Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoàn thiện bộ kit PCR 16 gen gắn huỳnh quang ứng dụng trong nghiên cứu dân tộc học và giám định gen

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI<br /> TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN<br /> <br /> TRẦN TRỌNG HỘI<br /> <br /> NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN BỘ KIT PCR 16 GEN GẮN<br /> HUỲNH QUANG ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU DÂN<br /> TỘC HỌC VÀ GIÁM ĐỊNH GEN<br /> <br /> Chuyên ngành : Di truyền học<br /> Mã số : 62420121<br /> <br /> DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC<br /> <br /> 1<br /> <br /> Hà Nội - 2015<br /> <br /> Công trình được hoàn thành tại:<br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN<br /> ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI<br /> <br /> Người hướng dẫn khoa học:<br /> 1. PGS.TS. Trịnh Đình Đạt<br /> 2. PGS.TS. Nguyễn Văn Hà<br /> <br /> Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .<br /> Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .<br /> Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .<br /> <br /> Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia<br /> chấm luận án tiến sĩ họp tại . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .<br /> . . . . . . .vào hồi<br /> <br /> giờ<br /> <br /> ngày<br /> <br /> 2<br /> <br /> tháng<br /> <br /> năm 20...<br /> <br /> MỞ ĐẦU<br /> Ở mức độ di truyền, người ta đã ước tính được khoảng 99,7% hệ gen người là giống<br /> nhau, sự khác biệt giữa hai cá thể được tìm thấy trong 0,3% của toàn bộ ADN còn lại trong cơ<br /> thể của mỗi người [38]. Hệ gen người có rất nhiều các trình tự ADN lặp lại, trong đó có các<br /> trình tự ngắn lặp lại liên tiếp (STR) hay còn được gọi là trình tự lặp lại đơn giản (SSR) hoặc vi<br /> vệ tinh (microsatellite). Các STR này thường có kích thước ngắn khoảng từ 100-400 bp, mang<br /> các đơn vị lặp lại, mỗi đơn vị lặp thường có 2-7 bp và được tìm thấy ở vùng ADN không mã<br /> hóa. Chúng nằm rải rác trên tất cả 22 cặp NST thường, cũng như trên cặp NST giới tính X và<br /> Y. Các STR trên NST thường có tính đa hình cao hơn so với các STR trên NST Y (Y-STR) do<br /> thiếu sự tái tổ hợp trên NST này. Chúng có một vai trò quan trọng trong nghiên cứu di truyền<br /> quần thể và phân tích ADN nhận dạng cá thể người (giám định ADN) [67].<br /> Vào những năm 1990, các locus STR đầu tiên được sử dụng trong các PTN phân tích<br /> ADN nhận dạng cá thể người. Ngày nay, kỹ thuật phân tích STR là một công cụ không thể<br /> thiếu được trong các PTN phân tích ADN hình sự [50, 66, 123]. Hiện nay, có khoảng hơn<br /> 20.000 locus STR lặp bốn nucleotide (có 4bp trong mỗi đơn vị lặp lại) được xác định có trong<br /> hệ gen người [44] và bộ CODIS 13 locus STR lõi do FBI (Mỹ) lựa chọn là bộ locus STR trên<br /> NST thường được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay [67].<br /> Mặt khác, công nghệ phân tích STR trên thế giới phát triển cũng rất đa dạng, bao gồm:<br /> Điện di gel polyacrlamide biến tính-nhuộm bạc [27, 99]; đánh dấu huỳnh quang-điện di mao<br /> quản [35, 85]; điện di mao quản vi mạch sử dụng microchip [74, 76, 101]; phân tích bằng khối<br /> phổ (mass spectrometry) [38, 39] và công nghệ pyrosequencing (giải trình tự bằng tổng hợp)<br /> [53, 56, 100]. Tuy nhiên, kỹ thuật đánh dấu huỳnh quang-điện di mao quản là công nghệ đã<br /> được nghiên cứu hoàn thiện và được sử dụng rộng rãi trong các PTN phân tích ADN hình sự<br /> trên thế giới với những ưu điểm: độ nhạy và chính xác cao; thời gian phân tích mẫu nhanh<br /> (được tính bằng phút); việc phân tích mẫu được thực hiện một cách tự động và có thể phân tích<br /> với quy mô số lượng mẫu lớn (xây dựng tàng thư ADN) [35].<br /> Ở Việt Nam, việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích STR trong nhận dạng cá thể<br /> người cũng đã được phát triển mạnh mẽ từ những năm 2000 đến nay với những nghiên cứu về<br /> tối ưu điều kiện PCR đa mồi cho các locus STR (từ 2- 4 locus), xây dựng thang alen cho các<br /> locus STR (2-3 locus), chế tạo các bộ kit PCR (3-4 locus STR) và sử dụng kỹ thuật điện di gel<br /> polyacrylamide biến tính-nhuộm bạc để phát hiện các alen STR [1-3, 7, 9-12]. Bên cạnh đó,<br /> việc nghiên cứu khảo sát tần suất alen của các locus STR cũng được thực hiện trên dân tộc<br /> người Mường (N=107, với ba locus D5S818-D13S317-D7S820) [5] và người Kinh [8, 13]. Tuy<br /> nhiên, kết quả nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức độ nghiên cứu thăm dò ban đầu, các dữ liệu<br /> tần suất alen và các chỉ số thống kê nhận dạng cá thể người chưa phản ánh đầy đủ cho các quần<br /> thể nghiên cứu. Mặt khác, công nghệ phân tách và phát hiện các alen STR được sử dụng trong<br /> các nghiên cứu này chủ yếu là dùng kỹ thuật điện di gel polyacrylamide biến tính-nhuộm bạc<br /> còn có nhiều mặt hạn chế như: Độ nhạy và chính xác chưa cao; thời gian phân tích mẫu lâu<br /> 3<br /> <br /> (được tính bằng ngày); việc phân tích mẫu không thực hiện tự động được và kết quả phân tích<br /> mẫu phụ thuộc rất nhiều vào thao tác cũng như kinh nghiệm của người làm thí nghiệm.<br /> Xuất phát từ những lý do trên, việc thực hiện luận án “Nghiên cứu hoàn thiện bộ kit<br /> PCR 16 gen gắn huỳnh quang ứng dụng trong nghiên cứu dân tộc học và giám định gen” là<br /> hết sức có ý nghĩa và mang tính cấp thiết.<br />  Mục tiêu nghiên cứu<br /> 1. Chế tạo bộ kit PCR 16 locus (gen) gắn huỳnh quang trên hệ thống điện di mao quản.<br /> 2. Ứng dụng trong nghiên cứu dân tộc học và giám định ADN.<br />  Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu<br /> Nhóm đối tượng nghiên cứu chính là các cá thể người thuộc ba dân tộc của Việt<br /> Nam là: người Kinh (N=300) sống ở khu vực Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh; người<br /> Mường (N=104) sống ở tỉnh Hòa Bình và người Khmer (N=110) sống tỉnh Sóc Trăng.<br />  Nội dung nghiên cứu<br /> 1. Nghiên cứu chế tạo bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trên hệ thống điện di mao<br /> quản.<br /> 2. Ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trong nghiên cứu di truyền quần thể ở<br /> ba dân tộc người Việt Nam (người Kinh, người Mường và người Khmer).<br /> 3. Ứng dụng bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trong phân tích ADN nhận dạng cá thể<br /> người (giám định ADN) tại Việt Nam.<br />  Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án<br /> 1. Bổ sung dữ liệu tần suất alen 15 locus STR trên NST thường (D3S1358, TH01, D21S11,<br /> D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, vWA,<br /> D8S1179, TPOX và FGA) của người Kinh (N=300) sống ở khu vực Hà Nội và thành<br /> phố Hồ Chí Minh; người Mường (N=104) sống ở tỉnh Hòa Bình và người Khmer<br /> (N=110) sống tỉnh Sóc Trăng vào CSDL STR của người Việt Nam phục vụ cho công tác<br /> nghiên cứu di truyền quần thể và giám định ADN tại Việt Nam.<br /> 2. Tạo ra được các bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh quang trên hệ thống điện di mao quản,<br /> giúp cho chủ động về công nghệ, đáp ứng các nhu cầu về phân tích ADN nhận dạng cá<br /> thể người, xác định huyết thống, làm thẻ ADN cá nhân, xây dựng CSDL tàng thư ADN,<br /> nghiên cứu di truyền quần thể...ở Việt Nam.<br />  Điểm mới của luận án<br /> Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về việc tối ưu điều kiện PCR đa mồi cho 16<br /> cặp mồi gắn huỳnh quang và chế tạo thành công bộ kit PCR 16 locus gắn huỳnh trên hệ<br /> thống điện di mao quản. Bộ kit mới này, đã được ứng dụng thành công ở hai lĩnh vực<br /> nghiên cứu chính. Đó là:<br /> 1. Nghiên cứu di truyền quần thể ở người Kinh (N=300) sống ở khu vực Hà Nội và thành<br /> phố Hồ Chí Minh, thu được 173 alen/15 locus; người Mường (N=104) sống ở tỉnh Hòa<br /> Bình, thu được 132 alen/15 locus và người Khmer (N=110) sống tỉnh Sóc Trăng, thu<br /> được 145 alen/15 locus. Kết quả nghiên cứu này đã bổ sung vào CSDL 15 locus STR<br /> nghiên cứu ở quần thể người Việt Nam là 32 alen mới so với kết quả nghiên cứu trước<br /> 4<br /> <br /> đây của tác giả Shimada và các đồng nghiệp [103]. Kết quả nghiên cứu cũng đã xây<br /> dựng được cây phả hệ di truyền theo phương pháp neighbor-joining bằng phần mềm<br /> POPTREE 2 [109] dựa trên dữ liệu tần suất alen của 13 locus thuộc bộ CODIS 13 locus<br /> STR lõi (do FBI-Mỹ lựa chọn) của 3 quần thể nghiên cứu và 14 quần thể tham khảo.<br /> Cây phả hệ này, đã phản ánh được mối quan hệ di truyền giữa 3 quần thể nghiên cứu với<br /> 14 quần thể khác nhau trên thế giới. Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra được người Kinh và<br /> người Mường có quan hệ gần gũi với nhau hơn so với người Khmer dựa trên giá trị<br /> khoảng cách di truyền chuẩn của Nei (DST).<br /> 2. Phân tích ADN nhận dạng cá thể người (giám định ADN) tại Việt Nam bằng việc truy<br /> nguyên cá thể người từ các dấu vết sinh phẩm thu được tại hiện trường của một số vụ án<br /> (dấu vết máu và tinh trùng) với độ tin cậy cao (≥ 99,999999999999999985%); truy tìm<br /> tung tích nạn nhân từ mẫu răng cửa của tử thi nạn nhân qua mối quan hệ huyết thống<br /> mẹ-con với xác suất quan hệ là 99,999%; đã xây dựng được 9/10 hồ sơ ADN cá nhân<br /> của 10 đối tượng cần kiểm soát an ninh (KSAN) và đã làm được 1.000 thẻ ADN cá nhân<br /> thử nghiệm phục vụ công tác an ninh và dân sinh.<br /> <br /> CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU<br /> 1.1. Các locus STR sử dụng trong nghiên cứu di truyền quần thể và phân tích ADN hình<br /> sự<br /> Ngày nay, người ta đã phát hiện ra trong hệ gen người có chứa rất nhiều trình tự ADN lặp<br /> lại. Những trình tự lặp lại này thường nằm giữa các gen, chúng có thể khác nhau về kích thước<br /> ở các cá thể khác nhau mà không ảnh hưởng đến sức khỏe di truyền của cá thể đó [38].<br /> Các trình tự ngắn lặp lại liên tiếp (STR) cũng được tìm thấy trong hệ gen người. Các STR<br /> này đã trở thành các marker di truyền được sử dụng phổ biến hơn trong nghiên cứu di truyền<br /> quần thể và phân tích ADN hình sự vì chúng dễ dàng được nhân bội để phân tích bằng kỹ thuật<br /> PCR đa mồi [38].<br /> Các tiêu chí để lựa chọn các locus STR sử dụng trong phân tích ADN hình sự bao gồm<br /> [62, 45]:<br /> - Tính dị hợp tử được cao (≥ 70 %);<br /> - Có vị trí riêng biệt trên các NST khác nhau;<br /> - Có khả năng kết hợp với các locus khác để tạo thành các bộ phức nhiều locus<br /> (multiplex);<br /> - Có tỷ lệ stutter thấp (