Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx phân lập từ cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:70

Thêm vào BST

Báo xấu

24
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là phân lập được đoạn mã hóa cDNA của gen CrPrx từ cây dừa cạn hoa hồng tím; thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx phân lập từ cây dừa cạn hoa hồng tím, phục vụ chuyển gen nâng cao hàm lượng alkaloid ở cây dừa cạn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx phân lập từ cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ––––––––––––––––––– ĐÀO THỊ NHÂM THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC GEN CrPrx PHÂN LẬP TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G. Don) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN – 2016 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ––––––––––––––––––– ĐÀO THỊ NHÂM THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC GEN CrPrx PHÂN LẬP TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G. Don) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm THÁI NGUYÊN – 2016 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiê ̣n dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác. Thái Nguyên, tháng 4 năm 2016 Tác giả Đào Thị Nhâm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN i http://www.ltc.tnu.edu.vn
LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc Bô ̣ môn Di truyề n & Sinh ho ̣c hiê ̣n đa ̣i , Ban chủ nhiê ̣m K hoa Sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Lê Văn Sơn, Ths. Hồ Mạnh Tường và các cán bô ̣ Phòng DNA ứng du ̣ng , Phòng thí nghiệm Trọng điểm C ông nghê ̣ gen , Viê ̣n Công nghê ̣ S inh ho ̣c , Viê ̣n Hàn lâm Khoa ho ̣c và Công nghê ̣ Viê ̣t Nam đã ta ̣o điề u kiê ̣n và giúp đỡ tôi tiế n hành các thí nghiê ̣m của đề tài luận văn . Tôi xin cảm ơn sự động viên , khích lệ của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian ho ̣c tâ ̣p và thực hiê ̣n đề tài luận văn . Đề tài luâ ̣n văn th uô ̣c chương triǹ h đào ta ̣o nghiên cứu sinh và cao ho ̣c của Bộ môn Di t ruyề n & Sinh ho ̣c hiê ̣n đa ̣i , Khoa Sinh học, Trường Đa ̣i ho ̣c Sư phạm - Đa ̣i ho ̣c Thái Nguyên . Thái Nguyên, tháng 4 năm 2016 Tác giả Đào Thị Nhâm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – iiĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
MỤC LỤC Lời cam đoan ..................................................................................................... i Lời cảm ơn ....................................................................................................... ii Mục lục ........................................................................................................... iii Danh mục chữ viết tắt ...................................................................................... iv Danh mục bảng ................................................................................................. v Danh mục hình ................................................................................................ vi MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề ............................................................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................. 2 3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3 1.1. Giới thiệu về cây dừa cạn ...................................................................... 3 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại ........................................................................ 3 1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây dừa cạn ....................................................... 4 1.1.3. Tác dụng của cây dừa cạn ..................................................................... 5 1.2. Hợp chất alkaloid và tác dụng ............................................................... 6 1.2.1. Alkaloid ................................................................................................ 6 1.2.2. Alkaloid trong cây dừa cạn ................................................................. 10 1.2.3. Peroxidase và gen mã hóa peroxidase ................................................. 14 1.3. Các nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở cây dừa cạn ...................................................................... 17 1.3.1. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở cây dừa cạn bằng phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật ............... 17 1.3.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở cây dừa cạn bằng phương pháp chuyển gen .......................................... 19 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 22 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị................................................................ 22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –iii ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
2.1.1. Vật liệu ............................................................................................... 22 2.1.2. Hóa chất và thiết bị ............................................................................. 22 2.2. Phương pháp nghiên cứu..................................................................... 24 2.2.1. Thiết kế cặp mồi nhân gen .................................................................. 27 2.2.2. Kỹ thuật tách chiết RNA tổng số......................................................... 28 2.2.3. Phương pháp tổng hợp cDNA từ mRNA............................................. 28 2.2.4. Nhân gen CrPrx bằng kĩ thuật RT-PCR .............................................. 29 2.2.5. Phương pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR .......................................... 30 2.2.6. Kỹ thuật tách dòng gen ....................................................................... 31 2.2.7. Phương pháp xác định và phân tích trình tự nucleotide đoạn gen CrPrx ..... 34 2.2.8. Thiết kế vector chuyển gen mang CrPrx ............................................. 34 2.2.9. Xử lý số liệu bằng phần mềm chuyên dụng ......................................... 37 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 38 3.1. Kết quả phân lập và tách dòng gen CrPrx ........................................... 38 3.1.1. Kết quả khuếch đại đoạn gen CrPrx từ mRNA ................................... 38 3.1.2. Kết quả ghép nối gen CrPrx vào vector tách dòng .............................. 39 3.2. Xác định trình tự gen CrPrx ................................................................ 43 3.3. Thiết kế vector chuyển gen mang gen CrPrx ...................................... 47 3.3.1. Tạo cấu trúc chứa gen đích CrPrx (35S-CrPrx-Cmyc) ....................... 48 3.3.2. Gắn cấu trúc chứa gen CrPrx vào vector pBI121 ................................ 51 3.4. Tạo vi khuẩn A.tumefaciens mang vector chuyển gen CrPrx .............. 54 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 56 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – iv ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ABA Abscisic acid Axit Absisic A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens Bp base pairs Cặp bazơ nitơ CaMV 35S Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter Cs Cộng sự CrPrx Catharanthus roseus peroxidase Gen mã hóa peroidase ở cây dừa cạn C. roseus Catharanthus roseus (L.) G. Don. Cây dừa cạn DAT Deacetylvindoline 4-O-acetyl Gen DAT tranferase DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Xét nghiệm ELISA Assa IPTG Isopropyl β-D-1- Thiogalactopyranoside LB Luria Bertami Môi trường dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy vi khuẩn MCS Multi Cloning Site Vùng cắt gắn đa vị NptII Neomycin phosphotransferase gene PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase Kb Kilo base SDS Sodium dodecyl sulphate RT-PCR Reverse transcription - Polymerase Phản ứng chuỗi polymerase Chain Reaction -phiên mã ngược X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta- Dgalacto-pyranoside V/p Vòng/ phút Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – iv ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần phản ứng RT-PCR nhân gen CrPrx....................................... 29 Bảng 2.2: Chu trình nhiệt và thời gian phản ứng RT- PCR nhân gen CrPrx ............. 30 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng gắn gen CrPrx vào vector tách dòng pBT .............. 31 Bảng 2.4: Thành phần môi trường nuôi cấy khuẩn ................................................... 32 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng colony - PCR ......................................................... 32 Bảng 2.6: Thành phần hoá chất tách plasmid............................................................ 33 Bảng 2.7: Thành phần cắt vector tái tổ hợp pBT-CrPrx và pRTRA7/3 ..................... 35 Bảng 2.8: Thành phần ghép nối vector pRTRA7/3 và gen CrPrx ............................. 35 Bảng 2.9: Thành phần phản ứng cắt plasmid pRTRA7/3-CrPrx và pBI121 .............. 36 Bảng 3.1: Vị trí nucleotide sai khác giữa hai trình tự gen CrPrx và LN809932 ........ 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – vĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hoa của ba giống Catharanthus roseus (L.) G. Don. ............................................. 4 Hình 1.2: Sơ đồ tổng hợp vinblastine và vincristine .............................................................. 12 Hình 1.3: Công thức hóa học của vinblastine ........................................................................ 13 Hình 1.4: Công thức hóa học của vincristine ......................................................................... 13 Hình 2.1: Vector tách dòng pBT ............................................................................................. 23 Hình 2.2: Vector pRTRA7/3 ................................................................................................... 23 Hình 2.3: Vector pBI121........................................................................................................ 23 Hình 2.4: Sơ đồ thí nghiệm phân lập và thiết kế vector chuyển gen pBI121-CrPrx........... 26 Hình 3.1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại đoạn cDNA CrPrx............ 38 Hình 3.2: Đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biến E. coli DH5 chứa vector tái tổ hợp mang đoạn gen CrPrx ............................................................................................. 40 Hình 3.3: Kế t quả điê ̣n di sản hẩ p m colony- PCR từ khuẩ n lạc.......................................... 41 Hình 3.4: Kết quả điện đi sản phẩm DNA tinh sạch sau khi cắt plasmid bằng NcoI/NotI ................................................................................................................ 43 Hình 3.5: So sánh trình tự nucleotid của gen CrPrx với trình tự gen mang mã số LN809932 ............................................................................................... 45 Hình 3.6: Sơ đồ thiết kế vector pBI121-CrPrx ...................................................................... 47 Hình 3.7: Đoạn DNA đích đã tinh sạch từ pRTRA7/3 cắt mở vòng bằng NcoI/NotI........... 49 Hình 3.8: Kết quả PCR các dòng khuẩn lạc từ plasmid tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx ................................................................................................ 50 Hình 3.9: Kết quả cắt plasmid pRTRA7/3-CrPrx bằng HindIII thu nhận cấu trúc chứa gen CrPrx................................................................................................................. 52 Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid vector pBI121 .......................................... 53 Hình 3.11: Kết quả điện di colony-PCR của vector tái tổ hợp pBI121-CrPrx ...................... 54 Hình 3.12: Kết quả điện di sản phẩm A.tumefaciens mang vector chuyển gen .................... 55 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – viĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Nước ta là một nước nhiệt đới với những điều kiện khí hậu thuận lợi, vì vậy nguồn tài nguyên thiên nhiên rất phong phú và đa dạng. Cùng với nền y học cổ truyền dân tộc có truyền thống lâu đời, nhân dân ta đã biết sử dụng các loài cây cỏ xung quanh làm nguồn dược liệu để chữa bệnh rất có hiệu quả. Ngày nay, bên cạnh thuốc tân dược thì các loại dược liệu có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày càng được ưa chuộng. Sự thay đổi khí hậu toàn cầu dẫn tới sự khắc nghiệt của thời tiết, môi trường sống bị ô nhiễm, thói quen sinh hoạt của con người thay đổi, thực phẩm không an toàn… Những yếu tố này tác động đến sức khỏe của con người, làm gia tăng nguy cơ mắc bệnh, trong đó có nguy cơ các tế bào bị biến đổi. Đây là một trong các nguyên nhân làm cho số ca mắc bệnh ung thư ngày càng tăng. Vì thế, một trong những nhiệm vụ hàng đầu của các nhà khoa học là nghiên cứu, cải tiến các biện pháp chữa trị ung thư để nâng cao chất lượng đời sống cho người bệnh. Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) là một trong những cây có khả năng sản xuất các indol alkaloid có dược tính quan trọng trong chế tạo các loại thuốc chống ung thư, đặc biệt là ung thư máu. Trong các indol alkaloid có mặt trong cây dừa cạn, hai loại alkaloid là vinblastine, vincristine được sử dụng nhiều nhất. Nhưng các chất này lại có hàm lượng rất nhỏ trong cây dừa cạn, khoảng nửa tấn lá khô mới chiết được 1g vinblastine cho sản xuất dược phẩm (Noble, 1990) [21]. Các chất này không thể tổng hợp bằng con đường hóa học do có cấu trúc rất phức tạp. Do vậy, nâng cao hàm lượng vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn theo hướng công nghệ gen là một hướng nghiên cứu được quan tâm bởi nhiều nhà khoa học trên thế giới. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – 1ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
Trong cây dừa cạn, vinblastine và vincristine được tạo ra từ sự kết hợp của catharanthine và vindoline. Gen CrPrx mã hoá peroxidase có chức năng xúc tác cho phản ứng tạo tiền chất cho sự tổng hợp vinblastine và vincristine. Các nghiên cứu cho thấy, trong các giống dừa cạn hiện có thì giống dừa cạn hoa hồng nhụy tím có hàm lượng alkaloid toàn phần và các chất là vinblastine và vincristine cao nhất. Nâng cao năng suất tổng hợp vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn phục vụ cho việc tạo thuốc chữa bệnh ung thư là rất cần thiết. Để tăng năng suất tổng hợp hai loại alkaloid trên, việc nghiên cứu đặc điểm gen tham gia vào các con đường tổng hợp alkaloid và thiết kế vector phục vụ chuyển gen là rất quan trọng. Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx phân lập từ cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập được đoạn mã hóa cDNA của gen CrPrx từ cây dừa cạn hoa hồng tím. Thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx phân lập từ cây dừa cạn hoa hồng tím, phục vụ chuyển gen nâng cao hàm lượng alkaloid ở cây dừa cạn. 3. Nội dung nghiên cứu Phân lập, tách dòng gen CrPrx. Xác định trình tự gen CrPrx được nhân lên từ cặp mồi chứa điểm cắt của enzyme giới hạn NotI/NcoI. Thiết kế vector chuyển gen mang gen CrPrx từ cây dừa cạn hoa hồng tím. Tạo dòng vi khuẩn A.tumefaciens mang vector chuyển gen gắn CrPrx. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – 2ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây dừa cạn 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại Cây dừa cạn hay còn gọi là hải đằng, dương giác, bông dừa, trường xuân, hoa thuộc họ Apocynaceae, chi Catharanthus, loài Catharanthus roseus. [4], [37]. Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) có nguồn gốc ở Madagasca (châu Phi), mọc hoang và được trồng ở nhiều nước nhiệt đới và ôn đới như Việt Nam, Ấn Độ, Indonesia…. Cây dừa cạn được người Pháp đưa vào trồng ở Việt Nam để làm cây cảnh. Tại châu Âu và châu Mỹ ở những vùng nóng cây dừa cạn được trồng quanh năm, nhưng ở những vùng lạnh cây được trồng theo mùa vì không chịu được lạnh. Cây dừa cạn dễ trồng, phát triển nhanh chịu nắng, hạn tốt, không kén đất và ít phải chăm sóc, cách chăm sóc không quá đặc biệt nên ít lâu sau nó đã lan ra ở nhiều địa phương, nhất là ở các tỉnh đồng bằng và ven biển nước ta. Cây dừa cạn ra hoa quanh năm, chủ yếu là từ tháng 5 - 9 [5]. Ở Việt Nam, dừa cạn có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tương đối tập trung ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam, Ðà Nẵng, Bình Ðịnh và Phú Yên. Ở những vùng phân bố tự nhiên ven biển, dừa cạn có khi mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ, cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển. Trước đây cây dừa cạn còn chỉ được trồng để làm cảnh, nhưng gần đây cây đã được trồng để thu hoạch lấy cây, lá, rễ dùng làm thuốc [5]. Cây dừa cạn là nguồn giàu alkaloid thuộc alkaloid terpenoid indole được phân lập từ 3 giống cây khác nhau: (1) Catharanthus roseus “Roseus” có hoa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – 3ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
màu hồng tím; (2) Catharanthus roseus “Ocellatus” có hoa màu trắng nhụy đỏ; (3) Catharanthus roseus “Albus” có hoa màu trắng. Trong đó, hoa màu hồng tím có hàm lượng vincristine và vinblastine cao nhất [37]. Hình 1.1: Hoa của ba giống Catharanthus roseus (L.) G. Don [37]. 1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây dừa cạn Cây dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40cm – 60cm, phân nhiều cành, cây có bộ rễ phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên. Thân hình trụ có 4 khía dọc, lông ngắn, thân non màu xanh lục nhạt sau chuyển sang màu hồng tím có bộ rễ rất phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên. Cây dừa cạn mọc thành bụi dày có cành đứng. Lá mọc đối, thuôn dài, đầu lá hơi nhọn, phía cuống hẹp nhọn, kích thước của lá thường biến động tùy từng vùng phân bố dài 3cm - 6cm, rộng 2cm - 3cm. Cuống lá ngắn 3 - 5mm. Gân lá hình lông chim lồi mặt dưới, gồm 12 - 14 cặp gân phụ hơi lồi mặt dưới. Mỗi cành thường có 8 - 15 cặp lá, lá có phiến bầu dục màu xanh thẫm, mặt trên nhẵn mặt dưới có nhiều lông. Mùa hoa và quả vào tháng 4 - 5 và tháng 9 - 10 hàng năm [5]. Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5; cuống hoa dài 4 - 5mm. Lá đài 5, hơi dính nhau ở dưới, trên chia thành 5 thùy hình tam giác hẹp, có lông ở mặt ngoài, dài 3 - 4mm. Cánh hoa 5, dính. Ống tràng màu xanh, cao 2 - 4cm, hơi phình ở gần họng, mặt ngoài có 5 chấm lồi; 5 thùy có màu đỏ hay hồng tím, trắng, …. Mặt trên và mặt dưới của hoa màu trắng, dài 1,5 - 1,7cm, miệng ống tràng có nhiều lông và có màu khác phiến (màu vàng hay đỏ nếu hoa trắng, màu đỏ sẫm hay vàng nếu hoa màu hồng tím). Nhị 5, rời, đính ở phần phình của ống tràng, xen Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – 4ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
kẽ cánh hoa, chỉ nhị ngắn. Hoa có mùi thơm, mọc riêng lẻ ở các kẽ lá phía trên. Quả gồm hai đại dài 2cm - 4cm, rộng 2mm – 3mm, mọc thẳng đứng hơi ngả hai bên, trên vỏ có vạch dọc, đầu quả hơi tù. Trong quả chứa 12 - 20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, trên mặt hạt có các hột nổi thành đường chạy dọc [4], [2]. Rễ thường chỉ có một rễ cái và chùm rễ phụ. Rễ cái đâm thẳng xuống đất có thể đạt chiều dài 30cm – 40cm, rễ phụ mọc thành chùm thưa ngắn, phát triển theo chiều ngang [4], [5]. 1.1.3. Tác dụng của cây dừa cạn Trong tất cả các bộ phận của cây dừa cạn đều chứa alkaloid. Người ta đã chiết, phân lập ra trên 150 alkaloid khác nhau, chủ yếu là vinblastine, vincristine, tetrahydroalstonine, pirinine, vindoline, catharanthine, vindolinine, ajmalicine… chúng được sử dụng làm nguyên liệu điều trị bệnh ung thư [5]. Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam và Trung Quốc, có nơi dùng thân và lá phơi khô sắc uống để thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít, làm thuốc điều kinh, tẩy giun, chữa sốt, săn da, chữa bệnh ngoài da. Một số bài thuốc dân gian chữa bệnh ung thư của cây dừa cạn [4]: Tăng huyết áp: Lấy 20g thân lá dừa cạn khô sao vàng và 20g lá dâu, sắc lấy nước, chia uống từ 2 – 3 lần mỗi ngày. Cách khác, lấy 6g hoa dừa cạn, 10g nụ hoa hoè (hoặc 10g cúc hoa), hãm với nước sôi trong bình kín khoảng 20 phút. Uống thay nước trà mỗi ngày. Ung thư máu, viêm đại tràng: Lấy từ 15 – 20g thân lá dừa cạn khô sao vàng và sắc uống từ 2 – 3 lần trong ngày. Mất ngủ: Lấy 20g thân lá dừa cạn khô sao vàng, 12g lá vông nem, 12g hạt muồng sao đen, sắc uống trước khi đi ngủ. Rong kinh: Lấy từ 20 – 30g dừa cạn sao vàng (toàn cây có cả hoa và rễ), sắc lấy nước, uống liên tục từ 3 – 5 ngày. Chữa bỏng nước sôi: Lá dừa cạn tươi lượng vừa đủ, giã nát, nhuyễn với chút gạo, đắp lên vết thương bỏng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – 5ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
Trị bệnh bạch cầu lympho cấp: Dùng 15g dừa cạn sắc nước uống. Y học đã chiết được vinblastine từ lá dừa cạn và dưới dạng thuốc tiêm vinblastine sulfate để chữa bệnh này. Cây dừa cạn chữa bạch cầu cấp (bệnh máu trắng) bằng cách sắc dùng thân và lá cây dừa cạn (khoảng 15 gam thân, lá khô/ngày) sắc uống. Điều trị zona: Dừa cạn (sao vàng hạ thổ) 16g, thổ linh 16g, bạch linh 10g, kinh giới 12g, chi tử 10g, nam tục đoạn 16g, cam thảo đất 16g, hạ khô thảo 16g. Sắc uống ngày 1 thang, sắc 3 lần, uống 3 lần. Thuốc đắp: lá dừa cạn kết hợp với lá cây hòe. Hai thứ lượng bằng nhau, giã nhỏ đắp lên các tổn thương, băng lại. Tác dụng làm giảm đau nhức. Điều trị lị trực trùng: Đi ngoài nhiều lần, bụng đau từng cơn, phân có chất nhầy, có máu mũi, sút cân nhanh. Bài thuốc: dừa cạn (sao vàng hạ thổ) 20g, cỏ sữa 20g, cỏ mực 20g, chi tử 10g, lá khổ sâm 20g, hoàng liên 10g, rau má 20g, đinh lăng 20g. Đổ 3 bát nước sắc lấy 1,5 bát, chia 3 lần uống trong ngày. Cây dừa cạn điều trị u xơ tuyến tiền liệt: Dừa cạn 12g, huyền sâm 12g, xuyên sơn 10g, chè khô 12g, hoàng cung trinh nữ 5g, cát căn 16g, bối mẫu 10g, đinh lăng 16g. Sắc uống ngày 1 tháng, chia ba lần. 1.2. Hợp chất alkaloid và tác dụng 1.2.1. Alkaloid Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ gia thực phẩm có giá trị. Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, thường được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức năng trao đổi chất chưa được biết đầy đủ. Chúng là sản phẩm các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ chống lại vi sinh vật và động vật. Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ XX. Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside [2], [27]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – 6ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
Alkaloid có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh lý trên tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Họ alkaloid bao gồm codein, nicotine, caffeine và morphine [2], [27]. Một số loại thực vật chứa nhiều alkaloid như là cây thuốc phiện, cây cà độc dược, cây thuốc lá và khoai tây. Đôi khi toàn cây chứa alkaloid, cũng có khi chỉ tập trung trong lá. Trong cùng một cây có thể tùy theo bộ phận của cây mà tạo ra các alkaloid khác nhau. Tùy theo từng loại alkaloid mà tác dụng lên các bộ phận khác nhau như lên hệ thần kinh, hệ cơ, mạch máu và hệ hô hấp [2]. Hàm lượng alkaloid trong cây phụ thuộc vào nhiều yếu tố như khí hậu, ánh sáng, chất đất, phân bón, giống cây, bộ phận thu hái và thời kỳ thu hái. Vì vậy, đối với mỗi loại dược liệu cần nghiên cứu cách trồng trọt, thu hái và bảo quản để có hàm lượng hoạt chất cao [2]. 1.2.1.1. Đặc điểm chung của alkaloid Alkaloid là những chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ và có tính base, thường gặp trong nhiều loại thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài động vật. Ngoài ra, alkaloid còn được sử dụng rộng rãi để bào chế thuốc (cafeine, cocaine, ephedrin...) [11]. Đặc biệt, alkaloid có hoạt tính sinh lý rất cao đối với cơ thể con người và động vật nhất là đối với hệ thần kinh. Tùy vào hàm lượng alkaloid nó có thể là chất độc gây chết người nhưng có khi nó là thần dược trị bệnh đặc hiệu [12]. Alkaloid có phản ứng kiềm cho các muối với acid và các muối này dễ kết tinh. Hàm lượng alkaloid có thể đạt tới 10% trong các loại rau quả thông dụng như khoai tây, chè, cà phê. Alkaloid là hợp chất thiên nhiên rất quan trọng về nhiều mặt. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao [12]. 1.2.1.2. Phân loại alkaloid Các alkaloid thông thường được phân loại theo đặc trưng phân tử chung của chúng, dựa theo kiểu trao đổi chất được sử dụng để tạo ra phân tử. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – 7ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
Khi người ta chưa biết nhiều về tổng hợp sinh học của alkaloid, thì chúng được gộp nhóm theo tên gọi của các hợp chất đã biết. Ví dụ: do các cấu trúc phân tử xuất hiện trong sản phẩm cuối cùng nên các alkaloid thuốc phiện đôi khi còn được gọi là các “phenanthrene”. Hay gọi tên dựa theo nhóm động/thực vật từ đó chiết xuất ra các alkaloid, ví dụ như các alkaloid chiết từ cây dừa cạn vinca thì được gọi chung là các vinca alkaloid [12]. Các nhóm alkaloid hiện nay, gồm có nhóm pyridine (piperine, coniine, trigonelline, arecaidine, guvacine, pilocarpine, cytisine, nicotine, spartein, pelletierine); nhóm pyrrolidine (hygrine, cuscohygrine, nicotine) nhóm tropan (atropine, cocaine, ecgonine, scopolamine); nhóm quinoline (quinine, quinidine, dihydroquinine, dihydroquinidine, strychnine, brucine, veratrine, cefradine); nhóm isoquinoline (morphine, codeine, thebaine, papaverine, narcotine, sanguinarine, narceine, hydrastine, berberine); nhóm phenethylamine (mescaline, ephedrine, dopamine, amphetamine); nhóm indole gồm các tryptamine (DMT, N-metyltryptamine, psilocybin, serotonine), ergoline (alcaloid từ ngũ cốc/cỏ như ergine, ergotamine, axid lysergic v.v), beta- cacbolin (harmin, harmaline, yohimbine, reserpine, emetine) và các alkaloid từ chi Ba gạc (Rauwolfia) (reserpine); nhóm purine bao gồm xanthine (caffeine, theobromine, theophylline); nhóm terpenoid gồm các alkaloid aconitin, steroid (solanine), samandarin (muscarine, choline, neurin) [12]. 1.2.1.3. Tính chất của alkaloid Phần lớn alkaloid trong tự nhiên, công thức cấu tạo có oxy thường ở thể rắn ở nhiệt độ thường. Ví dụ: Morphine (C17H19NO3), codeine (C18H21NO3), strychnine (C21H22N2O2), quinine (C20H24N2O2), reserpine (C33H40O9N2)…. Những alkaloid trong thành phần cấu tạo không có oxy thường ở thể lỏng. Ví dụ như: Coniine (C8H17N), nicotine (C10H14N2), sparteine (C15H26N2) [27]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – 8ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
Tuy nhiên, cũng có vài chất trong thành phần cấu tạo có oxy vẫn ở thể lỏng như arecoline (C8H13NO2), pilocarpidine (C10H14N2O2) và có vài chất không có oxy vẫn ở thể rắn như sempecviren (C19H16N2), conexine (C24H40N2). Các alkaloid ở thể rắn thường kết tinh và có điểm chảy rõ ràng, nhưng cũng có một số alkaloid không có điểm chảy vì bị phân hủy bởi nhiệt độ trước khi chảy [27]. Đa số alkaloid không mùi, có vị đắng và một số ít có vị cay như capsaicin, piperine… Hầu hết các alkaloid đều không màu, trừ một số alkaloid có màu vàng như berberine, palmatine, chelidonine. Các alkaloid base không tan trong nước, dễ tan trong các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, ether, chloroform, benzen… Muối của alkaloid dễ tan trong nước, hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ. Dựa vào độ tan khác nhau của alkaloid base và muối alkaloid người ta sử dụng dung môi thích hợp để chiết xuất và tinh chế alkaloid. Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alkaloid ra khỏi muối của nó bằng dung dịch kiềm trung bình và mạnh như NH4OH, NaOH… [27]. Qua nghiên cứu định tính và định lượng alkaloid trong các bộ phận khác nhau của cây và theo dõi sự vận chuyển của chúng, người ta nhận thấy nơi tạo ra alkaloid không phải là nơi tích tụ nhiều alkaloid. Nhiều alkaloid được tạo ra ở rễ sau đó vận chuyển lên phần trên của cây. Sau khi thực hiện những biến đổi thứ cấp chúng được tích lũy ở lá, quả và hạt. Ví dụ: L-hyoscryamine trong cây cà độc dược (Atropa belladonna) được tạo ra ở rễ, sau đó chuyển lên phần trên của cây. Khi cây 1 tuổi thân cây chứa nhiều alkaloid hơn lá, khi cây 2 tuổi thân cây hóa gỗ nhiều hơn, hàm lượng alkaloid giảm xuống, hàm lượng alkaloid ở phần ngọn đạt được mức tối đa vào lúc cây ra hoa và giảm đi khi quả chín [6]. Ngoài ra, hàm lượng của alkaloid trong cây cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như khí hậu, ánh sáng, chất lượng đất, giống cây và bộ phận thu hái [32]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – 9ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
1.2.2. Alkaloid trong cây dừa cạn 1.2.2.1. Một số alkaloid chính trong cây dừa cạn Lá và hoa cây dừa cạn có hàm lượng vindoline, catharanthine và anhydro vinblastine cao, trong khi ở rễ lại tích lũy hàm lượng ajmalicine, vindolinine và serpentine cao hơn ở các vị trí khác trong cây [25]. Cây ở giai đoạn sinh trưởng khác nhau thì mức độ sản sinh alkaloid khác nhau. Hàm lượng alkaloids indole mono giảm, trong khi alkaloid bisindole tăng với lá già và khi cây ngừng phát triển [24]. Alkaloid toàn phần có ở lá dừa cạn với hàm lượng 0,37% - 1,15%, thân 0,40%, rễ chính 0,7% - 2,4%, rễ phụ 0,9% - 3,7%, hoa 0,14% - 0,84%, vỏ quả 1,14%, hạt 0,18%. Trong khoảng 150 loại alkaloid đã được chiết từ cây dừa cạn, người ta đặc biệt chú ý 20 nhóm alkaloid dimeric là những nhóm có hoạt tính chống ung thư bao gồm vincristine và vinblastine [22]. Vinblastine có ở lá với hàm lượng 0,013% - 0,063%, ở bộ phận trên mặt đất 0,0015%, ở rễ 0,23%. Nếu cây bị bệnh asteryllow-virus thì sẽ không có vinblastine. Vincristine có hàm lượng thấp hơn 0,0003% - 0,0015% [23]. Lá dừa cạn thu thập ở nhiều địa phương khác nhau chứa 0,7% - 1,2% alkaloid toàn phần. Vinblastine có với hàm lượng 1,6 – 2 phần vạn ở lá. Thời gian thu hái nguyên liệu tốt nhất để trên cây có hàm lượng hoạt chất cao là vào cuối tháng 8 đến giữa tháng 9 dương lịch [20]. 1.2.2.2. Tác dụng của alkaloid trong cây dừa cạn Các nhà khoa học đã nghiên cứu chiết xuất từ cây dừa cạn hai alkaloid vinblastin và vincristin, là những chất ức chế mạnh sự phân bào. Các alkaloid này liên kết đặc hiệu với Tubulin, là protein ống vi thể ở thoi phân bào ngăn cản sự tạo thành các vi ống và gây ngừng phân chia tế bào ở pha giữa. Cho nên, chúng hạn chế hình thành bạch cầu thừa ở bệnh nhân ung thư máu. Vì vậy, vinblastin và vincristin được sử dụng làm nguyên liệu bào chế thuốc điều trị ung thư [5]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –10 ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn
Nhờ thực nghiệm trên chuột, các nhà khoa học Canada đã phát hiện tác dụng làm giảm bạch cầu của một số chất tách được từ dừa cạn và phát hiện ra chất vincaleucoblastine và 3 ankaloid khác cũng có tác dụng chống khối u là leurosine, leurocristine và leurosidine. Ngoài ra, các nhà khoa học còn phát hiện ra tác dụng tẩy giun khá mạnh, tác dụng lợi tiểu của catharanthine, vindolinine và vincolidin [33]. Các alkaloid được chiết xuất từ dừa cạn được dùng dưới dạng muối sulfate. Vinblastine sulfate được coi là lựa chọn hàng đầu để điều trị ung thư biểu mô tinh hoàn, ngoài ra nó rất hiệu quả trong liệu pháp trị bệnh Hodgkin, ung thư nhau, ung thư biểu mô da đầu và ung thư biểu mô thận. Hơn nữa, vinblastine sulfate còn được dùng để điều trị u nguyên bào thần kinh, ung thư vú, ung thư cổ tử cung và ung thư dạng nấm da [30]. Vincristine sulfate là một trong những thuốc chống ung thư được dùng rộng rãi hàng đầu, đặc biệt đối với các bệnh ung thư máu, thường được dùng để làm thuyên giảm bệnh bạch cầu lympho cấp. Đây là lựa chọn hàng đầu để điều trị bệnh Hodgkin, u bạch huyết không - Hodgkin, ung thư biểu mô phổi, u Wilm, bạch cầu tủy bào mạn (đợt cấp tính), sarcom Ewing và sarcom cơ vân. Ngoài ra, ở dạng dùng phối hợp, vincristine sulfate còn được dùng cho ung thư biểu mô vú, ung thư cổ tử cung, u nguyên bào thần kinh và bệnh bạch cầu lympho mạn tính [30]. Hiện nay, y khoa vẫn chưa tìm ra phương pháp nào điều trị bệnh bạch cầu tốt hơn vinblastine và vincristine nên cây dừa cạn càng trở nên có giá trị. Tuy nhiên, để chữa được bệnh ung thư cần sử dụng vincristine, vinblastine với hàm lượng rất cao. Nhưng dùng các thành phần này, cần có sự hướng dẫn của bác sỹ điều trị, nếu không dễ bị ngộ độc [9]. Vinblastine được chuyển hóa chủ yếu ở gan để thành desacetyl vinblastine. Thuốc này được thải trừ qua mật vào phân và nước tiểu, một số đào thải dưới dạng thuốc không biến đổi [9]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –11 ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn