Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ: Nghiên cứu khả năng tăng trưởng và tích lũy các chất chống oxy hóa của Vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 dưới ảnh hưởng của các điều kiện ức chế

Chia sẻ: Mucnang Mucnang | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:81

Thêm vào BST

Báo xấu

44
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của đề tài là khảo sát sự tăng trưởng của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 và sự tăng trưởng của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiện ức chế. Xác định hàm lượng carotenoid tổng, khả năng chống oxy hóa, hàm lượng phenolic tổng, hàm lượng lipid, diệp lục tố và trọng lượng khô của vi tảo. - Xác định hàm lượng β-carotene tích lũy trong vi tảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ: Nghiên cứu khả năng tăng trưởng và tích lũy các chất chống oxy hóa của Vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 dưới ảnh hưởng của các điều kiện ức chế

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH CHU NGỌC PHƯỢNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY CÁC CHẤT CHỐNG OXY HÓA CỦA VI TẢO DUNALIELLA BARDAWIL DCCBC 15 DƯỚI ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN ỨC CHẾ Chuyên ngành: Quản lý và cung ứng thuốc KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Hướng dẫn khoa học: TS. Võ Hồng Trung TPHCM – 2018
LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan đây là báo cáo khóa luận của riêng em. Các thông tin, số liệu sử dụng phân tích và kết quả nghiên cứu được nêu trong khóa luận là trung thực, khách quan, có nguồn gốc rõ ràng, hoàn toàn được hình thành và phát triển trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu của em tại Bộ môn Hóa sinh – Độc chất trường Đại học Nguyễn Tất Thành, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Võ Hồng Trung. Các luận điểm, dữ liệu được trích dẫn đầy đủ nếu không là ý tưởng hoặc kết quả tổng hợp của chính bản thân em. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 02 tháng 10 năm 2018 Sinh viên ký tên CHU NGỌC PHƯỢNG
LỜI CẢM ƠN Sau mô ̣t thời gian thực hiê ̣n khóa luâ ̣n tố t nghiê ̣p đế n nay, mo ̣i công viê ̣c liên quan đế n khóa luâ ̣n đã hoàn tấ t. Trong suố t thời gian này, em đã nhâ ̣n đươ ̣c nhiề u sự giúp đỡ. Ở phầ n đầ u tiên của khóa luâ ̣n, cho phép em có đôi điề u gởi đế n những người mà em vô cùng biế t ơn. Em xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô Khoa Dược Trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã tận tình giảng dạy cho chúng em trong suốt quá trình học tập tại trường. Đă ̣c biê ̣t, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Võ Hồ ng Trung, Trưởng Bô ̣ môn Hóa sinh - Đô ̣c chấ t, Khoa Dươ ̣c Trường Đa ̣i ho ̣c Nguyễn Tấ t Thành, người đã trực tiếp hướng dẫn, tâ ̣n tâm truyền đạt cho em nhiều kiến thức thực tế quý báu về nghiên cứu khoa ho ̣c và giúp đỡ cho em trong suố t quá trình thực hiê ̣n khóa luâ ̣n tố t nghiê ̣p ta ̣i Bô ̣ môn. Bên ca ̣nh đó, em muốn bày tỏ lòng biết ơn đến Quý Thầ y Cô Bô ̣ môn Hóa sinh - Đô ̣c chấ t, Khoa Dươ ̣c Trường Đa ̣i ho ̣c Nguyễn Tấ t Thành, đă ̣c biê ̣t là ThS. Nguyễn Thi ̣ Hồ ng Phúc đã nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ và tạo nhiều thuận lợi cho em trong quá trình thực hiê ̣n khóa luâ ̣n tố t nghiê ̣p này. Sau cùng, xin chân thành cảm ơn các ba ̣n cùng khóa Dươ ̣c 2013 và các em sinh viên khóa Dươ ̣c 2014 đang thực hiê ̣n các đề tài nghiên cứu khoa ho ̣c ta ̣i Bô ̣ môn Hóa sinh - Đô ̣c chấ t, những người luôn sát cánh cùng em, đô ̣ng viên, chia sẻ những kiế n thức, tình cảm, giúp đỡ em trong suố t quá triǹ h ho ̣c tâ ̣p và nghiên cứu.
MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................. iii DANH MỤC HÌNH ẢNH ....................................................................................... iv DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. vi ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3 1.1. Tổng quan về Dunaliella.................................................................................. 3 1.1.1. Giới thiệu vi tảo Dunaliella ...................................................................... 3 1.1.2. Hình dạng và cấu trúc tế bào Dunaliella .................................................. 3 1.1.3. Các chất có hoạt tính sinh học ở Dunaliella ............................................. 4 1.1.4. Cơ chế sinh tổng hợp carotenoid ở Dunaliella ......................................... 6 1.1.5. Các điều kiện ức chế ảnh hưởng lên sự tổng hợp carotenoid ................. 10 1.1.6. Mối quan hệ giữa con đường tổng hợp carotenoid và lipid .................... 16 1.2. β-carotene và vai trò đối với sức khỏe ........................................................... 19 1.2.1. Giới thiệu β-carotene............................................................................... 19 1.2.2. Vai trò của β-carotene đối với sức khỏe ................................................. 20 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................22 2.1. Chủng Dunaliella bardawil DCCBC 15 và môi trường nuôi cấy ................. 22 2.2. Phương pháp phân tích ................................................................................... 22 2.2.1. Quan sát hình thái tế bào ......................................................................... 22 2.2.2. Xác định mật độ tế bào và tốc độ tăng trưởng đặc hiệu.......................... 22 2.2.3. Xác định hàm lượng carotene tổng và diệp lục tố .................................. 23 2.2.4. Xác định khả năng chống oxy hóa .......................................................... 23 2.2.5. Xác định hàm lượng phenolic tổng ......................................................... 24 2.2.6. Xác định trọng lượng khô ....................................................................... 24 2.2.7. Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp sulfo-phospho-vanillin ... 24 2.2.8. Thu hoạch sinh khối tảo phân tích β-carotene ........................................ 25 i
2.3. Phương pháp thiết kế thí nghiệm ................................................................... 25 2.3.1. Khảo sát sự tăng trưởng của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl ................................................................... 25 2.3.2. Khảo sát sự tăng trưởng và tích lũy carotenoid của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau .............. 26 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...............................................................28 3.1. Kết quả ........................................................................................................... 28 3.2. Bàn luận .........................................................................................................54 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................60 4.1. Kết luận .......................................................................................................... 60 4.2. Kiến nghị ........................................................................................................ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt µg/mL Microgram/mL µL Microlit µM Micromol/lít AS Ánh sáng g/l Gram/lít M Mol/lít NPK Nitơ – Phosphor – Kali pg/tb Picogram/tế bào ROS Reactive oxygen species Gốc tự do oxy hóa tb/mL Tế bào/mL và cs. Cộng sự iii
DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Tế bào Dunaliella bardawil chụp dưới kính hiển vi điện tử [11] .............4 Hình 1.2. Sơ đồ sinh tổng hợp isoprenoid ở vi tảo Dunaliella salina [54] ...............8 Hình 1.3. Các con đường tổng hợp carotenoid ở các sinh vật tự dưỡng tạo oxy [54] ....... 10 Hình 1.4. Các cơ chế đáp ứng của tế bào D.salina đối với các ức chế môi trường [54] ... 13 Hình 1.5. Chu trình glycerol ở Dunaliella [11] .......................................................14 Hình 1. 6. Cấu trúc phân tử β-carotene ...................................................................20 Hình 3.1. Hình thái của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl .........................................................................................................................28 Hình 3.2. Mật độ tế bào và trọng lượng khô của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl ..........................................................................29 Hình 3.3. Hàm lượng diệp lục tố a trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl ...................................31 Hình 3.4. Hàm lượng diệp lục tố tổng trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl ...................................32 Hình 3.5. Hàm lượng carotenoid trên thể tích (a), trên tế bào (b) và tỷ lệ carotenoid/ diệp lục tố (c) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl .............. 34 Hình 3.6. Hình thái của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau ......................................................................................................36 Hình 3.7. Mật độ tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau ...............................................................................................37 Hình 3.8. Tro ̣ng lươ ̣ng khô của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau .......................................................................................37 Hình 3.9. Hàm lượng diệp lục tố a trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau ..................40 Hình 3.10. Hàm lượng diệp lục tố tổng trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau ..................41 iv
Hình 3.11. Hàm lượng carotenoid trên thể tích (a), trên tế bào (b) và tỷ lệ carotenenoid/diệp lục tố (c) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau .......................................................................................44 Hình 3.12. Hàm lượng β-carotene của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiện nuôi cấy ức chế khác nhau ...............................................................................47 Hình 3.13. Hàm lượng lipid trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau .....................................48 Hình 3.14. Hàm lượng phenolic trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau ..................50 Hình 3.15. Khả năng chống oxy hóa trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau ..................52 v
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Thí nghiệm ảnh hưởng của các điều kiện ức chế khác nhau lên sự tích lũy carotenoid của D.bardawil DCCBC 15 ...................................................................27 Bảng 3.1. Mật độ tế bào và trọng lượng khô của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl ..........................................................................30 Bảng 3.2. Hàm lượng diệp lục tố a, diệp lục tố tổng trên thể tích và trên tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl .........................33 Bảng 3.3. Hàm lượng carotenoid trên thể tích, trên tế bào và tỷ lệ carotenoid/diệp lục tố của D.bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl ..................35 Bảng 3.4. Mật độ tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau ...............................................................................................38 Bảng 3.5. Tro ̣ng lươ ̣ng khô của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau .......................................................................................39 Bảng 3.6. Hàm lượng diệp lục tố a trên thể tích và trên tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau .....................................42 Bảng 3.7. Hàm lượng diệp lục tố tổng trên thể tích và trên tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau ..................42 Bảng 3.8. Hàm lượng carotenoid trên thể tích của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau .........................................................45 Bảng 3.9. Hàm lượng carotenoid trên tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau .................................................................45 Bảng 3.10. Tỷ lệ carotenoid/diệp lục tố của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau .......................................................................46 Bảng 3.11. Hàm lượng β-carotene của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiện kiện nuôi cấy ức chế khác nhau .......................................................................47 Bảng 3.12. Hàm lượng lipid tổng trên thể tích và trên tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau .....................................49 vi
Bảng 3.13. Hàm lượng phenolic trên thể tích và tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau .....................................51 Bảng 3.14. Khả năng chống oxy hóa trên thể tích và trên tế bào của vi tảo D.bardawil DCCBC 15 dưới các điề u kiê ̣n nuôi cấy ức chế khác nhau ..................53 vii
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học – Năm học 2013 – 2018 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY CÁC CHẤT CHỐNG OXY HÓA CỦA VI TẢO DUNALIELLA BARDAWIL DCCBC 15 DƯỚI ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN ỨC CHẾ Chu Ngọc Phượng Hướng dẫn khoa học: TS. Võ Hồng Trung TÓM TẮT Mở đầ u: Nhu cầu sử dụng β-carotene trên thế giới ngày càng cao nhưng nguồn cung cấp chủ yếu là từ tổng hợp hóa học do đó Dunaliella bardawil DCCBC 15 được xem là nguồn sản xuất β-carotene tự nhiên tốt và có khả năng đáp ứng cao vì chứa các hợp chất có ứng dụng quan trọng trong dược phẩm như β-carotene, glycerol và các chất màu khác. Đố i tươ ̣ng và phương pháp nghiên cứu: Chủng tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 được sử dụng để khảo sát sự tăng trưởng trong môi trường MD4 1,5M NaCl và ảnh hưởng của ức chế H2O2 riêng rẽ và H2O2 kết hợp với ánh sáng cao, độ muối cao lên sự tăng trưởng, tích lũy các chất chống oxy hóa, đặc biệt là hàm lượng β-carotene tích lũy trong vi tảo. Kế t quả: Dunaliella bardawil DCCBC 15 tăng trưởng tốt trong môi trường MD4 1,5M NaCl, hàm lượng diệp lục tố tăng cao trong phase tăng trưởng, hàm lượng carotenoid tăng mạnh khi vi tảo đạt phase ổn định hoặc suy vong do cạn kiệt dinh dưỡng. Trong các điều kiện ức chế, sự tăng trưởng của Dunaliella bardawil DCCBC 15 bị ức chế, hàm lượng diệp lục tố duy trì ổn định, trong khi đó tăng tổng hợp lipid và các chất chống oxy hóa như carotenoid và phenolic. Trong đó ở điều kiện ức chế cạn kiệt dinh dưỡng và kết hợp với cường đô ̣ chiế u sáng ma ̣nh thì hàm lượng β-carotene cao hơn so với các điều kiện còn lại. Kế t luâ ̣n: Dunaliella bardawil DCCBC 15 là vi tảo lục đơn bào có khả năng tổng hợp lượng lớn β-carotene và các chất chống oxy hóa dưới các điều kiện ức chế ánh sáng cao và cạn kiệt dinh dưỡng. Do đó việc sản xuất β-carotene từ vi tảo này là một hướng nghiên cứu mới đầy tiềm năng, đồng thời tận dụng dải bờ biển dài của nước ta cho việc nuôi trồng loài vi tảo biển này. Từ khóa: Dunaliella bardawil DCCBC 15, môi trường MD4, β-carotene, khả năng chống oxy hóa. viii
Final assay for the degree of BS Pharm - Academic year: 2013 - 2018 STUDY ON THE GROWTH AND ACCUMULATION OF ANTIOXIDANTS OF DUNALIELLA BARDAWIL DCCBC 15 UNDER THE INFLUENCE OF INHIBITORY CONDITIONS Chu Ngọc Phượng Supervisor: Vo Hong Trung, Ph.D ABSTRACT Introduction: The demand for β-carotene in the world is increasing but the source of supply is mainly from chemical synthesis. Dunaliella bardawil DCCBC 15 is considered to be a good natural source of β-carotene production and highly responsive because it contains important pharmaceutical ingredients such as β-carotene, glycerol and other pigments. Materials and methods: Dunaliella bardawil DCCBC 15 was used to investigate growth in 1.5M NaCl MD4 medium and the effect of stress culturing conditions including separate H2O2 supplement and combination of H2O2 supplement with high light intensity and salt concentration on the growth and accumulation of antioxidants, especially β-carotene content in the microalgae. Results: Dunaliella bardawil DCCBC 15 in 1.5M NaCl MD4 medium was high growth rate, high chlorophyll content at exponental phase and carotenoid content reaching high level at stationary phase or death phase due to nutrient starvation of cultural medium. Under stress conditions, the growth of Dunaliella bardawil DCCBC 15 was inhibited and stable chlorophyll content while the biosynthesis of lipid and antioxidants such as carotenoids and phenolic increased. Under the stress conditions, the nutrient starvation and combination of high light intensity, the content of β-carotene is higher than the other stress conditions. Conclusion: Dunaliella bardawil DCCBC 15 is a unicellular green microalgae, be able to accumulate large amount of β-carotene and antioxidants under stress conditions such as nutrition starvation and high light intensity. Therefore, the β-carotene production from the microalgae is one of the studied prospects in future, expecially Viet Nam has long coastline. Keywords: Dunaliella bardawil DCCBC 15, MD4 medium, β-carotene, antioxidant capacity. ix
ĐẶT VẤN ĐỀ Carotenoid được biết đến như là chất chống oxy hóa mạnh có nguồn gốc tự nhiên giúp ngăn cản các tế bào bình thường chuyển thành các tế bào gây ung thư, làm chậm lại sự phát triển của khối u, ngăn cản sự tạo thành các chất gây ung thư. Ngoài ra, carotenoid còn đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa và điều trị các bệnh như tim mạch, viêm thấp khớp, chứng loạn dưỡng cơ, bệnh đục thủy tinh thể và một số rối loạn về thần kinh. β-carotene là đồng phân quan trọng của carotenoid, thuộc nhóm các sắc tố hữu cơ tự nhiên. β-carotene có thể chuyển hóa thành vitamin A trong cơ thể và được xem là tiền chất tốt nhất của vitamin A trong các loại carotenoid. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng β-carotene là một sắc tố tự nhiên có khả năng chống oxy hóa rất cao, kích thích tế bào miễn dịch, phối hợp với các chất chống oxy hoá khác như vitamin C và vitamin E làm giảm các nguy cơ nhiễm trùng, làm chậm quá trình lão hóa, giảm tác hại của ánh sáng mặt trời, cũng như giảm nguy cơ một số bệnh về tim mạch và ngăn ngừa một số bệnh ung thư [1]. Hiện nay, chủng tảo Dunaliella được xem là nguồn sản xuất β-carotene tự nhiên tốt nhất do có chứa tỉ lệ cao đồng phân 9-cis-β-carotene, được chứng minh là có hoạt tính chống oxy hóa tốt hơn nhiều đồng phân all-trans-β-carotene. Trong khi đó, β-carotene tổng hợp chỉ chứa đồng phân all-trans-β-carotene. Mặt khác, việc sản xuất carotenoid từ nguồn có sẵn trong tự nhiên được cho là an toàn hơn vì ít tạo ra các dạng đồng phân cấu trúc có khả năng ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người so với từ con đường tổng hợp hóa học. Vi tảo biển Dunaliella bardawil DCCBC 15 là nhóm vi tảo lục đơn bào thuộc Ngành Tảo lục - Họ Dunaliellaceae có giá trị kinh tế cao bởi nó có chứa các hợp chất có ứng dụng quan trọng trong dược phẩm như β- carotene, glycerol và các chất màu khác [1]. Loài tảo này chẳng những xuất hiện ở châu Phi, Đại Tây Dương và Địa Trung Hải, mà còn có mặt ở Biển Chết, các đại dương, biển, hồ khác - những nơi nước rất mặn, ánh nắng mạnh và nhiệt độ cao. Nhu cầu sử dụng β-carotene trên thế giới ngày càng cao nhưng nguồn cung 1
cấp β-carotene chủ yếu là từ tổng hợp hóa học (chiếm 84,8%), trong khi đó β- carotene ly trích từ tảo chỉ chiếm 8,5% và từ thực vật chiếm 6,7%. Do đó, việc sản xuất β-carotene từ vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 là một hướng nghiên cứu mới đầy tiềm năng và có khả năng đáp ứng cao, mở rộng khả năng cung ứng nguồn β-carotene có hoạt tính tốt, đồng thời tận dụng dải bờ biển dài của nước ta cho việc nuôi trồng loài vi tảo biển này [1]. Với những lợi ích đã trình bày trên, việc nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy làm tăng khả năng tăng trưởng và khả năng tích lũy β-carotene của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 là rất quan trọng và cần thiết. Đây cũng chính là mục tiêu nghiên cứu của đề tài “Nghiên cứu khả năng tăng trưởng và tích lũy các chất chống oxy hóa của Vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 dưới ảnh hưởng của các điều kiện ức chế”. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU - Khảo sát sự tăng trưởng của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 trong môi trường MD4 và sự tăng trưởng của vi tảo Dunaliella bardawil DCCBC 15 dưới các điều kiện ức chế. - Xác định hàm lượng carotenoid tổng, khả năng chống oxy hóa, hàm lượng phenolic tổng, hàm lượng lipid, diệp lục tố và trọng lượng khô của vi tảo. - Xác định hàm lượng β-carotene tích lũy trong vi tảo. 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về Dunaliella 1.1.1. Giới thiệu vi tảo Dunaliella Vi tảo là một cấu thành quan trọng của sinh vật phù du (plankton), đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì và phát triển hệ sinh thái dưới nước. Vi tảo là thức ăn tươi sống đặc biệt quan trọng cho sự phát triển ấu trùng của hầu hết các loài tôm, cá, ốc và cho các động vật phù du; tính ưu việt của vi tảo là không gây ô nhiễm môi trường, cung cấp đầy đủ các vitamin, chất khoáng, vi lượng, đặc biệt là chúng chứa rất nhiều loại acid béo không no. Chúng có giá trị dinh dưỡng rất cao và phạm vi ứng dụng rộng rãi [2]. Dunaliella là nhóm vi tảo lục đơn bào thuộc Ngành Tảo lục - Họ Dunaliellaceae. Các loài Dunaliella hiện diện trong các môi trường nước biển, các hồ muối trên khắp thế giới và có khả năng chống chịu với các độ muối khác nhau. Loài tảo này chẳng những xuất hiện ở Châu Phi, Đại Tây Dương và Địa Trung Hải, mà còn có mặt ở Biển Chết, các đại dương, biển, hồ khác - những nơi nước rất mặn, có ánh sáng mạnh và nhiệt độ cao. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng chúng có khả năng thay đổi hình dạng và thể tích để đáp ứng với sự thay đổi áp suất thẩm thấu ngoại bào. Đây là sinh vật hiếm hoi có thể sinh tồn trong môi trường nước rất mặn, nhờ chứa nồng độ cao carotenoid bảo vệ chúng khỏi ánh sáng và chứa lượng glycerol cao giúp chúng giữ độ ẩm. Ngoài ra, chúng cũng rất giàu vitamin C và E [2]. 1.1.2. Hình dạng và cấu trúc tế bào Dunaliella Dunaliella là vi tảo lục đơn bào, có hình cầu, hình trứng, hình ellips, hình trụ hay hình quả lê tùy theo các giai đoạn tăng trưởng cũng như môi trường dinh dưỡng khác nhau trong nuôi cấy, có kích thước rộng 4-15 μm và dài 6-25 μm [16], [9]. Tế bào di động do có 2 roi, không có vách cellulose mà chỉ có lớp nhầy bên ngoài gọi là glycocalyx [14], chỉ có một lục lạp với tâm tạo bột ở giữa [22], [7]. Các tế bào 3
Dunaliella không có vách giúp tế bào có thể nhanh chóng thay đổi thể tích tế bào đế đáp ứng với những thay đổi áp suất thẩm thấu ngoại bào [3], [11] (hình 1.1). Tế bào Dunaliella có các bào quan điển hình của tảo lục: nhân bao bọc bởi màng nhân nằm ở phần đầu của tế bào [5], ty thể, không bào, bộ máy Golgi và một điểm mắt [3], [12]. Hình 1.1. Tế bào Dunaliella bardawil chụp dưới kính hiển vi điện tử [11] 1.1.3. Các chất có hoạt tính sinh học ở Dunaliella Vi tảo có thể sản xuất một lượng lớn các chất chống oxy hóa và các sắc tố (carotenoid gồm fucoxanthin, lutein, β-carotene, astaxanthin và phycobilliprotein), LC-PUFA, protein (các acid amin thiết yếu như methionin, threonin và tryptophan), hợp chất phenolic, hợp chất sulfate và vitamin với ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, nông nghiệp và các ngành công nghiệp dược phẩm [3], [40], [45]. Vi tảo đơn bào là một nguồn các chất chống oxy hóa đầy hứa hẹn gồm nhiều 4
loài khác nhau Botryococcus, Chlorella, Dunaliella, Nostoc, Phaeodactylum, Spirulina, Haematococcus và Chaetoceros. Nhóm hợp chất chống oxy hóa chính và được biết đến nhiều từ vi tảo là carotenoid. Carotenoid đóng một vai trò quan trọng trong việc dập tắt các gốc tự do (ROS) tạo ra trong quá trình quang hợp, đặc biệt là oxy singlet. Ngoài ra, các hợp chất phenolic cũng là chất chống oxy hóa quan trọng ở vi tảo. Hàm lượng các hợp chất phenolic trong sinh khối tảo tăng khi tiếp xúc với các điều kiện ức chế khác nhau (như ánh sáng, nhiệt độ, độ muối, cạn kiệt dinh dưỡng...) cho thấy chúng thật sự đóng một vai trò quan trọng trong đáp ứng với các ức chế này [3], [23]. Dunaliella là một trong những loài tảo lục chịu mặn có thể sản xuất và tích lũy ba sản phẩm có giá trị cao về thương mại là glycerol, β-carotene và acid béo [8]. D.salina được nuôi cấy trong điều kiện ức chế khác nhau tăng sản xuất carotene và dịch trích chứa carotene này có hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn và chống ung thư cao [60]. Milko (1963) đã đề cập đến khả năng tạo ra lượng lớn β-carotene ở Dunaliella sp. Sau đó, nhiều nhà khoa học như Ben-Amotz và Avron (1983), Borowitzka (1988) đã chứng minh Dunaliella sinh ra nhiều β-carotene để làm chất bảo vệ cho bộ máy quang hợp dưới các điều kiện môi trường bất lợi. Các yếu tố môi trường như cường độ ánh sáng cao, điều kiện dinh dưỡng giới hạn, nồng độ muối cao và nhiệt độ cao đều tác động đến các quang thụ quan cảm nhận ánh sáng hay kênh vận chuyển, làm giảm tính ổn định của chúng, qua đó làm tăng các stress oxy hóa và nồng độ oxy đơn bội. Các stress này có thể làm cho sự tăng trưởng của Dunaliella bị giảm nhưng lại tăng cường sự tích lũy carotenoid. Từ đó, các nhà khoa học nhận thấy Dunaliella chính là nguồn nguyên liệu chứa β-carotene tự nhiên tốt nhất với các đồng phân 9-cis (chiếm 41%), all-trans (42%), 15-cis (10%) và đồng phân khác (7%). Chính vì vậy, từ đầu những năm 1960, người ta đã bắt đầu sản xuất Dunaliella để thu β-carotene tự nhiên và đến cuối những năm 1980, việc nuôi trồng D.salina trên quy mô công nghiệp cũng đã bắt đầu được triển khai tại Australia, Israel, Hoa Kỳ, Trung Quốc, Kuwait, Iran... 5
Việc sản xuất carotenoid từ nguồn có sẵn trong tự nhiên được cho là an toàn hơn vì ít tạo ra các dạng đồng phân cấu trúc có khả năng ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người so với từ con đường tổng hợp hóa học. Vi tảo biển, đặc biệt là loài D.salina, trong các điều kiện nhất định, có khả năng tổng hợp nguồn β-carotene rất hữu hiệu [9]. Trên thế giới, mô hình làm giàu β-carotene trong sinh khối của D.salina đã được nghiên cứu trên quy mô phòng thí nghiệm và sản xuất thương mại [28]. Để tích lũy β-carotene cần độ mặn cao, nhiệt độ cao và cường độ chiếu sáng mạnh, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng ở độ mặn trên 27% NaCl D.salina có thể tích lũy được lượng carotenoid lên tới trên 14% trọng lượng khô [2]. Nước ta có đường bờ biển dài, cường độ chiếu sáng mạnh quanh năm, vào mùa khô nhiệt độ luôn duy trì ở mức ổn định 25-35oC, hơn nữa có hệ thống các ruộng muối có độ mặn cao, vì vậy là điều kiện rất tốt để vừa xen canh làm muối, vừa nuôi trồng vi tảo biển sinh carotenoid như Dunaliella. 1.1.4. Cơ chế sinh tổng hợp carotenoid ở Dunaliella Carotenoid là isoprenoid được tổng hợp bởi tất cả sinh vật quang hợp, một số nấm và vi khuẩn không quang hợp [18]. Hơn 750 carotenoids đã được xác định cấu trúc [65]. Ở các sinh vật quang hợp, carotenoid gắn với các protein màng thykaloid nơi mà chúng tham gia vào hấp thu ánh sáng và bảo vệ cho bộ máy quang hợp chống lại những tổn thương quang oxy hóa [18]. Quá trình sinh tổng hợp carotenoid trong các sinh vật quang hợp được thực hiện qua hai giai đoạn: + Sinh tổng hợp tiền chất isoprenoid (IPP). + Sinh tổng hợp carotenoids từ tiền chất IPP. Carotenoid được tổng hợp đầu tiên là các tiền chất C5-terpenoid; isopentyl diphosphat (IPP), hợp chất này sau đó chuyển thành geranyl diphosphat (C20). Hai phân tử này kết hợp với nhau tạo thành phytoene sau đó tiếp tục khử hydro tạo thành phytofluene, zeta-carotene và neurosporence để cho ra lycopene. Tiếp theo 6
đó là sự tạo vòng, sự khử hydro và sự oxy hóa để tạo ra các carotenoid riêng biệt thường gặp trong tự nhiên, tuy nhiên có một số ít các hợp chất được biết có sự chuyển hóa cấu trúc cuối cùng dẫn đến hình thành hàng trăm các carotenoid khác nhau. Một lượng lớn các chất biến dưỡng thứ cấp như isoprenoid hay terpenoid gồm một vài hợp chất có giá trị sinh học và kinh tế như carotenoid. Ở các sinh vật quang hợp, isoprenoid được tổng hợp từ isopentyl diphosphate (IPP) và dimethylallyl diphosphate (DMAPP) từ con đường mevalonate trong tế bào chất (MVA) hoặc con đường 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate (MEP) trong lục lạp (con đường không MVA hoặc 1-desoxy-D-xylulose-5-phosphate [DXP]). Ở tảo lục chỉ có con đường MEP trong lục lạp cung cấp các tiền chất cho sinh tổng hợp tất cả isoprenoid [3], [54]. Ở tảo lục (Chlorophyta) (như D.bardawil DCCBC 15) dường như thiếu con đường MVA trong tế bào chất. Ngược với con đường MVA trong tế bào chất cần 3 phân tử acetyl-coenzyme A (acetyl-CoA) để tạo IPP, con đường MEP sử dụng pyruvate và glyceraldehyde-3-phosphate làm cơ chất và 8 enzyme nằm trong lục lạp sử dụng các cofactor và ion kim loại khác nhau (hình 1.2) [54]. 7
Hình 1.2. Sơ đồ sinh tổng hợp isoprenoid ở vi tảo Dunaliella salina [54] GA-3P, glyceraldehyde-3-phosphate; DXS, 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase; DXR, 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase; MCT, 2-C- methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferrase; CMK, 4-(cytidine 5’- diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol kinase; MDS, 2-C-methyl-D-erythritol 2,4- cyclodiphosphate synthase; HDS, 4-hydroxy 3-methylbut-2-enyl diphosphate synthase; HDR, 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase; IPP, isopentenyl diphosphate; DMAPP, dimethylallyl diphosphate; IPI1 & 2, isopentenyl pyrophosphate isomerase; GPP, geranyl diphosphate; GPS, GPP synthase; FPP, farnesyl diphosphate; FPS, FPP synthase; GGPP, geranyl geranyl diphosphate; 8