra và từ đó nhân được các cụm chồi và các phôi vô tính sinh trưởng tốt, quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn sản xuất. Cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy. Thành phần và điều kiện môi trường cần được tối ưu hóa nhằm đạt được mục tiêu nhân nhanh. Đối với môi trường nhân chồi, sử dụng các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin (BAP, kinetin) với nồng độ khác nhau tùy từng đối tượng. Giai đoạn nhân nhanh chồi từ vài chồi ban đầu không nên kéo dài quá lâu để tránh hình thành các biến dị soma [18]. 10