Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân tích và đánh giá sinh trưởng các dòng bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla) chuyển gen GS1

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:84

Thêm vào BST

Báo xấu

23
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Xác định được các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 thông qua sàng lọc kháng sinh và phân tích sự có mặt của gen, số bản copy, mức độ biểu hiện phiên mã bằng các kỹ thuật sinh học phân tử; đánh giá được sinh trưởng của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 ở giai đoạn nhà lưới/vườn ươm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân tích và đánh giá sinh trưởng các dòng bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla) chuyển gen GS1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ HUYỀN PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ SINH TRƯỞNG CÁC DÒNG BẠCH ĐÀN URÔ (Eucalyptus urophylla) CHUYỂN GEN GS1 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội - 2017
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ HUYỀN PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ SINH TRƯỞNG CÁC DÒNG BẠCH ĐÀN URÔ (Eucalyptus urophylla) CHUYỂN GEN GS1 Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. BÙI VĂN THẮNG Hà Nội - 2017
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: - Đây là công trình nghiên cứu của tôi và cùng cộng tác với các cộng sự khác; - Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; - Phần kết quả còn lại của luận văn chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày 31 tháng 10 năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Huyền
ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Bùi Văn Thắng, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu tạo giống Bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla) sinh trưởng nhanh bằng công nghệ chuyển gen” là người thầy đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ kinh phí và các điều kiện cần thiết khác để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Văn Việt, Chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ tế bào và toàn thể các cán bộ thuộc Bộ môn đã tạo những điều kiện thuận lợi để tôi được học tập, thực hiện và hoàn thành đề tài luận văn. Trong quá trình làm luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của toàn thể cán bộ Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận văn này. Hà Nội, ngày 31 tháng 10 năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Huyền
iii MỤC LỤC Trang TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii MỤC LỤC ............................................................................................................ iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................ vi DANH MỤC CÁC BÀNG.................................................................................. vii DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. viii DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN .......... x MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 4 1.1. Tổng quan về Bạch đàn nói chung và Bạch đàn Urô nói riêng ..................... 4 1.2. Một số nghiên cứu chuyển gen vào Bạch đàn ............................................... 7 1.3. Gen GS1 và kết quả nghiên cứu chuyển gen GS1 vào cây trồng ................ 10 1.4. Vector chuyển gen GS1 vào cây bạch đàn Urô ........................................... 15 1.5. Các phương pháp phân tích đánh giá cây chuyển gen ở phòng thí nghiệm và đồng ruộng........................................................................................................... 18 1.5.1. Đánh giá chọn lọc cây chuyển gen in vitro và in vivo .............................. 18 1.5.2. Phân tích cây chuyển bằng kỹ thuật sinh học phân tử................................ 19 1.5.3. Phân tích chức năng sinh học của gen chuyển ........................................... 23 Chương 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..... 25 2.1. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 25 2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 25 2.2.1. Phân tích, xác định các dòng cây chuyển gen ........................................... 25 2.2.2. Đánh giá sinh trưởng của các dòng cây chuyển gen ở giai đoạn nhà lưới 25 2.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 25 2.3.1. Phương pháp sàng lọc các thể nhận gen GS1 in vitro .............................. 26
iv 2.3.2. Đánh tính kháng kháng sinh Kanamycin của các dòng cây bạch đàn Urô chuyển gen GS1 trồng ở nhà lưới ....................................................................... 27 2.3.3. Phương pháp tách DNA tổng số (lượng nhỏ) từ thực vật ......................... 27 2.3.4. Phương pháp tách chiết ADN tổng số (lượng lớn) từ thực vật ................. 28 2.3.5. Phương pháp định tính và định lượng DNA tổng số .................................. 29 2.3.6. Phương pháp tách chiết RNA tổng số ........................................................ 30 2.3.7. Phương pháp tách chiết mRNA ................................................................. 30 2.3.8. Phương pháp tổng hợp cDNA ................................................................... 31 2.3.9. Phương pháp kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong cây chuyển gen bằng PCR............................................................................................................. 33 2.3.10. Phương pháp Southern blot ..................................................................... 35 2.3.11. Phương pháp RT-PCR (Reverse transcription PCR) .............................. 36 2.3.12. Phương pháp nhân giống vô tính các dòng bạch đàn Urô ........................ 37 2.3.13. Đánh giá sinh trưởng của các dòng bạch đàn chuyển gen GS1 .............. 38 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................... 39 3.1. Kết quả sàng lọc chồi bạch đàn Urô chuyển gen GS1 trên môi trường kháng sinh chọn lọc in vitro ........................................................................................... 39 3.2. Kết quả sàng lọc các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 in vivo ............. 42 3.3. Kết quả phân tích các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 bằng kỹ thuật PCR ..................................................................................................................... 45 3.4. Kết quả phân tích các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 bằng kĩ thuật lai Southern............................................................................................................... 48 3.5. Kết quả phân tích các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 bằng kĩ thuật RT-PCR ............................................................................................................... 49 3.6. Kết quả đánh giá mức độ ổn định của gen chuyển trong các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 ........................................................................................... 51 3.7. Kết quả đánh giá sinh trưởng của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 55 3.7.1. Sinh trưởng về chiều cao của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 trồng trong nhà lưới ............................................................................................. 55
v 3.7.2. Đánh giá sinh khối tươi của các dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1 và đối chứng giai đoạn vườn ươm ........................................................................... 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO
vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa đầy đủ A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-Benzylaminopurine cDNA Complementary DNA CS. Cộng sự DNA Axic deoxiribonucleic E. Eucalyptus Food and Agriculture Organization of the United FAO Nations GS Glutamin synthetase IBA Indol Butyric Acid Kan Kanamycin MS Murashige & Skoog NAA Napthalene Acetic Acid MT Môi trường NN&PTNT Nông nghiệp và Phát triển nông thôn RNA Riboucleic acid RT-PCR Reverse transcription Polymerase Chain Reaction WT Wild type (hoang dại)
vii DANH MỤC CÁC BÀNG Bảng 2.1. Thành phần các môi trường sàng lọc chồi bạch đàn Urô chuyển gen GS1 trên môi trường kháng sinh chọn lọc in vitro ................................................................ 26 Bảng 2.2. Cặp mồi kiểm tra gen nptII, 35S-P, NOS-T trong cây chuyển gen ..............33 Bảng 2.3. Cặp mồi kiểm tra gen GS1 trong cây chuyển gen ........................................34 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR kiểm tra cây chuyển gen ..................................34 Bảng 2.5. Cặp mồi kiểm tra gen GS1 từ mRNA trong cây chuyển gen .......................37 Bảng 3.1. Kết quả nghiên cứu chuyển gen GS1 vào bạch đàn Urô .............................. 40 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của kanamycin đến tỉ lệ cháy lá ở bạch đàn Urô không chuyển gen .................................................................................................................................43 Bảng 3.3: Kết quả đánh giá tính kháng kháng sinh kanamycin của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 ở nhà lưới ....................................................................................44 Bảng 3.4. Sinh trưởng về chiều cao của các dòng Bạch đàn Urô chuyển gen GS1 và đối chứng .......................................................................................................................56 Bảng 3.5. Sinh khối tươi của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 và đối chứng (wt).................................................................................................................................59
viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Vai trò của GS trong quá trình đồng hóa và tái sử dụng nitơ (Stéphanie và cs, 2009). ...................................................................................... 14 Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121-GS1................................. 17 Hình 1.3. Sơ đồ thiết kế cấu trúc đoạn T-DNA của vector chuyển gen pBI121- GS1. ..................................................................................................................... 18 Hình 3.1. Chồi bạch đàn Urô chuyển gen GS1 tái sinh trên môi trường chứa kanamycin 150 mg/l , 200 mg/l và ra rễ trên môi trường ra rễ chọn lọc chứa 75 mg/l kanamycin ................................................................................................... 41 Hình 3.2. Các dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1 trồng ở nhà lưới và đánh giá tính kháng kháng sinh. ........................................................................................ 45 Hình 3.3. DNA tổng số tách chiết từ các dòng bạch đàn Urô giả định chuyển gen GS1 ............................................................................................................... 46 Hình 3.4. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen GS1 từ các dòng bạch đàn Urô chuyển gen. ...................................................................................................................... 46 Hình 3.5. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen nptII từ các dòng bạch đàn Urô chuyển gen........................................................................................................... 47 Hình 3.6. Sản phẩm PCR nhân đoạn 35S-Promoter và NOS-T từ các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1. ................................................................................... 48 Hình 3.7. Kết quả Southern blot các mẫu bạch đàn Urô chuyển gen GS1......... 49 Hình 3.8. Ảnh điện di sản phẩm RT-PCR các dòng cây bạch đàn Urô chuyển gen GS1 bằng mồi GS1-F/R và Act-F/R. ........................................................... 50 Hình 3.9. Các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 ở chu kì nhân giống thứ 5. 51 Hình 3.10. DNA tổng số các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 tách chiết ở chu kì 5 trên gel agarose 0,8%. ........................................................................... 52 Hình 3.11. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen GS1 + NOS -T từ các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1............................................................................................ 53
ix Hình 3.12. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen nptII từ các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1. .................................................................................................. 54 Hình 3.13. Sản phẩm PCR nhân đoạn 35S-Promoter và NOS-T từ các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 nhân giống vô tính ở CK5. ................................ 55 Hình 3.14. Tăng trưởng về chiều cao cây của các dòng bạch đàn chuyển gen GS1 và đối chứng (wt) ở giai đoạn 3 tháng tuổi ở nhà lưới................................ 57 Hình 3.15. Kiểu hình của dòng cây chuyển gen GS1 và đối chứng không chuyển gen giai đoạn 3 tháng tuổi. .................................................................................. 58 Hình 3.16. Sinh khối của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 và đối chứng không chuyển gen (wt). ....................................................................................... 60
x DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 1. Bùi Văn Thắng, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Thị Huyền, Chu Hoàng Hà, Tạo cây bạch đàn Urô chuyển gen GS1 mã hóa glutamin synthetaza tăng cường hiệu quả sử dụng nitơ, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 17(2017), 130-135.
1 MỞ ĐẦU Bạch đàn là loài cây được trồng rừng với diện tích lớn và phổ biến nhất trên thế giới, ước tính khoảng 20 triệu ha (GIT Forestry, 2008). Gỗ Bạch đàn đang được coi là nguồn cung cấp nguyên liệu chính cho các nhà máy sản xuất giấy vì gỗ Bạch đàn có thành phần hóa học và cấu tạo sợi rất thích hợp cho sản xuất bột giấy. Ngoài ra, gỗ Bạch đàn còn được sử dụng để sản xuất ván dăm, ván sợi xuất khẩu, làm đồ mộc, cột chống, lá của một số loài được sử dụng để tách chiết tinh dầu, tanin và chế biến dược phẩm. Do đó, cây Bạch đàn được xếp vào danh mục giống cây trồng lâm nghiệp chính của Việt Nam (Thông tư số 44/2015/TT-BNNPTNT ngày 23/11/2015 của Bộ trưởng Bộ NN&PTNT). Với giá trị to lớn của cây bạch đàn trong trồng rừng sản xuất, việc ứng dụng kỹ thuật di truyền trong tạo giống cây bạch đàn chuyển gen sinh trưởng nhanh đang rất được quan tâm. Để cải thiện giống cây trồng lâm nghiệp sinh trưởng nhanh bằng công nghệ chuyển gen, có hai hướng chính là chuyển các gen liên quan đến sinh tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng dạng hoạt động và các gen liên quan đến việc nâng cao hiệu quả sử dụng nitơ, phốt pho, v.v, trong đó chuyển gen liên quan đến quá trình đồng hóa nitơ được đánh giá là có triển vọng nhất. Bởi vì, nitơ là một trong những nguyên tố cần thiết và đóng vai trò quan trọng nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Nitơ có thể được đồng hóa hoặc tái sử dụng thông qua các cơ chế đồng hoá nitơ từ môi trường và nitơ giải phóng từ các quá trình quang hô hấp. Gen GS1 mã hóa cho glutamine synthetase (GS, EC 6.3.1.2) xúc tác cho phản ứng chuyển hoá glutamic acid thành glutamine, dùng amoniac như một cơ chất (Miflin và Lea, 1980). Enzyme GS1 có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc đồng hóa và tái sử dụng nitơ (Dubois và cs, 1996; Cren và Hirel, 1999; Stéphanie và cs, 2009). Tăng cường hoạt động của GS1 sẽ giúp cây sử dụng hiệu quả nguồn nitơ vốn là nhu cầu thiết yếu cho cây sinh trưởng; gen GS1 hoạt động mạnh thì cây trồng trong điều kiện đầy đủ hoặc nghèo nguồn nitơ cây vẫn có khả năng sinh trưởng nhanh
2 (Stéphanie và cs, 2009). Đã có một số nghiên cứu về chuyển gen GS1 vào cây trồng, cây dương lai chuyển gen GS1 sinh trưởng nhanh hơn nhiều so với cây không chuyển gen ở giai đoạn cây con và trồng rừng (Gallardo và cs, 1999; Zhong và cs, 2004); cây thuốc lá chuyển gen GS1 cho thấy mức độ phiên mã và tổng hợp glutamine synthetase tăng cao, cây sinh trưởng nhanh hơn so với cây đối chứng (Fuentes và cs, 2001; Nguyễn Thị Hồng Gấm và cs, 2016). Trong khuôn khổ thực hiện đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu tạo giống Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) sinh trưởng nhanh bằng công nghệ chuyển gen” do Trường Đại học Lâm nghiệp chủ trì, gen GS1 đã được phân lập và thiết kế cấu trúc vector chuyển gen thực vật, gen GS1 dưới sự điều khiển của promoter cơ định 35S và đoạn kết thúc NOS-terminator; gen chọn lọc là nptII đã được chuyển vào bạch đàn Urô; bước đầu đã tạo được một số dòng bạch đàn Urô tái sinh từ thể nhận gen trên môi trường chọn lọc. Với mục tiêu sàng lọc được các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 và bước đầu đánh giá sinh trưởng của các dòng chuyển gen ở giai đoạn vườn ươm, chúng tôi thực hiện đề tài “Phân tích và đánh giá sinh trưởng các dòng bạch đàn Urô (Eucalyptus urophylla) chuyển gen GS1” phục vụ cho việc chọn lọc dòng bạch đàn Urô chuyển gen có sức sinh trưởng nhanh triển vọng làm giống. Mục tiêu của đề tài - Xác định được các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 thông qua sàng lọc kháng sinh và phân tích sự có mặt của gen, số bản copy, mức độ biểu hiện phiên mã bằng các kỹ thuật sinh học phân tử. - Đánh giá được sinh trưởng của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 ở giai đoạn nhà lưới/vườn ươm. Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa khoa học: Phân tích, đánh giá và chọn tạo được dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 liên quan đến quá trình đồng hóa và tái sự dụng nitơ giúp cây
3 sinh trưởng nhanh sẽ cung cấp thêm cơ sở khoa học trong việc tạo giống cây lâm nghiệp chuyển gen sinh trưởng nhanh. - Ý nghĩa thực tiễn: Phân tích, đánh giá mức độ ổn định của gen chuyển qua các thế hệ nhân giống sinh dưỡng in vitro và đánh giá được sự sinh trưởng của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 ở giai đoạn nhà lưới/vườn ươm sẽ làm cơ sở cho việc chọn tạo dòng bạch đàn Urô chuyển gen sinh trưởng nhanh có triển vọng làm giống.
4 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về Bạch đàn nói chung và Bạch đàn Urô nói riêng Bạch đàn (Eucalyptus) là một chi thực vật thuộc họ Sim (Myrtaceae), bộ Sim (Myrtaces), phân lớp Hoa hồng (Rosidae), lớp hai lá mầm (Dicotyledone). Tên bạch đàn Eucalyptus lần đầu tiên được nhà thực vật học người Pháp Charles Louis L’Heritier de Brutelle đặt cho vào năm 1788. Từ đó đến nay đã có tới 900 loài, phân loài và các biến chủng bạch đàn lai trên toàn thế giới (Boland và cs, 2006). Theo Eldridge và cs (1993) chi bạch đàn được chia làm 8 chi phụ. Trong đó, chi phụ Symphyomyrtus có nhiều loài được sử dụng vào trồng rừng đại trà, như: Loài E. camaldulensis, E. urophylla, E. tereticornis, E. grandis… Bạch đàn có xuất xứ từ Australia và chỉ có 2 loài bạch đàn phân bố ngoài Australia là loài E. deglupta Blume và E. urophylla S.T. Blake. Cho đến nay, bạch đàn đã được gây trồng phổ biến ở khắp nơi trên thế giới, đặc biệt là ở các quốc gia vùng nhiệt đới, ôn đới, như: Brazil, Trung Quốc, Ấn độ, Việt Nam,... (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2000). Bạch đàn là loài cây thân gỗ lâu năm, cây trồng 5 - 6 năm tuổi thường có chiều cao trên 7m và đường kính thân khoảng 9 – 10 cm. Cây bạch đàn có cơ chế tự bảo vệ nhờ một cơ quan dưới mặt đất được gọi là “củ gỗ” và cơ chế phát triển nhanh nhờ chồi bất định và búp phụ, do đó cây có khả năng thích nghi cao với nhiều loại lập địa và khí hậu. Bạch đàn có thể sinh trưởng phát triển ở vùng khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới, ôn đới (Grupo Empresarial ENCE, 2009). Bạch đàn là cây mọc nhanh, chu kỳ kinh doanh ngắn, có khả năng sinh trưởng trên nhiều dạng lập địa khác nhau, thích hợp cho rừng trồng sản xuất. Do đó, bạch đàn được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia và rừng trồng bạch đàn chiếm 0,5% diện tích rừng trên toàn thế giới (Grupo Empresarial ENCE, 2009). Gỗ bạch đàn được coi là nguồn cung cấp nguyên liệu chính cho ngành công nghiệp sản xuất giấy vì gỗ bạch đàn có thành phần hóa học và cấu tạo sợi rất thích hợp cho sản xuất bột giấy. Mỗi năm trên thế giới có hàng triệu tấn bột giấy được sản
5 xuất từ gỗ bạch đàn. Bên cạnh đó, gỗ bạch đàn còn được sử dụng làm đồ mộc, sản phẩm thủ công mỹ nghệ, sản xuất ván dăm, ván sợi xuất khẩu, gỗ xây dựng, cột chống,… Ngoài ra, lá của một số loài bạch đàn còn được sử dụng để tách chiết tinh dầu, tanin và chế biến dược phẩm. Trên thế giới, bạch đàn đang là một trong các loài cây trồng rừng có triển vọng nhất đối với các ngành Lâm nghiệp, công nghiệp sản xuất gỗ và bột giấy (Wu et al. 2006, Clarke et al. 2009, Ishiguri et al. 2013, Hung et al. 2015, Wessels et al. 2016), với diện tích trồng ngày càng được mở rộng. Bên cạnh vùng sinh thái tự nhiên, rừng trồng bạch đàn được mở rộng từ 0,7 triệu ha năm 1955 lên hơn 20 triệu ha năm 2009 và có mặt ở hơn 100 quốc gia trên thế giới (Iglesias và cs, 2008; Shi và cs, 2012). Trong đó, phân bố ở châu Á 40,78%, châu Mỹ 36,41%, châu Phi 11,65%, châu Âu 6,31% và châu Đại Dương 4,85% (Global, 2009). Brazil là nước có diện tích rừng trồng bạch đàn lớn nhất thế giới, năm 2012 ước tính có khoảng 6,5 triệu hecta chủ yếu phục vụ cho sản xuất giấy và bột giấy (Anuário Estatístico Da Abraf, 2012). Ở Việt Nam, cây bạch đàn được người Pháp đưa vào gây trồng từ trước năm 1945, song việc gây trồng bạch đàn trên quy mô lớn mới chỉ được bắt đầu từ năm 1960. Trong một thời gian ngắn, cây bạch đàn đã phát triển mạnh mẽ và trở thành một trong số các loài cây lâm nghiệp trồng rừng quan trọng của nước ta hiện nay. Ở Việt Nam, bạch đàn chiếm vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng rừng, có mặt tại 6/9 vùng sinh thái chính trong cả nước. Tuy nhiên, thực tế trồng rừng ở Việt Nam cho thấy, hầu hết các vùng được quy hoạch để trồng rừng là các vùng đất trống bạc màu và đồi trọc nghèo dinh dưỡng vì vậy mà năng suất cây trồng giảm mạnh do cây sinh trưởng chậm, kéo dài luân kỳ khai thác. Do đó, hiện nay việc nghiên cứu cải thiện giống cây lâm nghiệp với đặc tính sinh trưởng nhanh trên các nền đất bạc màu rất được chú trọng. Việc nghiên cứu chọn tạo được giống bạch đàn sinh trưởng nhanh trên các vùng đất nghèo dinh
6 dưỡng sẽ quyết định đến việc nâng cao được năng suất rừng trồng bạch đàn, mang lại giá trị kinh tế ổn định và bền vững cho người dân trồng rừng. Giống Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) Bạch đàn Urô (E. urophylla) có nguyên sản ở Indonesia (tập trung ở một số đảo là Flores, Adona, Pantar và Timor), phân bố từ 7030 - 100 vĩ Nam và 1220 - 1270 kinh Đông trên các dốc núi và trong các thung lũng, trên các loại đất bazan, diệp thạch và phiến thạch, đôi khi mọc ở núi đá vôi. Bạch đàn Urô phân bố ở độ cao 300 - 2960m so với mặt nước biển, nơi có nhiệt độ trung bình hàng năm từ 24-280C. Nơi nguyên sản, bạch đàn Urô có thể cao 25 - 45m, dưới điều kiện thuận lợi có thể đạt đến chiều cao 55m và đường kính trên 2m ( Eldridge và cs, 1993). Lần đầu tiên bạch đàn Urô có mặt ở Việt Nam trong chương trình khảo nghiệm loài và xuất xứ bạch đàn năm 1979 tại vùng nguyên liệu giấy trung tâm Bắc Bộ. Các vườn giống cây trồng bằng hạt (Seedling Seed Orchard - SSO) của loài hiện đã được xây dựng tại địa bàn các tỉnh Phú Thọ và Hà Nội. Theo thông tin từ Xí nghiệp giống Lâm nghiệp vùng trung tâm Bắc Bộ và Đồng bằng sông Hồng thì hạt giống bạch đàn Urô thu tại rừng giống chuyển hoá xã Trạm Thản, Phù Ninh, Phú Thọ là nguồn cung cấp hạt giống chính cho việc trồng rừng bạch đàn ở các tỉnh Bắc Bộ và đáp ứng một phần nguyên liệu cho nhà máy giấy Bãi Bằng. Cho đến nay, ở Việt Nam, loài bạch đàn Urô đã có 3 xuất xứ (Lembata cho vùng Bắc Trung Bộ, Lewotobi và Egon cho các tỉnh miền Bắc và Tây Nguyên) và 6 dòng vô tính được công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật: PN2, PN14, PN10, PN46, PN47, PN3d (Lê Đình Khả và cs, 2006). Đồng thời, bạch đàn Urô là một trong các loài cây rừng nằm trong danh mục các loài cây chủ lực cho trồng rừng sản xuất và danh mục các loài cây chủ yếu cho trồng rừng theo các vùng sinh thái Lâm nghiệp theo quyết định số 4861/QĐ-BNN-TCLN của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành ngày 17/11/2014.
7 Bạch đàn Urô được đánh giá là loài có dáng thân rất đẹp, chất lượng gỗ tốt. Tại nơi nguyên sản, gỗ bạch đàn này được sử dụng với rất nhiều mục đích như: Gỗ xây dựng, làm đồ dùng trong gia đình, gỗ trụ mỏ,... Tuy nhiên, bạch đàn Urô được xem như là nguyên liệu chính cho công nghiệp sản xuất giấy trên thế giới và Việt Nam. 1.2. Một số nghiên cứu chuyển gen vào Bạch đàn Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống Bạch đàn mới có năng suất cao, chất lượng gỗ tốt, chống chịu được sâu hại, nấm bệnh và các điều kiện bất lợi của môi trường (hạn, mặn, lạnh) đang được thực hiện tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Sử dụng công nghệ gen để tạo các giống bạch đàn chuyển gen với các tính trạng quý là hướng đã và đang được nhiều nhà khoa học đánh giá cao, nhiều quốc gia đầu tư, quan tâm nghiên cứu mạnh trong những năm gần đây, đặc biệt là các nước như Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Brazil. Lần đầu tiên vào năm 1991 đã công bố chuyển thành công gen cat và uidA vào loài bạch đàn E. Gunni nhờ dung hợp tế bào trần (Teulieres và cs, 1991), từ đó mở ra hướng nghiên cứu mới trên đối tượng các loài bạch đàn cho nhiều nhà khoa học trên thế giới. Yu và cs (2013) khi chuyển gen codA vào đỉnh chồi bạch đàn Eucalyptus globulus thu được kết quả: Ở tất cả các dòng chuyển gen đều ghi nhận hàm lượng glycinebetaine tích lũy cao, đặc biệt là ở lá non. Đặc biệt, dòng 107-1 có khả năng chịu được nồng độ muối cao hơn các dòng chuyển gen còn lại và là dòng bạch đàn chuyển gen chịu mặn tiềm năng. Báo cáo kết quả đánh giá khả năng chịu mặn và an toàn sinh học môi trường của 36 dòng bạch đàn (Eucaluptus camaldulensis) chuyển gen mangrin chỉ ra rằng 7/36 dòng có khả năng chịu mặn cao hơn đáng kể so với các dòng đối chứng không chuyển gen và quan trọng hơn hết báo cáo không ghi nhận một tác động đáng kể nào đến an toàn sinh học môi trường (Yu và cs, 2013).
8 Kết quả trồng khảo nghiệm trong thời gian 4 năm nhằm đánh giá, so sánh tác động môi trường của 3 dòng bạch đàn (Eucalyptus globulus Labill.) chuyển gen codA (gen choline oxydase) có nguồn gốc từ vi khuẩn Arthrobacter globiformis và 3 dòng bạch đàn không chuyển gen làm đối chứng của nhóm tác giả Oguchi và cộng sự (2014) cho thấy: Không có sự khác biệt đáng kể giữa các dòng bạch đàn chuyển gen và không chuyển gen trên các biến số quan sát bao gồm: sản xuất sinh khối, hệ vi sinh vật đất liền kề và thảm thực vật bằng cách giám sát các thông số tăng trưởng, thay đổi theo mùa ở các vi khuẩn đất và hoạt động allelopathic của lá. Năm 2016, nhóm tác giả Ouyang và cộng sự công bố công trình về ảnh hưởng của gen aiiA cảm ứng tính kháng bệnh cho dòng bạch đàn lai (Eucalyptus urophylla × Eucalyptus grandis) cho thấy: N-acyl-homoserine lactones (AHLs) là những chất chuyển hóa của hầu hết vi khuẩn gram âm và là phân tử tín hiệu quan trọng trong hệ thống cảm ứng của vi khuẩn. Ở nồng độ ngưỡng, AHLs có thể kích hoạt sự biểu hiện của gen gây bệnh và gây ra bệnh ở thực vật. Vì vậy, làm giảm nồng độ AHLs là điểm cốt lõi trong kiểm soát bệnh ở thực vật. AHL- lactonase được mã hóa bởi aiiA, có phổ biến trong nhóm Bacillus sp., và có thể thủy phân AHLs. Trong nghiên cứu này, gen aiiA nhân lên từ Bacillus subtilis bằng PCR. Vector biểu hiện ở thực vật Pcam-PPP3-aiiA chứa gen aiiA được xây dựng, trong đó aiiA được điều khiển bởi promoter PPP3 cảm ứng gây bệnh ở thực vật. Plasmid tái tổ hợp được chuyển vào Eucalyptus urophylla × Eucalyptus grandis bằng Agrobaterium tumefaciens. Kết quả PCR và lai Southern khẳng định aiiA đã được gắn thành công vào hệ gen của Eucalyptus urophylla × Eucalyptus grandis. RT –PCR cho thấy aiiA biểu hiện giống như sau khi tiêm Ralstonia solanacearum 12h. Hiệu quả phiên mã của aiiA tăng tương ứng 43,88 -30,65 và 18,95 lần sau khi tiêm Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora và Cylindrocladium quinqueseptatum, được xác định nhờ phản ứng RT-real time - PCR. Chuyển gen vào Eucalyptus urophylla × Eucalyptus grandis biểu hiện sự tổng hợp protein gen aiiA tăng cường đáng kể khả năng kháng bệnh so với cây không chuyển gen bằng cách trì hoãn sự bắt đầu héo và làm giảm chỉ số bệnh.