Luận án Tiến sĩ Khoa học vật liệu: Nghiên cứu tổng hợp nanoliposome từ lecithin có nguồn gốc đậu nành và biến tính chúng với PEG định hướng làm hệ mang thuốc điều trị ung thư

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:159

Thêm vào BST

Báo xấu

12
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Khoa học vật liệu "Nghiên cứu tổng hợp nanoliposome từ lecithin có nguồn gốc đậu nành và biến tính chúng với PEG định hướng làm hệ mang thuốc điều trị ung thư" nghiên cứu tổng hợp, đánh giá tính ổn định cùng hiệu quả mang thuốc paclitaxel/carboplatin của vật liệu nanoliposome từ lecithin có nguồn gốc đậu nành biến tính bề mặt bằng PEG.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Khoa học vật liệu: Nghiên cứu tổng hợp nanoliposome từ lecithin có nguồn gốc đậu nành và biến tính chúng với PEG định hướng làm hệ mang thuốc điều trị ung thư

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Lê Ngọc Thùy Trang NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP NANOLIPOSOME TỪ LECITHIN CÓ NGUỒN GỐC ĐẬU NÀNH VÀ BIẾN TÍNH CHÚNG VỚI PEG ĐỊNH HƯỚNG LÀM HỆ MANG THUỐC ĐIỀU TRỊ UNG THƯ LUẬN ÁN TIẾN SỸ KHOA HỌC VẬT LIỆU Thành phố Hồ Chí Minh – 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Lê Ngọc Thùy Trang NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP NANOLIPOSOME TỪ LECITHIN CÓ NGUỒN GỐC ĐẬU NÀNH VÀ BIẾN TÍNH CHÚNG VỚI PEG ĐỊNH HƯỚNG LÀM HỆ MANG THUỐC ĐIỀU TRỊ UNG THƯ Chuyên ngành: Vật liệu cao phân tử và tổ hợp Mã số : 9440125 LUẬN ÁN TIẾN SỸ KHOA HỌC VẬT LIỆU NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS. TS. Nguyễn Cửu Khoa 2. PGS. TS. Vũ Minh Thành Thành phố Hồ Chí Minh – 2022
iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, kết quả trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nào khác. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm nếu có bất kỳ sự gian dối nào. Nghiên cứu sinh Lê Ngọc Thùy Trang
iv LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Học viện Khoa học và Công nghệ cùng tất cả các thầy cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu, cảm hứng nghiên cứu, kỹ năng chuyên môn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và làm luận án Tiến sĩ. Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến GS. TS. Nguyễn Cửu Khoa và PGS.TS. Vũ Minh Thành đã tận tụy hướng dẫn, định hướng và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Bên cạnh đó tôi xin gửi đến Viện Khoa học Vật liệu Ứng, Phòng Vật liệu y sinh lời cảm ơn chân thành vì đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Đồng thời tôi xin kính chúc quý thầy, cô Học viện Khoa học Công nghệ luôn mạnh khỏe để tiếp tục con đường sự nghiệp “Trồng người” của mình. Chúc quý thầy, cô, anh, chị Viện Khoa học vật liệu ứng dụng và các anh chị nghiên cứu sinh Khóa 2017 dồi dào sức khỏe và luôn luôn có được nhiều niềm vui trong cuộc sống. Cuối cùng, con xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến ba mẹ cùng anh, chị trong gia đình đã hết lòng giúp đỡ và động viên con mỗi khi con gặp khó khăn trong quá trình học tập cũng như trong cuộc sống để con có được thành tựu như ngày hôm nay. Nghiên cứu sinh Lê Ngọc Thùy Trang
v MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................... iii LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... iv MỤC LỤC .................................................................................................................. v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT...................................... viii DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................ x DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ................................................................xii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 4 1.1. Giới thiệu về liposome ..................................................................................... 4 1.1.1. Cơ chế hình thành liposome ...................................................................... 4 1.1.2. Phân loại liposome .................................................................................... 4 1.1.3. Nhược điểm và ưu điểm của liposome ...................................................... 6 1.1.4. Nguyên liệu tổng hợp liposome ................................................................. 7 1.1.5. Phương pháp tổng hợp liposome ............................................................ 10 1.2. Biến tính bề mặt nanoliposome .................................................................... 11 1.2.1. PEG hóa bề mặt vật liệu ......................................................................... 11 1.2.2. Phương pháp biến tính PEG lên bề mặt liposome .................................. 11 1.3. Vật liệu biến tính bề mặt nanoliposome ....................................................... 15 1.3.1. Polyethylen glycol (PEG)........................................................................ 15 1.3.2. Chitosan .................................................................................................. 15 1.3.3. Gelatin ..................................................................................................... 16 1.4. Thuốc chống ung thư paclitaxel ................................................................... 17 1.4.1. Tính chất hóa lý ....................................................................................... 17 1.4.2. Cơ chế tác động ...................................................................................... 18 1.4.3. Dược động học ........................................................................................ 19 1.4.4. Dược lực học ........................................................................................... 19 1.4.5. Tác dụng phụ [36] ................................................................................... 19 1.4.6. Những thách thức trong sử dụng paclitaxel ............................................ 20 1.5. Thuốc chống ung thư carboplatin ................................................................ 21 1.5.1. Tính chất hóa lý ....................................................................................... 21
vi 1.5.2. Cơ chế tác động ...................................................................................... 22 1.5.3. Dược động học ........................................................................................ 23 1.5.4. Dược lực học ........................................................................................... 23 1.5.5. Tác dụng phụ ........................................................................................... 23 1.5.6. Những thách thức trong sử dụng carboplatin ......................................... 23 1.6. Các nghiên cứu về hệ liposome mang thuốc chống ung thư ...................... 24 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 29 2.1. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 29 2.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu .................................................. 29 2.2.1. Hóa chất .................................................................................................. 29 2.2.2. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................. 31 2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 32 2.3.1. Phương pháp khảo sát các yếu tố lên quá trình tổng hợp nanoliposome từ lecithin có nguồn gốc đậu nành ........................................................................ 32 2.3.2. Phương pháp tổng hợp mPEG-cholesterol, mPEG-chitosan và mPEG- gelatin ................................................................................................................ 34 2.3.3. Phương pháp PEG hóa bề mặt nanoliposome bằng mPEG-Chol, mPEG- CS và mPEG-Gel............................................................................................... 39 2.3.4. Phương pháp nang hóa thuốc vào nanoliposome đã biến tính............... 40 2.3.5. Phương pháp đánh giá tính chất vật liệu ................................................ 41 2.3.6. Phương pháp đánh giá độc tính của vật liệu .......................................... 45 2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu....................................................................... 46 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 47 3.1. Kết quả khảo sát các yếu tố lên quá trình tổng hợp nanoliposome từ lecithin có nguồn gốc đậu nành ........................................................................................ 47 3.1.1. Kết quả khảo sát nhiệt độ chuyển pha của lecithin có nguồn gốc đậu nành ........................................................................................................................... 47 3.1.2. Kết quả khảo sát phương pháp giảm kích thước hạt .............................. 47 3.1.3. Kết quả khảo sát tỷ lệ thành phần tạo liposome ..................................... 48 3.2. Kết quả tổng hợp và khảo sát nanoliposome mPEG-Chol .......................... 52 3.2.1. Kết quả tổng hợp mPEG-Chol ................................................................ 52
vii 3.2.2. Kết quả biến tính bề mặt nanoliposome bằng mPEG-Chol và đánh giá tính chất vật liệu ................................................................................................ 56 3.3. Kết quả tổng hợp và khảo sát nanoliposome mPEG-CS ............................. 69 3.3.1. Kết quả tổng hợp mPEG-CS ................................................................... 69 3.3.2. Kết quả phủ mPEG-CS lên bề mặt nanoliposome và đánh giá tính chất vật liệu ............................................................................................................... 74 3.4. Kết quả tổng hợp và khảo sát nanoliposome mPEG-Gel ............................ 85 3.4.1. Kết quả tổng hợp mPEG-Gel .................................................................. 85 3.4.2. Kết quả phủ mPEG-Gel lên bề mặt nanoliposome và đánh giá tính chất vật liệu ............................................................................................................... 89 3.5. Kết quả đánh giá độc tính của vật liệu ....................................................... 100 3.5.1. Kết quả đánh giá độc tính của vật liệu mPEG-Chol và nanoliposome biến tính PEG bằng mPEG-Chol ............................................................................ 100 3.5.2. Kết quả đánh giá độc tính của vật liệu mPEG-CS và nanoliposome phủ bề mặt với mPEG-CS ...................................................................................... 105 3.5.3. Kết quả đánh giá độc tính của vật liệu mPEG-Gel và nanoliposome phủ bề mặt với mPEG-Gel ..................................................................................... 111 KẾT LUẬN ............................................................................................................ 119 KIẾN NGHỊ ........................................................................................................... 121 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ.................................................... 122 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 123 PHỤ LỤC ............................................................................................................... 130
viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ tiếng anh Nghĩa tiếng Việt Abs Absorption Độ hấp thu AIDS Acquired Immuno Deficiency Hội chứng suy giảm miễn Syndrom dịch mắc phải CAR Carboplatin CCF Cholesteryl chloroformate Chol Cholesterol CMC Critical micelle concentration Nồng độ micelle tới hạn CS Chitosan CTAB Cetyltrimethylamnonium bromide Da Dalton DLC Drug loading content Khả năng mang thuốc DLE Drug loading efficiency Hiệu suất nang hóa DLS Dynamic Light Scattering Tán xạ ánh sáng động DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DNA Deoxyribonucleic acid DSC Differential Scanning Calorimeter Phân tích nhiệt quét vi sai EDA Ethylenediamine EPR Enhanced Permeability and Hiệu ứng tăng cường tính Retention thấm và thời gian lưu giữ FBS Fetal Bovine Serum FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ FTIR Fourier Transform Infrared Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier Gel Gelatin Globocan Global Cancer Observatory Báo cáo thực trạng ung thư thế giới GUV Giant Unilamellar Vesicle Đơn lớp khổng lồ HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography IARC International Agency for Research Cơ quan nghiên cứu ung on Cancer thư quốc tế ICP-MS Inductively coupled plasma mass
ix LUV Large unilamellar Đơn lớp loại lớn MLV Multi-lamellar Đa lớp mPEG Methoxypolyethylene glycol mPEG-Chol mPEG-cholesterol mPEG-CS mPEG-chitosan mPEG-Gel mPEG-gelatin MTT 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5- diphenyl tetrazolium bromide MUV Medium unilamellar Đơn lớp loại vừa MVV Multi-vesicular Liposome chứa liposome Mw Molecular weight Trọng lượng phân tử MWCO Molecular weight cut off Chọn lọc khối lượng phân tử NCI National Cancer Institute Viện Ung thư Quốc gia NMR Nuclear magnetic resonance Cộng hưởng từ hạt nhân NPC p-nitrophenyl chloroformate OLV Oligo-lamellar Đa lớp PBS Phosphate Buffered Saline Dung dịch đệm phosphat PDI Polydispersity index Hệ số đa phân tán PEG Polyethylene glycol PTX Paclitaxel RES Reticuloendothelial system Hệ thống lưới nội mô RSD Relative Standards Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standards Deviation Độ lệch chuẩn SLP Soy lecithin liposome Liposome có nguồn gốc đậu nành SUV Small unilamellar Đơn lớp loại nhỏ T½ Thời gian bán thải TEM Transmission Electron Microscope Kính hiển vi điện tử truyền qua THF Tetrahydrofuran Tm Nhiệt độ nóng chảy USDA United States Department of Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ Agriculture WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới
x DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Phân loại liposome dựa theo kích thước và số lớp màng lipid kép [7] ...... 5 Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng trong thực nghiệm ........................................................ 29 Bảng 2.2. Thiết bị và dụng cụ sử dụng trong thực nghiệm ....................................... 31 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát phương pháp giảm kích thước hạt ................................ 47 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tỷ lệ lecithin:cholesterol ................................................ 48 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tỷ lệ CTAB .................................................................... 49 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tỷ lệ tween 80 ................................................................ 50 Bảng 3.5. Kết quả phổ FT-IR của mPEG, mPEG-NPC, mPEG-NH2, CCF và mPEG-Chol ............................................................................................................... 53 Bảng 3.6. Kết quả phổ 1H-NMR của mPEG-NPC, mPEG-NH2 và mPEG-Chol ..... 55 Bảng 3.7. Kết quả DLS và thế zeta của các sản phẩm SLP@mPEG-Chol .............. 56 Bảng 3.8. Kết quả phổ FT-IR của SLP, mPEG-Chol, PTX/SLP@mPEG-Chol và CAR/SLP@mPEG-Chol ........................................................................................... 59 Bảng 3.9. Hằng số tốc độ và hệ số tương quan của PTX nguyên liệu, PTX được nang hóa trong SLP và SLP@mPEG-Chol thu được thông qua mô hình động học bậc không, mô hình động học bậc một, mô hình Higuchi và mô hình Korsmeyer- Peppas........................................................................................................................ 64 Bảng 3.10. Hằng số tốc độ và hệ số tương quan của CAR, CAR/SLP và CAR/SLP@mPEG-Chol thu được thông qua mô hình động học bậc không, mô hình động học bậc một, mô hình Higuchi và mô hình Korsmeyer-Peppas ...................... 67 Bảng 3.11. Kết quả phổ FT-IR của mPEG, mPEG-NPC, chitosan và mPEG-CS ... 71 Bảng 3.12. Kết quả 1H-NMR của mPEG-NPC và mPEG-CS .................................. 72 Bảng 3.13. Kết quả DLS và thế zeta của sản phẩm SLP@mPEG-CS sau tổng hợp và sau 1 tuần bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8oC ................................................................ 74 Bảng 3.14. Kết quả phổ FT-IR của SLP, mPEG-CS, PTX/SLP@mPEG-CS và CAR/SLP@mPEG-CS .............................................................................................. 75 Bảng 3.15. Hằng số tốc độ và hệ số tương quan của PTX nguyên liệu, PTX được nang hóa trong SLP và SLP@mPEG-CS thu được thông qua mô hình động học bậc không, mô hình động học bậc một, mô hình Higuchi và mô hình Korsmeyer-Peppas80
xi Bảng 3.16. Hằng số tốc độ và hệ số tương quan của CAR, CAR/SLP và CAR/SLP@mPEG-CS thu được thông qua mô hình động học bậc không, mô hình động học bậc một, mô hình Higuchi và mô hình Korsmeyer-Peppas ...................... 83 Bảng 3.17. Kết quả phổ FT-IR của mPEG, mPEG-NPC, gelatin và mPEG-Gel ..... 86 Bảng 3.18. Kết quả 1H-NMR của mPEG-NPC và mPEG-Gel ................................. 88 Bảng 3.19. Kết quả DLS và thế zeta của sản phẩm SLP@mPEG-Gel sau tổng hợp và sau 1 tuần bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8oC ................................................................ 89 Bảng 3.20. Kết quả phổ FT-IR của SLP, mPEG-Gel, PTX/SLP@mPEG-Gel và CAR/SLP@mPEG-Gel ............................................................................................. 91 Bảng 3.21. Hằng số tốc độ và hệ số tương quan của PTX nguyên liệu, PTX được nang hóa trong SLP và SLP@mPEG-Gel thu được thông qua mô hình động học bậc không, mô hình động học bậc một, mô hình Higuchi và mô hình Korsmeyer-Peppas95 Bảng 3.22. Hằng số tốc độ và hệ số tương quan của CAR, CAR/SLP và CAR/SLP@mPEG-Gel thu được thông qua mô hình động học bậc không, mô hình động học bậc một, mô hình Higuchi và mô hình Korsmeyer-Peppas ...................... 98 Bảng 3.23. Bảng kết quả độ độc của SLP@mPEG-Chol, PTX, PTX/SLP@mPEG- Chol, CAR và CAR/SLP@mPEG-Chol trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 ....... 100 Bảng 3.24. Bảng kết quả độ độc của SLP@mPEG-Chol, PTX, PTX/SLP@mPEG- Chol, CAR và CAR/SLP@mPEG-Chol trên dòng tế bào lành L929 ..................... 103 Bảng 3.25. Bảng kết quả độ độc của SLP@mPEG-CS, PTX, PTX/SLP@mPEG-CS, CAR và CAR/SLP@mPEG-CS trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 .................... 106 Bảng 3.26. Bảng kết quả độ độc của SLP@mPEG-CS, PTX, PTX/SLP@mPEG-CS, CAR và CAR/SLP@mPEG-CS trên dòng tế bào lành L929.................................. 109 Bảng 3.27. Bảng kết quả độ độc của SLP@mPEG-Gel, PTX, PTX/SLP@mPEG- Gel, CAR và CAR/SLP@mPEG-Gel trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 ........... 112 Bảng 3.28. Bảng kết quả độ độc của SLP@mPEG-Gel, PTX, PTX/SLP@mPEG- Gel, CAR và CAR/SLP@mPEG-Gel trên dòng tế bào lành L929 ......................... 114 Bảng 3.29. Bảng tổng hợp kết quả biến tính bề mặt nanoliposome ....................... 117
xii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1. Cơ chế hình thành liposome [6] .................................................................. 4 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của lecithin có nguồn gốc đậu nành (SPC) ................... 7 Hình 1.3. Công thức cấu tạo của cholesterol .............................................................. 8 Hình 1.4. Công thức cấu tạo của CTAB ..................................................................... 9 Hình 1.5. Công thức cấu tạo của tween 80 ................................................................. 9 Hình 1.6. Hình ảnh so sánh giữa liposome được biến tính PEG trong quá trình tổng hợp (I) và biến tính PEG lên liposome đã được tổng hợp từ trước (II) [19]............. 12 Hình 1.7. Công thức cấu tạo của polyethylene glycol .............................................. 15 Hình 1.8. Công thức cấu tạo của chitosan ................................................................. 16 Hình 1.9. Công thức cấu tạo của gelatin ................................................................... 17 Hình 1.10. Công thức cấu tạo của paclitaxel ............................................................ 18 Hình 1.11. Công thức cấu tạo của carboplatin .......................................................... 22 Hình 2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài ............................................. 29 Hình 2.2. Quá trình tạo màng lipid ........................................................................... 32 Hình 2.3. Quá trình hydrat hóa.................................................................................. 33 Hình 2.4. Quá trình giảm kích thước tiểu phân liposome ......................................... 33 Hình 2.5. Phản ứng tổng hợp mPEG-NPC ............................................................... 35 Hình 2.6. Phản ứng tổng hợp mPEG-NH2 ................................................................ 36 Hình 2.7. Phản ứng tổng hợp mPEG-Chol ............................................................... 36 Hình 2.8. Quy trình tổng hợp mPEG-CS .................................................................. 37 Hình 2.9. Quy trình tổng hợp mPEG-Gel ................................................................. 38 Hình 3.1. Phổ FT-IR của mPEG, mPEG-NPC, mPEG-NH2, CCF và mPEG-Chol . 52 Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của mPEG5000-Chol .........................................................54 Hình 3.3. Hiệu suất mang thuốc (a) và khả năng mang thuốc (b) của hệ SLP@mPEG-Chol ở các nồng độ mPEG-Chol ........................................................57 Hình 3.4. Phổ FT-IR của SLP, mPEG-Chol, PTX/SLP@mPEG-Chol và CAR/SLP@mPEG-Chol ...........................................................................................58 Hình 3.5. Kết quả DLS (a), thế zeta (b) và TEM scale 200 nm (c) của PTX/SLP@mPEG-Chol ............................................................................................60
xiii Hình 3.6. Kết quả DLS (a), thế zeta (b) và TEM scale 200 nm (c) của CAR/SLP@mPEG-Chol ...........................................................................................61 Hình 3.7. Kết quả đánh giá sự thay đổi độ đục (được biểu thị bằng độ hấp thu) của PTX/SLP@mPEG-Chol (a, b) và CAR/SLP@mPEG-Chol (c, d) khi ủ với 50% FBS ...................................................................................................................................62 Hình 3.8. Kết quả phóng thích thuốc PTX nguyên liệu, PTX được nang hóa trong SLP và SLP@mPEG-Chol trong môi trường PBS (pH 7,4) ....................................63 Hình 3.9. Mô hình động học giải phóng thuốc PTX nguyên liệu, PTX từ PTX/SLP và PTX/SLP@mPEG-Chol thông qua bốn mô hình động học: (a) Mô hình bậc không, (b) Mô hình bậc một, (c) Mô hình Higuchi và (d) Mô hình Korsmeyer-Peppas ........65 Hình 3.10. Kết quả phóng thích thuốc CAR nguyên liệu, CAR được nang hóa trong SLP và SLP@mPEG-Chol trong môi trường PBS (pH 7,4) ....................................66 Hình 3.11. Mô hình động học giải phóng thuốc CAR nguyên liệu, CAR từ CAR/SLP và CAR/SLP@mPEG-Chol thông qua bốn mô hình động học: (a) Mô hình bậc không, (b) Mô hình bậc một, (c) Mô hình Higuchi và (d) Mô hình Korsmeyer-Peppas ....................................................................................................68 Hình 3.12. Phổ FT-IR của mPEG, mPEG-NPC, chitosan và mPEG-CS .................70 Hình 3.13. Phổ 1H-NMR của mPEG-NPC và mPEG-CS .........................................71 Hình 3.14. Hiệu suất mang thuốc (a) và khả năng mang thuốc (b) của hệ SLP@mPEG-CS ở các nồng độ mPEG-CS ..............................................................73 Hình 3.15. Phổ FT-IR của SLP, mPEG-CS, PTX/SLP@mPEG-CS và CAR/SLP@mPEG-CS ..............................................................................................75 Hình 3.16. Kết quả DLS (a), thế zeta (b) và TEM scale 200 nm (c) của PTX/SLP@mPEG-CS ...............................................................................................77 Hình 3.17. Kết quả DLS (a), thế zeta (b) và TEM scale 200 nm (c) của CAR/SLP@mPEG-CS ..............................................................................................78 Hình 3.18. Kết quả đánh giá sự thay đổi độ đục (được biểu thị bằng độ hấp thu) của PTX/SLP@mPEG-CS (a, b) và CAR/SLP@mPEG-CS (c, d) khi ủ với 50% FBS .79 Hình 3.19. Kết quả phóng thích thuốc PTX nguyên liệu, PTX được nang hóa trong SLP và SLP@mPEG-CS trong môi trường PBS (pH 7,4) .......................................79
xiv Hình 3.20. Mô hình động học giải phóng thuốc PTX nguyên liệu, PTX từ PTX/SLP và PTX/SLP@mPEG-CS thông qua bốn mô hình động học: (a) Mô hình bậc không, (b) Mô hình bậc một, (c) Mô hình Higuchi và (d) Mô hình Korsmeyer-Peppas ......81 Hình 3.21. Kết quả phóng thích thuốc CAR nguyên liệu, CAR được nang hóa trong SLP và SLP@mPEG-CS trong môi trường PBS (pH 7,4) .......................................82 Hình 3.22. Mô hình động học giải phóng thuốc CAR nguyên liệu, CAR từ CAR/SLP và CAR/SLP@mPEG-CS thông qua bốn mô hình động học: (a) Mô hình bậc không, (b) Mô hình bậc một, (c) Mô hình Higuchi và (d) Mô hình Korsmeyer- Peppas........................................................................................................................84 Hình 3.23. Phổ FT-IR của mPEG, mPEG-NPC, gelatin và mPEG-Gel ...................86 Hình 3.24. Phổ 1H-NMR của mPEG-NPC và mPEG-Gel ........................................87 Hình 3.25. Hiệu suất mang thuốc (a) và khả năng mang thuốc (b) của hệ SLP@mPEG-Gel ở các nồng độ mPEG-Gel ............................................................88 Hình 3.26. Phổ FT-IR của SLP, mPEG-Gel, PTX/SLP@mPEG-Gel và CAR/SLP@mPEG-Gel .............................................................................................90 Hình 3.27. Kết quả DLS (a), thế zeta (b) và TEM scale 200 nm (c) của PTX/SLP@mPEG-Gel ..............................................................................................92 Hình 3.28. Kết quả DLS (a), thế zeta (b) và TEM scale 200 nm (c) của CAR/SLP@mPEG-Gel .............................................................................................93 Hình 3.29. Kết quả đánh giá sự thay đổi độ đục (được biểu thị bằng độ hấp thu) của PTX/SLP@mPEG-Gel (a, b) và CAR/SLP@mPEG-Gel (c, d) khi ủ với 50% FBS94 Hình 3.30. Kết quả phóng thích thuốc PTX nguyên liệu, PTX được nang hóa trong SLP và SLP@mPEG-Gel trong môi trường PBS (pH 7,4) ......................................94 Hình 3.31. Mô hình động học giải phóng thuốc PTX nguyên liệu, PTX từ PTX/SLP và PTX/SLP@mPEG-Gel thông qua bốn mô hình động học: (a) Mô hình bậc không, (b) Mô hình bậc một, (c) Mô hình Higuchi và (d) Mô hình Korsmeyer-Peppas ........96 Hình 3.32. Kết quả phóng thích thuốc CAR nguyên liệu, CAR được nang hóa trong SLP và SLP@mPEG-Gel trong môi trường PBS (pH 7,4) ......................................97 Hình 3.33. Mô hình động học giải phóng thuốc CAR nguyên liệu, CAR từ CAR/SLP và CAR/SLP@mPEG-Gel thông qua bốn mô hình động học: (a) Mô hình bậc không, (b) Mô hình bậc một, (c) Mô hình Higuchi và (d) Mô hình Korsmeyer-Peppas ........99
xv Hình 3.34. Biểu đồ độ độc dòng tế bào ung thư vú MCF-7 của (a) PTX và PTX/SLP@mPEG-Chol, (b) CAR và CAR/SLP@mPEG-Chol và (c) SLP@mPEG- Chol .........................................................................................................................101 Hình 3.35. Hình ảnh độ độc dòng tế bào ung thư vú MCF-7 của SLP@mPEG-Chol, PTX, PTX/SLP@mPEG-Chol, CAR và CAR/SLP@mPEG-Chol ........................102 Hình 3.36. Biểu đồ độ độc dòng tế bào lành L929 của (a) PTX và PTX/SLP@mPEG- Chol, (b) CAR và CAR/SLP@mPEG-Chol và (c) SLP@mPEG-Chol....................104 Hình 3.37. Hình ảnh độ độc dòng tế bào lành L929 của SLP@mPEG-Chol, PTX, PTX/SLP@mPEG-Chol, CAR và CAR/SLP@mPEG-Chol ..................................105 Hình 3.38. Biểu đồ độ độc dòng tế bào ung thư vú MCF-7 của (a) PTX và PTX/SLP@mPEG-CS, (b) CAR và CAR/SLP@mPEG-CS và (c) SLP@mPEG-CS .................................................................................................................................107 Hình 3.39. Hình ảnh độ độc dòng tế bào ung thư vú MCF-7 của SLP@mPEG-CS, PTX, PTX/SLP@mPEG-CS, CAR và CAR/SLP@mPEG-CS ..............................108 Hình 3.40. Biểu đồ độ độc dòng tế bào lành L929 của (a) PTX và PTX/SLP@mPEG-CS, (b) CAR và CAR/SLP@mPEG-CS và (c) SLP@mPEG-CS .................................................................................................................................110 Hình 3.41. Hình ảnh độ độc dòng tế bào lành L929 của SLP@mPEG-CS, PTX, PTX/SLP@mPEG-CS, CAR và CAR/SLP@mPEG-CS ........................................111 Hình 3.42. Biểu đồ độ độc dòng tế bào ung thư vú MCF-7 của (a) PTX và PTX/SLP@mPEG-Gel, (b) CAR và CAR/SLP@mPEG-Gel và (c) SLP@mPEG-Gel .................................................................................................................................112 Hình 3.43. Hình ảnh độ độc dòng tế bào ung thư vú MCF-7 của SLP@mPEG-Gel, PTX, PTX/SLP@mPEG-Gel, CAR và CAR/SLP@mPEG-Gel ............................113 Hình 3.44. Biểu đồ độ độc dòng tế bào lành L929 của (a) PTX và PTX/SLP@mPEG-Gel, (b) CAR và CAR/SLP@mPEG-Gel và (c) SLP@mPEG- Gel ...........................................................................................................................115 Hình 3.45. Hình ảnh độ độc dòng tế bào lành L929 của SLP@mPEG-Gel, PTX, PTX/SLP@mPEG-Gel, CAR và CAR/SLP@mPEG-Gel ......................................116
1 MỞ ĐẦU Tình hình mắc và tử vong do ung thư trên toàn thế giới theo thống kê trong báo cáo của GLOBOCAN năm 2020 cho thấy đều có xu hướng tăng cao. Trong đó, Việt Nam được xếp hạng thứ 50/185 về tỷ lệ tử vong và 91/185 về tỷ lệ mắc mới ung thư trên 100000 người. Ung thư là tập hợp các bệnh lý liên quan đến việc các tế bào tăng sinh một cách mất kiểm soát khi bị kích thích bởi các tác nhân sinh ung thư và tạo thành khối u. Bệnh nhân trong giai đoạn hóa trị ung thư thường mệt mỏi, chán ăn, giảm sức đề kháng và rụng tóc,… nguyên nhân là do trong quá trình điều trị, thuốc chống ung thư được đưa vào trong cơ thể không chỉ tiêu diệt các tế bào ung thư bên cạnh đó còn tác động đến các tế bào lành. Điều đó khiến cho hiệu quả điều trị giảm và gây ảnh hưởng đến sức khỏe của người bệnh. Vật liệu nano đã và đang được ứng dụng mạnh mẽ trong lĩnh vực y sinh, đặc biệt là điều trị ung thư sau nhiều thập niên phát triển. Trong đó, một trong số hệ nano ứng dụng trong điều trị ung thư được thương mại hóa chính là liposome. Liposome có kích thước nhỏ hơn các tế bào máu hàng ngàn lần đã được mô tả lần đầu tiên bởi Alec D Bangham tại viện nghiên cứu Babraham (Cambridge, Anh) vào năm 1961. Liposome được sử dụng làm chất mang tải thuốc có thể cải thiện tính tan, tăng dung nạp và giảm các tác dụng phụ của thuốc. Tuy nhiên, các nghiên cứu trên cho thấy hệ liposome chưa được biến tính bề mặt cho sinh khả dụng chưa cao vì có độ ổn định sinh học thấp vì vậy dễ bị đào thải ra khỏi cơ thể [1,2]. Vì vậy, nhiều nhà nghiên cứu đã tiến hành biến tính polyethylene glycol (PEG) lên bề mặt liposome. Việc biến tính này nhằm tạo ra một hàng rào ngăn cản sự tương tác của liposome với các opsonin và đại thực bào; đồng thời các chuỗi dài polyme này còn hạn chế được sự tương tác giữa các liposome với nhau giúp kéo dài thời gian tuần hoàn trong máu và tăng khả năng hướng đích cho hệ liposome [3,4]. Bên cạnh đó, các hệ liposome đã được phát triển hiện nay hầu hết đều sử dụng các nguyên liệu lipid có nguồn gốc từ động vật nên đại đa số thuốc điều trị ung thư dựa trên công nghệ liposome đều có giá thành cao và người bệnh khó tiếp cận được với các sản phẩm này. Trên cơ sở đó, chúng tôi đã chọn thực hiện đề tài “Nghiên cứu tổng hợp nanoliposome từ lecithin có nguồn gốc đậu nành và biến tính chúng với PEG định hướng làm hệ mang thuốc
2 điều trị ung thư”. Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu tổng hợp, đánh giá tính ổn định cùng hiệu quả mang thuốc paclitaxel/carboplatin của vật liệu nanoliposome từ lecithin có nguồn gốc đậu nành biến tính bề mặt bằng PEG. Nội dung của luận án: - Khảo sát các yếu tố lên quá trình tổng hợp nanoliposome từ lecithin có nguồn gốc đậu nành. - Tổng hợp mPEG-cholesterol, biến tính bề mặt nanoliposome với mPEG- cholesterol và đánh giá tính chất vật liệu. - Tổng hợp mPEG-chitosan, phủ mPEG-chitosan lên bề mặt nanoliposome và đánh giá tính chất vật liệu. - Tổng hợp mPEG-gelatin, phủ mPEG-gelatin lên bề mặt nanoliposome và đánh giá tính chất vật liệu. - Đánh giá độc tính của vật liệu. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn: Các kết quả nghiên cứu tổng hợp vật liệu nanoliposome từ lecithin có nguồn gốc đậu nành biến tính bề mặt bằng PEG không chỉ có ý nghĩa về mặt khoa học mà còn có ý nghĩa tốt về mặt thực tiễn. Kết quả thu được góp phần làm sáng tỏ vấn đề về sự ổn định và tính hiệu quả của nanoliposome trong mang và phóng thích thuốc paclitaxel/carboplatin, làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn sau này về chức năng và lâm sàng. Những đóng góp mới của luận án: Đã tổng hợp thành công các vật liệu mPEG-Chol, mPEG-CS và mPEG-Gel được sử dụng để biến tính bề mặt nanoliposome mang thuốc PTX/CAR. Trong đó, nanoliposome biến tính bằng mPEG-Chol, mPEG-CS mang PTX/CAR và nanoliposome biến tính bằng mPEG-Gel chưa được nghiên cứu trước đây. Kích thước hạt của các hệ nanoliposome biến tính PEG với các khối lượng phân tử khác nhau của mPEG cho thấy khi khối lượng phân tử của mPEG tăng sẽ làm tăng kích thước của liposome và khối lượng phân tử của mPEG càng nhỏ thì
3 liposome càng bền. Đây là nét mới của luận án trong việc đánh giá khối lượng phân tử mPEG phù hợp để sử dụng trong tổng hợp các vật liệu biến tính. Đã đánh giá độ ổn định trong huyết thanh, khả năng phóng thích thuốc kết hợp phân tích động học phóng thích thuốc và độc tính của các hệ nanoliposome biến tính PEG bằng các vật liệu tổng hợp. Các kết quả này sẽ làm nền tảng cho các nghiên cứu chuyên sâu hơn cũng như trong lâm sàng.
4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về liposome 1.1.1. Cơ chế hình thành liposome Liposome có cấu trúc bao gồm một vỏ phospholipid với một hoặc nhiều lớp bao bọc xung quanh một nhân nước ở giữa và có kích thước hạt từ hàng chục cho đến hàng nghìn nanomet [5]. Đặc tính của màng phospholipid của liposome là lớp kép phospholipid. Trong đó, “đầu ưa nước” là đầu phospholipid chứa một nhóm phosphat tích điện âm và glycerol; “đuôi kỵ nước” là đuôi phospholipid gồm 2 chuỗi axit béo dài, kỵ nước và tránh tương tác với nước. Các lớp kép lipid khi được đặt trong dung dịch nước thì các đầu ưa nước sẽ quay ra ngoài để tiếp xúc với nước và các đuôi kỵ nước sẽ quay vào với nhau bởi tương tác kỵ nước tạo thành cấu trúc liposome. Hình 1.1. Cơ chế hình thành liposome [6] 1.1.2. Phân loại liposome Tùy từng thành phần lipid, phương pháp bào chế, điện tích bề mặt và kích thước mà các liposome hình thành có các đặc tính khác nhau; thường khác nhau về cấu trúc, kích thước và khả năng mang thuốc/ hoạt chất. Phân loại liposome thường dựa vào cấu trúc của lớp lipid kép. Bên cạnh đó, phương pháp bào chế cũng là một trong những cách phân loại liposome. 1.1.2.1. Phân loại dựa vào cấu trúc Dựa vào số lớp màng lipid kép và kích thước hạt, liposome được phân loại thành các dạng như trong Bảng 1.1.
5 Bảng 1.1. Phân loại liposome dựa vào số lớp màng lipid kép và kích thước hạt [7] Dạng liposome Từ viết tắt Kích thước hạt Số lớp màng lipid kép Liposome chứa liposome MVV > 1 µm Cấu trúc đa ngăn Đa lớp OLV 0,1 – 1 µm 5 Đa lớp MLV > 0,5 µm 5 – 25 Đơn lớp khổng lồ GUV > 1µm 1 Đơn lớp loại vừa MUV > 100 µm 1 Đơn lớp loại lớn LUV > 1000 µm 1 Đơn lớp loại nhỏ SUV 20 – 100 nm 1 1.1.2.2. Phân loại dựa vào phương pháp bào chế VET (Vesicles by extraction techniques): liposome được bào chế bằng kỹ thuật ép đùn qua các màng có kích thước khác nhau. REV (Reverse – phase evaporation vesicles): liposome được bào chế bằng phương pháp bốc hơi pha đảo. FTV (Freeze – thaw vesicles): liposome được bào chế bằng phương pháp đông lạnh-xã đông. DRV (Dehydrattion – Rehydration vesicles): liposome được bào chế bằng phương pháp dehydrat hóa – hydrat hóa trở lại. 1.1.2.3. Phân loại dựa vào mục đích sử dụng Với các tác nhân khác nhau được biến tính trên bề mặt mà liposome được phân loại thành các dạng sau [8]: - Conventional liposome (liposome): liposome thế hệ đầu tiên và cơ bản nhất được phát triển, trong đó, thành phần lớp màng lipid chỉ chứa các lipid tích điện dương, âm hoặc trung tính. - PEGylated liposome (liposome PEG hóa): liposome biến tính bề mặt bằng cách sử dụng các polymer ưa nước phủ bên ngoài lớp màng phospholipid kép để làm giảm tỷ lệ đào thải thuốc và tăng thời gian lưu thông trong máu. Trong đó, polyethylene glycol (PEG) là một trong số những polymer được sử dụng phổ biến để biến tính các hệ nano mang thuốc mang lại hiệu quả nhất hiện nay.