intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đồng thời SMV và BYMV

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:56

Thêm vào BST
Báo xấu
10
lượt xem 1
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật biến nạp cấu trúc RNAi vào mô lá cây thuốc lá C9-1 thông qua lây nhiễm A. tumefaciens tái tổ hợp; phân tích sự có mặt của đoạn gen chuyển trong cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR; nghiên cứ u lây nhiễm virus và phân tích số lượng bản sao virus SMV trong cây thuốc lá chuyển gen chứ a cấu trúc CPi (SMV-BYMV) bằng kỹ thuật Real time RT -PCR.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đồng thời SMV và BYMV

  1. i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ PHƯƠNG NGÂN NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG THUỐC LÁ CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi KHÁNG ĐỒNG THỜI SMV VÀ BYMV LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 60.42.01.21 Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 4/2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Thái Nguyên - 8/ 2014
  2. i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi được thực hiện dưới sự hướng dẫn của GS.TS. Chu Hoàng Mâ ̣u. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác. Thái Nguyên, ngày 10 tháng 4 năm 2015 Tác giả ̣ Nguyễn Thi Phương Ngân Ban chủ nhiê ̣m khoa Cán bộ hướng dẫn khoa học GS.TS. Chu Hoàng Mâ ̣u Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
  3. ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành Bản luâ ̣n văn tha ̣c si ̃ này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, cảm ơn Ban chủ nhiê ̣m khoa và các thầy cô khoa Sinh - KTNN đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành đề tài luận văn. Tôi xin cảm ơn các cán bô ̣ Phòng ADN ứng du ̣ng, Phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghệ gen, Viêṇ Công nghê ̣ sinh ho ̣c, Viêṇ Hàn lâm Khoa học và Công nghê ̣ Viê ̣t Nam đã ta ̣o điề u kiêṇ và giúp đỡ tôi trong quá trình tiế n hành thí nghiê ̣m của đề tài. Tôi xin cảm ơn Tiến sỹ Lò Thị Mai Thu và Thạc sĩ Lê Thị Hồng đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiêṇ đề tài luận văn. Đề tài luận văn thuộc chương trình đào tạo nghiên cứu sinh và cao học của Bộ môn Di truyề n & Sinh học hiê ̣n đại, khoa Sinh-Kỹ thuật nông nghiê ̣p, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. Tác giả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
  4. iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN…………………………………………………….. i LỜI CẢM ƠN........................................................................................ ii MỤC LỤC............................................................................................. iii DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT..................................................... iv DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................... v DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................... vii MỞ ĐẦU……………………………………………………………... 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………......... 4 1.1. SOYBEAN MOSAIC VIRUS VÀ BEAN YELLOW MOSAIC VIRUS........................................................................................................ 4 1.1.1. Bệnh khảm ở cây đậu tương........................................................ 4 1.1.2. Hệ gen của SMV, BYMV và Potyvirrus .................................... 8 1.2. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RNAi TRONG TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS............................................................. 11 1.2.1. Cây thuốc lá và bệnh virus trên cây thuốc lá............................... 11 1.2.2. Cơ chế RNA interference (RNAi)............................................... 14 1.2.3. Ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo cây trồng chuyển gen kháng 16 virus....................................................................................................... 1.3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ TRONG PHÂN TÍ CH CÂY 18 CHUYỂN GEN ........................................................................................ Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BI...................................... ̣ 22 2.1.1. Vật liệu........................................................................................ 22 2.1.2. Hóa chất...................................................................................... 22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
  5. iv 2.1.3. Thiết bị........................................................................................ 22 2.1.4. Địa điểm nghiên cứu.................................................................. 23 2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................... 23 2.2.1. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua Agrobacterium tumefaciens.................................................................. 23 2.2.2. Phân tích sự có mặt của cấu trúc chuyển gen pK7GW/SMV- BYMV-CPi bằng phương pháp PCR………………………………… 26 2.2.3. Lây nhiễm nhân tạo SMV và BYMV vào lá cây thuố c lá ……. 28 2.2.4. Phân tích số lượng bản sao virus trong cây thuốc lá chuyển gen chứa cấu trúc CPi (SMV-BYMV) bằng kỹ thuâ ̣t Real time RT- 29 PCR…………………………………………………………………... Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN............. 30 3.1. KẾT QUẢ CHUYỂN CẤU TRÚ C pK7GW/SMV-BYMV-CPi VÀO THUỐC LÁ..................................................................................... 30 3.1.1. Đồng nuôi cấy với dung dịch A. tumeffaciens và cảm ứng tạo 30 cu ̣m chồi................................................................................................ 3.1.2. Tạo rễ và phát triển cây chuyể n gen hoàn chỉnh ……………... 33 3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍ CH CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN........... 35 3.2.1. Kết quả kiểm tra cấ u trúc RNAi trong các dòng thuốc lá chuyển gen ........................................................................................... 35 3.2.2. Phân tích khả năng kháng virus của các dòng cây chuyển gen CPi (SMV-BYMV) trong điề u kiêṇ lây nhiễm nhân tạo ..................... 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHI…………………………………….......... ̣ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………........ 41 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
  6. iv DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT AS Acetosyringone A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-Benzyl Amino Purine BGMV Bean Golden Mosaic Virus BYMV Bean yellow mosaic virus bp Base pair (cặp base) CP Coat protein (protein vỏ) CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide cs Cộng sự ĐC Đối chứng EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetate Acid DNA Deoxyribo Nucleic Acid GA3 Gibberellic acid GM Môi trường tạo chồi hpRNA Hairpin RNA (cấu trúc RNA kẹp tóc) IhpRNA Intron hairpin RNA (Cấu trúc kẹp tóc mang intron) IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3butyric acid Kb Kilo base Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
  7. v LB Luria and Bertani MS Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) PCR Polymerase chain reaction RM Môi trường ra rễ RNAi RNA interference siRNA Short interfering RNA SMV Soybean mosaic virus T0, T6, T12 Các dòng thuốc lá chuyển gen TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus Vir Virulence Region WT1, WT2, WT3 Cây thuốc lá không chuyển gen Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
  8. v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trường tái sinh in vitro………….. 24 Bảng 2.2. Thành phần dung dịch đệm tách DNA tổng số……………. 26 Bảng 2.3. Trình tự nucleotide của că ̣p mồ i PCR khuế ch đa ̣i đoa ̣n Cpi 28 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen Cpi ........................................................................................................ 28 Bảng 3.1. Kết quả cảm ứng chồi từ mảnh lá…………………………. 31 Bảng 3.2. Kết quả tạo chồi từ mảnh lá………………………………... 33 Bảng 3.3. Kế t quả tạo rễ và tái sinh cây thuốc lá ở thí nghiệm và đối chứng………………………………………………………………….. 34 Bảng 3.4. Kết quả định lượng sự có mặt của virus SMV trong cây thuốc lá chuyển gen…………………………………………………... 39 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
  9. vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Lá cây đậu tương bị nhiễm SMV ...............................................................5 Hình 1.2. Sơ đồ cấu trúc hệ protein của potyvirus ....................................................9 Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pK7GW-CPi (SMV-BYMV) ............11 Hình 1.4. Cây thuốc lá giống C9-1 ...........................................................................11 Hình 1.5. Cơ chế hoạt động RNAi ..........................................................................15 Hiǹ h 3.1. Các mảnh lá được ngâm trong dung dịch huyền phù vi khuẩn A.tumefaciens tái tổ hơ ̣p ...........................................................................................31 Hình 3.2. Hình ảnh phát sinh cu ̣m chồ i. ...................................................................32 Hình 3.3. Hình ảnh tạo rễ trên môi trường kháng sinh chọn lọc ..............................34 Hin ̀ h 3.4. Các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hê ̣ T0 trồ ng trên châ ̣u trong nhà lưới ...................................................................................................................................35 Hình 3.5. Kế t quả điện di kiể m tra DNA tổng số tách từ các mẫu lá cây thuốc lá chuyể n gen ................................................................................................................35 Hình 3.6. Kế t quả điện di kiể m tra sản phẩ m PCR nhân đoa ̣n CPi (SMV-BYMV) từ 21 dòng cây thuốc lá chuyể n gen ..............................................................................36 ̀ h 3.7. Hình ảnh mô ̣t số dòng thuố c lá chuyể n gen và đố i chứng .......................37 Hin Hình 3.8. Đồ thị khuếch đại đoa ̣n cDNA từ các mẫu thuốc lá trong phân tích Real time RT-PCR .............................................................................................................38 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
  10. 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là một loại cây trồng cạn có giá trị kinh tế và hàm lượng dinh dưỡng cao. Hạt đậu tương được dùng làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc. Ngoài ra những sản phẩm như khô dầu đậu tương còn được dùng làm mực in, sơn, xà phòng, chất dẻo, thuốc trừ sâu... Hạt đậu tương còn được dùng nhiều trong y học, giúp tránh hiện tượng suy dinh dưỡng ở trẻ em, người già; hạn chế bệnh loãng xương ở phụ nữ; bệnh đái tháo đường, thấp khớp... Ngoài ra đậu tương là cây trồng ngắn ngày, rất thích hợp cho luân canh, xen canh gối vụ với nhiều loại cây khác và là cây cải tạo đất rất tốt [4]. Việt Nam là một nước nông nghiệp, trong đó đậu tương cũng là một trong những cây trồng chủ đạo. Mặc dù đã bắt đầu tiến hành sản xuất trên quy mô công nghiệp từ năm 2011 nhưng Việt Nam vẫn tiếp tục phải nhập khẩu phần lớn lượng bột đậu tương nhằm bù đắp sự thiếu hụt về thực phẩm protein trong nước và đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của ngành công nghiệp thức ăn chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản. Năng suất và sản lượng đậu tương của nước ta còn ở mức khá thấp có thể do các nguyên nhân như: Nhiều giống hiện trồng mặc dù năng suất khá nhưng do tính ổn định chưa cao, sức biến động khá lớn giữa các miền, các vùng; Khả năng kháng virus và sâu bệnh của các giống đậu tương đang trồng rất thấp; Chưa có những dự báo về thời vụ gieo trồng thích hợp cho từng vùng. Đậu tương là một trong số các cây trồng dễ bị nhiễm nhiều loại virus, ví dụ như bệnh khảm (Soybean mosaic virus - SMV), bệnh khảm vàng ở đậu tương (Soybean yellow mosaic virus - SYMV), bệnh xoăn lá, bệnh gỉ sắt hại đậu tương do nấm Phakopsora pachyrhizi, bệnh Sương mai (đốm phấn) do nấm Peronospora manshurica, bệnh lở cổ rễ do nấm Rhizoctonia solani hoặc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
  11. 2 Fusarium solani fsp phaseoly, bệnh đốm lá vi khuẩn hại đậu tương và một số bệnh hại khác. Thống kê trên thế giới cho thấy có hơn 100 loại virus gây hại trên cây đậu tương. Bệnh virus đậu tương phân bố rộng khắp và gây thiệt hại lớn đến năng suất và chất lượng nông sản. Với đặc điểm khí hậu thời tiết ở nước ta, đậu tương rất dễ bị nhiễm nhiều loại virus, trong đó Soybean mosaic virus (SMV) gây bệnh khảm lá và Bean yellow mosaic virus (BYMV) gây bệnh khảm vàng là hai loại virus có tác đô ̣ng xấ u lớn nhất đến sự sinh trưởng, phát triển và năng suất cây đậu tương. SMV và BYMV có thể nhiễm đồng thời trên cùng một cây và triệu chứng biể u hiêṇ rất khó phân biệt. Ảnh hưởng của việc nhiễm cùng lúc nhiều loại virus khác nhau dẫn tới năng suất đậu tương có thể bị giảm từ 66% - 80% (Hartman và cs 1999) [34]. Hiện nay, trong sản xuất đậu tương chủ yếu mới dừng ở biện pháp phòng mà chưa có thuốc trị bệnh khảm do SMV và BYMV gây nên. Một trong những biện pháp phòng hai loài SMV và BYMV có hiệu quả là sử dụng các giống đậu tương kháng bệnh. Tuy nhiên nguồn giống đậu tương kháng bệnh tự nhiên đối với SMV và BYMV là rất hạn chế. Chính vì vậy hướng tiếp cận tạo cây đậu tương chuyển gen kháng virus được quan tâm nghiên cứu, đó là chuyển các gen có nguồn gốc từ chính loài virus gây bệnh theo nguyên lý của kỹ thuật RNA interference (RNAi). Thuốc lá là cây mô hình được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu chuyển gen ở thực vật. Cây thuốc lá rất dễ nhiễm các loài virus thuộc nhóm Potyvirus. Hai loài SMV, BYMV gây bệnh khảm ở cây đậu tương cũng thuộc nhóm virus này. Kết quả thử nghiệm thành công chuyển cấu trúc RNAi vào cây thuốc lá và đánh giá tính kháng đối với hai loài SMV, BYMV của cây thuốc lá chuyển gen sẽ là cơ sở để thực hiện mục tiêu tạo cây đậu tương chuyển gen kháng đồng thời hai loài SMV và BYMV theo nguyên lý của kỹ thuật RNAi. Xuất phát từ những cơ sở trên chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
  12. 3 đề tài: “Nghiên cứu tạo dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đồng thời SMV và BYMV” 2. Mục tiêu nghiên cứu Tạo được dòng cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả năng kháng virus gây bê ̣nh khảm từ giống thuốc lá C9-1. 3. Nội dung nghiên cứu (1) Nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen bằ ng kỹ thuâ ̣t biến nạp cấu trúc RNAi vào mô lá cây thuốc lá C9-1 thông qua lây nhiễm A. tumefaciens tái tổ hợp; (2) Phân tích sự có mặt của đoạn gen chuyển trong cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR; (3) Nghiên cứu lây nhiễm virus và phân tích số lượng bản sao virus SMV trong cây thuốc lá chuyển gen chứa cấu trúc CPi (SMV-BYMV) bằ ng kỹ thuâ ̣t Real time RT-PCR. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
  13. 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. SOYBEAN MOSAIC VIRUS VÀ BEAN YELLOW MOSAIC VIRUS ̣ khảm ở cây đâ ̣u tương 1.1.1. Bênh Đậu tương nói riêng và thực vâ ̣t nói chung dễ bị nhiễm các bênh ̣ như ̣ khảm, bệnh xoăn lá do virus; bệnh gỉ sắt do nấm Phakopsora bênh pachyrhizi, bệnh Sương mai (đốm phấn) do nấm Peronospora manshurica, bệnh lở cổ rễ do nấm Rhizoctonia solani hoặc Fusarium solani fsp phaseoly, bệnh đốm lá vi khuẩn hại đậu tương và một số bệnh hại khác. Đố i với cây đâ ̣u tương, thống kê trên thế giới cho thấy có hơn 100 loại virus gây hại và phân bố rộng khắp và gây thiệt hại lớn đến năng suất và chất lượng sản phẩm. Cây đậu tương bị nhiễm bệnh nặng, năng suất có thể bị giảm đến 50% khi trồng ở ngoài đồng, thậm chí mức giảm có thể lên đến 93% - 95% trong điều kiện lây nhiễm trong phòng thí nghiệm [11]. Một số nước có tỷ lệ thiệt hại lớn do bệnh virus ở đậu tương, như vùng Georgia ở Mỹ (37%), Australia và Thái lan (60%), New Zealand và khu vực Bắc Mỹ (40-50%)[11], [17], [33]. Bệnh khảm đậu tương do virus nhóm khảm (Potyvirus) gây ra. Bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1900 và đến nay virus khảm đậu tương đã có mặt ở hầu hết các vùng trồng đậu tương trên thế giới. Việt Nam cũng đã công bố phát hiện loại virus này từ năm 1994, chủ yếu tập trung ở những vùng trồng đậu tương lớn, như khu vực trung du, miền núi Bắc bộ, khu vực Đồng bằng sông Hồng và Tây Nguyên [4], [11]. Các nhà khoa học đã xác định trong một số loài virus đặc biệt nguy hiểm, gây hại trên cây đậu tương, có Soybean mosaic virus (SMV) và Bean yellow mosaic virus (BYMV) [10], [11], [31]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
  14. 5 SMV là loài virus gây bệnh khảm ở cây đậu tương, thuộc nhóm Potyvirus, họ Potyviridae, và là một trong những virus chủ yếu nhất gây bệnh ở đậu tương. Bệnh do SMV gây ra xảy ra trên phạm vi toàn thế giới [10], [25]. Khi bị bệnh lá cây có những phần xanh nhạt, đậm và biến vàng xen kẽ. Lá non ở ngọn khảm mạnh và biến dạng, các đốt thân co ngắn, cây chùn lại, phát triển chậm. Quả ít và thường lép biến dạng, sần sùi, có vị đắng. Hình 1.1. Lá cây đậu tương bị nhiễm SMV SMV gây thiệt hại đáng kể về năng suất, thậm chí ở một số trường hợp tổn thất có thể lên đến 94% tổng sản lượng đậu tương. Những cây đậu tương bị nhiễm SMV thường sinh trưởng phát triển chậm, hình thái thân, lá, quả bị biến dạng, và khi bị nhiễm ở giai đoạn muộn sẽ làm giảm sản lượng và chất lượng hạt [35] [36]. Họ Potyviridae được biết đến là có số lượng loài lớn nhất trong các họ virus gây bệnh ở thực vật. Nếu nhiễm đồng thời Potyvirus và các loài virus khác thì thiệt hại về năng suất và chất lượng hạt đậu tương tăng lên gấp bội [48]. Những cây bị nhiễm Potyvirus cũng dễ bị nhiễm thêm các nấm gây bệnh hơn [48]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
  15. 6 SMV sinh ra thể vùi trong tế bào cây bệnh. Thể vùi có dạng hình múi khế hay hình chong chóng. Thời gian tồn tại của virus trong cây bệnh là 2-5 ngày, nhiệt độ mất hoạt tính Q10 là 55- 700C. Khi bị chiếu tia cực tím virus bị mất hoạt tính trong hai giờ. Độ pH thích hợp là 6. Nhiệt độ thích hợp để virus nhân lên trong tế bào cây bệnh là 21-260C. Tại Hoa Kỳ, SMV đã được phân thành chín chủng bằng cách sử dụng các phản ứng di truyền trên tám giống cây. Ngoài SMV, BYMV cũng gây nên bệnh khảm ở đậu tương. Trước đây, bệnh khảm vàng lá do BYMV gây ra thường bị nhầm lẫn với bệnh khảm do SMV và sau này mới được xác nhận là do virus khác gây ra. Bệnh này tương đối ít nghiêm trọng hơn bệnh khảm, hầu như cây vẫn tăng trưởng và cho năng suất bình thường. BYMV là một loại virus thuộc chi potyvirus, họ potyviridae, có vật liệu di truyền là sợi đơn RNA. So với phần lớn các potyvirus BYMV có phạm vi ký chủ rất rộng trên toàn thế giới, có khả năng lây nhiễm bệnh vào cả các cây họ đậu và không thuộc họ đậu. BYMV có dạng sợi mềm, có chiều dài khoảng 750 nm, đường kính 15nm. BYMV không được lan truyền qua hạt giống mà chỉ có thể lan truyền qua các loài rầy mềm như Aphis tabae Seop và Macrosiphum pisi Kalt. Virus này có một số dạng chuyên tính khác nhau, gây ra các triệu chứng bệnh khác nhau và có thể chịu được độ pha loãng 1:1000 và mất hoạt tính ở 56-600C [27]. Đối với cây đậu tương, SMV và BYMV có thể nhiễm đồng thời trên cùng một cây và triệu chứng rất khó phân biệt. Ảnh hưởng của việc nhiễm cùng lúc nhiều loại virus khác nhau dẫn tới năng suất đậu tương có thể bị giảm từ 66% - 80% [34]. Bằng các quan sát thực địa nhóm tác giả ở Ukraine Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
  16. 7 đã xác định được triệu chứng nhiễm hai loại SMV và BYMV ở đậu tương vùng Cherkassy, Vinnitsa, Kiev và kết quả đã được xác nhận bằng kính hiển vi điện tử và kỹ thuật ELISA [41]. Trên cơ sở phân tích gen và thiết lập cây phát sinh loài một số tác giả cho rằng BYMV phân lập từ các vùng thuộc Cộng hòa Séc được phân bố ở ba nhóm trên sơ đồ hình cây và không phụ thuộc vào cây chủ [45]. Phản ứng của cây đậu tương đối với SMV và BYMV phụ thuộc vào kiểu gen của giống, chủng virus, tuổi cây, thời gian lây nhiễm, nhiệt độ không khí và các điều kiện môi trường khác [11],[23]. SMV và BYMV có thể xâm nhiễm trực tiếp vào tế bào đậu tương hoặc có thể xâm nhiễm qua môi giới trung gian là rệp. Virus và cơ thể côn trùng có mối quan hệ sinh học với nhau. Virus có thể tiềm ẩn một thời gian dài trong cơ thể côn trùng, qua tuyến nước bọt để đi vào hệ thống tiêu hoá thấm qua thành ruột vào máu rồi trở lại tuyến nước bọt. Sau giai đoạn tiềm ẩn, virus được nhân lên trong cơ thể côn trùng và ở thời điểm này côn trùng có khả năng truyền bệnh một cách nhanh chóng. Tuy nhiên khả năng truyền bệnh của côn trùng cũng có những hạn chế do tuổi của côn trùng thường rất ngắn [8],[9],[11]. SMV có khả năng xâm nhập vào tế bào qua các vết thương nhẹ do cọ xát giữa các cây với nhau, hoặc còn có thể truyền bệnh trong trường hợp hạt phấn bị nhiễm virus rơi vào noãn của cây. SMV di chuyển trong tế bào chất và có thể di chuyển sang tế bào khác thông qua các sợi liên bào. Sau 3 ngày virus mới nhiễm hết một lá đơn, sau 4 ngày thì mới nhiễm hết đoạn gân của lá kép và một phần đoạn thân sát gốc [11], [47]. Sau 5 ngày virus nhiễm hết dọc thân chính và các lá ngọn, khoảng sau 25 ngày virus có thể nhiễm trên toàn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
  17. 8 cây. Khi cây trưởng thành có thể bị nhiễm virus từ 90 - 100% ở các mức độ biểu hiện bệnh khác nhau [11], [48]. SMV và BYMV có cấu tạo đơn giản, gồm hai thành phần chính là protein (60 - 95%) và nucleic acid (5 - 40%) [52]. Hệ gen của SMV và BYMV là RNA sợi đơn dương (RNA (+)). Đời sống của Potyvirus sau khi xâm nhập vào các tế bào chủ qua mô tổn thương bao gồm quá trình dịch mã, xử lý polyprotein, nhân lên của mRNA, quá trình lắp ráp RNA và protein vỏ thành hạt virus và di chuyển đến các tế bào khác, tới các bộ phận của cây và các cây khác [48]. SMV lan truyền qua rệp vừng, bọ trĩ và hạt giống bị nhiễm bệnh. Rệp ăn lá từ cây này sang cây khác và mang theo mầm bệnh. Trên thế giới có khoảng 30 loài rệp truyền virus SMV. Nghiên cứu gần đây đã khẳng định rệp vừng ở đậu tương (Aphis Glycine) là mô ̣t vector của virus khảm đậu tương. Rệp càng nhiều thì tỉ lệ nhiễm bệnh càng cao. Vậy cách hiệu quả nhất kiểm soát bệnh là tạo ra giống đậu tương kháng virus SMV nhằm nâng cao năng suất và chất lượng đậu tương [8],[9]. 1.1.2. Hệ gen của SMV, BYMV và Potyvirrus Các Potyvirus có dạng thanh, khúc khuỷu dài khoảng 750 nm và đường kính là 11-15 nm và bao gồm các protein vỏ được sắp xếp đối xứng, xoắn ốc xung quanh phân tử RNA sợi đơn dương. Phân tử RNA có khoảng 10.000 ribonucleotide. Hệ gen RNA có đầu 3’gắn đuôi poly A và một protein virion kết nối gen (VPg) ở đầu 5’. RNA virus được dịch mã tạo ra một polyprotein được phân cắt bởi protease tạo thành ít nhất 10 phân tử protein [39] (hình 1.2). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
  18. 9 Hình 1.2. Sơ đồ cấu trúc hệ protein của potyvirus [39] (UTR) vùng 5 'và 3': vùng chưa dịch mã; CP: protein vỏ của virus; Nib: RNA polymerase phụ thuộc RNA;P1, P3, Nia: protease; CI: protein hình trụ; VPg: protein liên kết; HC-Pro: thành phần trợ giúp và protease. Theo Won-Seok Lim và cs (2003), trình tự nucleotide hoàn chỉnh của hệ gen SMV chủng G5 (SMV-G5), G7H (SMV-G7H) gồm 9588 nucleotide (chưa kể đuôi poly A), chứa một khung đọc mở (ORF) mã hóa cho một polyprotein mà sau đó được phân cắt thành 10 phân tử protein chức năng. So sánh trình tự amino acid của 2 chủng G5 và G7 với các chủng SMV khác cho thấy sự tương đồng lớn giữa chúng. Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn giữa chủng SMV-G5 và SMV-G7H là 99% [38], [54]. Trình tự đầy đủ các nucleotide của các chủng này có thể cung cấp những cơ sở để xác định các yếu tố quyết định đến triệu chứng bệnh khảm ở cây đậu tương, từ đó có các biện pháp hiệu quả để phòng trừ SMV cho cây đậu tương. Gen CP là gen đặc trưng nhất ở các Potyvirus, mã hóa protein CP được chia thành ba vùng: vùng đầu N, vùng lõi và vùng đầu C. Chức năng của CP thể hiện trong sự nhân lên, capsid hóa, di chuyển của virus từ tế bào đến tế bào và trong sự truyền virus của côn trùng truyền bệnh. Chính vai trò quan trọng của gen CP đối với hoạt động sống của Potyvirus mà trình tự gen này Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
  19. 10 được sử dụng để kháng lại chính các loài virus gây bệnh trong kỹ thuật chuyển gen theo nguyên lý RNAi [18], [19], [42]. Gen CP ở SMV có kích thước là 807 nucleotide, vùng mã hóa gồm 804 nucleotide mã hóa 267 amino acid, và từ amino acid thứ 33 đến 264 trong CP được gọi là vùng poty-coat (CP) [38], [42]. Ở BYMV, gen CP có kích thước 933 nucleotide, vùng mã hóa gồm 822 nucleotide, mã hóa 273 amino acid, trong đó vùng Poty-coat từ amino acid thứ 37 đến 272 [30], [38], [41]. Các số liệu so sánh cho thấy có sự khác biệt lớn về kích thước và trình tự amino acid của CP, tuy nhiên lại có sự tương đồng cao về trình tự ở vùng đầu C của CP [32]. Trên cơ sở đó, nhóm nghiên cứu thuộc đề tài cấp Bộ B2013 đã thiết kế thành công vector chuyể n gen thực vâ ̣t pK7GW-CPi (SMV-BYMV) mang đoa ̣n CPi theo nguyên tắ c của kỹ thuâ ̣t Gateway và biế n na ̣p vào vi khuẩ n A. tumefaciens. Dựa trên nguyên lý kỹ thuật RNAi và đă ̣c điể m đoa ̣n mã hóa của gen CP của SMV và của BYMV, cấ u trúc RNAi mang hai đoạn bảo thủ của gen mã hóa coat protein của cả hai loài SMV và BYMV ký hiê ̣u là CPi (SMV- BYMV) đươ ̣c lựa cho ̣n trong vector chuyể n gen. Đoa ̣n CPi (SMV-BYMV) có kích thước 573 bp, gồm đoạn nucleotide có nguồ n gốc từ gen CP của SMV, kích thước là 294 bp và đoa ̣n nucleotide có nguồ n gốc từ gen CP của BYMV, kích thức 279 bp. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
  20. 11 Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pK7GW-CPi (SMV-BYMV) [14] P35S: Promoter CaMV35S; attB1 và attB2: các vị trí tái tổ hợp trong phản ứng LR;LB: left T-DNA border; RB: right T-DNA border; T35S: terminator 35S; Kan: gen kháng kanamycin; CmR: gen kháng chloramphenicol; CPi: vị trí đoạn CPi (SMV-BYMV) chèn vào; XbaI, EcoRI, HindIII: vị trí cắt của các enzyme giới hạn; T35R, P35SF2, Fi, Ri: vị trí bám cặp mồi đặc hiê ̣u SMV-CPi-Fi/BYMV-CPi-Ri 1.2. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RNAi TRONG TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS 1.2.1. Cây thuốc lá và bệnh virus trên cây thuốc lá Cây thuốc lá có tên khoa học là Nicotiana tabacum L. Thuộc ngành Hạt kín, lớp Hai lá mầm, phân lớp Cúc, bộ Cà, họ Cà. Họ này có trên dưới 85 chi với tổng số trên 1800 loài. Một số loài trong họ này được trồng rộng rãi như khoai tây, cà chua, ớt và các loại cà, trong đó có chi Nicotiana. Đặc trưng của các loài trong họ này là trong thân và quả thường chứa alkaloid như solanin, atropine, scoplamin, nicotine…[1],[15]. Hình 1.4. Cây thuốc lá giống C9-1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.26: Bộ 320 Luận Văn Thạc Sĩ Y Học
320 tài liệu
1228 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
8=>2