Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ: Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời Omeprazole, Lansoprazole, Pantoprazole và Rabeprazole trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - DAD)

Chia sẻ: Mucnang Mucnang | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:152

Thêm vào BST

Báo xấu

30
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của luận văn nhằm nghiên cứu điều kiện sắc ký định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong huyết tương. Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu. Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng và đề ra quy trình phân tích thường quy để định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong huyết tương theo hướng dẫn FDA.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ: Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời Omeprazole, Lansoprazole, Pantoprazole và Rabeprazole trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - DAD)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO NGUYỄN LÊ VÂN HÀ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH NGUYỄN LÊ VÂN HÀ QUẢN LÝ VÀ CUNG ỨNG THUỐC XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI OMEPRAZOLE, PANTOPRAZOLE, RABEPRAZOLE VÀ LANSOPRAZOLE TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC – DAD) KHÓA 2013 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC TPHCM – 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH NGUYỄN LÊ VÂN HÀ XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI OMEPRAZOLE, PANTOPRAZOLE, RABEPRAZOLE VÀ LANSOPRAZOLE TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC – DAD) Chuyên ngành: Quản lý và cung ứng thuốc KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Hướng dẫn khoa học: DS. Dương Đình Chung TPHCM – Năm 2018
LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Chữ ký SV SV. Nguyễn Lê Vân Hà
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến DS. Dương Đình Chung, người thầy đã tận tình hướng dẫn cũng như truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất, giúp tôi bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học và hoàn thành tốt khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các anh chị trong bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm cũng như các thầy cô trong khoa Dược – trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã tận tình truyền dạy cho tôi những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm khóa luận tại trường. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô, các cán bộ trường Đại học Nguyễn Tất Thành, những người đã trang bị cho tôi rất nhiều kiến thức trong suốt quá trình học tập để tôi có được thành quả ngày hôm nay. Tôi xin chân thành cảm ơn!
MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................2 1.1. TỔNG QUAN VỀ NHÓM PPIs ......................................................................2 1.1.1. Lịch sử phát minh nhóm thuốc ức chế bơm proton ..................................2 1.1.2. Công thức hóa học và tính chất ................................................................3 1.1.3. Cơ chế tác dụng ........................................................................................4 1.1.4. Dược động học .........................................................................................4 1.1.5. Dược lực học ............................................................................................4 1.1.6. Tác dụng không mong muốn ....................................................................4 1.1.7. Chỉ định ....................................................................................................4 1.1.8. Chống chỉ định .........................................................................................5 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐỊNH LƯỢNG OPZ, LPZ, PPZ VÀ RPZ TRONG DỊCH SINH HỌC ...................................................................................................5 1.2.1. Trên thế giới .............................................................................................5 1.2.2. Trong nước ...............................................................................................7 1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ...............................8 1.3.1. Cơ sở lý thuyết..........................................................................................8 1.3.2. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC .........................................................8 1.3.3. Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký ...........................................9 1.3.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký................................11 1.3.5. Một số phương pháp tính toán kết quả định lượng bằng HPLC ............13 1.4. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG DỊCH SINH HỌC 14 1.4.1. Khái niệm ...............................................................................................14 1.4.2. Các chỉ tiêu thẩm định ............................................................................14 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................18 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU.......................................18 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................18 2.1.2. Hóa chất, dung môi.................................................................................18 i
2.1.3. Chất đối chiếu, vật liệu nghiên cứu ........................................................18 2.1.4. Dụng cụ, máy móc, thiết bị ....................................................................18 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................19 2.2.1. Các dung dịch thử nghiệm ......................................................................19 2.2.2. Nội dung nghiên cứu ..............................................................................20 2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KẾT QUẢ............................................................26 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...............................................................28 3.1. XÂY DỰNG ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ .............................................................28 3.1.1. Kết quả khảo sát bước sóng phát hiện ....................................................28 3.1.2. Kết quả khảo sát pha động......................................................................29 3.1.3. Lựa chọn nội chuẩn ................................................................................34 3.2. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU ....................................................................36 3.3. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐÃ CHỌN ................................39 3.3.1. Tính tương thích hệ thống ......................................................................39 3.3.2. Thẩm định tính đặc hiệu .........................................................................42 3.3.3. Thẩm định độ tuyến tính.........................................................................45 3.3.4. Giới hạn định lượng dưới .......................................................................48 3.3.5. Thẩm định độ đúng, độ lặp lại ................................................................49 3.3.6. Hiệu suất chiết ........................................................................................54 3.3.7. Độ ổn định ..............................................................................................54 3.4. BÀN LUẬN ...................................................................................................62 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................67 4.1. KẾT LUẬN ....................................................................................................67 4.2. KIẾN NGHỊ ...................................................................................................68 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt ACN Acetonitril Acetonitril AUC Area Under Curve Diện tích dưới đường cong Cmax Nồng độ đỉnh CTCT Công thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử CV Coefficient of Variation Hệ số biến thiên DĐVN Dược điển Việt Nam EMA European Medicine Agency Cơ quan quản lý thuốc Châu Âu Cơ quan quản lý thực phẩm và FDA Food and Drug Administration thuốc Hoa Kỳ HQC High Quality Control Sample Mẫu kiểm tra nồng độ cao High Performance Liquid HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography HT Huyết tương IDM Indomethacin Indomethacin IS Internal Standand Chất nội chuẩn KLPT Khối lượng phân tử LLOQ Lower Limit Of Quantification Giới hạn định lượng dưới LPZ Lansoprazole Lansoprazol LQC Lower Quality Control Sample Mẫu kiểm tra nồng độ thấp MeOH Methanol Methanol MP Mobile phase Pha động MQC Middle Quality Control Sample Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình OPZ Omeprazole Omeprazol PDA/ Photodiod array Dãy diod quang DAD iii
PPIs Proton Pump Inhibitors Ức chế bơm proton PPZ Pantoprazole Pantoprazol RPZ Rabeprazole Rabeprazol RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối S Standard Chất chuẩn SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SKD Sinh khả dụng SKĐ Sắc ký đồ S/N Signal/Noise SW Standard Working Dung dịch chuẩn làm việc TB Trung bình TĐSH Tương đương sinh học TEA Triethylamine Triethylamin The United States USP Dược điển Mỹ Pharmacopoeia UV-Vis Ultraviolet - Visible Tử ngoại - khả kiến iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu .......................................................................20 Hình 3.1. Phổ UV của OPZ, LPZ, PPZ, PPZ ...........................................................29 Hình 3.2. SKĐ khảo sát pha động MeOH – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (40 : 60) ..30 Hình 3.3. SKĐ khảo sát pha động MeOH – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (75 : 25) ..30 Hình 3.4. SKĐ khảo sát pha động ACN – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (40 : 60) .....31 Hình 3.5. SKĐ khảo sát pha động ACN – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (25 : 75) .....31 Hình 3.6. SKĐ khảo sát pha động ACN – đệm natri acetat 5 mM, pH 7,6 (25 : 75) ...................................................................................................................................32 Hình 3.7. SKĐ khảo sát pha động ACN – nước 0,3 % TEA, pH 7,2 (55 : 45)........33 Hình 3.8. SKĐ khảo sát pha động MeOH – ACN – nước 0,3 % TEA, ...................33 Hình 3.9 SKĐ: a. chất nội chuẩn domperidone và PPIs; b. chất nội chuẩn metronidazole và PPIs và c. chất nội chuẩn indomethacin và PPIs ..........................35 Hình 3.10. SKĐ: a. huyết tương trắng; b. Mẫu huyết tương xử lý bằng phương pháp gây tủa protein với MeOH; c. Mẫu huyết tương xử lý bằng phương pháp gây tủa protein với MeOH thêm dung dịch kiềm hóa KOH, d. Mẫu huyết tương xử lý bằng phương pháp chiết phân bố lỏng - lỏng và e. Mẫu chuẩn, nội chuẩn pha trong pha động (hệ pha động số 7). ....................................................................................38 Hình 3.11. SKĐ: a. mẫu huyết tương trắng; b. mẫu thử giả lập; c. mẫu huyết tương chứa mẫu thử thêm chuẩn; d. mẫu pha động ............................................................43 Hình 3.12. Phổ hấp thu UV: a. IS; b. PPZ; c. OPZ; d. RPZ ; e. LPZ; Độ tinh khiết pic: f. IS; g. PPZ; h. OPZ; i. RPZ ; j. LPZ ................................................................44 Hình 3.13. Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ của PPZ .....................................................................................................................45 Hình 3.14. Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ của OPZ .....................................................................................................................46 Hình 3.15. Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ của RPZ .....................................................................................................................47 Hình 3.16. Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ của LPZ .....................................................................................................................48 v
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Công thức hóa học và tính chất của các PPIs.............................................3 Bảng 1.2. Tóm tắt các nghiên cứu định lượng OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong dịch sinh học đã được công bố trên Thế giới ......................................................................5 Bảng 2.1. Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu ....................................................18 Bảng 2.2. Thiết bị dùng trong nghiên cứu ................................................................18 Bảng 2.3. Cách chuẩn bị mẫu đối chiếu ...................................................................23 Bảng 3.1. Kết quả phân tích ANOVA các phương pháp xử lý mẫu ........................39 Bảng 3.2. Bảng kết quả phân tích tính tương thích hệ thống ...................................41 Bảng 3.3. Kết quả thẩm định độ tuyến tính của PPZ................................................45 Bảng 3.4. Kết quả thẩm định độ tuyến tính của OPZ ...............................................46 Bảng 3.5. Kết quả thẩm định độ tuyến tính của RPZ ...............................................47 Bảng 3.6. Kết quả thẩm định độ tuyến tính của LPZ ...............................................48 Bảng 3.7. Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày (3 ngày) ..........................................................................................................................49 Bảng 3.8. Kết quả thẩm định độ chính xác (độ lặp lại) trong ngày và khác ngày....50 Bảng 3.9. Số liệu của Summary Statistics (Độ đúng) ..............................................51 Bảng 3.10. Kết quả hiệu suất chiết của PPZ và OPZ ...............................................52 Bảng 3.11. Kết quả hiệu suất chiết của RPZ và LPZ ...............................................53 Bảng 3.12. Kết quả thẩm định độ ổn định dung dịch chuẩn gốc PPIs và IS ............55 Bảng 3.13. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của PPZ trong huyết tương ..................57 Bảng 3.14. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của OPZ trong huyết tương .................58 Bảng 3.15. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của RPZ trong huyết tương..................59 Bảng 3.16. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của LPZ trong huyết tương ..................60 Bảng 3.17. Kết quả phân tích thống kê nghiên cứu độ ổn định mẫu huyết tương ...61 vi
TÓM TẮT Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học – Năm học 2013 – 2018 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI OMEPRAZOLE, PANTOPRAZOLE, RABEPRAZOLE VÀ LANSOPRAZOLE TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC – DAD) Nguyễn Lê Vân Hà Hướng dẫn khoa học: DS. Dương Đình Chung Mở đầu Nhóm thuốc ức chế bơm proton (PPIs) bao gồm Lansoprazole (LPZ), Omeprazole (OPZ), Pantoprazole (PPZ) và Rabeprazole (RPZ), được dùng để điều trị bệnh trào ngược dạ dày - thực quản, loét dạ dày tá tràng,...Tuy nhiên việc định lượng riêng lẻ từng hoạt chất trong nhóm thuốc này phải qua nhiều quy trình khác nhau gây phức tạp và tốn kém. Do đó, mục tiêu của đề tài là xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong huyết tương bằng phương pháp HPLC theo hướng dẫn của FDA. Đồng thời ứng dụng quy trình này để phát triển vào nghiên cứu dược động học lâm sàng đối với nhóm thuốc PPIs. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là các thuốc OPZ, LPZ, PPZ và RPZ có trong huyết tương. Phương pháp nghiên cứu: xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – DAD). Kết quả Điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng đồng thời bốn PPIs trong huyết tương bằng phương pháp HPLC là: Cột sắc ký XDB Zobrax C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm), đầu dò DAD với bước sóng phát hiện 285 nm, pha động là hỗn hợp nước 0,3 % TEA (pH = 7,2 được điều chỉnh bằng acid acetic) – ACN – MeOH (53 : 15 : 32, tt/tt/tt), tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 μl, nhiệt độ cột là 45ºC. Quy trình đã được thẩm định đạt các chỉ tiêu: tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác, giới hạn định lượng dưới, tính tuyến tính, độ ổn định theo hướng dẫn của FDA. Kết luận Đã xây dựng được quy trình định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang. Quy trình đã được thẩm định, đáp ứng đầy đủ yêu cầu của một quy trình định lượng thuốc trong dịch sinh học theo hướng dẫn của FDA. Từ khóa: HPLC, Omeprazole, Pantoprazole, Rapeprazole, Lansoprazole, định lượng, thẩm định.
ABSTRACT Final assay for the degree of BS Pharm - Academic year: 2013 -2018 DEVELOPMENT AND VALIDATION OF HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY METHOD (HPLC – DAD) FOR THE SIMULTANEOUS DETERMINATION OF OMEPRAZOLE, PANTOPRAZOLE, RABEPRAZOLE AND LANSOPRAZOLE IN HUMAN PLASMA Nguyen Le Van Ha Supervisor: B.S. Duong Dinh Chung Introduction Proton pump inhibitors (PPIs), viz. Lansoprazole (LPZ), Omeprazole (OPZ), Pantoprazole (PPZ) and Rabeprazole (RPZ), are used for treating gastro-oesophagal reflux disease, duodenal gastric ulcers,...However, the quantitation of these compounds is often complex and difficult as each component requires each analytical procedure. Therefore, the aim of this study is to develop and validate a simple and rapid reverse-phase HPLC method for simultaneous quantitation of OPZ, LPZ, PPZ and RPZ in human plasma according to the FDA guidelines. The developed method is applied to a pharmacokinetic study for PPIs. Materials and methods Materials: OPZ, LPZ, PPZ and RPZ in human plasma. Methods: Developing and validating the method for simultaneous quantitation of OPZ, LPZ, PPZ and RPZ in human plasma by high performance liquid chromatography (HPLC - DAD). Results The separation of the four components was performed on XDB Zobrax C18 column (150 x 4.6 mm, 5 µm), using the mixture of 0.3% triethylamine (pH 7.2 adjusted with acetic acid) – acetonitrile – methanol (53 : 15 : 32, v/v/v) as a mobile phase. An isocratic elution was made at 45ºC, flow rate of 1.0 ml/min with 20 μL injection volume. The UV detection was performed at 285 nm. Validation results showed that the method is suitable for the HPLC system and the procedure obtained the specificity, accuracy, precision, lower limit of quantitation, linearity, and stability according to the FDA guidelines. Conclusion A reverse-phase HPLC method was developed and validated for the simultaneous determination of OPZ, LPZ, PPZ and RPZ in human plasma according to the FDA guidelines. Keywords: HPLC, Omeprazole, Pantoprazole, Rapeprazole, Lansoprazole, Quantitation, Validation.
ĐẶT VẤN ĐỀ Loét dạ dày - tá tràng là bệnh đứng đầu về mức độ phổ biến trong số các bệnh lý đường tiêu hóa. Ước tính khoảng 10 % dân số thế giới mắc bệnh ở mọi lứa tuổi, không phân biệt giới tính và mỗi năm tăng thêm khoảng 0,2 % dân số mắc bệnh. Trước thực trạng đó, nhiều nhóm thuốc điều trị loét dạ dày - tá tràng như nhóm kháng acid, kháng histamin H2 hay ức chế bơm proton…được sử dụng trong điều trị. Trong đó, nhóm thuốc ức chế bơm proton (PPIs) thường được kê đơn nhiều vì ưu điểm cho tác dụng nhanh, hiệu quả làm lành vết loét có thể đạt đến 95% sau tám tuần điều trị; thuốc ít ảnh hưởng đến khối lượng dịch vị, sự bài tiết pepsin, yếu tố nội tại và sự co bóp dạ dày [5]. Omeprazole (OPZ), Lansoprazole (LPZ), Pantoprazole (PPZ) và Rabeprazole (RPZ) là các đại diện quan trọng và được kê đơn phổ biến nhất của nhóm ức chế bơm proton. Để có được sự điều chỉnh liều sử dụng hợp lý cho từng đối tượng bệnh nhân thì việc kiểm soát nồng độ các hoạt chất này trong huyết tương là rất cần thiết, từ đó, làm định hướng giúp bác sĩ thực hiện kê đơn thuốc an toàn và hiệu quả. Tuy nhiên, cho đến nay, nước ta vẫn chưa có một quy trình chuẩn, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm để định lượng đồng thời các hoạt chất này trong huyết tương. Do đó, xuất phát từ yêu cầu thực tế và với mong muốn xây dựng một quy trình chung, nhanh chóng, chính xác, đơn giản và tiện lợi để xác định đồng thời 4 hoạt chất trên trong huyết tương nhằm phục vụ công tác điều trị cũng như đánh giá sinh khả dụng (SKD) và tương đương sinh học (TĐSH), chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời Omeprazole, Lansoprazole, Pantoprazole và Rabeprazole trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - DAD)”. Đề tài được thực hiện với mục tiêu: 1. Nghiên cứu điều kiện sắc ký định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong huyết tương. 2. Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu. 3. Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng và đề ra quy trình phân tích thường quy để định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong huyết tương theo hướng dẫn FDA. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ NHÓM PPIs 1.1.1. Lịch sử phát minh nhóm thuốc ức chế bơm proton Thuốc PPI đầu tiên ra đời vào năm 1989 là OPZ, tiếp theo đó là sự ra đời của các thuốc LPZ, PPZ và RPZ, esomeprazole và mới đây nhất là dexlansoprazole. Các thuốc ức chế bơm proton gồm OPZ, esomeprazole, LPZ, PPZ và RPZ. Chúng ức chế bài tiết acid dịch vị do ức chế hệ thống enzym H+/K+ – ATPase (“bơm proton”) của tế bào thành dạ dày. Các thuốc ức chế bơm proton điều trị có hiệu quả trong loét dạ dày và tá tràng, phối hợp với kháng sinh để tiệt trừ Helicobacter pylori. Trong bệnh trào ngược dạ dày – thực quản, chỉ dùng thuốc nhóm này khi có triệu chứng nặng (lúc đầu ngắn ngày) và khi có các biến chứng như hẹp, loét, chảy máu đã được xác định bằng nội soi (phải điều trị duy trì đủ liều bằng một thuốc của nhóm này). Các thuốc ức chế bơm proton cũng được dùng để phòng ngừa và điều trị các trường hợp loét do dùng NSAID. ở những người phải tiếp tục dùng NSAID sau khi vết loét đã liền, thông thường không nên giảm liều thuốc ức chế bơm proton vì tình trạng loét không triệu chứng có thể xảy ra. Thuốc ức chế bơm proton có hiệu quả trong điều trị hội chứng Zollinger – Ellison (kể cả các trường hợp kháng với các điều trị khác) [6]. 2
1.1.2. Công thức hóa học và tính chất Bảng 1.1. Công thức hóa học và tính chất của các PPIs OPZ LPZ PPZ RPZ CTPT C17H19N3O3S C16H14F3N3O2S C16H15F2N3O4S C18H21N3O3S KLPT 345,4 369,36 383,4 358,4 5-methoxy-2-[(4-methoxy-3,5- 2-[[3-methyl-4-(2,2,2- 6-(Difluoromethoxy)-2-[[(3,4- 2-[[4-(3-methoxypropoxy)-3- Danh dimethylpyridin-2-yl)- trifluoroethoxy)pyridin-2-yl]- imethoxypyridin-2-yl) methylpyridin-2-yl]methyl- pháp methylsulfinyl]-1H- methylsulfinyl]-1H-benzimidazole methylsulfinyl]-1H- sulfinyl]-1H-benzimidazole benzimidazole benzimidazole CTCT Bột trắng hoặc gần như trắng. Bột kết tinh màu trắng hay nâu nhạt, Bột kết tinh màu trắng hay gần Bột kết tinh màu trắng hoặc hơi Tan trong dicloromethan và nhiệt độ nóng chảy khoảng 166°C. như trắng. Khó tan trong nước và vàng trắng. Khó tan trong nước và dung dịch kiềm loãng, hơi tan Rất dễ tan trong dimethylformamid, ethanol (96%), thực tế không tan ethanol, thực tế không tan trong Tính trong ethanol 96% và tan trong methanol, hơi tan trong trong hexan. Rất dễ bị phân hủy hexan. Rất dễ bị phân hủy trong chất methanol, rất khó tan trong ethanol, khó tan trong ethyl acetat, trong môi trường acid, thường môi trường acid, thường thấy ở nước [1], [21]. dicloromethan, rất khó tan trong thấy ở dạng muối natri ngậm 1,5 dạng muối natri [21]. acetonitril, thực tế không tan trong phân tử nước [4], [11], [14], [21]. hexan và nước [1], [21], [22]. 3
1.1.3. Cơ chế tác dụng Các thuốc thuộc nhóm ức chế bơm proton là dẫn xuất benzimidazole, chúng có cùng cơ chế là ức chế bơm H+/ K+ ATPase (còn gọi là bơm proton). Sau khi vào trong cơ thể, ở pH ≤ 5, thuốc được proton hóa thành 2 dạng: acid sulphenic và sulphenamic. Hai chất này gắn thuận nghịch với nhóm sulfhydryl của bơm H+/ K+ ATPase ở tế bào thành dạ dày nên ức chế bài tiết acid do bất kỳ nguyên nhân nào [3], [6]. 1.1.4. Dược động học Khi dùng đường uống, các PPIs hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa nhưng thay đổi tùy thuộc theo liều dùng và pH dạ dày. Sinh khả dụng theo đường uống có thể đạt đến 70 % nếu dùng lặp lại. Các thuốc gắn mạnh vào protein huyết tương (> 95 %). Nhóm thuốc PPIs chuyển hóa chủ yếu qua gan, chất chuyển hóa được đào thải chủ yếu qua nước tiểu (80 %), phần còn lại qua mật vào phân. Thời gian bán thải khoảng 30 – 90 phút [3], [6]. 1.1.5. Dược lực học Thuốc ức chế đặc hiệu và không hồi phục bơm proton do tác dụng chọn lọc trên tế bào thành dạ dày nên thuốc tác dụng nhanh và hiệu quả hơn các thuốc khác. Tỷ lệ làm lành vết loét có thể đạt 95 % sau 8 tuần điều trị. Rất ít ảnh hưởng đến khối lượng dịch vị, sự bài tiết pepsin, yếu tố nội dạ dày và sự co bóp dạ dày [2], [6]. 1.1.6. Tác dụng không mong muốn Thuốc có thể gây các rối loạn tiêu hóa như buồn nôn, táo bón hay tiêu chảy, các rối loạn thần kinh trung ương như chóng mặt, nhức đầu, ngủ gà (ít gặp). Ngoài ra, do thuốc gây ức chế tiết acid sẽ khiến pH dạ dày tăng lên, làm cho một số vi khuẩn phát triển gây ung thư (hiếm). PPIs ức chế cytochrome P450 nên có thể ảnh hưởng đến tác dụng của các thuốc khác khi dùng đồng thời [2], [6]. 1.1.7. Chỉ định  Trào ngược dạ dày - thực quản.  Loét dạ dày, tá tràng.  Dự phòng loét dạ dày, tá tràng do dùng thuốc chống viêm không steroid, do stress.  Hội chứng Zollinger – Ellison [6]. 4
1.1.8. Chống chỉ định Quá mẫn với bất kỳ thành phần nào của thuốc [6]. 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐỊNH LƯỢNG OPZ, LPZ, PPZ VÀ RPZ TRONG DỊCH SINH HỌC 1.2.1. Trên thế giới Bảng 1.2. Tóm tắt các nghiên cứu định lượng OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong dịch sinh học đã được công bố trên Thế giới Bước sóng Tốc độ Thể tích Đối tượng Chuẩn nội Pha động Cột sắc ký phát hiện dòng bơm định lượng (nm) (ml/phút) mẫu (µl) H.A. Dugger và ACN – đệm kali các cộng sự Megesterol C18, 250 mm x LPZ dihydrophosphat pH 4,5 (46 : 285 1,5 10 (2001) acetat 4,6 mm; 5µm 54) [12] Na2HPO4 0,05 M – acetonitril K.H. Yuen và các (ACN) (65 : 35), đã điều chỉnh C18, 150 mm x cộng sự (2001) OPZ Chloramphenicol 302 1,0 20 pH đến 6,5 bằng acid acetic 4,6 mm; 5 µm [24] băng Ramakrishna và Đệm phosphate 10 mM (pH C18, 250 mm x cộng sự (2005) PPZ Zonisamide 290 1,0 100 6,0) – ACN (6 1: 39) 4,6 mm; 5 µm [19] 5
Đệm amoni acetate 5 mM (đã Ramakrishna và PPZ điều chỉnh pH đến 7,4 bằng C18, 250 mm x các cộng sự RPZ 284 1,0 100 dung dịch natri hydroxit) – 4,6 mm; 5µm (2005) [20] ACN – MeOH (45 : 20 : 35) Đệm amoni bihydro phosphate 285 nm Zeng Xiaohui và 0,01 M – ACN C18, 150 mm x với LPZ các cộng sự LPZ OPZ 1,0 20 (66 : 34), được thêm 1 ‰ 4,6 mm; 5 µm và 305nm (2006) [23] Octylamine với OPZ Triethylamin (TEA) 0,1 % (pH D.V. Bharathi và OPZ, = 6,0 được điều chỉnh bằng C18, 75 mm x cộng sự (2009) LPZ, PPZ Zonisamide 270 1,0 20 acid ortho phosphoric) – ACN 4,6 mm; 3,5 µm [10] và RPZ (72 : 28) Định lượng OPZ và LPZ thì PPZ 290 nm Maryam OPZ, được sử dụng Đệm phosphate 10 mM – đối với Noubarani và các C18, 150 mm x LPZ, PPZ làm chất chuẩn ACN (53 : 47), đã điều chỉnh PPZ và 1,0 50 cộng sự (2010) 4,6 mm; 5 µm và RPZ nội. Định lượng pH đến 7,3 bằng TEA 285 nm [18] PPZ và RPZ thì với LPZ LPZ được dùng 6
làm chất chuẩn nội R.F. Hussein và Đệm Na2HPO4 0,05 M –ACN Cột C18, 4,5 x cộng sự (2016) OPZ LPZ (60 : 40), đã điều chỉnh pH đến 302 1,0 100 150 mm; 5 µm [16] 7,0 bằng acid phosphoric Các PPIs cũng có thể được định lượng trong huyết tương bằng một số phương pháp khác như: phương pháp LC/MS, LC/MS/MS [15], [25], [27], [28], [31] hay phương pháp điện di mao quản [30]. 1.2.2. Trong nước Năm 2010, Đào Văn Đôn và các cộng sự đã nghiên cứu định lượng PPZ trong huyết tương chó bằng phương pháp HPLC, sử dụng chất nội chuẩn là LPZ. Với điều kiện sắc ký là cột Gemini C18, 250 mm x 4 mm; 5 µm. Pha động ACN – đệm K2HPO4 0,01 M, điều chỉnh pH đến 6,0 (39 : 61); tốc độ dòng là 1,0 ml/phút; thể tích tiêm mẫu là 100 µl. Đầu dò UV ở bước sóng 296 nm. Kết quả cho thấy khảo sát độ tuyến tính trong khoảng nồng độ 20 – 5000 ng/ml. Phương pháp HPLC có độ chính xác trong ngày và khác ngày lần lượt là 1,4 – 5,2 % và 1,5 – 4 %. Độ đúng trong ngày và khác ngày tương ứng là 99,3 – 102,2 % và 100,7 – 103,5 % [7]. 7
1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.3.1. Cơ sở lý thuyết Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng ở áp suất cao. Pha tĩnh có thể là chất rắn được bao trên bề mặt một chất mang rắn, hoặc là chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế: hấp phụ, phân tán, trao đổi ion hay tương tác hóa học trên bề mặt [8], [5]. 1.3.2. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC 1.3.2.1. Hệ thống bơm Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm này phải điều chỉnh được áp suất (thường là từ 0 - 400 bar) để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ dòng ổn định, phù hợp với quá trình sắc ký [8], [5]. 1.3.2.2. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh, đôi khi bằng thép không gỉ. Dung môi cần được lọc loại các hạt (thường dùng màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm) và đuổi khí hòa tan trong dung môi (thường dùng máy siêu âm đuổi khí) [8], [5]. 1.3.2.3. Bộ phận tiêm mẫu Để đưa mẫu phân tích vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng hệ thống tiêm mẫu tự động. Thể tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa mẫu (tiêm tay) hay microsyringe tiêm trong hệ thống tiêm mẫu tự động [8], [5]. 1.3.2.4. Cột sắc ký Cột là bộ phận có thể coi là quan trọng nhất của hệ thống sắc ký vì ở cột xảy ra quá trình phân tách các chất. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu được áp suất cao tới vài trăm bar. Cột có nhiều cỡ khác nhau, tùy theo mức độ và mục đích của quá trình sắc ký. Nhìn chung, các cột phân tích thường có chiều dài từ 10 – 25 cm, đường kính 2 – 5 mm [8], [5]. 8