Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Sự tạo mô sẹo và dịch treo tế bào từ cây sưa (Dalbergia Tonkinensis Prain) In Vitro

Chia sẻ: Lavie Lavie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:112

Thêm vào BST

Báo xấu

84
lượt xem 16
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Sự tạo mô sẹo và dịch treo tế bào từ cây sưa (Dalbergia Tonkinensis Prain) In Vitro tập trung tìm hiểu về nuôi cấy tạo cây sưa; sự tạo mô sẹo, sự tăng trưởng của mô sẹo, những biến đổi hình thái giải phẫu trong quá trình hình thành mô sẹo,... Mời các bạn tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Sự tạo mô sẹo và dịch treo tế bào từ cây sưa (Dalbergia Tonkinensis Prain) In Vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Võ Dương Thanh SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ DỊCH TREO TẾ BÀO TỪ CÂY SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN) IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Võ Dương Thanh SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ DỊCH TREO TẾ BÀO TỪ CÂY SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN) IN VITRO Chuyên ngành : SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số : 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. BÙI TRANG VIỆT TS. LÊ THỊ TRUNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2013
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Thầy PGS.TS Bùi Trang Việt đã tận tình hướng dẫn, giảng dạy, bồi dưỡng kiến thức, đóng góp nhiều ý kiến quý báu và luôn tạo điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành luận văn. Cô TS. Lê Thị Trung đã giảng dạy, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm, luôn động viên giúp đỡ em trong quá trình học tập và làm luận văn. Cô TS. Dương Thị Bạch Tuyết, cô TS. Nguyễn Thị Mong, cô TS. Trần Thanh Hương, Thầy PGS.TS Bùi Văn Lệ, Thầy TS. Đỗ Minh Sĩ, cô TS. Trần Lê Bảo Hà, Thầy PGS.TS Nguyễn Minh Công đã giảng dạy cho em những kiến thức bổ ích. Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, Khoa sinh học và bộ môn Sinh lý Thực vật đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian học tập và làm luận văn ở trường. Các Thầy, Cô trong hội đồng đã dành thời gian đọc và đóng góp nhiều ý kiến cho luận văn của em. Em Hồ Thị Mỹ Linh đã nhiệt tình hướng dẫn và cho em mượn dụng cụ; hoá chất để thực hiện thí nghiệm. Các anh chị chuyên ngành sinh học thực nghiệm khóa 20, các bạn cùng khóa 21, khóa 22 và các em học viên ở phòng bộ môn Sinh lý Thực vật. BGH và tập thể giáo viên trường THPT Phú Quốc đã tạo điều kiện, giúp đỡ để em có thời gian hoàn thành chương trình học. Cảm ơn tất cả những người thân, những người bạn đã luôn ở bên cạnh tôi, dõi theo và động viên em trong suốt quá trình học tập. Cuối cùng, con xin chân thành cảm ơn ba mẹ và anh chị,cả cu Bin nữa đã luôn yêu thương, động viên và tạo điều kiện tốt nhất cho con hoàn thành chương trình học tập. Một lần nữa, tôi xin chân thành biết ơn! TP Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2013 Võ Dương Thanh
MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục các hình Danh mục các bảng MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1 Chương1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 2 1.1. Khái quát về cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)....................................... 2 1.1.1. Phân loại .................................................................................................... 2 1.1.2. Sự phân bố ................................................................................................. 2 1.1.3. Đặc điểm sinh học ..................................................................................... 2 1.1.4. Giá trị ......................................................................................................... 3 1.1.5. Tình trạng .................................................................................................. 3 1.1.6. Những nghiên cứu về cây Sưa................................................................... 3 1.2. Sự phát sinh hình thái thực vật ........................................................................ 4 1.2.1. Khái niệm sự phát sinh hình thái thực vật ................................................. 4 1.2.2. Sự phát sinh cơ quan và phát triển phôi hợp tử ......................................... 5 1.2.2.1. Mô phân sinh ngọn chồi và sự phát triển chồi ....................................... 5 1.2.2.2. Mô phân sinh ngọn rễ và sự hình thành rễ ............................................. 7 1.2.2.3. Sự phát triển phôi hợp tử ........................................................................ 9 1.2.3. Cơ sở phân tử của sự phát sinh cơ quan và phát sinh phôi ..................... 10 1.3. Sự phát sinh hình thái thực vật in vitro.......................................................... 12 1.3.1. Sự tạo mô sẹo .......................................................................................... 13 1.3.2. Sự tạo dịch treo tế bào ............................................................................. 14 1.3.3. Sự phát sinh cơ quan ............................................................................... 15 1.3.4. Sự phát sinh và thu nhận phôi thể hệ ...................................................... 16
1.4. Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật ....................................... 18 1.4.1. Auxin ....................................................................................................... 18 1.4.2. Cytokinin ................................................................................................. 22 1.4.3. Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin trong nuôi cấy in vitro .................... 24 1.4.4. Gibberelline ............................................................................................. 25 1.4.5. Abscissic acid (ABA) .............................................................................. 27 1.4.6. Etylene ..................................................................................................... 28 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ...................................................... 29 2.1. Vật liệu ........................................................................................................... 29 2.1.1. Vật liệu dùng trong nuôi cấy ................................................................... 29 2.1.2. Vật liệu sinh trắc nghiệm......................................................................... 29 2.2. Phương pháp .................................................................................................. 29 2.2.1. Nuôi cấy tạo cây Sưa in vitro .................................................................. 29 2.2.2. Sự tạo mô sẹo .......................................................................................... 30 2.2.2.1. Sự tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro......................................................... 30 2.2.2.2. Sự tăng trưởng của mô sẹo ................................................................... 31 2.2.3. Sự phát sinh cơ quan từ mô sẹo............................................................... 32 2.2.4. Quan sát hình thái giải phẫu .................................................................... 33 2.2.5. Đo cường độ hô hấp ................................................................................ 33 2.2.6. Đo cường độ quang hợp .......................................................................... 33 2.2.7. Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật ............................... 33 2.2.7.1. Ly trích ................................................................................................. 33 2.2.7.2. Phân đoạn và đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh.................................................................................................... 35 2.2.8. Áp dụng kết quả sự thay đổi hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng thực vật trong quá trình tạo mô sẹo ........................................................ 36 2.2.9. Sự tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo ............................................................ 37 2.2.9.1. Khảo sát khối lượng mô sẹo ảnh hưởng đến sự tạo dịch treo tế bào của cây Sưa in vitro ................................................................................ 37
2.2.9.2. Khảo sát nồng độ các chất điều hoà tăng trưởng thực vật ảnh hưởng đến quá trình tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo của cây Sưa in vitro .......... 38 2.2.10. Phân tích số liệu .................................................................................... 38 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 39 3.1. Kết quả ........................................................................................................... 39 3.1.1. Nuôi cấy tạo cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) in vitro ................. 39 3.1.2. Sự tạo mô sẹo .......................................................................................... 39 3.1.2.1. Sự tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro......................................................... 39 3.1.2.2. Sự tăng trưởng của mô sẹo ................................................................... 55 3.1.2.3. Quan sát hình thái giải phẫu mô sẹo .................................................... 57 3.1.2.4. Sự thay đổi cường độ hô hấp của các mẫu cấy trong quá trình tạo mô sẹo ..................................................................................................... 64 3.1.2.5. Sự thay đổi hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trong quá trình tạo mô sẹo .............................................................. 65 3.1.2.6. Áp dụng kết quả sự thay đổi hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng thực vật trong quá trình tạo mô sẹo ........................................................ 66 3.1.3. Sự phát sinh cơ quan ............................................................................... 67 3.1.3.1. Sự phát sinh cơ quan từ mô sẹo............................................................ 67 3.1.3.2. Hình thái giải phẫu khối mô sẹo trong quá trình phát sinh cơ quan .... 70 3.1.3.3. Sự thay đổi cường độ quang hợp trong quá trình phát sinh cơ quan của mô sẹo .............................................................................................. 73 3.1.3.4. Sự thay đổi cường độ hô hấp trong quá trình phát sinh hình thái của mô sẹo ..................................................................................................... 74 3.1.3.5. Sự thay đổi hoạt tính các CĐHTTTV trong quá trình phát sinh cơ quan......................................................................................................... 75 3.1.4. Sự tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo của cây Sưa in vitro ........................... 76 3.1.4.1. Ảnh hưởng của khối lượng mô sẹo đến sự tạo dịch treo tế bào cây Sưa in vitro.............................................................................................. 76
3.1.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ các chất điều hoà tăng trưởng thực vật đến quá trình tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo cây Sưa in vitro ....................... 78 3.2. Thảo luận ....................................................................................................... 81 3.2.1. Sự tạo cây Sưa in vitro ............................................................................ 81 3.2.2. Sự tạo mô sẹo .......................................................................................... 81 3.2.3. Sự tăng trưởng của mô sẹo ...................................................................... 82 3.2.4. Những biến đổi hình thái giải phẫu trong quá trình hình thành mô sẹo.. 82 3.2.5. Sự thay đổi cường độ hô hấp trong quá trình tạo mô sẹo ....................... 83 3.2.6. Vai trò của các chất điều hoà tăng trưởng thực vật nội sinh trong quá trình tạo mô sẹo ...................................................................................... 83 3.2.7. Áp dụng kết quả sự thay đổi hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng thực vật trong quá trình tạo mô sẹo ........................................................ 84 3.2.8. Sự phát sinh cơ quan từ mô sẹo............................................................... 84 3.2.9. Những biến đổi hình thái giải phẫu trong quá trình phát sinh cơ quan từ mô sẹo ................................................................................................. 84 3.2.10. Sự thay đổi cường độ hô hấp và quang hợp trong quá trình phát sinh cơ quan từ mô sẹo ................................................................................... 85 3.2.11. Vai trò của các chất điều hoà tăng trưởng thực vật nội sinh trong quá trình phát sinh cơ quan từ mô sẹo. .......................................................... 85 3.2.12. Sự tạo dịch treo tế bào ........................................................................... 85 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 87 4.1. Kết luận .......................................................................................................... 87 4.2. Đề nghị ........................................................................................................... 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 88 PHỤ LỤC ................................................................................................................ 95
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4- dichlorophenoxyacetic acid ABA : abscissic acid BA : N6-Benzyladenine CĐHTTTV : chất điều hoà tăng trưởng thực vật DNA : deoxyribonucleic acid GA : gibberelline GA 3 : gibberellic acid IAA : indol acetic acid IBA : indolbutyric acid IUCN : International Union for Conservation of Nature and Natural Resources MS : Murashige và Skoog NAA : α-napthalenacetic acid RNA : ribonucleic acid TDZ : thidiazuron VU : Vulnerable (bị đe doạ, sắp nguy cấp)
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình1.2. Sơ đồ tổng quát chỉ các vùng mô phân sinh ngọn ....................................... 5 Hình 1.3. Sự tổ chức của vùng phát sinh hình thái để tạo mô phân sinh rễ ................ 8 Hình 1.4. Sự thành lập rễ (với AIA 10-6 M) và mô sẹo (với 2,4-D 10-6) từ mảnh lá Sansevieria (Bùi Trang Việt 2000). ..................................................... 13 Hình 1.5. Các giai đoạn chính của sự thu nhận phôi thể hệ. ..................................... 17 Hình 1.6. Cấu trúc phân tử một số chất điều hoà tăng trưởng thực vật nhóm auxin ........................................................................................................ 19 Hình 1.7. Cấu trúc phân tử một số chất điều hoà tăng trưởng thực vật nhóm cytokinin. ................................................................................................. 23 Hình 1.8. Cấu trúc phân tử một số chất điều hoà tăng trưởng thực vật nhóm gibberelline. ............................................................................................. 26 Hình 1.9. Cấu trúc phân tử abscissic acid. ................................................................ 27 Hình 1.10. Cấu trúc phân tử etylene ......................................................................... 28 Hình 2.2. Mẫu cấy cây Sưa 1 tuần tuổi để tạo mô sẹo. ............................................. 30 Hình 2.3. Sơ đồ li trích và cô lập các chất điều hoà tăng trưởng thực vật nội sinh .. 34 Hình 2.4. Mẫu cấy cây Sưa 1 tuần tuổi để tạo mô sẹo. ............................................. 36 Hình 3.1. Cây Sưa con nảy mầm in vitro sau 1 tuần trên môi trường MS............... 39 Hình 3.2. Các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro trên môi trường MS sau 1 tuần, không hình thành mô sẹo. ............................ 40 Hình 3.3.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l .............................................................................................. 40 Hình 3.4.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l và BA 0mg/l. ....................................................................... 41 Hình 3.5.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 0mg/l. ....................................................................... 41
Hình 3.6.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt trụ hạ diệp non của cây Sưa in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 0,5 mg/l. ............................................................................. 42 Hình 3.7.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt trụ hạ diệp non của cây Sưa in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 1mg/l. ................................................................................ 42 Hình 3.8.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt trụ hạ diệp non của cây Sưa in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l và BA 0,5mg/l. .............................................................................. 43 Hình 3.9.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l và BA 1mg/l. ....................................................................... 43 Hình 3.10.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 0,5mg/l. .................................................................... 44 Hình 3.11.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt trụ hạ diệp non của cây Sưa in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l. ................................................................................. 44 Hình 3.12.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l. ............................................................................................. 45 Hình 3.13.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l. ............................................................................................. 46 Hình 3.14.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l. ............................................................................................. 46 Hình 3.15.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung
2,4-D 1mg/l và BA 0,1mg/l. .................................................................... 47 Hình 3.16.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 1mg/l. ....................................................................... 47 Hình 3.17.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l và BA0,5mg/l. ..................................................................... 48 Hình 3.18.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l. ....................................................................... 48 Hình 3.19.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l. ....................................................................... 49 Hình 3.20.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 0,5mg/l. .................................................................... 49 Hình 3.21.Mô sẹo có nguồn gốc từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l. .................................................................................... 50 Hình 3.22.Mô sẹo có nguồn gốc từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l. .................................................................................... 51 Hình 3.23.Mô sẹo có nguồn gốc từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l. .................................................................................... 51 Hình 3.24.Mô sẹo có nguồn gốc từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 0,5 mg/l. .......................................................... 52 Hình 3.25.Mô sẹo có nguồn gốc từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp)
của cây Sưa in vitro sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 1mg/l. .............................................................. 52 Hình 3.26.Mô sẹo có nguồn gốc từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l và BA 0,5mg/l. ........................................................... 53 Hình 3.27.Mô sẹo có nguồn gốc từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l và BA 1mg/l. .............................................................. 53 Hình 3.28.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l. ....................................................................... 54 Hình 3.29. Các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro trên môi trường MS sau 3 tuần, không hình thành mô sẹo. ............................ 54 Hình 3.30. Sự tăng trưởng của mẫu cấy tạo mô sẹo (trọng lượng tươi và trọng lượng khô) trên môi trường khác nhau theo thời gian. ............................ 55 Hình 3.31. Sự tăng trưởng của mô sẹo (trọng lượng tươi và trọng lượng khô) trên môi trường MS có bổ sung 2.4-D 3mg/l và BA 1mg/l theo thời gian nuôi cấy. ................................................................................................... 56 Hình 3.32.Lát cắt ngang thân non (trụ hạ diệp) cây Sưa in vitro 1 tuần tuổi............ 57 Hình 3.33. Lát cắt ngang mẫu cấy tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 3 ngày, có sự phản phân hóa của các tế bào nhu mô và sự phân chia của tế bào tượng tầng (mủi tên). .......................................................................................................... 57 Hình 3.34. Lát cắt ngang mẫu cấy tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 5 ngày, các tế bào mô sẹo đang phân chia để hình thành khối mô sẹo. ...................................... 58 Hình 3.35. Lát cắt ngang mẫu cấy tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 7 ngày, các tế bào mô sẹo đang tách rời nhau. ............................................................................ 58
Hình 3.36. Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có hình dạng không ổn định và kéo dài. ........................................................................ 59 Hình 3.37. Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có hình dạng không ổn định và kéo dài. ........................................................................ 59 Hình 3.38. Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có hình dạng không ổn định và kéo dài. ........................................................................ 60 Hình 3.39. Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 0,5mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có hình dạng không ổn định và kéo dài. ....................................................... 60 Hình 3.40. Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 1mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có hình dạng không ổn định. ........................................................................ 61 Hình 3.41. Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l và BA 0,5mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có hình dạng không ổn định. ........................................................................ 61 Hình 3.42. Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 1mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có hình dạng không ổn định, có những tế bào kéo dài và những tế bào hình cầu. . ................................................................................................. 62 Hình 3.43. Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 0,5mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có hình dạng không ổn định. ........................................................................ 62 Hình 3.44. Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có dạng hình cầu ổn định nhất. ..................................................................... 63 Hình 3.45. Sự thay đổi cường độ hô hấp của mô sẹo từ mẫu cấy khúc cắt thân
non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l theo thời gian. ................................................ 64 Hình 3.46. Sự thay đổi hoạt tính các CĐHTTTV nội sinh của khối mô sẹo qua các tuần tuổi trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l. ....................................................................................................... 65 Hình 3.47. Sự tăng trưởng của mẫu cấy tạo mô sẹo (trọng lượng tươi) trên các môi trường khác nhau theo thời gian. ...................................................... 66 Hình 3.48. Mô sẹo hoá nâu và chết sau 2 tuần trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,5mg/l và BA 0,1mg/l................................................................... 67 Hình 3.49. Mô sẹo phát triển mạnh và hoá nâu dần trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,5mg/l và BA 0,5mg/lsau 6 tuần. ........................................ 68 Hình 3.50. Mô sẹo phát sinh cơ quan, bắt đầu xuất hiện màu xanh trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l sau 2 tuần, .............. 68 Hình 3.51. Mô sẹo phát sinh hình thái trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l sau 4 tuần, đã hình thành cơ quan. ....................... 69 Hình 3.52. Mô sẹo phát sinh hình thái trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l sau 6 tuần, cơ quan đang phát triển. ..................... 69 Hình 3.53. Các cấu trúc sơ khởi chồi hình thành trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l...................................................................... 70 Hình 3.54. Sơ khởi chồi kéo dài trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l. ............................................................................................ 70 Hình 3.55. Cơ quan chồi phát triển và hình thành hệ mạch dẫn trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l. ........................................... 71 Hình 3.56.Cơ quan chồi phát triển mạnh và hình thành látrên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l. ....................................................... 71 Hình 3.57. Cơ quan chồi phát triển mạnh hoàn thiện trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l. ............................................................ 72 Hình 3.58. Sự thay đổi cường độ quang hợp của mô sẹo trên môi trường tạo cơ quan MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l theo thời gian. ........... 73
Hình 3.59. Sự thay đổi cường độ hô hấp của mô sẹo trên môi trường tạo cơ quan MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l theo thời gian. .................... 74 Hình 3.60. Sự thay đổi hoạt tính các CĐHTTTV nội sinh của khối mô sẹo nuôi cấy tạo cơ quan trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l theo thời gain nuôi ......................................................................... 75 Hình 3.61. Dich treo ở nghiệm thức 2,0 gam mô sẹo phát triển trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 1 tuần. ............................. 76 Hình 3.62. Dich treo ở nghiệm thức 500 mg mô sẹo phát triển trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 1 tuần. ............................. 77 Hình 3.63. Cụm tế bào trong dịch treo ở nghiệm thức 2,0 gam mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 1 tuần. ................ 77 Hình 3.64. Cụm tế bào trong dịch treo ở nghiệm thức 500 mg mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 1 tuần. ................ 78 Hình 3.65. Cụm tế bào trong dịch treo ở nghiệm thức 500 mg mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 0,5mg/l sau 1 tuần. ............. 79 Hình 3.66. Cụm tế bào trong dịch treo ở nghiệm thức 500 mg mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 1mg/l sau 1 tuần. ................ 79 Hình 3.67. Cụm tế bào trong dịch treo ở nghiệm thức 500 mg mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l và BA 0,5mg/l sau 1 tuần. ............. 80 Hình 3.68. Cụm tế bào trong dịch treo ở nghiệm thức 500 mg mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l và BA 1mg/l sau 1 tuần. ................ 80
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Nồng độ các chất điều hoà tăng trưởng thực vật được bổ sung vào các môi trường tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro. ............................................. 31 Bảng 2.2. Nồng độ các chất điều hoà tăng trưởng thực vật được bổ sung vào môi trường phát sinh cơ quan từ mô sẹo cây Sưa. .......................................... 32 Bảng 2.3. Nồng độ các chất điều hoà tăng trưởng thực vật bổ sung vào các môi trường tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro. .................................................... 37 Bảng 2.4. Nồng độ các chất điều hoà tăng trưởng thực vật bổ sung vào các môi trường tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo từ cây Sưa in vitro. ...................... 38 Bảng 3.1. Sự thay đổi trọng lượng tươi và khô của mô sẹo có nguồn gốc từ khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro theo thời gian nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2.4-D 3mg/l và BA 1mg/l. ................... 55 Bảng 3.2. Sự thay đổi trọng lượng tươi và khô của mô sẹo cây Sưa trên môi trường MS có bổ sung 2.4-D 3mg/l và BA 1mg/l theo thời gian nuôi cấy. ........................................................................................................... 56 Bảng 3.3. Sự thay đổi cường độ hô hấp của mô sẹo từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l theo thời gian. .......................................................... 64 Bảng 3.4. Sự thay đổi hoạt tính các CĐHTTTV nội sinh của khối mô sẹo qua các tuần tuổi trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l. .... 65 Bảng 3.5. Sự tăng trưởng (trọng lượng tươi) của mẫu cấy tạo mô sẹo trên các môi trường có bổ sung 2,4-D và BA ở các nồng khác nhau theo thời gian. .. 66 Bảng 3.6. Sự thay đổi cường độ quang hợpcủa mô sẹo trên môi trường tạo cơ quan MS có bổ sung 2,4-D 0,1mg/l và BA 3mg/l theo thời gian. ........... 73 Bảng 3.7. Sự thay đổi cường độ hô hấp của mô sẹo trên môi trường tạo cơ quan MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l theo thời gian. .................... 74 Bảng 3.8. Sự thay đổi hoạt tính các CĐHTTTV nội sinh của khối mô sẹo nuôi cấy tạo cơ quan trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l theo thời gian nuôi cấy. ................................................................. 75
1 MỞ ĐẦU Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) là loài cây gỗ quý, hiếm, có giá trị kinh tế cao. Gỗ thuộc loại nặng, cứng, có vân đẹp, không bị mối mọt và có mùi thơm đặc biệt ( Đỗ Văn Bản và cs 2009).Chính vì vậy gỗ Sưa được dùng để đóng đồ đạc gia đình cao cấp, làm đồ mỹ nghệ và chạm khắc. Cây có tán đẹp, hoa thơm nên được trồng làm cây đường phố và vườn hoa (Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam 1996). Trong y học cổ truyền của Việt Nam và Trung Quốc, nhiều loài trong chi Dalbergia đã được sử dụng để chữa trị các bệnh về xương khớp, tiêu hoá, mụn nhọt, ngoại thương xuất huyết (Võ Văn Chi 1999).Những năm gần đây, giới thương gia Trung Quốc đổ xô săn lùng gỗ Sưa, giá gỗ Sưa rất đắt, vào thời điểm “ sốt” nhất, giá 1kg gỗ Sưa lên đến hàng chục triệu đồng, thậm chí đến 11 tỉ đồng/m3. Chính vì vậy gỗ Sưa đang bị khai thác quá mức. Cây Sưa được ghi nhận trong danh mục sách đỏ Việt Nam và được chính phủ Việt Nam quy định trong nhóm IA của nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày 30 tháng 3 năm 2006 là loại đặc biệt quý hiếm và có nguy cơ đe dọa tuyệt chủng. Theo đánh giá của hiệp hội bảo tồn thiên nhiên thế giới, cây Sưa hiện nay là VU A1 cd – sắp nguy cấp (UICN 1997). Đề tài “Sự tạo mô sẹo và dịch treo tế bào từ cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) in vitro”, nhằm tạo tiền đề cho sự nhân giống Sưa sau này. Nội dung đề tài tập trung nghiên cứu sự tạo mô sẹo, sự phát sinh cơ quan từ mô sẹo và bước đầu tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo của cây Sưa in vitro.
2 Chương1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái quát về cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 1.1.1. Phân loại Giới : Plantae Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Bộ : Fabales Họ : Fabaceae Phân Họ : Faboideae Chi : Dalbergia Loài : Dalbergia tonkinensis Prain Cây Sưa còn được gọi là Trắc thối (Võ Văn Chi 2003). 1.1.2. Sự phân bố Ở Việt Nam, cây Sưa phân bố ở các tỉnh: Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Hà Tây, Ninh Bình, Phú Yên, Khánh Hòa, Đồng Nai, Gia Lai. Trên thế giới, cây Sưa có mặt ở Trung Quốc (đảo Hải Nam). Cây có tán đẹp, hoa thơm nên được trồng làm cây đường phố và vườn hoa (Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam 1996). 1.1.3. Đặc điểm sinh học Cây Sưa (Dalbergia tonkinesis Prain) thuộc gỗ nhỡ, rụng lá, cao 15 – 20 m, đường kín thân 0,5 – 0,7 m. Vỏ màu xám trắng, thịt vàng, dày 3 mm (Bộ khoa học và công nghệ Việt Nam 1996) Gỗ Sưa có dác và lõi phân biệt. Gỗ dác có màu xám và vàng nhạt. Gỗ lõi có nhiều màu sắc, từ đỏ vàng đến nâu hồng hơi tím, thường có sọc màu sẫm tạo thành vân rất đẹp cả trên 3 mặt cắt. Tia gỗ nhỏ và hẹp, có cấu tạo tầng. Gỗ sưa có mùi thơm rất đặc biệt mà gỗ trắc và cẩm lai không có. Trên mặt cắt ngang phần gỗ lõi vừa mới cắt ngang thường thấy có chất nhựa màu nâu đỏ đùn ra. Gỗ sưa chủ yếu có lỗ mạch đơn đến kép ngắn 2-3 (gỗ trắc, cẩm lai có mạch kép 5-7). Chất nhựa chứa trong mạch nhiều, màu nâu đỏ đến nâu vàng. Mô mền không dính mạch thường tụ
3 hợp thành những đám, đặc biệt có chứa chất hữu cơ màu nâu đỏ đến nâu vàng (Đỗ Văn Bản và cs 2009). Lá kép lông chim một lần, mang 7 – 17 lá chét, mọc cách, hình bầu dục rộng, đầu có mũi nhọn ngắn, gốc tròn, gân bậc hai khoảng 10 đôi, mặt dưới màu hơi mốc.Hoa trắng thơm. Cụm hoa là chùy ở nách lá. Đài dạng chuông, xẻ 5 thùy.Quả đậu hình bầu dục dài 5 – 7 cm, rộng 2 – 2,5 cm, mùa hoa tháng 2 – 3, mùa quả chín 9 – 11. Quả mang 1 – 2 hạt hình thận, dài 9 mm, rộng 5 mm. Tái sinh bằng hạt và chồi (Bộ khoa học và công nghệ Việt Nam 1996). 1.1.4. Giá trị Gỗ Sưa là một trong những loại gỗ quý, hiếm ở nước ta, có giá trị kinh tế cao. Gỗ thuộc loại nặng, cứng, có vân đẹp, không bị mối mọt và có mùi thơm đặc biệt (Đỗ Văn Bản và csv 2009).Chính vì vậy gỗ Sưa được dùng để đóng đồ đạc gia đình cao cấp, làm đồ mỹ nghệ và chạm khắc. Cây có tán đẹp, hoa thơm nên được trồng làm cây đường phố và vườn hoa (Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam 1996). Trong y học cổ truyền của Việt Nam và Trung Quốc, nhiều loài trong chi Dalbergia đã được sử dụng để chữa trị các bệnh về xương khớp, tiêu hoá, mụn nhọt, ngoại thương xuất huyết (Võ Văn Chi 1999). 1.1.5. Tình trạng Sưa hiện nay đang bị tận diệt khai thác. Theo IUCN thì cấp đe dọa của nó hiện nay là VU A1cd - sắp nguy cấp (năm đánh giá 1997). Dalbergia tonkinensis Prain được ghi nhận trong danh mục sách đỏ Việt Nam và được chính phủ Việt Nam quy định trong nhóm IA của nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày 30 tháng 3 năm 2006 là loại đặc biệt quý hiếm và có nguy cơ đe dọa tuyệt chủng. Giá gỗ Sưa rất đắt. Năm 2007, cơn “sốt” gỗ Sưa bùng phát ở Việt Nam. Ban đầu chỉ vài trăm ngàn đồng 1kg, chỉ trong một thời gian ngắn, vào thời điểm “sốt” nhất, giá 1kg sưa lên đến hàng chục triệu đồng, thậm chí đến 11 tỉ đồng/m3. 1.1.6. Những nghiên cứu về cây Sưa Tại một số trại cây giống, cây Sưa được nhân giống bằng hom, với điều kiện:
4 phải có giàn phun sương, hom đánh tẻ và sử dụng một số chất kích thích ra rễ như IBA, NAA (Trần Vinh 2007). Trên thế giới cũng như Việt Nam những nghiên cứu về cây Sưa chưa được công bố. Tài liệu về cây Sưa không nhiều và chưa chuyên sâu. Những nghiên cứu mớivề cây Sưa: Xác định trình tự đoạn gen tRNA – Leu cho hai loài cây gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis) và cây gỗ Trắc đỏ (Dalbergiacochinchinensis ) phục vụ việc phân loại mẫu vật tại bảo tàng thiên nhiên Việt Nam. Kết quả nghiên cứu đã xác định được trình tụ nucleotide thuộc gen tRNA – Leu (trnL) cho loài D.tonkinensis Việt Nam và D.cochinchinensis Việt Nam có độ dài là 476bp và 432bp (tương ứng) và mức độ tương đồng di truyền 99,8%. Mức độ tương đồng di truyền hai loài Dalbergia của Việt Nam với 13 loàiDalbergia khác trên thế giới dao động từ 94,6% (giữa D.tonkinensis Việt Nam và D. foliolosa; D.cochinchinensis Việt Nam và D. foliolosa) đến 100% (giữa D. decipularis và D. frutescens) (Vũ Thị Thu Hiền và cs 2009). Những kết quả nghiên cứu ban đầu về thành phần hoá học isoflavon và dihydrophenanthren của cây Sưa (Dalbergia tonkinensis). Đây là lần đầu tiên khung dihydrophenanthren được tìm thấy trong chi Dalbergia(Trần Anh Tuấn và cs 2009). 1.2. Sự phát sinh hình thái thực vật 1.2.1. Khái niệm sự phát sinh hình thái thực vật Sự phát sinh hình thái thực vật là quá trình phát triển của cơ thể thực vật, tế bào, mô, cơ quan theo thời gian, thông qua sự phân chia, sự tăng trưởng và sự phân hóa tế bào. Bao gồm các quá trình (Bùi Trang Việt 2000): + Phát sinh mô (histogenesis) + Phát sinh cơ quan (organogenesis) + Phát sinh phôi (embryogenesis) Sự phát sinh hình thái phụ thuộc vào hai quá trình căn bản: sự điều hòa hướng kéo dài tế bào, và sự kiểm soát vị trí và hướng của mặt phẳng phân chia tế