Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu một số biến đổi di truyền và mối liên quan với đặc điểm lâm sàng, kết quả điều trị trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh tại bệnh viện nhi Trung ương

Chia sẻ: Acacia2510 _Acacia2510 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

12
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận án là phát hiện một số biến đổi di truyền trên bệnh nhân nhi mắc bệnh u nguyên bào thần kinh. Xác định sự liên quan giữa các biến đổi di truyền với một số yếu tố tiên lượng và định hướng điều trị UNBTK.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu một số biến đổi di truyền và mối liên quan với đặc điểm lâm sàng, kết quả điều trị trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh tại bệnh viện nhi Trung ương

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _______________________ Vũ Đình Quang NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN VÀ MỐI TƢƠNG QUAN VỚI ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, KẾT QUẢ ĐIỀU TRỊ TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62420121 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2018
Công trình được hoàn thành tại trường Đại học khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân 2. TS. BS. Phùng Tuyết Lan Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp tại . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ................. vào hồi giờ ngày tháng năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội
MỞ ĐẦU U nguyên bảo thần kinh (UNBTK) là một khối u chủ yếu xảy ra ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ với tỷ lệ khoảng 6% các dạng ung thư nhi. Đây là dạng ung thư có biểu hiện lâm sàng đa dạng phụ thuộc vào các đặc điểm sinh học và di truyền. Có một số biến đổi gen và nhiễm sắc thể đặc (NST) hiệu cho UNBTK như khuếch đại gen MYCN hay các biến đổi bộ NST. Các thông tin di truyền này được các bác sĩ lâm sàng sử dụng để phân nhóm bệnh nhân, lựa chọn phác đồ tối ưu (giảm lượng hóa chất, điều trị đích…), tiên lượng và theo dõi trong và sau điều trị để đạt được kết quả điều trị tốt nhất cho từng bệnh nhân. Đây chính là xu hướng cá nhân hóa trong điều trị ung thư hiện đại. Tại Việt Nam, việc sử dụng các công cụ di truyền để phát hiện các biến đổi ở mức độ NST và gen cho UNBTK còn rất hạn chế. Do vậy kết quả điều trị thành công thường không cao so với thế giới. Xuất phát từ yêu cầu lâm sàng thực tiễn như vậy, đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu một số biến đổi di truyền và mối liên quan với đặc điểm lâm sàng, kết quả điều trị trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh tại bệnh viện nhi Trung ương” được tiến hành với hai mục tiêu sau: 1. Phát hiện một số biến đổi di truyền trên bệnh nhân nhi mắc bệnh u nguyên bào thần kinh. 2. Xác định sự liên quan giữa các biến đổi di truyền với một số yếu tố tiên lượng và định hướng điều trị UNBTK. Nội dung nghiên cứu 1. Nghiên cứu một số biến đổi di truyền của bệnh u NBTK - Phát hiện khuếch đại gen MYCN trên tất cả các bệnh nhân UNBTK bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ. 1
- Phát hiện biến đổi NST số 2 và NST số 17 trên một số bệnh nhân UNBTK nguy cơ thấp bằng kỹ thuật MLPA. - Phát hiện biến đổi bộ NST trên một số bệnh nhân UNBTK nguy cơ thấp bằng lai so sánh hệ gen. 2. Nghiên cứu sự liên quan giữa khuếch đại gen MYCN với tuổi chẩn đoán, giới tính, giai đoạn bệnh, nồng độ VMA, HVA, LDH, trạng thái biệt hóa của tế bào và tiên lượng mô bệnh học. 3. Sử dụng kết quả phân tích biến đổi di truyền trong định hướng điều trị bệnh UNBTK: phân nhóm nguy cơ theo hướng dẫn của tổ chức u NBTK quốc tế và định hướng điều trị tối ưu cho bệnh nhân theo phác đồ SIOPEN. Tính mới của luận án - Các biến đổi di truyền có giá trị tiên lượng trên khối UNBTK được xác định bằng các kỹ thuật di truyền hiện đại. Sự khuếch đại gen MYCN, được phát hiện bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ. Một số bệnh nhân không khuếch đại gen MYCN lần đầu tiên được đánh giá các biến đổi NST bằng kỹ thuật MLPA và kỹ thuật lai so sánh hệ gen. - Các đặc điểm về di truyền của khối u NBTK được sử dụng vào việc định hướng điều trị cho các bệnh nhân u NBTK. Nhóm bệnh nhân có khuếch đại gen MYCN được điều trị theo phác đồ nguy cơ trung bình hoặc cao, tùy thuộc vào giai đoạn bệnh. Các bệnh nhân không có khuếch đại gen MYCN nguy cơ thấp, kết quả phân tích bộ NST là yếu tố quan trọng trong việc quyết định điều trị hóa chất hay chỉ cần theo dõi định kỳ. 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về UNBTK UNBTK là dạng ung thư phổ biến nhất trong năm đầu tiên của cuộc đời. Tỷ lệ mắc mới là 10,2 ca trên 1 triệu trẻ em dưới 15 tuổi với tuổi chẩn đoán trung bình khoảng 18 tháng. Khoảng 8% các khối UNBTK có tính chất gia đình. Đó thường là các khối u có tuổi chẩn đoán sớm (9 tháng) và có các đột biến gen ALK và/hoặc PHOX2B di truyền từ bố mẹ Các biểu hiện lâm sàng của UNBTK rất đa dạng và kịch tính phụ thuộc vào vị trí u tiên phát và các biểu hiện di căn. Một mặt, UNBTK giải thích cho trạng thái bệnh và tỷ lệ tử vong không cân đối giữa các loại ung thư trẻ em; mặt khác nó biểu hiện sự thoái triển tự phát và hoàn toàn cao nhất trong tất cả các loại ung thư của con người. Các khối UNBTK gồm có 2 thành phần tế bào là các NBTK và các tế bào đệm Schwann, ở đó thành phần mô đệm Schwann chiếm dưới 50% toàn bộ khối u. Tùy thuộc vào trạng thái biệt hóa của tế bào, UNBTK được chia làm 3 nhóm là chưa biệt hóa (2-3%), ít biệt hóa (65-75%) và đang biệt hóa (5%). Ngoài ra có 4-5% UNBTK không xếp loại được. Căn cứ vào tuổi chẩn đoán, mức độ biệt hóa của khối u, chỉ số nhân chia/nhân tan, và nốt canxi hóa, Hiệp hội Giải phẫu bệnh u NBTK Quốc tế chia u NBTK thành 2 nhóm tiên lượng là mô bệnh học thuận lợi và mô bệnh học không thuận lợi. 2. Một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng UNBTK 2.1 Một số đặc điểm lâm sàng 3
UNBTK là dạng khối u có nguồn gốc phôi bào của hệ thần kinh giao cảm. Chính vì thế, u NBTK thường xảy ra ở trẻ nhỏ, và xuất hiện ở nhiều vị trí khác nhau như cổ, ngực, bụng và tiểu khung. Tế bào UNBTK hoặc theo con đường bạch huyết di căn vào hạch lympho khu vực hay hạch xa, hoặc theo đường máu di căn vào tủy xương, xương, gan, da. Một số trường hợp tế bào di căn vào hốc mắt/sọ gây lồi mắt hoặc khối u ở đầu. Các phương pháp chẩn đoán hình ảnh cho phép khảo sát khối u nguyên phát để đánh giá khả năng phẫu thuật cắt bỏ; phát hiện di căn xa để phân loại giai đoạn bệnh; hướng dẫn cho thủ thuật sinh thiết khối u bằng kim nhỏ; và là công cụ theo dõi, đánh giá tiến triển bệnh trong quá trình điều trị. Một trong những yếu tố tiên lượng đầu tiên của UNBK là tuổi chẩn đoán. Trong khi bệnh nhân dưới 1 tuổi có tiên lượng tốt, các bệnh nhân có tuổi chẩn đoán lớn hơn lại có nhiều đặc điểm sinh học không thuận lợi, làm cho bệnh có tiên lượng xấu. Các khối UNBTK được chia thành 2 nhóm lớn là giai đoạn khu trú và giai đoạn di căn. Theo hệ thống phân loại giai đoạn UNBTK theo nhóm nguy cơ, giai đoạn khu trú là L1 và L2, còn giai đoạn di căn là M và Ms. Giai đoạn Ms gặp ở các bệnh nhân bệnh nhân nhỏ hơn 12 tháng, có khối u di căn đến gan, tủy xương và da. Điểm đặc biệt ở đây là khả năng thoái triển ngẫu nhiên dù khối u tiên phát có kích thước lớn. 2.2. Một số đặc điểm cận lâm sàng Các tế bào UNBTK đều có rối loạn chuyển hóa catecholamine, làm tăng nồng độ các chất VMA và HVA trong nước tiểu. Chính vì 4
vậy, xét nghiệm VMA, HVA niệu là một xét nghiệm cần thiết cho chẩn đoán và theo dõi tiến triển bệnh UNBTK. Phần lớn bệnh nhân nhi có khối UNBTK khu trú có nồng độ LDH bình thường khi chẩn đoán; trong khi đó nồng độ LDH lại tăng cao ở các bệnh nhân giai đoạn di căn, phản ánh tế bào u phát triển nhanh và khối u nhiều tế bào ác tính, là dấu ấn phân loại các bệnh nhân nguy cơ cao. 3. Các đặc điểm di truyền bệnh UNBTK Nhiều đặc điểm di truyền của u NBTK như sự khuếch đại gen MYCN hay các bất thường số lượng, cấu trúc NST, hiện nay đã được xác định là có sự liên quan với biểu hiện lâm sàng và tiên lượng bệnh. 3.1. Bất thường số lượng NST Bất thường số lượng NST là một dấu ấn di truyền có ý nghĩa tiên lượng ở nhóm bệnh nhân ít hơn 1 tuổi. Ở đó, các khối u có bộ NST gần lưỡng bội có tiên lượng thuận lợi hơn so với các khối u gần tam bội. Việc xác định thể bội của khối u hiện nay được xác định gián tiếp thông qua chỉ số DNA bằng hệ thống đo đạc tế bào theo dòng chảy. 3.2. Bất thường cấu trúc NST Các bất thường cấu trúc ở UNBTK có nhiều ý nghĩa hơn và thường là tiên lượng xấu cho bệnh nhân. Thêm đoạn NST số 17 là bất thường cấu trúc NST đầu tiên và nhiều nhất được tìm thấy trên các bệnh nhân UNBTK (70-90% số ca). Các nghiên cứu cho thấy sự có mặt của một vùng vật chất di truyền ít nhất là 25Mb được thêm vào cánh dài nhiễm sắc thể 17 tại 5
vị trí 17q21-qter, và đó là kết quả của chuyển đoạn tương hỗ không cân bằng. Đột biến thêm cánh dài NST số 17 có quan hệ chặt chẽ với các khối u nguy cơ xấu như giai đoạn bệnh muộn, tuổi chẩn đoán trên 1 tuổi, cùng với mất đoạn 1p, khuếch đại gen MYCN và có kết quả điều trị kém. Giống như thêm đoạn 17q, mất đoạn NST số 1, từ vị trí 1p22 đến 1p36, có tỷ lệ cao trong bệnh UNBTK ở các khối u không thể phẫu thuật và di căn, kết quả điều trị kém. Hơn nữa, mất đoạn cánh ngắn NST số 1 thường đi kèm với khuếch đại gen MYCN (62%). Trạng thái vùng 1p36 này có ý nghĩa tiên lượng về tiến triển của bệnh ở nhóm nguy cơ thấp. Mất đoạn 1p hay gặp ở bệnh nhân tiên lượng xấu do một vài gen ức chế khối u có thể nằm trên vùng này. Mất đoạn NST số 11 được tìm thấy ở khoảng 41% khối u NBTK, tại vị trí 11q23.3. Biến đổi di truyền này luôn xuất hiện cùng các dấu ấn xấu của bệnh (tuổi chẩn đoán trên 1 tuổi, giai đoạn 4, mô bệnh học không thuận lợi), và gần như không đi kèm với khuếch đại gen MYCN. Về ý nghĩa lâm sàng, mất đoạn cánh dài NST số 11 là mất đoạn phổ biến nhất ở các khối UNBTK tiên phát, và là một dấu ấn cho tiên lượng xấu của bệnh độc lập với khuếch đại gen MYCN. Mất đoạn cánh dài NST số 14 cũng là một bất thường hay gặp trong các khối UNBTK. Khoảng 22% số ca có mất đoạn tại vị trí 14q23-qter. Mất đoạn 14q cho thấy sự liên hệ chặt chẽ với mất đoạn 11q trên các ca bệnh không có khuếch đại gen MYCN ở tất cả các nhóm nguy cơ. 6
3.3. Khuếch đại gen MYCN Một số khối UNBTK có đặc trưng về mặt di truyền tế bào là xuất hiện sự khuếch đại gen MYCN dưới dạng nhiều đoạn kép ngắn chất nhiễm sắc (DM) nằm ngoài bộ NST hoặc vùng bắt màu đồng nhất (HSR) trên 1 NST nào đó. Trạng thái biểu hiện của MYCN là một đặc điểm ổn định trong hệ gen UNBTK, và số lượng bản sao gen này là không thay đổi trong quá trình phát triển của khối u, giữa các vùng khác nhau của khối u, cũng như giữa khối u tiên phát và các khối di căn. MYCN là một gen tiền ung thư nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 2, ở vị trí 2p24. Gen MYCN được biểu hiện ở giai đoạn tiền làm tổ và giữ vai trò thiết yếu trong sự phát triển hoàn toàn của hệ thống thần kinh. Trong bệnh UNBTK, khuếch đại gen MYCN thường đi kèm với các khối u ở giai đoạn muộn, ác tính cao. Trong môi trường nuôi cấy, các tế bào ung thư mang khuếch đại gen có khả năng phát triển không kiểm soát và di căn cao, thông qua sự tăng cường tổng hợp DNA và ngăn chặn sự thoát ra khỏi chu trình tế bào cũng như sự biệt hóa tế bào thần kinh. Chỉ 5% bệnh nhân UNBTK có khuếch đại gen MYCN có thời gian sống không bệnh hơn 18 tháng, trong khi con số này ở các bệnh nhân không khuếch đại gen là 70%. Mặt khác, khuếch đại gen cho thấy khả năng điều trị không thành công ngay cả ở giai đoạn sớm. Có ít nhất 6 vùng trong hệ gen cũng được khuếch đại ở các ca UNBTK có khuếch đại MYCN như MDM2 trên nhiễm sắc thể 12q13 7
và MYCL trên nhiễm sắc thể 1p32. Sự khuếch đại các gen này không xảy ra độc lập, và góp phần vào sự ác tính của khối u. 3.4. UNBTK di truyền Một nhóm nhỏ bệnh nhân UNBTK có khuynh hướng hình thành khối u này trong gia đình. Con cái trong các gia đình này thường có tuổi chẩn đoán sớm (khoảng 9 tháng) và khối u nguyên phát ở cả 2 bên tuyến thượng thận hoặc nhiều vị trí khác nhau. Phần lớn các ca UNBTK di truyền là do đột biến gen ALK, chiếm tỷ lệ khoảng 7% số ca. Người mang đột biến gen ALK có khoảng 50-60% nguy cơ hình thành khối u [68]. Đột biến PHOX2B gặp ít hơn và thường xuất hiện trên các bệnh nhân có rối loạn phát triển mào thần kinh. 3.5. Mô hình biến đổi di truyền bệnh UNBTK Sự khởi tạo khối u được bắt đầu từ một NBTK riêng lẻ, thường liên quan đến sự bất hoạt một gen ức chế khối u. Mức độ biệt hóa khi các NBTK biến đổi quyết định sự biểu hiện của thụ thể neutrophin. Các khối u nhóm 1 chiếm khoảng 1/3 khối u có đặc điểm biểu hiện 8
TkrA cao. Các khối u này đặc trưng bởi rối loạn phân bào dẫn đến bộ nhiễm sắc thể đa bội hoặc gần tam bội, có xu hướng biệt hóa hoặc tế bào chết theo chu trình phụ thuộc vào sự có mặt hay không của NGF. Các bệnh nhân thường ít hơn 1 tuổi, khối u khu trú, tiên lượng rất tốt và điều trị chỉ bằng phẫu thuật và hóa trị triệu chứng. Khối u nhóm 2 đặc trưng bởi các bất thường nhiễm sắc thể lớn và có bộ nhiễm sắc thể gần lưỡng bội. Không có biến đổi nào cố định, nhưng thêm đoạn 17q hay gặp nhất, TrkA ít biểu hiện còn TrkB biểu hiện trội hơn. Trong nhóm này, các khối u lại được chia thành 2 nhóm nhỏ hơn. Một nhóm (nhóm 2A) không có khuếch đại gen MYCN và mất đoạn 1p, nhưng lại có mất đoạn 11q và 14q. Các bệnh nhân ở nhóm này thường có tuổi chẩn đoán lớn hơn, giai đoạn muộn hơn, nhưng tiến triển chậm và thường đe dọa đến tính mạng. Nhóm còn lại (nhóm 2B) là nhóm ác tính nhất, đặc trưng bởi khuếch đại gen MYCN đi kèm mất đoạn 1p. Nhóm này gồm các bệnh nhân từ 1 đến 5 tuổi, giai đoạn muộn, bệnh tiến triển nhanh dẫn đến phần lớn là tử vong (trên 75% số bệnh nhân). Như vậy, dù mỗi khối UNBTK có biểu hiện lâm sàng khác biệt, tính chất sinh học của khối u vẫn có thể dự đoán được dựa vào các đặc điểm bất thường về di truyền cũng như biểu hiện gen. Các thông tin như vậy được sử dụng để tiên lượng kết quả điều trị cũng như lựa chọn liều lượng liệu pháp thích hợp nhất từng bệnh nhân. 4. Các kỹ thuật di truyền đƣợc sử dụng trong bệnh UNBTK 4.1. Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ 9
Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ là một phương pháp nhằm định vị, phát hiện các trình tự nhất định bằng cách lai một đầu dò có gắn huỳnh quang với trình tự nghiên cứu theo nguyên tắc bổ sung. Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trải qua 5 bước gồm (1) gắn huỳnh quang vào đầu dò, (2) biến tính đầu dò và DNA đích, (3) phản ứng lai, (4) rửa sau lai và (5) quan sát. Hiện nay, kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ là một trong những kỹ thuật di truyền được sử dụng rộng rãi để đánh giá trạng thái gen MYCN trên các bệnh nhân UNBTK. 4.2. Kỹ thuật MLPA Phương pháp MLPA là phương pháp sử dụng nhiều phản ứng PCR cho phép khuếch đại nhiều đoạn gen khác nhau với chỉ một cặp mồi duy nhất. Phản ứng MLPA có thể chia thành năm bước: (1) biến tính sợi DNA và lai đầu dò; (2) ghép nối; (3) khuếch đại; (4) phân tích dữ liệu. Do có khả năng phát hiện được các thay đổi về số lượng bản sao của một gen hay một đoạn nhiễm sắc thể, kỹ thuật MLPA là một kỹ thuật phù hợp để phát hiện các mất đoạn hay thêm đoạn trên các khối u NBTK 4.3. Kỹ thuật lai so sánh hệ gen Kỹ thuật lai so sánh hệ gen là một kỹ thuật di truyền dựa trên việc so sánh 2 hệ gen, nghiên cứu và đối chứng, để phát hiện các CNV. Mỗi một hệ gen được lai với 1 màu huỳnh quang khác nhau (thường là xanh và đỏ), và tín hiệu tổng hợp của 2 màu huỳnh quang cho biết vùng gen/NST đó là mất hay thêm vật chất di truyền. 10
Kỹ thuật lai so sánh hệ gen có năm bước chính gồm (1) tách DNA, (2) khuếch đại và gắn huỳnh quang vào hệ gen, (3) lai với DNA chip, (4) rửa sau lai và (5) quét và phân tích kết quả. Phương pháp lai so sánh hệ gen được coi là kỹ thuật “đầu bảng” trong việc xác định các thay đổi về số lượng bản sao trên các bệnh nhân u NBTK với khả năng phát hiện các biến đổi nhỏ trên toàn bộ hệ gen chỉ với 1 lần chạy. 5. Tình hình nghiên cứu bệnh UNBTK ở Việt Nam Do thường xảy ra ở trẻ nhỏ, phần lớn các bệnh nhân UNBTK được khám và điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương (ở miền Bắc), bệnh viện U bướu thành phố Hồ Chí Minh (ở miền Nam). U nguyên bào thần kinh đã bắt đầu được nghiên cứu tại bệnh viện Nhi Trung uơng từ giữa những năm 1990. Năm 2005 và 2007, tác giả Phùng Tuyết Lan lần lượt công bố kết quả nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng cũng như kết quả điều trị bệnh nhân UNBTK tại Bệnh viện Nhi Trung ương. Năm 2016, tác giả Nguyễn Xuân Huy công bố kết quả nghiên cứu khuếch đại gen MYCN trên 54 bệnh nhân UNBTK bằng kỹ thuật FISH. Các nghiên cứu của Trần Chánh Khương và Nguyễn Thị Khen mở đầu cho hướng nghiên cứu UNBTK tại phía Nam. Năm 2015, nhóm nghiên cứu của Trương Đinh Kiều Diễm đã đánh giá khuếch đại gen MYCN bằng kỹ thuật Realtime PCR trên 60 bệnh nhân UNBTK. 11
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tƣợng nghiên cứu 141 bệnh nhân UNBTK sau khi khám và điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương từ tháng 01 năm 2015 đến tháng 06 năm 2017. 1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân - Các bệnh nhân đến khám và được chẩn đoán xác định mắc u nguyên bào thần kinh bằng xét nghiệm giải phẫu bệnh. - Có mẫu bệnh phẩm đủ tiêu chuẩn cho xét nghiệm di truyền. - Gia đình đồng ý tham gia vào nghiên cứu. 1.2. Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân - Không có mẫu bệnh phẩm hoặc mẫu bệnh phẩm không đủ tiêu chuẩn cho xét nghiệm di truyền. - Gia đình từ chối tham gia vào nghiên cứu. 1.3. Thiết kế nghiên cứu - Nghiên cứu cắt ngang và mô tả Nghiên cứu trạng thái gen MYCN và một số biến đổi di truyền trên bệnh nhân UNBTK. Nghiên cứu sự liên quan giữa một số biến đổi di truyền này với một số yếu tố lâm sàng có ý nghĩa tiên lượng. - Nghiên cứu tiến cứu Các bệnh nhân nghi ngờ UNBTK được thu thập mẫu bệnh phẩm. Sau khi có kết quả chẩn đoán xác định bằng mô bệnh học, tiến hành nghiên cứu biến đổi di truyền trên các khối UNBTK. 2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.1. Thu thập và bảo quản mẫu bệnh phẩm 12
- Mẫu u tươi: được thu thập ngay sau cuộc mổ hay sinh thiết. Bảo quản ở -80oC trước khi làm tiêu bản cắt lạnh. - Mẫu u nến: được thu thập sau khi khối u cố định trong nển. Bảo quản ở nhiệt độ phòng trước khi làm tiêu bản u nến. 2.2. Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ Đầu dò huỳnh quang sử dụng là là “LSI N-MYC (2p24) SpectrumGreen/CEP 2 SpectrumOrange Probe” của hãng Vysis (Abbott), đánh dấu màu xanh đánh dấu vào vùng gen MYCN; màu đỏ đánh dấu vào tâm động nhiễm sắc thể số 2. Mảnh u tươi được cắt lát 4 M và cố định lên tiêu bản bằng dung dịch Carnoy. Mảnh u nến cũng được cắt lát 4 M và trải qua quá trình tẩy nến bằng bộ kit SPOT-Light Tissue Pretreatment Kit (Life Sciences). Tiêu bản u được lai qua đêm ở 37oC sau khi biến tính ở 75oC trong 2 phút (u tươi) và 80oC trong 5 phút (u nến). Sau khi rửa với SSC 2X, tiêu bản được nhuộm với DAPI và phân tích dưới kính hiển vi huỳnh quang. 2.3. Kỹ thuật MLPA Bộ kit MLPA dùng cho nghiên cứu này là P252-B1 gồm các đầu dò cho nhiễm sắc thể số 2 và 17. DNA được biến tính ở 98oC và lai với đầu dò trong 16 tiếng ở 60oC. Hỗn hợp được tiến hành ghép nối ở 54oC, và tiến hành phản ứng PCR. Tiếp đến, mẫu được chạy trên máy giải trình tự 3130 Genetic Analyser (ABI) và phân tích bằng phần mềm Coffalyser. 2.4. Kỹ thuật lai so sánh hệ gen (CGH) DNA chip sử dụng là SurePrint G3 Human CGH Microarray Kit, 2x400K (Agilent) với độ phân giải 400000 đoạn oligo nucleotide phủ 13
toàn bộ hệ gen. 2 bộ DNA được lai với thuốc nhuộm huỳnh quang (Cy5 cho DNA nghiên cứu, Cy3 cho DNA chứng), nhỏ lên DNA chip và lai ở 67oC trong 40 giờ. Kết quả được phân tích bằng phần mềm CytoGenomics (Agilent). Kỹ thuật này được thực hiện trên hệ thống của hãng Agilent tại phòng Công nghệ gen – Protein, Bệnh viện đa khoa quốc tế Vinmec. 2.5. Xử lý số liệu Các số liệu được xử lý bằng phần mềm thống kê SPSS 23.0. Mối liên quan giữa một số biến đổi di truyền với yếu tố tiên lượng khác được xác định bằng kiểm định 2, Fisher. 3. Đạo đức trong nghiên cứu - Lợi ích đối với người bệnh: bệnh nhân có phác đồ điều trị phù hợp nhất, giảm tối đa đau đớn và tốn kém cho bệnh nhân, có tiên lượng điều trị và tái phát tốt. - Lợi ích đối với khoa học: là bước đầu trong việc xác định biến đổi di truyền cho từng bệnh nhân nhi mắc UNBTK. - Lợi ích đối với lâm sàng: các bác sĩ lâm sàng có thể phân giai đoạn bệnh chính xác, lựa chọn được phác đồ điều trị thích hợp, làm tăng tỷ lệ điều trị thành công cho bệnh nhân. - Sự chấp thuận:  Nghiên cứu được thông qua Hội đồng Y đức và Hội đồng Khoa học của Bệnh viện Nhi Trung ương.  Bệnh nhân, hoặc gia đình hay người bảo trợ cho bệnh nhân được giải thích trước khi đưa vào nghiên cứu. Trong trường hợp đồng ý, đối tượng được thu thập thông tin cần thiết, thu thập mẫu bệnh 14
phẩm và ký vào bản cam kết thực hiện xét nghiệm với các điều khoản đã soạn thảo.  Đảm bảo tính bí mật cho các đối tượng nghiên cứu. 4. Sơ đồ nghiên cứu 15
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 1. Phát hiện một số bất thƣờng di truyền trên các bệnh nhân nhi mắc UNBTK 1.1. Xác định trạng thái khuếch gen MYCN bằng kỹ thuật FISH Trong số 141 bệnh nhân UNBTK ở nghiên cứu này, có 21 trường hợp phát hiện khuếch đại gen MYCN, chiếm tỷ lệ 14,89%. Tỷ lệ này thấp hơn tỷ lệ chung của thế giới do nhiều bệnh nhân giai đoạn muộn, có tiên lượng xấu tại Bệnh viện Nhi Trung ương thường từ chối điều trị, không tiếp tục làm xét nghiệm chẩn đoán sau khi khám lâm sàng ban đầu. Có 92 mẫu bệnh phẩm u tươi và 49 mẫu bệnh phẩm u nến. Ở đó, mẫu bệnh phẩm u tươi cho thấy một số ưu điểm hơn so với u nến như dễ dàng tiến hành xét nghiệm, tín hiệu rõ ràng và có thể sử dụng cho các xét nghiệm chuyên sâu hơn. 1.2. Xác định biến đổi NST bằng kỹ thuật MLPA và CGH Một số bệnh nhân u nguyên bảo thần kinh nguy cơ thấp được chỉ định làm thêm xét nghiệm di truyền để đánh giá biến đổi bộ nhiễm sắc thể để lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp. 1.2.1. Phát hiện biến đổi NST bằng kỹ thuật MLPA Có 10 bệnh nhân u NBTK được tiến hành đánh giá NST số 2 và 17 bằng kỹ thuật MLPA. Kết quả cho thấy có 8 bệnh nhân không phát hiện bất thường NST, 1 bệnh nhân phát hiện thêm đoạn cánh dài NST số 17 và 1 bệnh nhân phát hiện mất đoạn cánh ngắn NST số 17. Đây đều là những dạng bất thường NST thường gặp trên bệnh nhân u NBTK. 16
Mặt khác, kỹ thuật MLPA cũng cho thấy hạn chế khi không thể đánh giá được toàn bộ các NST trong một lần chạy. Điều này sẽ gây ra khó khăn trong việc phân định bệnh nhân thuộc nhóm biến đổi về số lượng NST (NCA) hay nhóm biến đổi về cấu trúc NST (SCA). 1.2.2. Phát hiện biến đổi di truyền bằng kỹ thuật CGH Có 6 bệnh nhân UNBTK được tiến hành đánh giá bộ NST bằng kỹ thuật CGH. Kết quả cho thấy có 4 bệnh nhân thuộc nhóm NCA và 2 bệnh nhân thuộc nhóm SCA. Các dạng thay đổi về số lượng hay cấu trúc NST phát hiện được đều là những dạng hay gặp trên các khối UNBTK. Đó là thêm đoạn 17q, mất đoạn 1p, mất đoạn 11q, thêm NST số 3, thêm NST số 4, mất NST số 21… Có 2 bệnh nhân được làm cả kỹ thuật MLPA và CGH. Kết quả cho thấy kỹ thuật CGH có độ nhạy và độ chính xác cao hơn so với kỹ thuật MLPA, và trở thành kỹ thuật đầu bảng trong việc đánh giá biến đổi NST trên bệnh nhân UNBTK. 2. Xác định sự liên quan giữa các biến đổi di truyền với một số yếu tố tiên lƣợng và định hƣớng điều trị UNBTK. 2.1. Sự liên quan giữa trạng thái gen MYCN với tuổi chẩn đoán Tuổi chẩn đoán là một trong các yếu tố tiên lượng có ý nghĩa. Các bệnh nhân nhỏ hơn 12 tháng có tiên lượng tốt hơn so với các nhóm tuổi khác. 48,2% bệnh nhân trong nghiên cứu này ít hơn 1 tuổi. Khuếch đại gen MYCN chỉ gặp ở các bệnh nhân nhỏ hơn 48 tháng và tập trung ở nhóm từ 12 đến 24 tháng (9/21 bệnh nhân). Điều này cho thấy khuếch đại gen MYCN thúc đẩy các tế bào phát triển nhanh và ác tính nên thường gặp ở các bệnh nhân nhỏ tuổi. Các khối UNBTK 17
ác tính ở trẻ lớn sẽ ít phát hiện khuếch đại gen MYCN hơn. Kiểm định χ2 cho thấy 2 yếu tố này không có sự liên quan với nhau (với mức độ tin cậy là 95%). 2.2. Sự liên quan giữa trạng thái gen MYCN với giới tính Khối UNBTK gặp ở trẻ trai nhiều hơn trẻ gái. Trong nghiên cứu này tỷ lệ trẻ trai/gái = 1,56. Khuếch đại gen MYCN cũng gặp ở trẻ trai nhiều hơn trẻ trai. Tuy nhiên, sự khác biệt này nhiều khả năng đến từ chênh lệch giới tính nói chung ở bệnh u NBTK. Kiểm định Fisher cũng củng cố giả thuyết này khi cho thấy trạng thái gen MYCN và tuổi chẩn đoán không có sự liên quan với nhau (với mức độ tin cậy là 95%). 2.3. Sự liên quan giữa trạng thái gen MYCN với giai đoạn Khối UNBTK được phân loại theo hệ thống INRG, ở đó khối u khu trú được phân loại thành giai đoạn L1 và L2 được phân biệt bởi sự xâm lấn vào các cơ quan khác; khối u di căn gồm giai đoạn M và Ms phân biệt bởi tuổi và vị trí di căn. Trong nghiên cứu này, 19,86% bệnh nhân ở giai đoạn L1, 66,67% giai đoạn L2, 8,51% giai đoạn M và 4,96% giai đoạn Ms. Do là các khối u có độ ác tính cao, tỷ lệ khuếch đại gen MYCN trội hơn ở các bệnh nhân giai đoạn di căn, 66,67% bệnh nhân giai đoạn M và 28,57% bệnh nhân giai đoạn Ms. Ngược lại, các bệnh nhân ở giai đoạn khu trú có tỷ lệ khuếch đại gen này thấp, 3,57% và 10,64% lần lượt ở giai đoạn L1 và L2. Kiểm định χ2 cho thấy 2 yếu tố này độc lập với nhau (với mức độ tin cậy là 95%). 2.3. Sự liên quan giữa trạng thái gen MYCN với chỉ số VMA/HVA 18