Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu thu nhận enzym α–amylase từ trực khuẩn cỏ khô

Chia sẻ: Lavie Lavie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:101

Thêm vào BST

Báo xấu

69
lượt xem 14
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu thu nhận enzym α–amylase từ trực khuẩn cỏ khô tìm hiểu sự phân lập và tuyển chọn các chủng trực khuẩn có tính amylase cao; một số đặc điểm sinh học của chủng CK2; các điều kiện ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp α–amylase.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu thu nhận enzym α–amylase từ trực khuẩn cỏ khô

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM TP. HOÀ CHÍ MINH ------------------------------------ NGUYEÃN THÒ HOAØNG HAÛI NGHIEÂN CÖÙU THU NHAÄN ENZYM α – AMYLASE TÖØ TRÖÏC KHUAÅN COÛ KHOÂ LUAÄN VAÊN THAÏC SÓ SINH HOÏC Thaønh phoá Hoà Chí Minh – 2009
BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM TP. HOÀ CHÍ MINH ------------------------------------ NGUYEÃN THÒ HOAØNG HAÛI NGHIEÂN CÖÙU THU NHAÄN ENZYM α – AMYLASE TÖØ TRÖÏC KHUAÅN COÛ KHOÂ Chuyeân ngaønh: Vi sinh vaät hoïc Maõ soá: 60 42 40 LUAÄN VAÊN THAÏC SÓ SINH HOÏC NGÖÔØI HÖÔÙNG DAÃN KHOA HOÏC: PGS.TS. LÖÔNG ÑÖÙC PHAÅM Thaønh phoá Hoà Chí Minh – 2009
MỞ ÑAÀU Vi sinh vaät trong töï nhieân raát ña daïng vaø phong phuù. Chuùng coù maët khaép nôi: trong ñaát, trong nöôùc, trong khoâng khí,… keå caû trong cô theå con ngöôøi. Ngoaøi taùc haïi do vi sinh vaät gaây ra nhö: gaây beänh cho thöïc vaät, ñoäng vaät vaø con ngöôøi; thì nguoàn lôïi maø chuùng mang laïi cho chuùng ta voâ cuøng to lôùn neáu ta hieåu, bieát vaø söû duïng chuùng hôïp lyù. Caùc chuûng vi sinh vaät noùi chung vaø vi khuaån Bacillus noùi rieâng ñaõ vaø ñang ñöôïc söû duïng raát phoå bieán trong caùc cheá phaåm sinh hoïc ñeå phuïc vuï cho caùc ngaønh saûn xuaát nhö: röôïu, bia, coâng nghieäp deät, thuoäc da, boå sung vaøo thöùc aên cho gia suùc ñeå deã tieâu hoaù, thöùc aên trong nuoâi troàng thuyû saûn, trong y hoïc vaø nghieân cöùu,… laø nhôø khaû naêng sinh caùc loaïi enzym thuyû phaân cuûa caùc chuûng vi sinh vaät naøy. Enzym laø nhöõng chaát xuùc taùc sinh hoïc, ngoaøi nhöõng tính chaát cuûa moät chaát xuùc taùc noù coøn coù nhöõng tính chaát öu vieät hôn nhö: coù hieäu suaát xuùc taùc raát cao ôû ñieàu kieän nhieät ñoä vaø aùp suaát bình thöôøng, coù tính ñaëc hieäu cao. Caùc tính chaát naøy vaãn ñöôïc baûo toàn khi taùch enzym ra khoûi heä thoáng soáng, hoaït ñoäng trong ñieàu kieän invitro. Vì vaäy, enzym ngaøy caøng ñöôïc söû duïng roäng raõi trong thöïc teá, vôùi quy moâ ngaøy caøng lôùn, daãn ñeán vieäc hình thaønh vaø phaùt trieån ngaønh coâng ngheä saûn xuaát enzym. Vieäc söû duïng enzym trong thöïc teá khoâng chæ coù yù nghóa veà kinh teá maø coøn giaûi quyeát nhieàu vaán ñeà xaõ hoäi, caùc vaán ñeà böùc xuùc veà moâi tröôøng. Tröôùc kia, enzym thöôøng ñöôïc thu nhaän töø teá baøo thöïc vaät hoaëc ñoäng vaät (chaúng haïn amylase ñöôïc laáy töø haït naûy maàm, protease töø nhöïa ñu ñuû, daï daøy,…). Tuy nhieân quaù trình sinh toång hôïp enzym ôû ñoäng vaät vaø thöïc vaät gaén lieàn vôùi söï trao ñoåi chaát vaø nhu caàu cuûa teá baøo. Ngoaøi ra, ngöôøi ta coøn phaûi phaù boû caùc toå chöùc teá baøo ñeå taùch chieát vaø thu nhaän enzym. Nhö vaäy, vieäc duøng teá baøo ñoäng vaät, thöïc vaät laøm nguoàn nguyeân lieäu ñeå thu nhaän enzym laø khaù haïn cheá,
thieáu tính kinh teá vaø khoâng ñaùp öùng ñöôïc nhu caàu veà soá löôïng enzym caàn thieát cho saûn xuaát. Trong khi ñoù, ôû vi sinh vaät haàu nhö chöùa ñaày ñuû caùc loaïi enzym vaø vieäc söû duïng nguoàn enzym töø vi sinh vaät mang laïi lôïi ích lôùn hôn, cuï theå nhö nguoàn nguyeân lieäu duøng ñeå nuoâi caáy vi sinh vaät thöôøng reû tieàn hôn vì chuùng thöôøng laø pheá phuï phaåm coâng noâng nghieäp (nhö caùm, traáu, baõ mía, baõ khoai myø,…) hoaëc nguoàn nguyeân lieäu töï nhieân nhö daàu moû, khí ñoát,… Maët khaùc, ñieàu kieän nuoâi caáy deã daøng, vaø enzym coù hoaït tính cao hôn. Vì theá, khoaûng 50 naêm gaàn ñaây caùc cheá phaåm enzym töø vi sinh vaät ñaõ daàn thay theá caùc enzym coù nguoàn goác thöïc vaät, ñoäng vaät. Trong haøng loaït caùc loaïi enzym khaùc nhau thì amylase laø enzym phaân giaûi tinh boät taïo ñöôøng cho caùc sinh vaät. Töø nhöõng naêm ñaàu theá kyû 18 caùc nhaø khoa hoïc ñaõ baét ñaàu nghieân cöùu veà amylase vaø ñeán nay ñaõ bieát khaù roõ veà loaïi enzym naøy. Amylase ñöôïc öùng duïng roäng raõi trong nhieàu lónh vöïc saûn xuaát nhö coâng nghieäp thöïc phaåm, coâng nghieäp deät,…Saûn xuaát amylase coâng nghieäp ñaõ ñöôïc chuù yù töø raát laâu vaø ngaøy caøng phaùt trieån ôû nhieàu nöôùc treân theá giôùi. Vieät Nam chuùng ta laø moät trong nhieàu nöôùc ñaõ vaø ñang coù raát nhieàu nghieân cöùu vaø öùng duïng enzym amylase, nhöng neàn coâng nghieäp saûn xuaát enzym ôû nöôùc ta chöa thaät söï phaùt trieån. Xuaát phaùt töø cô sôû treân chuùng toâi choïn ñeà taøi cho luaän vaên: “Nghieân cöùu thu nhaän enzym α-amylase töø tröïc khuaån coû khoâ”. Noäi dung cuûa ñeà taøi goàm moät soá vaán ñeà sau: 1. Phaân laäp vaø tuyeån choïn caùc chuûng vi khuaån coù khaû naêng sinh tröôûng vaø sinh enzim amylase coù hoaït tính maïnh töø ñaát vöôøn qua trung gian coû khoâ. 2. Nghieân cöùu hình thaùi teá baøo, hình thaùi khuaån laïc, vaø caùc ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa chuûng tuyeån choïn.
3. Khaûo saùt caùc ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu ñeå thu ñöôïc dòch enzym amylase coù hoaït ñoä cao. 4. Ñònh danh chuûng ñöôïc tuyeån choïn baèng kyõ thuaät di truyeàn phaân töû. 5. Nuoâi caáy chuûng ñaõ tuyeån choïn trong thieát bò bình leân men tam giaùc 1 lít vôùi caùc ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu. Nghieân cöùu ñoäng hoïc quaù trình sinh toång hôïp amylase vôùi 3 thoâng soá laø pH, sinh tröôûng vaø hoaït ñoä enzym. 6. Taùch chieát enzym amylase töø dòch leân men nhôø caùc taùc nhaân tuûa. 7. So saùnh hieäu suaát thu nhaän vaø hoaït ñoä cheá phaåm enzym (CPE) amylase thu ñöôïc töø caùc taùc nhaân tuûa khaùc nhau. 8. Nghieân cöùu ñoä beàn nhieät vaø ñoä beàn pH cuûa CPE amylase.
Chương I: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU 1.1. Giống vi khuaån Bacillus [5], [16], [38], [39] Bacillus laø vi khuaån Gram döông, hình que coù kích thöôùc khaùc nhau (0,5 – 2,5) ×(1,2 - 10) μm. Chuùng phaân boá roäng raõi trong töï nhieân, trong ñaát, nöôùc, khoâng khí. Laø vi khuaån dò döôõng hoaù naêng, thu naêng löôïng nhôø söï oxi hoaù caùc hôïp chaát höõu cô, coù chuøm tieân mao giuùp chuùng coù khaû naêng di ñoäng, soáng hieáu khí hoaëc hieáu khí tuyø tieän. Bacillus coù khaû naêng sinh baøo töû, baøo töû ñöôïc hình thaønh khi teá baøo ñaõ traûi qua giai ñoaïn phaùt trieån maïnh nhaát, hoaëc khi thieáu chaát dinh döôõng. Moãi teá baøo sinh döôõng sinh ra moät baøo töû. Khi baøo töû tröôûng thaønh, teá baøo sinh döôõng töï phaân giaûi giaûi phoùng baøo töû. Caùc teá baøo Bacillus ñaëc tröng laø sinh baøo töû maøø vaãn giöõ hình daùng tröïc khuaån khi mang baøo töû, trong moät soá tröôøng hôïp teá baøo vi khuaån chæ phình to moät ít khi chöùa baøo töû. Tuyø loaøi maø baøo töû coù theå naèm chính taâm, leäch taâm hay gaàn ñaàu teá baøo. Baøo töû coù khaû naêng chòu nhieät, tia töû ngoaïi, phoùng xaï vaø nhieàu ñoäc toá, vì vaäy chuùng coù khaû naêng giöõ ôû traïng thaùi baøo töû nhieàu naêm. Baøo töû khoâng phaûi cô quan sinh saûn maø laø moät traïng thaùi baûo veä noøi gioáng, noù ñöôïc taïo ra ñeå giuùp teá baøo chòu ñöôïc caùc ñieàu kieän baát lôïi cuûa moâi tröôøng. Ñoù laø daïng nghæ cuûa teá baøo. Baøo töû ôû daïng töï do khoâng coù quaù trình trao ñoåi chaát, khi gaëp ñieàu kieän thuaän lôïi moãi baøo töû cho ra moät teá baøo sinh döôõng. Ña soá Bacillus sinh tröôûng toát ôû pH = 7, moät soá phuø hôïp vôùi pH = 9 – 10 nhö Bacillus alcalophillus, hoaëc vôùi pH = 2 – 6 nhö Bacillus- acidocaldrius. Veà nhieät ñoä, coù nhieàu chuûng öa nhieät ñoä cao (450C – 750C), hoaëc öa laïnh (50C –250C), nhöng thöôøng gaëp Bacillus soáng ôû nhieät ñoä toái öu laø 340C – 370C. Haàu heát Bacillus khoâng gaây beänh cho ngöôøi vaø ñoäng vaät. Moät soá loaïi gaây
beänh cho coân truøng nhö Bacillus thuringiensis, B. poplliae, B. lentimorbus, B. cereus, B. anthracis (trong ñoù B. cereus vaø B. anthracis coù theå gaây beänh cho ngöôøi)…ña soá coøn laïi trong töï nhieân laø coù ích. Bacillus coù khaû naêng sinh enzym ngoaïi baøo: α-amylase, protease kieàm, cellulase… vaø caùc enzym naøy ñöôïc öùng duïng raát nhieàu trong coâng nghieäp, baûo veä moâi tröôøng, noâng nghieäp… Sau ñaây laø moät soá loaøi Bacillus thöôøng gaëp trong töï nhieân 1.1.1 Bacillus subtilis Bacillus subtilis ñöôïc phaùt hieän vaø ñaët teân vaøo naêm 1872, noù phaân boá phoå bieán trong ñaát vaø ñaëc bieät laø ôû coû khoâ neân Bacillus subtilis ñöôïc goïi laø tröïc khuaån coû khoâ. Laø nhöõng vi khuaån hình que, ngaén, nhoû, kích thöôùc (3 -5) × 0,6 μm, nhieàu khi teá baøo noái laïi vôùi nhau thaønh chuoãi daøi ngaén khaùc nhau hoaëc teá baøo ñöùng rieâng reõ. Khuaån laïc khoâ, khoâng maøu hoaëc maøu xaùm nhaït, hôi nhaên hoaëc taïo ra lôùp maøng mòn lan treân beà maët thaïch, coù meùp nhaên baùm chaët vaøo moâi tröôøng thaïch. Nhieät ñoä thích hôïp cho Bacillus subtilis sinh tröôûng laø 300C – 500C, thöôøng nuoâi caáy ôû 370C. Baøo töû hình baàu duïc, kích thöôùc 0,6 – 0,9 μm, phaân boá leäch taâm, gaàn taâm nhöng khoâng chính taâm. Baøo töû coù theå soáng vaøi naêm ñeán vaøi chuïc naêm. Ñaõ coù nhöõng chöùng cöù veà vieäc duy trì söùc soáng baøo töû B. subtilis trong 200-300 naêm. Vi khuaån B. subtilis coù maøng nhaøy (giaùc maïc) giuùp vi khuaån coù khaû naêng chòu ñöôïc ñieàu kieän khaéc nghieät vì maøng nhaøy coù theå döï tröõ thöùc aên vaø baûo veä vi khuaån traùnh toån thöông khi khoâ haïn. Maøng nhaøy coù theå quan saùt ñöôïc khi nhuoäm tieâu baûn, qua kính hieån vi chuùng ta coù theå nhìn thaáy maøng nhaøy cuûa B. subtilis laø khoâng maøu, trong suoát, coøn teá baøo vi khuaån baét maøu naâu ñoû treân neàn tieâu baûn xanh hoaëc ñen.
B. subtilis coù khaû naêng sinh ra moät soá enzym nhö: α-amylase, protease kieàm coù giaù trò cao, ñaëc bieät coù khaû naêng toång hôïp riboflavin (tieàn vitamin B2). Vì vaäy, B. subtilis ñöôïc öùng duïng khaù nhieàu trong caùc ngaønh coâng nghieäp. 1.1.2. Bacillus mesentericus Bacillus mesentericus coøn ñöôïc goïi laø tröïc khuaån khoai taây do chuùng coù maët chuû yeáu treân khoai taây. Chuùng gaàn gioáng Bacillus subtilis khuaån laïc aên saâu vaø baùm chaët vaøo moâi tröôøng thaïch, beà maët nhaên nhuùm, khoâ, khoâng moïc lan ra moâi tröôøng, maøu xaùm nhaït-traéng, hoaëc hôi vaøng naâu, hoaëc hoàng nhö Bacillus mensentericus ruber hoaëc ñen nhö Bacillus mensentericus niger . Bacillus mensentericus sinh tröôûng phaùt trieån toát nhaát ôû nhieät ñoä 36 – 450C, toái ña 50 – 550C, pH = 4,5 – 5 thì ngöøng phaùt trieån. Bacillus mensentericus coù hoaït tính amylase vaø protease lôùn hôn haún Bacillus subtilis, nhöng leân men ñöôøng laïi keùm hôn. Bacillus mensentericus vaø Bacillus subtilis raát phoå bieán trong töï nhieân, chuùng laây nhieãm laøm hö hoûng thöïc phaåm, nhaát laø caùc loaïi thöïc phaåm coù chöùa nitô vaø caùc saûn phaåm giaøu ñöôøng (baùnh keïo, hoa quaû). Ngoaøi ra, chuùng coøn sinh ra moät loaïi hôïp chaát coù hoaït tính khaùng moät soá vi khuaån khaùc goïi laø bacterioxin, ôû Bacillus subtilis goïi laø subtilin. 1.1.3. Bacillus cereus Vi khuaån naøy coù moái quan heä gaàn guõi vôùi Bacillus anthracis, B. mycoides, B. thuringiensis. Baøo töû cuûa chuùng hình baàu duïc, kích thöôùc 0,9 × (1,2 – 1,5) μm, naèm leäch taâm, phaùt taùn khaép nôi, trong ñaát, trong khoâng khí…Chuùng thöôøng sinh soâi naûy nôû treân thöïc phaåm nhö côm vaø coù theå sinh ra ñoäc toá laøm cho thöïc phaåm hö hoûng vaø gaây ngoä ñoäc thöïc phaåm. Teá baøo cuûa B. cereus daøy, kích thöôùc (1 -1,5) × (3 – 5) μm coù khi daøi hôn, ñöùng rieâng reõ hoaëc xeáp thaønh chuoãi.
Khuaån laïc cuûa B. cereus phaúng, hôi loõm, beà maët hôi xuø xì (daïng boät, hoaëc daïng haït nhoû) traéng ñuïc, meùp loài loõm. 1.1.4. Bacillus megaterium Megaterium coù nghóa laø “con thuù lôùn”, teá baøo cuûa noù khaù lôùn khoaûng gaáp hôn 2 laàn teá baøo cuûa Bacillus subtilis, kích thöôùc (1,2 – 1,5) × (3 – 12) μm. ÔÛ caùc oáng nuoâi giaø thì teá baøo ngaén hôn, troøn hôn, ñoâi khi hình thoi vôùi ñaàu heïp laïi. Teá baøo chöùa nhieàu haït nhoû vaø chaát döï tröõ (haït môõ, glycogen). Baøo töû lôùn, hình ovan hay baàu duïc, kích thöôùc 1,5 × (0,7 – 1) μm, chuùng naèm leäch taâm thöôøng theo chieàu ngang hoaëc chieàu xieân cuûa teá baøo. Khuaån laïc troøn ñeàu, loài nhaün nhöng thöôøng coù voøng vieàn quanh khuaån laïc hoaëc caùc voøng ñoàng taâm treân beà maët, khoâng thuyø, khoâng neáp, meùp troøn ñeàu hay löôïn soùng, maøu traéng söõa hay ñuïc, coù khi coù maøu naâu nhaït. Sinh tröôûng treân moâi tröôøng dinh döôõng ñôn giaûn khoâng caàn theâm baát kyø yeáu toá dinh döôõng naøo khaùc. 1.1.5. Bacillus pumilus Baøo töû phaùt taùn roäng, coù maët trong ñaát nhieàu hôn Bacillus subtilis. Khuaån laïc nhoû, xung quanh vieàn môø lan khoâng ranh giôùi. Teá baøo cuûa noù gaàn gioáng teá baøo B. subtilis. 1.1.6. Bacillus polymyxa Kích thöôùc teá baøo laø (0,6 – 1) × (2 – 7) μm, ñöùng rieâng reõ hoaëc xeáp thaønh ñoâi, chuoãi ngaén. Khi hình thaønh baøo töû teá baøo seõ phoàng leân hình quaû chanh. Baøo töû hình baàu duïc keùo daøi khoaûng (1,7 – 2,6 μm), treân beà maët caét ngang nhö hình sao, naèm giöõa teá baøo, chuùng phaùt taùn roäng. Khuaån laïc cuûa B. polymyxa voâ maøu, phaúng hoaëc loài, trôn, lan daàn ra xung quanh, meùp ñoâi khi coù thuyø. Chuùng thöôøng sinh tröôûng phaùt trieån treân thöïc vaät ñang bò hoûng. Vì vaäy,
ngöôøi ta thöôøng phaân laäp chuùng töø thöïc phaåm. Chuùng laø nguoàn ñeå saûn xuaát khaùng sinh polymyxin. 1.1.7. Bacillus simplex Teá baøo B. simplex nhoû beù, coù kích thöôùc (2 – 5) × 0,6 μm, thöôøng ñöùng rieâng reõ khoâng gaén thaønh chuoãi. Baøo töû hình baàu duïc coù kích thöôùc 0,6 × 0,9 μm, naèm leäch taâm. Khuaån laïc cuûa B. simplex gioáng khuaån laïc B. cereus, chæ khaùc laø khuaån laïc cuûa B. simplex coù khaû naêng sinh saéc toá luïc nhaït, vaøng vaø tieát vaøo moâi tröôøng. 1.1.8. Bacillus brevis B. brevis laø tröïc khuaån coù kích thöôùc (0,7 – 1,0) × (3 – 5) μm, ñöùng rieâng reõ, ñoâi khi xeáp thaønh chuoãi. Baøo töû coù hình baàu duïc naèm cuoái teá baøo laøm cho teá baøo coù moät ñaàu hôi phoàng to. Khuaån laïc cuûa B. brevis maøu traéng, ñoâi khi coù maøu vaøng, loài hoaëc phaúng, laáp laùnh, meùp raêng cöa gioáng nhö daïng môõ ñaëc. 1.1.9. Bacillus aslersporus Teá baøo daøy (1,0–1,2) × (3 –7) μm, ñöùng rieâng reõ hoaëc xeáp thaønh ñoâi. Baøo töû hình truï hay hình keùo daøi, kích thöôùc 1,0 × (1,5–2) μm, naèm giöõa teá baøo. Khi hình thaønh baøo töû teá baøo phoàng leân moät chuùt troâng gioáng nhö daïng Clostridium. Khuaån laïc cuûa B. aslersporus nhoû, maøu traéng hay maøu luïc nhaït, phaúng, meàm, nhaøy, ñoàng chaát. 1.2. Khaùi quaùt chung veà enzym [1], [4], [15], [23], [49]. Sinh vaät ñöôïc xem nhö laø moät heä thoáng môû coù lieân quan chaët cheõ ñeán quaù trình trao ñoåi chaát trong teá baøo cuûa cô theå, vaø giöõa cô theå vôùi moâi tröôøng ngoaøi. Quaù trình trao ñoåi chaát cuûa sinh vaät laø bieåu hieän sinh ñoäng nhaát cuûa söï soáng. Khi cô theå khoâng coøn khaû naêng trao ñoåi chaát thì cô theå seõ cheát. Quaù trình trao ñoåi chaát lieân tuïc ñöôïc xaûy ra giöõa trong vaø ngoaøi teá baøo, taïo neân söï bieán ñoåi lieân tuïc
cuûa vaät chaát trong thieân nhieân. Caùc phaûn öùng sinh hoïc xaûy ra thöôøng xuyeân khoâng chæ ôû trong teá baøo sinh vaät maø ôû caû ngoaøi moâi tröôøng bao quanh teá baøo. Caùc phaûn öùng sinh hoïc naøy ñöôïc xuùc taùc bôûi moät loaïi protein ñaëc bieät ñöôïc goïi laø enzym. Caùc enzym tham gia phaûn öùng trong teá baøo goïi laø enzym noäi baøo, coøn caùc enzym thuyû phaân coù chöùc naêng phaân huyû chaát höõu cô ngoaøi teá baøo thaønh chaát dinh döôõng coù theå haáp thuï vaøo teá baøo goïi laø enzym ngoaïi baøo. Caû hai loaïi enzym naøy ñeàu ñöôïc toång hôïp trong teá baøo. 1.2.1. Enzym caûm öùng. Nhöõng enzym ñöôïc taïo thaønh töø VSV khoâng phaûi chæ phuï thuoäc vaøo loaïi VSV maø coøn phuï thuoäc thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy, ñieàu kieän nuoâi caáy. Hieän töôïng treân laø do trong moâi tröôøng coù chaát khoù ñoàng hoaù, VSV tieát vaøo moâi tröôøng moät hoaëc caùc enzym töông öùng ñeå taïo thaønh chaát coù theå ñoàng hoaù ñöôïc. Caùc enzym ñöôïc tieát ra nhö theá ñöôïc goïi laø enzym caûm öùng vaø caùc cô chaát kích thích quaù trình toång hôïp enzym caûm öùng goïi laø chaát caûm öùng. 1.2.2. Baûn chaát sinh hoïc cuûa enzym. Caùc loaïi enzym ñeàu coù caùc ñaëc tính sinh hoïc chung nhö sau: + Enzym ñöôïc taïo ra trong teá baøo sinh vaät. + Enzym tham gia phaûn öùng caû trong teá baøo soáng vaø caû khi enzym ñöôïc taùch khoûi teá baøo soáng. + Enzym tham gia phaûn öùng trong ñieàu kieän nhieät ñoä oân hoaø, vì enzym ñöôïc toång hôïp vaø hoaït ñoäng trong ñieàu kieän nhieät ñoä cuûa teá baøo vaø nhieät ñoä cuûa cô theå. Phaàn lôùn nhieät ñoä cuûa cô theå sinh vaät dao ñoäng trong khoaûng 30-40oC. + Enzym coù theå tham gia xuùc taùc caùc phaûn öùng trong vaø ngoaøi cô theå. + Phaûn öùng enzym laø nhöõng phaûn öùng tieâu hao naêng löôïng raát ít. Trong khi ñoù, caùc phaûn öùng hoaù hoïc ñöôïc xuùc taùc bôûi caùc chaát xuùc taùc hoaù hoïc ñoøi hoûi naêng löôïng raát lôùn.
+ Enzym chòu söï ñieàu khieån bôûi gen vaø caùc ñieàu kieän phaûn öùng. Ñieàu naøy coù yù nghóa raát lôùn trong vieäc ñieàu khieån söï toång hôïp enzym trong teá baøo sinh vaät. 1.2.3. Baûn chaát hoaù hoïc cuûa enzym. Phaân tích thaønh phaàn hoaù hoïc cuûa enzym ngöôøi ta chia thaønh hai nhoùm: + Nhoùm enzym ñôn caáu töû: laø caùc enzym ñöôïc caáu taïo chæ coù protein. Caùc hydrolase thuoäc loaïi naøy. + Nhoùm enzym ña caáu töû: bao goàm nhöõng enzym coù hai thaønh phaàn: • Phaàn protein thuaàn ñöôïc goïi laø apoprotein hay apoenzym. Ngaøy nay môùi tìm thaáy moät soá ARN coù hoaït tính enzym chuyeån hoaù tieàn chaát thaønh caùc ARN. Caùc enzym ARN ñöôïc goïi laø Ribozim. Hieän nay ñaõ bieát coù 3500 enzym coù baûn chaát protein vaø 100 ribozim. • Phaàn thöù hai laø thaønh phaàn khoâng phaûi protein maø laø nhöõng chaát höõu cô ñaëc hieäu coù vai troø thuùc ñaåy quaù trình xuùc taùc. Thieáu thaønh phaàn thöù hai naøy thì caùc enzym khoâng hoaït ñoäng, neân goïi chuùng laø chaát coäng taùc (cofactor). Caùc chaát höõu cô ñaëc hieäu naøy coù theå gaén raát chaët vôùi phaàn protein baèng lieân keát ñoàng hoaù trò ñöôïc goïi laø nhoùm phuï (prosthetic), hoaëc cuõng coù theå gaén loûng leûo vaø deã daøng taùch chuùng khoûi protein ñöôïc goïi laø coenzym. Apoenzym quyeát ñònh tính ñaëc hieäu cao vaø laøm taêng hoaït ñoä xuùc taùc cuûa enzym. Coøn nhöõng chaát höõu cô ñaëc hieäu quyeát ñònh kieåu phaûn öùng, tröïc tieáp tham gia phaûn öùng vaø laøm taêng ñoä beàn cuûa apoenzym ñoái vôùi caùc yeáu toá gaây bieán tính. Ngoaøi ra, trong thaønh phaàn cuûa enzym coøn coù söï hieän dieän moät soá kim loaïi, caùc kim loaïi naøy thöôøng raát deã taùch ra khoûi enzym. Trong tröôøng hôïp enzym maát kim loaïi chuùng seõ maát hoaït tính. Khi ñöa trôû laïi caùc kim loaïi töông öùng vaøo enzym thì hoaït tính cuûa enzym laïi ñöôïc khoâi phuïc, tính chaát naøy mang tính thuaän nghòch. Vai troø cuûa kim loaïi trong hoaït ñoäng cuûa enzym vaãn chöa thöïc
söï laøm saùng toû. Tuy nhieân caùc nhaø khoa hoïc cho raèng coù theå kim loaïi ñoùng vai troø lieân keát giöõa enzym vaø cô chaát, giöõa apoenzym vaø coenzym, tham gia tröïc tieáp vaøo quaù trình vaän chuyeån ñieän töû nhö vai troø cuûa saét trong cytochrome vaø peroxydase. 1.2.4. Tính chaát hoaù hoïc cuûa enzym. Enzym coù theå hoaø tan trong nöôùc, trong dung dòch muoái loaõng taïo thaønh caùc dung dòch keo öa nöôùc, nhöng enzym khoâng tan trong dung moâi khoâng phaân cöïc. Khi enzym ñöôïc hoaø tan vaøo nöôùc, caùc phaân töû nöôùc löôõng cöïc seõ keát hôïp vôùi caùc ion, caùc nhoùm ion hoaëc caùc nhoùm phaân cöïc trong phaân töû enzym taïo thaønh lôùp voû hydrat. Löôïng nöôùc hydrat naøy khaù lôùn vaø coù vai troø quan troïng laøm moâi tröôøng cho caùc phaûn öùng sinh hoaù. Enzym bò keát tuûa bôûi caùc taùc nhaân gaây tuûa protein nhö muoái trung tính baõo hoaø (NaCl, (NH4)2SO4 …), dung moâi höõu cô ôû nhieät ñoä thaáp (etanol, aceton…) neân caùc chaát naøy ñöôïc duøng ñeå thu cheá phaåm enzym hoaït ñoäng. Tuy nhieân, protein seõ bò bieán tính laøm cho enzym maát hoaït tính do söï taùc ñoäng cuûa caùc taùc nhaân nhö: nhieät ñoä cao, moâi tröôøng acid hay kieàm quaù cao, caùc muoái kim loaïi naëng. Vì vaäy, ngöôøi ta ñaõ duøng caùc yeáu toá treân ñeå kìm haõm hoaït tính enzym khi caàn thieát. 1.2.5. Caáu truùc enzym. Khoâng phaûi toaøn boä caùc thaønh phaàn cuûa enzym tham gia vaøo hoaït ñoäng xuùc taùc, maø chæ coù nhöõng boä phaän raát ñaëc bieät mang tính ñaëc hieäu trong phaân töû enzym môùi tham gia xuùc taùc phaûn öùng. Boä phaän ñaëc hieäu naøy ñöôïc goïi laø trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym. Phaàn coøn laïi ñoùng vai troø nhö moät caùi khung, giöõ cho caáu truùc khoâng gian thích hôïp vôùi khaû naêng xuùc taùc. Moãi enzym thöôøng coù moät trung taâm hoaït ñoäng. Tuy nhieân cuõng coù enzym coù hai thaäm chí coù boán trung taâm hoaït ñoäng. 1.2.6. Cô cheá taùc duïng cuûa enzym
Baûn chaát cuûa caùc phaûn öùng enzym laø khi coù söï tham gia xuùc taùc cuûa caùc enzym, caùc cô chaát seõ ñöôïc hoaït hoaù maïnh, töø ñoù laøm thay ñoåi tính chaát hoaù hoïc cuûa cô chaát. Döôùi taùc duïng cuûa enzym, cô chaát coù theå coù nhöõng thay ñoåi khoâng chæ veà caáu truùc hoaù hoïc, maø coøn thay ñoåi tính chaát hoaù hoïc. Quaù trình xuùc taùc cuûa enzym xaûy ra qua ba giai ñoaïn: • Giai ñoaïn thöù nhaát: enzym seõ keát hôïp vôùi cô chaát baèng nhöõng lieân keát yeáu, nhôø ñoù seõ taïo ra phöùc heä enzym-cô chaát thöôøng khoâng beàn, phaûn öùng xaûy ra raát nhanh, ñoøi hoûi moät ít naêng löôïng. • Giai ñoaïn thöù hai: cô chaát bò thay ñoåi caáu hình khoâng gian vaø möùc ñoä beàn vöõng cuûa caùc lieân keát. Keát quûa laø caùc lieân keát trong cô chaát bò phaù vôõ. • Giai ñoaïn thöù ba: ñaây laø giai ñoaïn cuoái cuøng, saûn phaåm ñöôïc taïo thaønh vaø taùch khoûi enzym. Enzym ñöôïc giaûi phoùng döôùi daïng töï do nhö ban ñaàu. Cô cheá xuùc taùc toång quaùt cuûa enzym ñöôïc toùm taét nhö sau: E + S ↔ ES → E + P Trong ñoù, E: enzym (enzyme); S: cô chaát (substrate); P: saûn phaåm (products). 1.2.7. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán vaän toác phaûn öùng enzym. • Noàng ñoä cô chaát Khi phaân giaûi moät loaïi cô chaát naøo ñoù, phaàn cô cheá taùc duïng cuûa enzym cho thaáy phaûn öùng khi coù enzym tham gia seõ traûi qua ba giai ñoaïn: Giai ñoaïn ñaàu neáu noàng ñoä cô chaát thaáp thì vaän toác phaûn öùng (V) phuï thuoäc tuyeán tính vôùi noàng ñoä cô chaát. Giai ñoaïn keá tieáp neáu V xaáp xæ giaù trò cöïc ñaïi thì V khoâng phuï thuoäc vaøo cô chaát. Giai ñoaïn tieáp theo neáu noàng ñoä cô chaát tieáp tuïc taêng cao thì haàu nhö V khoâng taêng nöõa maø ñaït giaù trò gaàn vôùi Vmax vì caùc enzym ñaõ baõo hoaø cô chaát.
• Noàng ñoä enzym Neáu thöøa cô chaát, V phuï thuoäc tuyeán tính vaøo noàng ñoä enzym: V = k[E] Trong ñoù: V: vaän toác phaûn öùng [E]: noàng ñoä enzym k: haèng soá vaän toác phaûn öùng. • Nhieät ñoä Nhieät ñoä coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán phaûn öùng enzym. Toác ñoä phaûn öùng chæ taêng ñeán moät giôùi haïn nhieät ñoä nhaát ñònh, vöôït quaù nhieät ñoä ñoù vaän toác phaûn öùng seõ giaûm vaø daãn ñeán möùc trieät tieâu do caáu truùc protein ñaõ bò phaù vôõ. Nhieät ñoä toái öu cuûa nhöõng enzym khaùc nhau laø hoaøn toaøn khaùc nhau. Phaàn lôùn enzym hoaït ñoäng maïnh nhaát ôû nhieät ñoä 40-50oC, coù moät soá enzym khaùc laø 600C hoaëc 700C, thaäm chí moät soá enzym cuûa vi khuaån Bacillus subtilis laïi hoaït ñoäng maïnh ôû 900C. Neáu taêng nhieät ñoä cao hôn möùc toái öu thì hoaït tính cuûa enzym seõ bò giaûm, khi ñoù enzym khoâng coù khaû naêng phuïc hoài laïi hoaït tính. Ngöôïc laïi, ôû nhieät ñoä 00C thì hoaït tính cuûa enzym bò haïn cheá raát maïnh, nhöng khi ñöa nhieät ñoä leân töø töø thì hoaït tính cuûa enzym seõ taêng daàn ñeàu ñeán möùc toái öu. Nhieät ñoä toái öu cuûa moät enzym phuï thuoäc raát nhieàu vaøo söï coù maët cuûa cô chaát, kim loaïi, pH, caùc chaát baûo veä. Ngöôøi ta thöôøng söû duïng heä soá nhieät Q10 ñeå bieåu thò aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán vaän toác phaûn öùng. Heä soá naøy caøng lôùn thì phaûn öùng caøng khoù xaûy ra ôû nhieät ñoä thöôøng. • pH moâi tröôøng pH thöôøng aûnh höôûng ñeán möùc ñoä ion hoaù cô chaát, enzym, vaø ñaëc bieät aûnh höôûng ñeán ñoä beàn cuûa enzym. Ña soá enzym beàn ôû pH = 5-9, ñoä beàn cuûa enzym taêng neáu coù maët cô chaát, coenzym, hoaëc Ca2+. Moãi enzym coù moät giaù trò pH toái öu (pHopt) taïi ñoù V ñaït Vmax.
Nhieàu enzym hoaït ñoäng raát maïnh ôû pH trung tính, cuõng coù enzym hoaït ñoäng ôû pH acid hoaëc pH kieàm. • Caùc chaát kìm haõm (I) Caùc chaát kìm haõm hoaït ñoäng cuûa enzym laøm giaûm hoaït tính enzym nhöng laïi khoâng bò enzym laøm thay ñoåi tính chaát hoaù hoïc, caáu taïo hoaù hoïc vaø tính chaát vaät lyù cuûa chuùng. Caùc chaát naøy bao goàm caùc ion, caùc phaân töû voâ cô, caùc chaát höõu cô vaø caû protein. Caùc chaát kìm haõm coù yù nghóa raát lôùn trong ñieàu khieån caùc quùa trình trao ñoåi chaát ôû teá baøo sinh vaät. Cô cheá kìm haõm cuûa caùc chaát kìm haõm coù theå thuaän nghòch hoaëc khoâng thuaän nghòch, ñaëc hieäu hoaëc khoâng ñaëc hieäu. Sau ñaây chuùng ta chæ xeùt caùc chaát kìm haõm thuaän nghòch. Tuyø thuoäc vaøo baûn chaát taïo phöùc EI, baûn chaát cuûa chaát kìm haõm ngöôøi ta chia thaønh caùc loaïi chaát kìm haõm sau:  Caùc chaát kìm haõm caïnh tranh Caùc chaát naøy coù caáu truùc töông töï nhö caáu truùc cuûa cô chaát vì theá chuùng coù khaû naêng keát hôïp vôùi trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym. Keát quaû laø trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym bò chaát kìm haõm chieám maát, do ñoù cô chaát maát moät phaàn khaû naêng töông taùc laøm toác ñoä phaûn öùng giaûm.  Caùc chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh Caùc chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh keát hôïp vôùi enzym ôû moät vò trí khoâng phaûi trung taâm hoaït ñoäng, keát quaû laø chuùng laøm thay ñoåi caáu truùc khoâng gian cuûa phaân töû enzym theo chieàu höôùng baát lôïi cho hoaït ñoäng xuùc taùc. Vì theá caùc chaát kìm haõm laøm giaûm hoaït ñoäng cuûa enzym. Khi keát hôïp vôùi chaát kìm haõm, enzym vaãn coù khaû naêng keát hôïp vôùi cô chaát khi ñoù seõ taïo thaønh phöùc hôïp EIS. Trong thöïc teá chaát kìm haõm chæ keát hôïp vôùi phöùc hôïp ES maø khoâng keát hôïp vôùi E töï do. Caùc chaát kìm haõm coù theå laø nhöõng chaát sau:
 Kìm haõm bôûi saûn phaåm cuûa phaûn öùng Caùc saûn phaåm cuûa phaûn öùng coù theå ñoùng vai troø nhö chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh. Neáu enzym xuùc taùc cho phaûn öùng cuûa cô chaát A vaø B taïo thaønh saûn phaåm P1 vaø P2, enzym coù aùi löïc vôùi P1, P2 vaø caû cô chaát A, B. Khi ñoù P1vaø P2 trôû thaønh chaát kìm haõm cuûa enzym.  Kìm haõm do thöøa cô chaát Khi ES ñöôïc taïo thaønh coù theå coù moät cô chaát gaén vôùi ES laøm chuùng khoâng theå chuyeån hoaù tieáp ñöôïc: ES + S ↔ ESS • Chaát hoaït hoaù Laø nhöõng chaát coù taùc duïng laøm taêng hoaït tính enzym. Chaát hoaït hoaù enzym coù theå laø anion, caùc ion kim loaïi, caùc chaát höõu cô coù caáu truùc phöùc taïp coù nhieäm vuï chuyeån nhoùm hydrogen hoaëc phaù vôõ moät soá lieân keát trong phaân töû tieàn enzym hoaëc phuïc hoài caùc nhoùm chöùc naêng trong trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym. Caùc chaát hoaït hoaù chæ coù taùc duïng hoaït hoaù ôû moät noàng ñoä nhaát ñònh, vöôït quaù noàng ñoä naøy chuùng seõ gaây öùc cheá hoaït ñoäng cuûa enzym. 1.3. Heä enzym amylase [4], [8], [13], [16], [27], [44] Amylase thuoäc heä enzym thuyû phaân (hydrolase) chuùng thuyû phaân caùc lieân keát α-1,4 vaø α-1,6 glucoside cuûa tinh boät. Töø xöa chuû yeáu ngöôøi ta thu nhaän amylase töø malt, nhöng ngaøy nay vieäc thu nhaän chuû yeáu töø nuoâi caáy VSV. Cuõng nhö nhieàu VSV khaùc, vi khuaån Bacillus taïo ra raát nhieàu enzym ngoaïi baøo nhö: amylase, protease, celullase,... Trong ñoù amylase raát quan troïng vì chuùng ñöôïc söû duïng phoå bieán vaø mang laïi nhieàu lôïi ích cho neàn saûn xuaát coâng nghieäp. Caùc loaïi amylase thöôøng gaëp khi nuoâi caáy VSV goàm: α – amylase, β- amylase vaø γ-amylase. 1.3.1. Giôùi thieäu veà enzym α – amylase. • Caáu taïo:
α-amylase coù caáu taïo goàm 3 tieåu ñôn vò: * A laø tieåu ñôn vò loõi coù caáu truùc ñaëc tröng helix (α/β) 8 barel. * Tieåu ñôn vò C ñöôïc noái vôùi A coù caáu truùc taùm ñoaïn β-sheet song song. * Tieåu ñôn vò B goàm hai ñoaïn β-sheet ñöôïc loàng vaøo giöõa ñoaïn β-sheet thöù ba vaø α-helix thöù ba cuûa tieåu ñôn vò A. Tieåu ñôn vò B quyeát ñònh ñoä beàn hoaït ñoä cuûa enzym vaø lieân keát enzym-cô chaát. Ion canxi noái giöõa tieåu ñôn vò A vaø B, coù töø 1-30 nguyeân töû gam Ca/mol. Khi taùch hoaøn toaøn canxi ra khoûi enzym thì α-amylase maát heát hoaït tính, vì Ca duy trì caáu hình hoaït ñoäng cuûa enzym. Maët khaùc, Ca coøn coù taùc duïng ñaûm baûo ñoä beàn raát lôùn cuûa enzym ñoái vôùi caùc taùc ñoäng gaây bieán tính vaø söï thuyû phaân cuûa caùc enzym phaân giaûi protein. Tuyø thuoäc vaøo daïng enzym maø coù theå coù theâm moät soá tieåu ñôn vò khaùc ñöôïc gaén vôùi ñaàu C-terminal hoaëc ñaàu N-terminal cuûa phaân töû protein. Taâm hoaït ñoäng cuûa α-amylase coù chöùa caùc nhoùm –COOH vaø NH3 . Hình 1.1. Caáu truùc phaân töû α-amylase [50] • Tính chaát lyù hoùa Ñieàu kieän hoaït ñoäng cuûa α-amylase töø caùc nguoàn khaùc nhau thöôøng khoâng
gioáng nhau. - pH pH toái thích cho hoaït ñoäng cuûa α-amylase töø naám sôïi laø 4,5-4,8 vaø cuûa vi khuaån laø 5,8-6,0. Nhìn chung pH toái öu naèm trong khoaûng acid yeáu 4,8-6,9. pH
• Cô cheá taùc duïng α-amylase coù khaû naêng phaân caét caùc lieân keát α-1,4 glucoside trong phaân töû polysaccharid moät caùch ngaãu nhieân. Vì theá ngöôøi ta goïi noù laø enzym amylase noäi phaân (endoamylase). Khi taùc duïng leân tinh boät taïo ra saûn phaåm chuû yeáu laø dextrin phaân töû löôïng thaáp (phaûn öùng khoâng maøu vôùi iod), ngoaøi ra coøn coù maltose, vaø moät ít glucose. Vì vaäy, ngöôøi ta goïi α-amylase laø amylase dextrin hoaù hay amylase dòch hoaù. 1.3.2 Nguoàn thu nhaän enzym amylase. Enzym coù theå ñöôïc thu nhaän töø nhieàu nguoàn khaùc nhau nhö ñoäng vaät, thöïc vaät, vi sinh vaät (VSV). Tuy nhieân vieäc khai thaùc enzym töø thöïc vaät, ñoäng vaät thöôøng gaëp khoù khaên vì nguoàn nguyeân lieäu haïn cheá, hieäu suaát thaáp neân giaù thaønh cao. Hieän nay phaàn lôùn enzym ñeàu ñöôïc thu nhaän töø vi sinh vaät, vì coù nhöõng ñieåm noåi baät sau: - VSV coù toác ñoä sinh tröôûng, phaùt trieån vaø sinh saûn cöïc kyø nhanh, töø ñoù toång hôïp enzym vôùi cöôøng ñoä raát maïnh, neân trong moät thôøi gian ngaén coù theå thu ñöôïc moät löôïng enzym raát lôùn. - Heä enzym cuûa VSV raát phong phuù, töø caùc chuûng VSV khaùc nhau ta coù theå thu nhaän ñöôïc nhieàu loaïi enzym khaùc nhau, trong ñoù coù nhöõng enzym chuyeân bieät chæ coù ôû VSV maø haàu nhö khoâng thaáy ôû ñoäng vaät, thöïc vaät. - Moâi tröôøng nuoâi caáy VSV ñôn giaûn, reû tieàn, thöôøng laø nhöõng pheá phuï lieäu cuûa ngaønh coâng nghieäp neân giaù thaønh enzym reû hôn vaø deã aùp duïng cho caùc cô sôû saûn xuaát. - VSV chòu aûnh höôûng raát lôùn bôûi thaønh phaàn dinh döôõng, caùc taùc ñoäng cuûa moâi tröôøng, do ñoù ngöôøi ta coù theå thay ñoåi thaønh phaàn dinh döôõng hoaëc caùc yeáu toá taùc ñoäng ñeå ñieàu khieån quaù trình toång hôïp enzym theo yeâu caàu. - Vieäc caûi taïo gioáng VSV ñeå taïo ra caùc chuûng VSV coù khaû naêng toång hôïp