Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu tạo dòng và tối ưu điều kiện biểu hiện gen mã hóa nattokinase trong Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:29

Thêm vào BST

Báo xấu

10
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài “Nghiên cứu tạo dòng và tối ưu điều kiện biểu hiện gen mã hóa nattokinase trong Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp” nhằm mục đích cung cấp nguồn dược chất tự nhiên cho các ứng dụng trong lĩnh vực y dược học.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu tạo dòng và tối ưu điều kiện biểu hiện gen mã hóa nattokinase trong Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp

ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ ANH THƢ NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG VÀ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA NATTOKINASE TRONG Bacillus subtilis BD170 TÁI TỔ HỢP TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HUẾ, 2024
Công trình đã đƣợc hoàn thành tại: Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. NGUYỄN HOÀNG LỘC Phản biện 1: GS.TS. Nghiêm Ngọc Minh Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Phản biện 2: PGS.TS. Lê Việt Dũng Trường Đại học Cần Thơ Phản biện 3: PGS.TS. Nguyễn Hữu Quân Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên Luận án sẽ bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Đại học, họp tại: Đại học Huế. Vào hồi …. giờ ….ngày …. tháng ….. năm …… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia. - Thư viện Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế
ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ ANH THƢ NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG VÀ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA NATTOKINASE TRONG Bacillus subtilis BD170 TÁI TỔ HỢP TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 9 42 02 01 Ngƣời hƣớng dẫn Khoa học: GS.TS. NGUYỄN HOÀNG LỘC HUẾ, 2024
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Nhồi máu cơ tim và các bệnh tim mạch là những bệnh rất nghiêm trọng, ảnh hưởng lớn đến sức khỏe con người và là nguyên nhân chính gây đột tử ở người. Ở người bình thường, sự tích tụ fibrin và phân hủy fibrin trong máu được duy trì cân bằng, tuy nhiên khi fibrin không bị phân hủy gây nên sự mất cân bằng, dẫn đến nhồi máu cơ tim và các rối loạn đông máu khác. Khi đó, máu đông sẽ hình thành trong thành mạch. Theo thời gian, cholesterol có xu hướng bám vào thành động mạch tạo các mảng bám trong động mạch máu. Nếu các mảng bám bị vỡ, máu sẽ đông lại dẫn đến sự tắc nghẽn dòng máu lưu thông trong động mạch. Ngoài ra, cục máu đông có thể tự tách ra và di chuyển đến các vị trị khác theo dòng tuần hoàn máu đến bất cứ cơ quan nào trong cơ thể người và có thể gây nên những nguy hiểm nghiêm trọng. Bacillus là một trong những nhóm vi sinh vật được ứng dụng nhiều nhất để sản xuất enzyme, phụ gia thực phẩm, vitamin, kháng sinh và thuốc diệt côn trùng. Bên cạnh ưu điểm sản xuất protein ngoại bào mạnh, vi khuẩn thuộc chi Bacillus còn sử dụng sản xuất các protein tái tổ hợp không glycosyl hóa do đặc tính di truyền của chúng được nghiên cứu rất kỹ và dễ dàng kiểm soát quá trình sinh tổng hợp thông qua các kỹ thuật di truyền. Trên cơ sở đó, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo dòng và tối ƣu điều kiện biểu hiện gen mã hóa nattokinase trong Bacillus subtilis BD170 tái tổ hợp” nhằm mục đích cung cấp nguồn dược chất tự nhiên cho các ứng dụng trong lĩnh vực y dược học. 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ NATTOKINASE 1.1.1. Đặc điểm của nattokinase Nattokinase được mã hóa bởi gen aprN và được sinh tổng hợp ở dạng tiền chất với tín hiệu peptide và trình tự propeptide nằm ở đầu tận cùng NH2 trong cấu trúc enzyme. 1.1.2. Nguồn sản xuất nattokinase Nattokinase được sản xuất từ các nguồn vi sinh vật khác nhau, chủ yếu từ thực phẩm lên men như Natto của Nhật Bản, Chungkook- jang và Meju của Hàn Quốc, Gembus của Indonesia, Douchi của Trung Quốc. 1.1.3. Ứng dụng của nattokinase - Ứng dụng trong chống đông máu - Các ứng dụng khác 1.2. HỆ THỐNG BIỂU HIỆN BACILLUS SUBTILIS 1.2.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis B. subtilis thuộc giới vi khuẩn, ngành Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ Bacillaceae, chi Bacillus, loài Bacillus subtilis. B. subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+). 1.2.2. Hệ thống vector biểu hiện ở Bacillus Hệ thống vector biểu hiện cho Bacillus, đặc biệt cho B. subtilis được chia thành hai nhóm chính: Nhóm vector biểu hiện là các plasmid tồn tại độc lập với hệ gen vật chủ; nhóm vector biểu hiện mang các trình tự tương đồng với một vị trí đích trên genome của B. subtilis từ đó có thể dung hợp và tồn tại cùng với genome của B. subtilis thông qua cơ chế tái tổ hợp tương đồng. 1.3. TINH SẠCH ENZYME BẰNG HỆ 2 PHA NƢỚC Hệ hai pha nước (ATPS) được tạo thành nhờ sự kết hợp giữa hai polymer hoặc giữa polymer với một muối vô cơ. 2
Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Các chủng Bacillus subtilis tự nhiên C10 và N05 do Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế cung cấp. Giống chuẩn B. subtilis BD170 (ATCC® 33608™) do GS. Seung-Moon Park (Đại học Quốc gia Chonbuk, Hàn Quốc) cung cấp. Vector pCR®2.1 được sử dụng để tạo dòng gen trong vi khuẩn E. coli TOP10 (Invitrogen, Mỹ) và vector pHT43 được sử dụng để biểu hiện gen trong B. subtilis BD170. 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phân lập gen mã hóa nattokianse từ các chủng B. subtilis C10 và N05 - Tách chiết DNA tổng số - Khuếch đại PCR - Tinh sạch sản phẩm PCR 2.2.2. Tạo dòng gen mã hóa nattokinase trong tế bào E. coli TOP10 - Tạo dòng gen mã hóa nattokinase trong vector pCR®2.1 - Phân lập gen natC10 và nat05 từ vector pCR® 2.1 tái tổ hợp - Gắn gen natC10 và nat05 vào vector biểu hiện pHT43 2.2.3. Biến nạp vector pHT43/natC10 và pHT43/nat05 vào Bacillus subtilis BD170 - Chuẩn bị vector tái tổ hợp và tế bào Bacillus subtilis BD170 khả biến - Biến nạp vector pHT43 tái tổ hợp vào Bacillus subtilis BD170 - Kiểm tra sự hiện diện của vector pHT43 tái tổ hợp 3
2.2.4. Biểu hiện nattokinase bằng hệ thống vector pHT43 - Cảm ứng sinh tổng hợp nattokinase - Thu nhận protein ngoại bào - Điện di SDS-PAGE - Điện di zymogram 2.2.5. Xác định hoạt tính nattokinase - Xác định hoạt độ protease tổng số - Xác định hoạt độ nattokinase 2.2.6. Ảnh hƣởng của một số yếu tố lên hoạt tính phân giải fibrin 2.2.7. Thử nghiệm khả năng phân giải fibrin trong máu thỏ bằng nattokinase tái tổ hợp 2.2.8. Tinh sạch nattokinase tái tổ hợp bằng hệ hai pha nƣớc - Chuẩn bị hệ hai pha nước - Tinh sạch nattokinase bằng chiết ngược 2.2.9. Xử lý thống kê Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NATTOKINASE TỪ CÁC CHỦNG B. SUBTILIS 3.1.1. Khuếch đại gen mã hóa nattokinase từ các chủng B. subtilis DNA tổng số của chủng B. subtilis N05 được sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng khuếch đại với cặp mồi đặc hiệu (NatF và NatR). 4
5 kb 2 kb ~ 1,1 1 kb ~1,1 kb 0,85 kb M1 1 2 M2 Hình 3.1. Khuếch đại PCR với cặp mồi NatF và NatR từ DNA tổng số. 1: sản phẩm PCR từ chủng B. subtilis N05, 2: sản phẩm PCR từ chủng B. subtilis C10, M1: thang chuẩn kích thước DNA (GeneRuler 100 bp DNA Ladder, Bio-Rad, Mỹ) và M2: thang chuẩn kích thước DNA (5 kb DNA ladder, Thermo Scientific, Mỹ). Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng GenJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific, Mỹ), kết quả điện di trên gel agarose 0,8% được trình bày ở hình 3.2 cho thấy xuất hiện các băng DNA đúng kích thước mong muốn, có thể sử dụng cho các thí nghiệm tạo dòng tiếp theo. 5
5 kb 2 kb ~1,1 kb 0,85 kb ~1,1 kb 1 kb 1 M1 2 M2 Hình 3.2. Tinh sạch sản phẩm PCR. 1: sản phẩm PCR từ chủng N05, 2: sản phẩm PCR từ chủng C10; M1: thang chuẩn kích thước DNA (5 kb DNA ladder, Thermo Scientific, Mỹ) và M2: thang chuẩn kích thước DNA (GeneRuler TM 1 kb DNA Ladder, Thermo Scientific, Mỹ). 3.1.2. Tạo dòng gen nattokinase giả định trong vector pCR®2.1 Kết quả trên hình ảnh điện di cho thấy cả 10 khuẩn lạc đều có sản phẩm khuếch đại PCR với kích thước mong muốn, như vậy cả 10 khuẩn lạc đều chứa vector pCR® 2.1 có mang gen nattokinase giả định từ 2 chủng B. subtilis N05 và C10. Các khuẩn lạc sau đó được nuôi cấy để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 6
~1,1 kb 1 2 3 M1 NC 4 5 ~1,1 kb M2 6 7 8 9 10 Hình 3.3. Kiểm tra khuẩn lạc mang sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu. M1: thang chuẩn kích thước DNA (GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder), M2: thang chuẩn kích thước DNA (GeneRuler 100 bp DNA Ladder). NC: đối chứng âm không có vector khuôn mẫu, 1-5: các khuẩn lạc mang sản phẩm PCR từ chủng N05. 6-10: các khuẩn lạc mang sản phẩm PCR từ chủng C10. Hình 3.4. Sơ đồ vector pCR®2.1 (Invitrogen, Mỹ) mang gen mã hóa nattokinase. Nat: gen nat05 hoặc natC10, M13 primer: vị trí gắn mồi M13, T7 promoter: trình tự của promoter T7. 7
3.1.3. Xác định trình tự gen nattokinase giả định từ các chủng B. subtilis Kết quả phân tích trình tự sản phẩm PCR từ chủng B. subtilis N05 từ khuẩn lạc số 4 cho thấy đoạn nucleotide có chiều dài 1146 bp, tương đồng 98,17% với gen aprN (mã số là KJ174338) đã được sử dụng để thiết kế mồi. Như vậy, sản phẩm PCR thu được là gen mã hóa cho nattokinase tương tự như gen aprN, gen được đặt tên là nat05 và được ký gửi ở GenBank với mã số KU341115. Tương tự, sản phẩm PCR từ chủng B. subtilis C10 từ khuẩn lạc số 6 cũng có chiều dài 1146 bp như nat05, tương đồng 99,65% với gen aprN (KJ174338). Gen được đặt tên là natC10 và được ký gửi ở GenBank với mã số là KU341112. 3.2. TẠO DÒNG GEN nat05 VÀ natC10 TRONG B. SUBTILIS BD170 3.2.1. Tạo dòng gen nat05 và natC10 vào vector pHT43 Các vector pCR®2.1/nat05 và pCR®2.1/natC10 sau khi tách chiết từ các dòng E. coli TOP10 tái tổ hợp được cắt bằng các enzyme hạn chế BamHI và XmaI, và tinh sạch để sử dụng. Vector pHT43 cũng được mở vòng bằng 2 enzyme tương tự. Sau khi tinh sạch các gen nat05, natC10 và vector pHT43 từ các phản ứng cắt hạn chế và thực hiện phản ứng gắn, các sản phẩm gắn đã được biến nạp vào E. coli TOP10. Các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pHT43/nat05 và pHT43/natC10 được kiểm tra bằng khuếch đại PCR. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy các gen nat05 và natC10 đã hiện diện trong vector pET43 (Hình 3.7). 8
1.146 bp 1 kb 1 2 M Hình 3.7. Kiểm tra sự hiện diện gen mã hóa nattokinase trong vector pHT43 ở chủng vi khuẩn E. coli TOP10 bằng phản ứng PCR. M: thang chuẩn kích thước DNA (GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder), 1: gen nat05, 2: gen natC10. Hình 3.8. Sơ đồ vector pHT43 (MoBiTec, Mỹ) mang gen mã hóa nattokinase. Nat: gen nat05 hoặc natC10, Amp: gen kháng ampiciline, ColE1 ori: điểm khởi đầu sao chép, Pgrac01: promoter, lacl: gen lacl, SP amyQ: tín hiệu peptide SP amyQ. 9
3.2.2. Biến nạp vector pHT43 tái tổ hợp vào B. subtilis BD170 Các vector tái tổ hợp pHT43/nat05 và pHT43/natC10 được biến nạp vào chủng B. subtilis BD170 bằng phương pháp hóa biến nạp, thể biến nạp đã được kiểm tra bằng khuếch đại PCR với cặp mồi đặc hiệu (5 khuẩn lạc/gen). Kết quả trình bày ở hình 3.8 cho thấy các vector pHT43/nat05 và pHT43/natC10 đã được biến nạp thành công vào B. subtilis BD170. Các dòng B. subtilis BD170 mang vector pHT43/nat05 được ký hiệu là R1, R2, R3, R4, và R5 trong khi các dòng mang vector pHT43/natC10 được ký hiệu là TC1, TC2, TC3, TC4 và TC5. Như vậy, vector pET43 tái tổ hợp đã được tạo dòng thành công vào vật chủ B. subtilis BD170, các khuẩn lạc mang gen sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. ~1,1 kb R1 R2 R3 R4 M1 R5 PC ~1,1 kb TC1 TC2 TC3 M2 NC TC4 TC5 Hình 3.9. Kiểm tra sự hiện diện của vector pHT43 tái tổ hợp trong B. subtilis BD170 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. PC: đối 10
chứng dương; NC: đối chứng âm là chủng B. subtilis BD170 thương mại; M1: thang chuẩn kích thước DNA (100 bp PCR Molecular Ruler); M2: thang chuẩn kích thước DNA (GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder). R1-R5: các khuẩn lạc mang vector pHT43/nat05. TC1-TC5: các khuẩn lạc mang vector pHT43/natC10. 3.3. BIỂU HIỆN NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP TRONG B. SUBTILIS BD170 3.3.1. Xác định dòng B. subtilis BD170 biểu hiện nattokinase mạnh Các dòng B. subtilis BD170 có chứa vector tái tổ hợp pHT43/nat05 và pHT43/natC10 được sử dụng để kiểm tra khả năng sinh tổng hợp nattokinase bằng cách quan sát vòng phân giải với cơ chất skim milk (cho hoạt tính protease) và fibrinogen (cho hoạt tính nattokinase). A B R4 TC1 NC1 TC5 R3 NC TC2 R5 NC2 TC4 R2 TC3 R1 1 cm Hình 3.10. Vòng phân giải skim milk của các dòng B. subtilis BD170 tái tổ hợp khi cảm ứng IPTG ở nồng độ 1 mM. A. các dòng mang gen nat05 (R1-R5), B. các dòng mang gen natC10 (TC1-TC5). NC. Đối chứng âm, NC1 và NC2: dịch nuôi cấy của chủng B. subtilis BD170 không biến nạp. 11
Từ kết quả đánh giá hoạt tính protease, dòng R4 được lựa chọn để xác định hoạt tính thủy phân fibrinogen cũng như nồng độ chất cảm ứng IPTG thích hợp để sinh enzyme ngoại bào. Kết quả trình bày ở hình 3.11 cho thấy hoạt tính thủy phân fibrinogen thể hiện rất mạnh, sau 8 giờ phản ứng, hiệu số D-d ở mẫu được cảm ứng với 4 mM IPTG có kích thước lớn nhất (12 cm), trong khi đó các mẫu đối chứng NC1 và NC2 có giá trị thấp hơn nhiều (khoảng 4 và 2 mm). 4 mM 5 mM 1 mM NC1 3 mM 2 mM NC2 1 cm Hình 3.11. Vòng phân giải fibrinogen của dòng R4 khi được cảm ứng với IPTG ở các nồng độ khác nhau (1-5 mM). NC1 và NC2: dịch nuôi cấy của chủng B. subtilis BD170 không biến nạp. 3.3.2. Đặc điểm của nattokinase tái tổ hợp ở dòng R4 3.3.2.1. Khối lượng phân tử Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy ở dòng R4 xuất hiện 1 băng protein có khối lượng phân tử khoảng 27,5 kDa, tương đương với khối lượng phân tử của phần mang chức năng subtilisin của enzyme nat05 tái tổ hợp (250 amino acid từ vị trí 132 đến 381) (Hình 3.12A). 12
A kDa B kDa 50 70 40 35 40 ~ 27,5 kDa 35 25 ~ 27,5 kDa 25 NC1 R4 M NC1 R4 Hình 3.12. Điện di SDS-PAGE (A) và điện di cơ chất (B) của dịch enzyme ngoại bào. M: PageRuler prestained protein ladder, NC1: chủng B. subtilis BD170, R4: dòng B. subtilis BD170 tái tổ hợp mang gen nat05 được cảm ứng bằng 4 mM IPTG. 3.3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ Kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính phân giải fibrin được thể hiện trong bảng 3.2. Trong các nhiệt độ được khảo sát, hoạt tính của enzyme tăng dần từ 33oC đến 37oC (HĐR cao nhất là 441,27 U/mg protein) sau đó giảm đáng kể ở khoảng nhiệt độ cao hơn 37oC. HĐR của enzyme tại 37oC cao hơn hẳn so với hoạt tính của mẫu đối chứng (HĐR 261,66 U/mg). 13
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính nattokinase của Nat05 NC R4 Nhiệt độ HĐC HĐR HĐC o HĐR (U/mg) ( C) (U/mL) (U/mg) (U/mL) 68,67 ± 234,36 ± 80,73 ± 384,44 ± 33 c c c 0,32 1,10 3,28 15,62c 75,10 ± 256,31 ± 86,70 ± 412,86 ± 35 b b b 0,92 3,13 2,03 9,67b 76,67 ± 261,66 ± 92,67 ± 441,27 ± 37 a a a 1,16 3,96 3,79 18,03a 74,00 ± 252,56 ± 84,37 ± 401,75 ± 39 b b bc 0,62 2,13 3,59 17,11bc 67,90 ± 231,74 ± 79,67 ± 379,37 ± 41 c c c 0,61 2,08 0,97 4,63c Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ ra sự sai khác có ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p < 0,05 (Duncan's test). 3.3.2.3 Ảnh hưởng của pH Ở các khoảng pH được khảo sát, hoạt tính enzyme tăng dần từ 5 tới 9 (HĐR cao nhất là 467,46 U/mg) (Bảng 3.3). Như vậy, enzyme Nat05 thuộc nhóm alkaline giống như các enzyme khác đã được công bố. Kết quả phân tích hoạt độ cũng cho thấy Nat05 kém bền ở điều kiện acid và tương đối bền trong điều kiện kiềm, hoạt độ enzyme ở pH 5 chỉ đạt khoảng 77% so với ở pH 9. Việc xác định đúng khoảng pH phù hợp để enzyme hoạt động tốt nhất rất quan trọng cho việc ứng dụng sau này. 14
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính nattokinase của Nat05 NC R4 HĐC HĐR HĐC HĐR pH (U/mL) (U/mg) (U/mL) (U/mg) 205,46 ± 364,60 ± 5 60,20 ± 2,15d c 76,57 ± 2,14c 7,34 10,18c 208,65 ± 376,19 ± 6 61,13 ± 1,78d c 79,00 ± 6,00c 6,07 28,57c 229,35 ± 82,30 ± 391,90 ± 7 67,20 ± 0,20c bc bc 0,68 2,52 12,02bc 256,66 ± 418,57 ± 8 75,20 ± 1,56b b 87,90 ± 4,20b 5,33 20,00b 302,50 ± 467,46 ± 9 88,63 ± 3,71a a 98,17 ± 0,49a 12,65 2,35a 267,69 ± 82,43 ± 392,54 ± 10 78,43 ± 0,38b bc bc 1,29 0,91 4,32bc Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ ra sự sai khác có ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p < 0,05 (Duncan's test). 3.3.3.3. Ảnh hưởng của ion kim loại và các chất hoạt động bề mặt Kết quả khảo sát ảnh hưởng của ion kim loại và các chất hoạt động bề mặt lên hoạt tính nattokinase được thể hiện ở bảng 3.4. Trong các ion kim loại và chất hoạt động bề mặt được khảo sát, hoạt tính của Nat05 giảm khi có mặt ion Ca2+ (75,23%) hoặc Cu2+ (22%) ở nồng độ 5 mM hoặc chất tẩy không ion Tween 20 (87,39%) ở nồng độ 1 mM. SDS ở nồng độ 1 mM ức chế mạnh hoạt tính của enzyme (8,24%). Hoạt tính enzyme tăng đáng kể khi có mặt Triton X-100 1 mM (155,26%). Điều này thể hiện rằng nồng độ ion có ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng và giảm hoạt tính của enzyme. 15
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của các ion kim loại và chất hoạt động bề mặt lên hoạt tính nattokinase của Nat05 Chất khảo sát So với đối chứng (%) 2+ Ca 75,23 ± 0,60b Cu2+ 21,74 ± 0,26c SDS 8,24 ± 0,10c Tween 20 87,39 ± 0,82b Triton X-100 155,26 ± 23,21a Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ ra sự sai khác có ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p < 0,05 (Duncan's test). 3.3.3.4. Khả năng phân giải cục máu đông của nattokinase tái tổ hợp Trong thí nghiệm này, cục máu đông thỏ được cho vào 3 ống nghiệm chứa 5 mL nước muối sinh lý, trong đó ống số 1 là đối chứng không có enzyme, ống số 2 chứa 500 µL dịch enzyme Nat05 được kết tủa bằng acetone, ống số 3 chứa 500 µL dịch enzyme Nat05 được kết tủa bằng muối trung tính (NH4)2SO4. Hình 3.13. Thử nghiệm khả năng phân giải cục máu đông thỏ bằng enzyme tái tổ hợp. (A): sau 15 phút, (B): sau 1 giờ và (C): sau 12 giờ thử nghiệm. DC: đối chứng, AC: kết tủa bằng acetone, NH4: kết tủa bằng muối trung tính (NH4)2SO4. 16