Tóm tắt dự thảo Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu sàng lọc gene mã hoá enzyme tham gia thủy phân cellulose từ khu hệ vi sinh vật trong ruột mối bằng kỹ thuật Metagenomics

Chia sẻ: Nguyễn Khắc Hấn | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

101
lượt xem 12
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài: Đánh giá được sự đa dạng vi sinh vật ruột mối và đa dạng gene mã hoá cellulase của chúng; phân lập, tách dòng và biểu hiện được một gene mã hoá cellulase từ DNA đa gene vi sinh vật ruột mối; xác định được ảnh hưởng của một số điều kiện đến hoạt động của protein do gene tách dòng được mã hoá.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt dự thảo Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu sàng lọc gene mã hoá enzyme tham gia thủy phân cellulose từ khu hệ vi sinh vật trong ruột mối bằng kỹ thuật Metagenomics

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thảo NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC GENE MÃ HÓA ENZYME THAM GIA THỦY PHÂN CELLULOSE TỪ KHU HỆ VI SINH VẬT TRONG RUỘT MỐI BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62420121 TÓM TẮT DỰ THẢO LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2014 1
Công trình đƣợc hoàn thành tại: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. GS. TS. Trƣơng Nam Hải 2. TS. Đỗ Thị Huyền Phản biện: 1. 2. 3. Dự thảo luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp tại Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên vào hồi giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Hà Nội - Trung tâm thông tin – Thƣ viện, Đại học quốc gia Hà Nội 2
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cellulase là nhóm enzyme đƣợc sử dụng phổ biến trong các ngành công nghiệp nhƣ chế biến thực phẩm, chế biến thức ăn, sản xuất giấy, sản xuất rƣợu, sản xuất bia, công nghệ dệt…. Đặc biệt, cellulase đang đƣợc quan tâm nghiên cứu ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học nhƣ cồn sinh học từ nguồn phế phẩm lignocellulose dồi dào thay thế cho nguồn nhiên liệu hóa thạch đang trên đà cạn kiệt. Trong vòng 25 năm qua, sản lƣợng cồn sinh học đã tăng trƣởng và đạt mức nhảy vọt kể từ năm 2000. Cồn sinh học có thể đƣợc dùng nhƣ nguồn nhiên liệu độc lập cho các loại xe có động cơ chuyên biệt hoặc làm phụ gia nhiên liệu cho loại xe có động cơ truyền thống với tỉ lệ lên đến 30%. Ở nƣớc ta, ƣớc tính hàng năm, nguồn nguyên liệu lignocellulose từ phế phẩm nông nghiệp nhƣ rơm, rạ, lá mía và bã cây mía bỏ phí lên đến 50 triệu tấn. Các biện pháp xử lý nguồn phế phẩm này chủ yếu là đốt đã gây ra những ảnh hƣởng tiêu cực đến môi trƣờng sống và sức khoẻ con ngƣời. Việc tận dụng đƣợc nguồn nguyên vật liệu lignocellulose phế phẩm này vào sản xuất cồn sinh học sẽ đem đến nhiều lợi ích to lớn cho môi trƣờng cũng nhƣ cho nền kinh tế của nƣớc ta. Việc sử dụng cellulase thay thế các hoá chất truyền thống nhƣ acid, kiềm và nhiệt độ cao vào trong quá trình sản xuất của các ngành công nghiệp đã giải quyết đƣợc nhiều vấn đề nhƣ hạn chế ô nhiễm môi trƣờng và bảo vệ đƣợc sức khoẻ ngƣời lao động cũng nhƣ tăng hiệu quả sản xuất. Tuy nhiên, vấn đề đặt ra là cần thiết phải có đƣợc nguồn cellulase hoạt động ở điều kiện pH và nhiệt độ thích hợp cho các quá trình sản xuất đó. Hơn nữa, việc sản xuất cồn sinh học đang gặp một số khó khăn trong việc giảm chi phí sản xuất đặc biệt là nguồn cellulase để phân cắt cellulose thành glucose hiệu quả. Do đó, vấn đề quan trọng nhất là tìm ra đƣợc nguồn cellulase mới phù hợp với điều kiện sản xuất của các ngành công nghiệp liên quan, phát triển các phức hợp cellulase hiệu quả và ổn định để khắc phục khó khăn trong quá trình sản xuất. Metagenomics là kỹ thuật cho phép thu nhận trực tiếp DNA đa hệ gene của toàn bộ các vi sinh vật trong môi trƣờng sống nhất định. Chính vì lợi thế là thu nhận và phân tích đƣợc tất cả hệ gene của vi sinh vật phong phú và đa dạng, đặc biết là 99% vi sinh vật không nuôi cấy đƣợc mà Metagenomics trở thành công cụ giúp các nhà nghiên cứu khai thác nguồn gene mới hiệu quả nhất. Thực tế đã chứng minh, sau 20 năm phát triển, đặc biệt là khoảng 5 năm gần đây, khi kỹ thuật giải mã gene thế hệ mới đƣợc áp dụng, Metagenomics đã đƣợc sử dụng rất hiệu quả để tìm hiểu sự đa dạng vi sinh vật cũng nhƣ 3
khai thác các gene mới từ nhiều môi trƣờng sống khác nhau nhƣ nƣớc, đất, các đƣờng tiêu hóa, phế thải, … Mối đóng một vai trò quan trọng đối với hệ sinh thái bởi khả năng phân hủy sinh khối lignocellulose và góp phần vào chu trình carbon. Khả năng phân hủy hiệu quả lignocellulose của mối là kết quả hoạt động tổng hợp của các enzyme cellulase và hemicellulase đƣợc tiết ra từ bản thân mối và từ vi sinh vật sống cộng sinh trong ruột mối. Trong đó, hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa hiệu quả nguồn thức ăn lignocellulose của mối. Vì vậy, ruột mối là một nguồn gene cellulase phong phú cần đƣợc khai thác nhằm tìm ra các enzyme mới liên quan đến sự phân hủy cellulose. Ở Việt Nam cho đến nay đã tìm thấy hơn 100 loài mối khác nhau. Tuy nhiên, hệ vi sinh vật của các loài mối ở Việt Nam vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu vì thế toàn bộ hệ enzyme thủy phân lignocellulose có nguồn gốc từ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối cũng chƣa đƣợc điều tra và khảo sát. Với đặc điểm đặc trƣng của quần xã vi sinh vật sống cộng sinh trong ruột mối và vai trò của chúng giúp vật chủ phân hủy thức ăn, quần xã vi sinh vật ở mối bậc thấp đƣợc xem là nguồn khai thác gene cellulase mới lý tƣởng sử dụng trong quá trình thủy phân cellusose. Do đó, để nghiên cứu hệ vi sinh vật ruột mối và khai thác gene mới mã hóa cellulase từ hệ vi sinh vật tƣơng ứng sống cộng sinh trong ruột hiệu quả, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu sàng lọc gene mã hoá enzyme tham gia thủy phân cellulose từ khu hệ vi sinh vật trong ruột mối bằng kỹ thuật Metagenomics”. 2. Mục tiêu của đề tài 1. Đánh giá đƣợc sự đa dạng vi sinh vật ruột mối và đa dạng gene mã hoá cellulase của chúng. 2. Phân lập, tách dòng và biểu hiện đƣợc một gene mã hoá cellulase từ DNA đa gene vi sinh vật ruột mối. 3. Xác định đƣợc ảnh hƣởng của một số điều kiện đến hoạt động của protein do gene tách dòng đƣợc mã hoá. 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu đƣợc tiến hành trên đối tƣợng là vi sinh vật ruột mối thợ Coptotermes thu thập ở miền Bắc Việt Nam. 4. Nội dung nghiên cứu 1. Xác định đối tƣợng để tách lấy DNA đa hệ gen của vi sinh vật và định danh đối tƣợng. 4
2. Xây dựng phƣơng pháp để tách chiết và tinh sạch DNA đa hệ gene. 3. Giải trình tự và xử lý trình tự DNA đa hệ gene. 4. Dự đoán gene theo hai khía cạnh là đa dạng vi sinh vật và đa dạng gene từ bộ dữ liệu trình tự DNA đa hệ gene. 5. Chọn một trình tự gene để thiết mồi, phân lập, tách dòng và biểu hiện. 6. Xác định đặc điểm của sản phẩm biểu hiện gene phân lập đƣợc. 1. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Ý nghĩa khoa học 1. Đã định loại đƣợc một loài mối bậc thấp Coptotermes gestroi thu thập ở sáu địa điểm tại Hà Nội và Hƣng Yên bằng phƣơng pháp phân tử. 2. Đã đánh giá đƣợc sự đa dạng vi sinh vật và đa đạng gene cellulase của vi khuẩn sống trong ruột mối C. gestroi. Ý nghĩa thực tiễn 3. Đã phân lập, tách dòng và biểu hiện đƣợc một gene mã hoá endoglucanase. Đây là enzyme đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp. 4. Đóng góp mới của đề tài 1. Đây là nghiên cứu đầu tiên về sự đa dạng vi sinh vật ruột mối bậc thấp C. gestroi cũng nhƣ đa dạng gen cellulase của chúng. 2. Trình tự của gen đã phân lập, tách dòng và biểu hiện đƣợc có độ sai khác so với trình tự gene tƣơng ứng của các cơ sở dữ liệu. 5. Bố cục của luận án Luận án gồm 151 trang bao gồm: phần mở đầu 3 trang; chƣơng 1: tổng quan tài liệu 37 trang; chƣơng 2: đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 22 trang; chƣơng 3: kết quả và thảo luận 58 trang; kết luận và kiến nghị 2 trang. Các công trình khoa học của tác giả 1 trang. Tài liệu tham khảo 19 trang. Trong luận án có 19 bảng và 62 hình. Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LIGNOCELLULOSE Nêu đại cƣơng về đặc điểm cấu trúc chung của ba thành phần chính cấu tạo nên lignocellulose là cellulose, hemicellulose và lignin. 1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CELLULASE Nêu tổng quan về cơ chế hoạt động của cellulase và sự thủy phân cellulose. Cấu trúc của cellulase. 5
1.3. CELLULASE CỦA VI KHUẨN Nêu tổng quan về các họ cellulase, đặc biệt các loài vi khuẩn và vi khuẩn cổ tạo ra cellulase. Đồng thời đặc điểm về nhiệt độ, pH và kích thƣớc cellulase của các vi khuẩn đƣợc đƣa ra cụ thể. Ngoài ra, phần này còn nêu một số ứng dụng nổi bật của cellulase. 1.4. MỐI VÀ HỆ VI SINH VẬT RUỘT MỐI LIÊN QUAN ĐẾN SỰ THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE Sơ lƣợc về mối và đa dạng mối ở Việt Nam. Nêu tổng quan hệ vi sinh vật trong ruột mối bậc thấp và sự tiêu hóa lignocellulose của mối. Khái quát tính hình nghiên cứu gene mã hóa cellulase của sinh vật trong đƣờng ruột mối bậc thấp 1.5. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ METAGENOMICS Nếu khái quát: phƣơng pháp tiếp cận tìm gene mới bằng Metagenomics, các nghiên cứu phân lập gene từ thƣ viện DNA đa hệ gene và hơn phƣơng pháp khai thác và phân lập gene từ dữ liệu trình tự DNA đa hệ gene. Nêu rõ phƣơng pháp giải trình tự của một số hệ thống máy thế hệ mới. Đặc biệt, đƣa ra các nghiên cứu ứng dụng của Metagenomics trong khai thác gene mới và đánh giá sự đa dạng vi sinh vật. Ngoài ra tiềm năng ứng dụng của Metagenomics cũng đƣợc đề cập. Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIỆT BỊ MÁY MÓC Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng đối tượng là vi sinh vật ruột mối thuộc chi Coptotermes do Viện Sinh thái và Bảo vệ công trình cung cấp; các chủng vi sinh vật dùng làm thể nhận trong thí nghiệm tách dòng gene và làm thể nhận biểu hiện gene; plasmid sử dụng để tách dòng và biểu hiện gene; các cặp mồi PCR. Các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều đƣợc đặt mua từ các công ty đạt tiêu chuẩn quốc tế nhƣ Bio-Lab (Mỹ), Fermentas (Mỹ), Sigma (Mỹ), Merck (Đức). 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Các phƣơng pháp vi sinh 2.2.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử 2.2.2.1. Tách chiết DNA tổng số của mối 2.2.2.2. Phƣơng pháp thu nhận vi sinh vật ruột mối và tách chiết DNA đa hệ gene của chúng 2.2.2.3. Tinh sạch DNA đa hệ gene bằng phƣơng pháp máng đơn (troughing) 2.2.2.4. Giải trình tự DNA đa hệ gene hiệu năng cao bằng máy giải trình tự thế hệ mới HiSeq2000 của Illumina 6
2.2.2.5. Phƣơng pháp biến nạp bằng sốc nhiệt DNA plasmid vào vi khuẩn E. coli 2.2.2.6. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E. coli 2.2.2.7. Phƣơng pháp cắt và ghép nối gene 2.2.2.8. Phƣơng pháp tinh sạch DNA từ gel agarose bằng QIAquick Gel Extraction kit 2.2.2.9. Kỹ thuật PCR 2.2.2.10. Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+) mang gene egc 2.2.2.11. Điện di DNA trên gel agarose 2.2.2.12. Phƣơng pháp biểu hiện gene 2.2.2.13. Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide-SDS 2.2.2.14. Điện di protein trên gel polyacrylamide không SDS 2.2.3. Các phƣơng pháp hóa sinh protein 2.2.3.1. Phƣơng pháp tinh sạch protein bằng sắc kí ái lực his-tag 2.2.3.2. Định lƣợng protein bằng phƣơng pháp Bradford 2.2.3.3. Định lƣợng đƣờng khử bằng phƣơng pháp DNS 2.2.3.4. Phƣơng pháp xác định hoạt tính endoglucanase 2.2.3.5. Phƣơng pháp xác định hoạt tính β-glucosidase và β-xylosidase 2.2.3.6. Xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ, pH, các ion kim loại và một số hóa chất lên hoạt tính endoglucanase 2.2.3.7. Xác định độ bền của enzyme 2.2.4. Các phƣơng pháp tin sinh học và xử lý số liệu bằng phần mềm sinh học 2.2.4.1. Phân tích trình tự DNA đa hệ gene vi sinh vật ruột mối 2.2.4.2. So sánh trình tự ORF của dữ liệu DNA đa hệ gene với CSDL của NCBI 2.2.4.3. Thiết kế mồi bằng phần mềm FastPCR 2.2.4.4. Kiểm tra vị trí của các enzyme hạn chế trên gene quan tâm bằng phần mềm trực tuyến RestrictionMapper 2.2.4.5. Chuyển mã trình tự DNA sang trình tự amino acid bằng chƣơng trình dịch mã ExPASy 2.2.4.6. Xây dựng cây chủng loài của loài mối nghiên cứu với các loài mối khác bằng phần mềm Genedoc và MEGA5 2.2.4.7. Dự đoán cấu trúc của EGC bằng phần mềm Phyre2 2.2.4.8. Xác định độ tinh sạch của protein EGC tinh sạch đƣợc bằng phần mềm Quantity One Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. THU THẬP MỐI 3.1.1. Thu thập mối Từ tháng 4 đến tháng 6 năm 2012, sáu tổ mối đƣợc thu thập ở sáu địa điểm khác nhau. Các tổ mối thu đƣợc ghi rõ địa điểm, sắp xếp vào các hộp đựng mẫu. Năm địa điểm 7
thu đƣợc mối tại Hà Nội là Văn Quán, Hà Đông; Tản Lĩnh, Ba Vì; Bùi Xƣờng Trạch, Đống Đa; Thái Hà, Đống Đa; Võng Thị, Tây Hồ và một địa điểm tại tỉnh Văn Lâm, Hƣng Yên. Trong tổ thu đƣợc có hai đẳng cấp là mối lính và mối thợ. Mối lính thực hiện chức năng bảo vệ. Còn mối thợ thực hiện chức năng tìm kiếm và dự trữ thức ăn. Chính vì mối thợ có vai trò then chốt trong tìm kiếm và tiêu hoá thức ăn, dó đó chúng là đối tƣợng quan trọng đƣợc lựa chọn để tách lấy vi sinh vật đƣờng ruột. Mối của sáu tổ đều ăn gỗ và có hình dạng bên ngoài giống nhau. Dựa vào hình thái, rất ngẫu nhiên, cả sáu mẫu mối đƣợc các nhà nghiên cứu thuộc Viện Sinh thái và Bảo vệ công trình đã định loại ở bậc giống đều là Coptotermes. 3.1.2. Kết quả định loài mối nghiên cứu bằng phƣơng pháp phân tử 3.1.2.1. Tách DNA tổng số của mối Để xác định loài mối bằng phƣơng pháp phân tử, trƣớc hết, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số của mối. DNA tổng số mối của cả sáu mẫu thu thập ở sáu địa điểm tách chiết đƣợc đều nguyên vẹn và có kích thƣớc lớn hơn 10 kb. Mẫu DNA này sẽ đƣợc sử dụng trực tiếp làm khuôn để khuếch đại đoạn gene ARN ribosome16S (rARN 16S) ti thể. 3.1.2.2. PCR khuếch đại đoạn DNA của gene ARN ribosome 16S ti thể mối bp TH VT BXT VL M VQ TL 1000 500 Sản phẩm PCR của cặp mồi thứ nhất 400 Sản phẩm PCR của cặp mồi thứ hai 100 Hình 3.1. Điện di đồ hỗn hợp sản phẩm PCR khuếch đại các đoạn gene mã hóa rARN 16S ti thể mối bằng hai cặp mồi LR-J-13007, LR-N-13398 và FST-F, FST-R từ khuôn DNA tổng số của mối Coptotermes trên gel agarose 1,7%. ĐC M: Thang chuẩn 100 bp (Fermentas); các ĐC TH, VT, BXT, VL, VQ và TL tương ứng là sản phẩm PCR từ khuôn là DNA hệ gene mối thu thập ở Thái Hà, Võng Thị, Bùi Xương Trạch, Văn Lâm, Văn Quán và Tản Lĩnh. Hai cặp mồi gồm cặp thứ nhất là LR-J-13007, LR-N-13398 và cặp thứ hai là FST- F, FST-R đƣợc sử dụng để khuếch đại hai đoạn DNA của gene mã hóa RNA ribosome ti thể mối. Kết quả là ở 54oC, cặp mồi thứ nhất đã khuếch đại hiệu quả đoạn DNA duy nhất đậm nét, kích thƣớc lớn hơn 400 bp và bé hơn 500 bp từ DNA tổng số của cả sáu mẫu mối. 8
Tuy nhiên, chỉ ở 57oC, cặp mồi thứ hai mới khuếch đại đƣợc một băng DNA duy nhất kích thƣớc lớn hơn 100 bp từ hai mẫu khuôn DNA tổng số thu thập ở Văn Quán và Tản Lĩnh, còn bốn mẫu DNA còn lại không có đoạn DNA nào đƣợc khuếch đại (Hình 3.1). Tất cả các đoạn DNA khuếch đại đƣợc đều đƣợc đọc và phân tích trình tự nucleotide. 3.1.2.3. Phân tích sản phẩm PCR Phân tích trình tự nucleotide đoạn DNA được khuếch đại bằng cặp mồi thứ nhất Trình tự nucleotide của sáu đoạn DNA khuếch đại bằng cặp mồi thứ nhất đƣợc sắp xếp và so sánh với nhau đã thể hiện rằng tất cả các trình tự đều tƣơng đồng với nhau trong vùng 430 bp và không có sự khác nhau giữa ba mẫu mối thu thập ở Võng Thị, Văn Lâm và Bùi Xƣơng Trạch. Tuy nhiên, giữa hai mẫu mối Văn Quán và Thái Hà khác với các nhóm khác từ 0,5-0,9%; mẫu mối Tản Lĩnh khác với các mẫu mối khác từ 0,5-1,5% (Bảng 3.1). Đồng thời, mức độ tƣơng đồng trình tự nucleotide của sáu đoạn DNA trên cũng đƣợc so sánh với các trình tự tƣơng ứng của NCBI bằng BlastN. Kết quả cho thấy có sự giống nhau rất cao (97-99%) giữa sáu trình tự nghiên cứu với các trình tự tƣơng ứng của C. gestroi (Bảng 3.2). Để xác định rõ hơn mỗi quan hệ giữa mối Coptotermes nghiên cứu và các loài thuộc giống này, cây phát sinh loài đƣợc thiết lập bằng phần mềm MEGA5 (Hình 3.2) dựa vào trình tự vùng 430 bp cùng với 21 trình tự (giống từ 92-99%) của gene tƣơng ứng mã hoá rARN 16S của các loài mối thuộc giống Coptotermes. Kết quả cho thấy tất cả sáu mẫu mối thu tại sáu địa điểm nằm hoàn toàn trong nhánh tiến hóa của C. gestroi. Phân tích trình tự nucelotide đoạn DNA được khuếch đại bằng cặp mồi thứ hai Hai trình tự nghiên cứu chỉ khác nhau 1 nucleotide duy nhất. Kết quả so sánh mức giống nhau của hai trình tự nghiên cứu với các trình tự tƣơng ứng của NCBI bằng Blastn cho thấy, mức giống nhau thể hiện cao nhất (99-100%) đối với các trình tự của Coptotermes gestroi. (Bảng 3.3). Đồng thời, các trình tự tƣơng ứng trên ngân hàng gene có mức giống nhau từ 95-100 % so với hai trình tự nghiên cứu và xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA5 thể hiện mỗi quan hệ giữa hai mẫu mối nghiên cứu và các loài mối thuộc giống Coptotermes. Giống với kết quả phân tích trình tự đoạn 430 bp, cây phát sinh loài cũng cho thấy hai mẫu mối nghiên cứu nằm hoàn toàn trong nhánh tiến hóa của C. gestroi. Nhƣ vậy, những kết quả phân tích trên đã chứng minh đầy đủ và chắc chắn rằng, ở mức độ phân tử, sáu mẫu mối nghiên cứu thu thập ở sáu địa điểm đều thuộc loài Coptotermes gestroi. 9
CTanLinhVN 64 CVongThiVN CHungYenVN CBuiXuongTrachVN 40 CgestEF092285SG CgestDQ004478SG 62 CgestDQ004480SG CgestDQ915942SG C. gestroi 61 CThaiHaVN 67 CVanQuanVN CgestDQ004481MY 92 39 CgestDQ004487AU 68 CgestEF156760US 55 CgestAY558905AG 70 CgestAY558906TC CcarvAY558909MY C. carvinatus CkalsAY683211MY C. kalshoveni 43 44 ClactAY558912AU C. lacteus CformAB626146JP 65 CformU17778US CformAB626145JP C. formosanus 100 CformAY558911CN 54 CformDQ007344US 31 CformGU075666CN CinteAY558904TG C. intermedius 68 CcrasAY558901BZ C. crassus 97 CvastAY558898US C. vastator 0.005 Hình 3.2. Cây phát sinh loài giữa loài mối nghiên cứu và 21 loài khác được xây dựng dựa trên các trình tự có mức độ giống cao nhất với đoạn DNA kích thước 430 bp được khuếch lại bằng cặp mồi LR-J-13007 và LR-N-13398. Bảng 3.1. Tỷ lệ giống nhau và khác nhau về trình tự nucleotide giữa các vùng 430 bp gene rARN ti thể mối Coptotermes thu thập từ 6 địa điểm. Tỷ lệ giống nhau (%) BXT VQ VL TL TH VT BXT 99,1 100 99,5 99,5 100 VQ 4 99,1 98,5 99,5 99,1 VL 0 4 99,5 99,5 100 TL 2 6 2 99,1 99,5 TH 2 2 2 4 99,5 VT 0 4 0 2 2 Số nucleotide khác nhau 10
BXT: Bùi Xương Trạch; VQ: Văn Quán; VL: Văn Lâm; TL: Tản Lĩnh; TH: Thái Hà; VT: Võng Thị Bảng 3.2: Mức độ giống nhau vùng trình tự 430 bp gene rARN 16S của sáu mẫu mối Coptotermes với trình tự tương ứng của cơ sở dữ liệu NCBI. Mức độ giống nhau (%) Loài Mã số gene Địa điểm BXT VL TL TH VQ VT C. formosanus AB626145 Nhật Bản 93 93 93 94 93 93 C. formosanus AY558911 Trung Quốc 94 94 93 94 94 94 C. formosanus U17778 Hoa Kỳ 93 93 93 93 93 93 C. gestroi CgA2 DQ004487 Australia 98 98 97 98 97 98 Đảo Antigua và C. gestroi AY558905 99 99 98 99 98 99 Barbuda Quần đảo Turk và C. gestroi AY558906 98 98 98 98 98 98 Caico C. gestroi CgS3 DQ004478 Singapore 99 99 99 99 99 99 C. gestroi CgF2 EF156760 Hoa Kỳ 98 98 98 98 98 98 C. kalshoveni AY683211 Malaysia 95 95 94 95 94 95 C. lacteus AY558912 Australia 93 93 92 93 93 93 C. vastator AY558898 Hoa Kỳ 93 93 92 93 93 92 (BXT: Bùi Xương Trạch; VQ: Văn Quán; VL: Văn Lâm; TL: Tản Lĩnh; TH: Thái Hà; VT: Võng Thị). 3.2. TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH DNA ĐA HỆ GENE VI SINH VẬT SỐNG TRONG RUỘT MỐI Toàn bộ ruột mối thợ gồm ruột trƣớc, ruột giữa và ruột sau đều đƣợc tách lấy. Sau đó, DNA đa hệ gene của hệ vi sinh vật ruột mối đƣợc tách lấy và tinh sạch. Kết quả cho thấy sản phẩm tinh chế chỉ còn một băng DNA đa hệ gene duy nhất đậm nét có kích thƣớc lơn hơn 10 kb (Hình 3.3). M 1 kb DNA đa hệ gen 10 Hình 3.3. Điện di đồ DNA đa hệ gene của hệ vi sinh vật ruột mối Coptotermes gestroi trên gel agarose 0,8%. ĐC M: Thang chuẩn 1 kb (Fermentas); ĐC 1: DNA đa hệ gene được tinh chế bằng phương pháp Máng đơn. Để có đủ lƣợng DNA cần thiết cho việc nghiên cứu, chúng tôi đã tách chiết DNA đa hệ gene vi sinh vật từ khoảng 1.000.000 ruột mối thợ Coptotermes gestroi của sáu mẫu mối thu thập ở sáu địa điểm và thu đƣợc gần 11 µg DNA đa hệ gene sạch có nồng độ 114 ng/µl và OD260/280 đạt 1,83. Trong đó, 8,5 µg DNA đa hệ gene đƣợc đọc trình tự. 11
3.3. ĐỌC VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ DNA ĐA HỆ GENE VI SINH VẬT RUỘT MỐI Coptotermes 3.3.1. Tập hợp trình tự và xác định gene Trình tự DNA đa hệ gene vi sinh vật ruột mối C. gestroi đƣợc đọc bằng máy giải trình tự HiSeq 2000 của Illumina. Dữ liệu gồm các read tốt có tổng kích thƣớc là 5,4 Gb. Những read tốt này đƣợc sử dụng để tập hợp thành các contig có kích thƣớc dài hơn bằng phần mềm SOAPdenovo. Với k = 41, phần mềm đã lắp ráp tất cả các read thành các contig tối ƣu nhất gồm số lƣợng contig nhiều nhất 79.262 contig có tổng chiều dài dài nhất khoảng 90,1 Mb, kích thƣớc contig dài nhất là 183.853 bp và kích thƣớc contig ngắn nhất là 500 bp. Từ 79.262 contig, phần mềm MetaGeneAnnotator đã dự đoán đƣợc 125.431 ORF. 3.3.2. Đa dạng vi sinh vật ruột mối C. gestroi Trên cơ sở bộ dữ liệu trình tự DNA đa hệ gene, mức độ đa dạng vi sinh vật ruột mối C. gestroi đƣợc đánh giá dựa theo hai cách: Thứ nhất, các read chất lƣợng cao đƣợc so sánh với các trình tự của CSDL. Trong số đó, 34,07% các read giống với gene vi khuẩn, 0,032% giống với gene của nấm, 3,79% giống với gene vi sinh vật đƣờng ruột ngƣời và 0,189% giống với trình tự của RDP. Tổng số read có trình tự giống với CSDL là 206.742.13. Trong đó, tổng số read có trình tự giống với CSDL của vi khuẩn là 186.147.74. Do đó, nếu chỉ xét riêng các read có trình tự tƣơng đồng với các CSDL thì số read của vi khuẩn chiếm 90% và chỉ một tỷ lệ nhỏ (< 1%) là của nấm. Thứ hai, tất cả các ORF đƣợc phần mềm MEGAN (MEtaGeneomic ANalyser) phân tích dựa vào CSDL NR. Kết quả cho thấy 80% ORF thuộc vi khuẩn, 0,42% thuộc vi khuẩn cổ, 0,58% thuộc eukaryote, một tỷ lệ nhỏ thuộc vi rút (0,20%) và còn lại 18,79% là các ORF không dự đoán đƣợc. Từ dữ liệu, tổng số 1.460 loài vi sinh vật đƣợc xác định có mặt trong ruột mối C. gestroi, trong đó, vi khuẩn có độ đa dạng cao nhất, với 1.368 loài (chiếm tới 93,7% tổng số loài đƣợc dự đoán) (Bảng 3.3) thuộc 628 chi, 217 họ, 97 bộ, 41 lớp và 22 ngành. Bảng 3.3. Đa dạng vi sinh vật ruột mối C. gestroi được dự đoán bằng MEGAN dựa vào CSDL NR (non-redundant database) của NCBI. Ngành Lớp Bộ Họ Chi Loài Số gene Tỷ lệ (%) Vi khuẩn 22 41 97 217 628 1368 100340 80 Vi khuẩn cổ 4 10 15 21 47 61 533 0,42 Eukaryota 20 14 25 33 43 24 731 0,58 Vi rút - - 1 11 13 7 249 0,2 Không dự 23570 18,79 đoán được Tổng số 46 65 138 282 731 1460 125423 100 12
Trong số 22 ngành vi khuẩn đƣợc dự đoán có 7 ngành chiếm ƣu thế nhất gồm Firmicutes, Proteobacteria, Spirochaetes, Bacteroidetes, Synergistetes, Planctomycetes và Actinobacteria. Số ORF của các loài thuộc các ngành này chiếm đến 57,72% (Bảng 3.4) tổng số ORF vi khuẩn dự đoán đƣợc.. Bảng 3.4. Đa dạng loài 7 ngành vi khuẩn chiếm ưu thể nhất sống trong ruột mối C. gestroi Ngành Lớp Bộ Họ Chi Loài Tỷ lệ có mặt (%) Firmicutes 4 8 40 126 429 22,48 Proteobacteria 6 41 84 260 490 17,84 Spirochaetes 1 1 3 8 34 17,4 Bacteroidetes 4 5 13 67 159 11,6 Synergistetes 1 1 1 9 11 4,27 Planctomycetes 2 3 3 9 10 1,14 Actinobacteria 1 5 37 72 135 0,48 Ở bậc phân loại bộ, trong số 97 bộ vi khuẩn dự đoán đƣợc có 12 bộ chiếm ƣu thế nhất thể hiện ở hình (Hình 3.5). Trong đó, chỉ có bộ Pseudomonades không thuộc 7 ngành chiếm ƣu thể, còn lại đều thuộc 7 ngành chiếm ƣu thế trên. 25 22.48 17.84 17.4 20 Tỷ lệ (%) 15 11.6 10 4.27 5 1.14 0.48 0 Ngành vi khuẩn Hình 3.4. Bảy ngành vi khuẩn chiếm ưu thế nhất có mặt trong ruột mối C.gestroi nghiên cứu Trong đó, Clostridiales, Actinobacteria, Bacillales, Enterobacteriales, Bacillales, Pseudomonades và Bacteroidales là những bộ có các loài phổ biến có khả năng phân huỷ cellulose, nhƣ Ruminococcus albus (62 ORF), Ruminococcus flavefaciens (40 ORF), Acetivibrio cellulolyticus (85 ORF), Pseudomonas fluorescens (1258 ORF). Xét bậc phân loại chi, Treponema là chi thuộc bộ Spirochaetales chiếm ƣu thế nhất (chiếm đến 91,2% bộ, 15% tổng số vi khuẩn xác định đƣợc). Chi chiếm ƣu thế thứ hai là Lactococcus (thuộc bộ Lactobacillales) chiếm 7,8%, tiếp đến là Pseudomonas (thuộc bộ Pseudomonades) chiếm 4,6% tổng số vi khuẩn có mặt trong mẫu ruột mối thu thập đƣợc. 13
Ngoài ra còn có năm chi cũng chiếm ƣu thế là Pseudomonas (5823 ORF), Enterobacter (3412 ORF), Dysgonomonas (2984 ORF), Clostridium (2968 ORF) và Bacteroides (2414 ORF). Những trình tự của tám chi ƣu thế nhất này chiếm đến 51,36% so với tổng tất cả các chi dự đoán đƣợc. Trong đó, Clostridium và Bacteroides là hai chi có rất nhiều loài phổ biến có khả năng phân hủy cellulose. Trong dữ liệu cũng chỉ ra nhiều loài thuộc hai bộ có khả năng phân huỷ cellulose nhƣ C. acetobutylicum (32 ORF), C. cellulolyticum (40 ORF), C. cellulovorans (46 ORF), C. papyrosolvens (53 ORF), B.cellulosilyticus (156 ORF). 25000 21825 Số lượng ORF 20000 15000 1306311995 9951 8438 10000 5861 3685 5000 2009 1740 1629 1470 410 0 Bộ vi khuẩn Hình 3.5. Mười hai bộ vi khuẩn chiếm ưu thế nhất trong ruột mối Coptotermes gestroi. ORF được chú thích dựa vào CSDL NR. 3.4. GENE MÃ HOÁ ENZYME THUỶ PHÂN CELLULOSE CỦA VI SINH VẬT RUỘT MỐI Coptotermes gestroi 3.4.1. Chú thích chức năng của DNA đa hệ gene Toàn bộ các trình tự amino acid tƣơng ứng của 125.431 ORF trong dữ liệu DNA đa hệ gene vi sinh vật ruột mối C. gestroi đƣợc chú thích bằng Blastp dựa vào CSDL eggNOG, COG và KEGG. Các ORF này đƣợc chú thích chức năng sâu hơn dựa trên CSDL COG và KEGG. Dựa vào COG, 7.428 ORF đƣợc chú thích liên quan đến quá trình chuyển hóa carbohydrate gồm 210 nhóm COG. Trong đó, 518 ORF thuộc các nhóm COG1472, COG2723, COG1904, COG3459, COG1486, COG1363, COG2730, COG2273, COG3405 liên quan trực tiếp đến sự phân hủy cellulose. Dựa vào KEGG, kết quả chú thích cũng thể hiện các ORF liên quan đến các con đƣờng chuyển hóa carbohydrate chiếm tỷ lệ cao 12,28% (12.763/103.918 ORF) và cao hơn rất nhiều so với kết quả dự đoán dựa vào CSDL KOG. Trong đó, 587 ORF mã hóa enzyme phân hủy lignocellulose gồm 316 ORF cellulase, 259 ORF hemicellulase và 12 ORF còn lại mã hóa pectatelyase và pectinesterase . 14
3.4.2. Gene mã hóa enzyme phân hủy cellulose Toàn bộ 316 ORF đƣợc chú thích (dựa vào CSDL KEGG) thuộc 11 họ GH khác nhau liên quan trực tiếp đến sự thủy phân cellulose thể hiện tám chức năng 6-phospho-β- glucosidase, licheninase, glucan endo-1,3-β-D-glucosidase, endoglucanase, cellulose 1,4- β-cellobiosidase, glucan 1,3- β-glucosidase và cellobiose phosphorylase (Bảng 3.5). Bảng 3.5. Các ORF mã hóa cellulase của vi sinh vật sống trong ruột C. gestroi. ORF hoàn ORF thiếu ORF thiếu ORRF thiếu STT Mã EC Enzyme Tổng số thiện đầu 5’ đầu 3’ cả 2 đầu 6-phospho-β- 1 3.2.1.86 19 20 15 6 60 glucosidase 2 3.2.1.21 β-glucosidase 29 40 55 87 211 cellobiose 3 2.4.1.20 1 1 2 4 phosphorylase cellulose 1,4-β- 4 3.2.1.91 1 3 4 cellobiosidase 5 3.2.1.4 endoglucanase 5 8 6 12 31 glucan 1,3-β- 6 3.2.1.58 2 1 3 glucosidase glucan endo-1,3-β-D- 7 3.2.1.39 1 1 glucosidase 8 3.2.1.73 licheninase 0 0 2 0 2 Tổng số 55 71 80 110 316 3.4.3. Lựa chọn ORF cellulase để biểu hiện Trong số 316 ORF đƣợc chú thích mã hóa các enzyme tham gia thủy phân cellulose có 55 ORF hoàn thiện, 71 ORF thiếu đầu 5’, 80 ORF thiếu đầu 3’ và 110 ORF thiếu cả hai đầu 5’ và 3’ (Bảng 3.5). 55 ORF hoàn thiện gồm 19 ORF mã hóa 6-phospho-β- glucosidase, 29 ORF mã hóa β-glucosidase, 5 ORF mã hóa endoglucanase và 2 ORF mã hóa glucan 1,3-β-glucosidase. Đặc biệt, endoglucanase có rất nhiều ứng dụng trong công nghiệp. Do vậy, trong nghiên cứu này, 5 ORF hoàn thiện đƣợc chú thích chức năng endoglucanase là những trình tự chúng tôi đặc biệt quan tâm. Từ tỷ lệ tƣơng đồng và giống của trình tự nucleotide và trình tự amino acid của 5 ORF, bƣớc đầu ORF GL0130684 đƣợc lựa chọn. Để chắc chắn về dự đoán ORF GL0130684 mã hoá endoglucanase, chúng tôi đã xây dựng cây phân loại để xem xét mỗi quan hệ của trình tự amino acid ORF GL0130684 với các trình tự amino acid tƣơng ứng của NCBI. Kết quả cho thấy, trình tự amino acid của GL0130684 thể hiện hoạt tính 15
endoglucanase rõ ràng (Hình 3.6) và thống nhất khi so sánh với các cơ sở dữ liệu COG, pfarm, PRK thông qua Blastp của NCBI. Hơn nữa, phần mềm Phyre 2 đã đƣa ra cấu trúc 3D và chức năng endoglucanase của trình tự amino acid của ORF GL0130684. Với những đặc điểm đã phân tích cho thấy ORF GL0130684 đƣợc dự đoán đúng chức năng endoglucanase với tỷ lệ cao, do đó ORF GL0130684 đƣợc lựa chọn để phân lập, tách dòng và biểu hiện. Chúng tôi kí hiệu ORF GL0130684 là gen egc. 41 Escherichia-coli-endoglucanase-(WP001592871) 61 Escherichia-coli-endoglucanase-(WP021532881) 100 Escherichia-coli-endoglucanase-(WP021527136) Enterobacteriaceae-endoglucanase-III-(WP001295222) 40 94 Enterobacteriaceae-endoglucanase-III-(WP000783609) Citrobacter-farmeri-endoglucanase-(GAL50460) 100 65 Citrobacter-koseri-endoglucanase-III-(WP012135658) Salmonella-enterica-endoglucanase-(WP 024145245) 100 Salmonella-entericagi-endoglucanase-(WP024147272) Enterobacteriaceae-bacterium-FGI57-endoglucanaseY-(WP015962575) EGC-GL0130684 Enterobacter-lignolyticus-endoglucanase-III-(WP 013364269) 96 66 Yokenella-regensburgei-endoglucanase-III-(WP006817672) 100 Yokenella-regensburgei-ATCC49455-endoglucanase-(KFD24598) 0.05 Hình 3.6. Phân tích cây phát sinh loài giữa EGC và các endogucanase dựa trên sự tương đồng về trịnh tự amino acid. 0,05 là chỉ số thể hiện sự khác nhau giữa 2 nhóm là 5 nucleotide/100 amino acid; các con số trên các nhánh là chỉ số Bootstrap. Tên các loài trên cây gồm: tên loài và mã số gene. 3.5. TÁCH DÒNG GENE egc 3.5.1. Trình tự ORF GL0130684 Gene egc chúng tôi lựa chọn có chiều dài 1107 bp. Phân tích đặc điểm của trình tự amino acid bằng chƣơng trình Expasy trực tuyến cho thấy, trình tự amino acid của gene egc chứa một đoạn tín hiệu tiết dài 22 amino acid (từ amino acid đầu tiên cho đến amino acid thứ 22), tƣơng ứng với độ dài trình tự nucleotide là 66 bp (từ đầu gene cho đến bp thứ 66). 3.5.2. Khuếch đại gene egc Để khuếch đại đƣợc gene egc từ khuôn DNA đa hệ gene vi sinh vật sống trong ruột mối với xác suất cao nhất, hai mồi xuôi GL0130684f1, GL0130684f2 và một mồi ngƣợc GL0130684r đã đƣợc sử dụng. Trong đó, mồi xuôi GL0130684f1 khuếch đại gene egc từ đầu gen (cả trình tự mã hoá tín hiệu tiết) và mồi xuôi GL0130684f2 khuếch đại gene egc từ vị trí ngay sau trình tự mã hoá tín hiệu tiết (không mang trình tự mã hoá tín hiệu tiết). 16
Trong khi khuếch đại gene egc, Vent DNA polymerase đã đƣợc sử dụng. Cả ba mồi đều đƣợc bổ sung vào cùng một phản ứng PCR. Một đoạn DNA kích thƣớc lớn hơn 1 kb đƣợc khuếch đại (Hình 3.7) tƣơng đƣơng với kích thƣớc của gene egc mong muốn. Tuy nhiên, đoạn DNA khuếch đại đƣợc với số lƣợng ít (băng DNA không rõ ràng), do đó, để thuận tiện cho việc tách dòng, sản phẩm khuếch đại có đoạn DNA mong muốn đƣợc sử dụng làm khuôn để khuếch đại đoạn DNA đó lên với số lƣợng lớn hơn. Kết quả đúng nhƣ dƣ đoán, lƣợng DNA mong muốn đƣợc khuếch đại lên với số lƣợng lớn hơn (Hình 3.10). Đoạn DNA đƣợc thu hồi bằng bộ kit tinh chế DNA QIAQuick gel extraction để ghép nối vào vector tách dòng. kb 1 M (-) M (-) 2 10 1,5 Sản phẩm PCR 1,0 Hình 3.7. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gene egc trên gel agarose 0,8%. ĐC (-): đối chứng âm; ĐC 1: sản phẩm PCR lần thứ nhất từ khuôn DNA đa hệ gene vi sinh vật trong ruột mối; ĐC 2: sản phẩm PCR lần thứ hai từ khuôn là sản phẩm PCR lần thứ nhất; ĐC M; thang chuẩn DNA 1 kb (Fermentas). 3.5.3. Ghép nối sản phẩm khuếch đại gene egc vào vector tách dòng pJET1.2 blunt Trong nghiên cứu này, vector pJET1.2/blunt đƣợc sử dụng để tách dòng gene egc. Tỷ lệ sản phẩm PCR và vector pJET1 trong phản ứng ghép nối gene là 3:1. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở nhiệt độ thích hợp. Sản phẩm của phản ứng ghép nối sẽ đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli DH10b bằng phƣơng pháp sốc nhiệt để chọn dòng mang plasmid mong muốn. 3.5.4. Biến nạp sản phẩm ghép nối vào tế bào E. coli DH10b Plasmid tái tổ hợp pJET-egc đƣợc biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH10b bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Các dòng tế bào biến nạp đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng LBA ở 37oC và lắc qua đêm để tế bào sinh trƣởng và tổng hợp số lƣợng lớn. Những khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trƣờng LBA chính là các dòng tế bào E. coli DH10b mang plasmid tái tổ hợp pJET-egc. Bốn dòng khuẩn lạc của sản phẩm biến nạp đƣợc lựa chọn tách chiết DNA plasmid đều chứa 17
plasmid có kích thƣớc đồng nhất và lớn hơn kích thƣớc của dòng pJET1.2/blunt chỉ mang một đoạn DNA ngắn không đáng kế. 3.5.5. Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme hạn chế M HindIII XbaI XhoI SalI BglII EcoRV kb EcoRV SalI XhoI 858 511 XbaI 352 377 BglII511 BglII 384, 4,5 340 wegc Eco47 HindIII, Sản phẩm R PlacUV5 624 cắt 16511 2,5 pJETwegc Sản phẩm 2782 4,2 Kb cắt 1 Bla (ApR) Rep(pMB1) A B Hình 3.8. A. Vị trí cắt của các enzyme cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp trên gene egc và trên vector pJET1.2/blunt. B. Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ bằng sáu enzyme hạn chế HindIII, SbalI, XhoI, SalI, BglII và EcoRV. Các ĐC HindIII, XbaI, XhoI, SalI, BglII và EcoRV tương ứng là sản phẩm cắt plasmid bằng enzyme HindIII, XbaI, XhoI, SalI, BglII và EcoRV. Sáu enzyme hạn chế gồm BglII, SalI, EcoRV, XhoI, XbaI và HindIII đƣợc sử dụng để cắt kiểm tra các plasmid tái tổ hợp. BglII, XhoI, XbaI và HindIII cắt plasmid tái tổ hợp trên vector pJET1.2/blunt và không cắt trên gene egc. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp đúng nhƣ tính toán lý thuyết (Hình 3.8). Nhƣ vậy, dòng plasmid chúng tôi lựa chọn cắt kiểm tra chính là pJET-egc mong muốn. 3.5.6. Phân tích trình tự gene egc phân lập đƣợc từ DNA đa hệ gene vi sinh vật ruột mối Trình tự nucleotide của gene egc phân lập đƣợc từ DNA đa hệ gene vi sinh vật mối chỉ khác với trình tự của ORF GL013068 một nucelotide ở vi trí 588/1104 Điều ngẫu nhiên là nucleotide sai khác này lại không làm thay đổi amino acid tƣơng ứng. Nghĩa là trình tự amino acid của đoạn DNA phân lập đƣợc và của ORF GL013068 giống hệt nhau. Gene egc này phân lập đƣợc có cả trình tự mã hoá tín hiệu tiết nên đƣợc đặt tên là gene wegc để phân biệt với gene egc không có tính hiệu tiết. Nhƣ vậy, plasmid tái tổ hợp chúng tôi có đƣợc là pJET-wegc. Điều đó chứng tỏ, trong ba mồi sử dụng để khuếch đại gene egc thì cặp mồi GL0130684f1 và GL0130684r đã khuếch đại đƣợc wegc. Trình tự tín hiệu tiết trong gene wegc sẽ đƣợc thay thế bằng trình tự tín hiệu tiết của protein pelB có trong vector biểu hiện pET22b+ , do đó, trình tự tín hiệu tiết cần phải loại bỏ khỏi gene wegc. Để loại bỏ trình tự tín hiệu tiết này khỏi gene wegc, chúng tôi sử dụng cặp mồi GL0130684f2 18
và GL0130684r để khuếch đại đúng đoạn DNA đích không có trình tự tín hiệu tiết từ khuôn plasmid tái tổ hợp pJET-wegc. 3.5.7. Khuếch đại gene egc không chứa tín hiệu tiết từ khuôn pJET-wegc Ở nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và khuôn là 50oC, trong 30 chu kỳ PCR, cặp mồi đặc hiệu GL0130684f2 và GL0130684r đã khuếch đại hiệu quả gene egc không mang tín hiệu tiết có kích thƣớc bé hơn wegc từ khuôn pJET-wegc (Hình 3.9). Gene egc này sẽ đƣợc tinh chế bằng bộ kit QIAQuick gel và ghép nối vào vector biểu hiện pET22b(+). Kb 1 2 M 10 Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm PCR 1,5 wegc khuếch đại gene egc từ khuôn là gene wegc trên 1,0 egc gel agarose 0, 8%. ĐC 1: gene wegc; ĐC 2: gene egc được khuếch đại từ gene wegc; ĐC M: thang chuẩn DNA 1 kb (Fermentas). 3.5.8. Thiết kế vector biểu hiện gene egc 3.5.8.1. Ghép nối gene egc vào vector biểu hiện Trong nghiên cứu này, vector pET22b(+) đƣợc sử dụng để biểu hiện gene egc. pET22b(+) là vector phù hợp cho biểu hiện protein tái tổ hợp trong vật chủ E. coli. Cả gene egc và vector pET22b(+) đều đƣợc xử lý bằng cặp enzyme hạn chế XhoI và NcoI. Sản phẩm cắt là gene egc kích thƣớc 1041 bp và pET22b(+) dạng thẳng kích thƣớc 5431 bp đều có hai đầu dính tƣơng ứng giống nhau. Đặc điểm này giúp cho quá trình ghép nối chúng với nhau hiệu quả cao. Sản phẩm ghép nối pET22-egc sẽ đƣợc biến nạp vào tế bào E.coli DH10B bằng sốc nhiệt để chọn dòng mong muốn. 3.5.8.2. Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22-egc Plasmid tái tổ hợp pET22-egc chỉ có một trình tự cắt duy nhất của XhoI và của NcoI ở hai đầu của gene egc. Khi sử dụng cặp enzyme này để cắt kiểm tra pET22-egc sẽ tạo ra hai đoạn DNA, đoạn thứ nhất chính là gene egc kích thƣớc 1041 bp và đoạn thứ hai chính là vector pET22b(+) kích thƣớc 5431 bp. Kết quả cắt kiểm tra bốn dòng plasmid đều tạo ra hai đoạn DNA có kích đúng bằng kích thƣớc của gene egc và pET22b(+) (Hình 3.10). Nhƣ vậy, gene egc đã đƣợc ghép nối vào vector biểu hiện 19
pET22b(+) đúng nhƣ thiết kế. Plasmid pET22-egc sẽ đƣợc biến nạp vào tế bào biểu hiện E. coli BL21(DE3) bằng sốc nhiệt để biểu hiện gene egc. kb 1 2 3 M 4 Hình 3.10. sản phẩm cắt các dòng 10 pET22-egc bằng cặp enzyme hạn chế XhoI và 6,0 10 pET22b(+ 5,0 NcoI trên gel agarose 0,8%. ĐC p1-4: 4 dòng ) plasmid pET22-egc; ĐC 1-4: sản phẩm cắt 4 egc dòng plasmid pET22-egc bằng XhoI và NxoI; 1,0 ĐC M: thang chuẩn DNA 1 kb (Fermentas); ĐC pET: vector pET22b(+). 3.6. BIỂU HIỆN GENE egc TRONG VI KHUẨN E. coli BL21(DE3) 3.6.1. Chọn dòng biểu hiện gene egc trong tế bào E. coli BL21(DE3) M (-) 1 2 3 kda M TS T KT kda 116 116 45 45 EGC EGC 35 35 14,4 14,4 A B Hình 3.11. Điện di đồ protein tổng số từ sản phẩm biểu hiện gene egc trong chủng E. coli o BL21(DE3), môi trường LBA ở 37 C sau 4 tiếng cảm ứng 0,5 mM IPTG ở ba dòng tế bào khác nhau trên gel polyacrylamide 12,6% có SDS. Tế bào sau khi biểu hiện đều cô đặc đến OD600 = 10. ĐC (-): đối chứng âm, protein tổng số của dòng tế bào biểu hiện chỉ mang vector pET22b(+) không mang gene egc; ĐC 1-3: protein tổng số của 3 dòng tế bào biểu hiện mang pET22-egc; ĐC TS: protein tổng số biểu hiện trong tế bào mang pET22-egc; ĐC T: protein ở dạng không tan biểu hiện trong tế bào mang pET22-egc; ĐC KT: protein ở dạng tan biểu hiện trong tế bào mang pET22-egc; ĐC M: thang chuẩn protein unstained (Thermo scientific). Kết quả cho thấy gene egc đã đƣợc tổng hợp thành protein EGC có kích thƣớc bé hơn 40 kda (Hình 3.11) tƣơng đƣơng với kích thƣớc tính toán lý thuyết ở cả ba dòng tế bào, đồng thời, ở dòng đối chứng âm không có băng protein này. Nhƣ vậy, gene egc trong vector pET22b(+) đã đƣợc biểu hiện thành protein EGC trong tế bào E. coli BL21(DE3). 20