Luận văn Thạc sĩ Lâm nghiệp: Nghiên cứu nhân giống Thông caribê (Pinus caribaea Morelet) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

Chia sẻ: Tri Lễ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:69

Thêm vào BST

Báo xấu

18
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu nhân giống, xác định được môi trường nuôi cấy thích hợp để nhân giống thông và tạo được cây con Thông caribê hoàn chỉnh bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Lâm nghiệp: Nghiên cứu nhân giống Thông caribê (Pinus caribaea Morelet) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

-1- Më ®Çu Mét trong nh÷ng loµi c©y ®· ®îc dÉn nhËp vµo trång thµnh c«ng ë ViÖt Nam lµ Th«ng caribª (Pinus caribaea Morelet), Th«ng caribª gåm ba biÕn chñng lµ Pinus caribaea var caribaea, Pinus caribaea var hondurensis vµ Pinus caribaea var bahamensis ®Òu cã ph©n bè tù nhiªn ë vïng Trung Mü [27]. §©y lµ loµi c©y gç lín, cã thÓ cung cÊp gç lµm nguyªn liÖu ®Ó s¶n xuÊt bét giÊy, v¸n nh©n t¹o vµ ®å gia dông. Lµ loµi c©y cã sinh trëng nhanh, cµnh nh¸nh nhá, th©n th¼ng ®Ñp, tû lÖ lîi dông gç cao… ®¸p øng ®îc nhiÒu môc tiªu kinh tÕ, nªn ®Õn nay ®· cã trªn 65 níc nhËp gièng g©y trång, chñ yÕu lµ c¸c níc thuéc vïng nhiÖt ®íi vµ ¸ nhiÖt ®íi [9]. Th«ng caribª ®îc nhËp vµo trång thö nghiÖm ë níc ta n¨m 1963 t¹i L©m §ång [9], qua c¸c kh¶o nghiÖm vµ rõng trång thö nghiÖm cho thÊy Th«ng caribª tá ra lµ loµi c©y cã søc sinh trëng nhanh, thÝch øng réng víi nhiÒu vïng sinh th¸i. KÕt qu¶ nhiÒu n¬i cho thÊy rõng sinh trëng kh¸ tèt vµ Th«ng caribª cã kh¶ n¨ng thÝch øng lín víi m«i trêng. §Æc biÖt Th«ng caribª cã thÓ sinh trëng ®îc trªn c¸c vïng ®Êt trèng, ®åi träc nghÌo dinh dìng, mét bé phËn ®Êt ®ai rÊt lín ë níc ta [2], [3]. Nh÷ng dÊu hiÖu ®ã cho thÊy Th«ng caribª lµ mét trong sè nh÷ng loµi c©y trång rõng cã triÓn väng cung cÊp gç nhì, gç lín, gç nguyªn liÖu giÊy … cho nÒn kinh tÕ quèc d©n vµ ®ång thêi sím n©ng cao ®é che phñ cña rõng gãp phÇn æn ®Þnh m«i trêng sinh th¸i vµ ®ang ®îc nhiÒu c¬ quan nghiªn cøu, nhiÒu c¬ së s¶n xuÊt hÕt søc quan t©m. ë ViÖt Nam c¸c loµi th«ng ®îc trång chñ yÕu hiÖn nay lµ Th«ng ba l¸ (Pinus kesiya), Th«ng nhùa (Pinus merkusii), Th«ng ®u«i ngùa (Pinus masoniana) vµ gÇn ®©y lµ Th«ng caribª (Pinus caribaeea) víi c¸c biÕn chñng kh¸c nhau [11]. Nh×n chung trong c¸c loµi th«ng nµy, Th«ng caribª lµ loµi th«ng cã sinh trëng nhanh, th©n c©y th¼ng ®Ñp, cµnh nh¸nh nhá h¬n Th«ng ba l¸ vµ Th«ng ®u«i ngùa, cã tû lÖ gç sö dông cao nªn ®îc a thÝch g©y trång. Víi ®Æc ®iÓm sinh lý, sinh th¸i
-2- vµ gi¸ trÞ kinh tÕ cña Th«ng caribª, trong ch¬ng tr×nh trång míi 5 triÖu hecta rõng hiÖn nay, Th«ng caribª ®· ®îc chän lµ mét trong nh÷ng c©y trång chÝnh quan träng cÇn ®îc u tiªn ph¸t triÓn. Tuy nhiªn sù ra hoa kÕt qu¶ cña Th«ng caribª ë ViÖt Nam tõ nhiÒu n¨m tríc ®©y cã mét sè vÊn ®Ò. Trªn c¬ së theo dâi vËt hËu c¸c l©m phÇn Th«ng caribª trong c¶ níc vµ sè liÖu ®iÒu tra c¸c nguån gièng, cã thÓ thÊy lµ kh¶ n¨ng cung øng gièng Th«ng caribª ë ViÖt Nam cha ®ñ ®¸p øng nhu cÇu trång rõng trong níc. T×nh tr¹ng thiÕu gièng hiÖn nay lµ do mét sè nguyªn nh©n. Nguyªn nh©n t¹o ra biÕn ®éng vÒ n¨ng suÊt vµ chÊt lîng h¹t gièng Th«ng caribª ë ViÖt Nam lµ do mét sè l©m phÇn cã diÖn tÝch lín míi b¾t ®Çu ®Õn tuæi thµnh thôc vµ cho h¹t h÷u thô nh ë U«ng BÝ (Qu¶ng Ninh), H¬ng S¬n (Hµ TÜnh). Ngoµi ra n¨ng lùc s¶n xuÊt h¹t gièng cña c¸c l©m phÇn Th«ng caribª ë ViÖt Nam cha ®¬c tËn dông hÕt ®Ó ®¸p øng nhu cÇu gièng trong níc [1]. NhiÒu khu rõng trång th«ng kh«ng ra hoa kÕt qu¶ hoÆc chØ ra qu¶ mµ kh«ng cã h¹t h÷u thô hoÆc sè h¹t h÷u thô rÊt Ýt, kh«ng ®ñ h¹t gièng cung cÊp cho trång rõng. Trong khi kh¶ n¨ng cung cÊp h¹t cña Th«ng caribª cha ®ñ, gi¸ thµnh h¹t nhËp ngo¹i ®¾t, nh©n gièng v« tÝnh th«ng cã vai trß quan träng trong viÖc ph¸t triÓn c©y gièng ®Ó cung cÊp cho trång rõng. Ngµy nay, kü thuËt nh©n gièng c©y trång ®· cã nh÷ng bíc ph¸t triÓn vît bËc, b»ng c«ng nghÖ nh©n gièng v« tÝnh cã thÓ t¹o ra mét sè lîng lín c©y gièng mang b¶n chÊt di truyÒn gièng hÖt c©y mÑ trong mét thêi gian ng¾n. Trªn thÕ giíi c«ng nghÖ nh©n gièng v« tÝnh th«ng bao gåm kü thuËt nu«i cÊy in vitro (nu«i cÊy m« tÕ bµo) vµ kü thuËt nh©n gièng hom, chiÕt, ghÐp… trong ®ã nu«i cÊy in vitro vµ gi©m hom ngµy cµng ®ãng vai trß chñ ®¹o. LÇn ®Çu tiªn n¨m 1976, nh÷ng thùc nghiÖm vÒ nh©n gièng hom víi mét sè loµi th«ng nhiÖt ®íi ®· ®îc tiÕn hµnh t¹i Trung t©m nghiªn cøu c©y cã sîi (nay lµ ViÖn nghiªn cøu c©y nguyªn liÖu giÊy) ë møc lµ nh÷ng nghiªn cøu rÊt s¬ khai vµ ®· ®¹t ®îc mét sè kÕt qu¶. Trung t©m nghiªn cøu gièng c©y rõng ( ViÖn KHLN ) còng ®· thö nghiÖm gi©m hom mét sè loµi th«ng vµ ®· thµnh c«ng bíc ®Çu víi c©y th«ng lai vµ c©y Th«ng Caribª. Tuy nhiªn Th«ng caribª l¹i lµ loµi khi nh©n gièng b»ng ph¬ng ph¸p gi©m hom trùc tiÕp
-3- tõ c©y tréi kh«ng ph¶i lu«n ®¹t ®îc kÕt qu¶. Khi gi©m hom cho loµi th«ng nµy tõ c©y non ë vên cÊp hom th× dÔ thµnh c«ng h¬n [8]. Nh vËy gi©m hom th«ng ë ViÖt Nam kÕt qu¶ cha cao, cha thÓ ®a vµo s¶n xuÊt quy m« lín. HiÖn nay nu«i cÊy in vitro ®· ®îc ¸p dông trong mét sè níc cã nÒn l©m nghiÖp ph¸t triÓn vµ ®· ®îc thùc hiÖn ë quy m« c«ng nghiÖp. Nu«i cÊy m« tÕ bµo lµ mét kü thuËt tiªn tiÕn trong nh©n gièng c©y trång, ®Æc biÖt ®èi víi c¸c c©y th©n gç nh c©y ¨n qu¶ vµ c©y l©m nghiÖp. Nu«i cÊy m« tÕ bµo cã nhiÒu u viÖt h¬n h¼n c¸c ph¬ng ph¸p nh©n gièng kh¸c: cho hÖ sè nh©n gièng cao, tõ mét c©y mÑ u viÖt ban ®Çu cã thÓ t¹o ra hµng triÖu c©y ®· ®îc lµm trÎ ho¸ vµ s¹ch bÖnh… C©y u viÖt ®îctrÎ ho¸ qua nu«i cÊy m« lµ nguån vËt liÖu lý tëng ®Ó cung cÊp hom gièng cho nh©n gièng b»ng gi©m hom. XuÊt ph¸t tõ nh÷ng vÊn ®Ò trªn, chóng t«i tiÕn hµnh nghiªn cøu ®Ò tµi: “ Nghiªn cøu nh©n gièng Th«ng caribª (Pinus caribaea Morelet) b»ng ph¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro” §èi tîng nghiªn cøu lµ loµi Th«ng caribª (Pinus caribaea var hondrensis), loµi th«ng nµy lµ mét trong 3 biÕn chñng cña Th«ng caribª cã nhiÒu triÓn väng ë ViÖt Nam.
-4- Ch¬ng 1 Tæng quan tµI liÖu 1.1. Mét sè kÕt qu¶ øng dông kü thuËt nu«i cÊy in vitro thùc vËt trong s¶n xuÊt n«ng l©m nghiÖp Nh©n gièng b»ng nu«i cÊy m« tÕ bµo hay vi nh©n gièng lµ tªn gäi chung cho c¸c ph¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro cho c¸c bé phËn nhá ®îc t¸ch khái c©y (George, 1993) ®ang ®îc dïng phæ biÕn ®Ó nh©n gièng thùc vËt, trong ®ã cã c©y l©m nghiÖp. C¸c bé phËn ®îc dïng ®Ó nu«i cÊy cã thÓ lµ chåi ®Ønh, chåi bªn, chåi bÊt ®Þnh, bao phÊn, phÊn hoa, ph«i vµ c¸c bé phËn kh¸c nh vá c©y, l¸ non, th©n mÇm … [18], [19]. Nhê øng dông kü thuËt nu«i cÊy m« vµo nh©n gièng, ngêi ta ®· t¹o ra hµng lo¹t c©y con ®ång nhÊt vÒ kiÓu gen víi sè lîng lín mµ c¸c ph¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh th«ng thêng kh¸c kh«ng thÓ cã ®îc. Nu«i cÊy m« cã u thÕ h¬n c¸c ph¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh kh¸c lµ cã tû lÖ nh©n gièng cao, tíi hµng triÖu c©y mçi n¨m. Ngoµi ra cã thÓ ¸p dông nhiÒu biÖn ph¸p xö lý lªn nu«i cÊy in vitro h¬n lµ c¸c ph¬ng ph¸p kh¸c. C©y gièng t¹o ra b»ng ph¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro võa khoÎ, trÎ sinh lý vµ cã thÓ s¹ch virus ngay c¶ khi mÉu lÊy tõ ®Ønh sinh trëng cña nh÷ng c©y ®· nhiÔm virus. N¨m 1960, Morell ®· nhËn thÊy m« ph©n sinh cña ®Þa lan vµ phong lan cã rÊt Ýt hoÆc kh«ng cã virus, tõ ®ã «ng ph¸t hiÖn ra kh¶ n¨ng nh©n nhanh c©y s¹ch bÖnh cña c¸c gièng nµy. ChØ sau mét n¨m, «ng thu ®îc 4 triÖu c©y ®ång nhÊt vÒ mÆt di truyÒn tõ mét chåi lan ban ®Çu [22]. Sau ®ã Morell vµ céng sù ®· phôc tr¸ng gièng khoai t©y b»ng c¸ch dïng kü thuËt nu«i cÊy m« ph©n sinh vµ ®· t¹o ra ®îc nh÷ng c©y khoai t©y kh«ng chøa virus (1968) [22]. Theo Murashige (1974) cã kho¶ng 300 loµi c©y cã thÓ nh©n gièng b»ng ph¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro) [33]. Kü thuËt nu«i cÊy m« ®· ®îc h¬n 600 c«ng ty trªn thÕ giíi ¸p dông ®Ó nh©n hµng triÖu c©y gièng hµng n¨m, trong ®ã chñ yÕu
-5- lµ nh©n gièng c©y hoa, c©y c¶nh, c©y ¨n qu¶, c©y c«ng nghiÖp vµ mét sè c©y rau (Vasin, 1994) [21]. Nhu cÇu c©y gièng in vitro ngµy cµng nhiÒu, mÊy n¨m gÇn ®©y hµng n¨m trªn thÕ giíi s¶n xuÊt kho¶ng 50 triÖu c©y c¸c lo¹i, íc tÝnh ph¶i ®¹t 250 triÖu c©y/n¨m míi ®¸p øng ®îc yªu cÇu thùc tiÔn [19]. Dù kiÕn thÞ trêng c©y gièng ®îc nh©n b»ng kü thuËt nu«i cÊy m« vµo kho¶ng 15 tû USD/n¨m vµ tèc ®é t¨ng trëng hµng n¨m cña thÞ trêng lµ kho¶ng 15% (Govil vµ Gupta, 1997) [21]. Th¸i Lan mçi n¨m xuÊt khÈu hoa thu kho¶ng 20 triÖu USD, trong ®ã phÇn lín lµ hoa ®îc nh©n gièng b»ng nu«i cÊy in vitro. ViÖc chän vËt liÖu ban ®Çu cho vi nh©n gièng lµ rÊt quan träng, kh«ng nh÷ng quyÕt ®Þnh sù thµnh c«ng ban ®Çu mµ c¶ qu¸ tr×nh nh©n tiÕp theo. C¸c c«ng tr×nh cña D’Amato (1977) cho thÊy chØ cã ®Ønh sinh trëng cña chåi míi ®¶m b¶o vÒ sù æn ®Þnh di truyÒn. TiÕp ®Õn lµ ®Ønh m« ph©n sinh víi kÝch thíc nhá, kÕt hîp víi xö lý nhiÖt ®Ó lµm s¹ch bÖnh lµ vËt liÖu tèt ®Ó nh©n. C¸c chåi nh©n ban ®Çu thêng ®îc lÊy tõ ®Ønh chåi hoÆc ®Ønh m« ph©n sinh trªn m«i trêng th¹ch chøa c¸c muèi kho¸ng, ®êng, vitamin vµ c¸c chÊt ®iÒu hoµ sinh trëng. Vi nh©n gièng ®îc b¾t ®Çu bÇu b»ng t¸ch ®Ønh chåi hoÆc m« ph©n sinh tõ c¸c c©y ®Þnh nh©n, sau ®ã khö trïng vµ ®a vµo nu«i cÊy ë m«i trêng phï hîp. C¸c chåi ®îc h×nh thµnh vµ ®îc t¸ch ra cÊy chuyÓn sang m«i trêng míi, quy tr×nh cø thÕ ®îc lÆp l¹i. §©y lµ ph¬ng ph¸p cho hÖ sè nh©n thÊp h¬n ph¬ng ph¸p nh©n qua giai ®o¹n m« sÑo hoÆc ph«i, nhng c¸c chåi ®îc h×nh thµnh gi÷ ®îc ®Æc ®iÓm cña c©y mÑ, Ýt hoÆc kh«ng bÞ thay ®æi vÒ mÆt di truyÒn. Trong mét sè trêng hîp, vi nh©n gièng cã thÓ thùc hiÖn th«ng qua viÖc t¹o ph«i hoÆc t¸i sinh c©y trùc tiÕp tõ m« sÑo. Ph¬ng ph¸p nµy cho hÖ sè nh©n cao h¬n nhng thêng kÐo theo sù biÕn dÞ soma [19]. ¦u ®iÓm cña nu«i cÊy in vitro lµ: cho hÖ sè nh©n cao sÏ rót ng¾n thêi gian ®a gièng vµo s¶n xuÊt; nh©n ®îc mét sè lîng c©y lín trong mét diÖn tÝch nhá; thuËn tiÖn vµ lµm h¹ gi¸ thµnh vËn chuyÓn, viÖc b¶o qu¶n c©y gièng thuËn lîi. C©y nu«i cÊy m« thêng ®îc trÎ ho¸ cao ®é vµ cã rÔ gièng nh c©y mäc tõ h¹t, thËm chÝ kh«ng cã sù kh¸c biÖt ®¸ng kÓ so víi c©y mäc tõ h¹t. Trong lóc c©y hom l¹i
-6- thêng kh«ng cã rÔ cäc, rÔ c©y kh«ng thÓ ®©m s©u xuèng ®Êt nh c©y mäc tõ h¹t vµ thêng cã hiÖn tîng b¶o lu côc bé. VÝ dô, c©y m« Keo lai ë giai ®o¹n 1-2 th¸ng tuæi (còng nh c¸c loµi c©y bè mÑ lµ Keo tai tîng vµ Keo l¸ trµm) cã ®ñ c¸c lo¹i l¸ kÐp mét lÇn, kÐp hai lÇn vµ l¸ gi¶, l¹i cã rÔ theo kiÓu rÔ cäc nh nh÷ng c©y mäc tõ h¹t ®iÓn h×nh, th× c©y hom còng cña gièng nµy l¹i chØ cã l¸ gi¶ cña c©y trëng thµnh vµ kh«ng cã rÔ cäc (nghÜa lµ tÝnh trÎ ho¸ bÞ h¹n chÕ , cßn tÝnh b¶o lu côc bé th× biÓu hiÖn râ rÖt). V× thÕ nu«i cÊy m« cßn lµ mét biÖn ph¸p trÎ ho¸ gièng trong s¶n xuÊt l©m nghiÖp [13]. Kh¸c víi c©y n«ng nghiÖp ng¾n ngµy, c©y rõng cã ®êi sèng dµi ngµy vµ ph¶i mÊt nhiÒu n¨m míi ra hoa kÕt qu¶. Sau khi chän ®îc c©y tréi, muèn cã gièng tèt ®Ó ®a vµo s¶n xuÊt, ph¶i x©y dùng vên gièng vµ rõng gièng vµ ph¶i ®îi thªm mét sè n¨m míi cã thÓ thu ®îc mét lîng h¹t ®ñ lín phôc vô trång rõng, tuy nhiªn c©y gièng tõ nh÷ng h¹t nµy sÏ bÞ ph©n ho¸ dÉn ®Õn n¨ng suÊt rõng biÕn ®éng. Nh©n gièng b»ng ph¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro lµ mét trong nh÷ng biÖn ph¸p h÷u hiÖu ®Ó duy tr× nh÷ng ®Æc tÝnh tèt nhÊt cña c©y mÑ cho c¸c thÕ hÖ c©y sinh dìng tiÕp theo. Do vËy nu«i cÊy in vitro ®· ®îc ¸p dông réng r·i cho mét sè loµi c©y rõng nh b¹ch ®µn [14]. HiÖn nay nu«i cÊy in vitro ®· vµ ®ang ®îc øng dông réng r·i trong s¶n xuÊt th¬ng m¹i ë nhiÒu níc trªn thÕ giíi, hµng tr¨m loµi c©y l¸ réng vµ hµng chôc loµi c©y l¸ kim ®· ®îc nu«i cÊy m« thµnh c«ng. Cho tíi n¨m 1991, Th¸i Lan ®· nh©n gièng thµnh c«ng b»ng nu«i cÊy m« cho 55 loµi trong tæng sè 67 loµi tre tróc thö nghiÖm. C«ng nghÖ nµy cho phÐp nh©n nhanh loµi Dendrocalamus asper víi c«ng suÊt 1 triÖu c©y mçi n¨m. Víi loµi Dendrocalamus asper, trong n¨m 1980 hä chØ cã trong tay vµi tr¨m h¹t gièng vµ ®· nhanh chãng cã trªn 100 000 c©y con ®îc ®a ra huÊn luyÖn t¹i vên ¬m, ®Õn n¨m 1992 môc tiªu cña hä lµ s¶n xuÊt vµi triÖu c©y con phôc vô trång rõng [14]. Sè c¸c loµi b¹ch ®µn ®· ®îc nh©n gièng b»ng ph¬ng ph¸p in vitro ngµy mét t¨ng, tíi n¨m 1987 ®· cã trªn 20 loµi b¹ch ®µn kh¸c nhau t¹o ®îc c©y con in
-7- vitro (Gupta vµ Mascarenhas, 1987). C¸c nhµ khoa häc Ên §é ®· t¹o thµnh c«ng c©y m« tõ c¸c c©y tr«i b¹ch ®µn Eucalyptus camandulensis, Eucalyptus globulus, Eucalyptus tereticornis, Eucalyptus torelliana vµ c¶ tõ c¸c c©y tréi cã hµm lîng tinh dÇu cao cña b¹ch ®µn chanh Eucalyptus citriodora. C©y m« cã nguån gèc tõ c©y u viÖt sinh trëng nhanh gÊp 3 lÇn vµ ®ång ®Òu h¬n lµ c©y mäc tõ h¹t cña cïng c©y mÑ. T¹i óc, nh©n gièng b»ng nu«i cÊy in vitro ®· ®îc ¸p dông ®Ó nh©n nhanh c¸c c©y ®îc chän cho tÝnh chÞu mÆn trong ®Êt vµ ®ang ®îc ®a vµo s¶n xuÊt lín cho loµi E. camaldulensis. Vµo n¨m 1987, kho¶ng 20 000 c©y m« cña c¸c dßng v« tÝnh chÞu mÆn ®· ®îc t¹o ra ®Ó trång l¹i rõng ë c¸c má bauxite gÇn Perth, T©y óc [14]. Trung Quèc ®· t¹o c©y in vitro thµnh c«ng cho 100 loµi c©y th©n gç nh d¬ng, b¹ch ®µn, bao ®ång, tÕch … Lµ níc øng dông sím vµ thµnh c«ng nu«i cÊy m« vµo trång rõng diÖn réng, c©y ®îc nh©n gièng thµnh c«ng chÝnh lµ E. urophylla. §Õn n¨m 1991 ë vïng Nam Trung Quèc, ngêi ta ®· t¹o ra trªn 1 triÖu c©y m« cña c¸c c©y vµ dßng lai ®îc chän läc. Nh÷ng c©y m« nµy ®îc dïng nh lµ c¸c c©y ®Çu dßng ®Ó t¹o c©y hom t¹i c¸c vên ¬m ®Þa ph¬ng vµ dïng th¼ng vµo trång rõng [15]. NhiÒu loµi c©y l¸ réng ch©u ¢u ®· ®îc thö nghiÖm nh©n gièng thµnh c«ng b»ng c¸c biÖn ph¸p nu«i cÊy m«, ®ã lµ c¸c loµi nh: Acer, Beluta, Carpinus, Fagus, Quercus, Ulmus, Fraxinus, Prunus, Juglans, Castanea, Tilia, Sorbus … C¸c c©y m« ®· ®îc trång ra thùc ®Þa ®Ó so s¸nh vµ ®· cho thÊy chóng cã phenotip gièng nhau, tû lÖ sèng ë rõng trång sau khi c©y ®îc huÊn luyÖn lµ kh¸ cao, ®¹t 90 -100% cho c¸c loµi Beluta, Quercus, Sorbus vµ Salix [15]. HiÖn nay nu«i cÊy in vitro còng lµ mét biÖn ph¸p nh©n gièng ®îc ¸p dông nhiÒu ë c¸c loµi c©y l¸ kim nh»m phôc vô cho c¸c ch¬ng tr×nh trång rõng dßng v« tÝnh. §èi víi c¸c loµi th«ng P. nigra, P. pinaster, P. sylvestris gi©m hom tõ c©y giµ lµ rÊt khã cho nªn ngêi ta ®ang ¸p dông c¸c biÖn ph¸p nu«i cÊy m« nh nu«i cÊy ph«i, nu«i cÊy t¹o m« sÑo … vµ c¸c biÖn ph¸p nµy cã nhiÒu triÓn väng, nhÊt lµ ®èi
-8- víi th«ng P. pinaster. Nh©n chåi in vitro tõ c©y non loµi V©n sam (Picea sitchensis) cho hÖ sè nh©n biÕn ®éng rÊt lín tuú theo c©y mÑ, cô thÓ lµ 17 – 5000 chåi mçi n¨m. Cã tíi 30 loµi trong sè c¸c loµi c©y l¸ kim ®îc nghiªn cøu nu«i cÊy m« vµ ®· ®¹t ®îc nh÷ng thµnh c«ng bíc ®Çu, trong ®ã ph¶i kÓ ®Õn c¸c loµi nh Abies balsamea (t¹o ®îc chåi ë c©y 15 – 20 tuæi), c¸c loµi B¸ch t¸n Araucaria, LiÔu sam Cryptomeria japonica, Larix sp., Picea glauca, ThiÕt sam Pseudotsuga menziesii, Cï tïng Sequoia sempervirens, Sequoiadendron gigenteum, Thuja sp., Tsuga heterophylla …[15]. Nu«i cÊy m« cã thÓ lµ biÖn ph¸p tèt ®Ó trÎ ho¸ vµ t¨ng hÖ sè nh©n, nhÊt lµ biÖn ph¸p t¹o ph«i v« tÝnh. Ngêi ta ®· nghiªn cøu t¹o nu«i cÊy ph«i v« tÝnh cho c©y ThiÕt sam (Pseudotsuga menziesii), mÆc dï cha t¹o ra ®îc c©y hoµn chØnh tõ c¸c ph«i v« tÝnh cña c©y nµy nhng chåi bÊt ®Þnh ®· ®îc t¹o ra tõ ®Ønh th©n c©y mÑ 64 tuæi. B»ng ph¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro, c¸c loµi B¸ch t¸n cho hÖ sè nh©n thÊp, chØ t¹o ®îc 20 – 60 chåi míi tõ mét c©y con trong vßng 4 th¸ng ®èi víi loµi A. cunninghamii vµ míi chØ cã c¸c chåi cña loµi c©y nµy ra rÔ in vitro [15] Trong sè 30 loµi c©y l¸ kim ®· ®îc nu«i cÊy m«, cã bèn loµi ®îc ®a vµo s¶n xuÊt diÖn réng, ®ã lµ Cï tïng Sequoia sempevirens ë AFOCEL (Ph¸p); th«ng P. radiate ë ViÖn nghiªn cøu l©m nghiÖp New Dil©n; P. taeda vµ Pseudotsuga menziesii ë Mü . C¸c biÖn ph¸p nu«i cÊy m« còng ®· ®îc ¸p dông cho c©y TÕch, Gupta vµ c¸c céng sù (1979) ®· m« t¶ sù h×nh thµnh côm chåi tõ phÇn c¾t cña c©y non vµ tõ mÇm c©y 100 tuæi. Tõ ®ã hä cã thÓ t¹o ®îc 500 c©y in vitro tõ mét chåi ë c©y trëng thµnh vµ 3000 c©y tõ mét c©y non trong mét n¨m. Kaosa-ard (1990) cho biÕt Th¸i Lan còng ®· ph¸t triÓn thµnh c«ng kü thuËt nu«i cÊy m« (nu«i cÊy ®Ønh th©n vµ ph«i) vµo n¨m 1986 cho c©y TÕch vµ cho phÐp t¹o 500 000 chåi tõ mét chåi trong mét n¨m. Perhutani (1991) còng cho biÕt Indonexia ®· thö nghiÖm nu«i cÊy m« thµnh c«ng vµ mét vµi c©y m« ®· ®îc ®em trång thö [15].
-9- Ngêi ta còng ®· nh©n gièng thµnh c«ng Phi lao b»ng c¸c biÖn ph¸p nu«i cÊy m« vµ ®· trång so s¸nh víi c©y h¹t trong nhµ kÝnh. Kü thuËt nµy ®ang ®îc dïng ®Ó t¹o c©y m« Phi lao sinh trëng nhanh, kh¸ng bÖnh vµ cè ®Þnh ®¹m cao cho trång rõng [15]. 1.2. Th«ng caribª, vÞ trÝ trong s¶n xuÊt l©m nghiÖp vµ triÓn väng trång rõng ë ViÖt Nam Th«ng caribª (Pinus caribaea Morelet) ®îc g©y trång ë níc ta tõ nh÷ng n¨m 1963, nh÷ng th«ng b¸o ®Çu tiªn cho thÊy Th«ng caribª lµ loµi sinh truáng nhanh th©n th¼ng ®Ñp, cµnh nh¸nh nhá h¬n Th«ng ba l¸ vµ Th«ng ®u«i ngùa nªn ®îc nhiÒu ®Þa ph¬ng a thÝch g©y trång. Tuy nhiªn cha ®îc ®¸nh gi¸ ®Çy ®ñ, v× vËy cã nhiÒu ý kiÕn kh¸c nhau trong viÖc sö dông loµi th«ng nµy [9], [12]. Th«ng caribª gåm 3 biÕn chñng lµ: Pinus caribaea var caribaea, Pinus caribaea var hondurensis vµ Pinus caribaea var bahamensis ®Òu cã ph©n bè tù nhiªn ë vïng Trung Mü. Trong ®ã biÕn chñng caribaea cã ph©n bè tõ 16o – 20o ®é vÜ B¾c, ph©n bè tù nhiªn ë Cuba vµ ®¶o Juventus thuéc vïng biÓn Caribª, chñ yÕu tËp trung ë nh÷ng vïng thÊp, ®åi b¸t óp, thêng ë ®é cao 330 m so víi mÆt níc biÓn. Ngoµi ra biÕn chñng caribaea cßn xuÊt hiÖn ë ®é cao xÊp xØ 760 m, Ýt cã trêng hîp ph©n bè ë ®é cao trªn 1200 m (Poyton, 1997) [4]. BiÕn chñng bahamensis ph©n bè tù nhiªn tõ 22o – 27o ®é vÜ B¾c, thuéc vïng ®¶o Bahamas vµ Caicos, ngoµi ra cßn t×m thÊy ë b¸n ®¶o Yucutan thuéc vïng §«ng B¾c Mü. BiÕn chñng hondurensis ph©n bè tù nhiªn tõ 12o – 16o ®é vÜ B¾c, tËp trung chñ yÕu ë ®¶o Belize, Guatelama, Poptun, Guanaja, Nicazagua. Sinh trëng chñ yÕu trªn c¸c khu vùc ®ång cá, ®ång b»ng ven biÓn cã ®é cao so víi mÆt níc biÓn lµ 460 – 760 m, nhng ph©n bè tËp trung nhiÒu nhÊt ë ®é cao 460 m (Perry JP Jr, 1991) [4]. Gç Th«ng caribª cã thí th¼ng mÞn, ®é bãng võa ph¶i, thêng ®îc sö dông lµm v¸n Ðp, th©n Th«ng caribª th¼ng, dÔ ca xÎ nhng phô thuéc nhiÒu vµo ®é tuæi
- 10 - (Bredenkamp vµ Van Vuuren, 1987) [25]. Ngoµi ra Th«ng caribª cßn cã nhiÒu c«ng dông kh¸c nh: gç x©y dùng, gç trô má, v¸n d¨m, v¸n Ðp, bét giÊy, gç ®ãng tµu thuyÒn, v¸n èp têng, gç ®ãng congten¬, v¸n èp trÇn, gç ®ãng ®å hép, gç cét ®iÖn, gç cét nhµ, gç néi thÊt, than cñi… Víi tèc ®é sinh trëng nhanh vµ kh¶ n¨ng thÝch øng réng víi c¸c vïng sinh th¸i kh¸c nhau trªn thÕ giíi, ®¸p øng ®îc nhiÒu môc tiªu kinh tÕ nªn Th«ng caribª ®· ®îc dÉn nhËp g©y trång ë 65 níc trªn thÕ giíi, chñ yÕu lµ c¸c níc thuéc vïng NhiÖt ®íi vµ ¸ nhiÖt ®íi. Giíi h¹n vÜ ®é trång më réng nhiÒu so víi n¬i nguyªn s¶n, tõ vÜ ®é 55o Nam ë Argentina tíi 33o vÜ ®é B¾c ë Ên §é D¬ng, giíi h¹n kinh ®é còng ®îc më réng tõ 180o kinh ®«ng ë Fiji tíi 158o kinh ®é t©y ë Hawaii. §é cao vïng trång biÕn ®éng tõ mÆt níc biÓn tíi 1200 m ë Zaire, 1220 m ë Nigeria, trªn 1820 m ë Uganda vµ 2400 m ë Kenya (Anoruo vµ Berlyn, 1993) [5] Nh vËy, Th«ng caribª ®· ®îc g©y trång ë tÊt c¶ c¸c d¹ng khÝ hËu cña c¸c níc nhiÖt ®íi vµ cËn nhiÖt ®íi. Vïng ph©n bè rõng trång cña loµi ®îc më réng c¶ vÒ vÜ ®é vµ kinh ®é, c¶ vïng cã khÝ hËu miÒn nói tíi khÝ hËu cËn nhiÖt ®íi vµ vïng ven biÓn (Anoruo vµ Berlyn, 1993) [5]. Nh×n chung th«ng Caribª cã thÓ sinh trëng tèt trªn nhiÒu lo¹i ®Êt kh¸c nhau khi ®îc trång ngoµi ph¹m vi ph©n bè tù nhiªn cña chóng. ViÖt Nam lµ mét níc n»m trong khu vùc nhiÖt ®íi cña Ch©u ¸, cã c¸c ®iÒu kiÖn ®Þa lý kh¸ t¬ng ®ång víi sù ph©n bè tù nhiªn cña Th«ng caribª, nªn ®· ®îc ®a vµo trång ë níc ta tõ nhiÒu n¨m nay. Ngµy nay Th«ng caribª ®· ®îc x¸c ®Þnh lµ mét trong c¸c loµi c©y trång rõng trong ch¬ng tr×nh 5 triÖu hecta rõng. C¸c kÕt qu¶ kh¶o nghiÖm bíc ®Çu ë ViÖt Nam cho thÊy th«ng lµ loµi c©y cã nhiÒu triÓn väng, ®Æc biÖt lµ biÕn chñng Pinus caribaea var hondurensis. KÕt qu¶ kh¶o nghiÖm Th«ng caribª t¹i §µ L¹t n¨m 1963 bíc ®Çu cho thÊy biÕn chñng hondurensis cña Th«ng caribª cã sinh trëng nhanh, h×nh d¸ng th©n ®Ñp, cao, thon ®Òu, t¸n l¸ nhá, cµnh mäc ngang, cã tèc ®é sinh trëng nhanh h¬n Th«ng ba l¸. ë tuæi 12, c©y cao b×nh qu©n 14.3 m vµ ®êng kÝnh ngang ngùc b×nh
- 11 - qu©n ®¹t 16.3 cm, t¨ng trëng b×nh qu©n vÒ chiÒu cao lµ 1.19 m/n¨m vµ ®êng kÝnh lµ 1.35 cm/n¨m. ë tuæi 16, c©y cao trung b×nh 19.9 m, ®êng kÝnh ngang ngùc trung b×nh lµ 26.4 cm, t¨ng trëng chiÒu cao b×nh qu©n lµ 1.24 m/n¨m vµ ®êng kÝnh lµ 1.65 cm/n¨m [12]. Kh¶o nghiÖm t¹i Mang Linh cho thÊy biÕn chñng hondurensis trång trªn ®Êt feralit vµng ®á ph¸t triÓn trªn ®¸ mÑ granit cã tÇng ®Êt s©u, Èm vµ líp mïn kh¸ dµy cã sinh trëng nhanh h¬n Th«ng ba l¸ §µ L¹t. Sau 16 n¨m trång, c©y cã chiÒu cao b×nh qu©n lµ 17 m vµ ®êng kÝnh lµ 26.6 cm, t¨ng trëng b×nh qu©n hµng n¨m vÒ chiÒu cao lµ 1.21 – 1.22 m/n¨m vµ ®êng kÝnh lµ 1.76 – 1.80 cm/n¨m [12]. Giai ®o¹n 1978 – 1982, mét kh¶o nghiÖm xuÊt xø kh¸ ®Çy ®ñ theo dù ¸n SIDA t¹i Phó Thä (P. Stahl, 1984) [40]. VËt liÖu nghiªn cøu gåm bèn loµi Th«ng: Th«ng nhùa (P. merkusii) víi 5 xuÊt xø, Th«ng ba l¸ (P. kesiya) víi 6 xuÊt xø, Th«ng oocarpa (P. oocarpa) víi 1 xuÊt xø, Th«ng caribª (P. caribaea) gåm 3 biÕn chñng, trong ®ã biÕn chñng caribaea (1 xuÊt xø), biÕn chñng bahamensis (1 xuÊt xø) vµ biÕn chñng hondurensis (4 xuÊt xø). Kh¶o nghiÖm ®îc x©y dùng trªn 4 ®Þa ®iÓm lµ Th¸i Long, S¬n Nam (Tuyªn Quang), §Òn Hïng vµ Yªn KiÖn (VÜnh Phó cò). Trong 4 loµi th«ng ®a vµo kh¶o nghiÖm (ë giai ®o¹n 6 – 8 tuæi) th× Th«ng caribª lµ loµi cã sinh trëng nhanh nhÊt, trong c¸c biÕn chñng Th«ng caribª ®îc kh¶o nghiÖm th× biÕn chñng hondurensis cã sinh trëng nhanh nhÊt, tiÕp ®Õn lµ biÕn chñng bahamensis vµ cuèi cïng lµ biÕn chñng caribaea [16], [30], [41]. KÕt qu¶ kh¶o nghiÖm ë tuæi 8 cho thÊy nh÷ng xuÊt xø cã sinh trëng tèt cña 2 biÕn chñng hondurensis vµ bahamensis lµ xuÊt xø Potun (Guatemala), Guanaja (Honduras), Cardwell (Queensland, Australia), Almicamba (Nicaragua) vµ Andros (Bahamas). T¸c gi¶ ®· ®i ®Õn kÕt luËn: ë khu vùc nµy nÕu trång rõng quy m« lín chØ tËp trung vµo c¸c xuÊt xø tèt cña hai biÕn chñng hondurensis vµ bahamensis [41]. KÕt qu¶ nghiªn cøu vµ ®¸nh gi¸ c¸c kh¶o nghiÖm loµi vµ xuÊt xø Th«ng caribª sau 9 n¨m trång kh¶o nghiÖm ë §¹i L¶i (VÜnh Phóc), §«ng Hµ (Qu¶ng TrÞ),
- 12 - S«ng M©y (§ång Nai), … cho thÊy Th«ng caribª lµ loµi c©y cã triÓn väng vÒ sinh trëng nhanh, trong ®ã biÕn chñng P. caribaea var hondurensis ®îc ®¸nh gi¸ lµ biÕn chñng cã sinh trëng nhanh h¬n hai biÕn chñng cßn l¹i, trong biÕn chñng hondurensis cã xuÊt xø Poptun, Alamicamba, Guanaja vµ Cardwell lµ nh÷ng xuÊt xø cã triÓn väng nhÊt vµ phï hîp víi mét sè vïng trång ë níc ta [3]. §¸nh gi¸ nh÷ng kÕt qu¶ kh¶o nghiÖm ®îc x©y dùng gÇn ®©y Lª §×nh Kh¶ còng cho thÊy P. caribaea var hondurensis lµ mét trong nh÷ng biÕn chñng triÓn väng h¬n hai biÕn chñng cßn l¹i [9], [10], [29]. §¸nh gi¸ míi nhÊt cña Phan Thanh H¬ng (2000) khi nghiªn cøu ®Æc ®iÓm sinh trëng cña mét sè xuÊt xø Th«ng caribª ®îc kh¶o nghiÖm trªn mét sè trªn mét sè vïng sinh th¸i ë ViÖt Nam cho thÊy trong ba biÕn chñng Th«ng caribª ®îc ®a vµo kh¶o nghiÖm, biÕn chñng hondurensis cã sinh trëng tèt nhÊt t¹i 5 ®Þa ®iÓm: §¹i L¶i (VÜnh Phóc), §«ng Hµ (Qu¶ng TrÞ), Pleiku (Gia Lai), Lang Hanh (L©m §ång) vµ S«ng M©y (§ång Nai); biÕn chñng Bahamensis sinh trëng tèt nhÊt ë Xu©n Khanh, CÈm Quú (Hµ T©y); biÕn chñng caribeaea sinh trëng kÐm nhÊt trªn tÊt c¶ c¸c lËp ®Þa [4]. 1.3. Nh÷ng nghiªn cøu vÒ nh©n gièng th«ng b»ng ph¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro trªn thÕ giíi 1.3.1. C¸c nghiªn cøu vÒ vËt liÖu nu«i cÊy in vitro vµ kh¶ n¨ng h×nh thµnh chåi tõ mÉu nu«i cÊy Nh÷ng nghiªn cøu nu«i cÊy m« cho loµi th«ng ®· ®îc tiÕn hµnh b»ng viÖc sö dông mÊu nu«i cÊy ban ®Çu tõ c©y con, v× loaÞ vËt liÖu nµy thuËn lîi cho viÖc khö trïng mÉu cÊy. Theo B. Macdonald khi lÊy mÉu cÊy ®èi víi c©y th©n gç nªn lÊy vµo s¸ng sím vµ kÝch thíc mÉu cÊy nªn dµi tõ 2 – 3 cm [17]. Murashige nhËn thÊy ®èi víi c¸c c©y th©n gç, mÉu cÊy lÊy tõ c©y non t¸i sinh tèt h¬n mÉu lÊy tõ c©y mÑ trëng thµnh [34]. Sù h×nh thµnh c¸c chåi bÊt ®Þnh tõ ph«i trëng thµnh ®· ®îc tiÕn hµnh cho loµi Th«ng P. radiate, P. loblolly v× kh¶ n¨ng cho hÖ sè nh©n cao, c¸c thö nghiÖm
- 13 - trång rõng tõ nh÷ng c©y m« (plantlet) ®· ®îc thiÕt lËp (Smith, 1985; Amerson vµ céng sù, 1985) [38]. Dïng c¸c mÉu cÊy kh¸c nhau th× sù h×nh thµnh chåi sÏ khã dÔ kh¸c nhau. PhÇn lín c¸c c«ng tr×nh trong nh©n gièng c©y l¸ kim ®· xuÊt b¶n ®Òu m« t¶ vËt liÖu nu«i cÊy ban ®Çu lµ nh÷ng c¬ quan cña c©y non v« trïng víi ph¬ng thøc t¸i sinh t¹o chåi vµ c©y con. Chåi cã thÓ ®îc kÝch thÝch vµ h×nh thµnh trùc tiÕp trªn ph«i h÷u tÝnh cña c©y l¸ kim vµ trªn nh÷ng c¬ quan cña c©y non ®Æc biÖt lµ l¸ mÇm vµ chåi ®Ønh, trong ®ã l¸ mÇm cña c©y non tõ lµ vËt liÖu ®îc sö dông réng r·i nhÊt [26]. Nh÷ng lo¹i mÉu cÊy nµy thuËn tiÖn cho viÖc khö trïng mÉu (lÊy tõ h¹t) vµ còng thuËn lîi cho ph«i v« tÝnh vµ l¸ mÇm ph©n ho¸ t¹o chåi bÊt ®Þnh. Trong hÇu hÕt c¸c nghiªn cøu, l¸ mÇm c©y non ®îc t¸ch ra ®Ó nu«i cÊy cho sè chåi bÊt ®Þnh nhiÒu h¬n ph«i nguyªn vÑn, trô díi l¸ mÇm hoÆc c¸c m« kh¸c cña c©y non vµ trë thµnh mÉu cÊy ®îc sö dông réng r·i. Kh¶ n¨ng t¸i sinh chåi cña l¸ mÇm phô thuéc ®éc lËp víi tuæi cña chóng, l¸ mÇm tõ c©y mÇm P. radiate 1 ngµy tuæi ë tr¹ng th¸i sinh lý tèt nhÊt cho sù t¹o chåi (Aitken – Christie vµ c¸c céng sù, 1982), trong khi chåi in vitro cña c©y Linh sam ( Douglas) ®îc t¸i sinh tõ l¸ mÇm cã tuæi tèi u tõ 2 – 4 tuÇn (Wochok vµ Abo El-Nil, 1977) [26]. Mét nghiªn cøu kh¸c ®îc thùc hiÖn bëi Cheng (1977) kh«ng t×m thÊy sù ¶nh hëng cña tuæi (2 tuÇn hoÆc 2 th¸ng tuæi) ®Õn sè chåi ®îc t¹o ra tõ l¸ mÇm c©y Linh sam (Douglas) non. Sè chåi ®îc h×nh thµnh tõ ph«i hoÆc mÉu cÊy tõ c©y non cã thÓ bÞ ¶nh hëng lín bëi c¸c thñ tôc xö lý tríc khi t¹o chåi. Sù t¸i sinh chåi in vitro sÏ thuËn lîi nÕu h¹t th«ng ®îc xö lý l¹nh (Smeltzer vµ céng sù, 1977; Relly vµ Washer, 1977) [26] hoÆc ®îc xö lý b»ng H2O2 ®Ó ph¸ vì tr¹ng th¸i ngñ tríc khi ph«i ®îc t¸ch ra vµ nu«i cÊy (Mehra-Palta vµ céng sù, 1977) [31]; (Mott vµ Amerson, 1981) [32]. So s¸nh c¸c kÕt qu¶ tõ h¹t ®îc xö lý vµ kh«ng xö lý, mét tû lÖ lín l¸ mÇm cña P. taeda vµ P. monticola ®· h×nh thµnh chåi vµ cã mét sè lín chåi trªn mét c©y so víi h¹t kh«ng ®îc xö lý [26].
- 14 - Tuy nhiªn nh÷ng mÉu cÊy trªn chØ nªn giíi h¹n trong viÖc nghiªn cøu qu¸ tr×nh ph¸t sinh h×nh th¸i v× khã ®¶m b¶o r»ng c¸c ®Æc tÝnh di truyÒn cña chóng cã ®îc b¶o vÖ hay kh«ng vµ cã phï hîp môc tiªu kh«ng, nªn kh«ng thÓ dïng cho s¶n xuÊt. NÕu môc ®Ých lµ nghiªn cøu, mÉu cÊy ®Òu cã thÓ lÊy tõ ph«i cña h¹t non, h¹t giµ. Nu«i cÊy m«, c¬ quan cña c©y trëng thµnh sÏ khã kh¨n h¬n v× khã t¹o ®îc mÉu cÊy, cã thÓ kh«ng cho ra ®îc chåi bÊt ®Þnh hay chåi n¸ch, ®«i khi khã ra rÔ vµ thêng t¹o ra nh÷ng c©y cã tÝnh híng nghiªng. 1.3.2. C¸c nghiªn cøu vÒ m«i trêng nu«i cÊy trong nh©n gièng th«ng in vitro Trªn thÕ giíi nh©n gièng c¸c loµi c©y l¸ kim b»ng ph¬ng ph¸p nu«i cÊy m« ®· ®îc thùc hiÖn vµ c«ng bè bëi nhiÒu t¸c gi¶ (Aitken – Christie vµ Thorpe, 1984; Berlyn vµ c¸c céng sù, 1986) [38]. Trong nu«i cÊy in vitro, chåi cã thÓ ®îc t¸i sinh trùc tiÕp tõ callus trªn mÉu cÊy cßn non cña c©y l¸ kim nhng nh vËy thêng hay cã nh÷ng rñi ro vÒ biÕn ®éng kiÓu gen, ®Æc biÖt lµ nu«i cÊy nh÷ng callus kh«ng cã tæ chøc (Aitken – Christie vµ c¸c céng sù, 1988) [38]. NÕu nh sù h×nh thµnh chåi tõ callus bÞ lo¹i trõ, kü thuËt nh©n gièng in vitro thÝch hîp cho c©y l¸ kim lµ: t¹o chåi trùc tiÕp; t¹o chåi tõ chåi n¸ch; nu«i cÊy ph«i v« tÝnh. MÉu cÊy sö dông cho nh÷ng kü thuËt nµy lµ ph«i h¹t non, c©y mÇm, chåi n¸ch ... MÉu cÊy tõ nh÷ng c©y trëng thµnh khã ®îc h×nh thµnh, cã thÓ kh«ng cho ra ®îc chåi bÊt ®Þnh hay chåi n¸ch, ®«i khi khã t¹o rÔ vµ kÕt qu¶ thêng t¹o ra nh÷ng c©y híng nghiªng (Aitken – Christie vµ céng sù, 1988) [38]. M«i trêng nu«i cÊy ®· ®îc dïng cho nu«i cÊy t¹o chåi in vitro c©y l¸ kim cã thÓ kÓ tíi lµ: SH (1972); WPM (1981); GD (1972); MCM (1983); SH (1972)…c¸c m«i trêng SH; GD; WPM; LPm … c¶i tiÕn vµ thÊy phÇn lín c¸c m«i trêng t¹o chåi tèt h¬n so víi m«i trêng MS (1962), chåi xuÊt hiÖn víi tÇn sè lín h¬n nhiÒu [26]. C¸c m«i trêng nu«i cÊy nãi trªn ®Òu chøa ®ñ c¸c nguyªn tè ®a lîng vµ vi lîng nhng sai kh¸c vÒ hµm lîng kh¸ lín.
- 15 - Thorpe vµ Harry (1991) ®· nghiªn cøu nu«i cÊy th«ng Pinus canariensis víi nguån vËt liÖu sö dông chñ yÕu tõ l¸ mÇm cña c©y con míi n¶y mÇm v« trïng, t¸c gi¶ sö dông hai lo¹i m«i trêng nu«i cÊy chÝnh lµ m«i trêng SH (1972); m«i trêng MCM (1983) cã bæ sung 5-10 M BAP. Nghiªn cøu ®· x¸c ®Þnh ®îc m«i trêng MCM víi nång ®é BAP tèi u trong giai ®o¹n t¸i sinh chåi lµ 10 M, x¸c ®Þnh ®îc tæ hîp phytohormon lµ BAP/2 iP (tû lÖ 1:1) lµ 5/5 M cho kÕt qu¶ t¸i sinh chåi tèt h¬n m«i trêng chØ cã BAP; x¸c ®Þnh ®îc gi¸ thÓ ra rÔ lµ hçn hîp v« trïng than bïn/vermiculate (tû lÖ 1:1) chøa 1/4 kho¸ng MCM, xö lý chåi ra rÔ b»ng IBA 1 M trong 4 giê. KÕt qu¶ ®· ®a c©y in vitro vµo gi¸ thÓ trong bÇu PVC ë ®iÒu kiÖn nhµ kÝnh [42]. Shakya, Joshee vµ Agrawal (1989) ®· thµnh c«ng trong nghiªn cøu nh©n gièng th«ng P. wallichiana b»ng kü thuËt nu«i cÊy ph«i cã ®Þnh híng. VËt liÖu nu«i cÊy lµ ph«i ®îc t¸ch ra tõ h¹t th«ng P. wallichiana (cßn gäi th«ng xanh hay th«ng Bhutan). Ph«i t¸ch ra ®îc nu«i cÊy trªn m«i trêng Aiken - Christie (LP- 1984) bæ sung BAP ë c¸c nång ®é tõ 0 - 88 M trong 10; 14; 21 ngµy. KÕt qu¶ ®¹t Ýt nhÊt 40 chåi/ph«i trong 1 chu kú cÊy chuyÓn 4 th¸ng [40]. N¨m 1995, Okamura M. vµ Kondo T. c«ng bè “Híng dÉn nu«i cÊy m« c©y th«ng” giíi thiÖu t¹o c©y con th«ng Pinus thunbergi trong èng nghiÖm tõ nu«i cÊy ph«i vµ l¸ mÇm. Trong híng dÉn nµy dïng m«i trêng GD (1972) vµ m«i trêng AE ®Ó nu«i cÊy giai ®o¹n nh©n chåi. Giai ®o¹n nu«i cÊy ban ®Çu bæ sung 5 - 10 M BAP vµ 3 % ®êng. Giai ®o¹n ra rÔ dïng m«i trêng Risser and White cã bæ sung 10 M IBA vµ ®· t¹o thµnh c«ng c©y con trong èng nghiÖm nhng kh«ng thÊy c«ng bè sè lîng vµ c¸c kÕt qu¶ thÝ nghiÖm [37]. Nu«i cÊy m« c©y l¸ kim cã nhiÒu khã kh¨n, ®Æc biÖt lµ ®èi víi c¸c lo¹i c©y nh th«ng. C¸c th«ng tin vÒ mÉu nu«i cÊy, m«i trêng dinh dìng kho¸ng vµ sö dông chÊt ®iÒu hoµ sinh trëng cho c¸c loµi c©y l¸ kim nãi chung vµ loµi th«ng nãi riªng ®îc kª trong biÓu 1.1 [26]: BiÓu 1.1: Th«ng tin vÒ nu«i cÊy in vitro c¸c loµi c©y l¸ kim
- 16 - M«i M«i Loµi c©y MÉu nu«i M«i trêng trêng trêng cÊy kÝch thÝch h×nh kÐo dµi Nguån tham kh¶o nh©n chåi thµnh chåi chåi Piece abies Ph«i h¹t giµ 1/2SH-1972 + 1/2SH-1972 Von Arnold vµ Eriksson 1.1 mg/lBAP (1987) Von Arnold (1987) Piece glauca Trô díi l¸ LPm-1981 + 2.2 LPm-1981 Ellis vµ c¸c céng sù mÇm mg/lBAP (1991) Piece glauca Trô díi l¸ CD-1975 +2.25 CD-1975 Campbell vµ Durzan mÇm mg/lBAP (1975) Piece Chåi vµ l¸ LPm-1981 + 1.0 LPm-1981 Budimir vµ Vujieie ormorika mÇm c©y mg/lBAP (1992) con Pinus briata Ph«i h¹t vµ SH mod.- 1981 SH mod.- 1981 Abdullah vµ c¸c céng sù l¸ mÇm + 3.0 mg/lBAP (1981) Pinus Ph«i h¹t MCM-1983 + 1/2David 1/2David Martinez Pulido vµ c¸c canariensis míi n¶y 2.2 mg/lBAP 1982a + céng sù (1991-1992) mÇm 0.05%AC Pinus caribeae Ph«i h¹t Cheng- Cheng-1977;1978 Halos vµ Go (1993); Go 1977;1978 + 2 vµ c¸c céng sù (1993) mg/lBAP Pinus contorta l¸ mÇm vµ 1/2LPm-1981 + 1/2LPm- 1/4LPm- Patel vµ Thorpe (1984) trô díi l¸ 2.25 mg/lBAP 1981 1981; mÇm c©y 1/8LPm- non 1981 Pinus elliotii l¸ mÇm tõ GD-1975 + 10 GD-1975 1/2GD- Lesney vµ c¸c céng sù ph«i mg/lBAP + 0.01 1975 (1988) mg/lNAA Pinus l¸ mÇm tõ GD mod.-1981 SH-1972 SH- 1972 Lopez Petalta vµ c¸c céng virginiana h¹t ®· n¶y + 10 mg/lBAP + 4 sù (1991) mÇm mg/lBAP
- 17 - S¬ ®å nu«i cÊy in vitro c©y l¸ kim tõ c¸c mÉu cÊy cã thÓ tãm t¾t [26]: Sự phát sinh Callus phôi Phôi vô Cây con phôi Phôi hoá tính in vitro T¹o chåi L¸ mÇm Chåi bÊt trùc tiÕp C©y mÇm ®Þnh Trô díi l¸ Chåi sinh Cây con mÇm trëng vµ in vitro v¬n dµi T¹o chåi Chåi n¸ch trùc tiÕp - Chåi n¸ch - Bã l¸ kim Trªn c¬ së cã m«i trêng dinh dìng kho¸ng víi thµnh phÇn vµ hµm lîng t¬ng ®èi thÝch hîp th× ®iÒu quan träng nhÊt cßn l¹i lµ vÊn ®Ò sö dông chÊt ®iÒu hoµ sinh trëng (cßn gäi lµ phytohormone hay hormon). BiÓu 1.1 cho thÊy trong nu«i cÊy in vitro c©y th«ng, ®Ó kÝch thÝch h×nh thµnh chåi thêng ®ßi hái hµm lîng chÊt ®iÒu hoµ sinh trëng t¬ng ®èi thÊp. PhÇn lín c¸c m«i trêng h×nh thµnh vµ v¬n chåi kh«ng cÇn sö dông phytohormon. Tuy nhiªn nhiÒu t¸c gi¶ cho r»ng cho thªm mét sè chÊt ®iÒu hoµ sinh trëng víi liÒu lîng thÝch hîp lµ cÇn thiÕt. Cã nghiªn cøu ®· dïng BAP ®Õn nång ®é 2 – 10 mg/l. Qua qu¸ tr×nh nghiªn cøu thµnh c«ng víi h¬n 30 loµi c©y l¸ kim cña c¸c t¸c gi¶ trªn thÕ giíi, nhËn thÊy r»ng BAP 2 mg/l – 2.25 mg/l lµ rÊt thÝch hîp cho sù ph©n ho¸ t¹o chåi, kÝch thÝch ph©n ho¸ t¹o chåi tõ ph«i v« tÝnh b»ng BAP sÏ t¬ng ®èi cã hiÖu qu¶. Nh©n gièng b»ng ph¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro víi th«ng, mÆc dï c¸c loµi cã ®ßi hái gÇn gièng nhau ®èi víi m«i trêng nu«i cÊy nhng do mçi ®Æc ®iÓm
- 18 - riªng cña mçi loµi mµ vÉn cã thÓ yªu cÇu nh÷ng xö lý, ®iÒu chØnh c¸ biÖt kh¸c nhau. T¸c dông dÉn d¾t ph©n ho¸ t¹o chåi cña c¸c cytokinin kh¸c nhau kh«ng gièng nhau hoÆc còng cã thÓ gièng nhau, trong biÓu cã thÓ thÊy t¸c dông cña BAP râ h¬n Kinetin. Trong sù phèi hîp gi÷a cytokinin vµ auxin, thêng thÊy sö dông BAP phèi hîp víi NAA h¬n lµ víi IAA vµ IBA. Trong viÖc dÉn d¾t h×nh thµnh rÔ, c¸c nghiªn cøu cã nhËn xÐt kh¸ thèng nhÊt víi nhau vµ phÇn lín ®Òu chän dïng IBA, tuy nhiªn vÒ chän chÊt auxin nµo vµ vÒ liÒu lîng th× cßn cÇn ph¶i thö nghiÖm cho phï hîp víi mçi loµi. Trong c¸c m«i trêng nu«i cÊy bæ sung thªm cytokinin (thêng sö dông BAP), ®«i khi kÕt hîp víi mét auxin ë mét nång ®é nhÊt ®Þnh. Chåi th«ng sau ®ã ®îc ra rÔ trªn m«i trêng chøa IBA [26]. M«i trêng nu«i cÊy c¸c loµi th«ng thêng ®îc bæ sung thªm vitamin vµ c¸c acid amin…C¸c chÊt nµy ®Òu cã ¶nh hëng tèt ®èi víi sù ph©n ho¸ t¹o chåi vµ h×nh thµnh ph«i v« tÝnh. Nh÷ng chÊt nµy cã thÓ cã t¸c dông n©ng cao tû lÖ h×nh thµnh chåi, ®Èy nhanh tèc ®é ph¸t triÓn cña chåi. Trong nu«i cÊy in vitro thùc vËt nãi chung vµ th«ng nãi riªng m«i trêng nu«i cÊy cã hµm lîng ®êng kh¸c nhau sÏ cã hiÖu qu¶ kh¸c nhau. Nång dé thÊp ¶nh hëng ®Õn nguån cung cÊp Hidratcarbon sÏ kh«ng cã lîi cho sinh trëng cña chåi. Nång ®é qu¸ cao lµm ¶nh hëng ®Õn ¸p suÊt thÈm thÊu vµ sÏ kh«ng cã lîi cho qu¸ tr×nh hÊp thô vµ vËn chuyÓn c¸c chÊt. C¸c nghiªn cøu nu«i cÊy t¹o chåi c©y th«ng thêng chän dïng nång ®é 2-3 %, phÇn lín dïng ®êng sacaroza. 1.4. Nh÷ng nghiªn cøu vÒ nh©n gièng c©y th©n gç vµ c©y th«ng b»ng ph¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro ë ViÖt Nam Sau khi mét sè gièng B¹ch ®µn cã n¨ng suÊt cao ®îc nhËp, c¸c dßng v« tÝnh B¹ch ®µn vµ Keo lai cã n¨ng suÊt cao ra ®êi, nu«i cÊy m« vµ gi©m hom ®· trë thµnh mét phong trµo nh©n gièng ®îc ¸p dông r«ng r·i trong s¶n xuÊt l©m nghiÖp.
- 19 - Nh÷ng c¬ së hiÖn ®ang nh©n gièng b»ng nu«i cÊy m« ë quy m« lín trong l©m nghiÖp níc ta lµ ViÖn nghiªn cøu c©y nguyªn liªô giÊy Phï Ninh, Trung T©m khoa häc s¶n xuÊt l©m nghiÖp Qu¶ng Ninh, XÝ nghiÖp gièng thµnh phè Hå ChÝ Minh, Trêng §¹i häc L©m nghiÖp. Trong khi n¨ng suÊt rõng tù nhiªn cöa ta chØ ®¹t 2 - 6 m3/ha/n¨m, n¨ng suÊt rõng trång qu¶ng canh ®îc trång b»ng c©y h¹t còng chØ ®¹t 5 - 7 m3/ha/n¨m, th× n¨ng suÊt rõng trång cña mét sè gièng B¹ch ®µn míi chän t¹o hoÆc míi nhËp ®îc trång b»ng c©y m« vµ c©y hom cã thÓ ®¹t 15 m3/ha/n¨m, cßn n¨ng suÊt gièng Keo lai ®îc trång b»ng c©y m« vµ c©y hom ë mét sè n¬i còng cã thÓ ®¹t 20 -30 m3/ha/n¨m [13]. Cïng víi nh÷ng kÕt qu¶ vÒ c¶i thiÖn gièng Trung t©m nghiªn cøu gièng c©y rõng ®· nghiªn cøu thµnh c«ng kü thuËt nu«i cÊy m« cho Keo lai, B¹ch ®µn vµ mét sè gièng c©y rõng kh¸c [13]. Nghiªn cøu nu«i cÊy m« cho gièng lai gi÷a Bach ®µn liÔu vµ B¹ch ®µn tr¾ng ®· ®îc NguyÔn Ngäc T©n vµ céng sù (1977) thùc hiÖn thµnh c«ng tõ n¨m 1993 vµ thÊy r»ng khi dïng BAP bæ sung vµo m«i trêng c¬ b¶n MS cã thÓ t¹o ®îc 20 -30 chåi/côm. M«i trêng MS bæ sung IBA cã thÓ ®¹t tû lÖ ra rÔ 80% [11]. Nghiªn cøu nu«i cÊy m« cho gièng B¹ch ®µn lai U29C3 do §oµn ThÞ Mai vµ céng sù (2000) tiÕn hµnh vµ ®· thu ®îc c©y m« tõ tæ hîp lai nµy ®Ó kh¶o nghiÖm. KÕt qu¶ cho thÊy thêi kú mÉu bÞ nhiÔm Ýt nhÊt vµ cã tû lÖ bËt chåi cao nhÊt lµ tõ th¸ng N¨m ®Õn th¸ng T¸m. M«i trêng MS bæ sung 0,5 mg/l BAP cho sè chåi trung b×nh trong mçi côm cao nhÊt (16.6 chåi/côm). M«i trêng ra rÔ thÝch hîp lµ m«i trêng MS bæ sung 1,0 mg/l IBA, cho tû lÖ ra rÔ tíi 83,8% [11]. D¬ng Méng Hïng (1993) nghiªn cøu nh©n gièng b»ng nu«i cÊy m« cho hai loµi b¹ch ®µn Eucalyptus camaldulensis vµ Eucalyptus urophylla tõ c©y tréi cña 2 loµi. KÕt qu¶ ®· t¹o ®îc mét sè c©y m« b¹ch ®µn, tuy nhiªn tû lÖ mÉu nhiÔm nÊm bÖnh khi ®a mÉu vµo m«i trêng v« trïng cßn cao, hÖ sè nh©n chåi thÊp (1 – 2 lÇn) [7].
- 20 - Nu«i cÊy m« cho L¸t hoa (Chukrasia tabularis) ®· ®îc thùc hiÖn cho chåi lÊy tõ c©y 2 tuæi. Giai ®o¹n nh©n chåi dïng m«i trêng MS cã 1,0 – 1,5 mg/l BAP ®¹t 10 chåi/côm. Giai ®o¹n ra rÔ dïng m«i trêng MS bæ sung 0,1 mg/l IBA hoÆc 0,1 mg/l IBA phèi hîp víi 0,1 mg/l NAA cho tû lÖ ra rÔ ®Õn 87,5% [10]. Nu«i cÊy m«, tÕ bµo c©y th©n gç cã nhiÒu khã kh¨n, ®Æc biÖt lµ víi c¸c loµi c©y l¸ kim nh c©y th«ng. ë níc ta, kü thuËt nu«i cÊy m«, tÕ bµo cho c©y th©n gç míi ë thêi kú cña nh÷ng bíc ®i ban ®Çu vµ øng dông vµo s¶n xuÊt quy m« lín chñ yÕu cho loµi b¹ch ®µn vµ ®Õn nay c¸c c«ng tr×nh ®· ®îc c«ng bè cha nhiÒu. N¨m 2003, TrÇn Trung HiÕu, NguyÔn Xu©n Th¬ng vµ c¸c céng sù c«ng bè kÕt qu¶ bíc ®Çu nh©n nhanh gièng th«ng caribª (Pinus caribaea) b»ng ph¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro. KÕt qu¶ ®· t×m ra m«i trêng nh©n chåi, ra rÔ vµ t¹o ®îc c©y con cã kh¶ n¨ng ph¸t triÓn ngoµi vên ¬m [6]. C¸c t¸c gi¶ sö dông mÉu cÊy lµ ®o¹n chåi non ®Çu cµnh cña c©y 3-5 tuæi do Trung t©m s¶n xuÊt L©m nghiÖp §«ng Nam Bé Thèng NhÊt - §ång Nai (ViÖn Khoa häc L©m nghiÖp) cung cÊp. M«i trêng nu«i cÊy c¬ b¶n lµ m«i trêng SH (1973), Litvay (1981) vµ c¸c m«i trêng kho¸ng ®a lîng gi¶m ®i mét nöa lµ SH-1/2 vµ LV-1/2. §Ó t¹o côm chåi, t¨ng trëng chåi vµ ra rÔ, c¸c t¸c gi¶ ®· dïng chÊt ®iÒu hoµ sinh trëng lµ BAP, NAA, IBA. KÕt qu¶ sau 6 tuÇn nu«i cÊy, sè chåi thu ®îc cao nhÊt trªn m«i trêng SH7 (cã bæ sung 3 mg/l BAP; 0.5 mg/l IBA) lµ 6,17  1,13 chåi/mÉu; trªn m«i trêng SH16 (cã 0,1 mg/l BAP; 0,1 mg/l IBA) cho chiÒu cao chåi cao nhÊt lµ 3,41  0,51 cm; sau 9 tuÇn nu«i cÊy trªn m«i trêng t¹o rÔ SH -1/2, chåi t¹o 3 rÔ/chåi vµ rÔ dµi nhÊt lµ 3 cm, sau 12 tuÇn nu«i cÊy c©y con cã thÓ ph¸t triÓn ngoµi vên ¬m. C«ng bè trªn kh«ng cho biÕt tû lÖ t¹o rÔ cña chåi in vitro vµ tû lÖ c©y sèng sau khi ®a ra ®iÒu kiÖn ngoµi. Cuèi n¨m 2002 nh÷ng nghiªn cøu bíc ®Çu vÒ nu«i cÊy m« c©y Th«ng caribª vµ Th«ng lai ®· ®îc tiÕn hµnh t¹i Trung t©m nghiªn cøu c©y nguyªn liÖu giÊy. KÕt qu¶ ®· x¸c ®Þnh ®îc ph¬ng ph¸p khö trïng mÉu cho tû lÖ mÉu sèng vµ s¹ch lµ 10,1% (khö trïng b»ng H2O2 5% trong 20 phót), ®· thö nghiÖm vµ x¸c ®Þnh