LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: " ẢNH HƯỞNG CỦA ANTISTRESS LÊN KHẢ NĂNG ĐỀ KHÁNG Edwardsiella ictaluri CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)"

Chia sẻ: Cung Ru | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:52

Thêm vào BST

Báo xấu

80
lượt xem 13
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Thí nghiệm được tiến hành nhằm tìm hiểu ảnh hưởng của Antistress lên khả năng kháng Edwardsiella ictaluri của cá tra thông qua việc phân tích huyết học sau cho ăn Antistress và theo dõi tỉ lệ chết sau cảm nhiễm. Cá tra giống khỏe cho ăn thức ăn đối chứng có hàm lượng 0% Antistress trong 1 tuần. Sau đó, cá được bố trí thành 4 nghiệm thức cho ăn thức ăn có hàm lượng 0%; 0,2%; 0,4%; 0,6% Antistress trong 8 tuần....

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: " ẢNH HƯỞNG CỦA ANTISTRESS LÊN KHẢ NĂNG ĐỀ KHÁNG Edwardsiella ictaluri CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)"

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN HOA CÚC ẢNH HƯỞNG CỦA ANTISTRESS LÊN KHẢ NĂNG ĐỀ KHÁNG Edwardsiella ictaluri CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN HOA CÚC ẢNH HƯỞNG CỦA ANTISTRESS LÊN KHẢ NĂNG ĐỀ KHÁNG Edwardsiella ictaluri CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH KS. ĐẶNG THỤY MAI THY KS. NGUYỄN THỊ THÚY LIỄU 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
TÓM TẮT Thí nghiệm được tiến hành nhằm tìm hiểu ảnh hưởng của Antistress lên khả năng kháng Edwardsiella ictaluri của cá tra thông qua việc phân tích huyết học sau cho ăn Antistress và theo dõi tỉ lệ chết sau cảm nhiễm. Cá tra giống khỏe cho ăn thức ăn đối chứng có hàm lượng 0% Antistress trong 1 tuần. Sau đó, cá được bố trí thành 4 nghiệm thức cho ăn thức ăn có hàm lượng 0%; 0,2%; 0,4%; 0,6% Antistress trong 8 tuần. Cá còn lai sau thu mẫu huyết học được tiêm 0,1ml vi khuần Edwardsiella ictaluri CAF255, nồng độ 1,2x106tb/ml. Kết quả thu được, số lượng hồng cầu tăng có ý nghĩa thống kê ở nghiệm thức bổ sung 0,4%và 0,6% Antistress so với nghiệm thức đối chứng và trước cho ăn. Tổng bạch cầu, tiểu cầu cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,2% Antistress. Trong khi đó, nghiệm thức bổ sung 0,4% Antistress lại có số lượng bạch cầu trung tính cao nhất; tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân lại cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,6% Antistress. Tuy nhiên, tất cả sự chênh lệch về bạch cầu không có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức. Bạch cầu đơn nhân, đại thực bào tăng trong cùng nghiệm thức trước và sau khi gây cảm nhiễm. Trong khi đó, hồng cầu, tổng bạch cầu, tế bào lympho, tiểu cầu lại giảm. Giữa các nghiệm thức sau khi gây cảm nhiễm, số lượng hồng cầu, tổng bạch cầu, tế bào lympho cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,6% Antistress. Bạch cầu đơn nhân; đại thực bào cao nhất nghiệm thức bổ sung 0,4% Antistress. Bạch cầu trung tính cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,2% Antistress. Sau cảm nhiễm, thu được tỉ lệ cá chết thấp nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,2% Antistress là 83%. Tỉ lệ cá chết cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 0,6% Antistress là 100%. i PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
LỜI CẢM TẠ Chân thành gửi lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh cùng quý thầy cô Bộ môn sinh học và bệnh Thủy Sản đã hết lòng hướng dẫn cũng như luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian học tập, thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Xin gửi lời biết ơn chân thành đến cô Đặng Thụy Mai Thy và chị Nguyễn Thị Thúy Liễu đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp Và cũng xin chân thành biết ơn sâu sắc gia đình và những người thân đã tạo mọi điều kiện, sự động viên, tình yêu thương về vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời gian học và hoàn thành luận văn. Gửi lời cảm tạ đến tập thể lớp BHTS - K31 đã hết lòng ủng hộ, quan tâm, giúp đõ trong suốt thời gian qua. Chân thành cảm tạ! ii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
MỤC LỤC Trang Tóm tắt .................................................................................................................... i Lời cảm tạ .............................................................................................................. ii Mục lục ................................................................................................................. iii Danh sách hính ...................................................................................................... v Danh sách bảng ..................................................................................................... vi Danh mục từ viết tắc ............................................................................................ vii Chương 1: Giới thiệu ............................................................................................. 1 Chương 2: Lược khảo tài liệu ................................................................................ 3 2.1 Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra ....... 3 2.2 Bệnh lí và sự thay đổi các chỉ tiêu huyết học .................................................. 3 2.3 Một số thí nghiệm gây cảm nhiễm gần đây..................................................... 6 2.4 Sản phẩm Antitress và vai trò của vitamin, chất khoáng đối với sức khỏe của cá. ........................................................................................................................... 7 Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu................................................... 9 3.1 Thời gian thực hiện đề tài ................................................................................ 9 3.2 Địa điểm nghiên cứu ....................................................................................... 9 3.3 Vật liệu nghiên cứu.......................................................................................... 9 3.4 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 9 3.5 Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................. 13 Chương 4: Kết quả và thảo luận .......................................................................... 14 4.1 Thí ngiệm 1 .................................................................................................... 14 4.1.1 Về hồng cầu ................................................................................................ 14 4.1.2 Bạch cầu ..................................................................................................... 15 4.2 Thí nghiệm 2 .................................................................................................. 16 4.2.1 Hồng cầu ..................................................................................................... 16 4.2.2 Các loại bạch cầu ........................................................................................ 17 4.2.3 Kết quả tỉ lệ chết sau cảm nhiễm ................................................................ 22 iii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
4.2.4 Kết quả phân lập vi khuẩn .......................................................................... 23 Chương 5: Kết luận và đề xuất ............................................................................ 26 5.1 Kết luận.......................................................................................................... 26 5.2 Đề xuất ........................................................................................................... 26 Tài liệu tham khảo ............................................................................................... 27 Phụ lục ................................................................................................................. 29 iv PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Tế bào hồng cầu...................................................................................... 3 Hình 2.2 Tế bào lympho ........................................................................................ 4 Hình 2.3 Tiểu cầu .................................................................................................. 4 Hình 2.4 Bạch cầu đơn nhân ................................................................................. 5 Hình 2.5 Bạch cầu trung tính ................................................................................ 5 Hình 3.1 Thao tác lấy mẫu máu và trải mẫu........................................................ 12 Hình 3.2 Buồng đếm hồng cầu ............................................................................ 12 Hình 4.1 Biểu đồ so sánh số lượng hồng cầu giữa các nghiệm thức sau cho ăn Antistress ............................................................................................................. 14 Hình 4.2 Biểu đồ thể hiện sự biến động số lượng hồng cầu giữa các nghiệm thức trước và sau cảm nhiễm ....................................................................................... 16 Hình 4.3 Các loại tế bào máu .............................................................................. 21 Hình 4.4 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ chết giữa các nghiệm thức sau cảm nhiễm E.ictaluri ............................................................................................................................. 22 Hình 4.5 Kết quả phân lập vi khuẩn ................................................................ 24 Hinh 4.6 Kết quả nhuộm Gram ...................................................................... 24 Hình 4.7 Kết quả test sinh hóa (OF, H2S, nitrate, indole) ................................... 24 v PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 4.1 Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu TTN và các NT sau cho ăn... .15 Bảng 4.2A Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu của nghiệm thức I trước và sau cảm nhiễm ........................................................................................................... 17 Bảng 4.2B Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu của nghiệm thức II trước và sau cảm nhiễm ........................................................................................................... 18 Bảng 4.2C Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu của nghiệm thức III trước và sau cảm nhiễm .................................................................................................... 18 Bảng 4.3D Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu của nghiệm thức IV trước và sau cảm nhiễm .................................................................................................... 19 Bảng 4.3 Sự biến đổi số lượng các loại bạch cầu giữa các nghiệm thức sau cảm nhiễm ................................................................................................................... 20 vi PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) Trước cảm nhiễm (TCN) Sau cảm nhiễm (SCN) Trước thí nghiệm (TTN) Đối chứng (ĐC) Nghiệm thức (NT) Tổng bạch cầu (TBC) Hồng cầu (HC) Tiểu cầu (T) Tế bào lympho (L) Tế bào mono (M) Neutrophil (N) Đại thực bào (ĐTB) vii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
CHƯƠNG I GIỚI THIỆU Cá tra được xem là loài cá kinh tế được nuôi phổ biến ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Cá thịt không chỉ được tiêu thụ nội địa mà còn là mặt hàng xuất khẩu lớn sang các nước Châu Âu và Mỹ. Hệ quả của việc nuôi cá tra phát triển nhanh không theo quy hoạch dẫn đến hiện trạng bệnh trên cá nuôi hiện nay xảy ra ngày càng nhiều, diễn biến ngày càng phức tạp hơn. Các bệnh thường gặp trên cá tra như: bệnh do ký sinh trùng, vi khuẩn, bệnh do môi trường, dinh dưỡng…trong đó bệnh mủ gan hay còn gọi là gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra đang rất phổ biến, ảnh hưởng lớn đến giai đoạn cá hương, cá giống và cả cá nuôi thương phẩm với tỉ lệ chết cao (10- 90%), gây thiệt hại lớn cho người nuôi (Từ Thanh Dung và ctv, 2004). Theo tập quán sản xuất của người nuôi cá khi có bệnh là nghĩ ngay đến việc dùng thuốc kháng sinh để điều trị và khi sử dụng lại không chú ý nhiều đến hướng dẫn, công dụng, liều lượng và thời gian sử dụng. Việc sử dụng thuốc kháng sinh trong một thời gian dài dẫn đến hiện tượng kháng thuốc, khi cá phát bệnh sẽ mạnh hơn và việc điều trị khó khăn tốn kém hơn nhiều. Theo điều tra của Nguyễn Tấn Duy Phong, (2008) trên cá tra nuôi ao thâm canh ở hai tỉnh Cần Thơ và An Giang thì chi phí cho thuốc thú y thủy sản là rất lớn (chiếm hơn 7% tổng chi phí sản xuất). Việc lạm dụng kháng sinh và thuốc thú y thủy sản không chỉ tốn kém mà còn làm cho sản phẩm cá tra, basa của Việt Nam gặp nhiều bất lợi khi xuất khẩu sang các thị trường trên thế giới. Để đảm bảo sức khỏe của người tiêu dùng nói chung cũng như đáp ứng tốt các yêu cầu và đòi hỏi ngày càng khắc khe của các thị trường thì việc hạn chế sử dụng kháng sinh, lựa chọn những phương pháp phòng bệnh bằng các giải pháp tích cực làm tăng cường sức đề kháng của cá nuôi đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Do đó, việc cung cấp thức ăn đầy đủ dinh dưỡng cũng như lựa chọn các sản phẩm bổ sung với thành phần chính là các vitamin và chất khoáng để kích thích hệ thống miễn dịch của cá, đặc biệt là hệ thống miễn dịch không đặc hiệu là một hướng đi tích cực trong việc phòng trị bệnh cá ngày nay. Antistress là một hỗn hợp bao gồm vitamin C, β-glucan và khoáng selenium hữu cơ được bổ sung vào thức ăn nhằm tăng cường sức kháng bệnh của cá tra. Vấn đề được đặt ra cho nhà sản xuất là cần có sự đánh giá chính xác về hiệu quả sử dụng cũng như liều lượng Antistress hợp lí cần bổ sung vào thức ăn. Xuất phát từ những thực tế trên đề tài “Ảnh hưởng của Antistress lên khả năng đề kháng Edwardsiella ictaluri của cá tra” được thực hiện. 1 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
Với mục tiêu: tìm hiểu ảnh hưởng của Antistress lên khả năng đề kháng Edwardsiella ictaluri của cá tra. Nội dung đề tài: 1. Ảnh hưởng của Antistress lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra. 2. Hiệu quả sử dụng Antistress qua cảm nhiễm với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. 2 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra E. ictaluri là vi khuẩn hình que, gram âm, không di động, lên men, không oxy hóa, oxidase âm tính, cho phản ứng catalase dương. Các chỉ tiêu sinh hóa của E. ictaluri đều âm tính, riêng lysine và glucose cho phản ứng dương tính Cá tra bị bệnh thường không có biểu hiện bất thường bên ngoài. Ở giai đoạn sớm cá vẫn còn bắt mồi. Tuy nhiên khi bệnh nặng, cá gầy, bơi lờ đờ, da nhợt nhạt, có hiện tượng xuất huyết trên da và hậu môn. Bên trong nội quan (gan, thận, tỳ tạng) xuất hiện những đốm trắng đường kính 1-3 mm, các cơ quan này sưng to và có hiện tượng nhũng ở thận. Bệnh thường xuất hiện vào mùa lũ cao điểm tháng 7 và tháng 8, gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá tra công nghiệp ở An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ. Bệnh gây tỉ lệ hao hụt cao ở cá hương, cá giống (10-90%), (Từ Thanh Dung và ctv, 2004). Bệnh lí và sự thay đổi các chỉ tiêu huyết học Máu là thành phần quan trọng trong hệ tuần hoàn của tất cả các cơ thể sống. Thành phần các tế bào máu của hệ tuần hoàn cá trơn bao gồm hồng cầu, tế bào lympho, tiểu cầu, tế bào mono và các loại bạch cầu trung tính có hạt. Hồng cầu (Erythrocyte) Hồng cầu trưởng thành ở cá có hình tròn hoặc hình oval với nhân bắt màu đậm và kích thước từ 10x11µm-12x13µm, đường kính nhân 4-5µm. Hồng cầu chưa trửơng thành ít được tìm thấy trong vòng tuần hoàn máu, kích thước giống hồng cầu trưởng thành nhưng nhân lớn hơn. Tế bào chất bắt màu xanh nhạt hoặc xám bởi thuốc nhuộm Wright và Giemsa (Chinabut et al, 1991). E: hồng cầu thành thục R: hồng cầu chưa thành thục Hình 2.1 Tế bào hồng cầu của cá trê trắng (Chinabut et al, 1991) 3 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
Tế bào lympho (lymphocyte) Tế bào lympho ở cá da trơn nhỏ hơn hồng cầu, kích thước biến động 6-11µm. Tế bào có hình tròn, nhân chiếm toàn bộ tế bào bắt màu tím đậm khi nhuộm với Giemsa, tế bào chất nhỏ không rõ ràng và thường bắt màu xanh nhạt. Hình 2.2 Tế bào lympho của cá trê trắng (Chinabut et al, 1991) Tiểu cầu (thrombocyte) Hình dạng thay đổi, có thể là hơi tròn, dài hoặc hình thoi. Có vành mỏng của tế bào chất bao quanh nhân. Tế bào chất có màu xanh nhạt khi nhuộm với dung dịch Wright and Giemsa. Tiểu cầu tham gia vào quá trình đông máu trong trường hợp bị tổn thương (Chinabut et al, 1991). Hình 2.3 Tiểu cầu của cá trê trắng (Chinabut et al, 1991) Bạch cầu đơn nhân (monocyte) Bạch cầu đơn nhân là tế bào lớn nhất trong các dạng tế bào máu với đường kính 10-14µm, hình dạng không đều, chúng có tâm lệch, trong tế bào chất tồn tại những không bào có nhiều kích thước khác nhau. Nhân bắt màu xanh, tế bào chất bắt màu xanh nhạt (Chinabut et al, 1991). 4 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
Hình 2.4 Bạch cầu đơn nhân của cá trê trắng (Chinabut et al, 1991) Bạch cầu trung tính (neutrophil) Tế bào lớn và tròn đường kính nhân 9-13µm với số lượng lớn của những hạt nhỏ trong tế bào chất màu xanh nhẹ hoặc hơi hồng. Nhân bắt màu xanh đậm, chia hai thuỳ ở tế bào thành thục và dạng tròn lệch tâm ở dạng chưa trưởng thành (Chinabut et al, 1991).. Hình 2.5 Bạch cầu trung tính của cá trê trắng (Chinabut et al, 1991) Không có bạch cầu ái toan hay bạch cầu ái kiềm được ghi nhận ở tế bào máu ngoại vi của cá trê, nhưng Williams and Waner (1976) đã tìm được 2 loại bạch cầu này trong máu cá nheo (Chinabut et al, 1991). Trần Hồng Ửng (2003) đã xác định sự thay đổi số lượng tế bào bạch cầu và mô tỳ tạng trên cá tra (P. hypophthalmus) bệnh trắng gan. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỉ lệ tế bào lympho của cá bệnh giảm so với cá khỏe nhưng tỉ lệ bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính thì tăng cao hơn. Điều này chứng tỏ khi cá bị nhiễm vi khuẩn gây bệnh thì trước hết hệ miễn dịch không đặc hiệu sẽ hoạt động do thành phần chính của hệ miễn dịch không đặc hiệu là bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính. Bạch cầu toan tính và bạch cầu kiềm tính có xuất hiện ở cá bệnh nhưng không có ở cá khỏe. Nghiên cứu cấu trúc mô và sự biến động số lượng tế bào hồng cầu trên cá tra (P. hypophthalmus) bị bệnh vàng da của Phan Thị Hừng (2004). Nghiên cứu 5 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
cho thấy số lượng hồng cầu ở cá bệnh giảm hơn 50% so với cá khỏe, hồng cầu ở cá bệnh bị thoái hóa, khó phân biệt tế bào chất và nhân hoặc có những tế bào chỉ còn nhân, không còn tế bào chất. Theo Benli and Yildiz (2004) nghiên cứu về sự thay đổi các chỉ tiêu huyết học trên cá rô phi ảnh hưởng bởi Edwardsiella tarda. Kết quả ghi nhận ở cá bệnh tổng bạch cầu tăng từ 12.00 ± 0,82 (x103µl-1) ở cá khỏe và cá bệnh là 21.75 ± 2.82 (x103µl-1) và có sự giảm số lượng hồng cầu ở cá bệnh so với cá khỏe và sự thay đổi này là có ý nghĩa thống kê. Phạm Thanh Hương (2006) xác định một số yếu tố huyết học trên cá tra bệnh vàng da ở Cần Thơ. Nghiên cứu cũng cho thấy sự giảm trong số lượng hồng cầu, tế bào lympho và tiểu cầu. Trong khi đó tổng bạch cầu, bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính lại tăng. Tuy nhiên, sự thay đổi số lượng tổng bạch cầu, tế bào lympho và tiểu cầu lại không có ý nghĩa thống kê. Theo Nguyễn Thị Thuý Liễu (2008) cũng có sự thay đổi rõ rệt về số lượng các tế bào máu giữa cá tra khỏe và cá tra bị mủ gan. Sự thay đổi này biểu thị cho phản ứng bảo vệ không đặc hiệu của cá khi bị mầm bệnh tấn công. Số lượng hồng cầu trên cá khỏe là 2,05x106 tế bào/mm3, còn trên cá bệnh là 0,75x106 tế bào/mm3, giảm 63,4% so với cá khỏe. Đồng thời có sự xuất hiện hồng cầu nhiều nhân và hồng cầu không nhân ở cá bệnh. Số lượng bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân trên cá bệnh tăng cao nhưng chỉ có sự tăng của bạch cầu trung tính là có ý nghĩa thống kê. Một số thí nghiệm gây cảm nhiễm gần đây Williams & Lawrence (2005) đã sử dụng vi khuẩn E. ictaluri R4383 WT và R4383 HM với nồng độ lần lượt là 7,0x107CFU/ml và 7,2x107 CFU/ml ngâm trên cá nheo Mỹ trong thời gian 30 phút, tỉ lệ chết là 90% và 85%. Đồng thời, tác giả cũng sử dụng phương pháp tiêm vi khuẩn E. ictaluri để so sánh với phương pháp ngâm với mật độ vi khuẩn tăng dần. Đối với vi khuẩn E. ictaluri R4383 WT tiêm với mật độ 5,2x103 CFU/ml, 5,2x10 4 CFU/ml, 5,2x105 CFU/ml thì tỉ lệ chết lần lượt là 67,2%, 100%, 100%. Trong khi đó, tiêm E. ictaluri R4383 HM với mật độ vi khuẩn là 5,2x103 CFU/ml, 5,2x104 CFU/ml, 5,2x105 CFU/ml và 5,2x10 6 CFU/ml gây chết 63,5%, 98,7%, 100%, 100%. Qua kết quả thí nghiệm, họ kết luận rằng không có sự khác nhau giữa hai phương pháp ngâm và tiêm. Lương Trần Thục Đoan (2006) đã chứng minh ngâm cá tra với mật độ vi khuẩn E. ictaluri từ 1x105 CFU/ml đến 1x107CFU/ml trong một giờ, thời gian theo dõi 10 ngày thì tỉ lệ chết cao nhất ở 1x107 CFU/ml là 75% cá thí nghiệm. Trong khi đó ở phương pháp tiêm thì ở mật độ vi khuẩn 1x105 CFU/ml đã đủ 6 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
mạnh để giết chết 100% cá thí nghiệm trong vòng 5 ngày và kết luận rằng phương pháp tiêm vi khuẩn chết nhanh hơn phương pháp ngâm vi khuẩn trong vòng một giờ. Ngô Minh Dung (2007) với mã vi khuẩn E. ictaluri: Tỷ-PTK 207 bằng phương pháp tiêm đã xác định được chủng vi khuẩn gây cảm nhiễm có giá trị LD50=106,5 CFU/ml và cá có thời gian biểu hiện bệnh lí sớm nhất ở nghiệm thức 108 cfu/ml sau 37 giờ. Sản phẩm Antistress và vai trò của vitamin, chất khoáng đối với sức khỏe của cá. Thành phần trong 6kg của Antistress - Selenium hữu cơ: 1kg - Stay C (vitamin C): 1kg - B. Glucan: 2kg - FC 20: 2kg Selenium Selenium là một dạng khoáng hữu cơ tăng khả năng đề kháng bệnh và hoạt động của một số emzym. Là một trong những yếu tố khoáng vi lượng chiếm tỉ lệ rất thấp trong cơ thể cá nhưng lại rất cần thiết cho hoạt động sống của cá. Vitamin C Vitamin C có dạng tinh thể màu trắng, dễ tan trong nước, dễ hấp thụ qua niêm mạc ruột, không tích lũy trong cơ thể, thải trừ nhanh. Nhưng vitamin C dễ bị phân hủy, mất tác dụng dưới tác dụng của nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm và sự oxy hóa. Có 4 loại vitamin C thường được dùng trong nuôi trồng thủy sản là: L Ascorbyl-2 Monophosphate, L Ascorbyl-2 Diphosphate, L Ascorbyl -2 Triphosphate, L Ascorbyl-2 Sulphate (Trần Thị Thanh Hiền, 2004) Theo Dabrowki (1990) Vitamin C được xác định là rất quan trọng cho động vật thủy sản bởi vì trong khi hầu hết các động vật khác có khả năng tổng hợp vitamin C từ glucuronic acid thì cá và giáp xác lại thiếu enzim gulonolactone oxidase cần thiết cho bước cuối cùng của quá trình tổng hợp. Chính vì vậy vitamin C của động vật thủy sản chủ yếu hấp thu từ thức ăn (trích dẫn bởi Trần Thị Thanh Hiền, 2004) Việc cung cấp thức ăn thiếu vitamin C hay do tình trạng cơ thể bị stress vì điều kiện môi truờng hay cơ thể bị mắc bệnh hậu quả dẫn đến tình trạng cơ thể bị suy giảm hệ thống miễn dịch, làm cho cơ thể cá dễ bị nhiễm bệnh và không có khả năng hồi phục lại chức năng bình thường của cơ thể. Vitamin C được ghi nhận là có vai trò quan trọng trong trao đổi chất, nó tham gia vào quá trình 7 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
sinh trưởng và phát triển của sinh vật bởi việc tạo thành collagen, tăng cường các phản ứng miễn dịch và sức đề kháng bệnh của tôm cá. (Phạm Khắc Hiếu (1997) trích dẫn bởi Nguyễn Kim Kha, 2006). Theo Lương Thanh Trúc (2000) có sự sai khác có ý nghĩa giữa tỉ lệ cảm nhiễm kí sinh trùng và tỉ lệ chết giữa nghiệm thức bổ sung 2000, 4000mg vitamin C/kg thức ăn so với nghiệm thức đối chứng. Beta glucan Beta glucan là một polysaccharide được ly trích từ hạt ngũ cốc hay từ men bánh mì. Beta glucan làm tăng khả năng thực bào của tế bào bạch cầu. Do khả năng tăng cường miễn dịch không đặc hiệu, beta glucan từ lâu đã được chế biến và sử dụng trong dược phẩm cho người và ngành chăn nuôi. Kumari and Sahoo (2006) nghiên cứu về khả năng miễn dịch bẩm sinh và kháng bệnh ở cá trê có chế độ ăn β- 1,3 glucan. Tác giả ghi nhận rằng với mức glucan 0,1% trong thức ăn có sự khác biệt về sự nâng cao MPO, lysozyme, O- và khả năng bảo vệ của huyết thanh chống lại Aeromonas hydrophila. Ở chế độ cho ăn glucan 0,1% trên 1 tuần có khả năng nâng cao khả năng miễn dịch không đặc hiệu và kháng bệnh của cá trơn một cách hiệu quả. Theo Saurabh and Sahoo (2008) lysozyme là phần tử bảo vệ quan trọng trong hệ thống miễn dịch không đặc hiệu của cá được tìm thấy trong dịch nhày, tế bào lympho, plasma và dịch lỏng ở cá. Theo Welker et al (2007) cá cho ăn thức ăn bổ sung thành phần men phụ có sự pha trộn β-glucan có tỉ lệ sống sau khi nhiễm E. ictaluri là 5-17% cao hơn cá ở nghiệm thức đối chứng và có sự giảm stress ở cá có cho ăn thức ăn bổ sung thành phần men phụ có sự pha trộn β-glucan. 8 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian thực hiện đề tài Đề tài được thực hiện từ tháng 11/2008 đến tháng 05/2009. 3.2 Địa điểm nghiên cứu - Thí nghiệm cho cá ăn với các hàm lượng Antistress khác nhau được bố trí tại trại thực nghiệm khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ. - Thí nghiệm gây cảm nhiễm tại phòng gây cảm nhiễm Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần thơ. - Phân tích mẫu tại phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học và bệnh thủy sản, khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ. 3.3 Vật liệu nghiên cứu 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu - Cá tra giống có khối lượng trung bình 12g/con. - Nguồn vi khuẩn: chủng Edwardsiella ictaluri CAF255 từ bộ sưu tập vi khuẩn trong tủ -80o, khoa Thủy Sản, trường Đại Học Cần Thơ. 3.3.2 Dụng cụ và thiết bị Kính hiển vi, nồi Autolaves, cân điện tử (hai số lẻ), bếp khuấy gia nhiệt, tủ cấy vô trùng, lọ nhuộm tiêu bản, lame và lamen, pipet, micro pipet, đầu col 1mL và 0,1mL, buồng đếm hồng cầu, bể composite, máy sục khí. Đĩa Petri, ống nghiệm, que cấy, bao tay, đèn cồn, bình xịt cồn, khay nhựa, viết lông dầu, chai thủy tinh, bình tam giác, kim tiêm 1ml, ống nghiệm nhựa 5ml và giá ống nghiệm... 3.3.3 Hóa chất NaCl, Na2SO4, Na2HPO4.2.H2O, NaH2PO4.2H2O, KH2PO4, formaline (37%), Chlorin , methyl violet, nước cất, methanol, glycerol, bột Wright, bột Giemsa, acid citric, môi trường tripticase soy agar (TSA), nutrient broth (NB), cồn 96°, cồn 70°, dung dịch nhuộm gram, giấy test oxidase, H202 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Thí nghiệm cho ăn thức ăn bổ sung Antistress Bố trí thí nghiệm 9 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
Thí nghiệm được bố trí với 4 nghiệm thức thức ăn có cùng mức protein, acid amin và năng lượng. Mỗi nghiệm thức được lập lại 3 lần Nghiệm thức 1: Thức ăn có 0% Antistress Nghiệm thức 2: Thức ăn có 0,2% Antistress Nghiệm thức 3: Thức ăn có 0,4% Antistress Nghiệm thức 4: Thức ăn có 0,6% Antistress Cá được cho ăn 2 lần/ngày. Thời gian thí nghiệm trong 8 tuần Thí nghiệm được thực hiện trên hệ thống bể composite (500L/bể), nước chảy tràn có sục khí. Mật độ cá thí nghiệm 50 con /bể. Các chỉ tiêu thu thập Kết thúc 8 tuần cho ăn thức ăn, thu mẫu huyết học ngẫu nhiên 3con/bể để so sánh số lượng hồng cầu, bạch cầu, đại thực bào giữa các nghiệm thức. 3.4.2 Thí nghiệm gây cảm nhiễm với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Chuẩn bị thí nghiệm Bể thí nghiệm - Nước cung cấp cho thí nghiệm được xử lí bằng Chlorin 30 ppm và sục khí mạnh trong vòng 3-4 ngày. - Bể, lưới che, vợt dùng trong thí nghiệm được xử lí bằng Chlorin 10% và làm sạch bằng xà phòng và nước trước khi sử dụng. Vi khuẩn cảm nhiễm Vi khuẩn E. ictaluri CAF 255 được phục hồi trên môi trường TSA và giữ trong tủ ấm 48 giờ ở 280 C. Kiểm tra tính thuần thông qua các đặc điểm hình thái của khuẩn lạc, hình dạng và kích thước của vi khuẩn, tính gram của vi khuẩn cũng như việc kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản (phản ứng oxidase, catalase, tính di động, phản ứng decarboxylase, khả năng lên men và oxi hóa đường glucose (Fermentation /Oxidation: O/F). Khi vi khuẩn đã thuần thì chọn hai khuẩn lạc đồng nhất để nuôi tăng sinh trong 30ml môi trường NB ở 280C trong 48 giờ. Sau đó, vi khuẩn sẽ được chuyển qua ống Falcon đã tiệt trùng. Li tâm ở 4.000rpm với nhiệt độ là 40C trong 5 phút. Rửa qua nước muối sinh lí 2-3 lần. Lần cuối vortex hòa tan nước muối và vi khuẩn. Đo mật độ vi khuẩn ở bước sóng 610nm (OD =1) tương đương mật độ 109cfu/mL. Pha loãng mật độ vi khuẩn về 106 cfu/mL. 10 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
Kiểm tra lại mật số vi khuẩn trên môi trường đĩa TSA Nồng độ vi khuẩn đã sử dụng 1,2x106 cfu/mL. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí với 5 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức được lập lại 3 lần 1. Nghiệm thức 1: gây cảm nhiễm, cá đã sử dụng thức ăn có 0% Antistress. 2. Nghiệm thức 2: gây cảm nhiễm, cá đã sử dụng thức ăn có 0,2% Antistress. 3. Nghiệm thức 3: gây cảm nhiễm, cá đã sử dụng thức ăn có 0,4% Antistress. 4. Nghiệm thức 4: gây cảm nhiễm, cá đã sử dụng thức ăn có 0,6% Antistress 5. Nghiệm thức đối chứng: tiêm nước muối sinh lí, cá đã sử dụng thức ăn có 0% Antistress. Cá được tiêm 0,1 ml dung dịch vi khuẩn ở các nghiệm thức gây cảm nhiễm và 0,1 ml nước muối sinh lí ở nghiệm thức đối chứng. Cá được cho ăn theo nhu cầu. Mật độ cá bố trí thí nghiệm là 10 con/bể Các chỉ tiêu thu thập Thu mẫu huyết học cá mới chết khoảng 3con/bể để so sánh số lượng hồng cầu, bạch cầu, đại thực bào giữa các nghiệm thức. Theo dõi và ghi nhận tỉ lệ chết sau cảm nhiễm ở các nghiệm thức. Phân lập vi khuẩn từ gan, thận của cá mới chết sau cảm nhiễm. 3.4.3 Phương pháp lấy mẫu máu Dùng ống tiêm tiệt trùng 1ml lấy máu ở động mạch đuôi của cá (lượng máu tối thiểu là 0,3ml). Nhỏ máu xuống lam, dùng pipet cho 10µl máu vào ống nghiệm nhựa có chứa 1990µl dung dịch Natt & Herrick và đếm hồng cầu bằng buồng đếm. Tiếp tục nhỏ một giọt máu lên một góc lame khác (lập lại 3 lần) cho thao tác trãi mẫu để đếm bạch cầu. Trãi mẫu máu: cho lamelle chạm vào giọt máu, đẩy lamelle ngược về phía trước (Hình 3.1). Mẫu máu sau khi khô được cố định bằng cách ngâm trong methanol 1-2 phút (Rowley, 1990 trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thúy Liễu, 2008). Để mẫu khô tự nhiên và trữ lạnh. 11 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com