Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu phát triển vector nhị thể mới ứng dụng trong cải biến di truyền một số loài nấm sợi

Chia sẻ: Acacia2510 _Acacia2510 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

15
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận án là tạo được các vector nhị thể mới và thiết lập được hệ thống chuyển gen tối ưu sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho ba loài nấm sợi là Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum và Penicillium digitatum. Điều tra được vai trò của gen laeA ở cả ba loài nấm sợi nghiên cứu nhờ áp dụng hệ thống chuyển gen tối ưu đã thiết lập

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu phát triển vector nhị thể mới ứng dụng trong cải biến di truyền một số loài nấm sợi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _______________________ VŨ XUÂN TẠO NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VECTOR NHỊ THỂ MỚI ỨNG DỤNG TRONG CẢI BIẾN DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI NẤM SỢI Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9420101.07 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2019
Công trình đƣợc hoàn thành tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. TS. Trần Văn Tuấn 2. PGS.TS Nguyễn Quang Huy Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp tại Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN vào hồi….giờ….ngày… tháng… năm 20... Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Nấm sợi là những loài mang lại nhiều lợi ích thiết thực cho con ngƣời nhƣng chúng cũng có thể gây ra những thiệt hại khôn lƣờng cho sản xuất nông nghiệp. Nấm sợi Aspergillus niger đƣợc sử dụng rộng rãi trong sản xuất công nghiệp nhiều loại enzyme và axit hữu cơ, trong khi đó nấm Penicillium chrysogenum lại là loài nổi tiếng trong sinh tổng hợp kháng sinh penicillin, kháng sinh β-lactam đầu tiên đƣợc phát hiện và sản xuất ở quy mô công nghiệp. Việc khai thác các loài nấm sợi sẵn có trong tự nhiên để sản xuất enzyme, axit hữu cơ và các chất có hoạt tính sinh học là có giới hạn. Mặc dù nhiều chủng đột biến của A. niger và P. chrysogenum có khả năng sinh tổng hợp hàm lƣợng cao sản phẩm đã đƣợc tạo ra nhờ phƣơng pháp vật lý và hóa học. Tuy nhiên các phƣơng pháp này tạo ra các thể đột biến ngẫu nhiên và khó xác định đƣợc gen đích đã bị gây hỏng. Do đó nghiên cứu cải tiến, nâng cấp năng lực cho các chủng tự nhiên bằng cách can thiệp trực tiếp, có định hƣớng vào hệ gen nấm là việc làm cần thiết, mang tính ứng dụng cao. Bên cạnh đó, đối sản xuất nông nghiệp, vi nấm liên quan mật thiết đến năng suất cây trồng và bảo quản sản phẩm sau thu hoạch. Nấm Penicillium digitatum đƣợc coi là tác nhân gây hỏng nghiêm trọng đối với các loại quả có múi ở giai đoạn sau thu hoạch. Việc nghiên cứu làm sáng tỏ vai trò của các gen gây bệnh ở P. digitatum sẽ góp phần trong việc định hƣớng phát triển các giải pháp “xanh” hiệu quả trong bảo quản nông sản sau thu hoạch. Nghiên cứu này hƣớng đến phát triển giải pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens có thể sử dụng chung cho nhiều loài nấm sợi khác nhau. Việc phối hợp giữa tối ƣu hóa phƣơng pháp
chuyển gen và xây dựng đƣợc hệ thống các vector nhị thể mới sẽ là nền tảng để triển khai các nghiên cứu chuyên sâu về điều tra chức năng của các gen ở vi nấm. 2. Mục tiêu của đề tài - Tạo đƣợc các vector nhị thể mới và thiết lập đƣợc hệ thống chuyển gen tối ƣu sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho ba loài nấm sợi là Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum và Penicillium digitatum. - Điều tra đƣợc vai trò của gen laeA ở cả ba loài nấm sợi nghiên cứu nhờ áp dụng hệ thống chuyển gen tối ƣu đã thiết lập. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên đƣợc thực hiện một cách có hệ thống tại Việt Nam và trên thế giới về phát triển các vector nhị thể mới ứng dụng trong cải biến di truyền ba loài nấm sợi sử dụng phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Đề tài đã chứng minh hiệu quả của hệ vector tạo đƣợc bằng cách áp dụng trực tiếp vào việc biểu hiện gen, xóa gen ở cả ba loài nấm sợi khác nhau. 4. Những đóng góp mới của luận án * Đã tạo thành công các vector nhị thể mới dùng cho biểu hiện gen, xóa gen và bổ trợ gen ở ba loài nấm sợi gồm A. niger, P. chrysogenum và P. digitatum. * Phát triển thành công hệ thống chuyển gen hiệu quả cao sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens ở ba loài nấm sợi nghiên cứu. Lần đầu tiên, hệ thống chuyển gen hoàn toàn mới dựa trên cơ chế trợ dƣỡng uridine/uracil đƣợc thiết lập ở nấm sợi A. niger và P. chrysogenum. Đồng thời, hệ thống chuyển gen sử dụng marker kháng kháng sinh ở
P. chrysogenum và P. digitatum đƣợc tối ƣu và hiệu quả chuyển gen đạt đƣơc cao hơn từ 10 đến 20 lần so với các nghiên cứu trƣớc đây. * Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên chứng minh việc xóa, phục hồi và biểu hiện quá mức gen laeA đƣợc thực hiện thành công ở ba loài nấm sợi A. niger, P. chrysogenum và P. digitatum nhờ sử dụng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Đặc biệt nghiên cứu này đã phát hiện ra các vai trò hoàn toàn mới của gen laeA trong điều hòa biệt hóa hình thái tế bào nấm, trao đổi chất và kiểm soát khả năng gây bệnh trên quả sau thu hoạch. 5. Bố cục của luận án Bố cục của luận án gồm 163 trang, 2 bảng và 43 hình. Cụ thể: Mở đầu 4 trang; Chƣơng 1 Tổng quan tài liệu 35 trang; Chƣơng 2 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 19 trang; Chƣơng 3 Kết quả và thảo luận 70 trang; Kết luận và kiến nghị 3 trang; Danh mục các công trình 2 trang; Tài liệu tham khảo 30 trang. CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM A. niger, P. chrysogenum VÀ P. digitatum Aspergillus niger là một trong những loài phổ biến nhất trong khoảng 250 loài thuộc chi Aspergillus. A. niger là một vi nấm mô hình quan trọng đối với một số lĩnh vực nghiên cứu, bao gồm nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp protein, enzyme, cơ chế phân tử và các cơ chế liên quan tới việc kiểm soát đặc điểm hình thái nấm. P. digitatum là nấm gây bệnh thực vật đầu tiên thuộc loài Penicillium đƣợc giải mã toàn bộ hệ gen. Nhiều nghiên cứu về cơ chế gây bệnh của nấm P. digitatum ở mức độ phân tử cho thấy một
số gen đóng vai trò quy định độc lực của nấm P. digitatum. Tuy nhiên cho tới hiện nay, việc điều tra vai trò của các gen quy định độc lực gây bệnh của nấm P. digitatum vẫn đang tiếp tục đƣợc thực hiện. Nấm P. chrysogenum đƣợc nghiên cứu từ rất lâu, tuy nhiên tới năm 2008 hệ gen của loài nấm này mới đƣợc giải trình tự toàn bộ. Ứng dụng nổi bật nhất của nấm mốc P. chrysogenum là khả năng sinh kháng sinh penicillin với nhiều chủng cho hiệu suất sinh tổng hợp cao, đặc biệt sau khi đã đƣợc xử lý đột biến. 1.2. PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO NẤM SỢI THÔNG QUA VI KHUẨN A. tumefaciens (ATMT) Để thực hiện các nghiên cứu về cải biến di truyền nấm sợi thì phƣơng pháp chuyển gen là một công cụ không thể thiếu. Hiện nay, một số phƣơng pháp chuyển gen đƣợc sử dụng phổ biến ở nấm sợi là chuyển gen qua tế bào trần (protoplast) và chuyển gen trung gian qua vi khuẩn A.tumefaciens. Với phƣơng pháp chuyển gen thông qua tế bào trần, các đoạn DNA hoặc các vector mang gen mong muốn đƣợc chuyển trực tiếp vào tế bào. Tuy nhiên, quá trình chuẩn bị tế bào trần cũng nhƣ các bƣớc chuyển gen khá phức tạp, tốn nhiều công sức, chi phí cao và không ổn định, đòi hỏi ngƣời thực hiện phải có nhiều kinh nghiệm, không thể áp dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm vừa và nhỏ. Phƣơng pháp chuyển gen vào nấm gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens kể từ khi công bố đến nay đã đƣợc áp dụng thành công trên nhiều loài nấm khác nhau, bởi đây thực sự là phƣơng pháp đơn giản, tiện dụng mà hiệu quả đạt đƣợc cao. 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ GEN laeA Ở NẤM SỢI LaeA (loss of aflR-expression A) là một protein có vai trò đa năng ở nấm sợi nói chung. LaeA đƣợc xem nhƣ một protein điều hòa
quan trọng bởi nó tƣơng tác với nhiều protein khác, trong đó có phức hệ velvet nổi tiếng. Xét về khía cạnh protein, LaeA sở hữu vùng chuyển nhóm methyl và tham gia vào việc điều hòa các quá trình trao đổi chất và phát triển của nấm. Trong cấu trúc protein, một vùng cấu trúc phụ thuộc S-adenosylmethione (SAM) có hoạt tính chuyển nhóm methyl khá tƣơng đồng với các enzyme chuyển nhóm methyl cho axit amin arginin. Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng LaeA và các protein velvet gồm VeA, VelB, VelC và VosA hoạt động nhƣ những protein điều hòa chủ chốt của quá trình phát triển và trao đổi chất bậc hai ở nấm thông qua việc hình thành các phức hệ nhƣ LaeA/VeA/VelB, VeA/VelB, VelB/VosA, VelB/VelB, VelC/VosA, VelC/VeA. Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU Các chủng vi sinh vật đƣợc sử dụng trong nghiên cứu gồm: Escherichia coli DH5α, Agrobacterium tumefaciens AGL1, Penicillium digitatum PdVN1, Penicillium digitatum N11, Penicillium chrysogenum VTCC-F1170, Penicillium chrysogenum VTCC-F1172, Aspergillus niger N402, Aspergillus niger CBS 113.46 và Staphylococcus aureus ATCC25923. 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phân lập, định danh chủng nấm mốc gây hỏng cam 2.2.2. Thu bào tử và hệ sợi nấm
2.2.3. Đánh giá khả năng mẫn cảm kháng sinh 2.2.4. Tách chiết DNA 2.2.5. Tạo các vector nhị thể dùng cho chuyển gen 2.2.6. Tối ƣu quy trình chuyển gen ở nấm A. niger, P. digitatum và P. chrysogenum và thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 2.2.7. Xóa và phục hồi gen laeA ở các nấm sợi nghiên cứu 2.2.8. Sàng lọc và xác nhận các thể chuyển gen 2.2.9. Điều tra vai trò của gen laeA ở các loài nấm sợi nghiên cứu Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN HIỆU QUẢ CAO SỬ DỤNG MARKER KHÁNG KHÁNG SINH 3.1.1. Nghiên cứu chuyển gen vào nấm A. niger sử dụng phƣơng pháp ATMT và marker là gen kháng kháng sinh Đây là nghiên cứu đầu tiên chỉ ra tỷ lệ dƣơng tính giả khi chuyển gen vào A. niger với marker chọn lọc là gen kháng kháng sinh. Đồng thời, nhận thấy nồng độ kháng sinh hygromycin dùng trong chuyển gen khá cao. Nhƣ vậy, việc chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng marker chọn lọc là gen kháng hygromycin tỏ ra không hiệu quả với chủng A. niger.
3.1.2. Phát triển hệ thống chuyển gen hiệu quả cao ở nấm P. chrysogenum và P. digitatum sử dụng marker kháng kháng sinh Hình 3.6. Quy trình chuyển gen tối ƣu vào nấm P. chrysogenum và P. digitatum Chúng tôi đã thiết lập thành công quy trình chuyển gen hiệu quả cao cho chủng P. digitatum PdVN1 và chủng P. chrysogenum VTCC-F1172 (Hình 3.6). Với quy trình này, ở P. digitatum PdVN1, hiệu suất chuyển gen đạt 1240 ± 165 thể chuyển gen, cao hơn 20 lần so với công bố trƣớc đây trên chủng Pd01. Với P. chrysogenum VTCC-F1172, hiệu suất chuyển gen đạt 5090 ± 96 thể chuyển gen/106 bào tử, cao gấp 10 lần so với công bố trƣớc đây trên chủng DS17690. Tính tới thời điểm hiện tại, đây đƣợc coi là quy trình chuyển gen hiệu quả nhất đối với loài nấm P. digitatum và P. chrysogenum. Đồng thời, đây là báo cáo đầu tiên về việc biểu hiện thành công gen mã hóa protein huỳnh quang đỏ DsRed ở P. digitatum và
huỳnh quang xanh GFP ở nấm P. chrysogenum bằng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Đặc biệt trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh gen kháng phleomycin là một marker mới hiệu quả cho chuyển gen và biểu hiện gen ở cả nấm P. chrysogenum và P. digitatum. 3.2. PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN SỬ DỤNG MARKER TRỢ DƢỠNG pyrG Ở A. niger VÀ P. chrysogenum Lần đầu tiên việc xóa gen pyrG tạo thể đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil đƣợc thực hiện thành công trên hai loài nấm là A. niger và P. chrysogenum bằng phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens. Nghiên cứu của chúng tôi đã xây dựng đƣợc hệ thống chuyển gen mới với hiệu quả cao dựa trên gen trợ dƣỡng pyrG sinh tổng hợp uridine/uracil (marker trợ dƣỡng pyrG) ở hai loài nấm A. niger và P. chrysogenum. Các thông số tối ƣu cho hệ thống chuyển gen này là nồng độ bào tử cho chuyển gen là 106 bào tử/ml, đồng nuôi cấy ở 22°C trên môi trƣờng cảm ứng (induction medium, IM) bổ sung 0,02% uridine và 0,02 % uracil, IM của cả 2 giai đoạn cảm ứng đều bổ sung 200 µM acetosyringone (AS), thời gian đồng nuôi cấy là 60 giờ. Đây là nghiên cứu đầu tiên thiết lập thành công hệ thống chuyển gen trợ dƣỡng uridine/uracil mà không cần sử dụng đến gen kháng kháng sinh ở hai loài nấm này. Đây là một bƣớc tiến vƣợt trội và hệ thống chuyển gen thiết lập đƣợc có thể đƣợc sử dụng cho các nghiên cứu tái tổ hợp mang tính ứng dụng trong tƣơng lai.
Hình 3.15. Quy trình chuyển gen hiệu quả cao cho nấm A. niger và P. chrysogenum trợ dƣỡng uridine/uracil (A) Quy trình chuyển gen tối ƣu. (B) Kết quả chuyển gen trên chủng A. niger N402, CBS 113.46 và P. chrysogenum VTCC-F1172 trợ dƣỡng uridine/uracil. Với quy trình chuyển gen tối ƣu vào A. niger trợ dƣỡng uridine/uracil đã biểu hiện thành công gen huỳnh quang DsRed. Điều này đã mở ra triển vọng mới cho nghiên cứu biểu hiện enzyme và protein tái tổ hợp ở loài nấm sợi tiềm năng này.
3.3. NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GEN laeA Ở A. niger, P. chrysogenum VÀ P. digitatum 3.3.1. Nghiên cứu vai trò của gen laeA ở A. niger Hình 3.18. Xác nhận xóa gen laeA ở A. niger Với kết quả xác nhận bằng PCR với 3 cặp mồi đặc hiệu nhƣ trên, chúng tôi đã xóa thành công gen laeA theo cơ chế tái tổ hợp tƣơng đồng ở nấm A. niger. Đây là lần đầu tiên trên thế giới gen laeA ở nấm A. niger đƣợc xóa thành công theo cơ chế tái tổ hợp tƣơng đồng sử dụng phƣơng pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens. Đồng thời với phƣơng pháp này, gen laeA đã đƣợc phục hồi và quá mức thành công. Sử dụng các chủng này, chúng tôi đã phát hiện một loạt các vai trò mới của gen laeA ở A. niger. * Gen laeA ảnh hưởng đến sự sinh trưởng trên các nguồn cacbon của A. niger
Hình 3.23. Sự sinh trƣởng và hình thành bào tử của các chủng A. niger trên các nguồn cacbon khác nhau Trên môi trƣờng có galactose, lactose, tinh bột và xylan, chủng xóa gen laeA hình thành ít bào tử. Đặc biệt bào tử chủng xóa gen trên nguồn cacbon là lactose giảm tới 93,75% và trên nguồn cacbon là xylan giảm 70,55% so với chủng tự nhiên. * Gen laeA ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng trên các nguồn nitơ Hình 3.24. Sự sinh trƣởng và hình thành bào tử của các chủng A. niger trên nguồn nitơ nitrat và ammonium Đây là lần đầu tiên mối liên quan giữa gen laeA với các nguồn nitơ đƣợc nghiên cứu ở nấm A. niger. Chúng tôi phát hiện một điểm mới chƣa từng đƣợc công bố trƣớc đây về vai trò của gen laeA trong biệt hóa hình thái và hình thành bào tử ở nấm A. niger trên nguồn nitơ ammonium.
* Gen laeA ảnh hưởng đến khả năng phân giải cellulose của A.niger Hình 3.25. Khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng A. niger Việc xóa gen laeA làm mất khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase ở A. niger. Đây là phát hiện mới chƣa từng đƣợc công bố về vai trò của gen laeA trong điều hòa kiểm soát khả năng sinh enzyme cellulase ở A. niger. * Gen laeA ảnh hưởng tới khả năng gây hỏng quả của A. niger Sau 10 ngày, thông qua xác định đƣờng kính vết lây nhiễm nhận thấy khả năng gây hỏng táo của chủng xóa gen laeA giảm so với chủng tự nhiên và chủng phục hồi trung bình khoảng 44,25% (Hình 3.26A). Tƣơng tự, chủng xóa gen laeA cũng giảm khả năng gây hỏng trên nho khoảng 53,33% (Hình 3.26B). Điều này chứng tỏ gen laeA đóng vai trò nhất định trong việc gây hỏng quả sau thu hoạch ở nấm A. niger. Phát hiện này chƣa từng đƣợc công bố trƣớc đây.
Hình 3.26. Khả năng gây hỏng quả sau thu hoạch của các chủng A. niger (A) Gây hỏng trên táo. (B) Gây hỏng trên nho 3.3.2. Nghiên cứu vai trò của gen laeA ở P. chrysogenum Đây là lần đầu tiên gen laeA đƣợc xóa bỏ khỏi hệ gen của P. chrysogenum sử dụng phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Đồng thời, chủng phục hồi gen laeA cũng đã đƣợc tạo thành công, giúp chúng tôi phát hiện một số điểm mới về vai trò của gen laeA ở loài nấm sợi này mà chƣa từng đƣợc công bố trƣớc đây.
Hình 3.30. Xác nhận chủng xóa gen laeA bằng PCR (A) Sơ đồ trao đổi chéo và vị trí các cặp mồi dùng để kiểm tra. (B) Sự sinh trƣởng của các chủng nấm trên môi trƣờng PDA và CD sau 3 và 6 ngày. (C) Kết quả PCR kiểm tra. M: 1 kb DNA marker, (-) Đối chứng âm sử dụng nƣớc cất vô trùng. * Gen laeA ảnh hưởng tới khả năng sinh kháng sinh penicillin Việc phát hiện ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến quá trình khôi phục kiểu hình và khả năng sinh kháng sinh penicillin kháng vi khuẩn S. aureus ở chủng P. chrysogenum xóa gen laeA chƣa từng đƣợc nhắc đến, do vậy kết quả này góp phần bổ sung thêm sự hiểu biết về vai trò điều hòa của gen laeA ở P. chrysogenum.
Hình 3.32. Sự sinh trƣởng và sinh kháng sinh penicillin của các chủng P. chrysogenum trên nguồn nitơ là nitrat và ammonium * Gen laeA ảnh hưởng tới khả năng hình thành bào tử ở nấm P. chrysogenum Sau 6 ngày nuôi cấy, ở nguồn nitơ nitrat, chủng xóa laeA hình thành bào tử, tuy nhiên lƣợng bào tử hình thành chỉ bằng 45,6% so với chủng tự nhiên. Trên môi trƣờng với nguồn nitơ là ammonium, lƣợng bào tử của chủng xóa gen laeA tăng lên rất nhiều. Cụ thể lƣợng bào tử hình thành bằng 87,3% so với chủng tự nhiên (Hình 3.33B). Nhƣ vậy, nguồn nitơ ammonium thúc đẩy quá trình phục phồi khả năng hình thành bào tử cho chủng P. chrysogenum xóa laeA. Đây là nghiên cứu đầu tiên chỉ ra vai trò của nguồn nitơ ảnh hƣởng tới hoạt động kiểm soát của gen laeA tới khả năng hình thành bào tử ở nấm P. chrysogenum.
Hình 3.33. Sự hình thành bào tử của các chủng P. chrysogenum trên nguồn nitơ nitrat và ammonium * Gen laeA ảnh hưởng tới khả năng sinh enzyme α-amylase ở nấm P. chrysogenum Với nguồn nitơ nitrat, khả năng sinh enzyme α-amylase của chủng P. chrysogenum xóa laeA giảm so với chủng tự nhiên và chủng phục hồi. Trong khi đó, trên môi trƣờng sử dụng nguồn nitơ ammonium, khả năng sinh enzyme α-amylase của chủng xóa laeA đƣợc phục hồi tƣơng đƣơng so với chủng tự nhiên và chủng phục
hồi. Nhƣ vậy, nguồn nitơ ảnh hƣởng tới hoạt động của gen laeA ở P. chrysogenum trong điều hòa quá trình sinh enzyme ngoại bào α- amylase. Hình 3.34. Khả năng sinh enzyme α-amylase của các chủng P. chrysogenum trên nguồn nitơ nitrat và ammonium 3.3.3. Nghiên cứu vai trò của gen laeA ở P. digitatum Hiện nay, đã có báo cáo về vai trò của một số gen trong hệ gen của nấm P. digitatum nhƣ: PdMpkB, PdSNF1, PdSlt2,…. Tuy nhiên, vai trò của gen laeA chƣa từng đƣợc đề cập ở nấm P. digitatum. Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên trên thế giới gen laeA ở nấm P. digitatum đƣợc xóa thành công, việc điều tra đặc điểm của chủng xóa gen laeA sẽ giúp làm sáng tỏ vai trò của gen này ở vi nấm P. digitatum. Đồng thời, trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến tạo thành công chủng phục hồi và chủng biểu hiện quá mức gen laeA. Các chủng phục hồi và biểu hiện quá mức gen laeA ở nấm P. digitatum sẽ giúp cho việc điều tra vai trò của gen laeA đƣợc đầy đủ và chính xác.
Hình 3.39. Xác nhận xóa và phục hồi gen laeA ở P. digitatum (A) Sơ đồ xóa và phục hồi; (B) PCR sử dụng ba cặp mồi PdlaeA- P5/PdlaeA-P6, PdlaeA-ORF-F/PdlaeA-ORF-R và NAT-F/NAT-R; (C) PCR sử dụng ba cặp mồi PdlaeA-P5/PdlaeA-P6, PdlaeA-ORF- F/PdlaeA-ORF-R và PgpdA-F/HPH-R