LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: "TÌM HIỂU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC Ở TÔM SÚ (P.monodon) BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU VÀ CƠ QUAN LẬP BIỂU MÔ"

Chia sẻ: Cung Ru | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:34

Thêm vào BST

Báo xấu

191
lượt xem 39
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THUỲ NGÂN TÌM HIỂU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC Ở TÔM SÚ (P.monodon) BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU VÀ CƠ QUAN LẬP BIỂU MÔ (IHHNV – Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: "TÌM HIỂU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC Ở TÔM SÚ (P.monodon) BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU VÀ CƠ QUAN LẬP BIỂU MÔ"

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THUỲ NGÂN TÌM HIỂU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC Ở TÔM SÚ (P.monodon) BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU VÀ CƠ QUAN LẬP BIỂU MÔ (IHHNV – Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2008
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THUỲ NGÂN TÌM HIỂU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC Ở TÔM SÚ (P.monodon) BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU VÀ CƠ QUAN LẬP BIỂU MÔ (IHHNV – Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths. BÙI THỊ BÍCH HẰNG 2008
MỤC LỤC Lời cảm tạ .................................................................................................................... i Tóm tắt........................................................................................................................ ii Danh sách hình........................................................................................................... iii Danh mục từ viết tắt ................................................................................................... iii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU .................................................................................................... 1 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ...................................................................... 3 2.1 Sơ lược nghề nuôi tôm trên thế giới, ở Việt Nam ............................................. 3 2.2 Tác nhân gây bệnh IHHNV.............................................................................. 4 2.2.1 Đặc điểm của tác nhân gây bệnh IHHNV................................................ 4 2.2.2 Dấu hiệu bệnh lý..................................................................................... 5 2.2.3 Phân bố và lan truyền bệnh ..................................................................... 5 2.2.4 Chẩn đoán bệnh ...................................................................................... 6 2.2.5 Thiệt hại do IHHNV gây ra ..................................................................... 6 Trung tâm Học2.2.6 Những nghiên cứu về @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 6 liệu ĐH Cần Thơ bệnh ..................................................................... 2.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh ................................................................... 7 2. 3. 1 Phương pháp PCR................................................................................. 7 2.3.2 Phương pháp mô học .............................................................................. 8 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................... 11 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu................................................................... 11 3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu .............................................................. 11 3.2.1 Chẩn đoán bệnh IHHNV bằng kỹ thuật PCR theo bộ kit IQ TM 2000 ...................................................................................................................... 11 3.2.2 Kỹ thuật mô học .................................................................................... 14 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................. 17 4.1 Kết quả xét nghiệm PCR................................................................................ 17 4.2 Kết quả mô học .............................................................................................. 17 4.2.1 Những biến đổi mô học lớp biểu mô dưới vỏ tôm sú nhiễm IHHNV. .................................................................................................................... 17
4.2.2 Những biến đổi mô học ở mang tôm sú nhiễm IHHNV......................... .17 4.2.3 Những biến đổi mô học ở mô liên kết gan tuỵ tôm sú nhiễm IHHNV ..................................................................................................................... 19 4.2.4 Những biến đổi mô học ở tuyến râu tôm sú nhiễm IHHNV.................... 20 4.2.5 Những biến đổi mô học ở cơ tôm sú nhiễm IHHNV............................... 21 4.2.6 Những biến đổi mô học ở cơ quan tạo máu tôm sú nhiễm IHHNV......... 21 Chương 5: KẾT LUẬN & ĐỀ XUẤT ....................................................................... 23 5.1 Kết luận ......................................................................................................... 23 5.2 Đề xuất........................................................................................................... 23 Tài Liệu Tham Khảo. ................................................................................................ 24 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
LỜI CẢM TẠ Xin trân trọng cảm tạ cô Bùi Thị Bích Hằng giáo viên hướng dẫn thực hiện đề tài đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Xin trân trọng cảm tạ quí thầy cô phụ trách phong thí nghiệm cùng cán bộ phụ trách thư viện khoa Thuỷ Sản đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này. Có được kết quả ngày hôm nay tôi xin chân thành cảm ơn tất cả quí thầy cô của trường, khoa thuỷ sản đã giáo dục, truyền đạt các kiến thức cần thiết ngay từ những ngày đầu bước chân đến giảng đường. Cảm ơn tập thể lớp Bệnh Học Thuỷ Sản- K30 đã giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báo trong suốt khoảng thời gian thực hiện đề tài. Và cuối cùng xin chân thành cảm tạ cha mẹ tôi, gia đình tôi đã hết lòng nuôi dưỡng, thương yêu, bảo bọc và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể lớn lên, được giáo dục và có được thành quả như ngày hôm nay. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu i
TÓM TẮT Để tìm hiểu đặc điểm mô bệnh học bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV) trên tôm sú giống, trước tiên ứng dụng kỹ thuật PCR (dùng bộ kit IQ 2000 TM) xét nghiệm 66 mẫu được15 mẫu dương tính. Sau đó, tiến hành làm tiêu bản mô học trên mẫu đã xét nghiệm bằng phương pháp truyền thống (Lightner, 1996). Quá trình thực hiện từ tháng 01/ 2008 đến tháng 05/ 2008 tại khoa thuỷ sản trường Đại Học Cần Thơ. Kết quả quan sát trên tiêu bản mô học cho thấy khi tôm bị bệnh IHHNV biểu hiện dưới mức độ vi thể là thể vùi IHHNV trong nhân phì đại của các tế bào biểu mô dưới vỏ, mang, cơ quan tạo máu, tuyến râu, cơ, mô liên kết gan tuỵ cũng như hiện tượng hoại tử làm mất cấu trúc bình thường trên các cơ quan này. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu ii
DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1: Kết quả điện di sản phẩm PCR........................................................... 13 Hình 4.1: Lớp biểu mô dưới vỏ tôm nhiễm IHHNV .......................................... 17 Hình 4.2: Cấu tạo vi thể của mang bị nhiễm IHHNV......................................... 18 Hình 4.3: Thể vùi Cowdry loại A trên mô liên kết gan tuỵ và sự hoại tử với nhiều khoảng trống........................................................................................... .19 Hình 4.4: Tuyến râu tôm sú nhiễm IHHNV ....................................................... 20 Hình 4.5: (A) Cơ tôm sú bình thường; (B) Cơ tôm sú bị bệnh. .......................... 21 Hình 4.6: Mô tạo máu nhiễm IHHNV ............................................................... 22 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT bp = Base pair ĐBSCL = Đồng Bằng Sông Cửu Long IHHNV = Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus NTTS = Nuôi Trồng Thuỷ Sản Trung tâm Học liệuThủy Sản Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu TS = ĐH Cần ORF = Open Reading Frame PCR = Polymerase Chain Reaction µl = Micro lít nm = Nano mét ADN = Acid Deoxyribonucleotide % = Phần trăm WSSV = White spot syndrome virus YHV = Yellow head virus iii
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU Việt Nam có truyền thống lâu đời trong các hoạt động khai thác và NTTS (Nuôi Trồng Thuỷ Sản). Ngành thuỷ sản đóng góp hơn 3% GDP trong hơn mười năm qua và được xem là một trong những ngành có bước trưởng thành nhanh chóng nhất trong thập kỷ vừa rồi. Tháng 12/ 1999 Chính phủ đã thông qua chương trình phát triển NTTS Việt Nam giai đoạn 2000- 2010, trong đó chỉ ra rằng đến năm 2010 tổng sản lượng NTTS phải đạt 2 triệu tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt 2,5 tỷ đô la (Tạp chí TS, số 6, 2007). Riêng sản lượng tôm nuôi năm 2004 theo Bob Rosenberry, Việt Nam đứng thứ hai trên thế giới (350.000 tấn) vượt cả Thái Lan (300.000 tấn). Thu nhập ngoại tệ từ NTTS tăng lên hàng năm và chỉ riêng tôm đã mang lại ước tính gần một tỷ USD. Thật vậy, hiện nay tôm sú (Penaues monodon) là đối tượng thuỷ sản có giá trị thương phẩm cao và cũng là đối tượng nuôi quan trọng của một số nước đang phát triển ở Châu Á. Tuy nhiên khi nuôi thuỷ sản phát triển theo hướng năng suất cao thì luôn đi kèm theo sự phát triển của dịch bệnh và đó luôn là một trong những khó khăn của NTTS. Ở Việt Nam, dịch bệnh trong NTTS trong vài năm qua đã cho thấy đây là một trong những yếu tố giới hạn rất quan trọng mà cần phải Trung tâm Họcgiải pháp khắc phục nhằm@ Tài liệu học tập phát nghiên cứu có các liệu ĐH Cần Thơ đưa nghề nuôi thuỷ sản và triển theo hướng bền vững. Bệnh đốm trắng và bệnh đầu vàng trong nuôi tôm sú hay bệnh mủ gan và ký sinh trùng trên cá da trơn là những bệnh nguy hiểm và gây tác hại nghiêm trọng cho nghề nuôi. Trong đó, tôm sú nhiễm virus gây bệnh đốm trắng có tỷ lệ chết rất cao (> 80%) mà chưa có thuốc trị hiệu quả (Tạp chí TS, số 6, 2007). Trong khi đó thì IHHNV (Infectiuos Hypodermal and Haematopoietic necrosis) là tác nhân nguy hiểm nhất ở tôm P. stylirostris và P. vannamei (Kalagayan et al., 1991). IHHNV là virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cow quan lập biểu mô ở tôm Penaeid, lần đầu tiên phát hiện vào năm 1981 ở Hawai khi gây chết hàng loạt tôm P. stylirostris (Lightner et al., 1983). Theo Carpenter & Brock (1992) IHHNV gây thiệt hại nặng nề về mặt kinh tế vì gây chết 90% tôm P. stylirostris sau hai mươi ngày thả nuôi. Tuy virus này không gây chết cho tôm sú nhưng lại là một trong những tác nhân gây chậm lớn, dị hình (Flegel, 1997). Mặc khác các đợt dịch bệnh do IHHNV gây ra có thể xảy ra bất cứ mùa nào trong năm và tôm giống là rủi ro nhất. Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật thì các phương pháp chẩn đoán bệnh trong thuỷ sản cũng ngày càng tiến bộ. Trước tiên phải kể đến PCR (Polymerase Chain Reaction), đây là kỹ thuật khuếch đại trình tự ADN
một cách nhanh nhất, được phát minh và đặt tên bởi Mullis & ctv vào năm 1985. Bên cạnh đó phương pháp mô bệnh học là một phương pháp góp phần quan trọng vào việc chẩn đoán bệnh thuỷ sản, đặc biệt là bệnh tôm. Mô bệnh học không chỉ mô tả các tổn thương ở các mô và tế bào ở mức độ vi thể mà còn so sánh đối chiếu các tổn thương đó với những biểu hiện lâm sàng của cá, tôm, nhuyễn thể (Lightner and Bell, 1988). Để ứng dụng mô bệnh học vào việc chẩn đoán tác nhân gây bệnh IHHNV trên tôm sú cũng như tìm hiểu về đặc điểm mô học của virus này đề tài ”Tìm hiểu đặc điểm mô bệnh học ở tôm sú bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV)” được thực hiện. Mục tiêu: Mô tả đặc điểm mô bệnh học ở tôm sú nhiễm IHHNV ở Việt Nam. Nội dung: Xét nghiệm IHHNV trên tôm sú giống bằng PCR nhằm tìm ra mẫu bị bệnh. Tiến hành làm tiêu bản mô học trên mẫu dương tính với IHHNV. Quan sát đặc điểm mô bệnh học ở tôm nhiễm IHHNV. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 2
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược nghề nuôi tôm trên thế giới, ở Việt Nam Trên thế giới: Các quốc gia tham gia sản xuất tôm khu vực Châu Á hiện nay như Thái Lan đã cơ bản giải quyết được các vấn đề về kỹ thuật, công nghệ nuôi tôm. Ấn Độ cũng đang có nhiều cố gắng để cải tiến các biện pháp khoa học công nghệ. Ở các quốc gia này nhiều biện pháp kỹ thuật tiên tiến đã được áp dụng vào sản xuất tôm giống có chất lượng cao như: sàng lọc tôm bố mẹ sạch bệnh bằng phương pháp kiểm tra PCR, hạn chế sử dụng thuốc kháng sinh, tăng cường sử dụng các chế phẩm sinh học, áp dụng các phương pháp kiểm dịch vệ sinh nghiêm ngặt, … Ấn Độ và Thái Lan đã thành lập các ngân hàng tôm bố mẹ có khả năng kháng bệnh và đang nghiên cứu phát triển đàn tôm bố mẹ thông qua phương pháp thuần hoá, … Tóm lại đẩy mạnh phát triển khoa học công nghệ nhằm nâng cao tính bền vững của nuôi tôm là ưu tiên hàng đầu của người sản xuất và các quốc gia xuất khẩu tôm (Nguyễn Thị Ngọc, 2007). Trung tâm Học liệu ĐHtăng số lượng tôm thì bệnh tômhọc tập và nghiên cứu Song song với việc Cần Thơ @ Tài liệu cũng ngày càng phát triển nhiều và xuất hiện nhiều bệnh lạ chưa có giải pháp điều trị. Theo Bùi Quang Tề (2006) thì có gần 30 bệnh và hội chứng của tôm nuôi với một số tác nhân gây bệnh quan trọng như virus, vi khuẩn, nấm và nguyên sinh động vật. Hiện nay chưa có phương pháp nào điều trị bệnh virus thành công ở tôm. Ở Việt Nam Nghề nuôi tôm ở Việt Nam thực sự phát triển vào năm 1987 và nuôi tôm thương phẩm phát triển vào những năm đầu thập kỷ 90 của thế kỷ trước. Đến giữa thập kỷ 90 (1994 – 1995) phát triển nuôi tôm ở Việt Nam có phần chững lại do gặp phải nạn dịch bệnh tôm. Trong các năm 1996 – 1999 dịch bệnh có giảm nhưng vẫn tiếp tục gây thiệt hại cho người nuôi (Phạm Văn Công, 2007). Năm 2000 được xem là năm đánh dấu sự bùng nổ của nghề nuôi tôm thương phẩm khi chính phủ ban hành nghị quyết 09 cho phép chuyển đổi một phần diện tích trồng lúa, làm muối năng suất thấp, đất hoang hoá sang NTTS (Tạp Chí Thuỷ Sản, số 6, 2007) Theo Hanafi & T. Ahmad (1999) (trích dẫn từ Lê Khanh (2006)) thì diện tích nuôi tôm ở Việt Nam tăng từ 250.000 ha năm 2.000 sang 478.000 ha năm 2001 và 540.000 ha năm 2003, cho đến nay diện tích nuôi tôm vẫn tiếp tục 3
tăng tuy nhiên tốc độ đã có phần chững lại. Theo số liệu hiện có Việt Nam là nước có diện tích nuôi tôm vào loại lớn trên thế giới, vượt xa Indonesia, nước có diện tích nuôi tôm lớn nhất vào năm 1996 (khoảng 360.000 ha). Phần lớn diện tích nuôi tôm tập trung ở ĐBSCL, rãi rác dọc các cửa sông, kênh, gạch, ven biển miền Trung và ở đông bằng sông Hồng, sông Thái Bình ở miền Bắc. ĐBSCL được đánh giá là vùng trọng điểm về NTTS của Việt Nam với hơn 1 triệu ha diện tích mặt nước ngọt và lợ. Năm 2003, ĐBSCL sản xuất khoảng 0,67 triệu tấn thuỷ sản chiếm 64,6% sản lượng thuỷ sản nuôi cả nước và hơn 55% tổng giá trị xuất khẩu (Bộ Thuỷ Sản, 2004). Song song với việc mở rộng diện tích, sản lượng nuôi tôm cũng tăng mạnh từ những năm 90 và đặc biệt là từ sau năm 2000. Các loài tôm nuôi chính ở Việt Nam bao gồm: tôm sú (Penaeus monodon), tôm he (Penaeus merguiensis), tôm đất (Metapenaeus ensis), … trong đó tôm sú là tôm nuôi chủ đạo đóng góp sản lượng cao nhất. Các thị trường xuất khẩu tôm quan trọng của Việt Nam là: Mỹ, Nhật Bản, Trung Quốc và Liên Minh Châu Âu (Hanafi & T. Ahmad, 1999 trích dẫn từ Lê Khanh, 2006). 2.2 Tác nhân gây bệnh IHHNV 2.2.1 Đặc điểm của tác nhân gây bệnh IHHNV Trung tâm Học là virus nhỏ Cầnthuộc họ@ Tài liệuhọ phụ tập và nghiên cứu IHHNV liệu ĐH nhất Thơ Parvoviridae, học Densovirinae, giống Brevidensovirus hoặc Contravirus (Shike et al., 2000). Virus có cấu trúc khối 20 mặt, không có màng bao, đường kính từ 19 – 22 nm, ADN sợi đơn (Lightner et al., 1983). Hệ gen của IHHNV gồm 3 đoạn ORF (Open Reading Frame): ORF1, ORF2, ORF3 (Nunan et al., 2000). Trong đó đoạn ORF1 chiếm khoảng 50% hệ gen và không chứa protein cấu trúc, có khả năng mã hoá một chuỗi polypeptit dài 666 amino acid (Tratschin et al., 1984; Hermonat et al., 1984). Đoạn ORF2 cũng không chứa protein cấu trúc, có khả năng mã hoá chuỗi polypeptit gồm 434 amino acid (Shike, 2000). Cuối cùng là đoạn ORF3, đoạn này có khả năng mã hoá chuỗi polypeptit dài 329 amino acid. Thành phần cấu tạo gen của IHHNV là: 20,68% A, 19% C, 24,04% G, 36,28% T và A + T= 56,96%; G + C= 43,04%. Đoạn ORF3 có 4 chuỗi polypeptit với trọng lượng phân tử lần lượt là 74, 47, 39, 37,5 kda. ADN có tính phân cực (85% âm cực, 15% dương cực) (Regenmortel et al., 2000 được trích dẫn bởi Bùi Thị Bích Hằng, 2007). Về đặc điểm mô học, sau khi IHHNV tấn công vào tế bào vật chủ tạo thể vùi Cowdry loại A trong nhân tế bào làm nhân phì đại. Thể vùi ưa eosin nằm ở trung tâm nhân, tách rời mép rìa nhiễm sắc thể bởi một vòng sáng không nhuộm màu. Thể vùi xuất hiện trong nhân tế bào ở một số cơ quan: mang, biểu 4
mô dưới vỏ, tế bào hệ thần kinh, tuyến râu, mô tạo máu, tế bào tuyến sinh dục tổ chức limpho, mô liên kết, cơ, tim, hồng cầu. (Bell & Lightner, 1984, Lightner, 1996). 2.2.2 Dấu hiệu bệnh lý Theo Bell & Lightner (1984) thì biểu hiện chung khi 3 loài tôm P. stylirostris, P. vannamei, P. monodon nhiễm IHHNV là hội chứng dị hình, còi cọc (RDS: runt deformity syndrome). Biểu hiện riêng của từng loài như sau: Khi tôm P. stylirostris nhiễm IHHNV dạng cấp tính, tôm nổi lên mặt nước, xoay tròn rồi chìm xuống đáy, bỏ ăn, hôn mê, xuất hiện chấm lốm đốm ở lớp vỏ ngoài, cơ đục, tỷ lệ chết cao. Biểu hiện về mặt mô học là sự hoại tử, viêm sưng lớp biểu mô dạ dày, ruột, mang, cơ, hệ thần kinh, mô liên kết và mô tạo máu, đồng thời xuất hiện thể vùi Cowdry loại A trong nhân của những tế bào trên (Lightner et al., 1983). Đối với tôm P. vannamei thì IHHNV không gây tỷ lệ chết cao như P. stylirostris nhưng cũng không kém phần nguy hiểm. IHHNV làm tôm chậm lớn, dị hình, còi cọc (Kalagayan et al., 1991). Tôm giống chậm phát triển, dị hình, râu quăn queo, vỏ kitin xù xì hoặc biến dạng. Tuy vậy, khi tôm mới nhiễm bệnh thường không có biểu hiện rõ ràng (Bell & Lightner,1984; Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu thấy cótập vàhiện thể vùi cứu Lightner et al., 1983). Phân tích mô bệnh học cho học sự xuất nghiên Cowdry loại A ở tế bào thần kinh, tuyến râu, lớp biểu bì dưới vỏ, mô tạo máu nhưng không tìm thấy ở tổ chức limpho cũng như cơ tim (Kalagayna et al., 1991). Tôm sú P. monodon khi nhiễm IHHNV lúc sắp chết thường chuyển sang màu xanh, cơ phần bụng mờ đục (Lightner et al., 1983). P. monodon ở Philippin khi nhiễm bệnh chậm phát triển, còi cọc, riêng tôm đực thì chất lượng tinh dịch không tốt (Primavera & Quinitio, 2000). Tuy nhiên, ở Thái người ta chưa đánh giá mức độ ảnh hưởng của IHHNV trên tôm sú (Chayaburakul et al., 2005). 2.2.3 Phân bố và lan truyền bệnh IHHNV được phát hiện đầu tiên vào năm 1981ở Hawai khi gây chết hàng loạt tôm P. stylirostris (Lightner et al., 1983). Sau đó virus lan rộng đi khắp nơi như Tahiti, Florida, Texas, Islands, Israel, Panama, Costa Rica, Belize, Ecuador, Brazil, Honduras, France và Jamaica (Vega- Villasante & Puente, 1995). Ấu trùng tôm P. stylirostris thường lây nhiễm IHHNV từ nguồn tôm bố mẹ, tuy nhiên virus không gây ảnh hưởng ngay trong vài tuần đầu, nó chỉ gây chết khi ấu trùng tôm đạt trọng lượng 0,05 – 0,1g (Lightner et al., 1983). Bệnh 5
xuất hiện từ giai đoạn ấu trùng đến tôm trưởng thành. Tuỳ vào mức độ nhiễm mà có biểu hiện bệnh khác nhau. Bệnh xuất hiện cả ở Singapore, Thái Lan, Philippines, Indonesia, Malaysia. Virus có thể lây lan theo chiều dọc và chiều ngang (Bell & Lightner, 1984). Lightner (1996) cho biết khi nuôi ấu trùng và tôm giống với mật độ cao rất dễ mắc bệnh. IHHNV có thể lây nhiễm ở nhiều loài tôm Penaeid: P. stlirostris, P. vannamei, P. monodon, P. japonicus, P. aztecus và P. duoraum nhưng chỉ gây thiệt hại nặng nề cho P. stylirostris, P. vannamei (Lightner, 1996). Ngoài những loài tôm kể trên còn có P. occidentalis, P. californiensis, P. semisalcatus, P. setiferus, P. indicus, P. merguiensis cũng có khả năng nhiễm IHHNV (V A. Graindorge & T W. Flegel, 1999 trích dẫn từ Bùi Quang Tề, 2006). 2.2.4 Chẩn đoán bệnh Dựa vào dấu hiệu bệnh lý Xét nghiệm PCR Quan sát tế bào tuyến râu, mang, biểu mô dưới vỏ,…của tôm trên tiêu bản cắt mô nhuộm màu hematoxylin & eosin. 2.2.5 Thiệt hại do IHHNV gây ra Trung tâm Học liệuthiệt hại nặng nề về mặt kinh tế học tập và nghiên cứu IHHNV gây ĐH Cần Thơ @ Tài liệu vì gây chết 90% tôm P. stylirostris sau 20 ngày thả nuôi (Carpenter & Brock, 1992). Theo Lightner & Redman (1998) thì thiệt hại do IHHNV gây ra trên tôm P. vannamei là 10% - 50%, tôm tự nhiên ở Ecuador 63%, tôm nuôi Panama 95%. Trong bài báo của mình, Lê An (2007) cho biết virus gây hoại tử xuất hiện thành dịch gây thiệt hại 70% - 80% tôm nuôi P. vannamei năm 2004 tại các vùng nuôi ở Brazil và vẫn còn nguy cơ báo động trở lại. IHHNV thường xuất hiện sau khi thả 30 ngày làm tôm bị biến dạng chuỷ, cơ thể cong queo, nếu tôm bệnh nhẹ tỷ lệ biến dạng là 10% - 20%, trường hợp bệnh nặng biến dạng 70% - 80%. Các đợt dịch có thể xảy ra bất cứ mùa nào trong năm. 2.2.6 Những nghiên cứu về bệnh Khi tôm nhiễm bệnh, IHHNV được tìm thấy ở rất nhiều bộ phận như: mang, biểu bì ruột trước, tuyến râu, dây thần kinh, … Những bộ phận này thường được sử dụng để chẩn đoán bệnh bằng phương pháp mô bệnh học (Lightner et al.,1983; Bell & Lightner, 1984). So sánh trình tự nucleotit của IHHNV gây bệnh trên tôm P. vannamei Mỹ và P. stylirostris, Bonami et al (1990), Shike et al (2000) cho biết sự giống nhau đó là 99,5%. Jimenez et al (1999) đã phát triển phương pháp lai tại chỗ để chẩn đoán bệnh IHHNV, phương pháp này nhạy và mang tính đặc hiệu cao nhưng cần thời gian dài để hoàn thành (2- 3 6
ngày). Nghiên cứu sâu hơn ở mức độ phân tử, dòng IHHNV trên tôm M. rosenbergii có trình tự nucleotit tương đồng với IHHNV trên tôm P. monodon ở Đài Loan là 99,7% (Hsieh et al., 2003). IHHNV có thể gây ra tỷ lệ chết cao ở tôm post Macrobrachium rosenbergii cũng như P. stylirostris nhưng cơ quan đích khác nhau (Hsieh et al., 2006). Hiện nay đã sản xuất được kháng thể đơn dòng của IHHNV. Bên cạnh đó, Dot blot, lai western, hoá mô miễn dịch là những phương pháp chuẩn để đánh giá sự tiện dụng của loại kháng thể này. Kháng thể có thể phát hiện IHHNV với độ nhạy 0,1- 0,5x 10-3 µg/µl protein GP3. Đồng thời cũng thể hiện băng đậm khi phát hiện vi khuẩn Ecoli chứa protein tái tổ hợp GP3- pETI 5b ở vị trí 37 kda với độ pha loãng 1: 1000. Mặt khác, kháng thể với nồng độ 1: 10 cũng cho phản ứng đặc hiệu khi bao xung quanh các thể vùi IHHNV ở nhiều bộ phận của tôm bị nhiễm bệnh như: mang, dây thần kinh, cơ, tế bào biểu bì (Bùi Thị Bích Hằng & Timothy W. Flegel, 2007). Melena et al (2005) thực hiện cảm nhiễm lần đầu cho ấu trùng và hậu ấu trùng tôm P. vannamei virus IHHN hoặc WSSV đã được bất hoạt bằng formalin. Kết quả sau quá trình gây cảm nhiễm và kiểm chứng kết luận: tiền cảm nhiễm IHHNV cũng như WSSV bất hoạt đều có tác dụng làm chậm khả năng sao chép của WSSV, giảm tỷ lệ tôm chết. Qua đó cho thấy vai trò bảo vệ của IHHNV như một virus ức chế quá Trung tâm Học liệucủa WSSV (Melena,@ Tài liệu học tập và nghiên cứu trình sinh sản ĐH Cần Thơ 2005). 2.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh: 2.3.1 Phương pháp PCR Kỹ thuật PCR ( Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật khuếch đại trình tự ADN chuyên biệt một đoạn ADN với sự hiện diện của một hoặc hai đoạn mồi (Olygonucleotides), enzyme tổng hợp ADN, các nucleotit tự do, dung dịch đệm theo các chu kỳ nhiệt. Kỹ thuật này được phát minh và đặt tên bởi Mullis và các cộng sự (Mỹ) vào năm 1985. Đây là một kỹ thuật rất nhạy bén và đặc biệt cho phép tìm ra rất nhanh chóng chỉ với một lượng virus rất thấp . Những virus ẩn không có các biến đổi về mô học cũng có thể tìm thấy bằng kỹ thuật này và hiện nay nó được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu để phát hiện và tạo ra đột biến gen, chẩn đoán bệnh, … Theo Trần Thị Tuyết Hoa (2004) thì PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước: Bước 1 (giai đoạn biến tính): phân tử ADN được làm biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử ADN, thường là 92 – 95oC trong 30 – 60 giây. Mạch đôi ADN tách ra thành mạch đơn tạo điều kiện cho sự bắt cặp các đoạn mồi. 7
Bước 2 (giai đoạn gắn mồi): trong bước này nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy, các đoạn mồi sẽ bắt cặp mạch đơn ADN khuôn ở vị trí bổ xung. Nhiệt độ này dao động từ 45 – 65oC trong khoảng thời gian là 1phút. Nhiệt độ này có thể thay đổi vì thay đổi cặp mồi. Bước 3 (giai đoạn kéo dài): nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp cho ADN polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất. Lúc này các đoạn mồi đã bắt cặp ADN khuôn mẫu sẽ được kéo dài. Thời gian của bước này tuỳ thuộc độ dài của trình tự ADN cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây – 1 phút. Mỗi chu kỳ trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần lặp lại làm tăng gấp đôi mẫu của lần trước. Đây là sự lặp lại theo cấp số nhân, tối đa là 40 chu kỳ với khoảng 106 bản sao. Sau phản ứng PCR các ADN được nhuộm bởi ethidium bromide và có thể quan sát thấy thông qua việc điện di sản phẩm PCR trên gel agarose và đọc kết quả dưới bàn đọc UV. 2.3.2 Phương pháp mô học: Các định nghĩa về mô bệnh học: Mô học là môn khoa học nghiên cứu các tổn thương ở các mô và tế bào. Nghĩa Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài đó ở mức độ tập và nghiên cứu là mô tả đầy đủ mọi chi tiết của tổn thương liệu học vi thể. Mô bệnh học không chỉ mô tả tổn thương mà còn là công việc so sánh, đối chiếu các tổn thương đó với những biểu hiện lâm sàng của cá, tôm, nhuyễn thể, nghĩa là tìm hiểu mối quan hệ mật thiết giữa biến đổi hình thái và các rối loạn chức năng, trên cơ sở đó xác định việc chẩn đoán (Lightner and Bell, 1988 trích dẫn từ Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003). Mô học được nghiên cứu bắt đầu từ khi chiết kính hiển vi đầu tiên được chế tạo bởi Antoni Van Leuwenhock người Hà Lan, đến cuối thế kỷ XVIII Robert Hooke đã xác định tế bào là đơn vị cấu tạo cơ thể sinh vật. Ông đã nghiên cứu rất nhiều về mô và có viết một tài liệu ngắn về mô bệnh học nói về đặc điểm của những tế bào chết (sự hoá lỏng, hoá rắn và sự biến đổi hình dạng nhân của tế bào chết), phản ứng sinh lý của cơ thể khi bị nhiễm bệnh và phương pháp kỹ thuật để làm tiêu bản mô bệnh học. Mô học có thể được định nghĩa như một hệ thống các tế bào và chất gian bào có cùng nguồn gốc, cấu tạo và chức năng, chúng được hình thành do quá trình tiến hoá sinh học và xuất hiện ở một cơ thể đa bào do quá trình biệt hoá . Trong thuỷ sản mô học là một kỹ thuật rất quan trọng trong nghiên cứu bệnh tôm và nhiều trường hợp chỉ có thể chẩn đoán được bệnh bằng phương pháp này. Tuy nhiên cũng có những hạn chế là thao tác chậm, tốn nhiều thời gian và 8
chỉ phát hiện rõ khi tôm đã bị nhiễm nặng. Phương thức mô chỉ nên sử dụng như là một lĩnh vực trong việc xác định nguyên nhân của bệnh. Nó phải được kết hợp với tất cả các dữ liệu về môi trường và sức khoẻ tôm nghĩa là so sánh và đối chiếu với các kết quả quan sát bên ngoài để có được một chẩn đoán đúng. Nếu chỉ dựa vào các hình thái tổn thương bên trong mà không biết các dữ kiện khác có liên quan thì thường có những kết luận sai lầm vì những hình thái tổn thương của một số bệnh có biểu hiện giống nhau . Một số ứng dụng cuả mô bệnh học: Young (1959) và Johnson (1980) đã ứng dụng giải phẩu học và mô học trong việc hệ thống bệnh thường gặp trong nuôi tôm ở Châu Mỹ, Châu Á (Lightner et al, 1992). Thời gian sau, Wang và ctv (1997) chứng minh sự hiện diện của vi rút đốm trắng trên tôm sú, tôm thẻ và tôm he Nhật Bản bằng việc quan sát tiêu bản mô học dưới kính hiển vi quang học và điện tử. Một năm sau đó, năm 1998, Sudha và ctv bằng phương pháp mô học đã xác định mối quan hệ giữa các loài vi rút gây nhiễm trên các loài tôm biển ở Ấn Độ. Ở Việt Nam năm 1999, Nguyễn Văn Hảo nghiên cứu bệnh tôm trên tôm sú nuôi tại Trà Vinh bằng phương pháp mô học và PCR, bằng việc kết hợp hai phương pháp này ông mô tả rất cụ thể các đặc điểm mô học của các tác nhân Trung tâm Học liệu tôm sú. Năm Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu gây bệnh trên ĐH Cần sau ông cũng ứng dụng kỹ thuật này trong nghiên cứu đề tài về bệnh đỏ mang trên tôm bố mẹ. Phương pháp mô học cũng được Hoà năm 2001 ứng dụng trong việc xác định cường độ cảm nhiễm MBV. Bùi Quang Tề (2003) đã ứng dụng kỹ thuật mô học vào chẩn đoán bệnh tôm và nêu ra phương pháp phòng trị. Cùng năm này, Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003 đã ứng dụng kỹ thuật mô học trong chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm sú. Qua đó, tác giả đã mô tả hầu hết đặc điểm các cơ quan trên tôm bình thường và tôm bệnh. Cho đến nay, mô bệnh học vẫn luôn đựơc ứng dụng trong nhiều trường hợp để chẩn đoán tác nhân gây bệnh trên cá, tôm, nhuyễn thể nói chung. 9
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu: Địa điểm: Phòng thí nghiệm bệnh học thuỷ sản, khoa thuỷ sản, trường Đại Học Cần Thơ. Thời gian: Tháng 01/ 2008 đến tháng 05/ 2008. 3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: Vật liệu nghiên cứu: Mẫu tôm sú giống được thu từ những hộ dân đem mẫu đến phòng thí nghiệm để xét nghiệm bệnh. Phương pháp nghiên cứu: 3.2.1 Chẩn đoán bệnh IHHNV bằng kỹ thuật PCR theo bộ kit IQ Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 2000TM Dụng cụ và hoá chất: Máy PCR Máy chụp hình gel Bộ micropippet Cân Ông típ 2ml và 0.5ml Bô kit WSSV/ IQ 2000 Đầu cone xanh, vàng Agarose Máy ủ Ethanol Máy trộn mẫu Ethidium bromide Máy li tâm Dung dịch điện di TAE Máy điện di Nước cất Ly trích ADN bằng lysis buffer Lấy 500µl lysis buffer Cho 20 – 25 tôm bột vào ống eppendoff 1.5ml và nghiền kỹ. Ủ mẫu đã chuẩn bị ở 95 oC trong 10 phút, sau đó ly tâm (12000 vòng/ phút) trong 10 phút. 10
Chuyển 200µl phần trong ở trên sang ống eppendoff 1.5ml mới có chứa 400µl dung dịch 95 ethanol. Lắc nhẹ và ly tâm (12000 vòng/ phút) trong 5 phút. Sau đó rút bỏ dung dịch ethanol và làm khô ADN. Hoà tan ADN với 200µl dung dịch TE. Sau khi hoà tan xong trữ mẫu ở tủ lạnh -20oC cho đến khi sử dụng. Thực hiện các thao tác PCR Chuẩn bị hoá chất phản ứng: PCR: 13µl/ phản ứng. Chuẩn bị các hoá chất cần thiết sau: Pre- Mix reagent: 12,5µl Iqzyme ADN polymerase 2UI/ µl: 0.5µl Các thao tác thực hiện phản ứng Việc chuẩn bị hỗn hợp cho phản ứng PCR được thực hiện dựa theo số lượng mẫu cần phân tích. Mỗi lần chuẩn bị cần tính thêm đối chứng dương và một mẫu đối chứng âm. Trung tâm Học liệu hợp trên vào típ nhựa@ Tài liệu làm dấu. và nghiên cứu Cho 13µl hỗn ĐH Cần Thơ 0.2ml đã được học tập Thêm 2µl ADN mẫu hoặc mẫu chuẩn vào mỗi phản ứng. Thực hiện PCR theo điều kiện phản ứng sau: 94oC trong 20 giây 70oCtrong 20 giây Lặp lại chu kỳ trên 10 lần 94oC trong 20 giây 56oC trong 20 giây 72oC trong 30 giây Lặp lại chu kỳ trên 35 lần 72oC trong 30 giây 20oC trong 30 giây Điện di: Chuẩn bị bản thạch 11
Qúa trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 0,5X và bản thạch (1% agarose). Đun nóng dung dịch agarose bằng lò vi sóng cho tới khi agarose tan hoàn toàn. Sau đó, để dung dịch agarose nguội khoảng 50 - 60oC, cho Ethidium bromide vào và đổ từ từ agarose vào khay đựng gel đã chuẩn bị trước. Thể tích gel tuỳ thuộc vào khay gel. Khi gel đặc lại cẩn thận gỡ lược gel và các keo dán ở hai bên ra khởi khay đựng gel. Gel sẽ được điện di. Điện di Đầu tiên, đặt gel vào bồn điện di (phân tử ADN sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương vì ADN mang điện tích âm), thêm dung dịch điện di TAE 0.5X vào bồn cho tới khi dung dịch này vừa bao phủ gel. Dùng pipette hút 10µl mẫu cần phân tích trộn với một giọt 6X Loading Dye cho vào từng giếng một. Phải dùng thang ADN cho từng gel để xác định trọng lượng phân tử của mẫu cần phân tích. Sau đó, nối bồn điện di với nguồn điện, điều chỉnh dòng điện là 90V và thực hiện quá trình điện di. Ngừng điện di khi màu xanh đậm di chuyển đến khoảng Trung tâm Học2/3 gel.ĐH đó tiến hành đọc kết quả.liệu học tập và nghiên cứu 1/2 đến liệu Sau Cần Thơ @ Tài Đọc kết quả: Nếu mẫu hiện lên vạch tương ứng 438bp, 644bp thì mẫu dương tính với IHHNV. Nếu mẫu chỉ hiện lên vạch tương ứng vạch 243bp thì mẫu âm tính với IHHNV. Hình 3.1: Kết quả điện di sản phẩm PCR (Nguồn Interligene Farming) Cột 1: mẫu chuẩn một, 20000 bản sao/ phản ứng. Cột 2: mẫu chuẩn một, 2000 bản sao/ phản ứng Cột 3: mẫu chuẩn một, 200 bản sao/ phản ứng Cột 4: nước cất 12
Cột 5: mẫu nhiễm IHHNV nặng. Cột 6: mẫu nhiễm IHHNV trung bình Cột 7: mẫu nhiễm IHHNV nhẹ. Cột 8: mẫu không nhiễm IHHNV. Cột M: trọng lượng phân tử được đánh dấu 848, 630, 333bp. 3.2.2 Kỹ thuật mô học: (phương pháp của Lightner, 1996) Dụng cụ và hoá chất: Dụng cụ: bộ tiểu phẩu, kính hiển vi, máy cắt lát, lame, lamelle, khuôn đúc, khai nhuộm, máy ảnh, … Hoá chất: dung dịch cố định Davidson’s, nước cất, cồn tuyệt đối, xylen, parafin, thuốc nhuộm Hematoxylin & Eosin, keo Canada palsam, … Phương pháp làm tiêu bản mô học Cho tôm post trực tiếp vào dung dịch cố định Davidson’s trong vòng 12 đến 24 giờ, sau đó mẫu được chuyển sang giữ ở cồn 70o. Xử lý mẫu Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ TàiHoward, 1997) được càinghiên cứu Qui trình xử lý mẫu mô tôm (Coolidge và liệu học tập và đặt trong máy xử lý mô theo các bước: STT Hoá chất sử dụng Thời gian (phút) 1 Cồn 80o 30 2 Cồn 95o 60 3 Cồn 95o 30 4 Cồn 100o 60 5 Cồn 100o 180 6 Cồn 100o 180 7 Cồn 100o 180 8 Xylen 30 9 Xylen 30 10 Parafin - Xylen (7:3) 60 11 Parafin - Sáp ong (1: 1) 60 12 Parafin - Sáp ong (7:1) 60 Sau khi hoàn thành bước cài đặt chương trình xử lý mô thì tiến hành cho sọt chứa mẫu mô vào lọ số 1 và cho chương trình được cài đặt trên vận hành. Đúc khối: 13