Luận án Tiến sĩ Khoa học vật liệu: Nghiên cứu chế tạo, đặc trưng và khảo sát tiềm năng ứng dụng của hệ dẫn thuốc nano đa chức năng nền copolyme PLA-PEG có và không có hạt từ (Fe3O4)

Chia sẻ: Lê Thị Hồng Nhung | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:170

Thêm vào BST

Báo xấu

74
lượt xem 8
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án: Tổng hợp được copolyme PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác nhau trong vùng 3:1-1:3. Chế tạo hệ nano copolyme PLA-PEG mang Curcumin có và không gắn yếu tố hướng đích Folat. Nghiên cứu khả năng mang Curcumin của các hệ nano copolyme PLAPEG, nghiên cứu khả năng phóng thích Curcumin đối với các hệ nano copolyme không và có gắn Folat. Nghiên cứu độc tính tế bào in vitro của hệ nano copolyme PLA-PEG mang Curcumin không và có gắn Folat trên dòng tế bào ung thư gan người HepG2. Mời các bạn tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Khoa học vật liệu: Nghiên cứu chế tạo, đặc trưng và khảo sát tiềm năng ứng dụng của hệ dẫn thuốc nano đa chức năng nền copolyme PLA-PEG có và không có hạt từ (Fe3O4)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -------------------------- PHAN QUỐC THÔNG NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO, ĐẶC TRƯNG VÀ KHẢO SÁT TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA HỆ DẪN THUỐC NANO ĐA CHỨC NĂNG NỀN COPOLYME PLA-PEG CÓ VÀ KHÔNG CÓ HẠT TỪ (Fe3O4) Chuyên ngành: Vật liệu điện tử Mã số: 9.44.01.23 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU Hà Nội - 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -------------------------- PHAN QUỐC THÔNG NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO, ĐẶC TRƯNG VÀ KHẢO SÁT TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA HỆ DẪN THUỐC NANO ĐA CHỨC NĂNG NỀN COPOLYME PLA-PEG CÓ VÀ KHÔNG CÓ HẠT TỪ (Fe3O4) Chuyên ngành: Vật liệu điện tử Mã số: 9.44.01.23 LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TSKH. NGUYỄN XUÂN PHÚC TS. HÀ PHƯƠNG THƯ Hà Nội - 2019
LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất của mình tới GS.TSKH. Nguyễn Xuân Phúc và TS. Hà Phương Thư – những người Thầy hướng dẫn đã ân cần chỉ bảo, cũng như tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn trân trọng nhất tới PGS.TS. Đỗ Hùng Mạnh, PGS.TS. Phạm Thanh Phong, TS. Lê Trọng Lư vì sự quan tâm sâu sắc, sự giúp đỡ tận tình trước và trong quá trình thực hiện luận án. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn trân trọng nhất tới PGS.TS. Lê Thị Mai Hương, TS. Trần Thị Hồng Hà thuộc Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung, ThS. Nguyễn Đắc Tú của Bộ môn sinh học tế bào thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội vì những hợp tác nghiên cứu trong các ứng dụng y sinh. Bản luận án này sẽ không thể hoàn thành nếu không có sự giúp đỡ của các đồng nghiệp. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn của mình tới tất cả các thành viên làm việc tại Phòng Vật liệu nano y sinh và Phòng vật lý vật liệu từ và siêu dẫn của Viện Khoa học vật liệu. Đặc biệt, tôi xin được gửi tới TS. Phạm Hồng Nam, NCS. Đỗ Khánh Tùng, NCS. Lưu Hữu Nguyên, NCS. Mai Thị Thu Trang, NCS. Nguyễn Hoài Nam, NCS. Lê Thị Hồng Phong và ThS. Tạ Ngọc Bách, TS. Vương Thị Kim Oanh lời cảm ơn chân thành vì sự giúp đỡ thực hiện các phép đo và sự quan tâm động viên hết sức quý báu với tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới GS. Phan Mạnh Hưởng ở Đại học Nam Florida và GS. Sri Sridhah thuộc Trường Đại học Đông Bắc, Hoa Kỳ về những phép đo trên các máy chuyên dụng thực hiện tại đó. Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới GS. Nguyễn Thị Kim Thanh và Cộng sự tại Đại học London – Vương quốc Anh về những hợp tác nghiên cứu và giúp đỡ tôi thực hiện những phép đo quý báu. i
Luận án được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài nghiên cứu cơ bản định hướng ứng dụng mã số DT.NCCB-DHUD.2012-G/08 và dự án AOARD award FA 2386 14-1-0025 giữa nhóm nghiên cứu của GS. Nguyễn Xuân Phúc, Viện Khoa học vật liệu với các nhóm của GS. Nguyễn Thị Kim Thanh, Trường đại học London và GS. Sri Sridhah, Trường đại học Đông Bắc – Hoa Kỳ; đề tài “Nghiên cứu quy trình chế tạo và thử nghiệm hệ dẫn thuốc hướng đích cấu trúc nano đa chức năng (polyme-drug- folate)”, Mã số 106.99-2012.43, Nafosted (7/2013-7/2016) và đề tài “Nghiên cứu chế tạo hệ dẫn thuốc nano Paclitaxel phối hợp Curcumin và đánh giá tác động của chúng lên các tế bào ung thư”, mã số:VAST03.04/16-17, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (1/2016-12/2017) do TS. Hà Phương Thư làm chủ nhiệm. Tôi cũng xin được cảm ơn tới Ban lãnh đạo, Bộ phận quản lý đào tạo và các cán bộ Phòng thí nghiệm trọng điểm của Viện Khoa học vật liệu, vì đã luôn tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình thực hiện bản luận án. Sau cùng, tôi muốn gửi tình cảm yêu thương nhất và sự biết ơn tới bố, mẹ, vợ và các con cũng như tất cả những người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn cổ vũ, động viên để tôi vượt qua khó khăn hoàn thành tốt nội dung nghiên cứu trong bản luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm Tác giả luận án Phan Quốc Thông ii
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, dưới sự hướng dẫn của GS.TSKH. Nguyễn Xuân Phúc và TS. Hà Phương Thư. Các số liệu, kết quả sử dụng trong luận án được trích dẫn từ các bài báo và báo cáo đề tài đã được sự đồng ý của các đồng tác giả. Các số liệu, kết quả này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Phan Quốc Thông iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT I. Danh mục các ký hiệu B0 : Từ trường cố định Bcl-2 : Protein gây chết rụng tế bào BT-474 : Dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến vú người C : Nhiệt dung riêng của hệ mẫu C3 : Một loại protein trong hệ thống miễn dịch CS : Khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo % so với đối chứng G2 : Pha trống 2 H : Cường độ từ trường HepG2 : Dòng tế bào ung thư gan ở người IC50 : Nồng độ ức chế (Inhibited Concentration) LD50 : Chỉ số xác định liều cận trên và cận dưới M : Pha nguyên phân mi : Khối lượng hạt từ ms : Khối lượng tổng cộng của hệ mẫu Ms : Từ độ bão hòa r1, r2 : Độ hồi phục dọc và ngang, tương ứng 1 và 2 R1, R2 : Tốc độ hồi phục dọc và ngang, tương ứng 1 và 2 RF : Tần số radio Ro1,2 : Tốc độ hồi phục dọc và ngang khi không có chất tương phản Sarcoma180 : Dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột T1, T2 : Thời gian hồi phục dọc và ngang, tương ứng 1 và 2 0 : Mômen từ của chân không f : Tần số của từ trường T : Tốc độ tăng nhiệt ban đầu t  : Độ lệch tiêu chuẩn φ : Hằng số pha iv
ω0 : Tần số Larmor II. Danh mục các chữ viết tắt BCS : Huyết thanh Bò (Bovine Calf Serum) CLT : Chất lỏng từ CT : Kỹ thuật chụp cắt lớp với sự hỗ trợ của máy tính (Computed Tomography) Cur : Curcumin Cur/Fe3O4@PLA-PEG: Hạt nano Fe3O4 bọc copolyme PLA-PEG mang Curcumin Cur/PLA-PEG: Polylactic axit- Polyethylene glycol mang Curcumin Cur/PLA-PEG-Fol: Polylactic axit- Polyethylene glycol mang Curcumin và gắn yếu tố hướng đích Folat DCM : Dung môi (Dichlomethan) DLS : Giản đồ tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering) DMEM : Môi trường nuôi cấy tế bào (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) DMSO : Dung môi (Dimethyl Sulfoside) FC : Làm lạnh có từ trường (Field Cool) FDA : Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Thuốc Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) Fe3O4@PLA-PEG: Hạt nano Fe3O4 bọc copolyme PLA-PEG FE-SEM : Kính hiển vi điện tử quét- phát xạ trường (Field Emission Scanning Electron Microscope) FT-IR : Phổ hấp thụ hồng ngoại Fourier HDT : Hệ dẫn thuốc HDTNN : Hệ dẫn thuốc kích thước nano ILP : Công suất tổn hao nội tại (Intrinsic Loss Power) IO : Ôxit sắt (Iron oxide) MFH : Nhiệt trị ung thư dùng chất lỏng từ (Magnetic Fluid Hyperthermia) MIH : Đốt nóng cảm ứng từ (Magnetic Inductive Heating) MNPs : Các hạt nano từ tính (Magnetic Nanoparticles) MPEG-PLA : Methôxy poly(ethylene glycol)-poly(lactic axit) v
MRI : Ảnh cộng hưởng từ (Magnetic Resonance Imaging) NAA : Axit amin không thiết yếu (Non-Essential Amino Acids) PBS : Đệm sinh lý (Phosphate Buffered Saline) PEG : Polyethylene glycol PET : Kỹ thuật ghi hình bằng bức xạ positron (Positron Emission Tomography) PLA : Polylactic axit PLA-PEG : Polylactic axit- Polyethylene glycol PLA-TPGS : Poly(lactic axit)-vitamin E PLGA : Poly (lactic-co-glycolic) PLGA-PEG : Poly(lactic-co-glycolic)-polyethylene glycol PSF : Hợp chất kháng sinh (Penixillin- Streptomycin sulfate- Fungizone) SAR : Tốc độ hấp thụ riêng (Specific Absorption Rate) Sn(Oct)2 : Sn(II) 2-ethylhexanoate (Tin (II) 2-ethylhexanoate) SRB : Thuốc nhuộm (Sulfo Rhodamine B) TCA : Axit hữu cơ Tricloacetic (Trichloro Acetic acid) TEM : Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscope) TGA : Phân tích nhiệt vi lượng (Thermal Gravimetric Analysis) UV-Vis : Phổ tử ngoại-khả kiến (Ultraviolet-Visible) VSM : Từ kế mẫu rung (Vibrating Sample Magnetometer) XRD : Nhiễu xạ tia X (X-Ray Diffraction) vi
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1. Sơ đồ hình thành hạt nano đa chức năng .................................................. 9 Hình 1.2. Các loại hạt nano nền polyme cấu trúc lõi-vỏ đặc trưng cho phân phối thuốc .............................................................................................................. 11 Hình 1.3. Sơ đồ hệ dẫn thuốc nano đa chức năng ................................................. 12 Hình 1.4. Cấu trúc hệ dẫn thuốc đa chức năng với: A) Các hạt nano đa chức năng đơn giản với thuốc và/hoặc các liệu pháp được mang vào bên trong; B) Các hạt nano đa chức năng phức tạp bao gồm hạt nano ôxit sắt, hạt nano lõi silica – vỏ hạt vàng, hạt nano Gadolinium biến tính bề mặt gắn các phối tử hướng đích và đóng gói thuốc ........................................................... 14 Hình 1.5. Cấu trúc Curcumin ............................................................................... 16 Hình 1.6. Sơ đồ tổng hợp copolyme PLA-PEG bằng phương pháp trùng ngưng mở vòng polyme ......................................................................................... 25 Hình 1.7. Cấu trúc tinh thể của Fe3O4 ................................................................... 26 Hình 1.8. Nguyên lý của chụp ảnh cộng hưởng từ: a) spin của các proton của phân tử nước quay tròn dưới sự tác dụng của từ trường ngoài B0 với tần số Larmor (ω0); b) sau khi áp dụng từ trường xoay chiều tần số radio (RF) có hướng vuông góc với B0 spin proton sẽ bị kích thích và lệch khỏi hướng ban đầu; c) thời gian phục hồi dọc T1; d) thời gian phục hồi ngang T2 .. 29 Hình 1.9. Mô hình hệ nanovector lõi hạt từ tính ................................................... 38 Hình 2.1. Ảnh thiết bị kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường Hitachi S-4800 ... 43 Hình 2.2. Ảnh thiết bị kính hiển vi điện tử truyền qua TEM ................................. 44 Hình 2.3. (a) Hệ thí nghiệm đốt nóng cảm ứng từ, (b) Minh họa bố trí thí nghiệm đốt nóng cảm ứng từ ............................................................................. 48 Hình 3.1. Mô tả quy trình chế tạo hệ dẫn thuốc nano Cur/PLA-PEG, Cur/PLA-PEG- Fol ........................................................................................................ 62 Hình 3.2. Ảnh FE-SEM của hạt nano copolyme PLA-PEG với các hợp phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 tương ứng với các hình 1A, 1B, 1C, 1D, 1E ......................................................................................................... 63 Hình 3.3. Phân bố kích thước thủy động (DLS) của các hệ nano PLA-PEG với tỷ lệ thành phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2 và 1:3 tương ứng các hình A, B, C, D và E. .................................................................................................. 64 Hình 3.4. Thế Zeta của copolyme PLA-PEG ........................................................ 65 vii
Hình 3.5. Ảnh FE-SEM của hệ hạt nano Cur/PLA-PEG với các hợp phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, tương ứng với các hình 2A, 2B, 2C, 2D, 2E ....... 67 Hình 3.6. Phân bố kích thước thủy đông (DLS) của các hệ nano Cur/PLA-PEG với tỷ lệ thành phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2 và 1:3, tương ứng các hình A, B, C, D và E .......................................................................................... 68 Hình 3.7. Thế Zeta của hạt nano Cur/PLA-PEG ................................................... 69 Hình 3.8. Ảnh FE-SEM của hạt nano Cur/PLA-PEG-Fol với các hợp phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, tương ứng với các hình 3A, 3B, 3C, 3D, 3E ....... 70 Hình 3.9. Đường phân bố kích thước (DLS) của các hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol với tỷ lệ thành phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2 và 1:3, tương ứng các hình A, B, C, D và E ......................................................................................... 71 Hình 3.10. Thế Zeta của hạt nano Cur/PLA-PEG-Fol ............................................. 72 Hình 3.11. Phân bố kích thước các hệ nano PLA-PEG, Cur/PLA-PEG và Cur/PLA- PEG-Fol ............................................................................................... 72 Hình 3.12. Phổ UV-Vis (B) và phương trình đường chuẩn Curcumin (A) .............. 74 Hình 3.13. Phổ UV-Vis của các hệ nano Cur/PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 ............................................................ 74 Hình 3.14. Ảnh hưởng của tỷ lệ PLA:PEG đến hiệu quả mang thuốc của hệ nano Cur/PLA-PEG ...................................................................................... 75 Hình 3.15. Phổ UV-Vis của Curcumin, Cur/PLA-PEG (A) và của Curcumin, axit folic và Cur/PLA-PEG-Fol (B) ..................................................................... 76 Hình 3.16. Phổ FT-IR của PLA, PEG và PLA-PEG với tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác nhau ............................................................................................. 77 Hình 3.17. Phổ FT-IR của PLA, PLA-PEG, Curcumin, Cur/PLA-PEG .................. 78 Hình 3.18. Phổ FT-IR của axit folic, PLA-PEG, Cur/PLA-PEG và PLA-PEG-Fol .. 78 Hình 3.19. Phổ FT-IR của Cur/PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác nhau ...................................................................................................... 79 Hình 3.20. Phổ FT-IR của Cur/PLA-PEG-Fol với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác nhau ...................................................................................................... 79 Hình 3.21. Tỷ lệ % giải phóng chậm Cur từ hệ nano Cur/PLA-PEG (A) và Cur/PLA- PEG-Fol (B) tại 37oC ............................................................................ 80 Hình 3.22. Giá trị IC50 của Cur/H2O, Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol ........... 84 Hình 3.23. Giá trị IC50 của Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol ........................... 85 viii
Hình 3.24. Sự thay đổi hình dạng tế bào HepG2 dưới tác dụng của Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol ................................................................................ 86 Hình 4.1. Sơ đồ tổng hợp hạt nano Fe3O4 bằng phương pháp đồng kết tủa ........... 89 Hình 4.2. Mô tả quy trình chế tạo hệ dẫn thuốc nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur ......................................................................... 90 Hình 4.3. Giản đồ XRD của Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur 91 Hình 4.4. Phổ FT-IR của các hệ mẫu hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur ......................................................................... 92 Hình 4.5. Ảnh SEM, TEM và phân bố kích thước của các hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur tương ứng hình 1A, 1B, 1C; 2A, 2B, 2C và 3A, 3B, 3C .................................................................... 93 Hình 4.6. Kích thước thủy động (DLS) các hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur tương ứng các hình (A), (B) và (C) .................. 94 Hình 4.7. Thế Zeta của hệ hạt nano Fe3O4 (A), 3Fe3O4@0,3PLA-PEG (C) và của một vài hệ hạt nano Fe3O4@PLA-PEG khác (B) ......................................... 96 Hình 4.8. Kết quả phân tích TGA cho mẫu hạt nano Fe3O4@PLA-PEG (A) và Fe3O4@PLA-PEG/Cur (B) ................................................................... 99 Hình 4.9. Từ độ phụ thuộc từ trường của Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA- PEG/Cur tính trên khối lượng tổng vỏ-lõi (A) và sau khi trừ đóng góp lượng vỏ hữu cơ (B) ........................................................................... 100 Hình 4.10. So sánh độ tương phản ảnh cộng hưởng từ hạt nhân theo chế độ trọng T2 của các hạt nano Fe3O4@PLA-PEG (A) và Fe3O4@PLA-PEG/Cur (B) ............................................................................................................ 102 Hình 4.11. Đường tốc độ hồi phục phụ thuộc nồng độ pha loãng mẫu: R1 vs C (A) và R2 vs C (B) của các các chất lỏng từ Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA- PEG/Cur ............................................................................................. 103 Hình 4.12. Tốc độ hồi phục dọc R1 (A) và gang R2 (B) phụ thuộc nồng độ mẫu Fe3O4@PLA-PEG S1 (C) và Fe3O4@PLA-PEG/Cur S2 (D) ................ 104 Hình 4.13. Đường gia nhiệt của hệ chất lỏng từ nồng độ 1 mg/mL của Fe3O4@PLA- PEG (A) và Fe3O4@PLA-PEG/Cur (B), đo với các từ trường khác nhau, và kết quả tính SAR cho các nồng độ 1 mg/mL của hệ nano Fe3O4@PLA- PEG (C) và Fe3O4@PLA-PEG/Cur (D) .............................................. 107 Hình 4.14. Đường gia nhiệt MIH của các hệ mẫu Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA- PEG/Cur ............................................................................................. 108 ix
Hình 4.15. Phổ UV-Vis (A) và lượng Curcumin giải phóng theo thời gian (B) từ hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur ủ tại nhiệt độ 37oC ................................. 109 Hình 4.16. Đốt nóng cảm ứng từ hệ Fe3O4@PLA-PEG/Cur với các khoảng thời gian 5 – 10 – 15 – 20 – 25 phút tương đương hình A – B – C – D – E ........ 110 Hình 4.17. Phổ UV-Vis (A) và phần trăm giải phóng Curcumin (B) từ hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur theo phương pháp đốt nóng cảm ứng từ tại các khoảng thời gian khác nhau ................................................................ 111 Hình 4.18. Kết quả thí nghiệm MIH giải phóng chậm Curcumin trong hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur ngắt tại 370C với thời gian chiếu khác nhau: đường gia nhiệt với các từ trường khác nhau (A), phổ UV-Vis của mẫu khi ngắt (B), và phần trăm giải phóng Curcumin (C) ........................................ 112 Hình 4.19. Kết quả giải phóng chậm Curcumin từ hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur tại nhiệt độ dừng chiếu từ 45oC: đường gia nhiệt với các từ trường khác nhau (A), phổ UV-Vis của mẫu mới ngắt (B) và phần trăm giải phóng Curcumin (C) ...................................................................................................... 113 Hình 5.1. Tỉ lệ tăng sinh của tế bào Sarcoma 180 (A) và BT-474 (B) so với đối chứng sinh học khi được thử nghiệm độc tính với hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG theo dải nồng độ 0,01-100 µg/mL. Tỉ lệ tăng sinh của tế bào ở nồng độ thử nghệm cao nhất vẫn đạt 85 % so với DCSH, ở 3 nồng độ tiếp theo đạt 90-95 % và ở nồng độ thấp nhất không có sự khác biệt so với ĐCSH ........................................................................................... 116 Hình 5.2. Đường cong đáp ứng liều của hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG dựa trên phương pháp Litchfield - Wilcoxon: (A) Thí nghiệm lần 1, (B) Thí nghiệm lần 2 ....................................................................................... 117 Hình 5.3. Ảnh MRI của hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA- PEG/Cur chụp theo chế độ T2W, TE 80ms, TR 3,0s ở điều kiện: (A) Fe3O4@PLA-PEG trong môi trường Agar 1,5 % chứa 2.106 tế bào Sarcoma 180; (B) Fe3O4@PLA-PEG trong môi trường Agar 1,5 %, (C) Fe3O4@PLA-PEG/Cur trong môi trường Agar 1,5 % chứa 2.106 tế bào sarcoma 180; (D) Fe3O4@PLA-PEG/Cur trong môi trường Agar 1,5 %. Nồng độ sắt từ trong mỗi giếng là: (1) 0,000 mg/mL; (2) 0,01 mg/mL; (3) 0,05 mg/mL; (4) 0,1 mg/mL; (5) 0,2 mg/mL; (6) 0,5 mg/mL ............. 118 Hình 5.4. Khả năng tăng tương phản MRI của hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA- PEG ở chế độ T2W, TE 80ms, TR 3,0s, góc chụp 180o (cắt lớp theo trục đầu – đuôi chuột). (A) Ảnh trước khi tiêm hệ chất lỏng nano từ; (B) Ảnh sau khi tiêm hệ chất lỏng nano từ: (1) chuột không được tiêm, (2) chuột tiêm 50 µg hạt từ trực tiếp vào khối u, (3) chuột tiêm 250 µg hạt từ trực tiếp vào khối u .................................................................................... 119 x
Hình 5.5. Ảnh chụp MRI theo chế độ T2W, TE 80ms, TR 3,0s, góc chụp 90o cho thấy tốc độ lan truyền của hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG trong khối u rắn dưới da chuột theo thời gian ở hai nồng độ vật liệu thử nghiệm là 25 µg/0,5 cm3 và 250 µg/0,5 cm3 .................................................... 120 Hình 5.6. Tế bào Sarcoma 180 sau khi đốt từ 30 phút với hệ chất lỏng nano từ nồng độ 2 mg/mL ở từ trường 70 Oe, 178 kHz. Mẫu thí nghiệm (A), Đối chứng (ĐC) nhiệt trị - có hạt từ, không chiếu từ trường (B), và Đối chứng sinh học -ĐCSH (C) ................................................................................... 121 Hình 5.7. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ hạt nano từ đến tỉ lệ chết của tế bào Sarcoma 180 ................................................................................ 122 Hình 5.8. Tế bào Sarcoma 180 tại thời điểm 0 phút (A) và 60 phút (B) .............. 123 Hình 5.9. Tỷ lệ tế bào Sarcoma 180 chết theo thời gian sau khi đốt nhiệt 60 phút với nồng độ 1 mg/ml và 2 mg/ml chất lỏng hệ chất lỏng nano từ ở từ trường 70 Oe, 178 kHz ................................................................................... 124 Hình 5.10. Ảnh khối u rắn dưới da sau 5 ngày (A), 10 ngày (B) và 15 ngày (C) cấy truyền ................................................................................................. 125 Hình 5.11. Ảnh khối u trước và sau khi điều trị trên khối u 5 ngày tuổi ................ 127 Hình 5.12. Ảnh về tăng khối u chuột đối chứng trong 12 ngày theo dõi ................ 128 Hình 5.13. Theo dõi sự thay đổi thể tích khối u được nhiệt trị trên khối u 5 ngày tuổi, Lô 1 – tiêm 30 µL hạt nano, lô 2 – tiêm 20 µL hạt nano ..................... 128 xi
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm nhiệt từ trị trên chuột mang khối u rắn dưới da .......... 57 Bảng 3.1. Phân bố kích thước hạt và thế Zeta của các hạt nano PLA-PEG ............ 65 Bảng 3.2. Phân bố kích thước hạt và thế Zeta của các hạt nano Cur/PLA-PEG ..... 69 Bảng 3.3. Phân bố kích thước hạt và thế Zeta của các hạt nano Cur/PLA-PEG-Fol .............................................................................................................. 73 Bảng 3.4. Kích thước hạt, lượng Curcumin và hiệu quả mang Curcumin của các hệ copolyme PLA-PEG, Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol ................. 75 Bảng 3.5. Tỷ lệ % Curcumin giải phóng chậm từ hệ nano Cur/PLA-PEG tại 37oC .............................................................................................................. 81 Bảng 3.6. Tỷ lệ % Curcumin giải phóng chậm từ hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol tại 37oC .............................................................................................................. 81 Bảng 3.7. Giá trị IC50 của hệ nano Cur/PLA-PEG, Cur/PLA-PEG-Fol và Cur/H2O .............................................................................................................. 84 Bảng 3.8. Giá trị IC50, hiệu quả mang Cur và hiệu quả nhập bào của hệ nano Cur/PLA-PEG ...................................................................................... 85 Bảng 3.9. Giá trị IC50, hiệu quả mang Cur và hiệu quả nhập bào của hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol ................................................................................ 85 Bảng 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ PLA-PEG đến độ bền phân tán hạt nano Fe3O4@PLA-PEG trong nước .............................................................. 95 Bảng 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ Fe3O4 đến độ bền phân tán hạt nano Fe3O4@PLA- PEG trong nước .................................................................................... 97 Bảng 4.3. Từ độ bão hòa: đo trực tiếp cho mẫu lõi+vỏ (Mcs); hiệu đính bởi khối lượng vỏ danh định (Mccal) và bởi khối lượng vỏ thí nghiệm TGA (Mcex) của các mẫu hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur .... 100 Bảng 4.4. Kết quả tính toán độ hồi phục r1, r2 và tỷ số r1/r2 cho 2 mẫu Fe3O4@PLA-PEG (S1), Fe3O4@PLA-PEG/Cur (S2) và chất thương phẩm Resovist, Ferumoxytol ......................................................................... 105 Bảng 4.5. Kết quả tính SAR của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG và Cur/Fe3O4@PLA- PEG ở các từ trường khác nhau .......................................................... 107 Bảng 4.6. Phần trăm Curcumin giải phóng từ hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur khi được ủ tại 37oC ................................................................................... 109 Bảng 4.7. Số liệu đo giải phóng Curcumin của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur đạt được ở 37oC và 45oC bằng phương pháp đốt nóng cảm ứng từ ........... 113 xii
Bảng 5.1. Nhiệt độ bão hòa đạt được (oC) khi kích thích hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG bằng những từ trường có cường độ khác nhau ...... 121 Bảng 5.2. Tỷ lệ tế bào chết (%) sau khi được trộn với hệ chất lỏng nano từ và chiếu từ trường 30 phút ................................................................................ 122 Bảng 5.3. Tỷ lệ tế bào chết tại các thời điểm sau khi chiếu từ trường với nồng độ chất lỏng nano từ 2 mg/mL ........................................................................ 123 Bảng 5.4. Tỷ lệ tế bào chết tại các thời điểm sau khi chiếu từ trường với nồng độ chất lỏng nano từ 1 mg/mL ........................................................................ 123 xiii
MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Lời cam đoan iii Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt iv Danh mục các hình vẽ vii Danh mục các bảng xii MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 Chương 1 TỔNG QUAN MỘT SỐ HỆ DẪN THUỐC .......................................7 1.1. Hệ dẫn thuốc ...................................................................................................7 1.1.1. Hệ dẫn thuốc kích thước thông thường .....................................................7 1.1.2. Hệ dẫn thuốc kích thước nano (HDTNN) ..................................................8 1.1.3. Các loại polyme nghiên cứu ứng dụng ..................................................... 21 1.1.4. Copolyme phân hủy sinh học PLA-PEG .................................................. 22 1.2. Hệ dẫn thuốc nano từ tính ........................................................................... 26 1.2.1. Hạt nano từ ............................................................................................... 26 1.2.2. Các phương pháp chế tạo hạt nano từ ..................................................... 33 1.2.3. Bọc bảo vệ và chức năng hệ nano từ tính ................................................ 37 Tóm lược chương 1 ............................................................................................... 399 Chương 2 CÁC KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM ................................................ 40 2.1. Phương pháp tổng hợp PLA-PEG............................................................... 40 2.1.1. Hóa chất và thiết bị ................................................................................... 40 2.1.2. Tổng hợp PLA-PEG ................................................................................. 40 2.2. Phương pháp chế tạo các hạt nano .............................................................. 40 2.2.1. Chế tạo hệ nano PLA-PEG, Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol ........ 40 2.2.2. Chế tạo hạt nano Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur .................. 41 2.3. Các phương pháp đặc trưng ........................................................................ 42 xiv
2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ copolyme và hạt nano Fe3O4 đến độ bền phân tán của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG ................................................. 42 2.3.2. Hiển vi điện tử .......................................................................................... 42 2.3.3. Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) ............................................... 44 2.3.4. Giản đồ tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering - DLS) .......... 45 2.3.5. Phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis (Ultraviolet-Visible) ................................. 45 2.3.6. Nhiễu xạ tia X (XRD) ............................................................................... 45 2.3.7. Phân tích nhiệt vi lượng (Thermal Gravimetric Analysis-TGA) .............. 46 2.3.8. Từ kế mẫu rung (Vitrating Sample Magetometer – VSM) ....................... 47 2.3.9. Đốt nóng cảm ứng từ (Magnetic Inductive Heating - MIH) .................... 47 2.3.10. Cộng hưởng từ hạt nhân ........................................................................ 49 2.3.11. Chụp ảnh cộng hưởng từ hạt nhân cho mẫu động vật .......................... 50 2.4. Phương pháp nghiên cứu giải phóng chậm thuốc ...................................... 51 2.4.1. Giải phóng chậm Curcumin bằng ủ nhiệt ................................................ 51 2.4.2. Giải phóng chậm Curcumin bằng MIH ................................................... 51 2.5. Thực nghiệm sinh học .................................................................................. 52 2.5.1. Thử nghiệm độc tính in vitro trên dòng tế bào HepG2 ............................ 52 2.5.2. Thử nghiệm sinh học trên tế bào ung thư và chuột mang khối u ............ 53 2.5.3. Phương pháp nhiệt từ trị tiêm trực tiếp vào khối u .................................. 56 Tóm lược chương 2 ............................................................................................... 588 Chương 3 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ ĐẶC TÍNH CỦA HỆ NANO COPOLYME PLA-PEG ĐA CHỨC NĂNG ...................... 59 3.1. Chế tạo các hệ nano copolyme PLA-PEG, Cur/PLA-PEG và Cur/PLA- PEG-Fol ........................................................................................................ 60 3.1.1. Chế tạo hạt nano copolyme PLA-PEG ..................................................... 60 3.1.2. Chế tạo hạt nano copolyme PLA-PEG mang Curcumin (Cur/PLA-PEG) .. ................................................................................................................ 60 3.1.3. Chế tạo hạt nano copolyme PLA-PEG mang Curcumin và gắn yếu tố hướng đích Folat (Cur/PLA-PEG-Fol) .................................................... 61 3.2. Cấu trúc, hình thái học và đặc trưng tính chất của các hạt nano PLA- PEG, Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol ............................................... 62 xv
3.2.1. Hình dạng, kích thước và sự phân bố kích thước hạt nano PLA-PEG ... 62 3.2.2. Hình dạng, kích thước và sự phân bố kích thước hạt nano Cur/PLA-PEG ................................................................................................................ 66 3.2.3. Hình dạng, kích thước và sự phân bố kích thước hệ nano Cur/PLA-PEG- Fol ............................................................................................................. 69 3.2.4. Khả năng mang thuốc của các hạt nano PLA-PEG ................................ 73 3.2.5. Kết quả đo phổ UV-Vis ............................................................................. 76 3.2.6. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại FT-IR ................................................ 77 3.3. Nghiên cứu giải phóng chậm Curcumin ..................................................... 80 3.4. Nghiên cứu khả năng gây độc trên tế bào ung thư của các hệ nano Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol ......................................................... 83 Kết luận chương 3 ................................................................................................... 87 Chương 4 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ ĐẶC TÍNH CỦA HỆ CHẤT LỎNG NANO TỪ ĐA CHỨC NĂNG LÕI HẠT Fe3O4 ................. 88 4.1. Chế tạo hệ nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur ................. 89 4.1.1. Tổng hợp hạt nano Fe3O4 ......................................................................... 89 4.1.2. Chế tạo hệ nano Fe3O4@PLA-PEG.......................................................... 90 4.1.3. Chế tạo hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur .................................................. 90 4.2. Cấu trúc, hình thái học và đặc trưng tính chất các mẫu hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur ................................................. 91 4.2.1. Phân tích XRD .......................................................................................... 91 4.2.2. Phân tích FT-IR ....................................................................................... 91 4.2.3. Hình dạng, kích thước và sự phân bố kích thước các hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur .............................................. 92 4.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ copolyme PLA-PEG và hạt nano Fe3O4 đến độ bền phân tán của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG .......................................... 95 4.3. Đặc trưng đóng góp khối lượng và từ tính của các mẫu Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur ............................................................................ 98 4.4. Ảnh cộng hưởng từ hạt nhân hệ nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA- PEG/Cur ..................................................................................................... 101 4.5. Kết quả đốt nóng cảm ứng từ của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur ............................................................................... 106 xvi
4.6. Đốt nóng cảm ứng từ giải phóng Curcumin của hệ nano Fe3O4@PLA- PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur ................................................................. 108 4.6.1. Đốt nóng cảm ứng từ bởi từ trường cường độ yếu................................. 108 4.6.2. Giải phóng Curcumin của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur bằng phương pháp ủ nhiệt ............................................................................................ 109 4.6.3. Giải phóng Curcumin của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur kích bởi đốt nóng cảm ứng từ..................................................................................... 109 4.6.4. Kết quả đốt từ giải phóng chậm Curcumin hệ nano Fe3O4@PLA- PEG/Cur khi ngắt tại cùng nhiệt độ ....................................................... 111 Kết luận chương 4 ................................................................................................. 114 Chương 5 THỰC NGHIỆM SINH HỌC HỆ CHẤT LỎNG NANO TỪ ĐA CHỨ NĂNG LÕI HẠT Fe3O4 ............................. 115 5.1. Kết quả thử nghiệm độc tính ..................................................................... 115 5.1.1. Độc tính tế bào ........................................................................................ 115 5.1.2. Độc tính cấp ............................................................................................ 116 5.2. Khả năng tăng tương phản ảnh cộng hưởng từ hạt nhân ........................ 117 5.2.1. Khả năng tăng tương phản ảnh cộng hưởng từ dịch tế bào .................. 117 5.2.2. Khả năng tăng tương phản ảnh chụp cộng hưởng từ khối u rắn .......... 118 5.3. Khả năng điều trị ung thư bằng nhiệt từ trị ............................................. 121 5.3.1. Khả năng tiêu diệt tế bào ung thư bằng nhiệt từ trị ............................... 121 5.3.2. Tiêu diệt khối u bằng nhiệt từ trị sử dụng Fe3O4@PLA-PEG ............... 125 Kết luận chương 5 ................................................................................................. 129 KẾT LUẬN CHUNG ............................................................................................ 131 A. CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN ....................... 133 B. CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN HƯỚNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN .. 134 xvii
MỞ ĐẦU Trong thế kỉ XXI, ngành khoa học vật liệu đã có bước phát triển đột phá nhờ khả năng can thiệp của con người tại kích thước nanomet (10-9 m). Công nghệ nano đang làm thay đổi cuộc sống của chúng ta từng ngày nhờ các ứng dụng đa dạng trên tất cả các phương diện về kinh tế và xã hội. Các kết quả nghiên cứu trong trên hai thập kỉ qua cho thấy công nghệ nano có nhiều tiềm năng ứng dụng trong y học (công nghệ nano Y học – Nanomedicine) và chuyên sâu hơn là trong điều trị ung thư (Công nghệ nano Ung thư – Cancer nanotechnology) [1, 2]. Trong vài thập niên trở lại đây, các hệ vật liệu kích thước nano phân phối thuốc đã được quan tâm phát triển mạnh, hệ phân phối thuốc kích thước nano được chứng minh là có nhiều ưu điểm vượt trội so với các hệ dẫn thuốc thông thường. Với kích thước nanomet, khả năng đóng gói thuốc tốt, có thể chức năng hóa bề mặt để tăng lưu thông trong máu, tăng tính tương thích sinh học, dễ dàng nhập bào theo cơ chế thụ động do có kích thước nanomet hoặc gắn yếu tố hướng đích làm tăng khả năng nhập bào và bám đích theo cơ chế chủ động và chọn lọc. Trong tất cả các hệ vật liệu phân phối thuốc kích thước nanomet, hệ polyme, hệ hạt vàng, hệ hạt từ được quan tâm hơn cả. Đặc biệt, hệ phân phối thuốc nanomet trên nền hạt nano sắt từ (Fe3O4) được quan tâm phát triển mạnh trong những năm gần đây với nhiều ưu điểm vượt trội như dễ dàng phát triển thành hệ nano phân phối thuốc đa chức năng ứng dụng cho cả mục đích chẩn đoán và điều trị bệnh. Polyme phân hủy sinh học được sử dụng để thiết kế các hệ phân phối thuốc kích thước nano với những đặc tính ưu việt hơn so với các hệ phân phối thuốc truyền thống như: kiểm soát giải phóng thuốc, tự phân hủy và không gây độc sau khi sử dụng, giảm liều dùng và sự phụ thuộc của bệnh nhân vào thuốc được cải thiện. Trong số các polyme phân hủy sinh học phải kể đến polylactic axit (PLA), poly(lactic-co-glycolic) (PLGA), … đã được cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (FDA) cho phép ứng dụng trong dược phẩm và lưu hành trên thị trường [3]. 1