Tóm tắt dự thảo Luận án Tiến sĩ Sinh học: Phân lập và nghiên cứu gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn của thực vật

Chia sẻ: Nguyễn Khắc Hấn | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

102
lượt xem 13
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài "Phân lập và nghiên cứu gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn của thực vật": Phân lập và xác định trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã điều khiển tính chịu hạn từ lúa; nghiên cứu một số đặc tính của gen mã hóa nhân tố phiên mã phân lập được trên cây lúa chuyển gen mô hình.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt dự thảo Luận án Tiến sĩ Sinh học: Phân lập và nghiên cứu gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn của thực vật

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------- Nguyễn Duy Phƣơng PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62420116 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2015
Công trình đƣợc hoàn thành tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Phạm Xuân Hội 2. GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa Phản biện 1: ............................................. Phản biện 2: ............................................. Phản biện 3: ............................................. Luận án sẽ đƣợc bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Quốc gia họp tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội vào hồi......giờ......., ngày.......tháng.......năm 2015 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm thông tin - Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hạn là yếu tố môi trƣờng gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sản xuất nông nghiệp, làm giảm năng suất, sản lƣợng cây trồng và dẫn tới tình trạng mất an ninh lƣơng thực. Đặc biệt, trong bối cảnh biến đổi khí hậu toàn cầu, tình trạng hạn hán xảy ra ngày càng thƣờng xuyên hơn, với mức độ ngày càng trầm trọng, nhiều lúc vƣợt quá tầm kiểm soát của con ngƣời. Chính vì vậy, việc nghiên cứu các gen liên quan tới tính kháng hạn để tiến tới tạo giống cây trồng biến đổi gen có khả năng chịu hạn có ý nghĩa đặc biệt quan trọng đối với việc duy trì và tăng sản lƣợng nông nghiệp, góp phần giữ ổn định an ninh lƣơng thực quốc gia. Tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen và sự biểu hiện của các gen liên quan chặt chẽ với quá trình phiên mã. Các nhà khoa học đã chứng minh đƣợc chức năng quan trọng của nhóm gen điều khiển trong việc tăng cƣờng tính chịu hạn ở thực vật. Do đó, việc nghiên cứu phân lậ c đặ ố phiên mã liên quan đến chịu hạn đang trở thành xu hƣớng triển vọng và nhận đƣợc sự quan tâm đặc biệt. Hàng loạt gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến chịu hạn đã đƣợc xác định và chuyển vào các giống cây trồng khác nhau. Các gen mã hóa nhân tố phiên mã mặc dù không tham gia trực tiếp vào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn nhƣng sự biểu hiện của chúng lại có vai trò điều hòa biểu hiện của rất nhiều gen chức năng khác, dẫn tới làm tăng cƣờng khả năng chịu hạn của thực vật. Nhiều cây trồng chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã đã đƣợc chứng minh tăng cƣờng khả năng chịu hạn so với cây không chuyển gen 1
Ở Việt Nam, cho đến nay chúng ta vẫn chƣa có một nghiên cứu cơ bản hoàn chỉnh nào về phân lập và nghiên cứu chức năng gen liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn ở thực vật, đặc biệt là nhóm gen mã hóa nhân tố phiên mã. Xuất phát từ trên, chúng tôi tiến hành đề tài luận án tiến sĩ “Phân lập và nghiên cứu gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn của thực vật” với mục tiêu xác định một gen mã hóa nhân tố phiên mã mới có liên quan tới tăng cƣờng tính chống chịu hạn ở thực vật. 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Phân lập và xác định trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã điều khiển tính chịu hạn từ lúa. - Nghiên cứu một số đặc tính của gen mã hóa nhân tố phiên mã phân lập đƣợc trên cây lúa chuyển gen mô hình. 3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài Đối tượng nghiên cứu của đề tài: Gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng chống chịu stress hạn của lúa Oryza sativa L. Nội dung nghiên cứu của đề tài: - Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến chống chịu điều kiện bất lợi ở lúa. - Nghiên cứu đặc điểm chức năng của protein OsNLI-IF. - Thiết kế các hệ vector biểu hiện gen OsNLI-IF trong tế bào thực vật. - Nghiên cứu biểu hiện OsNLI-IF trong cây chuyển gen mô hình. 4. Địa điểm thực hiện đề tài Các nghiên cứu của luận án đƣợc thực hiện tại Bộ môn Bênh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp 2
Việt Nam), e và Phòng Thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật thuộc Trung tâm Kỹ thuật Di truyền và Công nghệ Sinh học Quốc tế (New Delhi, Ấn Độ). 5. Đóng góp mới của đề tài Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam thực hiện một cách có hệ thống về nghiên cứu cơ bản theo định hƣớng ứng dụng gen OsNLI-IF chƣa đƣợc xác định chức năng. Gen OsNLI-IF đƣợc chứng minh mã hóa một nhân tố phiên mã hoạt động cảm ứng với điều kiện ngoại cảnh bất lợi nhƣ hạn, mặn, lạnh, nhiệt độ cao và có khả năng tăng cƣờng tính chịu hạn trong các cây chuyển gen mô hình (thuốc lá/ lúa). Ngoài ra, các vector biểu hiện gen OsNLI-IF đƣợc điểu khiển bởi các promoter hoạt động liên tục (35S và Ubiquitin) và hoạt động trong điều kiện stress (Lip9) đã đƣợc chuyển vào cây mô hình để nghiên cứu biểu hiện gen. Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu của luận án là hoàn toàn mới, có giá trị khoa học và ý nghĩa thực tiễn trong công tác chọn tạo giống cây trồng chuyển gen. 6. Ứng dụng thực tiễn của đề tài Kết quả nghiên cứu của luận án lần đầu tiên đã chứng minh vai trò tăng cƣờng tính chịu hạn của gen OsNLI-IF trong các dòng cây chuyển gen. Trên cơ sở kết quả của luận án, các vector biểu hiện gen OsNLI-IF do luận án tạo ra đang đƣợc nghiên cứu chuyển vào các giống cây trồng quan trọng nhƣ ngô, đậu tƣơng, bông… để chọn tạo các giống cây chuyển gen kháng hạn nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết của sản xuất trong điều kiện thay đổi khí hậu toàn cầu. 7. Bố cục của luận án Luận án gồm 179 trang bao gồm: Phần mở đầu (03 trang); Tổng quan tài liệu (41 trang); Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu (28 3
trang); Kết quả nghiên cứu và thảo luận (70 trang); Kết luận (02 trang); Kiến nghị (01 trang); Các công trình khoa học của tác giả liên quan đến luận án (01 trang); Tài liệu tham khảo (18 trang), 177 tài liệu gồm 2 thứ tiếng tiếng Việt (17 ) và tiếng Anh (160 ); Phụ lục (06 trang). Luận án có 11 bảng, 45 hình. 4
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. HẠN HÁN VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT Hạn đối với thực vật là khái niệm đƣợc dùng để chỉ trạng thái thiếu nƣớc do môi trƣờng gây nên trong suốt quá trình sống hay trong từng giai đoạn sống, làm ảnh hƣởng đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của thực vật. Môi trƣờng khô hạn gây ra hàng loạt những tác động tiêu cực tới thực vật ở tất cả các cấp độ, từ hình thái tới phân tử và ở tất cả các giai đoạn phát triển. Để đối phó với điều kiện hạn hán, thực vật sẽ khởi động cơ chế phòng vệ chống lại sự thiếu hụt nƣớc, sau đó sẽ là một loạt các cơ chế ở các cấp độ khác nhau. Đáp ứng chống chịu stress hạn của thực vật đƣợc thực hiện thông qua một chuỗi các quá trình rất phức tạp với sự tham gia của hàng loạt các yếu tố và có thể chia thành 3 giai đoạn: nhận tín hiệu – dẫn truyền tín hiệu – đáp ứng chống chịu khởi đầu chuỗi truyền tín hiệu. 1.2. ĐIỀU HÒA HOẠT ĐỘNG GEN TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN Ở THỰC VẬT Thực vật thích nghi với môi trƣờng sống nhờ khả năng điều hòa nhanh biểu hiện của các gen chức năng. Quá trình điều hòa biểu hiện gen đóng một vai trò quan trọng trong đáp ứng của thực vật với các điều kiện stress phi sinh học, trong đó có hạn hán. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh stress hạn tác động tới tất cả các bƣớc trong quá trình điều hòa hoạt động gen của thực vật, bao gồm: điều hòa quá trình phiên mã, điều hòa sau phiên mã, điều hòa quá trình dịch mã, điều hòa sau dịch mã, điều hòa hoạt động gen thông qua các phân tử RNA không mã hóa và yếu tố di truyền ngoại sinh (ví dụ nhƣ quá trình methyl hóa DNA hay quá trình biến đổi histone). 5
1.3. VAI TRÒ CỦA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ TRONG ĐÁP ỨNG STRESS HẠN Trong hệ gen thực vật có khoảng 7% gen mã hóa nhân tố phiên mã (TF), trong số đó có rất nhiều gen liên quan đến đáp ứng chống chịu stress. Các TF tham gia trong mạng lƣới điều hòa hoạt động gen đáp ứng stress hạn đã biết cho tới nay đƣợc xác định thuộc hầu hết các nhóm TF lớn của thực vật, trong đó đƣợc nghiên cứu nhiều nhất là các nhóm AP2/ERF, NAC, WRKY, MYB/MYC, bZIP hay ZF. 1.4. NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA LÚA BẰNG CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN THỰC VẬT Việc phát triển các giống lúa chịu hạn và giảm lƣợng nƣớc tiêu thụ trong sản xuất lúa gạo có ý nghĩa vô cùng to lớn để tăng sản lƣợng và đảm bảo an ninh lƣơng thực. Một hƣớng nghiên cứu phổ biến và rất đƣợc quan tâm hiện nay là tăng cƣờng biểu hiện các gen đáp ứng hoặc liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn trong cây lúa chuyển gen. Do cơ chế chống chịu hạn phức tạp của thực vật, việc sử dụng các gen điều hòa (mã hóa các protein tham gia vào mạng lƣới điều hòa đáp ứng stress) trong nghiên cứu chuyển gen tạo giống lúa chịu hạn thƣờng mang lại hiệu quả cao hơn so với các gen chức năng (mã hóa protein/ enzyme trực tiếp tham gia vào đáp úng chống chịu stress). Tuy nhiên, cho đến nay mới chỉ có một vài nghiên cứu chứng minh khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen trong điều kiện thử nghiệm trên đồng ruộng. Ở Việt Nam chƣa có một nghiên cứu hoàn chỉnh nào về các gen liên quan đến đáp ứng chống chịu stress ở thực vật, đặc biệt là nhóm gen mã hoá nhân tố phiên mã liên quan tới đáp ứng chống chịu hạn ở lúa. 6
Chƣơng 2. VẬT LIỆU & PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu Thƣ viện cDNA sơ cấp của lúa Oryza sativa L. xử lý điều kiện hạn và mặn ấp bởi Bộ môn Bệnh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp. Hạt lúa PB1 và hạt thuốc lá Nicotiana tabacum (L.) doTrung tâm Kỹ thuật Di truyền & Công nghệ sinh học Quốc tế (Ấn Độ) cung cấp. 2.1.2. Chủng vi sinh vật Chủng vi khuẩn E. coli DH5α đƣợc mua từ hãng Fermentas (Mỹ); chủng vi khuẩn E. coli XLOR, XL1-Blue MRF và phage “trợ giúp” đƣợc mua từ Công ty Agilent Technologies (Mỹ); chủng vi khuẩn E. coli Rosetta (DE3) khả biến đƣợc mua từ Công ty Merck Millipore (Mỹ); chủng vi khuẩn Agrobacterium LBA4404 khả biến, chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae YM4271 và AH109 đƣợc mua từ Công ty Clontech (Mỹ). 2.1.3. Vector và oligonucleotide Các vector pLacZi/JRC0332, pLacZi/JRC0528, pLacZi/JRC2606, pHISi/JRC0332, pHISi/JRC0528, pHISi/JRC2606 do nhóm nghiên cứu của Phạm Xuân Hội thiết kế và cung cấp; vector YEpGAP, pBI- Lip9, pBI-Ubi do nhóm nghiên cứu của Kazuko Yamaguchi- Shinozaki thiết kế và cung cấp; các vector pAD-GAL4, pGBKT7 đƣợc mua từ Công ty Clontech; vector pET28a đƣợc mua từ hãng Novagen, vector pRT101 do nhóm nghiên cứu của Reinhard Topfer thiết kế; vector pCAMBIA1301 đƣợc mua từ Công ty Marker Gene Technologies; vector pGEM-T đƣợc mua của hãng Promega. Các cặp sử dụng làm mồi oligonucleotide đầu dò 7
đƣợc đặt mua từ hãng Invitrogen (Mỹ) và Sigma (Mỹ). 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Xử lý mẫu thực vật theo phƣơng pháp của Qin (2007), Dubouzet (2003) và Tran (2004). - Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA - Nhân dòng gen OsNLI-IF vào vector pGEM-T - Thiết kế vector biểu hiện gen OsNLI-IF Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế vector pCAM-35S/OsNLI-IF Hình 2.3: Sơ đồ thiết kế vector pBI-Lip9 và pBI-Ubi - Sàng lọc gen từ thƣ viện cDNA bằng kỹ thuật lai phân tử trong tế bào nấm men. - Tạo kháng thể đa dòng kháng protein OsNLI-IF tái tổ hợp - Tạo cây chuyển gen biểu hiện OsNLI-IF 8
Chƣơng 3. KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 3.1. PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN CHỐNG CHỊU ĐIỀU KIỆN BẤT LỢI Ở LÚA Trong nghiên cứu đƣợc công bố năm 2003, Rabbani và cộng sự đã xác định đƣợc 72 gen biểu hiện cảm ứng với các điều kiện stress khác nhau ở lúa. Khi phân tích trình tự promoter của các gen này, hai motif (đoạn trình tự lặp lại) có trình tự là CCTCCTCC và CTCCAC đƣợc tìm thấy xuất hiện lặp lại nhiều lần trong vùng promoter của nhiều gen và đƣợc dự đoán là những yếu tố cis điều hòa biểu hiện gen trong điều kiện stress. Chúng tôi đã sử dụng hai đoạn DNA kích thƣớc 50 bp đƣợc tổng hợp dựa trên trình tự của hai promoter JRC0528 và JRC0332 có chứa đồng thời cả hai motif làm “mồi câu” trong thí nghiệm sàng lọc gen mã hoá nhân tố phiên mã từ thƣ viện cDNA bằng kỹ thuật Y1H. Bảng 3.2: Protein liên kết với đoạn DNA đích Protein liên kết JRC0332 Protein liên kết JRC0528 Protein Số KL Protein Số KL OsNLI-IF 3 OsNLI-IF 5 R2R3 typical-P-type 1 Protein họ Zinc Finger 1 Protein cảm ứng lạnh 1 Protein C3HC4-type ring finger 1 Nhân tố ức chế dịch mã EIF4D 1 Protein liên kết RNA 1 Dehydrogenase 1 Protein ribosomal 60S 1 Protein liên kết RNA 1 Protein giống methallothionein 1 Protein mang acyl 1 Carboxylase ribulose-bisphosphate 1 Protein liên kết RNA 1 Protein chuyển hóa lipid 1 Systeine synthase 1 Protein ƣu nhiệt 1 Protein ƣu nhiệt 1 Protein liên kết axit béo 1 Trình tự DNA không xác định 5 Trình tự DNA không xác định 4 Chúng tôi đã sàng lọc thƣ viện cDNA xử lý stress hạn và mặn của lúa và xác định đƣợc 37 dòng cDNA dƣơng tính, trong đó có 8 9
dòng mã hóa cho protein NLI-IF (Bảng 3.2). Tám dòng cDNA đều có chiều dài ~1850 bp, trong đó vùng ORF dài 1.320 bp mã hóa cho 439 axit amin, vùng không mã hóa đầu 5’ dài 311 bp, vùng không mã hóa đầu 3’ dài 219 bp. Gen OsNLI-IF sau đó đƣợc nhân bản bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu và nhân dòng vào vector pGEM-T. 3.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CHỨC NĂNG CỦA OsNLI-IF 3.2.1. Biểu hiện của OsNLI-IF trong các điều kiện stress Mức độ biểu hiện gen OsNLI-IF trong cây lúa đƣợc phân tích trong các điều kiện stress giả định, bao gồm mất nƣớc, hạn, mặn, lạnh, nhiệt độ cao và hormone ABA. Hình 3.14: Biểu hiện của OsNLI-IF trong điều kiện bất lợi. Ghi chú: (Hình trên) OsNLI-IF mRNA được phát hiện bằng đầu dò gắn phóng xạ P32; rRNA 18S được điện di trên gel agarose. (Hình dưới) Mức độ biểu hiện OsNLI-IF được xác định bằng Real-time RT-PCR với khuôn là mẫu RNA tách chiết từ mô thân & lá (cột màu xám) và mô rễ (cột màu đen); mức độ biểu hiện gen tại thời điểm chưa xử lý stress có giá trị bằng 1; gen actin được sử dụng làm gen nội chuẩn; giá trị thể hiện trên đồ thị là kết quả trung bình của 3 lần thí nghiệm. 10
Kết quả phân tích bằng kỹ thuật lai RNA và Real-time RT-PCR cho thấy OsNLI-IF tăng cƣờng biểu hiện bởi các yếu tố stress mặn, hạn, mất nƣớc, lạnh, nhiệt độ cao trong mô rễ và không cảm ứng biểu hiện với ABA (Hình 3.14). 3.2.2. Hoạt tính liên kết đặc hiệu DNA đích của OsNLI-IF Để chứng minh khả năng liên kết đặc hiệu DNA của protein OsNLI-IF, chúng tôi sử dụng kỹ thuật Y1H với hai đoạn DNA đích JRC0528 và JRC0332 đột biến (Hình 3.17A). Đoạn gen OsNLI-IF đƣợc ghép nối với trình tự mã hoá domain hoạt hoá phiên mã AD- GAL4 trên vector biểu hiện pAD-GAL4 và biến nạp vào tế bào nấm men chỉ thị YM4271. Hình 3.17: Khả năng liên kết DNA đặc hiệu của OsNLI-IF Ghi chú: (A) Trình tự các đoạn DNA đích nguyên bản (WT) và đột biến (MU). (B) Biểu hiện của gen chỉ thị trong tế bào nấm men: (i) sơ đồ bố trí thí nghiệm các chủng nấm men mang các cấu trúc khác nhau, (ĐC+): đối chứng dương, (ĐC-): đối chứng âm, (JRC0332-WT, JRC0528-WT, JRC0332-MU, JRC0528-MU): chủng nấm men chỉ thị mang các đoạn DNA đích JRC0332 hay JRC0528 được biến nạp vector pAD/OsNLI-IF; (ii) môi trường YPD; (iii) môi trường SD/-Leu/-Ura/-His; (iv) môi trường SD/-Leu/- Ura/-His có 3-AT 30 mM; (v) hoạt tính biến đổi cơ chất X-Gal của β- galactosidase. Kết quả đánh giá biểu hiện của gen chỉ thị HIS3 và lacZ cho thấy chỉ có tế bào nấm men tái tổ hợp mang một trong hai đoạn DNA đích 11
nguyên bản có thể sinh trƣởng đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc và thể hiện hoạt tính β-galactosidase (Hình 3.17B). Kết quả này chứng tỏ protein dung hợp AD-OsNLI-IF đã liên kết đặc hiệu với đoạn DNA chứa hai motif CCTCCTCC và CTCCAC và hoạt hoá quá trình phiên mã của gen chỉ thị. 3.2.3. Hoạt tính hoạt hóa phiên mã của OsNLI-IF Hoạt tính hoạt hóa phiên mã của OsNLI-IF đƣợc phân tích bằng kỹ thuật Y1H. Đoạn gen OsNLI-IF đƣợc ghép nối vào vector biểu hiện YEpGAP và biến nạp vào chủng tế bào nấm men chỉ thị YM4271. Hình 3.20: Hoạt tính hoạt hóa phiên mã của OsNLI-IF Ghi chú: (A) Sơ đồ bố trí thí nghiệm các chủng nấm men mang các cấu trúc khác nhau. (B) Môi trường YPD. (C) Môi trường SD/-Leu/-Ura/-His. (D) Môi trường SD/-Leu/-Ura/-His có 3-AT 30 mM. (E) Hoạt tính biến đổi cơ chất X-Gal của β-galactosidase. (ĐC+): đối chứng dương; (YM4271-WT): nấm men YM4271 nguyên bản; (OsNLI-IF): nấm men mang YEpGAP/OsNLI-IF; (JRC0332): nấm men mang pHis/JRC0332 + pLac/JRC0332; (Vector + JRC0332): nấm men mang pHis/JRC0332 + pLac/JRC0332 + YepGAP; (OsNLI-IF + JRC0332): nấm men mang pHis/JRC0332 + pLac/JRC0332 + YepGAP/OsNLI-IF. Kết quả thu đƣợc cho thấy chỉ có chủng nấm men mang đồng thời YEpGAP/OsNLI-IF và vector chỉ thị chứa đoạn DNA đích JRC0332 trong vùng điều khiển của gen HIS3 và lacZ có thể sinh trƣởng trên môi trƣờng chọn lọc và biến đổi cơ chất X-Gal để tạo thành màu xanh (Hình 3.20D & E). Kết quả này chứng tỏ protein OsNLI-IF đã tƣơng tác với đoạn DNA đích JRC0332 và hoạt động 12
nhƣ một nhân tố hoạt hoá quá trình phiên mã. 3.2.4. Nghiên cứu protein tƣơng tác với OsNLI-IF Protein tƣơng tác với OsNLI-IF đƣợc sàng lọc từ thƣ viện cDNA xử lý stress hạn và mặn của lúa, sử dụng kỹ thuật Y2H. Đoạn gen OsNLI-IF đƣợc ghép nối với trình tự mã hoá domain liên kết DNA BD-GAL4 trên vector biểu hiện pGBKT7 và biến nạp đồng thời cùng thƣ viện cDNA vào tế bào nấm men AH109 để thực hiện thí nghiệm sàng lọc gen. Sau khi sàng lọc các thể biến nạp, chúng tôi đã thu đƣợc tám dòng cDNA dƣơng tính, trong đó có hai dòng mã hóa cho protein ubiquitin, cho thấy có thể quá trình ubiquitin hóa là một trong những bƣớc biến đổi sau phiên mã của protein OsNLI-IF (Bảng 3.4). Bảng 3.4: Protein tƣơng tác OsNLI-IF sàng lọc từ thƣ viện Protein tƣơng tác OsNLI-IF Số khuẩn lạc Polyubiquitin 2 Protein kép chứa domain phosphatase 1 Protein liên kết kẽm, nhóm Alcohol dehydrogenase 1 Protein chƣa đƣợc nghiên cứu 1 Protein liên kết chlorophyll a/b nhóm I, tiền chất của 1 chloroplast Cyclophilin 2 1 U5 small nuclear ribonucleoprotein 200 kDa helicase 1 Nhƣ vậy, các thí nghiệm in vivo đã cho thấy OsNLI-IF là một nhân tố phiên mã đƣợc biểu hiện ở rễ dƣới điều kiện stress hạn, mặn, lạnh, nhiệt độ cao, mất nƣớc, có thể tƣơng tác với các vùng promoter chứa hai motif CCTCCTCC và CTCCAC, điều hòa quá trình phiên mã của gen đích và có thể liên quan tới quá trình ubiquitin hóa. 3.3. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN OsNLI-IF TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT 3.3.1. Thiết kế hệ vector chuyển gen pCAMBIA1301 Vector pCAMBIA1301 mang cấu trúc biểu hiện gen 35S:OsNLI- 13
IF:Nos đƣợc thiết kế theo sơ đồ trong hình 2.2, sử dụng vector pGEM/OsNLI-IF và vector trung gian pRT101 mang promoter 35S. Hình 3.28: Kiểm tra pCAM/OsNLI-IF-S và pCAM/OsNLI-IF-AS Ghi chú: (A) Vector pCAM/OsNLI-IF-S; (B) Vector pCAM/OsNLI-IF-AS. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb; giếng 1: PCR với cặp mồi EcoRI-NLI- Fw/XhoI-NLI-Rv; giếng 2: PCR với cặp mồi 35S-Fw/GUS-Rv; giếng 3(A): PCR với cặp mồi 35S-Fw/XhoI-NLI-Rv; giếng 3(B): PCR với cặp mồi 35S- Fw/EcoRI-NLI-Fw; giếng 4: đối chứng âm (không có DNA khuôn); giếng 5: sản phẩm cắt giới hạn bằng HindIII; giếng 6: vector nguyên bản; giếng 7: sản phẩm cắt giới hạn bằng EcoRI. Để khẳng định kết quả thu đƣợc, plasmid tái tổ hợp đƣợc tinh sạch từ các khuẩn lạc dƣơng tính và kiểm tra bằng PCR với các cặp mồi đặc hiệu khác nhau và bằng enzyme cắt giới hạn HindIII và EcoRI. Kết quả điện di sản phẩm PCR và cắt giới hạn cho thấy các băng DNA thu đƣợc phù hợp với kich thƣớc tính toán lý thuyết (Hình 3.28), chứng tỏ chúng tôi đã thiết kế thành công vector biểu hiện pCAMBIA1301 mang trình tự có nghĩa (sense) hay đối nghĩa (antisense) của gen OsNLI-IF, đặt dƣới sự điều khiển của promoter 35S. 3.3.2. Thiết kế hệ vector chuyển gen pBI101 Để thiết kế hệ vector biểu hiện pBI101, gen OsNLI-IF đƣợc nhân bản bằng phản ứng PCR và ghép nối lần lƣợt vào hai vector pBI-Lip9 và pBI-Ubi đã đƣợc xử lý bằng enzyme cắt đầu bằng SmaI (Hình 2.3). 14
Hình 3.31: Kiểm tra pBI-Ubi/OsNLI-IF và pBI-Ubi/OsNLI-IF Ghi chú: (A) Giếng 1 – 3: khuôn là pBI-Ubi/OsNLI-IF; giếng 4 – 6: khuôn là pBI-Lip9/OsNLI-IF; giếng 1: PCR với cặp mồi Ubi-Fw/SmaI-NLI-Fw; giếng 2 & 5: PCR với cặp mồi SmaI-NLI-Fw/SmaI-NLI-Rv; giếng 3: PCR với cặp mồi Ubi-Fw/SmaI-NLI-Rv; giếng 4: PCR với cặp mồi Lip9-Fw/ SmaI-NLI-Fw; giếng 6: PCR với cặp mồi Lip9-Fw/SmaI-NLI-Rv. (B) Giếng 1 & 2: pBI-Ubi/OsNLI-IF; giếng 3 & 4: pBI-Lip9/OsNLI-IF; giếng 1 & 3: sản phẩm cắt giới hạn bằng SmaI; giếng 2 & 4: vector nguyên bản. Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb. Để khẳng định kết quả thu đƣợc, plasmid tái tổ hợp cũng đƣợc tinh sạch từ các khuẩn lạc dƣơng tính và kiểm tra lần lƣợt bằng PCR với các cặp mồi đặc hiệu khác nhau, cắt giới hạn bằng enzyme SmaI và giải trình tự gen. Kết quả kiểm tra cho thấy trình tự mã hóa cho nhân tố phiên mã OsNLI-IF đã đƣợc ghép nối thành công vào hệ vector biểu hiện pBI101, đặt dƣới sự điều khiển của 2 promoter Lip9 và Ubiquitin (Hình 3.31). 3.4. NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN OsNLI-IF TRONG CÂY CHUYỂN GEN 3.4.1. Nghiên cứu biểu hiện OsNLI-IF trong cây thuốc lá Thí nghiệm biến nạp cấu trúc 35S:OsNLI-IF và vector pCAMBIA1301 không mang gen đích vào cây thuốc lá đã đƣợc tiến hành dựa trên phƣơng pháp chuyển nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium. Dựa vào kết quả phân tích các dòng thuốc lá T1 bằng phƣơng pháp nuôi cấy trên môi trƣờng có hygromycin và phƣơng 15
pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu của cấu trúc biểu hiện gen, năm dòng (TL1, TL3, TL4, TL7, TL8) mang cấu trúc 35S:OsNLI-IF và bốn dòng (ĐC2, ĐC3, ĐC8, ĐC9) mang cấu trúc pCAMBIA1301 đã đƣợc chọn để tiếp tục phân tích (Bảng 3.7). Bảng 3.7: Kết quả phân tích PCR các dòng thuốc lá T1. Dòng Số cây Số cây có kết quả PCR dƣơng tính cây kiểm tra Mồi Actin Mồi Hygromycin Mồi GUS Mồi OsNLI-IF TL1 20 20/20 18/20 18/20 18/20 TL3 20 20/20 15/20 15/20 15/20 TL4 20 20/20 20/20 20/20 20/20 TL7 20 20/20 17/20 17/20 17/20 TL8 20 20/20 12/20 12/20 12/20 TL10 20 20/20 18/20 18/20 18/20 ĐC2 10 10/10 8/10 8/10 0/10 ĐC3 10 10/10 6/10 6/10 0/10 ĐC8 10 10/10 8/10 8/10 0/10 ĐC9 10 10/10 10/10 10/10 0/10 TL: Dòng thuốc lá được chuyển cấu trúc pCAM-35S/OsNLI-IF. ĐC: Dòng thuốc lá được chuyển cấu trúc pCAMBIA1301. Sự có mặt của protein OsNLI-IF trong các dòng thuốc lá chuyển gen T1 đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật lai thẩm tách miễn dịch, sử dụng kháng thể đa dòng của chuột kháng OsNLI-IF (tạo từ protein OsNLI- IF tái tổ hợp). Kết quả thu đƣợc cho thấy dòng TL1 và TL8 biểu hiện OsNLI-IF mạnh nhất; dòng TL3 và TL7 biểu hiện vừa phải, dòng TL10 biểu hiện thấp nhất, dòng TL4 và các dòng thuốc lá đối chứng hoàn toàn không biểu hiện protein đích (Hình 3.39). Nhƣ vậy, chúng tôi đã chuyển thành công cấu trúc 35S:OsNLI-IF vào thuốc lá và thu đƣợc các dòng cây T1 có biểu hiện protein đích OsNLI-IF. Ba dòng thuốc lá TL1, TL4 và TL10 đại diện cho ba mức độ biểu hiện gen đích OsNLI-IF đƣợc chọn để phân tích khả năng sinh trƣởng 16
và chống chịu stress hạn. Kết quả quan sát các cây thuốc lá ở giai đoạn bốn tuần tuổi cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về hình thái và tốc độ sinh trƣởng giữa các cây thuốc lá đối chứng và cây thuốc lá chuyển gen đích, tuy nhiên tốc độ sinh trƣởng của cây chuyển gen tỉ lệ nghịch với mức độ biểu hiện của gen OsNLI-IF (Hình 3.40). Hình 3.39: Biểu hiện của OsNLI-IF trong cây thuốc lá T1 Ghi chú: (A) Giếng M: thang chuẩn protein; giếng 1 – 3 & 5 – 7: dịch chiết protein tổng số của các dòng thuốc lá TL1, TL3, TL4, TL7, TL8, TL10; giếng 4: protein OsNLI-IF tái tổ hợp (P); giếng 8: dịch chiết protein tổng số của dòng thuốc lá ĐC8 (V); giếng 9: dịch chiết protein tổng số của cây thuốc lá không chuyển gen (WT). (B) Đồ thị so sánh hàm lượng protein OsNLI-IF tương quan giữa các dòng cây; hàm lượng OsNLI-IF trong dịch chiết protein tổng số của dòng TL10 có giá trị bằng 1. Hình 3.40: Khả năng sinh trƣởng của các cây thuốc lá T1 Ghi chú: Hình thái của các dòng thuốc lá sinh trưởng ở giai đoạn 4 tuần tuổi. (WT) cây thuốc lá dại; (V) dòng thuốc lá mang cấu trúc pCAMBIA1301; (TL1, TL4, TL10) dòng thuốc lá mang cấu trúc 35S:OsNLI- IF:Nos. 17
Để đánh giá khả năng chống chịu stress hạn của các dòng thuốc lá chuyển gen, các cây thuốc chuyển gen T1 đƣợc trồng trong điều kiện stress hạn giả định (không tƣới nƣớc) trong một tháng, sau đó tƣới nƣớc trở lại và quan sát khả năng phục hồi. Kết quả trình bày trong bảng 3.8 cho thấy dòng TL10 biểu hiện protein OsNLI-IF ở mức độ thấp có khả năng chống chịu hạn cao nhất (75% cây phục hồi). Khả năng chịu hạn của dòng thuốc lá TL1 (có gen OsNLI-IF biểu hiện mạnh) thấp hơn so với dòng thuốc lá TL10 (56% cây phục hồi). Đặc biệt, tỉ lệ sống sót của các cây thuốc lá có biểu hiện OsNLI- IF cao hơn rõ rệt so với dòng thuốc lá đối chứng không chuyển gen (16%) và dòng thuốc lá đƣợc chuyển cấu trúc vector pCAMBIA1301 không mang gen (dòng ĐC2) hay dòng thuốc lá đƣợc chuyển cấu trúc 35S:OsNLI-IF nhƣng không biểu hiện gen đích. Bảng 3.8: Tỉ lệ phục hồi sau xử lý hạn của các dòng thuốc lá. Số cây sống sót/Số cây kiểm tra Cấu trúc biểu Dòng thuốc lá hiện gen Tƣới nƣớc1 Không tƣới nƣớc2 35/35 6/36 Đối chứng Không chuyển gen (100%) (16%) 36/36 3/36 ĐC2 pCAMBIA1301 (100%) (8%) 35/36 20/36 TL1 35S:OsNLI-IF (97%) `(56%) 36/36 8/36 TL4 35S:OsNLI-IF (100%) (22%) 36/36 27/36 TL10 35S:OsNLI-IF (100%) (75%) Ghi chú:(1)Cây thuốc lá được trồng trong chậu đất và tưới nước hàng ngày; (2)Cây thuốc lá được trồng trong chậu đất và không tưới nước liên tục trong 1 tháng, sau đó tưới nước trở lại liên tục trong 3 ngày. 18