Luận văn Thạc sĩ Lâm nghiệp: Nghiên cứu nhân giống in vitro loài Hoàng tinh trắng (Disporopsis longifolia Craib)

Chia sẻ: Tri Lễ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:52

Thêm vào BST

Báo xấu

35
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là xác định được phương pháp khử trùng mẫu củ Hoàng tinh trắng bằng HgCl2 để tạo vật liệu vô trùng phục vụ việc tái sinh in vitro; xác định được nồng độ GA3 thích hợp cho khả năng tái sinh chồi; nồng độ BAP, BAP kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh chồi; nồng độ IAA, NAA, IBA thích hợp đến khả năng ra rễ của chồi; đưa ra được một số đề xuất về bảo tồn và phát triển loài Hoàng tinh trắng từ kết quả nghiên cứu.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Lâm nghiệp: Nghiên cứu nhân giống in vitro loài Hoàng tinh trắng (Disporopsis longifolia Craib)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NÔNG THỊ HOA NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LOÀI HOÀNG TINH TRẮNG (Disporopsis longifolia Craib) LUẬN VĂN THẠC SỸ LÂM NGHIỆP Chuyên ngành: Lâm học Cao Bằng - 2020
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NÔNG THỊ HOA NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LOÀI HOÀNG TINH TRẮNG (Disporopsis longifolia Craib) Chuyên ngành: Lâm học Mã số: 60.62.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ LÂM NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Thị Thu Hà Cao Bằng - 2020
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của bản thân tôi. Các số liệu và kết quả nghiên là quá trình nghiên cứu hoàn toàn trung thực, chưa công bố trên các tài liệu, nếu có gì sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Cao Bằng, ngày tháng năm Người viết cam đoan Nông Thị Hoa
ii LỜI CẢM ƠN Luận văn “Nghiên cứu nhân giống in vitro loài Hoàng tinh trắng (Disporopsis longifolia Craib)” được hoàn thành theo chương trình đào tạo cao học Lâm nghiệp, chuyên ngành Lâm học, khóa học K26 của Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên. Trong quá trình học tập cũng như hoàn thành luận văn, tác giả đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học và các thầy, cô giáo Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên. Nhân dịp này tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Trong quá trình nghiên cứu, đề tài có kế thừa 1 phần kết quả nghiên cứu về đặc điểm sinh thái học, sinh học của loài Hoàng tinh trắng trong đề tài “Nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen Hoàng tinh trắng (Disporopsis longifolia Craib) có giá trị kinh tế cao tại tỉnh Hà Giang” do Thạc sĩ Hoàng Thanh Phúc làm chủ nhiệm đề tài, thời gian (2018 – 2020) được thực hiện tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm Nghiệp và tỉnh Hà Giang. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Thị Thu Hà đại diện cơ quan chủ trì thực hiện đề tài và cũng là người hướng dân Tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, đã giúp cho tôi được tiếp cận và làm việc trong môi trường nghiên cứu với cơ sở vật chất khang trang, đầy đủ cùng với các đồng nghiệp, cộng sự dày dặn kinh nghiệm để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn chủ nhiệm đề tài Th.S Hoàng Thanh Phúc đã đồng ý và giúp tôi được tham gia nghiên cứu cùng nhóm nghiên cứu của đề tài. Vì điều kiện thời gian nghiên cứu và trình độ chuyên môn của bản thân còn có những hạn chế nhất định, nên luận văn không thể tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận được những ý kiến góp ý quý báu của các nhà khoa học cũng như các bạn đồng nghiệp để bài luận văn này được hoàn chỉnh hơn. Cuối cùng tác tôi xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp, bạn bè và người thân trong gia đình đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Tác giả Nông Thị Hoa
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................ii MỤC LỤC ..................................................................................................................... iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................................... vi DANH MỤC BẢNG BIỂU ...........................................................................................vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ .............................................................................................. viii DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................................ i MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài............................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................................... 2 3. Ý nghĩa của đề tài ........................................................................................................ 2 3.1. Ý nghĩa khoa học ...................................................................................................... 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ...................................................................................................... 2 Chương 1 ......................................................................................................................... 3 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ....................................................................................... 3 1.1. Một số nghiên cứu về loài Hoàng tinh trắng trên thế giới........................................ 3 1.2. Một số nghiên cứu về loài Hoàng tinh trắng ở Việt Nam ........................................ 3 1.3. Giới thiệu về cây Hoàng tinh trắng (Disporopsis longifolia Craib) ......................... 4 1.3.1. Phân loại học ......................................................................................................... 4 1.3.2. Đặc điểm thực vật học ........................................................................................... 4 1.3.3. Đặc điểm sinh thái và phân bố .............................................................................. 5 1.3.4. Thành phần hóa học và tác dụng dược lý .............................................................. 5 1.3.5. Giá trị của cây Hoàng tinh trắng............................................................................ 5 1.4. Kế thừa kết quả nghiên cứu một số đặc điểm sinh thái, sinh học của loài Hoàng tinh trắng từ đề tài “Nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen Hoàng tinh trắng (Disporopsis longifolia Craib) có giá trị kinh tế cao tại tỉnh Hà Giang” .......................... 6
iv 1.5. Tổng quan về nhân giống in vitro............................................................................. 8 1.5.1. Khái quát nuôi cấy mô tế bào ................................................................................ 8 1.5.2. Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào ............................................................... 9 1.5.3. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào ................................................................... 9 1.5.4. Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật ...................................................................... 10 1.5.5. Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật .......................................... 11 1.5.6. Các giai đoạn của nhân giống vô tính ................................................................. 13 Chương 2 ....................................................................................................................... 16 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......... 16 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .......................................................................... 16 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .......................................................................... 16 2.3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 16 2.4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 16 2.4.1. Phương pháp kế thừa tài liệu ............................................................................... 16 2.4.2. Hóa chất, thiết bị chuẩn bị cho nuôi cấy in vitro Hoàng tinh trắng .................... 17 2.4.3. Phương pháp nghiên cứu khử trùng mẫu củ Hoàng tinh trắng bằng HgCl2 để tạo vật liệu vô trùng phục vụ việc tái sinh in vitro ................................................................ 18 2.4.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng tái sinh chồi Hoàng tinh trắng ...................................................................................................... 19 2.4.5. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của BAP, BAP kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh chồi Hoàng tinh trắng ................................................................................... 19 2.4.6. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của IAA, NAA, IBA đến khả năng ra rễ Hoàng tinh trắng .............................................................................................................. 20 2.4.7. Điều kiện thí nghiệm ........................................................................................... 21 2.4.8. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu .............................................................. 21 Chương 3 ....................................................................................................................... 22 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN............................................................. 22
v 3.1. Kết quả nghiên cứu khử trùng mẫu củ Hoàng tinh trắng bằng HgCl2 để tạo vật liệu vô trùng phục vụ việc tái sinh in vitro ........................................................................... 22 3.2. Sự khác nhau của nồng độ GA3 đến khả năng tái sinh chồi Hoàng tinh trắng ...... 24 3.3. Kết quả nghiên cứu sự khác nhau của nồng độ chất BAP, BAP kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Hoàng tinh trắng .......................................................... 27 3.3.1. Kết quả nghiên cứu sự khác nhau của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi chồi Hoàng tinh trắng .............................................................................................. 27 3.3.2. Sự khác nhau của nồng độ BAP kết hợp với Kinein đến khả năng nhân nhanh chồi Hoàng tinh trắng ...................................................................................................... 29 3.4. Sự khác nhau của nồng độ IAA, NAA, IBA đến khả năng ra rễ Hoàng tinh trắng30 3.5. Đề xuất một số giải pháp bảo tồn, phát triển loài Hoàng tinh trắng từ kết quả nghiên cứu ..................................................................................................................... 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 39 1. Kết luận...................................................................................................................... 39 2. Kiến nghị ................................................................................................................... 39 PHỤ LỤC ...................................................................... Error! Bookmark not defined.
vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BAP : 6-Benzylaminopurine cs : Cộng sự GA3 : Gibberellic Acid IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole butyric acid NAA : α-naphthaleneaceticd.
vii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1. Thành phần cơ bản của môi trường MS........................................................ 17 Bảng 2.2. Nghiên cứu Ảnh hưởng của IAA, NAA, IBA đến khả năng ra rễ Hoàng tinh trắng ............................................................................................................................... 20 Bảng 3.1. Sự khác nhau của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1 % đến khả năng tạo vật liệu vô trùng ............................................................................................................. 22 Bảng 3.2. Sự khác nhau của nồng độ GA3 đến khả năng tái sinh chồi Hoàng tinh trắng25 Bảng 3.3. Sự khác nhau của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Hoàng tinh trắng ............................................................................................................................... 27 Bảng 3.5. Sự khác nhau của nồng độ IAA đến khả năng ra rễ Hoàng tinh trắng ......... 31 Bảng 3.6. Sự khác nhau của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ Hoàng tinh trắng ........ 33 Bảng 3.7. Sự khác nhau của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ Hoàng tinh trắng .......... 34
viii DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Sự khác nhau giữa thời gian khử trùng đến khả năng tạo vật liệu ............23 vô trùng ..........................................................................................................................23 Biểu đồ 3.2. Sự khác nhau của nồng độ GA3 đến khả năng tái sinh chồi Hoàng tinh trắng ..............................................................................................................................26 Biểu đồ 3.3. Biểu đồ so sánh kết quả ra rễ giữa 3 chất điều hòa sinh trưởng IAA, NAA, IBA ...............................................................................................................................36
i DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Hình ảnh Lá, thân, hoa, quả cây Hoàng tinh trắng .......................................... 8 Hình 3.1. Hình ảnh mẫu Hoàng tinh trắng sống không bị nhiễm sau khi khử trùng bằng HgCl2 0,1 % trong 5 phút.............................................................................................. 24 Hình 3.2. Hình ảnh tái sinh chồi của mẫu Hoàng tinh trắng khi môi trường có bổ sung GA3 1,0 mg/l ................................................................................................................. 27 Hình 3.5. Mẫu Hoàng tinh trắng cấy trong môi trường có bổ sung IBA 1,0mg/l sau 30 ngày theo dõi ................................................................................................................. 35 Hình 3.6. Hình ảnh chồi Hoàng tinh trắng ra rễ khi bổ sung các chất kích thích ra rễ khác nhau ....................................................................................................................... 36
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hoàng tinh trắng (Disporopsis longifolia Craib) là một loài dược liệu quý được đưa vào Dược điển Việt Nam tập 2, 3: là vị thuốc được ghi đầu tiên trong “Danh y biệt lục” với nhiều công năng và tác dụng chữa bệnh rất tốt và hữu ích. Hoàng tinh trắng có tác dụng: bổ âm, bổ phế, bổ huyết, sinh tân dịch, bồi dưỡng cơ thể, đắp chữa sưng tấy, đụng dập, trĩ và kết hợp với các vị thuốc để chữa nhiều bệnh khác (Đỗ Tất Lợi, 2004). Với nhiều công dụng tốt như vậy nên Hoàng tinh trắng ngoài tự nhiên bị khai thác ngày càng cạn kiệt. Hiện nay có rất ít các công trình nghiên cứu về bảo tồn và phát triển nguồn gen các loài cây thuốc bản địa quý. Ở nước ta công tác bảo tồn các loài cây dược liệu nói chung và cây Hoàng tinh trắng nói riêng chưa thực sự gắn liền với phát triển. Để phát triển, công tác chọn tạo giống, công nghệ nhân và nuôi trồng giống tốt cung cấp nguyên liệu chất lượng cần được quan tâm. Chính vì vậy, việc cải tiến áp dụng công nghệ trong bảo tồn, nhân giống là một giải pháp hữu hiệu giải quyết vấn đề về phát triển dược liệu hiện nay. Theo báo cáo của hầu hết các tỉnh vùng núi phía Bắc, việc bảo tồn và phát triển các loài cây dược liệu tại các địa phương còn nhiều hạn chế từ giống cho đến trồng và thu hoạch. Giống sử dụng không rõ nguồn gốc, giống tạp, chất lượng chưa cao, nhân giống bằng phương pháp truyền thống nên giống không được đảm bảo cả số lượng và chất lượng. Trên thế giới, ứng dụng nhân giống bằng công nghệ sinh học trong nhân giống đảm bảo cây giống tạo ra chất lượng cao, sạch bệnh, đồng nhất thích hợp để sản xuất đại trà, quy mô công nghiệp theo hướng sản xuất hàng hóa rất phát triển. Ở nước ta, công nghệ sinh học cũng được ứng dụng để nhân giống thành công nhiều loài cây dược liệu quý tại các cơ sở nghiên cứu viện, trường, trung tâm. Để bảo tồn và phát triển được loài Hoàng tinh trắng thì việc điều tra, nghiên cứu các đặc điểm sinh thái học, sinh học từ đó nghiên cứu các biện pháp nhân giống nhằm tạo ra nguồn giống tốt, sạch bệnh chất lượng cao để cung cấp nguồn giống tốt trên quy mô công nghiệp là rất cần thiết. Chính vì vậy chúng Tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu nhân giống invitro loài Hoàng tinh trắng (Disporopsis longifolia Craib)”.
2 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định được phương pháp khử trùng mẫu củ Hoàng tinh trắng bằng HgCl2 để tạo vật liệu vô trùng phục vụ việc tái sinh in vitro. - Xác định được nồng độ GA3 thích hợp cho khả năng tái sinh chồi; nồng độ BAP, BAP kết hợp với Kinetin đến khả nhân nhanh chồi; nồng độ IAA, NAA, IBA thích hợp đến khả năng ra rễ của chồi. - Đưa ra được một số đề xuất về bảo tồn và phát triển loài Hoàng tinh trắng từ kết quả nghiên cứu. 3. Ý nghĩa của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học - Kết quả nghiên cứu của đề tài là những tư liệu quý, tài liệu tham khảo có giá trị và là cơ sở khoa học để đề xuất các biện pháp bảo tồn và phát triển loài cây Hoàng tinh trắng (Disporopsis longifolia Craib) ở nước ta. - Làm tài liệu cho công tác nghiên cứu khoa học, tài liệu tham khảo khác về loài Hoàng tinh trắng. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Từ kết quả nghiên cứu của đề tài có thể áp dụng phương pháp nhân giống in vitro loài Hoàng tinh trắng để sản xuất ra cây giống tốt, sạch bệnh, đồng đều với số lượng lớn giúp cung cấp cây giống cho người dân có thể mở rộng các mô hình trồng Hoàng tinh trắng trên quy mô công nghiệp, tạo công ăn việc làm, tăng thu nhập cho người dân các vùng núi.
3 Chương 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. Một số nghiên cứu về loài Hoàng tinh trắng trên thế giới Hoàng tinh trắng có tên khoa học là Disporopsis longifolia Craib, thuộc họ Hoàng tinh (Convallariaceae) (Acharya et al., 2009). Cây phân bố rộng khắp các vùng nhiệt đới từ Ấn Độ tới các dãy núi ở Đông Nam Á, Trung Quốc. Cây đặc biệt ưa ẩm, ưa bóng và ưa vùng có khí hậu quanh năm ẩm mát. Chúng thường mọc thành khóm trên đất ẩm nhiều mùn hay trên các hốc đá, dọc hành lang ven suối, dưới tán rừng ẩm ở độ cao khoảng 400 - 1500 m (Thomas, 2016). Hiện nay Hoàng tinh trắng được nhân giống vô tính chủ yếu bằng hom củ. Trung Quốc là nước có lịch sử rất dài trong sử dụng các loài Hoàng tinh như một loại thảo dược quý (Bulpitt, 2005). Trên thế giới, Hoàng tinh trắng ngoài tự nhiên đã bị thu hái đến mức cạn kiệt. Giá bán trên thị trường thế giới khoảng 60.000 – 70.000 đồng/kg củ tươi. Hoàng tinh trắng có tác dụng điều hòa huyết áp, lipit máu, tăng cường miễn dịch, điều trị đái tháo đường. Nghiên cứu hóa sinh hiện đại cho thấy dược liệu hoàng tinh chứa Glucose, Mannose, Galacturonic acid, Fructose (Pengelly, 2004). Theo y học cổ truyền Đài Loan, Hoàng tinh sau khi chế biến có tác dụng tăng cường chức năng miễn dịch, chống xơ vữa động mạch, làm hạ đường huyết, tăng lưu lượng máu qua động mạch vành, kháng viêm. Hoàng tinh trắng đang được xếp vào Sách đỏ ở nhiều nước do môi trường sống ngày càng thu hẹp (Winkel, 2006). Vì vậy, bảo tồn và phát triển nguồn gen loài cây này đã được quan tâm ở nhiều nước. Nghiên cứu nhân giống và nuôi trồng còn ít được công bố. 1.2. Một số nghiên cứu về loài Hoàng tinh trắng ở Việt Nam Hoàng tinh trắng được xếp vào dạng sẽ nguy cấp, sắp bị tuyệt chủng do số lượng cá thể suy giảm nhanh, lại bị thu hái bằng cách đào thân rễ và môi trường sống bị thu hẹp. Mức độ đe doạ: Bậc V. Hiện nay, loài cây này đang nằm trong sách Đỏ cần ưu tiên bảo tồn và phát triển. Trong tự nhiên loài Hoàng tinh trắng phân bố chủ yếu ngoài rừng tự nhiên nhưng do khai thác liên tục dẫn đến cạn kiệt và hiếm dần. Việc
4 nghiên cứu nhân giống để bảo tồn và phát triển loài dược liệu này đang là vấn đề cấp bách. Cho đến nay có rất ít công trình nghiên cứu về bảo tồn và nhân giống Hoàng tinh. Đặng Ngọc Hùng và Hoàng Thị Phong (2013) đã nhân giống cây Hoàng tinh trắng (Disporopsis longifolia) bằng hom củ tại Cao Bằng. Trần Ngọc Hải đã tiến hành đề tài cấp Bộ NN&PTNT: “Khai thác và phát triển nguồn gen hai loài cây thuốc Hoàng tinh trắng (Disporopsis longifolia Craib.) và Củ dòm (Stephania dielsiana Y.C.Wu.) ở một số tỉnh vùng miền núi Phía Bắc” giai đoạn 2012-2014. Nhìn chung chưa có công bố nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô. 1.3. Giới thiệu về cây Hoàng tinh trắng (Disporopsis longifolia Craib) 1.3.1. Phân loại học Ở Việt Nam Hoàng tinh trắng còn có tên gọi khác là: Hoàng tinh cách, Hoàng tinh lá mọc cách, cây đót, co hán han (Thái), voòng chính, néng lài (Tày). Hoàng tinh trắng có tên khoa học là Disporopsis longifolia Craib., thuộc họ Hoàng tinh Convallariaceae, bộ Măng tây Asparagales (Sách đỏ Việt Nam, 2007). Giới Thực vật (Plantae) Phân giới Thực vật xanh (Viridaeplantae) Ngành Hạt kín (Magnoliophyta) Lớp Thực vật hai lá mầm (Magnoliopsida) Bộ Cúc (Asterales) Họ Hoa Chuông (Campanulaceae) Chi Đẳng sâm (Codonopsis) Loài C. Pilosula 1.3.2. Đặc điểm thực vật học Hoàng tinh trắng là loại cây cỏ, sống nhiều năm. Thân rễ mập, thành chuỗi, mọc ngang, gồm nhiều đốt, mặt trên có sẹo do vết thân tàn lụi để lại. Thân khí sinh cao 0,6 - 1 m, đứng, nhẵn, cao đến gần 1m. Lá không cuống, mọc so le, dài 10 - 20 (27) cm, rộng 2,5 - 6 (10) cm phiến hình mác, đầu nhọn dài hình trứng hoặc trái xoan. Hoa trắng, hình chuông, Cụm hoa mọc ở nách lá, có 5 - 7 hoa, rủ xuống, cuống hoa 1cm. Hoa màu trắng, bao hoa hợp thành sống chia 6 thùy ở miệng. Nhị 6, đính ở miệng ống, chỉ nhị, hình bản, có 2 tai ở đầu. Quả chín màu trắng xốp. Quả mọng, hình cầu, khi
5 chín màu tím đen. Mùa hoa tháng 3-5; Quả: Tháng 6-8. Tái sinh bằng thân rễ hoặc bằng hạt. Cây sinh trưởng phát triển mạnh vào mùa xuân hè. Vào mùa thu đông chỉ còn lại củ trong đất thời điểm này cần thu hoạch củ. Trồng và chăm sóc cây sau 3-4 năm sẽ cho thu hoạch củ (Đỗ Tất Lợi, 2004). 1.3.3. Đặc điểm sinh thái và phân bố Hoàng tinh trắng mọc ở nơi ẩm mát, ưa bóng, dưới tán rừng và ưa vùng có khí hậu quanh năm ẩm mát trên các hốc mùn đá tại vùng núi cao ở ở các tỉnh miền núi phía bắc như Hoà Bình, Hà Tây, Ninh Bình, Lai Châu, Điện Biên, Lào Cai, Sơn La, Hà Giang, Yên Bái, Cao Bằng, Nghệ An. Cây mọc hoang thành khóm, trên đất ẩm nhiều mùn hay trên các hốc đá, dọc hành lang ven suối, dưới tán rừng kín thường xanh ẩm (nhất là loại hình rừng núi đá), ở độ cao 100 - 1200 m. Cho đến nay chủ yếu khai thác từ nguồn gen mọc hoang, rất ít được trồng (Sách đỏ Việt Nam, 2007). 1.3.4. Thành phần hóa học và tác dụng dược lý Thành phần hoá học trong củ Hoàng tinh gồm chất nhầy, đường, tinh bột, acid amin, alcaloid, flavonoid, sterol, chất béo, chất nhầy, iridoid glycozid, alcaloid, 17 acid amin trong đó có nhiều acid amin cần thiết cho cơ thể (Nguyễn Thị Phương Dung, 2002). Tác dụng: Hoàng tinh trắng được xem là một loài cây có giá trị cao trong y học. Hoàng tinh có vị ngọt, tính bình; có tác dụng bổ trung ích khí, trừ phong thấp, nhuận tâm phế, ích tỳ vị, trợ gân cốt, thêm tinh tuỷ, đen tóc sống lâu (Ngô Triệu Anh, 2011). Ngày nay người ta đã biết Hoàng tinh trắng có tác dụng bổ, tăng lực, làm hạ đường huyết, làm săn da và làm dịu viêm, chữa các chứng hư tổn, suy nhược, chứng mệt mỏi, tăng huyết áp, chống lão suy, tăng cường chức năng miễn dịch, tăng lưu lượng máu qua động mạch vành tim, chống xơ vữa mạch máu, hạ đường huyết, kháng viêm (Võ Văn Chi, 1997). Bộ phận dùng: Thân rễ. Thu hái vào mùa thu. Rửa sạch, đồ chín, phơi khô, sau đó chế thành "thục" bằng cách: ban đêm đun, ban ngày phơi, làm liên tục 9 lần. 1.3.5. Giá trị của cây Hoàng tinh trắng Hiện nay ở nước ta, cây Hoàng tinh trắng được người dân thu hái và bán cho thương lái giá trên 200 nghìn đồng/kg và chủ yếu bán cho thương lái Trung Quốc.
6 Việc bị săn lùng ráo riết để bán cho Đài Loan, Trung Quốc, đã dẫn tới cạn kiệt dược thảo quý này ở nước ta. Cây Hoàng tinh trắng thường xuyên bị khai thác trong vòng vài chục năm trở lại đây; trữ lượng giảm mạnh; nhiều vùng chỉ còn cây nhỏ hoặc đã trở nên hiếm rõ rệt. Hiện chỉ còn ở khu bảo tồn thiên nhiên Tát Kẻ - Bản Bung (Nà Hang - Tuyên Quang) và Vườn Quốc gia Ba Bể thỉnh thoảng gặp cây lớn. Nạn phá rừng làm nương rẫy cũng trực tiếp làm thu hẹp vùng phân bố (Văn Bàn và Mường Khương - Lào Cai; Tràng Định - Lạng Sơn). Loài Hoàng tinh trắng đang được ghi trong Sách Đỏ Việt Nam với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp” (Bậc V) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 2) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ để hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại. Bảo vệ các quần thể hiện có trong các Vườn quốc gia (Ba Vì, Tam Đảo, Ba Bể, Cúc Phương). Chỉ nên khai thác những cây lớn, có thân rễ (củ) khoảng 100 gam trở lên. 1.4. Kế thừa kết quả nghiên cứu một số đặc điểm sinh thái, sinh học của loài Hoàng tinh trắng từ đề tài “Nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen Hoàng tinh trắng (Disporopsis longifolia Craib) có giá trị kinh tế cao tại tỉnh Hà Giang” * Đặc điểm sinh thái Qua điều tra nghiên cứu loài Hoàng tinh trắng tại tỉnh Hà giang kết quả cho thấy Hoàng tinh trắng là cây đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng. Thường mọc thành khóm trên đất ẩm nhiều mùn hay trên các hốc đá, dưới tán rừng. Khu vực phân bố Hoàng tinh trắng có khí hậu ẩm mát quanh năm, nhiệt độ trung bình khoảng 23,40C, độ ẩm không khí trung bình 84%, tổng lượng mưa trên năm khoảng 2.805 mm, tổng số giờ nắng trên năm khoảng 1.210 giờ. Đất có màu từ xám nhạt đến xám đen, tầng đất mặt tơi xốp, nhiều mùn, ẩm ướt, thành phần cơ giới đất từ thịt nhẹ, trung bình đến nặng, tỉ lệ lẫn đá ít, khả năng thấm, thoát nước tốt. Hoàng tinh trắng phân bố hẹp thường mọc rải rác ở ven rừng tự nhiên và dọc các khe suối có độ tàn che cao. * Đặc điểm sinh học
7 - Lá Hoàng tinh trắng có màu xanh đậm khi trưởng thành và màu xanh nhạt lá mạ khi còn non, lá có các vân dọc xong xong nhau. Lá không cuống, mọc so le, dài 10 - 20 cm, rộng 3 - 6 cm, phiến hình mác, đầu nhọn dài hình trứng hoặc trái xoan. - Hoàng tinh trắng là cây thân thảo, đứng, sống nhiều năm, cao 0,6 - 1,2 m. Thân nhẵn lúc non có đốm tím hồng, sau xanh trắng, đường kính 0,3 - 0,6 cm. Thân rễ mập, mọc ngang chia thành những lóng tròn có sẹo to, lõm non như cái chén và nhiều ngấn ngang. Thân lá lụi vào mùa đông, sinh trưởng mạnh trong mùa xuân hè, có khả năng đẻ nhánh tạo thành khóm lớn với nhiều thân. - Hoa Hoàng tinh trắng màu trắng, hình chuông. Cụm hoa mọc ở nách lá, có 5 - 7 hoa, rủ xuống, cuống hoa 1cm. Hoa màu trắng, bao hoa hợp thành sống chia 6 thùy ở miệng. Nhị 6, đính ở miệng ống, chỉ nhị, hình bản, có 2 tai ở đầu. Mùa hoa tháng 3 - 6, quả tháng 6 – 9. - Quả Hoàng tinh trắng là dạng quả mọng, chín màu trắng xốp, hình cầu, khi chín già màu tím đen. Mùa quả vào tháng 6-8, hạt nhỏ. - Rễ Hoàng tinh trắng là dạng rễ chùm, Thân rễ mọc ngang có nhiều đốt, đường kính to tới 3-4cm, lõi màu trắng, phía ngoài màu phớt hồng, mập mạp, có mùi thơm. Cây con thường thấy xung quanh gốc cây mẹ. Phần thân mang lá lụi hàng năm vào mùa đông, chồi mới mọc từ thân rễ vào đầu mùa xuân. Thân rễ bị gãy, phần còn lại vẫn có thể tái sinh. Lá cây Hoàng tinh trắng Thân cây Hoàng tinh trắng
8 Hoa cây Hoàng tinh trắng Quả cây Hoàng tinh trắng Hình 1.1. Hình ảnh Lá, thân, hoa, quả cây Hoàng tinh trắng * Đánh giá chung về tình hình tổng quan nghiên cứu Nhìn chung các nghiên cứu về loài Hoàng tinh trắng ở Việt Nam và trên thế giới đã nghiên cứu và mô tả được các đặc điểm sinh vật, đưa ra được đặc điểm sinh thái phân bố của loài. Nghiên cứu được các thành phần hóa học trong củ Hoàng tinh trắng và các tác dụng dược lý do Hoàng tinh trắng mang lại. Các công trình nghiên cứu về bảo tồn và nhân giống loài Hoàng tinh trắng ở Việt Nam và trên thế giới đã có nhưng rất ít và chủ yếu là nghiên cứu về giâm hom. Nghiên cứu về nhân giống in vitro hầu như chưa có công bố nào chính thức. Một vấn đề đặt ra hiện nay là muốn bảo tồn và phát triển loài Hoàng tinh trắng cần kết hợp giữa các biện pháp bảo tồn với nghiên cứu nhân giống để tạo ra được các giống có nguồn gen tốt đảm bảo chất lượng, cây giống tạo ra với số lượng lớn, độ đồng đều cao, giải pháp tốt nhất hiện nay là nghiên cứu nhân giống in vitro loài Hoàng tinh trắng. 1.5. Tổng quan về nhân giống in vitro 1.5.1. Khái quát nuôi cấy mô tế bào Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng. Nhân giống vô tính in vitro được tiến hành trên nguyên tắc cắt nuôi đoạn thân có mang chồi ở nách lá, đoạn rễ hay mảnh củ.
9 Nuôi cấy mô tế bào thực vật được hình thành và phát triển từ những năm 80 của thế kỉ XX và được ứng dụng chủ yếu trong các lĩnh vực: Nhân giống vô tính in vitro, nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng để tạo cây sạch bệnh, bảo quản nguồn gen in vitro, tạo phôi vô tính và hạt nhân tạo...Trịnh Đình Đạt (2007). Trong những năm gần đây, nhiều quy trình nhân giống bằng kỹ thuật nhân giống vô tính nuôi cấy in vitro được nhiều cơ sở khoa học nghiên cứu và hoàn thiện trên các đối tượng khác nhau như: cây rừng, cây lương thực, thực phẩm, cây ăn quả, hoa, cây cảnh, cây dược liệu… Nhằm góp phần vào cung cấp nguồn giống cây rừng phục vụ cho công tác nâng cao và cải thiện giống cây rừng, đồng thời duy trì bảo tồn và phát triển loài cây quý hiếm. Hàng loạt quy trình nhân giống in vitro các loại cây rừng được nghiên cứu và hoàn thiện nhằm tạo ra lượng lớn cây giống, có chất lượng tốt. Cho đến nay, nuôi cấy mô tế bào thực vật được xem giải pháp công nghệ quan trọng trong công nghệ sinh học nói chung. Trên môi trường nhân tạo, từ các mô hoặc các cơ quan thực vật ban đầu có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh và chỉ trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một lượng lớn cây trồng có cấu trúc di truyền và các đặc điểm sinh học giống hệt nhau. 1.5.2. Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902. Haberlandt lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đó phân hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào (Nguyễn Quang Thạch, 2009). 1.5.3. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào Sự phân hoá là sự chuyển các tế bào từ dạng phôi sinh sang tế bào chuyên hoá để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hoá khác nhau.