Luận văn Thạc sĩ Sinh học thí nghiệm: Nghiên cứu định danh và đánh giá đa dạng di truyền của loài tế Thanh Thành (Asarum splenders) thu thập tại Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:85

Thêm vào BST

Báo xấu

20
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học thí nghiệm "Nghiên cứu định danh và đánh giá đa dạng di truyền của loài tế Thanh Thành (Asarum splenders) thu thập tại Việt Nam" trình bày các nội dung chính sau: Tách chiết DNA và PCR khuếch đại 4 đoạn chỉ thị DNA barcode ở thực vật; Giải mã và phân tích trình tự nucleotide các đoạn chỉ thị DNA barcode; Phân tích đánh giá sự đa dạng của mẫu nghiên cứu dựa trên chỉ thị DNA bằng công cụ tin sinh.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học thí nghiệm: Nghiên cứu định danh và đánh giá đa dạng di truyền của loài tế Thanh Thành (Asarum splenders) thu thập tại Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Lê Đình Kỳ NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA LOÀI TẾ TÂN THANH THÀNH (ASARUM SPLENDERS) THU THẬP TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội - 2022
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Lê Đình Kỳ NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA LOÀI TẾ TÂN THANH THÀNH (ASARUM SPLENDERS) THU THẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số: 8 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : Hướng dẫn 1: TS. HUỲNH THỊ THU HUỆ Hướng dẫn 2: PGS.TS. NGUYỄN HUY HOÀNG Hà Nội - Năm 2022
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tôi tự tìm hiểu và nghiên cứu. Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách quan nhất. Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ một nghiên cứu nào. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm. Tác giả luận văn Lê Đình Kỳ
ii LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự trân trọng và quý mến, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến toàn bộ quý Thầy Cô của Học viện Khoa học và Công nghệ, quý Thầy Cô và các bạn trong Viện Nghiên cứu Hệ gen đã truyền đạt những kiến thức quý báu, những kinh nghiệm trong nghiên cứu cho em trong suốt thời gian học tập và thực hành nghiên cứu. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cô TS. Huỳnh Thị Thu Huệ, ngƣời đã tận tâm giúp cho em trong từng việc làm, chỉ dạy từ cách thu thập mẫu, bảo quản và thực hành nghiên cứu đến chỉnh sửa những sai sót khi hoàn thành luận văn này. Em rất biết ơn định hƣớng của Thầy PGS. TS. Nguyễn Huy Hoàng đã cho em có cơ hội tiếp xúc với nghiên cứu khoa học, cách làm khoa học cũng nhƣ cách thức để vận dụng những nghiên cứu khoa học vào thực tiển. Mặc dù thời gian đi thực tế thu thập mẫu nghiên cứu bị tác động bởi dịch bệnh Covid-19, do mỗi địa phƣơng đều cố gắng chống dịch triệt để nên có nhiều tác động đến việc đi lại thu thập mẫu. Trên tinh thần quyết tâm hết sức vƣợt qua trở ngại và đƣợc sự giúp đỡ hết lòng của các đơn vị để có đƣợc mẫu, em thấy thật là may mắn và biết ơn nhiều đến Đại tá Nguyễn Xuân Thủy - Phó chỉ huy trƣởng Bộ chỉ huy bộ đội Biên Phòng tỉnh Lai Châu; Thiếu tá Vũ Văn Dũng đoàn kinh tế Quốc phòng 327, quân khu 3, Bắc Phong Sinh, tỉnh Quảng Ninh; các anh chị, đồng bào tại các khu Bảo tồn thiên nhiên Yên Tử, Quảng Ninh, khu Bảo tồn thiên nhiên Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc. Nghiên cứu này cũng đƣợc hỗ trợ nghiên cứu phân loại từ đề tài: "Nghiên cứu cơ sở khoa học cho việc sử dụng và bảo tồn một số loài mộc hƣơng (Aristolochia L.) ở Việt Nam", mã số: ĐLTE 00.09/21-22. Bƣớc đầu tiếp xúc nghiên cứu khoa học, do kiến thức và khả năng lý luận của bản thân còn hạn chế dù đã cố gắng hết khả năng nhƣng luận văn không tránh khỏi sai sót, em rất mong sự cảm thông và chỉ dạy của Thầy Cô để em có cơ hội đƣợc tiếp thu học tập nhiều hơn nữa. Sự quan tâm, động viên và chia sẻ của gia đình và bạn bè đã tạo sự thuận lợi rất lớn cho em hoàn thành luận văn này. Em trân trọng và biết ơn tất cả! Hà Nội, ngày 20 tháng 2 năm 2022 Tác giả luận văn Lê Đình Kỳ
iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT bp Cặp bazơ nitơ (base pair) BPS Bắc Phong Sinh CBOL Hiệp hội mã vạch sự sống (Consortium for the Barcode of Life) CR Rất nguy cấp (Critically Endangered) CTAB Cetyl trimethylammonium bromide DD Thiếu dẫn liệu (Data Deficient) DNA Axit deoxyribonucleic (Deoxyribonucleic acid) EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EN Nguy cấp (Endangered) EW Tuyệt chủng ngoài tự nhiên (Extinct in the wild) EX Tuyệt chủng (Extinct) GenBank Ngân hàng dữ liệu gen quốc tế Enzyme quan trọng trong quá trình chuyển hóa glucose HK-2 (Hexokinase-2) Phƣơng pháp cắc ký lỏng (High Performance Liquid HPLC Chromatography) ITS Vùng đệm trong đƣợc sao mã (Internal transcribed spacer) Liên minh Quốc tế bảo tồn thiên nhiên và tài nguyên thiên nhiên IUCN (International Union for Conservation of Nature and Natural Resource) LC Lai Châu Locus Vị trí mang gen trên NST LR Ít nguy cấp (Lower risk) matK Enzyme maturase K NE Không đánh giá (Not Evaluated) OD Phép đo mật độ quang (Optical Density) PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) PVP Polyvinylpyrrolidone RNA Axit ribonucleic (Ribonucleic acid) rpoC RNA polymerase C TD Tam Đảo VU Sẽ nguy cấp (Vulnerable) YT Yên Tử
iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Danh mục xếp hạng các loài Tế tân (Asarum L.) ở Bảng 1 6 Việt Nam Đối tƣợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu các loài Bảng 2.1 19 Tế tân tại Việt Nam Bảng 2.2 Danh sách trình tự và tên các đoạn mồi 20
v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Thứ hạng loài Asarum L. theo tiêu chuẩn IUCN trong 5 “Sách đỏ Việt Nam” Hình 1.2 Tế tân Thanh Thành (A. splendens F. Maekawa) 7 Hình 1.3 Tế tân Thanh Thành (A. splendens F. Maekawa) 8 Vị trí và hình dạng lá, thân, rễ Tế tân Yên Tử (A. Hình 3.1 26 yentuense) tại núi Yên Tử Vị trí và hình dạng lá, thân, rễ Tế tân Yên Tử (A. Hình 3.2 27 yentuense) tại Bắc Phong Sinh Vị trí và hình dạng lá, thân, rễ Tế tân pételot (A. Hình 3.3 28 petelotii) tại Tam Đảo Hình 3.4 Vị trí và hình dạng lá, thân, rễ Tế tân Thanh Thành (A. 29 splendens) tại Lai Châu Hình 3.5 Kết quả điện di DNA tổng số của bốn mẫu Tế tân 31 Hình 3.6 Kết quả điện di các sản phẩm PCR 32 Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch các mẫu Tế tân 33 Hình 3.8 Kết quả giải trình tự và một số vị trí đa hình của các 35 mẫu Tế tân Hình 3.9 So sánh một số trình tự chỉ thị ITS1 của chi Asarum L. 39 Hình 3.10 So sánh một số trình tự chỉ thị ITS2 của chi Asarum L. 42 Hình 3.11 So sánh một số trình tự chỉ thị matK của chi Asarum L. 50 Hình 3.12 So sánh một số trình tự chỉ thị rpoC của chi Asarum L. 55 Hình 3.13 Cây phân loại dựa trên chỉ thị ITS1 56 Hình 3.14 Cây phân loại dựa trên chỉ thị ITS2 56 Hình 3.15 Cây phân loại dựa trên chỉ thị matK 57 Hình 3.16 Cây phân loại dựa trên chỉ thị rpoC 58
vi Contents LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... iii DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................iv DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................... v MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 4 1.1 Đ C ĐIỂM CHUNG VỀ CHI TẾ TÂN (ASARUM L.) ............................. 4 1.1.1 Đặc điểm phân bố, sinh thái và hình thái chung của chi Tế tân............... 4 1.1.2 Những nghiên cứu về hoạt chất sinh học trong chi Tế tân ....................... 8 1.1.3 Công dụng theo y học cổ truyền của các loài Tế tân ............................. 10 1.1.4 Những nghiên cứu các loài Tế tân ở Việt Nam ...................................... 13 1.2 CHỈ THỊ PHÂN TỬ DN B RCODING TR N THỰC VẬT .............. 14 1.2.1 Khái niệm về DN barcoding .............................................................. 155 1.2.2 Một số chỉ thị DN barcoding thƣờng sử dụng trong phân loại ........... 16 1.2.3 Những nghiên cứu DN barcoding trong chi Tế tân nói chung ............ 17 CHƢƠNG 2. NGUY N VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHI N CỨU .......... 19 2.1 NGUY N VẬT LIỆU, Đ I TƢ NG NGHI N CỨU ............................ 19 2.1.1 Đối tƣợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................... 19 2.1.2 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu.................................................................. 20 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHI N CỨU ............................................................. 21 2.2.1 Mô tả đặc điểm hình thái ........................................................................ 21 2.2.2 Tách chiết DN tổng số từ lá ................................................................. 21 2.2.3 PCR khuếch đại các chỉ thị DN barcoding .......................................... 22 2.2.4 Tinh sạch các đoạn DN ........................................................................ 22 2.2.5 Xác định trình tự nucleotide các chỉ thị DN ........................................ 23
vii 2.2.6 Phân tích đánh giá sự đa dạng của mẫu nghiên cứu dựa trên chỉ thị DN b ng công cụ tin sinh....................................................................................... 24 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 25 3.1 Đ C ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CÁC MẪU NGHIÊN CỨU ..................................................................................... 25 3.2 NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ DN B RCODING CỦ CÁC MẪU NGHI N CỨU ................................................................................................ 30 3.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ các mẫu Tế tân............................... 30 3.2.2 Kết quả khuếch đại các đoạn chỉ thị DN b ng PCR ........................... 31 3.2.3 Kết quả tinh sạch các sản phẩm PCR khuếch đại các đoạn chỉ thị DNA .. ................................................................................................... 32 3.2.4 Kết quả xác định trình tự các đoạn DN barcoding .............................. 34 3.2.5 Kết quả phân tích đánh giá đa dạng di truyền các mẫu nghiên cứu dựa trên DNA barcoding ........................................................................................ 36 3.2.5.1 So sánh và phân tích trình tự các chỉ thị DNA ................................... 36 3.2.5.2 Xây dựng cây phân loại dựa trên các chỉ thị DNA ............................. 55 TÀI LIỆU TH M KHẢO......................................................................................... 62 PHỤ LỤC .....................................................................................................................i DANH SÁCH TRÌNH TỰ THAM CHIẾU TỪ CƠ SỞ DỮ LIỆU GENBANK........i TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CỦ CÁC ĐOẠN CHỈ THỊ ĐÃ GIẢI MÃ ................ ii HÌNH ẢNH KHẢO SÁT TẾ TÂN TẠI CÁC ĐỊ PHƢƠNG ............................... vii
1 MỞ ĐẦU Chi Tế tân (hay Hoa tiên, gừng dại – Asarum L.) thuộc họ Nam mộc hƣơng ( ristolochiaceae), bao gồm khoảng 128 loài, phát triển đa dạng ở các vùng ôn đới Bắc bán cầu. Chi này có nhiều loài bản địa ở khu vực Đông Nam Á, Trung Quốc, Đài Loan và duy nhất một loài ở châu Âu. Theo các nghiên cứu trong nƣớc, ở Việt Nam ghi nhận 10 loài theo các tài liệu phân loại thực vật trong đó các loài A. balansae Franch: Biến hóa núi cao; A. blumei Duch. Tế hoa blume; A. caudigerum Hance Thổ Tế tân; A. glabrum Merr. Hoa tiên; A. petelotii O. C. Schmidt Tế hoa pételot và A. reticulatum Merr Tế hoa mạng phân bố chủ yếu ở khu vực phía Bắc nƣớc ta; riêng A. wulingense Liang (Tế tân Vũ Linh) đƣợc phát hiện ở Hƣơng Sơn, Hà Tĩnh; trong đó 3 loài n m trong sách đỏ nƣớc ta. Ở một số khu vực vùng cao, các bộ phận nhƣ rễ, thân của các loài trong chi Tế tân đƣợc đồng bào các dân tộc sử dụng làm thuốc chữa các bệnh nhƣ viêm phế quản, hen suyễn hay phong hàn, tê thấp hay dùng thay thế mật gấu chữa bệnh. Trong các bài thuốc dân gian, các sản phẩm từ chi này còn đƣợc sử dụng kết hợp với các dƣợc liệu khác ngâm làm rƣợu thuốc, thuốc bổ. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc cho thấy, các loài Tế tân hầu hết có tinh dầu với một số thành phần chính nhƣ myristicin, metyl eugenol, myrcen, asafrol, borneol, safrol hay α-pinen... bên cạnh đó còn có các chất khác secquiterpen, sterol, naringenin hay các glycosyl flavonoid. Ở Việt Nam, đã có một số nhóm nghiên cứu khoa học về thành phần hóa học của một số loài trong chi này, tuy nhiên còn khá hạn chế về phƣơng pháp cũng nhƣ quy mô nghiên cứu. Bên cạnh đó, chƣa có nghiên cứu nào đƣợc ghi nhận về việc phân loại các loài này thông qua các chỉ thị phân tử ở nƣớc ta. Trong khi đó, nghiên cứu và ứng dụng nguồn tài nguyên cây cỏ vào y học cổ truyền rất có giá trị cho đời sống và y học. Việc có thêm những thông tin quan tâm vào hệ thống dữ liệu phát sinh gen sẽ giúp khắc phục các khó khăn trong việc nhận diện mẫu, điều gây trở ngại cho các nhà nghiên cứu phân loại, tiến hóa, đặc biệt là khi nghiên cứu nhóm phân bố rộng và các loài có nguy cơ tuyệt chủng với nguyên liệu quý hiếm, các loài cây thuốc có giá trị cao. Với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử hiện nay, việc khai thác thông tin loài thông qua chỉ thị phân tử là
2 rất cần thiết phục vụ trong nghiên cứu cơ bản cũng nhƣ các ứng dụng trong đời sống. Thông thƣờng, việc phân loại sẽ dựa trên các đặc điểm về hình thái bên ngoài, giải phẫu hoặc các đặc tính về sinh hóa, sinh lý bên trong nhờ vào bảng hƣớng dẫn định danh có sẵn nhƣng vẫn có sự sai sót nhất định trong phân loại khi những quan sát hình thái ở các giai đoạn sinh trƣởng, phát triển chƣa đầy đủ để định danh hoặc nhóm loài có quan hệ gần gũi mang những đặc điểm hình thái có độ tƣơng đồng cao, những mẫu vật bị khô héo, hƣ hỏng hay không còn nguyên dạng dẫn tới những khó khăn trong việc nhận diện và không thể nhận diện đƣợc. Trong các phƣơng pháp phân loại b ng phân tử chỉ thị DNA barcoding là kỹ thuật định danh loài b ng cách sử dụng các vùng DNA chuẩn trên hệ gen sinh vật chỉ với một mẫu vật rất nhỏ, dùng một trình tự nucleotide của một chuỗi DNA ngắn ở vùng có tính bảo thủ cao (vùng ít bị thay đổi) nhƣng có thể thay đổi trong quá trình tiến hóa để đánh giá sự sai khác di truyền giữa các sinh vật; phƣơng pháp này sẽ khắc phục các nhƣợc điểm phân loại b ng hình thái nhờ tính chính xác cao và nhanh chóng của nó. Chỉ thị DN sử dụng vùng gen của ty thể đã đƣợc thiết lập tốt ở động vật, việc lựa chọn các mã vạch cho thực vật thƣờng sử dụng các vùng gen ở lục lạp, cùng với sự kết hợp với một vài vùng trên hệ gen nhân nhƣ các đoạn ITS. Nghiên cứu về chỉ thị DNA của loài cây A. splendens ở nƣớc ta hầu nhƣ chƣa có cũng nhƣ các nghiên cứu quốc tế còn rất hạn chế. Là một trong những cây thuốc đƣợc ứng dụng thay thế mật gấu để chữa bệnh, đặc biệt là tiềm năng ứng dụng trong chữa bệnh gan và thực tế nghiên cứu về loài này còn ít nên chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu định danh và đánh giá đa dạng di truyền của loài tế tân Thanh Thành (Asarum splenders) thu thập tại Việt Nam”, thông qua đó góp phần vào hiểu biết chung về các đặc tính sinh học và về tính đa dạng trong di truyền DN phục vụ phân loại, giám định cho loài cây này. Đề tài thực hiện mục tiêu thu thập một số mẫu lá, thân của cây từ các vùng núi phía Bắc của Việt Nam. Đánh giá đƣợc tính đa dạng di truyền dựa trên các chỉ thị DN barcode ITS1, ITS2, matK và rpoC của cây Asarum splendens so với các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về loài Asarum splendens và với loài khác trong chi Tế tân. Từ đó, có cái nhìn khái quát
3 chung về đa dạng di truyền loài Tế tân nói chung và Tế tân A. splendens ở Việt Nam nói riêng. Với những nội dung thực hiện trong nghiên cứu nhƣ sau: - Thu thập mẫu tại các vùng núi khác nhau của miền núi phía Bắc. - Tách chiết DNA và PCR khuếch đại 4 đoạn chỉ thị DNA barcode ở thực vật. - Giải mã và phân tích trình tự nucleotide các đoạn chỉ thị DNA barcode. - Phân tích đánh giá sự đa dạng của mẫu nghiên cứu dựa trên chỉ thị DN b ng công cụ tin sinh. Ý nghĩa và điểm mới của luận văn: Cung cấp thêm dữ liệu DN đặc trƣng của loài Tế tân Thanh Thành (A. splender) cũng nhƣ ở một vài loài Tế tân khác ở Việt Nam, đóng góp rất có ý nghĩa trong nghiên cứu nh m tìm ra những chỉ thị hữu ích cho việc phân loại và nhận dạng loài Tế tân Thanh Thành cũng nhƣ các loài Tế tân khác của Việt Nam.
4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đ C ĐIỂM CHUNG VỀ CHI TẾ TÂN (ASARUM L.) 1.1.1 Đặc điểm phân bố inh hái và hình hái chung của chi Tế tân Chi Tế tân (hay Hoa tiên, gừng dại – Asarum L.) thuộc họ Nam mộc hƣơng ( ristolochiaceae), bao gồm khoảng 128 loài [1] phát triển đa dạng ở các vùng ôn đới Bắc bán cầu. Chi này có nhiều loài bản địa ở khu vực Đông Nam Á, Trung Quốc, Đài Loan và duy nhất một loài ở châu Âu. Theo một số nghiên cứu chi Tế tân đƣợc tìm thấy chủ yếu ở vùng núi có độ cao từ 700 m trở lên so với mặt nƣớc biển. Các loài cây Tế tân ƣa thích các khu vực ẩm ƣớt, có nhiều bóng râm và đất giàu mùn, lá có hình tim, mỗi năm lá mọc ra từ các đầu chồi tăng trƣởng trên thân rễ. Các nghiên cứu trong nƣớc cho thấy tuy cây Tế tân phát triển khá tốt trong các khu rừng đặc dụng, nhờ cách thức sinh trƣởng nhƣng cũng bị đe dọa do các hoạt động khai thác quá mức để làm thuốc dẫn đến suy giảm nghiêm trọng trong tự nhiên. Theo các công trình nghiên cứu của GS Phạm Hoàng Hộ trong cuốn “Cây cỏ Việt Nam, 1999” [2]; công trình nghiên cứu của GS Đỗ Tất Lợi trong cuốn “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, 2004” [3]; Sách đỏ Việt Nam, 2007 [4]; cuối năm 2007 ghi nhận đƣợc 7 loài Tế tân; năm 2012 Nguyễn Anh Tuấn và cộng sự bổ sung thêm 2 loài mới, đến năm 2017 Nguyễn Anh Tuấn và cộng sự tiếp tục bổ sung thêm loài mới là Tế tân Yên Tử, nhƣ vậy đến năm 2017 Việt Nam ghi nhận 10 loài Tế tân, phân bố ở các tỉnh nhƣ Lai châu, Cao B ng, Ba Vì - Hà Nội, Tam Đảo - Vĩnh Phúc, Sapa - Lào Cai, Hà Giang, Đảo Cát Bà - Hải Phòng, Hà Tĩnh, Yên Tử - Quảng Ninh. Các loài Tế tân ở nƣớc ta gồm có Tế hoa blume – A. blumei Duch, đƣợc Duch mô tả khoa học lần đầu tiên năm 1864: tên gọi khác là Biến hóa Blume [5 ; Thổ tế tân – A. caudigerum Hance, đƣợc Hance mô tả khoa học lần đầu tiên năm 1881: tên gọi khác là Tế tân, Biến hóa, Quán chì; Biến hóa núi cao – A. balansae Franch, đƣợc Franch mô tả khoa học lần đầu tiên năm 1898: tên gọi khác là Tế tân nam, hoa tiên [5]; Tế tân Pételot – A. petelotii O. C. Schmidt, đƣợc O.C.Schmidt mô tả khoa học đầu tiên năm 1931: tên gọi khác là Tế tân Pételot [5]; Hoa tiên – A. glabrum Merr, tên đồng nghĩa A. maximum Auct đƣợc Merr mô tả khoa học lần đầu tiên năm 1942: tên gọi khác là Trầu tiên, Dầu tiên, Đại hoa tế tân [2]; Tế hoa mạng – A. reticulatum Merr, đƣợc Merr
5 mô tả khoa học đầu tiên năm 1942; Vũ Linh Tế tân – A. wulingense Liang đƣợc C.F.Liang mô tả khoa học đầu tiên năm 1975; A. cordifolium C. E. C. Fischer và Tế tân Vân Nam – A. yunnanense T. Sugaw., Ogisu & C.Y. Cheng bổ sung năm 2012 [6], [7] và Tế tân Yên Tử - A. yentuense N. Tuan và cộng sự mô tả khoa học năm 2018 [8]. Trong đó có 3 loài n m trong sách đỏ, đó là A. balansae Franch là cây thuốc dạng quý hiếm, thuộc phân hạng nguy cấp EN 1c,d, B1+2b,c đang đứng trƣớc một nguy cơ rất lớn sẽ bị tuyệt chủng ngoài thiên nhiên trong một tƣơng lai gần, theo quan sát đã suy giảm ít nhất 50 %; A. caudigerum Hance và A. glabrum Merr. cũng là cây thuốc dạng quý hiếm, thuộc phân hạng nguy cấp VU 1a,c,d, và VU 1c,d tuy chƣa phải là rất nguy cấp nhƣng trong một tƣơng lai gần sẽ đứng trƣớc nguy cơ lớn tuyệt chủng ngoài thiên nhiên và đã suy giảm ít nhất 20 % [4]. Hình 1.1: Thứ hạng loài Asarum L. theo tiêu chuẩn IUCN trong “Sách đỏ Việt Nam”, 2007. Theo báo cáo “Điều tra đánh giá tình trạng bảo tồn các loài thực vật rừng nguy cấp, quý hiếm thuộc danh mục Nghị định 32/2006/NĐ-CP theo
6 vùng sinh thái” của Tổng cục Lâm nghiệp cuối năm 2010 thêm 2 loài Tế tân n m trong nhóm IIA: nhóm các loài thực vật nguy cấp, quý hiếm đó là A. petelotii O. C. Schmidt và A. reticulatum Merr [9]. Bảng 1: Danh mục xếp hạng các loài Tế tân (Asarum L.) ở Việt Nam Nghị định Số Tên chi Tế tân Tên khoa học 32/2006 thứ tự ND-CP 1 Biến hóa núi cao A. balansae Franch IIA 2 Thổ tế tân A. caudigerum Hance IIA 3 Đại hoa Tế tân A. glabrum Merr IIA 4 Tế hoa mạng A. reticulatum Merr IIA 5 Tế tân Pételot A. petelotii O. C. Schmidt IIA 6 Tế hoa blume A. blumei Duch - 7 Tế tân Vũ Linh A. wulingense C.F.Liang - Nguồn: Trung tâm Tài nguyên và Môi trường Lâm nghiệp Viện Điều tra Quy hoạch Rừng. Về đặc điểm hình thái Tế tân là cây lá nhỏ có vị cay, các loài thuộc chi Tế tân đều thân cỏ cao 10 cm - 30 cm tùy loài, mọc thấp thành đám nhỏ ở những nơi đất mùn, thƣờng mọc thành từng đám theo bờ khe suối, không tìm thấy dƣới tán cây lớn, chƣa thấy mọc trên đỉnh núi, thƣờng sống ở nơi có khí hậu mát mẻ, ẩm ƣớt quanh năm, nơi thƣờng xuyên có mây mù bao phủ và độ cao trên dƣới 1000 m, nơi có độ ẩm không khí trung bình năm trên 80 % và nhiệt độ trung bình năm từ 15 °C – 18 °C. Mỗi năm cây phát triển thêm 1 – 4 lá tùy loài, phiến lá dài 10 cm – 18 cm, rộng 8 cm – 12 cm, lá mềm mỏng màu xanh lục, mặt trên nhẵn, mặt dƣới hơi có lông, hình tim hoặc hình quả thận, mép nguyên, chóp lá nhọn, cuống lá dài, có lông tơ nhẵn mịn thƣờng có màu tím nhạt. Thân rễ dƣới đất, bò ngang, đầu thân rễ có phân nhánh, đƣờng kính thân rễ 4 – 5 mm, thân rễ n m rồi đứng, có rế sái vị, rễ nhỏ và dài, vê ở tay có mùi thơm [3]. Loài Tế tân Thanh Thành (A. splendens) còn gọi là gừng dại Trung Quốc (Chinese wild ginger) trƣớc đây còn gọi là A. chingchengense. Cây có tốc độ phát triển chậm, mỗi năm chỉ ra 1 lá, cuống lá dài 15 cm - 18 cm có
7 màu tím đậm hơn so với loài khác trong chi Asarum L., lá sớm rụng vào mùa đông và đến mùa xuân lá mới lại mọc ra từ các đầu chồi rễ n m dƣới đất, nên ngƣời địa phƣơng còn gọi là cây1 lá. Lá mỏng cỡ 13 cm x 18 cm có màu xanh đậm lốm đốm bạc ở mặt trên hai bên phiến lá khác biệt so với các loài trong chi Asarum L., lá hình tim nhọn ở chóp lá, 2 thùy gốc lá rộng (Xem hình 1.2). Hình 1.2: Tế tân Thanh Thành (Asarum splendens F. Maek.) (Hình vẽ theo Legacy.tropicos.org) [10] Hoa xuất hiện vào mùa xuân, mọc đơn giữa các gốc lá, ở mặt đất, hoa có màu nâu tía hình cái bát, kì dị nhƣ cái ấm nhỏ, nên có biệt danh là “Little Brown Jug” (cái ấm nâu nhỏ) (Xem hình 1.3) [11].
8 Hình 1.3: Tế tân Thanh Thành (Asarum splendens F. Maek.) (Hình ảnh theo Alamy.com) [11] 1.1.2 Những nghiên cứu về h ạ ch inh học ng chi Tế n Dựa trên các thành phần hợp chất phong phú, các loài trong chi Asarum L. cũng đƣợc các nhà khoa học quan tâm tới các hoạt tính sinh học của chúng trong những năm gần đây, mặc dù các loài này đã đƣợc ghi nhận trong các bài thuốc dân gian từ lâu. Nhìn chung, các nghiên cứu ở chi này thƣờng chỉ tập trung ở một số loài phổ biến nhƣ A. sieboldii (Hán thành tế tân) hay A. heterotropoides (Bắc tế tân). Chi Tế tân n m trong nhóm 10 chi giàu loài cây
9 thuốc có chứa tinh dầu nhất [12], lƣợng tinh dầu thƣờng ở khoảng 2 % - 3 % tùy thuộc vào loài. Nghiên cứu trƣớc đây của Yu Jing và cộng sự 2017 đã đánh giá hoạt tính kháng viêm của 37 hợp chất trên loài A. heterotropoides var. mandshuricum gồm các loại nhƣ lignans, neoasarinin, monoterpene, asarincin (Jing Y và cộng sự., 2017) [13]. Trong năm 2001, Zhang và cộng sự đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký để phân lập và phát hiện nhiều hợp chất mới từ rễ và thân rễ của loài A. longerhizomatosum C. F. Liang et C. S. Yang (Zhang và cộng sự, 2001) [14]. Ngoài ra, còn một số nghiên cứu đơn lẻ của các nhà khoa học Trung Quốc và Nhật Bản về thành phần hóa học của các loài Asarum L., chủ yếu phân lập và chiết xuất các dẫn chất flavonoid glycosid. Theo Feng Zhang 2005, tinh dầu lá ở mô lá của cây A. forbesii chứa hai thành phần chính là methylisoeugenol (33.3 %) và alpha-asaron (19.2 %); còn ở rễ tỉ lệ lần lƣợt là 58.8 % và 10.3 % [15]. Vào năm 2008, Shao-Qing Cai và cộng sự đánh giá hoạt tính gây độc của các cây trong chi Tế tân, ghi nhận một số chiết xuất có chống lại một số dòng tế bào ung thƣ nhất định; đáng chú ý trong đó có chiết xuất 95 % với ethanol hoặc nƣớc của A. splendens cũng thể hiện khả năng gây độc tế bào một cách có chọn lọc [16]. Năm 2017, Wenting Ji và cộng sự đã đánh giá khả năng điều tiết quá trình viêm của một loại thuốc có nguồn gốc Tế tân lên tế bào tua [17]. Một nhóm nghiên cứu khác sử dụng kỹ thuật sắc ký khối phổ để tìm hiểu về độc tính in vitro của các loài Tế tân lên tế bào thận ngƣời (HK-2) [18]. Kết quả cho thấy không có độc tính lên tế bào ở nồng độ trong nghiên cứu, tuy nhiên các cơ chế khác liên quan tới gây độc ở thận và hình thành ung thƣ do aristolochic acid có thể xảy ra. Công bố năm 2018 của nhóm khoa học Trung Quốc cho thấy các yếu tố viêm có liên quan tới độc tính trên phổi của Asarum, mở ra những hƣớng nghiên cứu tiếp theo về cơ chế phân tử của độc tính ở chi này [19]. Gần đây nhất, trong năm 2021, có hai nghiên cứu mới của các nhóm nhà khoa học Trung Quốc về đánh giá về hoạt tính và mức độ gây độc của thuốc có nguồn gốc Tế tân và khả năng bảo vệ tế bào khỏi virus cúm H1N1, giảm các tác động của quá trình viêm [20]. Các nhà khoa học Nga trong năm 2020 về hóa thực vật và dƣợc dân tộc học của chi Asarum L. lần nữa khẳng định sự có mặt của tinh dầu cùng các hợp chất thứ cấp cũng nhƣ hoạt tính sinh học rất phong phú [21]. Cũng trong năm này, tìm hiểu của Seol
10 Jang và cộng sự ghi nhận 6 thành phần gây dị ứng của loài A. sieboldii b ng phƣơng pháp HPLC [22]. 1.1.3 Công dụng theo y học cổ truyền của các loài Tế tân Tế tân đã đƣợc khai thác và sử dụng từ lâu trong nền Y học cổ truyền để chữa bệnh, là loại thuốc có vị cay, tính ôn, quy vào kinh tâm, kinh can, kinh phế và kinh thận. Có tác dụng khu phong tán hàn giải biểu, ôn ấm phế hóa đàm, thông khiếu, dùng trị phong hàn biểu chứng nhƣ đầu thống, tý thống, phúc thống, nha thống, đàm ẩm khái suyễn,...và cũng đƣợc dùng làm thuốc bồi bổ cơ thể. Qua thực tế và tìm hiểu cây thuốc Tế tân có thể đƣợc sử dụng cả lá, thân và rễ để làm thuốc, ở Việt Nam có nhiều nơi thu hoạch bán sang Trung Quốc, đồng thời các đại lý đông y cũng nhập Tế tân về từ Trung Quốc, khi sử dụng thƣờng kết hợp với một số vị thuốc khác để chữa bệnh, liều lƣợng thƣờng sử dụng 4 gram - 12 gram, lá Tế tân (Trầu tiên 1 lá) cùng với gừng gió, địa liền, vỏ quế, hoa hồi ngâm với rƣợu dùng để xoa bóp trị bong gân, thần kinh tọa, phong thấp, cảm lạnh hoặc hòa nƣớc tắm, ngâm chân tay khi đau nhức. Ở vùng cao, đồng bào các dân tộc sử dụng làm thuốc giải độc rƣợu, nấu lá nƣớc tắm chữa cảm phong hàn hay chữa các bệnh nhƣ viêm phế quản, hen suyễn, tê thấp. Ngoài ra các sản phẩm từ chi này còn đƣợc kết hợp với các vị thuốc khác thay thế mật gấu để chữa bệnh hay ngâm làm rƣợu thuốc bổ. Một số bài thuốc cổ phƣơng đến nay vẫn đƣợc sử dụng với vị thuốc Tế tân rất có hiệu quả nhƣ: 1. Bài thuốc Ma hoàng Phụ tử Tế tân thang gồm: Ma hoàng 4 g - 6 g, Phụ tử 4 g - 8 g, Tế tân 4 g – 8 g, sắc uống làm tráng dƣơng, giải biểu, trị dƣơng hƣ gầy yếu, cảm phong hàn, ớn rét, phế quản viêm mạn, hen phế quản. Tế tân vừa giúp Ma hoàng giải biểu, vừa giúp Phụ tử ôn kinh, tán hàn [23]. 2. Bài thuốc Độc hoạt ký sinh thang là phƣơng thuốc cổ truyền nổi tiếng đƣợc giới y học phƣơng Đông đánh giá cao về hiệu quả điều trị hội chứng đau thần kinh tọa, trừ phong thấp, giảm đau, dƣỡng can thận, bổ khí huyết gồm các vị nhƣ: Độc hoạt 8 g – 12 g, Phòng phong 8 g – 12 g, Bạch thƣợc 12 g– 16 g, Đỗ trọng 12 g – 16 g, Phục linh 12 g– 16 g, Tang ký sinh 12 g – 24 g, Tế tân 4 g– 8 g, Xuyên khung 6 g– 12 g, Ngƣu tất 12 g – 16 g,
11 Chích thảo 4 g, Tần giao 8 g – 12 g, Đƣơng qui 12 g – 16 g, Địa hoàng 16 g– 24 g, Đảng sâm 12 g– 16 g. Tùy từng trƣờng hợp mà có thể điều chỉnh gia giảm liều lƣợng từng vị cho phù hợp. Trong bài này độc hoạt và Tế tân là 2 vị chủ quy vào kinh thận loại bỏ các chứng tý khiến cho tà khí xuất ra ngoài [23] 3. Bài thuốc Linh cam ngũ vị khƣơng tân thang gồm: Tế tân 4 g– 8 g, Can khƣơng 8 g- 12 g, Phục linh 12 g– 16 g, Cam thảo 4 g- 8 g, Ngũ vị tử 4 g– 8 g sắc uống chữa trị ho nhiều đờm loãng nhƣ bệnh hen phế quản, giãn phế quản. Trong bài này Tế tân là vị chủ dƣợc ôn phế tán hàn [23]. 4. Bài thuốc Tái tạo tán gồm: Hoàng kỳ 8 g, Nhân sâm 4 g, Quế chi 4 g, Thƣợc dƣợc 4 g, Cam thảo 2 g, Thục Phụ tử 4 g, Tế tân 4 g, Khƣơng hoạt 4 g, Phòng phong 4 g, Xuyên khung 4 g, Gừng nƣớng 4 g, Đại táo 2 g. Bài thuốc có tác dụng trợ dƣơng, ích khí, giải biểu, trị chứng dƣơng hƣ, khí kém, mắc bệnh ngoại cảm phong hàn, thƣờng có các triệu chứng đau đầu, sốt, sợ lạnh, chân tay mát, không có mồ hôi, mệt mỏi, buồn ngủ, sắc mặt tái nhợt, tiếng nói nhỏ, lƣỡi nhợt, rêu lƣỡi trắng, mạch trầm, vô lực hoặc phù, đại vô lực [23]. 5. Đại hoàng Phụ tử thang chủ trị chứng thực hàn tích tụ, táo bón bụng đau, chân tay mát sợ lạnh, rêu lƣỡi nhớt trắng, mạch trầm, huyền khẩn gồm 3 vị: Đại hoàng 8 g– 12 g, Thục phụ tử 8 g– 12 g, Tế tân 4 g– 8 g [23]. 6. Thông quan tán gồm có 2 vị, lƣợng b ng nhau gồm Tạo giác, Tế tân tất cả thuốc tán thật mịn hòa đều, lúc dùng thổi vào mũi gây nên hắt hơi (nhảy mũi). Tác dụng làm thông quan, khai khiếu. Tế tân thổi vào mũi có tác dụng khai thông khiếu vì phế chủ khí toàn thân, gây hắt hơi làm cho phế khí đƣợc tuyên thông thì chứng bế đƣợc cứu [23]. 7. Bài thuốc chữa đau răng: Tế tân 10 g, thạch cao 10 g ngâm với 100 ml rƣợu trong nữa ngày. Dùng rƣợu này để ngậm trong miệng cho đến khi mỏi thì nhổ đi [3], nên súc lại miệng b ng nƣớc sạch. 8. Bài thuốc chữa lở mồm, lở lƣỡi: Tế tân và Hoàng liên lấy 2 vị lƣợng b ng nhau tán nhỏ bôi vào miệng, lƣỡi, ngậm cho đến khi chảy dãi ra là khỏi [3], nên súc lại miệng b ng nƣớc sạch. 9. Bài thuốc chữa cảm lạnh: Tế tân, bán hạ, phục linh, cát cánh, quế chi mỗi vị 2g và cam thảo 1g, sắc với 200 ml nƣớc còn 100 ml chia 3 lần uống trong ngày [3].