Sáng kiến kinh nghiệm THPT: Đánh giá một số dòng lúa chọn lọc thế hệ R2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh tại tỉnh Vĩnh Phúc

Chia sẻ: Tabicani09 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:54

Thêm vào BST

Báo xấu

15
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của đề tài là chọn lọc được một số dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh để tiếp tục theo dõi bồi dưỡng thành dòng có triển vọng. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Sáng kiến kinh nghiệm THPT: Đánh giá một số dòng lúa chọn lọc thế hệ R2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh tại tỉnh Vĩnh Phúc

SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VĨNH PHÚC TRƯỜNG THPT NGUYỄN THỊ GIANG  BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU, ỨNG DỤNG SÁNG KIẾN Tên sáng kiến kinh nghiệm: “ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ DÒNG LÚA CHỌN LỌC THẾ HỆ R2 CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU LẠNH TẠI TỈNH VĨNH PHÚC” Tác giả sáng kiến: Dương Thị Thu Huyền Mã sáng kiến : 25.56 Vĩnh Phúc, năm 2019 i
MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ……………………………………………….iii DANH MỤC BIỂU BẢNG ........................................................................... iv DANH MỤC HÌNH ....................................................................................... v 1. LỜI GIỚI THIỆU ....................................................................................... 1 2. TÊN SÁNG KIẾN ...................................................................................... 2 3. TÊN TÁC GIẢ: .......................................................................................... 2 4. CHỦ ĐẦU TƯ: .......................................................................................... 2 5. LĨNH VỰC ÁP DỤNG: ............................................................................. 3 6. NGÀY ÁP DỤNG SÁNG KIẾN: ............................................................... 3 7. MÔ TẢ BẢN CHẤT CỦA SÁNG KIẾN ................................................... 3 7. 1. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................... 3 7. 2. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 3 7.3. Vật liệu, phương pháp nghiên cứu và xử lý kết quả , tính toán số liệu ..... 3 7.3.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 3 7.3.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 5 7.3.3. Xử lý kết quả và tính toán số liệu ....................................................... 19 7.4. Kết quả và thảo luận .............................................................................. 20 7.4.1. Đặc điểm nông học các dòng lúa chọn lọc thế hệ R2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh ...................................................................................... 20 7.4.2. Kết quả đánh giá khả năng chịu lạnh của các dòng chọn lọc thế hệ R3 ................................................................................................................ 27 7.4.3. Đánh giá chất lượng hạt của một số dòng chọn lọc R3 có nguồn gốc từ giống XCH thông qua một số chỉ tiêu hóa sinh .................................. 34 7.4.4. Phân lập và tách dòng gen OsDREB1F liên quan đến khả năng chịu lạnh ở lúa ............................................................................................. 36 8. NHỮNG THÔNG TIN CẦN BẢO MẬT (NẾU CÓ). .............................. 41 9. CÁC ĐIỀU KIỆN CẦN THIẾT ĐỂ THỰC HIỆN. .................................. 41 10. ĐÁNH GIÁ LỢI ÍCH CỦA VIỆC ÁP DỤNG SÁNG KIẾN. ................. 42 11. DANH SÁCH NHỮNG TỔ CHỨC, CÁ NHÂN THAM GIA ÁP DỤNG THỬ HOẶC ÁP DỤNG SÁNG KIẾN LẦN ĐẦU: ......................... 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 44 ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4D 2,4D –dichlorphenoxyacetic acid ABA Abscisic acid DNA Deoxyribo nucleic acid BAP 6 – Benzyl amino purin bp Cặp base cs Cộng sự ĐC Đối chứng ĐVHĐ Đơn vị hoạt độ EDTA Ethylen diamin tetra axetic acid FAO Food Agriculture Orgnization kb Kilobase KLK Khối lượng khô mRNA ARN thông tin PCR Phản ứng chuỗi polymerase TAE Tris axetat EDTA XCH Xuân Châu Hương iii
DANH MỤC BIỂU BẢNG Bảng Tên Bảng Trang 2.1 Đặc điểm của các giống lúa nghiên cứu 4 2.2 Các dòng thế hệ R2 4 2.3 Mồi nhân gen osDREB1F ở lúa 9 Thành phần phản ứng của phản ứng PCR nhân đoạn gen 2.4 10 osDREB1F ở lúa Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách 2.5 11 dòng Đặc điểm nông học và mức độ biến dị của các dòng chọn 3.1 24 lọc thế hệ R2 (n = 30, α = 0,05) Giá trị Tα, Ttn một số đặc điểm nông học của các dòng 3.2 36 chọn lọc thế hệ R2(α = 0,05) Tỷ lệ chết và tỷ lệ thiệt hại khi xử lý lạnh ở 4oC± 0,5oC 3.3 trong 32 giờ ở giai đoạn cây mạ 3 lá của các dòng chọn 29 lọc thế hệ R3 Hàm lượng diệp lục sau khi xử lý lạnh ở 12oC ± 0,5oC ở 3.4 31 giai đoạn mạ 3 lá của các dòng chọn lọc thế hệ R3 3.5 Tương quan giữa hàm lượng diệp lục và mức độ thiệt hại 33 Một số chỉ tiêu hoá sinh của các dòng chọn lọc R3 thuộc 3.6 35 giống XCH iv
DANH MỤC HÌNH Hình Tên Hình Trang 3.1 Các dòng chọn lọc R2 có nguồn gốc từ giống C27 20 3.2 Các dòng chọn lọc R2 có nguồn gốc từ giống XCH 21 Các dòng chọn lọc R3 ở giai đoạn mạ ở thời điểm 3.3 28 trước trước và sau khi xử lý bởi lạnh 3.4 Kết quả tách chiết DNA tổng số của 2 mẫu lúa 36 3.5 Kết quả nhân gen osDREB1F của 2 mẫu lúa 37 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến 3.6 38 E.coli DH5α 3.7 Kết quả conoly PCR từ các dòng khuẩn lạc trắng 39 Kết quả tách chiết plasmid của các dòng khuẩn mang 3.8 40 vector tái tổ hợp Kết quả cắt plasmid của các dòng khuẩn mang vector 3.9 41 tái tổ hợp v
BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU, ỨNG DỤNG SÁNG KIẾN 1. LỜI GIỚI THIỆU Việt Nam là một nước nông nghiệp, trong đó cây lúa đang là thế mạnh đưa Việt Nam là một trong những nước đứng đầu thế giới về xuất khẩu gạo. Năm 2017, Việt Nam tiếp tục là nước xuất khẩu gạo đứng thứ ba thế giới sau Ấn Độ và Thái Lan. Chỉ tính riêng 9 tháng đầu năm 2018, Việt Nam đã xuất khẩu trên 4,89 triệu tấn gạo với giá trị khoảng 2,46 tỷ USD, lần lượt tăng 6,7% về lượng và tăng 21,3% về giá trị so với cùng kỳ năm trước. Gạo Việt hiện đã có mặt ở gần 150 quốc gia và vùng lãnh thổ với các sản phẩm khá đa dạng như: Gạo hạt dài, gạo hạt ngắn, gạo thơm, gạo đồ, gạo hữu cơ… Đáng chú ý, gạo Việt bước đầu đã thâm nhập được vào những thị trường có yêu cầu cao như: Hàn Quốc, Nhật Bản, Hoa Kỳ, EU… Tuy nhiên lúa thuộc nhóm cây nhạy cảm với nhiệt độ lạnh ở hầu hết các giai đoạn sinh trưởng và phát triển, nhất là đối với những giống có nguồn gốc nhiệt đới và cận nhiệt đới. Những tổn thương do nhiệt độ lạnh gây ra có thể được quan sát ở nhiều giai đoạn tăng trưởng khác nhau của cây lúa: hạt không nảy mầm, cây mạ kém phát triển, hiện tượng cây lùn, cằn cỗi, hiện tượng biến đổi màu sắc, hiện tượng thoái hóa đỉnh bông lúa, gia tăng tỉ lệ hạt lép và hiện tượng hạt chín bất bình thường [3], [49], [52]. Tác động của lạnh lên cây lúa rất rõ rệt. Ở nhiệt độ thấp dưới 100C, nếu thời gian rét kéo dài ở giai đoạn mạ hoặc sau khi cấy có thể gây chết hàng loạt với những giống không chịu được lạnh. Ở giai đoạn cây lúa trổ bông, nếu gặp nhiệt độ dưới 200C thì kết quả thụ phận sẽ giảm và tỷ lệ lép sẽ tăng lên đáng kể. Nếu lạnh hơn và thời gian kéo dài có thể gây bất thụ hoàn toàn. Nhiệt độ dưới 150C ức chế tổng hợp chlorophyll phân hủy lục lạp, sinh trưởng kém. Nếu nhiệt độ giảm xuống dưới 100C chức năng của rễ bị tổn thương, lá và cả thân bị khô héo, cây chết, mạ mũi chông có thể ngừng sinh trưởng hoàn toàn [2]. 1
Việt Nam hàng năm ở các tỉnh vùng núi phía Bắc, miền núi trung du đồng bằng sông hồng trong đó có tỉnh Vĩnh Phúc luôn có mùa đông lạnh giá. Nhiệt độ có năm xuống đến mức rét đậm, rét hại không đảm bảo cho cây lúa sinh trưởng tốt, làm ảnh hưởng không nhỏ đến năng suất, chất lượng và sản lượng xuất khẩu cuối năm. Đứng trước những khó khăn thách thức đó, năm 2012 tôi đã nghiên cứu và bảo vệ thành công đề tài luận văn thạc sĩ về “Đánh giá một số dòng lúa chọn lọc thế hệ R2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh”, bước đầu chọn lọc được một số dòng lúa thế hệ R2 cho thế hệ R3 đạt kết qủa tốt về khả năng chịu lạnh ở các tỉnh miền núi phía Bắc. Trong quá trình công tác tại tỉnh Vĩnh Phúc tôi nhận thấy vào vụ đông xuân cây lúa cũng chịu ảnh hưởng không nhỏ bởi điều kiện lạnh giá như ở các tỉnh miền núi phía bắc, những đợt rét đậm, rét hại làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản lượng lúa hàng năm của tỉnh. Xuất phát từ những lý do trên tôi đã tiếp tục tiến hành nghiên cứu đề tài:“Đánh giá một số dòng lúa chọn lọc thế hệ R2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh tại tỉnh Vĩnh Phúc” 2. TÊN SÁNG KIẾN Đánh giá một số dòng lúa chọn lọc thế hệ R2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh tại tỉnh Vĩnh Phúc. 3. TÊN TÁC GIẢ: - Họ và tên: DƯƠNG THỊ THU HUYỀN - Địa chỉ: Trường THPT Nguyễn Thị Giang – Đại Đồng – Vĩnh Tường – Vĩnh Phúc. - Số điện thoại: 0985123340 E_mail: duongthithuhuyen83@gmail.com 4. CHỦ ĐẦU TƯ: Dương Thị Thu Huyền giáo viên giảng dạy môn Sinh học trường THPT Nguyễn Thị Giang. 2
5. LĨNH VỰC ÁP DỤNG: Lĩnh vực áp dụng thuộc chương trình sinh học phổ thông và chương trình công nghệ nông nghiệp. 6. NGÀY ÁP DỤNG SÁNG KIẾN: Từ tháng 9 năm 2017 đến tháng 2 năm 2019. 7. MÔ TẢ BẢN CHẤT CỦA SÁNG KIẾN 7. 1. Mục tiêu nghiên cứu - Chọn lọc được một số dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh để tiếp tục theo dõi bồi dưỡng thành dòng có triển vọng. 7. 2. Nội dung nghiên cứu (1) Đánh giá đặc điểm nông học của một số dòng lúa thế hệ R2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh. (2) Đánh giá khả năng chịu lạnh của một số dòng chọn lọc thế hệ R3 Đánh giá khả năng chịu lạnh của các dòng chọn lọc thế hệ R3 ở giai đoạn mạ ba lá thông qua đánh giá ảnh hưởng của lạnh đến tỉ lệ thiệt hại, hàm lượng diệp lục a, b sau khi xử lý lạnh cây mạ ba lá. (3) Đánh giá chất lượng hạt của một số dòng chọn lọc thế hệ R3 (4) Nhân và tách dòng gen liên quan đến khả năng chịu lạnh của một số dòng chọn lọc triển vọng 7.3. Vật liệu, phương pháp nghiên cứu và xử lý kết quả , tính toán số liệu 7.3.1. Vật liệu nghiên cứu 7.3.1.1. Vật liệu thực vật Hạt R2 của một số dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh của giống U17, C27 và Xuân Châu Hương (XCH) được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu. - Giống: U17 do Sở Nông nghiệp tỉnh Vĩnh Phúc cung cấp. - Các giống: C27, XCH, do Sở Nông nghiệp tỉnh Phú Thọ cung cấp. 3
Bảng 2.1. Đặc điểm của các giống lúa nghiên cứu Thời gian sinh Chiều cao Khối lượng Giống Số hạt chắc/bông trưởng (ngày) cây (cm) 1000 hạt (g) C27 100 90 90 - 95 hạt 20- 21 U17 145 - 150 95 - 100 100 hạt 26 - 27 XCH 100 80 - 85 125 - 135 hạt 27 - 28 Bảng 2.2. Các dòng thế hệ R2 STT Dòng chọn lọc Nguồn gốc 1 R2.03, R2.08, R2.16, R2.18 C27 2 R2.01, R2.04, R2.05, R2.09, R2.11 U17 3 R2.06, R2.13, R2.20, R2.38, R2.44 XCH 7.3.1.2. Hoá chất và thiết bị - Hoá chất: Các hóa chất dùng trong nghiên cứu có nguồn gốc từ Anh Đức, Mĩ Trung Quốc gồm: EDTA, Tris-HCl , Acid acetic, X-gal, Kanamycin, Ampicilin, Agar; Agarose (Sigma, Mỹ), cồn tuyệt đối, bộ kit dùng cho phản ứng PCR, kit tách dòng, bộ kit sử dụng tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp, các loại enzym giới hạn: EcoRI, BamHI, NotI . Tế bào E. coli thuần chủng DH5α, photphat citrat, petroleum ether… - Thiết bị: Cân điện tử santorius, tủ sấy carbolite, máy quang phổ Uvis Cintra 40, máy li tâm lạnh Hettich, nồi hấp cao áp, box cấy, máy PCR system 9700 (Pharmacia), máy điện di (Biorad), máy đo quang phổ Diode Array Spectrophotometer, máy ổn định nhiệt, máy soi UV…có nguồn gốc từ Anh, Đức. 7.3.1.3. Địa điểm nghiên cứu - Các thí nghiệm đồng ruộng được tiến hành ở vụ mùa năm 2017 tại xã Đại Đồng, huyện Vĩnh Tường, tỉnh Vĩnh phúc. 4
- Các thí nghiệm phân tích sinh lý tiến hành tại phòng Công nghệ tế bào, phòng thí nghiệm Di truyền, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. - Phân tích sinh học phân tử được tiến hành tại phòng Sinh học hiện đại, khoa Sinh – KTNN, Trường ĐHSP Hà Nội 2 và Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật- Viện Công nghệ Sinh học. 7.3.2. Phương pháp nghiên cứu 7.3.2.1. Phương pháp trồng và theo dõi ngoài đồng ruộng Các dòng ở thế hệ R2 và giống đối chứng được trồng riêng và chăm sóc trong cùng một điều kiện. Theo dõi sự phát triển của các dòng chọn lọc và giống đối chứng qua các giai đoạn phát triển trong một vụ gieo trồng thông qua các chỉ tiêu nông học: chiều cao cây, số bông/khóm, chiều dài bông, số hạt chắc/bông, kích thước hạt, khối lượng 1000 hạt, thời gian sinh trưởng. Các chỉ tiêu được đánh giá theo chuẩn IRRI [12]. 7.3.2.2. Phương pháp phân tích hoá sinh phân tích một số chỉ tiêu hóa sinh ở giai đoạn hạt tiềm sinh Chuẩn bị mẫu : Hạt của các mẫu thế hệ R3 được nghiền mịn và sấy khô tuyệt đối.  Xác định hàm lượng lipit Dựa vào tính chất hòa tan của lipit trong dung môi hữu cơ để chiết lipit, dung môi hữu cơ được sử dụng là Petroleum ether. Hàm lượng lipit được xác định theo mô tả của Nguyễn Văn Mùi (2001) [19]. Các bước tiến hành như sau: (1) Cân 0,3g mẫu cho vào ống eppendort, cho 1,5ml Petroleum ether. (2) Li tâm lạnh 12.000 vòng/phút ở 40C trong thời gian 30 phút. (3) Loại bỏ dịch trong, lặp lại quá trình 3 lần. (4) Sấy khô tuyệt đối và cân khối lượng mẫu còn lại sau khi triết lipit. Hàm lượng lipit được tính theo công thức : Hàm lượng lipit (%)  A  B x 100% A Trong đó: A: Khối lượng mẫu trước khi đem phân tích (mg) 5
B: Khối lượng mẫu sau khi đem phân tích (mg).  Xác định hàm lượng protein tan theo phương pháp Lowry được mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và cs (1998) [4]. Các bước tiến hành như sau: (1) Cân 0,05g bột mẫu khô tuyệt đối cho vào ống eppendort (2ml), cho vào 1,5ml dung dịch đệm chiết photphat citrat (pH = 10), lắc đều trong 10 phút, để ống nghiệm ở 4oC trong vòng 24 giờ. (2) Li tâm lạnh 12.000 vòng/phút ở 4oC trong thời gian 30 phút, rồi thu dịch để làm thí nghiệm. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Dịch chiết được định mức lên 5 ml bằng dung dịch đệm phosphat citrat (pH=10) và đo hấp thụ trên máy UV vis Cintra ở bước sóng 750nm với thuốc thử foling. Hàm lượng protein tan được tính theo công thức: A.HSPL X(%)   100% M Trong đó: X: Hàm lượng protein (% khối lượng khô) A: Nồng độ đo được trên máy quang phổ (mg/ml) HSPL: Hệ số pha loãng M: Khối lượng mẫu đem phân tích (mg)  Xác định hàm lượng đường tan theo phương pháp vi phân tích được mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu [4]. Đường tan trong hạt nảy mầm được chiết bằng nước cất, để ở 40C trong 24 giờ. Sau đó li tâm ở 4oC với vận tốc 12000 vòng/phút trong thời gian 30 phút. Thu dịch để phân tích, tiến hành lặp lại 3 lần. Hàm lượng đường tan được tính theo công thức: a  b  HSPL X   100 % m Trong đó: X: hàm lượng đường tan (%) b: số ml dịch chiết HSPL: hệ số pha loãng m: khối lượng mẫu (mg) a: nồng độ đo được trên máy (mg/ml ) 6
7.3.2.3. Phương pháp phân tích sinh lý 7.3.2.3.1. Đánh giá khả năng chịu lạnh ở giai đoạn cây mạ 3 lá bằng phương pháp gây lạnh nhân tạo + Chuẩn bị mẫu: Hạt lúa của một số dòng thế hệ R3 ngâm, ủ cho nảy mầm dài 1cm thì chuyển vào hộp trồng cây đựng cát vàng rửa sạch. Mỗi hộp 45 - 50 mầm, 3 hộp cho mỗi giống. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với chế độ chăm sóc và điều kiện như nhau. Hai ngày đầu tưới nước cho đủ ẩm, từ ngày thứ ba trở đi tưới dung dịch Knop, khi cây mạ được ba lá (9 - 10 ngày) thì tiến hành xử lý lạnh ở nhiệt độ 40C ± 0,50C trong 32 giờ. Chuyển cây ra ngoài sáng bình thường ở nhiệt độ 25 - 300C. Sau hai, ba ngày xác định mức độ bị hại. + Đánh giá mức độ bị hại do lạnh theo thang điểm từ 0 đến 5: 0: Không bị hại, 1: đầu lá bị khô chết, 2: 1/3 đầu lá bị khô chết, 3: 1/2 đầu lá bị khô chết, 4: 3/4 lá bị khô chết, 5: chết cả cây. Tính giá trị trung bình của 50 cây mỗi giống nhắc lại 3 lần. + Tỷ lệ thiệt hại do lạnh của cây mạ được xác định theo công thức: a( % )   (n 0  b )  100 n c Trong đó: a: Tỷ lệ thiệt hại do lạnh gây ra (%) b: Trị số bị hại của mỗi cấp c: Trị số bị hại của cấp cao nhất n0: Số cây của mỗi cấp bị hại n: Tổng số cây xử lý Xác định khả năng chịu lạnh ở giai đoạn cây mạ theo phương pháp được mô tả trong tài liệu của Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1995) [1]. 7.3.2.3.2. Ảnh hưởng của lạnh đến hàm lượng diệp lục a, b ở giai đoạn mạ 3 lá - Chuẩn bị mẫu: Hạt lúa của một số dòng thế hệ R3 ngâm, ủ cho nảy mầm dài 1cm thì chuyển vào hộp trồng cây đựng cát vàng rửa sạch. Mỗi hộp 45 - 50 mầm, 3 hộp cho mỗi giống. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần với chế độ chăm sóc và điều kiện như nhau. Hai ngày đầu tưới nước cho đủ ẩm, từ ngày thứ ba trở đi tưới dung dịch Knop, khi cây mạ được ba lá (9 - 10 ngày) thì tiến hành xử lý lạnh ở nhiệt độ 12oC ± 0,5oC trong ngưỡng thời gian 3 và 5 ngày, thì thu hoạch lá, tiến hành xác định hàm lượng diệp lục. 7
- Phương pháp xác định hàm lượng diệp lục: Hàm lượng diệp lục được mô tả trong sổ tay phân tích đất, nước, phân bón cây trồng (1998) [31]. Các bước tiến hành như sau: + Cân 0,1 g lá nghiền trong cồn ethanol 96% + Li tâm ở 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi + Dịch thu được đem pha loãng 10ml rồi đo quang phổ hấp thụ trên máy quang phổ UV Visible ở bước sóng 665 nm và 649 nm. + Hàm lượng diệp lục (mg/g lá tươi) được tính theo công thức: C V  n A P  1000 Trong đó: C: nồng độ diệp tính ra (mg/l) (gồm có Ca, Cb, Ca+b) Ca (mg/l) = 13,70. E665 – 5,76. E649 Cb (mg/l) = 25,80. E649 – 7,60. E665 Ca+b (mg/l) = 6,10. E665 + 20,04. E649 P: Khối lượng mẫu (g) V: Thể tích sắc tố rút được (ml) 7.3.2.3. Phương pháp sinh học phân tử 7.3.2.3.1. Tách chiết DNA tổng số từ lá lúa Quy trình tách chiết và làm sạch DNA tổng số từ lá lúa dựa theo phương pháp của Foolad và cs (1995) có cải tiến [41]. - Tiến hành: Hạt lúa R3 của một số dòng từ thế hệ R2 được bóc vỏ và khử trùng, cấy hạt trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 3% saccharose, 0,8% agar, mật độ cấy 20 hạt/ bình. Sau 10 ngày thu lá, bảo quản ở tủ lạnh sâu -850C. DNA tách từ lá non của lúa được thực hiện theo các bước sau: (1) Phá vỡ tế bào bằng cách nghiền nhanh 0,2 g lá tươi trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn bằng chày cối sứ. (2) Cho 1,5 ml đệm chiết CTAB (CTAB 2,5%+100ml Tris - HCl pH=8 + 200 ml EDTA + NaCl 1,4mg), ủ trong 30 phút ở bể ổn nhiệt (650C). (3) Bổ sung 1,0ml hỗn dịch chloroform: isoamyl (24 : 1), lắc nhẹ trong 20 phút. (4) Li tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, thu dịch nổi trên. (5) Tủa dịch nổi bằng isopropanol (tỉ lệ 1:1). (6) Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi. 8
(7) Rửa DNA 2 - 3 lần bằng ethanol 70%. (8) Làm khô DNA (9) Hoà tan DNA trong 300 l TE. Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA a) Đo quang phổ hấp thụ: Đo dung dịch DNA trên máy quang phổ có chương trình xử lý trên máy vi tính. Mẫu DNA được coi là tinh sạch nếu tỷ số OD260/OD280 đạt 1,8 – 2,0. Mẫu được pha loãng 200 lần theo công thức: 995l nước cất + 5 l DNA mẫu. Đo mẫu ở bước sóng  = 260 nm và  = 280 nm. Tính hàm lượng và độ sạch của DNA theo công thức: + Hàm lượng DNA (ng/µl) = 50  HSPL  OD260 + Độ sạch của DNA = OD260/OD280 Trong đó: 50: Hằng số HSPL: Hệ số pha loãng OD260: Chỉ số đo được ở bước sóng 260nm OD280: Chỉ số đo được ở bước sóng 280nm b) Điện di trên gel agarose xác định chất lượng của DNA tổng số Chuẩn bị gel agarose 1%, dung dịch đệm dùng cho điện di là TAE 1X. Tra mẫu và chỉ thị phân tử (Marker). Chạy điện di ở 100V trong 30 phút. Nhuộm gel trong dung dịch Ethidium bromide (2g/ml; 15 l/bản gel) trong 10 phút. Rửa gel bằng nước cất, sau đó soi qua tia cực tím và chụp ảnh bằng máy Gel Logic 1500 – Kodak –USA. 7.3.2.3.2. Nhân và tách dòng gen osDREB1F Nhân gen osDREB1F bằng PCR từ DNA hệ gen cây lúa Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi DREB1F/ DREB1R được thiết kế dựa trên trình tự DNA trên GenBank với mã số AY78589 [60], cặp mồi được tổng hợp tại hãng Invitrogen, trình tự cặp mồi ở bảng 2.2 Bảng 2.3. Mồi nhân gen osDREB1F ở lúa Mồi Trình tự mồi Nhiệt độ gắn mồi DREB1F 5' - ATGGACACCGAGGACACGTCGTC - 3' 54OC DREB1R 5' - TCAGTCCATCCATAGCTTGTAGTC - 3' 54OC 9
Thành phần phản ứng của phản ứng PCR nhân đoạn gen osDREB1F ở lúa được trình bày ở bảng 2.4 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng của phản ứng PCR nhân đoạn gen osDREB1F ở lúa 1 Thành phần Thể tích(µl) 2 Nước khử ion vô trùng 12,85 3 Buffer 10X 2,5 4 dNTP (25mM) 2,5 5 Mg2+ (25mM) 2,5 6 DREB1F (10mM) 1 7 DREB1R (10mM) 1 8 Taq- polymerase(5U/µl) 0.15 9 Khuôn DNA(100ng/µl) 2 10 Tổng 25 Chu kỳ nhiệt: 94oC: 3 phút; lặp lại 30 chu kỳ (94oC- 1 phút, 56oC- 1 phút, 72oC- 1 phút 30 giây); 72oC- 10 phút; 4oC - ∞. Sau chu kỳ cuối cùng, chuyển về nhiệt độ 4oC bảo quản trước khi tinh sạch, bảo quản ở -20oC. Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kít của Hãng Bioneer (AccuPrep PCR Purification Kít) theo qui trình như sau: - Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm - Bổ sung đệm hòa tan (GB - Gel binding buffer) theo tỉ lệ: Vmẫu : VGB: V Izopropanol = 1 : 3 : 1 (1µl tương ứng với 1mg mẫu). Ủ ở 60o trong 10 phút, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút cho gel tan hoàn toàn. - Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột Qiaquick spin colum, ly tâm 13000v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. 10
- Bổ sung 500 µl dung dịch GB, để 2 phút ở nhiệt độ phòng cho dung dịch GB tiếp xúc hoàn toàn với sản phẩm PCR sau đó ly tâm 13000v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. - Rửa màng lọc chứa DNA của PCR bằng cách cho 500 µl dung dịch WB (Washing buffer) lên trên màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, rồi bỏ dịch dưới. Ly tâm lại lần hai đảm bảo cho màng chứa DNA của PCR thật khô. - Chuyển cột lọc sang ống eppendorf mới, bổ sung 30 µl dung dịch EB (Elution buffer) lên trên màng lọc, để nhiệt độ phòng 2 phút, đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, sau đó bỏ cột. Thu mẫu DNA đã được tinh sạch. Bảo quản ở -200C. Gắn gen vào vector tách dòng và biến nạp vector tái tổ hợp - Sản phẩm PCR làm sạch từ thôi gen được gắn vào vector tách dòng pBT sử dụng bộ kit pGEM – T System. Bảng 2.5. Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng Tên hóa chất Thể tích (µl) Nước tinh khiết 12,2 DNA khuôn (50ng/μl) 4 Vector pBT 1 Ligation buffer 10X 2 Enzyme T4 ligase (2 unit/μl) 0,8 Tổng thể tích 20 - Hỗn hợp được ủ ở 220C trong 2 giờ, sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli Vector tái tổ hợp được đưa vào tế bào E. coli chủng DH5α bằng một quá trình gọi là chuyển nạp (transformation). Đó là quá trình tạo cho plasmid đã 11
được gắn nối, tiếp xúc với tế bào thích ứng nhằm tạo điều kiện cho chúng xuyên qua màng vào trong nguyên sinh chất. Khi đã được chuyển nạp, plasmid (có thể tái tổ hợp hoặc không) sẽ cùng nhân lên cùng với tế bào chủ khi nuôi trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Quy trình biến nạp như sau: Bổ sung 7µl vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến Ecoli DH 5α và trộn nhẹ, rồi ủ trong đá lạnh (0 – 4oC) trong 30 phút, cho plasmid xuyên qua màng chuyển nạp vào tế bào. Sau đó hỗn hợp được xử lý sốc nhiệt ở 42oC trong 1 phút và ngay lập tức chuyển vào ủ trên đá lạnh trong 5 phút. Bổ sung 400µl môi trường LB lỏng (pepton, cao nấm men, NaCl) vào hỗn hợp rồi đem hỗn hợp nuôi lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ ở 37oC để vi khuẩn tái tổ hợp nhân lên trong vài chu kỳ sinh trưởng và phát triển. Sử dụng que cấy trải, trải 100 - 150µl dịch khuẩn lên đĩa môi trường LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agarose) có chứa kháng sinh ampicillin (100mg/l), X-gal (40mg/l) và IPTG (100µM). Ủ đĩa ở 37oC trong 16 - 20 giờ. Chọn dòng bằng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc Sau khi biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli, chọn lọc trên môi trường thạch có chứa 100mg/l ampicillin, X-gal (4mg/l), IPTG (100μM), ủ đĩa ở 370C trong 16 - 20 giờ sẽ thu được các khuẩn lạc xanh trắng. Chọn 10 khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu để tiến hành phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18(có trình tự bắt cặp mồi trên vector và cách nhau khoảng 0,2kb). Thành phần phản ứng colony-PCR tương tự như trong phản ứng PCR chỉ khác cặp mồi sử dụng và mẫu DNA thay bằng khuẩn lạc. Điện di sản phẩm colony-PCR trên gel agarose 1% để chọn ra các khuẩn lạc chứa plasmit như mong muốn. Đồng thời, nuôi những khuẩn lạc này trong 3 ml môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin 100mg/l nhằm mục đích tách plasmit. Tách DNA plasmid tái tổ hợp - Tách plasmit được sử dụng đệm chiết TELT: Tris-HCl 0,5M, pH=7,5; EDTA 0,5M ,pH=8,0; LiCl 1M ; Trion X-100. 12
- Thành phần dung dịch lysozym: lysozym; Tris-HCl 0,5M, pH=7,5; EDTA. 0,5M, pH=8,0. Quy trình: - Chọn các khuẩn lạc trắng riêng rẽ, nuôi trên môi trường LB lỏng có bổ sung 50mg/l ampicillin qua đêm ở 37oC. - Lấy 2ml dịch khuẩn đã nuôi qua đêm cho vào ống eppendorf 2ml, ly tâm 10000v/p trong 7 phút, loại dịch. - Bổ sung 200μl TELT, 10μl lysozym, khuấy tan để khuẩn tan hết. - Để nhiệt độ phòng trong 5 phút, ủ ở 95oC trong 3 phút, ủ 4oC trong 5 phút, ly tâm 13000v/p trong 15 phút. - Hút dịch nổi sang ống eppendorf 1,5ml, bổ sung một lượng tương đương isopropanol, ly tâm 13000v/p trong 15 phút. - Loại dịch nổi, rửa tủa 2 lần bằng cồn 70%. - Làm khô plasmit bằng máy Speed Vac. - Hoà tan Plasmit trong 40 ml nước cất khử ion khử trùng. - Bổ sung 0,1μl RNase, ủ ở 37oC trong 2 giờ. - Tinh sạch plasmit để đọc trình tự. Quy trình tinh sạch plasmit - Bổ sung PB theo tỉ lệ Vmẫu : VPB = 1 : 5, mix nhẹ. - Cho hỗn hợp dung dịch vào cột tinh sạch, li tâm 13000v/p trong 1 phút. - Loại dịch, ly tâm bổ sung 1 phút để loại sạch đệm rửa. Cho cột tinh sạch vào ống eppendorf 1,5ml. - Bổ sung 30μl nước khử ion khử trùng, để nhiệt độ phòng 1-2phút, ly tâm 13000v/p trong 1 phút. 7.3.2.4. Ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy in vitro trong việc đánh giá và nâng cao khả năng chống chịu ở cây trồng 7.3.2.4.1. Cơ sở khoa học của kĩ thuật nuôi cấy in vitro Cơ sở khoa học đầu tiên là tính toàn năng của tế bào thực vật. Mỗi một tế bào bất kỳ lấy từ cơ thể thực vật đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Điều này đã được các nhà khoa học chứng minh qua nhiều thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật [6], [24], [27]. 13
Cơ sở thứ hai là mô hoặc quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm một số lượng lớn các tế bào không đồng nhất. Vì thế, quần thể tế bào nuôi cấy có thể xem như quần thể thực vật mà ở đó cũng diễn ra những thay đổi về kiểu gen, kiểu hình và tuổi. Khi những tế bào được tái sinh thành cây sẽ thể hiện thay đổi đó ở mức độ cơ thể. Thậm chí có những quần thể tế bào phát triển từ một tế bào ban đầu nhưng trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển tế bào đến khi thành một cơ thể hoàn chỉnh có thể diễn ra nhiều thay đổi di truyền do ảnh hưởng của các yếu tố môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các chất điều hoà sinh trưởng. Tế bào nuôi cấy in vitro có tỉ lệ biến dị di truyền lớn vì thế có thể chọn được các cá thể đột biến nhanh hơn và có hiệu quả hơn so với các phương pháp chọn giống thông thường khác áp dụng trên cây nguyên vẹn. Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào còn cho phép làm giảm đáng kể thời gian cần thiết để chọn được những tính trạng mong muốn [6], [24], [27]. Những hệ thống nuôi cấy đã được sử dụng trong chọn dòng tế bào soma: + Nuôi cấy mô sẹo + Nuôi cấy tế bào huyền phù + Nuôi cấy tế bào trần Các phương pháp chọn dòng tế bào + Chọn dòng trực tiếp + Chọn dòng tổng thể + Chọn dòng tổng thể Các tế bào dị dưỡng thực vật thường được chọn bằng phương thức xử lý đột biến và nuôi trên môi trường có chứa yếu tố dinh dưỡng cần thiết có khi lại chính là yếu tố gây đột biến. Tuy nhiên cũng cần kiểm tra cả mức độ di truyền và mức độ phân tử qua các thế hệ. Những thay đổi tính trạng do đột biến là những tính trạng di truyền cho thế hệ sau bằng sinh sản hữu tính. Đột biến DNA 14
nhân sẽ phân li theo định luật Mendel sau khi lai, còn đột biến DNA cơ quan tử như lục lạp và ti thể là di truyền theo dòng mẹ [27], [30]. 7.3.2.4.2.Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nâng cao khả năng chống chịu ở cây trồng Để nâng cao khả năng chống chịu ở cây trồng, các tác giả đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để chọn các dòng có khả năng chống chịu tốt và duy trì dòng chống chịu đó để làm giống, cải thiện những giống gốc không có khả năng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi như chịu nhiệt độ thấp [16], [24], [37], [38], chịu nóng [23], chịu mặn [13], [15], [29], [37], [39], chịu hạn [20], [21], [25], [26]. Một hướng nghiên cứu mới cũng được quan tâm nghiên cứu và thu được nhiều thành công đáng kể là chuyển gen liên quan đến tính chống chịu vào cây trồng, sau đó ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nâng cao khả năng chống chịu cho cây [48]. Khả năng chống chịu với nhiệt độ cũng như khả năng chống chịu với các tác động bất lợi của ngoại cảnh khác liên quan đến sự có mặt của các chất có khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào như prolin, protein tan, glicinebetain, đường tan… Alia và cs (1998) đã chuyển gen CodA mã hóa enzyme cholin oxidase vào arabidopsis, sau đó tiến hành nuôi cấy in vitro thu được cây chuyển gen có sự tích lũy hàm lượng cao glycinebetain trong hạt, nâng cao đáng kể khả năng chịu nóng trong suốt giai đoạn hút nước và nảy mầm của hạt cũng như trong giai đoạn sinh trưởng của cây non [34]. Honghong Hu và cs (2004) đã biểu hiện thành công gen NAM, ATAF và CUC (viết tắt là NAC) giúp làm tăng tính chịu hạn và chịu mặn ở cây lúa Zhonghan số 5 [42]. Benze Xiao và cs (2007) đã nghiên cứu chuyển gen LEA 3-1 vào giống lúa Zhonghua 11. Kết quả nghiên cứu cho thấy, các dòng lúa chuyển gen có khả năng chịu mặn cao hơn so với đối chứng [36]. Qiuyun Wang và cs (2008) đã chuyển gen OsDREB1F vào arabidopsis và lúa sau đó ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro đã tạo ra được các dòng cây chuyển gen có khả năng chịu lạnh cao hơn so với đối chứng [48]. 15