Khóa luận tốt nghiệp Nông học: Ảnh hưởng của BA, NAA và dịch chiết đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya (Cattleya sp.) in vitro

Chia sẻ: Tomjerry | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:121

Thêm vào BST

Báo xấu

60
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của khóa luận nhằm xác định liều lượng của BA và NAA thích hợp để nhân chồi lan Cattleya. Xác định liều lượng dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa thích hợp cho sự sinh trưởng chồi lan Cattleya. Xác định liều lượng NAA thích hợp cho sự tạo rễ lan Cattleya.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp Nông học: Ảnh hưởng của BA, NAA và dịch chiết đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya (Cattleya sp.) in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA NÔNG HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ẢNH HƯỞNG CỦA BA, NAA VÀ DỊCH CHIẾT ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA LAN CATTLEYA (Cattleya sp.) IN VITRO NGÀNH : NÔNG HỌC KHÓA : 2012 - 2016 SINH VIÊN THỰC HIỆN : NGUYỄN CAO KIỆT Tp. Hồ Chí Minh, tháng 03 năm 2016
ẢNH HƯỞNG CỦA BA, NAA VÀ DỊCH CHIẾT ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA LAN CATTLEYA (Cattleya sp.) IN VITRO Tác giả NGUYỄN CAO KIỆT Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng kỹ sư ngành Nông học NGƯỜI HƯỚNG DẪN: ThS. Nguyễn Thị Thanh Duyên Tp. Hồ Chí Minh, tháng 03 năm 2016 i
LỜI CẢM ƠN Con xin thành kính khắc ghi công ơn bố mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng và dạy dỗ con nên người, anh chị em và những người thân trong gia đình đã hết lòng yêu thương, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho con có được ngày hôm nay. Em xin trân trọng cảm ơn cô Nguyễn Thị Thanh Duyên – khoa Nông học trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn:  Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.  Các thầy cô giáo đã truyền đạt kiến thức trong những năm đầu học tập.  Văn phòng khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM đã giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập.  Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô khoa Nông học trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích trong suốt thời gian học tập tại trường.  Quý thầy cô trong bộ môn Di truyền – Giống, khoa Nông học đã tạo điều kiện cho em trong thời gian thực hiện đề tài.  Các anh, chị và các bạn trong và ngoài lớp đã luôn động viên và tận tình giúp đỡ trong thời gian tiến hành khóa luận. Xin chân thành cảm ơn! TP. Hồ Chí Minh, tháng 3 năm 2016 Sinh viên Nguyễn Cao Kiệt ii
TÓM TẮT Đề tài “Ảnh hưởng của BA, NAA và dịch chiết đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya (Cattleya sp.) in vitro” đã được tiến hành tại bộ môn Di truyền – Giống, khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh từ tháng 10/2015 đến tháng 3/2016. Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố và hai yếu tố với ba lần lặp lại bao gồm thí nghiệm khảo sát nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân chồi của lan Cattleya, thí nghiệm khảo sát liều lượng dịch chiết khoai tây, cà rốt, nước dừa đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya và thí nghiệm khảo sát nồng độ NAA lên sự tạo rễ của lan Cattleya nhằm mục tiêu nhân nhanh số lượng chồi, kích thích sự ra rễ của giống Cattleya sp. in vitro. Kết quả thu được như sau: Xác định được môi trường MS + agar 8,5 g/l + than hoạt tính 0,5 g/l + đường 30 g/l có bổ sung (0,1 mg NAA + 4 mg BA)/lít thích hợp cho việc nhân chồi lan Cattleya nhất. Kết quả cho thấy số chồi hình thành nhiều nhất (19,03 chồi ở giai đoạn 90 NSC). Xác định được môi trường MS + agar 8,5 g/l + than hoạt tính 0,5 g/l + đường 30 g/l có bổ sung 20% nước dừa thích hợp cho sự sinh trưởng lan Cattleya nhất. Kết quả cho thấy số chồi hình thành nhiều nhất (14,06 chồi ở giai đoạn 90 NSC), khối lượng lớn nhất (0,77 g ở giai đoạn 90 NSC). Xác định được môi trường MS + agar 8,5 g/l + than hoạt tính 0,5 g/l + đường 30 g/l có bổ sung 5 mg NAA trên lít thích hợp nhất cho sự hình thành rễ lan Cattleya. Kết quả cho thấy số rễ hình thành nhiều nhất (3,27 rễ/cây ở giai đoạn 80 NSC). iii
MỤC LỤC Trang tựa ...................................................................................................................... i Lời cảm ơn...................................................................................................................ii Tóm tắt .......................................................................................................................iii Mục lục....................................................................................................................... iv Danh sách từ viết tắt ................................................................................................... vii Danh sách bảng .........................................................................................................viii Danh sách hình............................................................................................................ ix GIỚI THIỆU .............................................................................................................. 1 Đặt vấn đề .................................................................................................................... 1 Mục tiêu – Yêu cầu ...................................................................................................... 2 Mục tiêu....................................................................................................................... 2 Yêu cầu........................................................................................................................ 2 Giới hạn ....................................................................................................................... 2 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................................... 3 1.1 Giới thiệu về nuôi cấy mô tế bào thực vật................................................................ 3 1.1.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật ...................................................... 3 1.1.2 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam ............................................. 6 1.1.3 Lợi ích của phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô........................................ 8 1.1.4 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ...................................................... 8 1.1.5 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ............. 9 1.1.5.1 Auxin ............................................................................................................. 10 1.1.5.2 Cytokinin........................................................................................................ 11 1.1.6 Dịch chiết sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ......................................... 11 1.1.6.1 Khoai tây ........................................................................................................ 12 1.1.6.2 Cà rốt.............................................................................................................. 12 1.1.6.3 Nước dừa ........................................................................................................ 12 1.1.7 Môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm .......................................................... 12 1.2 Một số hình ảnh về hoa Cattleya ........................................................................... 14 iv
1.3 Giới thiệu về lan Cattleya ..................................................................................... 15 1.3.1 Danh pháp khoa học .......................................................................................... 15 1.3.2 Nguồn gốc ......................................................................................................... 15 1.3.3 Đặc điểm thực vật học và phân loại .................................................................... 16 1.3.4 Yêu cầu sinh thái ............................................................................................... 16 1.3.5 Kỹ thuật chăm sóc ............................................................................................. 17 1.4 Sơ đồ quy trình nhân giống hoa lan in vitro ........................................................... 18 1.5 Một số kết quả nghiên cứu về nuôi cấy mô phong lan .......................................... 19 1.5.1 Thế giới ............................................................................................................. 19 1.5.2 Việt Nam ........................................................................................................... 20 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 22 2.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm .......................................................................... 22 2.2 Nội dung .............................................................................................................. 22 2.3 Vật liệu thí nghiệm ............................................................................................... 22 2.3.1 Giống ................................................................................................................ 22 2.3.2 Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm ................................................................ 23 2.3.2.1 Phòng thí nghiệm ............................................................................................ 23 2.3.2.2 Môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm ....................................................... 24 2.3.2.3 Các hóa chất ................................................................................................... 24 2.4 Phương pháp thí nghiệm ....................................................................................... 25 2.4.1 Thí nghiệm 1: khảo sát nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân chồi của lan Cattleya...................................................................................................................... 25 2.4.2 Thí nghiệm 2: khảo sát liều lượng dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya ............................................................................... 26 2.4.3 Thí nghiệm 3: khảo sát nồng độ NAA lên sự tạo rễ của lan Cattleya ................... 28 2.5 Xử lý số liệu ......................................................................................................... 29 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 30 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân chồi của lan Cattleya ..... 30 3.2 Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya ................................................................................................................ 38 3.3 Ảnh hưởng của NAA lên sự tạo rễ của lan Cattleya ............................................... 46 v
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ....................................................................................... 50 Kết luận................................................................................................................. 50 Đề nghị ................................................................................................................. 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................ 52 PHỤ LỤC ................................................................................................................. 55 Phụ lục 1 Hình ảnh thí nghiệm.................................................................................... 55 Phụ lục 2 Kết quả xử lý thống kê ................................................................................ 58 vi
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Đầy đủ ( Nghĩa) BA 6-Benzyladenine BAP 6-Benzylaminopurin CTV Cộng tác viên KC Knudson C Lux Đơn vị tính cường độ ánh sáng MS Murashige và Skoog NAA  -Naphthalene acetic acid NCM Nuôi cấy mô ND Nước dừa NSC Ngày sau cấy PLBs Protocorm-like bodies PPFD Photosynthetic photon flux density (Mật độ dòng photon hữu hiệu cho quang hợp) TN Thí nghiệm VW Vacin & Went RE Robert Ernst RPM Revolutions Per Minute (Vòng trên phút) vii
DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân chồi ..................... 26 Bảng 2.2 Ảnh hưởng của các dịch chiết đến khả năng nhân chồi ................................. 27 Bảng 3.1a Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến chiều cao chồi giai đoạn 10 – 40 NSC (cm) ...................................................................................................... 31 Bảng 3.1b Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến chiều cao chồi giai đoạn 50 – 90 NSC (cm) ...................................................................................................... 32 Bảng 3.2a Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến số chồi giai đoạn 30 – 60 NSC (chồi) .................................................................................................. 33 Bảng 3.2b Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến số chồi giai đoạn 70 – 90 NSC (chồi) .................................................................................................. 35 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến đường kính (cm) và khối lượng (g) cụm chồi giai đoạn 90 NSC ........................................................................................... 37 Bảng 3.4a Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến chiều cao chồi giai đoạn 10 – 40 NSC (cm) ........................................................................................ 38 Bảng 3.4b Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến chiều cao chồi giai đoạn 50 – 90 NSC (cm) ........................................................................................ 40 Bảng 3.5a Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến số chồi giai đoạn 10 – 60 NSC (chồi)...................................................................................................... 42 Bảng 3.5b Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến số chồi giai đoạn 70 – 90 NSC (chồi) ....................................................................................... 44 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến đường kính (cm) và khối lượng (g) cụm chồi giai đoạn 90 NSC .................................................................... 45 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự tạo rễ của Cattleya giai đoạn 20 – 80 NSC (rễ/cây) .................................................................................................. 46 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tốc độ ra rễ của Cattleya giai đoạn 10 – 80 NSC (rễ/cây/10 ngày)..................................................................................... 48 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến chiều dài rễ của Cattleya giai đoạn 80 NSC (cm) .............................................................................................................. 49 viii
DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1.1 Một số hình ảnh lan Cattleya ...................................................................... 14 Hình 1.2 Loại lan Cattleya dùng trong TN.................................................................. 15 Hình 1.3 Quy trình kỹ thuật cơ bản nhân giống hoa lan bằng phương pháp NCM tế bào ......................................................................................................................... 18 Hình 1.4 Mẫu cụm chồi lan Cattleya được sử dụng trong thí nghiệm .......................... 55 Hình 1.5 Các nghiệm thức ở thí nghiệm 1 giai đoạn 90 NSC ...................................... 55 Hình 1.6 Các nghiệm thức ở thí nghiệm 2 giai đoạn 90 NSC ...................................... 56 Hình 1.7 Các nghiệm thức ở thí nghiệm 3 giai đoạn 80 NSC ...................................... 56 Hình 1.8 Cân trọng lượng cụm chồi tươi .................................................................... 57 Hình 1.9 Đo đường kính cụm chồi ............................................................................. 57 ix
GIỚI THIỆU Đặt vấn đề Ngày nay, khi đời sống được nâng cao thì hoa là một nhu cầu không thể thiếu của con người. Với hương thơm, màu sắc và ý nghĩa riêng của mình, mỗi loài hoa góp phần làm đẹp thiên nhiên, làm đẹp cho cuộc sống và là biểu tượng cho cái đẹp, hạnh phúc và sức sống cho con người. Trong muôn ngàn loài hoa, hiếm có loài hoa nào lại phong phú, tập hợp nhiều họ, nhiều chủng loại, màu sắc, dáng nét và giàu sức quyến rũ bằng hoa lan. Hoa lan không chỉ mang vẻ đẹp đài các, sang trọng mà còn ấm áp, gần gũi và chất chứa trong mình những giá trị tiềm ẩn, mới lạ, hấp dẫn. Đặc biệt, lan Cattleya rất được ưa thích về màu sắc, kiểu dáng trang nhã nhưng cũng không kém phần kiêu sa. Chính vì vậy, việc trồng lan Cattleya không chỉ dừng lại ở quy mô gia đình mà đã nhanh chóng được mở rộng và trở thành lĩnh vực quan trọng trong nông nghiệp mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nhiều nước trên thế giới như Đài Loan, Nhật Bản, Hà Lan, Mỹ. Trong đó, Việt Nam cũng là một nước có nhiều tiềm năng trở thành một nước sản xuất hoa phong lan lớn trong khu vực, có khí hậu thích hợp và nhiều nguyên liệu làm giá thể tốt cho cây lan sinh trưởng. Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu hoa trong nước cũng như xuất khẩu đòi hỏi phải có một số lượng lớn cây giống đồng đều trong khi Cattleya lại là một loài lan rất khó nhân giống, thường cho hệ số nhân thấp trong điều kiện nhân vô tính tự nhiên. Do đó việc nghiên cứu để tìm ra phương pháp nhân giống tối ưu cho lan Cattleya là hết sức cần thiết. Trong các phương pháp nhân giống lan Cattleya hiện nay thì nuôi cấy mô là phương pháp thích hợp để nhân nhanh giống lan trong một thời gian ngắn, tạo ra các dòng cây con đồng nhất, sạch bệnh, ổn định về mặt di truyền nhưng không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết. Phương pháp này có thể tạo ra số lượng hoa lan lớn mà vẫn đáp ứng được yêu cầu ngày càng khắt khe hơn của người chơi hoa lan về màu sắc, kiểu dáng phải mới 1
lạ, độc đáo, cây sinh trưởng phát triển tốt, khả năng thích ứng với môi trường cao, ít nhiễm sâu bệnh, hoa tươi lâu, có độ bền, đẹp về màu sắc. Hiện nay, có rất nhiều chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô. Đặc biệt, các chất BA, NAA và dịch chiết là các chất phổ biến trên thị trường bởi vì tính không độc, an toàn với môi trường, dễ tìm, giá cả hợp lý và tác động nhanh đến quá trình nhân chồi, tạo rễ. Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, đề tài “Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA và dịch chiết đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya (Cattleya sp.) in vitro” được tiến hành. Mục tiêu – Yêu cầu Mục tiêu - Xác định liều lượng của BA và NAA thích hợp để nhân chồi lan Cattleya. - Xác định liều lượng dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa thích hợp cho sự sinh trưởng chồi lan Cattleya. - Xác định liều lượng NAA thích hợp cho sự tạo rễ lan Cattleya. Yêu cầu - Tìm hiểu và đánh giá sự tác động của các chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA và một số dịch chiết đến khả năng nhân chồi của lan Cattleya. - Theo dõi sự sinh trưởng của lan Cattleya thông qua chỉ tiêu số chồi, chiều cao của chồi và chiều dài rễ, số rễ. - Đánh giá ảnh hưởng của NAA đến sự tạo rễ lan Cattleya. Giới hạn Đề tài được tiến hành trong 4 tháng nên chỉ giới hạn vào việc thực hiện các thí nghiệm ở giai đoạn nhân chồi và tạo rễ của lan Cattleya tại phòng nuôi cấy mô bộ môn Di truyền – Giống, khoa Nông học. 2
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật Theo Nguyễn Đức Lượng (2006), lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật gắn liền với các sự kiện nổi bật như sau: Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết về tính toàn năng của tế bào vào thực nghiệm. Theo ông, tất cả tế bào thực vật đều có tính toàn năng, mỗi tế bào đều mang một lượng thông tin di truyền đầy đủ của cơ thể và khi gặp điều kiện thuận lợi thì có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Tuy nhiên, ông đã dùng tế bào quá chuyên biệt nên không thành công. Năm 1922, Kotte và Robbins thực hiện lại thí nghiệm của Haberlandt và đã thành công trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng từ đầu rễ một cây hòa thảo. Năm 1934, White (Hoa Kỳ) đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cây cà chua trên môi trường lỏng có chứa muối khoáng, đường và dịch chiết nấm men. Ở các thí nghiệm tiếp theo, White chứng minh có thể thay thế dịch chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6) và Nicotinic acid. Từ đó, việc nuôi cấy đầu rễ trong thời gian vô hạn đã được tiến hành ở nhiều cây khác nhau. Sau đó ít lâu, Went và Thimann phát hiện ra chất điều hòa sinh trưởng đầu tiên là IAA (Indol acetic acid). Năm 1939, cùng với Nobercourt, Gautheret đã thành công trong việc duy trì sự sinh trưởng trong thời gian dài của mô sẹo cà rốt (Daucus carota) trên môi trường rắn bằng thạch. 3
Năm 1941, Overbeck (Hoa Kỳ), chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi họ cà (Datura). Trong thời gian này, nhiều chất sinh trưởng nhân tạo đã được nghiên cứu và tổng hợp thành công, như Napthyl acetic acid (NAA), 2,4 Dichlorphenoxy acetic acid (2,4D). Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa, NAA và 2,4D đã giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôi cấy. Năm 1955, Skoog và tìm ra chất điều hòa sinh trưởng trong tinh dịch cá bẹ là 6- Furfurylaminopurine và đặt tên là Kinetin, có tác dụng kích thích sự phân bào. Việc phát hiện vai trò của NAA, IAA, 2,4D và Kinetin cùng với phát hiện vai trò của các vitamin và nước dừa là một bước tiến quan trọng, đây là tiền đề kỹ thuật cho việc xây dựng các môi trường xác định về mặt hoá học, cho việc làm các thí nghiệm ổn định và dẫn đến những thành công tiếp theo của ngành khoa học này. Năm 1957, Skoog và Miller công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan của mô sẹo thuốc lá. Khi giảm thấp tỷ lệ kinetin/auxin, mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ. Ngược lại thì dẫn đến khuynh hướng tạo chồi ở mô sẹo. Hiện tượng này được xác nhận trên nhiều cây khác nhau và đóng góp rất lớn vào sự điều khiển sinh trưởng, phát triển của mô tế bào trong nuôi cấy. Từ 1954 đến 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn đã được phát triển. Muir, Hildebrandt và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành các tế bào đơn bằng cách sử dụng máy lắc. Năm 1960, Bergman công bố có thể dùng phương pháp lọc đơn giản để thu được hầu hết là tế bào đơn mà không phải là dính cụm. Các tế bào đơn có thể gieo trên môi trường, tiếp tục phân chia và tái tạo lại mô sẹo. Cùng với kỹ thuật gieo tế bào của Bergman, nhiều tác giả khác đã thành công trong việc tạo cây hoàn chỉnh từ tế bào, chứng minh được tính toàn thế của tế bào. 4
Năm 1960, Cooking (Anh) công bố có thể dùng men cellulose để phân huỷ vỏ cellulose của tế bào thực vật, kết quả thu được các tế bào tròn, không vỏ bọc, gọi là protoplast. Đầu những năm 1970, Nagata và Takebe (Nhật) thành công trong việc làm cho các protoplast tách từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia, tạo nên một quần thể tế bào trong môi trường lỏng. Do các protoplast có khả năng dung hợp với nhau trong các điều kiện nhất định và hấp thu các phân tử lớn hoặc thậm chí từ các cơ quan tử từ bên ngoài. Các nhà nuôi cấy mô thực vật đặt hy vọng lớn vào kỹ thuật protoplast để chọn giống có kết quả hơn. Năm 1965, Ledoux và cộng tác viên đề xướng về vấn đề biến tính của tế bào. Ông cho rằng các tế bào có khả năng hấp thụ DNA ngoại lai vào, gây nên sự biến tính ở thực vật. Từ 1980 đến 1992, có nhiều các thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gene thực vật được công bố, hàng loạt các công trình chuyển gene ngoại lai vào nhiều họ thực vật. Khả năng nhân giống và phục tráng cây trồng được thể hiện rõ rệt trong những ứng dụng của nuôi cấy mô thực vật. Morel (1960), đã nhận thấy đỉnh sinh trưởng của các loài địa lan (Cymbidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành các protocorm. Khi chia cắt các protocorm và nuôi cấy tiếp thì thu được các protocorm mới. Khi để trong các điều kiện thích hợp nhất định thì protocorm có thể phát triển thành cây lan con. Do đó, có thể phục tráng, tạo ra các dòng vô tính không bị nhiễm virus. Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị đối với các cây như: khoai tây, cây ăn quả và nhiều cây nhân giống vô tính khác. Hiện nay, đang bước vào giai đoạn nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng và phát triển mạnh mẽ trong việc nhân giống, chọn tạo giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao. Nuôi cấy mô thực vật hiện nay được đưa vào trong các chương trình chọn giống, nhân giống hiện đại (Nguyễn Văn Uyển, 1993). 5
1.1.2 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam Theo Trần Văn Minh (2005), sau năm 1975, nước ta mới bắt đầu chú trọng đến kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật. Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh Học, Viện Khoa Học Việt Nam do Lê Thị Muội khởi xướng. Bước đầu phòng tập trung nghiên cứu các phương pháp nghiên cứu cơ bản trong điều kiện Việt Nam, như nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy mô sẹo và protoplast. Và đã thành công khi nuôi cấy bao phấn lúa và thuốc lá được công bố vào năm 1978 (Lê Thị Muội và ctv, 1978; Lê Thị Xuân và ctv, 1978). Tiếp đó là thành công nuôi cấy protoplast khoai tây (Lê Thị Muội và Nguyễn Đức Thành, 1978; Nguyễn Đức Thành và Lê Thị Muội, 1980, 1981). Phòng thí nghiệm tiếp theo được đặt tại phân viện Khoa Học Việt Nam ở TP. Hồ Chí Minh, sau đó là Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội và Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Việt Nam, chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây. Đến nay, đã có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô không những ở các Viện nghiên cứu (Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Rau Quả Trung ương, các trường Đại học), mà có cả ở một số tỉnh và cơ sở sản xuất (Đà Lạt, Yên Bái, Hưng Yên, Thanh Hóa, Cần Thơ, Nghệ Tĩnh). Từ giữa 1980 đến nay, hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật phát triển mạnh. Những kết quả đáng khích lệ đã đạt được trong lĩnh vực vi nhân giống khoai tây (Viện Công Nghệ Sinh Học, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Lâm Nghiệp). Một số kết quả bước đầu đã được ghi nhận trong lĩnh vực chọn dòng tế bào kháng bệnh (Lê Bích Thủy và ctv, 1994), chọn dòng chịu muối, chịu mất nước (Nguyễn Tường Vân và ctv, 1994; Định Thị Tòng và ctv, 1994). Các kết quả về dung hợp tế bào trần, chuyển gen lục lạp cũng thu được kết quả lý thú (Nguyễn Đức Thành và ctv, 1993, 1997). Nuôi cấy bao phấn để tạo dòng thuần đã được ứng dụng nhiều tại Viện Công Nghệ Sinh Học và Di Truyền Giống Nông Nghiệp. Nuôi cấy các cây dược liệu quí để bảo tồn nguồn gen và tạo các dòng tế bào có hàm lượng sinh học quan trọng cũng đã và đang được phát triển (Phan Huy Bảo và Lê Thị Xuân, 1998; Phan Thị Bảy và ctv, 1995; Bùi Bá Bổng, 1995). Không dừng lại ở đó, các công trình nghiên cứu ngày càng đạt được những bước tiến vượt bậc. Cụ thể: 6
- Tại Viện sinh học Nhiệt đới, từ đầu những năm 2000, đã tập trung vào công nghệ nuôi cấy mô các cây công nghiệp như cà phê, hồ tiêu và nhóm cây lâm nghiệp thân gỗ như Paulownia, dó bầu, Neem... Hoàn chỉnh công nghệ nhân nhanh, phục tráng giống, tạo các giống cây trồng nông lâm nghiệp sạch bệnh. Nghiên cứu cải thiện điều kiện nuôi cấy invitro, biorector cho các cây có giá trị như cây thuốc, cây lấy dầu, hoa lan, cây cảnh... Lần đầu tiên trong nước, các nhà nghiên cứu đã nuôi cấy thành công mô phôi vô tính (soma), mô chồi sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong môi trường lỏng tạo điều kiện rất thuận lợi cho việc nhân sinh khối quy mô lớn tạo sản phẩm có khả năng thương mại hóa. Tạo và nuôi nhân rễ bất định sâm Ngọc Linh và bước đầu ghi nhận được sự hình thành rễ tơ (hairy root) sâm Ngọc Linh nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes, tạo điều kiện cho việc nuôi nhân quy mô lớn sinh khối nhằm thu hoạt chất phục vụ ngành mỹ phẩm và y dược. Tạo thành công mô sẹo/rễ bất định hai cây dược liệu quý là Xạ đen và Tam thất nhằm nhân nhanh sinh khối phục vụ sản xuất hợp chất thứ cấp. Đã nhân giống thành công giống lan đặc hữu Việt Nam (Dendrobium farinatum Schildh. et Schraut) (Bích Diệp, 2014). - Các công trình nghiên cứu tại Lâm Đồng đạt được nhiều thành tựu: Dương Tấn Nhựt thu được nhiều kết quả trong nuôi cấy các loài hoa cúc, lyli, salem, hồng môn, hoa hồng,… và đặc biệt ứng dụng hệ chiếu sáng đơn sắc của công nghệ đèn LED vào luận án tại Đại học Kagawa, Nhật Bản (2002). Mới đây tác giả đã đạt được nhiều kết quả mới về công nghệ sinh khối sâm K5 Panax vietnamensis, thông đỏ Taxus wallichiana, công nghệ phôi vô tính các loài Hồ điệp (Phalaenopsis spp.),… mở ra hướng công nghệ tạo giống chủ động và sinh khối chất lượng cao với những công trình phong phú cùng những đề tài tiềm năng lớn; Nguyễn Văn Kết và ctv triển khai khá thành công nuôi cấy các loài lan rừng Cát Tiên - Lâm Đồng - Đồng Nai, và đặc biệt là đưa từng bước công nghệ nuôi cấy mô hiện đại với các hệ thống Bioreactor vào thực tiễn nhân giống, xuất phát từ luận án tiến sĩ tại Đại học Chungbuk, Hàn Quốc (2005); Phạm Xuân Tùng đã phát triển công nghệ tạo giống khoai tây kết hợp nuôi cấy in vitro (củ bi và siêu bi - microtuber) với công nghệ gieo hạt. Hiện nay tác giả cùng các cộng sự tiếp tục triển khai kết quả công nghệ lai tạo và chọn lọc các dòng hoa quý: cúc, đồng tiền, cẩm chướng… có giá trị thương mại cao (Lê Xuân Thám, n.d.). 7
1.1.3 Lợi ích của phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô Tạo ra các cây con đồng nhất và giống như cây mẹ. Nhân một số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong một thời gian ngắn. Tạo ra các cây con sạch bệnh. Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh. Một giống cây quý có thể được nhân ra nhanh chóng để đưa vào sản xuất. Việc trao đổi giống quốc tế các nguồn gen sạch bệnh nuôi trong ống nghiệm được thực hiện dễ dàng. Thông qua nuôi cấy mô có thể ứng dụng việc chuyển gen cho những thực vật bậc cao để chọn tạo giống mới theo yêu cầu sản xuất (Bùi Bá Bổng, 1995). 1.1.4 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Theo Dương Công Kiên (2002), nuôi cấy mô thực vật có một số phương pháp như sau: Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Một phương thức dễ dàng nhất đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên. Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Sau một thời gian, từ đỉnh sinh trưởng sẽ phát triển thành một hay nhiều chồi. Chồi tiếp tục phát triển, vươn thân, ra lá, rễ, để trở thành một cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức. Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có bổ sung auxin. Trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo, khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. 8
Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với các loại thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống cây mẹ, từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma lại cao hơn. Nuôi cấy tế bào đơn Khối mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường lỏng và đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp, sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ, gọi là tế bào đơn. Sau đó, tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường thích hợp để phát triển, tăng sinh khối. Nuôi cấy protoplast Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn tách lớp vỏ cellulose, trong điều kiện nuôi cấy thích hợp protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và phát triển thành cây hoàn chỉnh. Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng. Nuôi cấy hạt phấn đơn bội Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên môi trường thích hợp tạo thành mô sẹo. Mô sẹo này được phát triển thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội. 1.1.5 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Trong đời sống thực vật, ngoài các chất dinh dưỡng như glucid, protein, lipid, cây còn nhiều chất hoạt tính sinh lý như các vitamine, enzyme, các chất điều hòa sinh trưởng (phytohormon). Trong công nghệ nuôi cấy mô thực vật, các phytphormon rất quan trọng trong quá trình thay đổi các đặc trưng hình thái sinh lý của cây trồng, đặc biệt là trong tạo mô sẹo và hình thành cây hoàn chỉnh (Lê Văn Tri, 1997). Một số đặc tính và cơ chế tác dụng của nhóm chất như auxin, cytokinin. 9
1.1.5.1 Auxin Auxin là một chất có nhân Idol, có công thức hóa học là C10H9O2N. Auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol acetic acid (IAA). IAA có dẫn xuất là 1- naphthalene acetic acid (NAA) và 2,4-dichlorophenoxyl acetic acid (2,4-D). NAA được Went và Thimann phát hiện năm 1937 và là một auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA. Trong cây IAA tập trung nhiều trong các mô non (chồi, lá đang phát triển), trong hạt, trong hạt nảy mầm (Trịnh Xuân Vũ và ctv, 1976). Tác động sinh lý của auxin Auxin có vai trò điều hòa quan trọng trong việc kìm hãm sự phát triển của chồi bên (duy trì hiện tượng ưu thế ngọn). Auxin gây tính hướng động của cây (hướng quang và hướng địa). Auxin kích thích quá trình tăng trưởng nhờ tác dụng kéo giãn tế bào. Sự kéo tế bào diễn ra đồng thời trên hai trục (trục ngang và trục dọc). Nhờ vào tác dụng này mà auxin giúp tăng diện tích lá, tăng đường kính và chiều dài cành, thân, rễ; làm củ, quả phình to ra. Auxin kích thích sự tăng trưởng của quả, ngăn ngừa hiện tượng rụng lá, quả, kích thích sự ra rễ (Nguyễn Văn Uyển, 1989). Ứng dụng Auxin kích thích sự ra rễ đặc biệt là rễ bất định trên cành giâm, cành chiết và trên mô nuôi cấy. Trong nuôi cấy mô, auxin (IBA, NAA) cũng có tác dụng tạo rễ tốt. Để tăng đậu quả, tăng sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt, người ta xử lý auxin dưới dạng NAA 20 ppm, 2,4-dichlorophenoxyl acetic acid (2,4-D) 10 ppm cho một số cây trồng như cà chua, cam, chanh. Để kéo dài sự chín của quả và dùng bảo quản quả lâu, sử dụng dung dịch NAA (10 – 20 ppm) (Nguyễn Văn Uyển, 1989). 10