Luận văn cao học nuôi trồng thủy sản: Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của malachite green và nhiệt độ lên một số chỉ tiêu sinh lý và men cholinesterase của cá tra (pangasianodon hypophthalmus)

Chia sẻ: Nguyen Khanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:76

Thêm vào BST

Báo xấu

191
lượt xem 16
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn cao học nuôi trồng thủy sản: Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của malachite green và nhiệt độ lên một số chỉ tiêu sinh lý và men cholinesterase của cá tra (pangasianodon hypophthalmus).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn cao học nuôi trồng thủy sản: Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của malachite green và nhiệt độ lên một số chỉ tiêu sinh lý và men cholinesterase của cá tra (pangasianodon hypophthalmus)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN THỊ BÍCH NHƢ NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG KẾT HỢP CỦA MALACHITE GREEN VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ VÀ MEN CHOLINESTERASE CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2010 i
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN THỊ BÍCH NHƢ NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG KẾT HỢP CỦA MALACHITE GREEN VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ VÀ MEN CHOLINESTERASE CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN PGs.Ts. NGUYỄN THANH PHƢƠNG 2010 i
LỜI CẢM TẠ Tôi xin trân trọng gởi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Thanh Phƣơng đã tận tình hƣớng dẫn, động viên và cung cấp nhiều kiến thức quý báo đồng thời tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này. Xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô Đỗ Thị Thanh Hƣơng về những lời khuyên quí báu và sự hƣớng dẫn nhiệt tình trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Chân thành cảm ơn chị Nguyễn Hƣơng Thùy và bạn Nguyễn Thị Kim Hà, Nguyễn Văn Toàn cán bộ bộ môn Dinh dƣỡng và Chế biến Thủy sản đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện thí nghiệm. Xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến các em sinh viên lớp liên thông Nuôi trồng Thủy sản Khóa 33 và Nuôi trồng Thủy sản Liên thông Khóa 35 đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Chân thành cảm ơn dự án “Nghiên cứu đƣợc thực hiện dƣới sự tài trợ kinh phí của dự án - PhysCAM” (Nghiên cứu Đào tạo về sinh lý động vật Thủy sản ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, 2007-2010 do DANIDA, Đan Mạch tài trợ) đã hỗ trợ kinh phí và phƣơng tiện cho tôi thực hiện đề tài này. Cám ơn các bạn lớp Cao học Nuôi Tồng Thủy sản K15 đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt khóa học. Cuối cùng xin đƣợc bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và những ngƣời than đã chia sẻ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trƣờng. Xin chân thành cảm ơn. i
TÓM TẮT Nghiên cứu về ảnh hƣởng kết hợp của nhiệt độ và MG thông qua xác định khả năng chịu nhiệt của cá tra và sự thay đổi của các chỉ tiêu huyết huyết học và men ChE trong điều kiện nhiệt độ khác nhau. Từ đó tiến hành thí nghiệm tìm hiểu sự ảnh hƣởng kết hợp của nhiệt độ và MG lên sự thay đổi một số chỉ tiêu huyết học và men ChE của cá tra (P.hypophthalmus). Thí nghiệm xác định ngƣỡng chịu đựng nhiệt độ và sự thay đổi của các chỉ tiêu sinh lý và hoạt tính của men ChE trong quá trình tăng và giảm nhiệt. Kết quả cho thấy trong điều kiện bình thƣờng thì hoạt tính men ChE trong não cao hơn trong huyết tƣơng và ChE chịu ảnh hƣởng bởi nhiệt độ theo xu hƣớng nhiệt độ tăng hoạt tính tăng và nhiệt độ càng giảm khả năng ức chế hoạt tính ChE càng mạnh. Các chỉ tiêu huyết học trong điều kiện bình thƣờng thì có xu hƣớng thấp hơn so với điều kiện nhiệt độ cao nhƣng một số chỉ tiêu (hemoglobin, MCV, MCH, MCHC) lại cao hơn so với điều kiện giảm nhiệt. Đồng thời cũng xác định ngƣỡng nhiệt độ trên của cá tra là 42 oC và ngƣỡng dƣới là 12 oC. Trong nghiên cứu này khoảng nhiệt độ (22 0C, 28 0C và 34 0C) đƣợc chọn là khoảng nhiệt độ thích hợp và nhiệt độ bƣớc đầu có sự ảnh hƣởng đến các chỉ tiêu huyết học và hoạt tính của enzyme ChE trong não và máu của cá tra. Thí nghiệm ảnh hƣởng kết hợp của nhiệt độ (22 0 C, 28 0C và 34 0 C) và MG (0,15ppm và 02ppm) lên một số chỉ tiêu huyết học và hoạt tính của enzyme ChE lên cá tra có trọng lƣợng từ 15-20gam. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu với 6 nghiệm thức và 3 lần lặp lại. Mật độ cá thí nghiệm 30 con/bể, thể tích nƣớc là 200 lít, có bố trí sục khí trong suốt thời gian thí nghiệm.Thời gian thí nghiệm kéo dài trong 14 ngày với 5 lần thu mẫu và mỗi lần thu 4 con/bể. Kết quả thí nghiệm cho thấy sự biến đổi của các chỉ tiêu huyết học trong điều kiện tiếp xúc với MG ở các khoảng nhiệt độ 22 o C, 28 oC và 34 o C biến động theo nhiều xu hƣớng khác nhau. Số lƣợng hồng cầu, tỉ lệ huyết sắc tố, MCH, MCV giảm khi tiếp xúc với MG ở các khoảng nhiệt độ khác nhau nhƣng số lƣợng bạch cầu và hemoglobin giảm sau 6 giờ và 72 giờ tiếp xúc và lại tăng vào các khoảng thời gian gần kết thúc thí nghiệm. Nhiệt độ làm ảnh hƣởng đến độc tính của MG, khi nhiệt độ tăng kết hợp với nồng độ MG cao thì khả năng ức chế ChE trong não càng mạnh. Riêng về hoạt tính của ChE trong máu có những biểu hiện theo nhiều xu hƣớng khác nhau theo nhiệt độ và nồng độ của MG và khả năng ức chế ChE trong máu cần có thời gian tiếp xúc dài hơn so với não. ii
Abstract Study effect of MG and temperatune to some physiological parameters and the active of enzyme ChE of tra fish through determine the threshold of tolerated temperature, the changes of the physiological indicators and the active of enzyme ChE upon temperature of Tra fish (Pansianodon hypophthalmus) at the fry stage . From which determine the changes of some physiological indicators, enzyme ChE of Tra fish (Pangasianodon hypophthalmus) in different temperature ranges with different concentrations of MG. Determine the threshold of tolerated temperature, the changes of the physiological parameters and the active of enzyme ChE upon temperature of Tra fish (Pansianodon hypophthalmus) fingerlings (15-20g). Results showed that in normal conditions, the enzyme activity in brain higher in plasma and ChE influenced by temperature. When the temperature increase, the processing enzyme activity increased and temperature decrease the ability to inhibit the enzyme ChE increases. In this study, the effects of temperature (22 0C, 28 0C and 34 0C) on selected the blood parameters and the inhibition of cholinesterase (ChE) activity in bain and blood of Tra fish (P. hypophthalmus). Study the effects of MG (0,15ppm and 0,2ppm) and temperature (22 0 C, 28 0C and 34 0C) on hematology and and enzyme Cholinesterase on Tra fish (P.hypophthalmus) fingerlings (15-20g) were randomly designed in the laboratory of College of Aquacultute and Fisheries, Can Tho Universit. Fish were stocked at density of 30 individuals per 200 liters tank.The experiment was three replications in continuously aerated composite tank system and implemented for 14 days. Sampling was performed at 5 distinct points of time. Each time collect randomly four fish/tank, the last time harvest all fish left. The results showed that the quantity of erythrocyte, hematorite value, MCH and MCV decreased after exposed to MG at concentrations and different temperatures, but the quantity of white blood cells and hemoglobin decreased after 6 hours and 72 hours of exposure and increased in the period near the end of the experiment. Temperature affects the toxicity of MG, as the temperature increases associated with higher concentrations of MG, the ability to inhibition ChE in brain stronger. ChE activity in the blood manifesting in many different trends with temperature and the concentration of MG and institutional ability to inhibit blood exposure time should be longer than the brain. iii
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam kết luận văn này đƣợc hoàn thành trên kết quả nghiên cứu thực tế của tôi trong khuôn khổ dự án “Nghiên cứu đƣợc thực hiện dƣới sự tài trợ kinh phí của dự án - PhysCAM” (Nghiên cứu Đào tạo về sinh lý động vật Thủy sản ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, 2007-2010 do DANIDA, Đan Mạch tài trợ). Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào liên quan trong cùng lĩnh vực. Dự án có quyền sử dụng kết quả của luận văn này để phục vụ cho dự án. Trần Thị Bích Nhƣ iv
MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ...................................................................................................................i TÓM TẮT ...................................................................................................................... ii Abstract .......................................................................................................................... iii LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... iv MỤC LỤC ....................................................................................................................... v DANH SÁCH HÌNH....................................................................................................vii DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................ viii DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................ viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.......................................................................................ix Phần 1: .............................................................................................................................1 ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................1 1.1 Giới thiệu...................................................................................................................1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ...............................................................................................2 1.3 Nội dung của đề tài ..................................................................................................2 1.4 Thời gian thực hiện ..................................................................................................2 Phần 2: .............................................................................................................................3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................................................3 2.1 Giới thiệu về Malachite green (MG) .....................................................................3 2.1.1 Sơ lƣợc về MG ......................................................................................................3 2.1.2 Đặc điểm hóa học .................................................................................................3 2.2. Một số nghiên cứu về ảnh hƣởng của MG lên một số đối tƣợng thủy sản ......5 2.3.1 Ảnh hƣởng của MG đến các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa ................................8 2.3 Một số nghiên cứu về men ChE .......................................................................... 11 Phần 3: .......................................................................................................................... 14 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................. 14 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ...................................................................... 14 3.2 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................... 14 3.3 Bố trí thí nghiệm ................................................................................................... 14 3.3.1 Xác định ngƣỡng chịu đựng nhiệt độ và sự thay đổi của các chỉ tiêu sinh lý và hoạt tính của men ChE theo nhiệt độ của cá tra (P. hypophthalmus) ............. 14 3.3.2 Xác định ảnh hƣởng của MG và nhiệt độ lên các chỉ tiêu huyết học và men ChE. .................................................................................................................. 15 3.4 Phƣơng pháp phân tích ........................................................................................ 17 3.4.1 Phƣơng pháp phân tích mẫu ............................................................................. 17 3.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu .................................................................................. 21 Chƣơng 4 ...................................................................................................................... 22 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................... 22 4.1 Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên chỉ tiêu huyết học và men ChE lên cá tra ......... 22 4.1.1 Nhiệt độ ảnh hƣởng đến hoạt động của cá...................................................... 22 4.1.2.1 Các chỉ tiêu huyết học .................................................................................... 22 4.1.2.2 Hoạt tính của enzyme ChE ............................................................................ 24 4.1.3.1 Các chỉ tiêu huyết học .................................................................................... 26 4.1.3.2 Hoạt tính của enzyme ChE ........................................................................... 27 4.2 Ảnh hƣởng của nhiệt độ và MG lên một số chỉ tiêu huyết học và men ChE 30 v
4.2.1Các yếu tố môi trƣờng bể thí nghiệm ............................................................... 30 4.2.2 Biểu hiện lâm sàng của cá khi tiếp xúc với MG ........................................... 30 4.2.3 Ảnh hƣởng của MG và nhiệt độ lên các chỉ tiêu huyết học ......................... 32 4.2.3.1 Ảnh hƣởng của MG và nhiệt độ lên số lƣợng hồng cầu ............................ 32 4.2.3.2 Ảnh hƣởng của MG và nhiệt độ lên tổng bạch cầu .................................... 34 4.2.3.3 Tỷ lệ huyết sắc tố (hematocrite) ................................................................... 35 4.2.3.4 Khối lƣợng trung bình của huyết sắc tố trong hồng cầu (MCH) ............. 37 4.2.3.5 Nồng độ của huyết sắc tố trong hồng cầu – MCHC (%) ........................... 38 2.3.6 Thể tích hồng cầu – MCV (µm3 ) ..................................................................... 39 4.2.3.7 Số lƣợng của huyết sắc tố (Hemoglobin) .................................................... 40 4.2.4 Ảnh hƣởng của nhiệt độ và MG lên hoạt tính của men ChE ....................... 42 4.2.4.1 Hoạt tính men ChE não .................................................................................. 42 4.2.4.2 Hoạt tính men ChE trong máu ...................................................................... 44 Phần 5............................................................................................................................ 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT....................................................................................... 46 5.1 Kết luận .................................................................................................................. 46 5.2 Đề xuất .................................................................................................................. 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 47 Phụ lục A ...................................................................................................................... 51 Phụ lục B....................................................................................................................... 55 Phụ lục C....................................................................................................................... 61 vi
DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Công thức cấu tạo của MG (Oxolate) .......................................................3 Hình 2.2: Ba dạng của MG ..........................................................................................4 Hình 2.3: Sự biến đổi của MG.....................................................................................5 Hình 2.4: Sự thay đổi của một số chỉ tiêu máu ở cá (Heteropneustes fossilis).....8 Hình 3.1: Buồng đếm Neubauer............................................................................... 18 Hình 3.2 Cách làm kính phết ................................................................................... 19 Hình 4.1: Ảnh hƣởng của nhiệt độ tăng lên hoạt tính ChE ở não và máu ......... 25 Hình 4.2: Hoạt tính của men ChE trong não và máu cá tra khi giảm nhiệt độ .. 28 Hình 4.3: Biến động số lƣợng hồng cầu ảnh hƣởng bởi nhiệt độ và MG ........... 33 Hình 4.5: Ảnh hƣởng của của nhiệt độ và MG lên ChE trong não...................... 44 Hình 4.6: Ảnh hƣởng của của nhiệt độ và MG lên ChE trong máu .................... 45 vii
DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Các giá trị LC0 , LC50 and LC100 (mg/l) của malachite greens ..........6 Bảng 2.2: Giá trị LC50 của một số loài cá khác nhau khi tiếp xúc với MG. .........7 Bảng 4.1: Số cá chết khi tiến hành tăng và giảm nhiệt ........................................ 22 Bảng 4.2: Biến động các chỉ tiêu huyết học khi tiến hành tăng nhiệt ................... 24 Bảng 4.3: Hoạt tính của men ChE khi tiến hành tăng nhiệt ................................... 25 Bảng 4.4: Biến động các chỉ tiêu huyết học khi tiến hành giảm nhiệt.................. 27 Bảng 4.5:Hoạt tính của men ChE khi tiến hành giảm nhiệt ................................... 28 Bảng 4.6: Biến động các yếu tố môi trƣờng trong quá trình thí nghiệm .............. 31 Bảng 4.7:Ảnh hƣởng của nhiệt độ và MG lên số lƣợng hồng cầu ........................ 33 Bảng 4.8:Ảnh hƣởng của nhiệt độ và MG lên số lƣợng bạch cầu cầu ............... 336 Bảng 4.9:Ảnh hƣởng của nhiệt độ và MG lên tỉ lệ huyết cầu................................ 36 Bảng 4.10:Ảnh hƣởng của nhiệt độ và MG lên MCH ............................................ 37 Bảng 4.11:Ảnh hƣởng của nhiệt độ và MG lên MCHC ......................................... 39 Bảng 4.12:Ảnh hƣởng của nhiệt độ và MG lên MCV ............................................ 40 Bảng 4.13:Ảnh hƣởng của nhiệt độ và MG lên hemoglobin ................................. 41 Bảng 4.14: Ảnh hƣởng của nhiệt độ và MG lên hoạt tính của enzyme ChE ..............................................................43Error! Bookmark not defined. Bảng 4.15: Ảnh hƣởng của nhiệt độ và MG lên hoạt tính của enzyme ChE .... 455 viii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT MG Malachite green LMG Leucomalachite Green ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu long VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm NTTS Nuôi trồng thủy sản KST Ký sinh trùng CPSH Chế phẩm sinh học AFB1 Aflatoxin B1 ChE Cholinesterase BuChE Butyl cholineseterase AChE Acetylcholineseterase NT Nghiệm thức MCV Thể tích hồng cầu MCH Khối lƣợng hồng cầu MCHC Nồng độ của huyết sắc tố trong hồng cầu DTNB Dithiobisnitrobenzoate ix
ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Trong những năm gần đây, nuôi trồng thủy sản đang phát triển mạnh trên nhiều khía cạnh khác nhau nhƣ gia tăng diện tích, phát triển nhiều mô hình nuôi, tăng mức độ thâm canh với nhiều đối tƣợng nuôi khác nhau. Trong các đối tƣợng nuôi thì cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là một trong những đối tƣợng đang đƣợc chú ý phát triển ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) hiện nay. Tuy nhiên, do tập trung quá vào mức độ thâm canh và nâng cao năng suất nên đã làm gia tăng sự sử dụng thuốc và hóa chất để kiểm soát môi trƣờng, phòng và trị bệnh ngày càng trở nên phổ biến. Thế nhƣng, việc sản xuất, kinh doanh, sử dụng và quản lý thuốc, hóa chất và các chế phẩm sinh học dùng trong nuôi trồng thủy sản còn có nhiều hạn chế do sự hiểu biết của ngƣời nuôi, ngƣời cung cấp dịch vụ cũng nhƣ sự hỗ trợ của cơ quan khuyến ngƣ và nhà quản lý khác còn có giới hạn. Vấn đề tồn lƣu kháng sinh trong các sản phẩm thủy sản ngày càng trở nên phổ biến và là nguy cơ ảnh hƣởng đến vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP). Hƣớng tới vấn đề VSATTP trong các sản phẩm thuỷ sản, Bộ Thủy sản đã ra quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ban hành ngày 24 tháng 2 năm 2005 quy định danh mục 17 loại hóa chất kháng sinh cấm sử dụng và danh mục 34 loại hạn chế sử dụng trong sản xuất kinh doanh thủy sản, trong đó có Malachite green (MG). MG đã đƣợc sử dụng rộng rãi từ lâu và đƣợc dùng rất phổ biến với tác dụng là xử lý nƣớc, sát nấm (loại Saprolegnia ssp) cũng nhƣ để sát ký sinh trùng nhóm nguyên sinh vật (Protozoa) và bệnh nấm ký sinh trên trứng cá, cá và các loại sò hến nhƣ phòng trị các bệnh nấm thủy mi, bệnh trùng quả dƣa,… (Alderman, 2002; Srivastava et al, 2004). Khi vào cơ thể, một phần MG chuyển hóa thành Leucomalachite Green (LMG), thời gian đào thải của MG nhanh, ngƣợc lại chất LMG có thể tồn tại trong thời gian dài (Bergwerff et al, 2005) và MG đƣợc xem là một chất có khả năng gây bệnh ung thƣ (Annalaura et al., 2005). Theo nhận định của của Srivastava et al. (2004) thì độc tính của MG sẽ càng cao khi nhiệt độ càng tăng. Thế nhƣng trong quá trình sử dụng MG vào mục đích nuôi trồng thủy sản thì rất ít ngƣời nuôi xem xét tới tác động của nhiệt độ lên hóa chất này. Từ thực tế trên, việc “Nghiên cứu ảnh hƣởng của malachite green và nhiệt độ lên một số chỉ tiêu sinh lý và men Cholinesterase trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” là cần thiết. 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Xác định khả năng chịu nhiệt của cá tra và sự thay đổi của các chỉ tiêu huyết huyết học và men ChE trong điều kiện nhiệt độ khác nhau. - Tìm hiểu sự ảnh hƣởng kết hợp của nhiệt độ và MG lên sự thay đổi một số chỉ tiêu huyết học nhƣ hồng cầu, bạch cầu, hematocrit, hemoglobine và men ChE của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). 1.3 Nội dung của đề tài - Xác định ngƣỡng chịu đựng nhiệt độ và sự thay đổi của các chỉ tiêu sinh lý và hoạt tính của men ChE theo nhiệt độ của cá tra (Pansianodon hypophthalmus) giai đoạn giống. - Xác định sự biến đổi của một số chỉ tiêu sinh lý, men ChE của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) trong các khoảng nhiệt độ khác nhau với nồng độ MG khác nhau. 1.4 Thời gian thực hiện Từ tháng 9/2009 đến tháng 9/2010 2
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về Malachite green (MG) 2.1.1 Sơ lƣợc về MG MG có tên hóa học là Triphenylmethane; một số tên thƣơng mại khác là Aniline green; Bright green N; Malachite green G. sulfate; Malachite oxolate; Noxich; Victoria green B. Trong nuôi trồng thủy sản thì Malachite oxolate đƣợc sử dụng khá phổ biến và có công thức phân tử là: C52 H54 N4O12. Hình 2.1: Công thức cấu tạo của MG (Oxolate) Nguồn http://www.tcieurope.eu/it/common/img-structure/A5100.gif 2.1.2 Đặc điểm hóa học Malachite green hay triarylmethane dye có công thức hóa học là C23 H26 N2O, CI 42000, dạng tinh thể rắn đƣợc điều chế bởi một phần của benzaldehyde và hai phần của diemethylaniline dƣới xúc tác của a-xít sulphuric hoặc là kẽm clorua. MG có ở nhiều dạng nhƣng chủ yếu là oxalate hoặc là ở dạng muối hydrochloride, tối thiểu hòa tan đƣợc 50% nhƣ một hỗn hợp của acetate và muối hydrochloride. MG hydrochloride là một sản phẩm công nghiệp và đƣợc tạo ra do sự kết tủa khi thêm kẽm chloride. Thuốc nhuộm này giống nhƣ một triphenylemethanes khác có thể tồn tại trong 2 dạng ion nhƣ là muối và rƣợu metilic hay pseudobase. Theo Albert (1979) nếu ở dạng pseudobase thì có khả năng xâm nhập vào tế bào làm hòa tan đƣợc nhiều chất béo (lipid). Độ ion hóa cố định (pK) của MG là 6,90. MG bị ion hóa 100% ở pH 4,0; 50% tại pH 6,9; 25% tại pH là 7,4 và 0% khi pH là 10,1. Ở dạng chuyển hóa của MG, LMG có cấu trúc giống nhƣ là chuổi aromatic amin có vai trò quan trọng trong quá trình tạo màu (trích dẫn bởi Srivastava et al., 2004). 3
Hình 2.2: Ba dạng của MG Tính chất: MG là một loại thuốc nhuộm hữu cơ, màu xanh, kết tinh lấp lánh, có tính chất kiềm yếu, rất dễ tan trong nƣớc, không có mùi đặc biệt, có khả năng oxy hóa rất mạnh, có tác dụng tiêu diệt sinh vật gây bệnh, đặc biệt là nấm gây bệnh. MG dùng để nhuộm tơ, vải, giấy, da trong công nghiệp. MG cũng đƣợc dùng trong phòng thí nghiệm để nhuộm vi trùng và bào tử của nó. Ngoài ra MG còn có khả năng hoà tan sắt, chì và một số kim loại khác, sẽ gây ngộ độc cho tôm, cá nếu dùng các dụng cụ bằng sắt, chì để bảo quản và pha chế lúc sử dụng. Khi đi vào cơ thể sinh vật MG bị phân huỷ thành chất chuyển hoá (metabolite) là LMG (Nguyễn Thuần Anh, 2006). Cơ chế diệt trùng của MG: MG có thể can thiệp vào quá trình sinh tổng hợp protein của cơ thể sinh vật gây bệnh, đi đến tiêu diệt chúng (Bùi Quang Tề và ctv, 2004). Tác dụng: Từ lâu, MG đƣợc xem là chất diệt trùng. MG đƣợc dùng khá rộng rãi để xử lý nƣớc, bể và dụng cụ. MG cũng đƣợc sử dụng để chống lại bệnh nhiễm trùng do giun sán Dactylogyrus vastator ở cá chép (Cyprinus carpio), diệt trùng, sát nấm (loại saprolegnia ssp), sát ký sinh trùng nhóm nguyên sinh vật (protozoa) (Alderman, 2002; Srivastava et al., 2004). Tùy vào đối tƣợng mà nồng độ và phƣơng pháp sử dụng khác nhau. MG có tính độc với ngƣời sử dụng, nên chỉ dùng khi thật sự cần thiết (Bùi Quang Tề và ctv, 2004). MG đã đƣợc ngƣời nuôi thủy sản trên thế giới sử dụng rộng rãi từ lâu để phòng và trị bệnh cho cá tôm và hến. Tại Canada trƣớc 1992 các trại sản xuất cá giống cũng thƣờng sử dụng MG để ngăn ngừa trứng cá bị nhiễm nấm. Ngày nay Canada cũng nhƣ hầu hết các quốc gia khác trên thế giới trong đó có Trung quốc và Việt Nam đều cấm ngặt việc dùng chất MG trong việc nuôi trồng thủy sản. Chloramphenicol, Nitrofurans, xanh Malachite đƣợc thấy liệt kê trong danh mục các chất cấm sử dụng của Bộ Thủy Sản Việt Nam. Tại Việt Nam thì MG có thể 4
đƣợc các hộ nuôi trồng thủy sản sử dụng để sát trùng ao hồ, để tắm cá trƣớc khi thả chúng vào lồng nhằm mục đích ngừa cá bị nhiễm nấm hoặc nhiễm ký sinh trùng. Khi vào cơ thể cá, MG sẽ bị phân hủy ra thành chất chuyển hóa (metabolite) là LMG. Thời gian đào thải của MG nhanh, ngƣợc lại chất LMG có thể tồn tại trong một thời gian rất lâu dài trong thịt và nhất là trong mỡ của cá đã bị nhiễm độc (Bergwerff et al., 2005). Thí nghiệm cho thấy MG và LMG làm hại gan, làm biến đổi tuyến giáp trạng, gây ra tình trạng mất máu, làm đột biến thay đổi gene (mutagenic) và khả năng gây ung thu (carcinogenic) trên loài chuột thí nghiệm (Roberta et al., 2004). Qua việc thẩm định các kết quả trên, các nhà khoa học đƣa ra kết luận rằng MG và LMG là 2 chất nguy hại có tiềm năng gây cancer cho ngƣời. Năm 2002 Canada cũng nhƣ nhiều quốc gia khác đã nhận thấy chất MG có thể là mối đe dọa cho sức khỏe nên bắt đầu đề ra những chƣơng trình thử nghiệm MG ở các loại cá tôm nuôi bày bán ở thị trƣờng. Các quốc gia trong khối Liên hiệp Âu châu và Úc châu ấn định ngạch số tối đa của MG và LMG trong thủy sản là phải ở mức 2 phần tỉ (ppb), tức là không đƣợc vƣợt quá 0.002mg/kg. Hoa kỳ và Canada thì cho áp dụng nguyên tắc zero tolerance, nghĩa là không chấp nhận sự hiện diện của bất dƣ lƣợng nào dù là thật thấp của MG và LMG . Khi MG vào cơ thể, nó đƣợc xem là một chất có khả năng gây bệnh ung thƣ nay cả hai trong môi trƣờng vitro và vivo (Annalaura et al, 2005), MG ảnh hƣởng đến sức khoẻ con ngƣời nên đã bị cấm sử dụng và đƣợc kiểm tra nghiêm ngặt về dƣ lƣợng có trong thực phẩm ở nhiều nƣớc trên thế giới (Nguyễn Thuần Anh, 2006). Hình 2.3: Sự biến đổi của MG Nguồn http://www.restek.com/graphics/figure_fff_003-1.gif 2.2. Một số nghiên cứu về ảnh hƣởng của MG lên một số đối tƣợng thủy sản Các độc tính của MG sẽ tăng theo thời gian tiếp xúc dài, nhiệt độ và nồng độ cao. MG Làm thay đổi đáng kể các thông số huyết học của máu cá, tuy nhiên 5
MG vẫn đƣợc sử dụng trong một số trƣờng hợp đặc biệt ở nồng độ thích hợp và thời điểm khi nhiệt độ thấp (Srivastava et al, 2004). Srivastava et al. (1995) đã tiến hành nghiên cứu về tính độc của MG và những ảnh hƣởng của MG lên các chỉ số huyết học ở cá da trơn (Heteropneustes fossilis) nhƣ hàm lƣợng canxi, protein trong huyết tƣơng và hàm lƣợng cholesterol; các chỉ tiêu này đƣợc xem nhƣ là tiêu chuẩn đánh giá độc tính và thời gian tiếp cá với MG. Thí nghiệm xác định giá trị LC0 , LC50 và LC100 ở các thời điểm 24, 48 và 96 giờ trong khoảng nhiệt độ là 20,8±1,5 0C ở cá có khối lƣợng là 35,8±4,25 g; chiều dài 15,3±2,50 cm, với mật độ cá thí nghiêm là 20-25 cá/bể (5 cá/10 L) trong suốt thời gian thí nghiệm luôn quan sát và ghi nhận các biểu hiện của cá, đồng thời các yếu tố khác nhƣ oxy, độc cứng, pH đều nằm trong khoảng thích hợp. Kết quả quan sát cho thấy khi tiếp xúc với MG cá hoạt động nhanh không bình thƣờng, mang và ngực hoạt động rất nhanh lẹ, bơi lộ thất thƣờng và chậm dần, hô hấp khó khăn.Giá trị LC50 tại các thờ điểm 24, 48, 72 và 96 giờ với các nồng độ tƣơng ứng là 5,60; 1,40; 1,25 và 1,00 mg/l. Tuy nhiên, ở các loài cá khác nhau và khoảng nhiệt độ khác nhau thì giá trị LC50 cũng khác nhau (Srivastava et al., 2004). Nhƣ vậy, độc tính của MG có liên quan đến nhiệt độ của nƣớc. Ở nhiệt độ thấp cá, tôm có thể chịu đựng đƣợc nồng độ thuốc cao hơn. Đồng thời độc tính cũng tăng theo thời gian tiếp xúc và độc tính của MG tăng khi nhiệt độ tăng (Bảng 2.2). Bảng 2.1: Các giá trị LC0, LC50 and LC100 (mg/l) của malachite green đối với cá da trơn Heteropneustes fossilis Thời gian LC0 LC50 LC100 24 2.20 5.60 6.75 48 1.10 1.40 2.10 72 0.95 1.25 1.60 96 0.80 1.00 1.15 Nguồn: Srivastava et al., (1995) Srivastava et al. (2004) nhận thấy có nhiều nghiên cứu về giá trị LC50 của MG tại các giai đoạn khác nhau ở cá. MG đƣợc xem là chất có khả năng gây độc ở một số cá thể ở một những loài cá khác nhau trong các giai đoạn khác nhau, và rất khó đem ra để so sánh vì nó chịu ảnh hƣởng bởi các nhân tố khác nhau nhƣ là nhiệt độ, pH, độ cứng và hàm lƣợng oxy hòa tan trong nƣớc thử nghiệm. Trên những biến đổi giá trị LC50 của MG trên cá da trơn nƣớc ngọt Heteropneustes fossilis tại các thời gian và nồng độ khác nhau (Bảng 2.1 và 2.2) có thể nhận đinh rằng độc tính của MG tăng theo thời gian và nồng độ. 6
Bảng 2.2: Giá trị LC50 của một số loài cá khác nhau khi tiếp xúc với MG ở nồng độ, pH và nhiệt độ khác nhau. LC50 Nhiệt độ (◦ Thời gian Loài cá pH (mg/l) C) (giờ) Theo Bills et al. (1977) Cá Lepormis macrochirus) trƣởng thành 7.430 2.0 6.5 8.0 12 3 2.19 7.5 12 6 Cá nheo Mỹ giai đọan giống 0.238 7.5 22 6 (Ictarulus punctatus) 0.960 7.5 12 6 0.4 7.5 22 6 0.519 9.5 12 6 1.72 8.0 12 6 1.3 8.0 12 6 0.286 8.0 12 24 Cá hồi (Oncorhynchus mykiss) 1.4 7.5 12 3 2.35 8.0 12 3 6.8 8.0 12 6 Cá Micropterus dolomieui 0.154 7.5 12 24 0.045 7.5 12 96 Cá Micropterus salmoides 30.282 7.5 12 24 0.072 7.5 12 96 Cá hồi (Oncorhynchus kisutch) 8 3.0 7.5 12 6 0.569 7.5 12 24 0.383 7.5 12 96 Đại Tây Dƣơng (Salmo salar) 3.560 7.5 12 3 1.090 7.5 12 6 0.497 7.5 12 24 0.283 7.5 12 96 Brown trout (Salmo trutta) 1.730 7.5 12 3 1.270 7.5 12 6 0.352 7.5 12 24 0.237 7.5 12 96 Tôm nƣớc ngọt 9.1 7.5 16 24 (Palaemonetes kadiakensis) 1.9 7.5 16 96 Theo Srivastava et al. (1995a) Cá da trơn nƣớc ngọt (Heteropneustes 5.60 7.7 22 24 fossilis) 1.40 7.7 22 48 1.25 7.7 22 72 1.0 7.7 22 96 Trích dẫn của Srivastava et al., (2004) Nghiên cứu của Wright (1976) về thời gian gây chết trứng, cá hƣơng và cá trƣởng thành Micropterus salmonides khi tiếp xúc với MG; khi tăng nồng độ MG gấp đôi thì kết quả cho thấy tính độc tăng hơn 20 lần dựa theo tỉ lệ gây chết của trứng và cá bột. Qua nghiên cứu tác giả đã khẳng định MG là chất cực kỳ độc hại và tuyệt đối không sử cho cho bất cứ mục đích nào liên quan đến trứng 7
và cá hƣơng của loài. Có rất nhiều nghiên cứu về ảnh hƣởng của MG trên cá nhƣng đáng chú ý là sự phát triển không bình thƣờng của trứng cá khi tiếp xúc với MG, cụ thể là ở cá Oncorhynchus mykiss, cá có biểu hiện khác thƣờng của nhiễm sắc thể khi bị ảnh hƣởng bởi MG đã đƣợc thực hiện trên cá nƣớc ngọt (Worle, 1995), tác giả này nhận thấy rằng sau một thời gian dài tiếp xúc với MG ở nồng độ cao thì khả năng sống sót phôi sau 38 giờ thụ tinh giảm đáng kể và vào thời gian về sau khi ƣơng lên cá bột thì cá có dấu hiệu nhƣ xƣơng cột sống, đầu, vây và đuôi không bình (trích dẫn bởi Srivastava et al., 2004). 2.3.1 Ảnh hƣởng của MG đến các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa Srivastava et al.,(1995 ) nhận thấy khi cá Heteropneustes fossilis tiếp xúc với MG 0,2 mg/l thì ở thời điểm 96 giờ các chỉ số máu nhƣ hàm lƣợng protein và can-xi trong máu đều giảm ở mức có ý nghĩ thống kê (Hình 2.4) chỉ riêng tổng cholester máu là tăng trong suốt thời gian thí nghiệm; và tác giả cho rằng khả năng gây độc của MG là do sự biến đổi quan trọng trong các chỉ tiêu huyết học trong máu nhƣ làm suy yếu calcium của huyết thanh và hàm lƣợng protein; đồng thời cũng làm tăng tổng hàm lƣợng cholesterol trong máu, làm rối loạn quá trình trao đổi chất bột đƣờng và quá trình điều hòa áp suất thẩm thấu. MG là nguyên nhân gây tiêu giảm glycogen ở gan và cơ cùng với quá trình này là tăng lƣợng đƣờng trong máu và chlorine trong máu vƣợt quá giới hạn; tăng tính nhạy cảm tới sự giảm oxy huyết và làm giảm sự tổng hợp protein ở cá Bảng 2.3: Sự thay đổi của một số chỉ tiêu máu ở cá (Heteropneustes fossilis) sau 96 giờ tiếp xúc với MG nồng độ 0,2ppm Chỉ tiêu Đối chứng MG 0,2 ppm Canxi huyêt thanh (mg/100ml) 20,1±0,53 15,5±0,24*** Protein huyêt thanh (g/100ml) 6,1±0,13 5,2±0,13*** Tổng Cholesterrol máu (mg/100ml) 340,9±1,50 439,0±0,84*** Nguồn Srivastava et al.,1995 MG cũng là một trong những nguyên nhân làm biến đổi các chỉ tiêu huyết học của cá. Theo Lƣơng Thị Diễm Trang (2009) khi cá tra (P. hypophthalmus) tiếp xúc với MG ở nông độ 0,1; 0,15 và 0,2 ppm thì MG không chỉ làm giảm cƣờng độ hô hấp, làm tăng ngƣỡng oxy mà MG còn là nguyên nhân làm giảm số lƣợng hồng cầu, tỉ lệ huyết sắc tố, hemoglobin, đồng thời cũng làm tăng số lƣợng bạch cầu và thể tích hồng cầu. Musa and Omoregie (1999) báo cáo ở cá hồi và trê phi (Clarias gariepinus) và cả cá Heteropneustes fossilis cũng cho thấy sự giảm tổng số tế bào hồng cầu, hemoglobin và hematorit, tăng tổng số bạch cầu 8
và làm cản trở quá trình đông máu khi tiếp xúc với MG (trích dẫn Srivastava et al.,2004). Nhƣ vậy khả năng tác động của MG lên các chỉ tiêu huyết học cũng chịu ảnh hƣởng bởi nồng độ. Cụ thể, cá hồi (Oncorhychus mykiss) sau khi tiếp xúc với MG trong 5 ngày ở nồng độ 66,67mg/l và 5mg/l cũng làm thay đổi đáng kể về các chỉ tiêu huyết học. Số lƣợng hồng cầu và bạch cầu đều có xu hƣớng ý nghĩa giảm thống kê khi tiếp xúc cả 2 nồng độ. Tuy nhiên hàm lƣợng hemogobin, hematorite và MCV lại có xu hƣớng tăng ở nồng độ thấp và lại giảm khi ở nồng độ cao. Riêng về cá chỉ số MCHC và MCH lại có xu hƣớng tăng khi tiếp xúc với MG ở cả hai nồng độ (Naim Saglam et al., 1996). Sự giảm số lƣợng bạch cầu đơn nhân, tỉ lệ huyết sắc tố, thể tích trung bình của huyết cầu và sự tăng lên nồng độ trung bình của hemoglobin đã đƣợc xem nhƣ là một trong những chỉ tiêu để nhận biết sau khi cá tiếp xúc với MG (trích dẫn bởi Srivastava et al.,2004). MG có khả năng gây giảm quá trình hô hấp ở cá Cunninghamella elegans khi sử dụng để trị nấm, gây hiện tƣợng khó hô hấp ở cá hồi và cá rô phi Nile tilappia (trích bởi Srivastava et al, 2004) cũng nhƣ làm giảm cƣờng độ hô hấp ở cá tra (P. hypophthalmus) (Lƣơng Thị Diễm Trang, 2009). Giải thích cho hiện tƣợng này thì theo Grizzle (1997) khi quan sát tổ chức tế bào học của mang cho thấy tế bào biểu bì của phiến mang dày lên khi tiếp xúc với MG, chính vì sự dày lên này làm sự trao đổi khí giữa nƣớc và biểu bì mang làm giảm cƣờng độ hô hấp do cơ quan hô hấp bị tổn thƣơng, (trích dẫn Lƣơng Thị Diễm Trang, 2009). Theo Đỗ Thị Thanh Hƣơng và Trần Thị Thanh Hiền, (2000) thì sự xuất hiện của chất độc hóa học trong cơ thể có ảnh hƣởng lớn đến quá trình hô hấp của cá, các chất này có thể làm tổn thƣơng tế bào thƣợng bì mang, gây bổng mang, làm đông đặc chất nhầy và tạo thành một màng bao bộc bề mặt hô hấp làm ngăn cản quá trình trao đổi khí giữa nƣớc và máu, cá sẽ bị chết ngạt. Theo Lƣơng Thị Diễm Trang, (2009) khi gây nhiễm MG ở các nồng độ là 0,1; 0,15 và 0,2 ppm thì có sự biến đổi hoạt tính của ChE trong cơ, mang, gan và não của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) giai đoạn giống. Kết quả cho thấy hoạt tính của men ChE có chiều hƣớng bị ức chế khi tiếp xúc với MG. Ở nồng độ 0,15 ppm và 0,2 ppm thì hoạt tính của ChE ở não sau 7 ngày là 71% và 66,7% và mặc dù có sự giảm nhƣng hoạt tính của ChE của cá ở các lần thu 72 giờ, 7 ngày và 14 ngày ở tất cả nghiệm thức đều khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p