Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ: Xây dựng phương pháp định lượng Cefixim trong nước thải bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:54

Thêm vào BST

Báo xấu

30
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm 2 mục tiêu: Xây dựng phương pháp xử lí mẫu và điều kiện phân tích định lượng cefixim trong nước thải nhà máy sản xuất dược phẩm; thẩm định phương pháp định lượng cefixim trong mẫu nước này. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ: Xây dựng phương pháp định lượng Cefixim trong nước thải bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LAN ANH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFIXIM TRONG NƯỚC THẢI BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LAN ANH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFIXIM TRONG NƯỚC THẢI BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1.PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh 2.DS. Trần Thị Thanh Huế Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Hóa Phân Tích 2. Phòng Dược lí – Viện KN thuốc TW HÀ NỘI – 2013
LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Thị Kim Hương – Trưởng khoa Dược lý – Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương cùng tập thể cán bộ trong khoa đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận. Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn DS. Trần Thị Thanh Huế, người đã giúp đỡ rất tận tình và cho tôi những góp ý chân thành trong suốt thời gian tôi thực hiện khóa luận. Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường và thực hiện khóa luận. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động viên, khích lệ, tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này. Hà Nội, ngày 8 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị Lan Anh
MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.....................................................................................3 1.1 TỔNG QUAN VỀ CEPHALOSPORIN ............................................................3 1.1.1 Lịch sử ra đời, nguồn gốc...........................................................................3 1.1.2 Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng ...........................................3 1.1.3 Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu ...............................................5 1.2 TỔNG QUAN VỀ CEFIXIM ............................................................................6 1.2.1 Công thức cấu tạo......................................................................................6 1.2.2 Tính chất lí hóa...........................................................................................6 1.2.5 Chỉ định ......................................................................................................7 1.2.6 Một số phương pháp nghiên cứu định lượng cefixim ................................7 1.2.6.1 Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp đo quang............7 1.2.6.2 Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp HPLC ................7 1.4 SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ................................................................10 1.4.1 Khái niệm .................................................................................................10 1.4.2 Nguyên tắc ...............................................................................................10 1.4.3 Phân loại ...................................................................................................10 1.4.4 Các thông số đặc trưng .............................................................................10 1.4.5 Ứng dụng của HPLC ................................................................................12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................15 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................15 2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU....................................................................15 2.2.1 Hóa chất – thuốc thử - chất chuẩn ............................................................15 2.2.2. Thiết bị - dụng cụ ....................................................................................16 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................17 2.3.1 Khảo sát phương pháp xử lí mẫu .............................................................17 2.3.2. Xây dựng điều kiện sắc kí .......................................................................17 2.3.3. Đánh giá phương pháp ............................................................................17 2.3.4 Phương pháp xử lí số liệu ........................................................................18
CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.............................................................19 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH .......................................................19 3.1.1 Khảo sát phương pháp xử lí mẫu .............................................................19 3.1.1.1 Lựa chọn loại dung môi xử lí mẫu ....................................................19 3.1.1.2. Lựa chọn tỉ lệ dung môi xử lí mẫu ...................................................21 3.1.2 Khảo sát quy trình phân tích ....................................................................23 3.1.2.1 Khảo sát lựa chọn cột sắc kí .............................................................24 3.1.2.2 Khảo sát thành phần pha động và tốc độ dòng ................................25 3.1.2.3. Khảo sát thể tích tiêm mẫu ...............................................................26 3.1.3 Quy trình phân tích...................................................................................27 3.2.ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP.........................................................................29 3.2.1.Độ thích hợp của hệ thống .......................................................................29 3.2.2 Độ đặc hiệu ..............................................................................................30 3.2.3 Độ tuyến tính ............................................................................................32 3.2.4. Độ đúng ...................................................................................................34 3.2.5 Khảo sát độ chính xác ..............................................................................36 3.2.5.1 Độ lặp lại...........................................................................................36 3.2.5.2 Độ chính xác trung gian....................................................................36 3.2.6.Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).......................38 3.2.6.1.Giới hạn phát hiện ............................................................................38 3.2.5.2 Giới hạn định lượng ..........................................................................39 3.3.BÀN LUẬN ....................................................................................................39 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.............................................................42 4.1. KẾT LUẬN ....................................................................................................42 4.2. ĐỀ XUẤT .......................................................................................................43 TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril BP 2010 The Bristist Pharmacopoeia (Dược điển Anh 2010) C18 Octadecyl DAD Diode array derector (derector chuỗi diod) HPLC High perform liquid chromatography (sắc kí lỏng hiệu năng cao) HPLC-MS High perform liquid chromatography –Mas Spectrometry (sắc kí lỏng khối phổ) MeOH Methanol mg miligram ml mililit PA Pro analysis (tinh khiết phân tích) SĐK Số đăng kí USP 32 The United States Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ 34) UV - VIS Ultraviolet and visiable absorption Spectrophotometry (phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến)
DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1. Phổ tác dụng của các cephalosporin........................................................... 4 Bảng 1.2. Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu trong đề tài ............................ 5 Bảng 3.1. Khảo sát lựa chọn dung môi xử lí mẫu .................................................... 20 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu .......................................................... 27 Bảng 3.3. Kết quả độ thích hợp của hệ thống ........................................................... 29 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ tuyến tính ................................................................. 33 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ đúng ......................................................................... 35 Bảng 3.6. Kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian .......................................... 37 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát LOD .............................................................................. 38
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình vẽ, đồ thị Trang Hình 1.1. Công thức chung của cephalosporin ..........................................................3 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của cefixim ...................................................................6 Hình 2.1 Hóa chất,thuốc thử, chất chuẩn, thiết bị, dụng cụ .....................................16 Hình 3.1. Sắc kí đồ khảo sát lựa chọn dung môi xử lí mẫu......................................20 Hình 3.2. Sắc kí đồ khảo sát lựa chọn lượng dung môi xử lí mẫu ...........................22 Hình 3.3. Khảo sát lựa chọn cột sắc kí .....................................................................25 Hình 3.4. Sắc kí đồ khảo sát thành phần pha động và tốc độ dòng ..........................26 Hình 3.5. Mối liên quan giữa thể tích tiêm mẫu và diện tích pic .............................27 Hình 3.6. Sắc kí đồ khảo sát độ đặc hiệu: mẫu chuẩn (a), mẫu trắng (b), mẫu thử (c) ..............................................................................................................................31 Hình 3.7. Phổ cefixim trong dung dịch thử và trong dung dịch chuẩn ....................31 Hình 3.8. Sắc kí đồ khảo sát độ đặc hiệu khi phân tích cefixim và 6 cephalosporin khác ...........................................................................................................................32 Hình 3.9.a. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ (ng/ml) và diện tích pic (mAu.s) của cefixim ..................................................................................................33 Hình 3.9.b. Sắc kí đồ khảo sát độ tuyến tính............................................................34 Hình 3.10. Sắc kí đồ sát LOD...................................................................................39
1 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Năm 1929, Alexander Fleming phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của nấm Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh. Từ đó tới nay đã có rất nhiều dòng kháng sinh mạnh, phổ rộng như cephalosporin, macrolid, quinolon, cloramphenicol… được ra đời. Sự ra đời của các loại thuốc kháng khuẩn và kháng sinh là thành tựu vĩ đại của y học. Các bác sĩ đã có được những loại thuốc kì diệu giá rẻ và hiệu quả trong điều trị nhiễm khuẩn. Kháng sinh cùng với các biện pháp vệ sinh, tiêm phòng góp phần gia tăng tuổi thọ của con người trong nhiều năm, thậm chí nhiều thập kỉ. Mỗi lần phát hiện một loài vi khuẩn kháng thuốc, các phòng thí nghiệm lại đưa ra một loại thuốc kháng sinh mới[7], [25]. Tuy nhiên theo cảnh báo của WHO, những loại kháng sinh công hiệu nhất trong điều trị bệnh đang dần bị vô hiệu hóa. Trong cuộc chiến giữa vi khuẩn và con người, phần thắng đang nghiêng về phía các loại vi khuẩn kháng thuốc. Đây gần như là dấu chấm hết cho thời kì hoàng kim của thuốc kháng sinh [26]. Từ năm 1987 đã không hề có một loại kháng sinh nào được phát hiện còn vi khuẩn lại vẫn đang không ngừng biến đổi [25], [26]. Do đó, giảm tỉ lệ kháng thuốc của vi khuẩn là công việc cấp bách hơn bao giờ hết. Một trong những nguyên nhân quan trọng dẫn đến vi khuẩn kháng thuốc là do kháng sinh tồn dư trong nước thải đặc biệt là trong nước thải nhà máy sản xuất kháng sinh. Việc loại bỏ không hoàn toàn kháng sinh trong nước thải tại nhà máy dẫn đến việc xả nước vào môi trường tiềm năng ảnh hưởng đến sức khỏe con người và tác động đến hệ sinh thái, tạo điều kiện cho vi khuẩn kháng thuốc ngay cả ở nồng độ dấu vết [24]. Do vậy hướng nghiên cứu về dư lượng kháng sinh, chất chuyển hóa của chúng và ảnh hưởng của chúng lên con người và môi trường đang rất được quan tâm chú ý đặc biệt là ở các nước phát triển [24], [17]…Đã có nhiều nghiên cứu định lượng kháng sinh trong nước thải và ảnh hưởng của nó lên động thực vật và sức khỏe con người [19]. Tại Việt Nam vấn đề dư lượng kháng sinh trong nước thải cũng đang được quan tâm nghiên cứu như định lượng kháng sinh trong nước thải bệnh viện [3]. Công nghiệp dược đang phát triển mạnh với gia tăng số lượng các nhà máy sản xuất
2 dược phẩm cùng với lượng kháng sinh thải ra môi trường ngày càng nhiều. Tuy nhiên lại chưa có nghiên cứu về dư lượng kháng sinh trong nước thải nhà máy sản xuất dược phẩm. Cefixim là một kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 có phổ rộng, có hiệu quả trên nhiều vi khuẩn đã kháng nhiều loại kháng sinh như cephalosporin thế hệ 1, cephalosporin thế hệ 2, penicillin,… đặc biệt cefixim dùng theo đường uống – một đường dùng đơn giản và dễ sử dụng hơn so với nhiều cephalosporin khác. Vì vậy mà cefixim ngày càng được sử dụng nhiều. Để góp phần kiểm soát dư lượng kháng sinh, cụ thể là kháng sinh cefixim trong nhà máy sản xuất dược phẩm chúng tôi thực hiện đề tài: “ Xây dựng phương pháp định lượng cefixim trong nước thải bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao” Với mục tiêu: - Xây dựng phương pháp xử lí mẫu và điều kiện phân tích định lượng cefixim trong nước thải nhà máy sản xuất dược phẩm. - Thẩm định phương pháp định lượng cefixim trong mẫu nước này.
3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CEPHALOSPORIN 1.1.1 Lịch sử ra đời, nguồn gốc Năm 1945, Giuseppe Brotzu từ nguồn nước biển tại Cagliari (Italia) đã phân lập được chủng nấm Cephalosporium acremonium. Dịch lọc môi trường nuôi cấy nấm này có tác dụng ức chế sự phát triển của tụ cầu vàng Staphylococcus aureus và có tác dụng điều trị bệnh nhiễm khuẩn do tụ cầu vàng và bệnh thương hàn ở người. Từ năm 1948 đến năm 1956, Abraham và Neuton (Anh) từ môi trường nuôi cấy này (nay được gọi là Acremonium chrysogenum) đã chiết được một hỗn hợp kháng sinh cephalosporin P1, cephalosporin C và penicillin N. Năm 1971, từ chủng Norcardia, Nagarazan chiết xuất được cephamycin cũng có cấu trúc gần với cephalosporin C. Có nhiều cephalosporin tự nhiên được sinh tổng hợp từ các chủng nấm mốc khác nhau nhưng chúng hầu như không có ý nghĩa trong trị liệu. Vì vậy người ta đã tìm cách tạo ra các cephalosporin bán tổng hợp trên cơ sở cấu trúc vòng β-lactam. Ưu thế của các cephalosporin là có tác dụng kháng khuẩn đối với cả các vi khuẩn có hoạt tính β-lactamase, nhiều vi khuẩn Gram (-) và độc tính thấp. Vì vậy chúng nhanh chóng chiếm vị trí quan trọng trong trị liệu [8]. 1.1.2 Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng * Công thức chung của cephalosporin: R2 H R1 S H NH H O N O R3 HO O Hình 1.1: Công thức chung của cephalosporin Cephalosporin là dẫn chất acyl hóa của acid 7-aminocephalosporanic (A7AC), mang cấu trúc 3 -cephem, 3 mới đủ liên hợp điện tử với vòng β –lactam để hợp chất có tác dụng sinh học. Trong A7AC, các carbon bất đối C(6) và C(7) đều có cấu hình R, và hầu như là nguyên nhân làm cho các cephalosporin có tính hữu truyền khá mạnh [7].
4 * Phân loại và phổ tác dụng Hiện nay, cephalosporin được phân loại thành 4 thế hệ dựa trên phổ tác dụng. Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn Gram (+) mạnh hơn, nhưng trên Gram (-) yếu hơn thế hệ sau và ngược lại. Phổ chung của các thế hệ cephalosporin được giới thiệu tại bảng 1.1 [9]. Bảng 1.1 Phổ tác dụng của các cephalosporin Tên Tên đại Phổ tác dụng nhóm diện Thế hệ I Cephalexin - Phổ tác dụng trung bình, tác dụng trên các vi khuẩn Cephalothin Gram (+) như tụ cầu, liên cầu, phế cầu (trừ liên cầu Cephazolin kháng methicillin). … - Thuốc cũng có tác dụng trên một số vi khuẩn Gram (-) như E.coli, Kebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis và Shigella. Thế hệ II Cephaclor - Phổ tác dụng tương tự như thế hệ 1. Tuy nhiên tác Cephuroxim dụng trên vi khuẩn Gram (+) yếu hơn còn tác dụng Cefotetan… trên vi khuẩn Gram (-) mạnh hơn. Thế hệ III Cefixim - Tác dụng tốt trên vi khuẩn Gram (-), bền vững với β- Cefoperazon lactamase, tác dụng trên cả P. aeruginosa. Cefotaxim... - Trên vi khuẩn Gram (+), tác dụng kém thế hệ 1. Thế hệ IV Cefdinir - Phổ tác dụng tương tự nhưng mạnh hơn thế hệ 3. Cefepim… Thuốc tác dụng tốt với các vi khuẩn Enterobacteriaceae, Haemophilus, Pseudomonas, Streptococcus, lậu cầu, não mô cầu. - Bền vững với β-lactamase.
5 1.1.3 Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu Trong khuôn khổ của đề tài chúng tôi xin giới thiệu đặc tính của một số cephalosporin được sử dụng nghiên cứu trong đề tài tại bảng 1.2 [6], [7], [9], [13], [18], [22]. Bảng 1.2 Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu trong đề tài Thế Tên chất hệ Công thức phân tử Tính chất vật lí 1. Cephadroxil I C16H17N3O5S.H2O - Bột màu trắng hoặc gần như trắng. monohydrat - Khó tan trong nước, rất khó tan trong ethanol 96%. 2.Cefuroxim II C20H22N4O10S - Bột trắng hoặc hơi vàng. - Ít tan trong nước, tan trong aceton, ethyl acetat và methanol, ít tan trong ethanol. 3.Cefdinir III C14H13N5O5S2 - Bột trắng hoặc hơi vàng. - Tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1M (pH = 7), ít tan trong nước, trong alcol và diethyl ether. 4.Ceftazidim III C22H22N6O7S2.5H2O - Bột trắng hoặc hơi vàng. - Tan trong dung dịch kiềm, và trong dimethyl sulfoxid, ít tan trong dimethylformamid, methanol, nước, không tan trong aceton, ethanol, cloroform, dioxan, ether, ethyl acetat, toluen. 5.Cefotaxim III C16H16N5NaO7S2 - Bột trắng hoặc hơi vàng. natri - Dễ tan trong nước, hơi tan trong methanol, thực tế không tan trong ether. 6.Cefoperazon III C25H26N9NaO8S2 - Bột trắng hoặc hơi vàng. - Dễ tan trong nước, tan trong methanol, hơi tan trong ethanol 96%.
6 1.2 TỔNG QUAN VỀ CEFIXIM 1.2.1 Công thức cấu tạo .3H2O Hình 1.2: Công thức cấu tạo của cefixim + Công thức phân tử:C16H15N5O7S2.3H2O + Khối lượng phân tử: 507,5 +Tên khoa học: (6R, 7R)- 7- [[(Z)- 2- (2- aminothiazol- 4- yl)- 2- [(carboxy methoxy) imino] acetyl] amino]- 3- ethenyl- 8- oxo- 5- thia- 1-azabicyclo[4.2.0] oct- 2- en- 2- carboxylic trihydrat [6], [13], [22]. 1.2.2 Tính chất lí hóa Bột trắng hoặc gần như trắng, hơi hút ẩm. Ít tan trong nước, aceton, glycerin, tan trong methanol, propylen glycol, hơi tan trong ethanol, thực tế không tan trong ether, ethyl acetat và hexan, hầu như không tan trong dung dịch sorbitol 70% và octanol. Dung dịch chứa 0,7 mg cefixim trong 1 ml nước có pH từ 2,6 đến 4,1 [6], [13], [22]. 1.2.4 Dược lí Cefixim là một kháng sinh cephalosporin thế hệ 3, được dùng theo đường uống. Cefixim có độ bền vững cao với sự thủy phân của beta-lactamase mã hóa bởi gen nằm trên plasmid và chromosom. Cefixim có tác dụng cả invitro và trên lâm sàng với hầu hết các chủng của các vi khuẩn sau đây: - Vi khuẩn Gram (+): Streptococcus pneumonia, Streptococcus pyogenes.
7 - Vi khuẩn Gram (-): Haemophilus influenzae (tiết hoặc không tiết beta – lactamase), Moraxella catarrhalis (đa số tiết beta – lactamase), Escherichia coli, Proteus mirabilis, Neisseria gonorrhoeae (tiết hoặc không tiết penicillinase). Cefixim không có hoạt tính đối với Enterococcus, Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa và hầu hết các chủng Bacteroides và Clostridia [5], [9], [11], [12], [18]. 1.2.5 Chỉ định - Nhiễm khuẩn đường hô hấp trên và dưới, viêm tai giữa cấp tính. - Nhiễm khuẩn đường niệu không biến chứng. - Viêm niệu đạo do lậu cầu. - Điều trị các nhiễm khuẩn nặng do các vi khuẩn đã kháng cephalosporin thế hệ I và thế hệ II: Viêm màng não cấp, áp xe não, nhiễm khuẩn đường huyết, viêm màng trong tim, nhiễm khuẩn đường hô hấp nặng, nhiễm khuẩn tiêu hóa, nhiễm khuẩn đường mật, nhiễm khuẩn tiết niệu và sinh dục [5], [18]. 1.2.6 Một số phương pháp nghiên cứu định lượng cefixim Nghiên cứu định lượng cefixim rất phong phú với nhiều loại nền mẫu khác nhau. Chúng tôi xin giới thiệu một số nghiên cứu định lượng cefixim. 1.2.6.1 Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp đo quang - Định lượng cefixim trong viên nén khi đánh giá độ hòa tan tại λ = 288 nm, mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat 0,05 M pH = 7,2 (6,8 g KH2PO4, điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1M) [6], [22]. 1.2.6.2 Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp HPLC  Mẫu: nguyên liệu, viên nén, hỗn dịch - Cột: C18 (0,125 m x 4 mm, 5µm) - Pha động: ACN : dung dịch tetrabutylamoni hydroxyd 0,4 M pH = 6,5 (chỉnh pH bằng dung dịch H3PO4 1,5 M) (1:3) - Detector: UV λ = 254 nm - Tốc độ dòng: điều chỉnh cho thời gian lưu của cefixim khoảng 10 phút [6], [13], [22].
8  Mẫu dịch sinh học  Phạm Thu Trang: mẫu huyết tương - Tủa protein bằng dung dịch acid HClO4 20% - Điều kiện phân tích: o Cột Rp 18e (250 x 4,6 mm, 5µm) có bảo vệ cột, nhiệt độ cột 40 o Pha động: MeOH : đệm phosphat pH = 2,1 (NaH2PO4 12,5 mM, KH2PO4 5 mM; TBAH 0,06 mM) = 35 : 65, tốc độ dòng 1,5 ml/phút o Detector: DAD λ =285nm [10].  Abbas Khan và cộng sự: mẫu huyết tương - Tủa protein bằng acid tricloroacetic - Điều kiện phân tích: o Cột Supelco Discovery HS C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm), nhiệt độ cột 50 o Pha động: ACN : methanol (50:50): dung dịch trifloroacetic(19:81), tốc độ dòng 2 ml/phút o Detector: UV λ = 285 nm [16].  Joy A. McAteer và cộng sự: mẫu huyết tương - Tủa protein bằng ACN - Điều kiện sắc kí: o Cột Altex Ultrasphere C8 (150 x 4,6 mm, 5 µl) o Pha động: MeOH : dung dịch đệm phosphat pH 2,6 = 20:80, tốc độ dòng 2 ml/phút o Detector: UV λ = 254 nm [19].  Emirhan Nemutlu và cộng sự: mẫu huyết tương và nước ối - Chiết pha rắn cột polymeric sorbent (Strata X) - Điều kiện sắc kí: o Cột Xterra C18 (250 x 4,6 mm, 5 µl), nhiệt độ cột 32 o Pha động: dung dịch đệm phosphat 40mM pH = 3,2 và MeOH, gradient, tốc độ dòng 0,85 ml/phút o Detector: DAD λ = 285 nm [20].
9  Mẫu: nước bề mặt, nước ngầm, nước uống Nghiên cứu xác định cefixim trong mẫu nước bề mặt, nước ngầm, nước uống đã được công bố - Chiết pha rắn cột SPE: Isolute EVN 100 mg - Điều kiện sắc kí: o Cột Luna C18 (250 x 2 mm, 5 µm) o Pha động: Acid formic 0,1% : ACN : MeOH, gradient thành phần pha động, tốc độ dòng 0.2 ml/phút o Detector: MS-MS [23]. Nhận xét Cefixim là một kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 được sử dụng trong nhiều trường hợp.Vậy nên cefixim là một trong những kháng sinh được quan tâm nghiên cứu nhiều. Các nghiên cứu về cefixim rất phong phú đa dạng từ định lượng cefixim trong chế phẩm, huyết tương tới định lượng trong nước thải. Các dược điển các nước đều có chuyên luận riêng về cefixim [6], [13], [22]. Nghiên cứu định lượng cefixim trong huyết tương cũng rất được quan tâm chú ý. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu định lượng riêng cefixim hay định lượng cefixim đồng thời với các chất khác [16], [19], [20]. Tại Việt Nam, cũng đã có những nghiên cứu định lượng cefixim trong huyết tương [10]. Tuy nhiên những nghiên cứu về cefixim trong nước thải nhà máy còn khá ít. Các quy trình định lượng cefixim trong chế phẩm và huyết tương không thể áp dụng cho định lượng cefixim trong nước thải nhà máy. Chúng tôi mới chỉ tìm thấy một nghiên cứu định lượng cefixim trong nước thải nhà máy [17]. Nghiên cứu này sử dụng phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS, xử lí mẫu bằng chiết pha rắn. Phương pháp này cho độ đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện thấp. Tuy nhiên, hệ thống LC-MS/MS và chiết pha rắn giá thành cao, hiện nay chưa phổ biến tại Việt Nam. Trong khi đó, hệ thống HPLC UV-DAD và chiết lỏng - lỏng khá thông dụng, dễ kiếm, dễ áp dụng tại Việt Nam. Vì vậy chúng tôi xây dựng quy trình phân tích cefixim trong nước thải nhà máy với hệ thống HPLC UV-DAD và chiết lỏng - lỏng.
10 1.4 SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.4.1 Khái niệm HPLC là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc kí lỏng dựa trên cơ chế hấp thụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng [1]. 1.4.2 Nguyên tắc Mẫu phân tích được hòa tan trong pha động. Pha này là một chất lỏng được cho qua cột chứa các hạt pha tĩnh một cách liên tục. Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số phân bố giữa chất tan với pha tĩnh và pha động. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lượng [1], [2]. 1.4.3 Phân loại Các kĩ thuật sắc kí lỏng: sắc kí phân bố, sắc kí hấp phụ, sắc kí trao đổi ion, sắc kí loại cỡ, sắc kí ái lực, sắc kí các đồng phân quang học. Trong khuôn khổ của đề tài tôi xin trình bày chi tiết về sắc kí phân bố. Sắc kí phân bố là kĩ thuật được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay. Có thể phân thành 2 dạng tùy thuộc vào pha tĩnh: - Sắc kí lỏng – lỏng: Pha tĩnh là lớp chất lỏng bao quanh các hạt chất mang rắn, đó là chất nhồi cột. Quá trình lưu giữ chất phân tích liên quan đến sự phân bố giữa 2 pha lỏng. - Sắc kí pha liên kết: pha tĩnh có liên kết hóa học với bề mặt chất mang rắn ví dụ như silica, alumina... [1], [2]. 1.4.4 Các thông số đặc trưng * Hệ số phân bố K Trong đó CS
11 CS : nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh. CM: nồng độ mol của chất tan trong pha động. K càng lớn, sự di chuyển của các chất của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn [1]. * Thời gian lưu tR Thời gian lưu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất phân tích đến derector. Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là hằng định. Vì vậy có thể dùng thời gian lưu để phát hiện định tính các chất [1]. Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố: - Bản chất của pha tĩnh - Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động - Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan - Trong một số trường hợp còn phụ thuộc vào pH pha động. * Hệ số dung lượng k’ k’ = = K. Trong đó: K: hệ số phân bố VS: thể tích pha tĩnh VM: thể tích pha động Cần chọn cột, pha động... sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu [1]. * Hệ số đối xứng của pic AF AF = Ở đây: W: Chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic, : Khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic
12 Trong phép định lượng yêu cầu 0,8 AF 2 [1]. * Số đĩa lí thuyết và hiệu lực cột N: Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột. 2  t  2 t  N = 16  R  = 5,54  R  W  W1 / 2  Trong đó : W1/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh [1]. * Độ phân giải - Độ phân giải đánh giá khả năng tách hai chất trên sắc ký đồ cho 2 pic liền kề. 2(t RB − t RA ) 1,18(t RB − t RA ) RS = = WB + W A W1/ 2 B + W1/ 2 A - Trong đó : tRA, tRB : Thời gian lưu của 2 pic liền kề WA, WB : Độ rộng của pic đo ở các đáy pic. W1/2A, W1/2B : Độ rộng của pic đo ở nửa chiều cao các pic. Các giá trị tRA, tRB ,WA, WB , W1/2A, W1/2B phải tính theo cùng đơn vị [1]. - Yêu cầu RS > 1, giá trị tối ưu RS = 1,5. 1.4.5 Ứng dụng của HPLC - Định tính : - Sự giống nhau về thời gian lưu trên sắc kí đồ của chuẩn và thử là cơ sở của phép định tính. Trên các máy HPLC hiện đại với detector mảng diod ta có thể quét phổ UV-VIS của chất phân tích trên sắc kí đồ mẫu chuẩn và mẫu thử rồi chồng phổ với nhau để xác định sự giống nhau về dạng phổ thông qua hệ số Match (SI- similarity index). - Hệ số Match xấp xỉ 1,000 chỉ ra một phổ định tính giống nhau hoàn toàn. - Hệ số Match càng gần 1,000 thì sự tương tự của phổ càng cao. - Hệ số Match 0,990 : hai phổ tương tự nhau. - Hệ số 0,900 Match 0,990 : hai phổ có những điểm tương đồng. - Hệ số Match 0,900 : hai phổ khác nhau. - Định lượng :