Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu thu nhận quercetin từ thực vật và đánh giá khả năng ứng dụng

Chia sẻ: Acacia2510 _Acacia2510 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

29
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận án là xác định hàm lượng quercetin trong dịch thủy phân của thực vật bằng phương pháp HPLC. Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm quercetin (cao chiết thô, cao bán tinh khiết và tinh khiết) từ thực vật. Đánh giá hoạt tính sinh học một số chế phẩm quercetin thu nhận từ thực vật.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu thu nhận quercetin từ thực vật và đánh giá khả năng ứng dụng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Huy Hoàng NGHIÊN CỨU THU NHẬN QUERCETIN TỪ THỰC VẬT VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9420101.16 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội-2019
Công trình đƣợc hoàn thành tại: Bộ môn Hóa sinh và Sinh học phân tử, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Quang Huy PGS.TS. Hồ Bá Do Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp tại……………………………………………….. vào hồi giờ ngày thánh năm 20… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin-Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Do Thi Hai Anh, Le Huy Hoang, Kitsamone Shihavong, Nguyen Thai Uy, Nguyen Quang Huy (2016), “In vitro antibacterial activity of Quercetin containing extract from Hibiscus sabdariffa L. Calyxes”, VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology T. 32 (1S), tr. 147-152. 2. Lê Huy Hoàng, Đỗ Thị Hải Anh, Đỗ Thị Huế, Trần Thị Kiều Oanh, Nguyễn Quang Huy (2017), “Xác định quercetin dạng tự do trong dịch chiết nụ hoa của cây Hòe (Sophora japonica L.) bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”, Tạp chí Khoa học-Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, ĐHQGHN T. 33 (1S), tr. 214-223. 3. Lê Huy Hoàng, Phạm Thị Phƣợng, Nguyễn Thị Hạnh, Hồ Bá Do, Nguyễn Quang Huy (2019), “Nghiên cứu điều kiện thủy phân có hỗ trợ siêu âm để thu nhận và đánh giá hoạt tính chống oxi hoá của quercetin từ một số thực vật”, Tạp chí Khoa học-Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, ĐHQGHN (đã chấp nhận đăng). 4. Lê Huy Hoàng, Phạm Thị Phƣợng, Bùi Thị Vân Khánh, Hồ Bá Do, Nguyễn Quang Huy (2019), “Đánh giá hoạt tính của chế phẩm quercetin tách từ nụ hoa hòe (Sophora japonica L.) và lá sen (Nelumbo nucifera Gaertn.)”, Tạp chí Dược học T. 519, tr. 55-58.
MỞ ĐẦU Quá trình trao đổi chất và năng lƣợng của cơ thể sống đƣợc duy trì ổn định ở trạng thái cân bằng về oxy hóa và khử. Trong tình trạng stress oxy hóa, sự gia tăng và tích lũy gốc tự do gây tác động bất lợi lên các cơ quan và tổ chức, làm tăng nguy cơ mắc bệnh mạn tính ở ngƣời. Khi đó, chế phẩm chống oxy hóa ngoại sinh thu nhận từ thực vật ở dạng cao chiết (cao thô, cao bán tinh khiết) hoặc đơn chất tinh khiết, đƣợc quan tâm nghiên cứu và ứng dụng để cải thiện tình trạng stress oxy hóa. Trong các hợp chất thứ cấp từ thực vật có hoạt tính chống oxy hóa, polyphenol đƣợc ghi nhận là nhóm phổ biến nhất. Khi thu nhận polyphenol từ cùng loại thực vật, một số nghiên cứu đã cho thấy chế phẩm dạng bán tinh khiết có ƣu việt hơn dạng tinh khiết về hoạt tính chống oxy hóa cũng nhƣ khả năng phân tán trong nƣớc. Trong các polyphenol, flavonoid là nhóm lớn nhất, đóng vai trò chính về hoạt tính chống oxy hóa của cây thuốc. Hơn 6000 loại flavonoid khác nhau đã đƣợc xác định và số lƣợng phát hiện mới vẫn tăng lên. Trong đó, quercetin là flavonoid đƣợc chú trọng nghiên cứu nhiều nhất, với chế phẩm đƣợc sử dụng chủ yếu ở dạng tinh khiết thu nhận từ rutin. Ở Việt Nam và một số nƣớc châu Á, rutin đƣợc thu nhận chủ yếu từ nụ hoa hòe. Cho đến nay, nghiên cứu thu nhận và đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết chứa quercetin thu nhận trực tiếp từ nụ hoa hòe Việt Nam, so sánh với dạng quercetin tinh khiết từ rutin, chƣa đƣợc đề cập. Quercetin (dạng tinh khiết) đƣợc đánh giá có hoạt tính chống oxy hóa mạnh với hiệu quả trị liệu đa dạng. Với nhiều đích tác dụng, quercetin đƣợc ghi nhận có hoạt tính adaptogen với khả năng gia tăng sự thích ứng của cơ thể khi căng thẳng về thần kinh cũng nhƣ thể chất. Chính vì thế, quercetin đƣợc chú trọng nghiên cứu ứng dụng để cải thiện tình trạng stress oxy hóa liên quan đến tuổi, điều kiện sống, nghề nghiệp hoặc độc tính của thuốc trong điều trị (điển hình là 1
paracetamol). Gần đây, quercetin thuộc số ít các hợp chất thứ cấp đƣợc đƣợc định hƣớng bổ sung vào chế độ dinh dƣỡng, để tăng sức chịu đựng cho quân nhân, vận động viên hoặc bệnh nhân. Tuy nhiên, với đặc tính khử, sau hoạt động trung hòa gốc tự do, quercetin trở thành tiền chất oxy hóa. Trong cơ thể động vật, với đặc tính là chất lạ sinh học (xenobiotic) và không tan trong nƣớc, quercetin đƣợc chuyển hóa bởi gan để đào thải. Khi đó, hoạt tính sinh học in vivo của quercetin chịu sự chi phối đồng thời của dạng khử cũng nhƣ tiền chất oxy hóa. Vấn đề này đã tạo ra thách thức lớn trong ứng dụng quercetin tinh khiết, đặc biệt là ở mức liều cao trong nhiều ngày. Điều kiện chiết xuất trong hệ dung môi hữu cơ chứa axit đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu, áp dụng để thu nhận quercetin cho nghiên cứu hàm lƣợng hoặc hoạt tính sinh học. Trong đó, điển hình là điều kiện chiết xuất để nghiên cứu hàm lƣợng quercetin, đƣợc Gray và cộng sự tiêu chuẩn hóa trên lá bạch quả, sau đó đƣợc Watanabe và cộng sự áp dụng trên vỏ hành và gần đây đƣợc Nishimuro và cộng sự áp dụng trên một số rau, quả. Điều kiện chiết xuất trong các nghiên này đã đƣợc áp dụng thành công để tách đồng thời quercetin cùng với các flavonol trong nhiều thực vật khác nhau, có tiềm năng phát triển để thu nhận cao chiết chứa quercetin từ thực vật cho nghiên cứu hoạt tính sinh học. Tuy nhiên, áp dụng điều kiện chiết xuất nói để thu nhận quercetin từ nụ hoa hòe chƣa đƣợc thực hiện. Bên cạnh đó, quercetin có hoạt tính adaptogen nhƣng việc thu nhận mẫu chứa quercetin từ thực vật adaptogen, phổ biến ở Việt Nam gồm rau má, lá sen, rau đắng biển, quả ngũ vị tử, thân rễ cam thảo, lá chùm ngây, đài hoa của bụp giấm chƣa đƣợc chú trọng nghiên cứu. Vì vậy, với các giá trị về khoa học và tiềm năng ứng dụng của quercetin trong lĩnh vực y dƣợc, luận án “Nghiên cứu thu nhận quercetin từ thực vật và đánh giá khả năng ứng dụng” đƣợc tiến hành nhằm thực hiện các mục tiêu và nội dung sau: 2
Mục tiêu nghiên cứu của luận án 1. Xác định hàm lƣợng quercetin trong dịch thủy phân của thực vật bằng phƣơng pháp HPLC. 2. Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm quercetin (cao chiết thô, cao bán tinh khiết và tinh khiết) từ thực vật 3. Đánh giá hoạt tính sinh học một số chế phẩm quercetin thu nhận từ thực vật Nội dung nghiên cứu của luận án Nội dung 1. Nghiên cứu điều kiện thu dịch thủy phân; điều kiện sắc ký HPLC để định lƣợng quercetin trong dịch thủy phân thực vật nghiên cứu, gồm nụ hòe và một số mẫu thực vật thuộc danh mục có hoạt tính adaptogen (lá sen, ngũ vị tử, cam thảo, vỏ hành tây, lá chùm ngây, lá đinh lăng, rau đắng biển, rau má và bụp giấm). Nội dung 2. Thiết lập xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm quercetin (dạng tinh khiết và bán tinh khiết) từ một số thực vật để nghiên cứu hàm lƣợng và hoạt tính sinh học. Đánh giá hoạt tính in vitro (chống oxy hóa, kháng vi sinh vật kiểm định, kháng tế bào ung thƣ đại trực tràng) của chế phẩm quercetin thu nhận đƣợc. Nội dung 3. Đánh giá độc tính cấp và hoạt tính chống oxy hóa in vivo (trên chuột bị stress oxy hóa do độc tính của paracetamol hoặc sốc nhiệt) của mẫu quercetin dạng bán tinh khiết và dạng tinh khiết đƣợc thu nhận từ nụ hoa hòe. Những đóng góp mới của luận án - Luận án là công trình nghiên cứu có tính hệ thống về ảnh hƣởng của điều kiện chiết xuất đến hiệu quả thu nhận quercetin trên các mẫu chuẩn quercetin, rutin và một số thực vật của Việt Nam, để tạo mẫu chứa quercetin cho phân tích HPLC và nghiên cứu hoạt tính sinh học. - Luận án đã thiết lập mới quy trình thu nhận mẫu chứa quercetin dạng bán tinh khiết từ dịch chiết toàn phần của nụ hoa hòe (mẫu H1) với hiệu suất thu nhận cao hơn so với thu nhận từ rutin (mẫu H2). 3
Theo quy trình, luận án đã thu nhận đƣợc các chế phẩm quercetin có mức độ tinh khiết khác nhau từ mẫu thủy phân từ rutin (H2, 90,02%), mẫu thủy phân từ dịch chiết toàn phần nụ hoa hòe (H1, 59,19%) và lá sen (S, 10,85%). - Luận án đóng góp dữ liệu mới về hoạt tính sinh học của mẫu quercetin ở các mức độ tinh khiết khác nhau từ nụ hoa hòe (H1, H2,) về hiệu quả chống oxy hóa DPPH, kháng tế bào ung thƣ HCT116 và mức độ cải thiện tình trạng tổn thƣơng do stress oxy hóa của gan chuột nhắt trắng dƣới tác động của tác nhân paracetamol hoặc nhiệt độ cao, theo cách thức sử dụng là hỗ trợ dự phòng hoặc điều trị. Trong đó, mẫu quercetin bán tinh khiết thu đƣợc từ nụ hoa hòe (H1) có hoạt tính sinh học cao hơn, ít gây độc gan hơn so với quercetin chuẩn (Sigma) và quercetin tinh khiết thu nhận từ rutin (H2, hàm lƣợng 90,02%). CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ THỰC VẬT Thành phần có hoạt tính sinh học từ thực vật chủ yếu thuộc nhóm chất chuyển hóa thứ cấp, là sản phẩm cuối cùng của quá trình biểu hiện gen. Ngày nay, chất chuyển hóa thứ cấp đƣợc xác định là các hợp chất có trọng lƣợng phân tử thấp, có hoạt tính sinh học thuộc các nhóm alkaloid, isoprenoid (các terpenoid) và polyphenol. Thực vật có khoảng hơn 70% loài có giá trị làm thuốc, đƣợc 65% đến 80% dân số trên thế giới sử dụng trong chăm sóc sức khỏe. Xu hƣớng sử dụng các sản phẩm này ngày càng gia tăng. 1.1.1. Chế phẩm chứa hợp chất thứ cấp từ thực vật Chế phẩm chiết xuất là hình thức sử dụng của thực vật đƣợc phát triển trong y học hiện đại, với hợp chất đích đƣợc thu nhận ở dạng tinh khiết hoặc hỗn hợp với các thành phần khác có mức độ tinh khiết tăng dần (từ cao thô đến cao bán tinh khiết). 4
1.1.2. Thu nhận chế phẩm chiết xuất chứa hợp chất đích từ thực vật Theo hƣớng dẫn của tổ chức Y tế thế giới (WHO), quy trình thu nhận hợp chất thứ cấp từ thực vật bao gồm nhiều giai đoạn nối tiếp nhau, gồm chiết xuất thu dịch chiết, sau đó lọc loại tạp, làm giàu các hợp chất mục tiêu. Cuối cùng là các quá trình phân lập và tinh chế để tiêu chuẩn hóa sản phẩm 1.1.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu suất thu nhận, chất lƣợng của hợp chất thứ cấp Quy trình thu nhận hợp chất thứ cấp là sự kết hợp của kĩ thuật chiết xuất theo một số phƣơng pháp chiết xuất khác nhau, tùy thuộc vào đối tƣợng và mục tiêu chiết xuất. Quy trình chịu ảnh hƣởng nhiều nhất ở giai đoạn thu dịch chiết. Hiệu quả và khả năng lặp lại của giai đoạn thu dịch chiết chịu tác động trực tiếp của dung môi, kích thƣớc bột nguyên liệu, tỷ lệ nguyên liệu và dung môi, kĩ thuật chiết (thời gian chiết, nhiệt độ). 1.2. HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TỪ THỰC VẬT 1.2.1. Các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính chống oxy hóa Thực vật làm thuốc với đặc tính chống oxy hóa, đƣợc sử dụng thuốc thay thế để giảm thiểu bệnh liên quan đến stress oxy hóa . Trong các hợp chất polyphenol, flavonoid là nhóm lớn nhất và chất chống oxy hóa chính trong một số thực vật. Các nghiên cứu về chế độ ăn giàu flavonoid chủ yếu dựa trên hàm lƣợng của các hợp chất thuộc nhóm flavonol (quercetin, myricetin, kaempferol) và nhóm flavone (apigenin, luteolin). Trong đó, quercetin có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, là flavonoid chính có trong chế độ ăn, chiếm tỉ lệ từ 40 đến 100% tổng lƣợng flavonoid tiêu thụ hàng ngày 1.2.2. Đánh giá hàm lƣợng hợp chất thứ cấp và hoạt tính chống oxy hóa của mẫu chiết xuất từ thực vật Mẫu chiết xuất từ thực vật đƣợc thu nhận để làm giàu đơn chất 5
hoặc nhóm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học mong muốn, sử dụng cho mục đích cụ thể. 1.2.2.1. Xác định hợp chất đích trong mẫu chiết xuất Hệ thống HPLC thƣờng đƣợc sử dụng để trực tiếp phân tách, định tính, định lƣợng hoạt chất trong mẫu nghiên cứu. Điều kiện thực nghiệm cần đƣợc chuẩn hóa để đáp ứng yêu cầu của phƣơng pháp phân tích HPLC. 1.2.2.2. Đánh giá đặc tính chống oxy hóa dịch chiết thực vật Thử nghiệm độc tính và hoạt tính chống oxy hóa theo hƣớng bảo vệ tế bào trên cơ thể động vật bị gây tổn thƣơng bởi chất oxy hóa đƣợc đánh giá thông qua các chỉ tiêu huyết học, chỉ tiêu hóa sinh máu (ALT,enzym AST, creatinin, ure,..) và các chất chỉ thị cho tinh trạng stress oxy hóa (MDA, GSH,..) và các chỉ tiêu hành vi của động vật thí nghiệm. 1.3. CHIẾT XUẤT QUERCETIN TỪ THỰC VẬT Với nhiều đặc tính hóa học và sinh học độc đáo, quercetin là một trong những flavonoid đƣợc nghiên cứu nhiều nhất. Quercetin đƣợc tiếp cận nghiên cứu từ hai khía cạnh, gồm đặc tính hóa học và sinh học để đƣa ra các khuyến nghị về tác dụng chống oxy hóa cũng nhƣ áp dụng chất chống oxy hóa này trong lĩnh vực y dƣợc 1.3.1. Cấu trúc hóa học của quercetin Quercetin đƣợc xem là khung xây dựng cho các flavonoid khác với cấu trúc hóa học gồm 3 vòng thơm và 5 nhóm hydroxyl, có cấu tạo phân từ là C15H10O7. 1.3.2. Các điều kiện chiết xuất thu nhận quercetin từ thực vật . Quy trình thu nhận quercetin có thể đƣợc tiến hành theo nhiều phƣơng pháp với các kĩ thuật chiết xuất, hệ dung môi và đối tƣợng chiết xuất khác nhau, tùy thuộc vào mục đích thu nhận. 1.3.2.1. Chiết xuất quercetin từ thực vật sử dụng cho mục đích phân tích Các nghiên cứu thu nhận quercetin đƣợc đề cập chủ yếu đƣợc sử 6
dụng cho mục đích phân tích, chƣa đƣợc áp dụng cho nghiên cứu hoạt tính sinh học. 1.3.2.2. Chiết xuất quercetin từ thực vật tạo nguyên liệu ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm và y dược Hiện nay nguyên liệu quercetin dùng trong lĩnh vực thực phẩm và y dƣợc chỉ đƣợc thu nhận từ quá trình thủy phân rutin, chƣa đƣợc thu nhận trực tiếp từ thực vật. 1.4. ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ ỨNG DỤNG TRỊ LIỆU CỦA QUERCETIN 1.4.1. Đặc tính sinh học của quercetin Các công trình nghiên cứu gần đây về cơ chế tác dụng đã chỉ ra rằng, mặc dù quercetin có các quy luật tác động không hoàn toàn giống nhau nhƣng hiệu quả trị liệu trên in vivo đƣợc khởi nguồn chủ yếu từ hoạt tính chống oxy hóa. 1.4.2. Hoạt tính chống oxy hóa (anti-oxidant) của quercetin Quercetin có tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan chống lại tổn thƣơng gan cấp tính ở chuột gây ra bởi butyl hydro peroxide, paracetamol hoặc chất độc CCl4. Quercetin ức chế quá trình peroxid hóa lipid và tăng hoạt động chống oxy hóa và do đó có thể là một điều trị hiệu quả cho chấn thƣơng gan oxy hóa. 1.4.3. Tác dụng của quercetin trong phòng và hỗ trợ điều trị gan bị tổn thƣơng do sử dụng paracetamol liều cao Hiện nay, dữ liệu so sánh đồng thời về cách thức sử dụng (trƣớc và sau) của quercetin (dạng có mức độ tinh khiết cao) trong tình trạng sử dụng APAP dài ngày trên động vật thực nghiệm chƣa đƣợc công bố. Hơn nữa, nghiên cứu sử dụng chế phẩm quercetin ở mức độ tinh khiết thấp (bán tinh khiết) thu nhận từ thực vật (đặc biệt là nụ hoa hòe) trong bảo vệ tình trạng tổn thƣơng gan do APAP cũng chƣa đƣợc đề cập. 1.4.4. Hoạt tính tiền gốc oxi hóa (pro-oxidant) và ứng dụng trong trị liệu 7
Hiệu ứng tác dụng của quercetin trên in vivo phụ thuộc vào liều lƣợng và là sự phối hợp giữa hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính oxy hóa. Trên mức độ in vivo, quercetin có tác dụng chống lão hóa, tăng cƣờng sức chịu đựng, tăng sức bền, chống mệt mỏi; tăng quá trình hô hấp tế bào, tăng chức năng của thần kinh và trí nhớ, có tác dụng chống oxy hóa, tăng hấp thu. 1.5. MỘT SỐ THỰC VẬT SỬ DỤNG TRONG CHIẾT XUẤT QUERCETIN Quercetin là hợp chất có hoạt tính adaptogen, nhƣng hiện nay dữ liệu hàm lƣợng của quercetin trong các thực vật có hoạt tính adaptogen là chƣa đƣợc nghiên cứu đầy đủ. 1.5.1. Cây Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L) 1.5.2. Cây Cam thảo (Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC.) 1.5.3. Cây Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) 1.5.4. Cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms.) 1.5.5. Cây Hành tây (Allium cepa L) 1.5.6. Cây Hòe (Sophora japonica L) 1.5.7. Cây Ngũ vị tử (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill) 1.5.8. Cây Rau má (Centella asiatica L. Urb) 1.5.9. Cây Rau đắng biển (Bacopa monnieri L. Wettst) 1.5.10. Cây Sen (Nelumbo nucifera Gaertn.) CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Mẫu thực vật 10 mẫu thực vật : cây rau má (Centella asiatica (L.) Urban.), lá của cây đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms.), lá của cây chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) thu hái ở Bắc Giang; nụ hoa của cây hòe (Sophora japonica L.) thu ở Thái Bình; lá của cây sen (Nelumbo nucifera Gaertn.) thu hái ở Bắc Ninh; cây rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.) Wettst.) thu ở Ninh Thuận, đài hoa của cây 8
bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L.) thu ở Hà Nội, vỏ củ hành tây (Allium cepa L.) thu ở Đà Lạt, quả ngũ vị tử (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill) và rễ cam thảo (Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC.) thu ở Hà Nội. Mẫu đƣợc phân loại bởi ThS. Nguyễn Anh Đức và giữ tại Khoa Sinh học, Trƣờng ĐH Khoa học Tự nhiên. Các mẫu thu nhận trong thời gian 2015-2017. 2.1.2. Chủng vi sinh vật và dòng tế bào ung thƣ Các chủng vi sinh vật kiểm định gồm: E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 25923, B. subtilis ATCC 23857 và B. cereus ATCC 14579 đƣợc cung cấp từ Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, ĐHQGHN. Dòng tế bào ung thƣ đại trực tràng HCT116 đƣợc cung cấp từ Trƣờng ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN. 2.1.3. Động vật thí nghiệm Chuột giống đực, dòng Swiss albino khỏe mạnh, trọng lƣợng 25 - 30 g/con đƣợc Ban cung cấp Động vật thí nghiệm, Học viện Quân y cung cấp. Chuột đƣợc nuôi trong điều kiện tiêu chuẩn, đầy đủ thức ăn nƣớc uống trƣớc khi nghiên cứu 7 ngày và trong suốt thời gian thí nghiệm tại phòng thí nghiệm của Học viện quân Y, Bộ Quốc phòng. 2.1.4. Hóa chất nghiên cứu Chất chuẩn quercetin chuẩn hóa lý (ký hiệu QC) có mã số PHR1488-1G và quercetin chuẩn dƣợc lý (ký hiệu QUE) có mã số 337951-25G (Sigma Aldrich, Mỹ). Các dung môi hóa chất khác đạt yêu cầu cho nghiên cứu. 2.1.5. Thiết bị chính Bể siêu âm (Elma, Đức), tủ sấy chân không (MP 301zp, Mỹ), máy trộn (Maxi MixII, Mỹ), máy đo quang phổ (HALO RB10, Mỹ), máy phổ hồng ngoại IR (TENSOR II, Đức), Hệ thống HPLC (Agilent 1260 Infinity Bio-Inert Quaternary LC System, Đức),.. 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Nhóm phƣơng pháp hóa lý định tính, định lƣợng hợp chất thứ sinh 9
2.2.1.1. Phương pháp phân tích quercetin bằng HPLC Điều kiện cố định: cột pha đảo ZORBAX SB-C18 (Agilent) có kích thƣớc 4,6  150 mm, cỡ hạt 5 µm,.. Điều kiện khảo sát, tối ưu: 4 bƣớc sóng 283, 330, 367 và 370 nm , pha động , tốc độ dòng. 2.2.1.2. Phương pháp định tính một số nhóm hợp chất thứ cấp 2.2.1.3. Phương pháp định tính bằng sắc ký bản mỏng, đo điểm chảy, phổ hồng ngoại - Tiến hành sắc ký bản mỏng silicagel F254, điều chế vết tƣơng đƣơng mẫu chuẩn, đo điểm chảy và phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV) của các mẫu điểu chế đƣợc, so sánh với quercetin chuẩn (QC) và quercetin đối chiếu dƣợc lý (QUE). 2.2.1.4. Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid tổng số 2.2.2. Nhóm các phƣơng pháp chiết xuất quercetin từ thực vật Điều kiện thu nhận đƣợc thực hiện theo các phƣơng pháp của Nishimuro và cộng sự, Zhao và Zhang, Zhao và cộng sự đƣợc điều chỉnh phù hợp với điều kiện tách chiết và mục tiêu nghiên cứu. 2.2.2.1. Xử lý để loại tạp mẫu thực vật 2.2.2.2. Khảo sát lựa chọn hệ dung môi, kĩ thuật và xác định hàm lượng quercetin trong thực vật bằng HPLC 2.2.2.3. Khảo sát, lựa chọn điều kiện chiết xuất quercetin từ thực vật cho nghiên cứu hoạt tính sinh học 2.2.2.4. Thu nhận mẫu chứa quercetin từ cao chiết thủy phân và từ rutin chiết xuất từ thực vật được lựa chọn để nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro 2.2.3. Nhóm phƣơng pháp đánh giá hoạt tính in vitro 2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thông qua khả năng cho hydro Hoạt tính chống oxy hóa thông qua khả năng cho hydro đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Taskin và cộng sự. 10
2.2.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thông qua khả năng cho electron Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa qua độ hấp thụ quang và đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp mô tả bởi Wan C và cộng sự. 2.2.3.3. Phương pháp xác định năng lực khử Đánh giá năng lực khử qua độ hấp thụ quang và đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Ling và cộng sự. 2.2.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn dựa trên khuếch tán đĩa thạch theo phƣơng pháp của Kirby-Bauer đƣợc mô tả bởi Trang và cộng sự. 2.2.3.5. Phương pháp xác định hoạt tính kháng tế bào ung thư Đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thƣ dựa trên tác dụng giảm tỉ lệ sống sót của tế bào, theo phƣơng pháp mô tả bởi Carmona và cộng sự . 2.2.4. Nhóm phƣơng pháp đánh giá hoạt tính in vivo 2.2.4.1. Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp Đánh giá độc tính cấp của các mẫu thử hoạt tính gây chết chuột thí nghiệm, theo phƣơng pháp của Litchfield - Wilcoxon đƣợc mô tả bởi Tùng và cộng sự. 2.2.4.2. Phương pháp gây độc gan thực nghiệm và đánh giá khả năng cải thiện theo cách thức sử dụng của các mẫu chứa quercetin Phƣơng pháp gây mô hình viêm gan, sử dụng paracetamol liều cao, đƣợc tiến hành dựa trên các nghiên cứu của Mallhi và cộng sự, Sabir và cộng sự. a. Khảo sát mức liều phù hợp của paracetamol b. Gây mô hình và đánh giá hiệu quả can thiệp các mẫu chứa quercetin theo cách thức sử dụng 2.2.4.3. Phương pháp sốc nhiệt thực nghiệm và đánh giá khả năng cải thiện theo cách thức sử dụng của các mẫu chứa quercetin Phƣơng pháp sốc nhiệt đƣợc tiến hành dựa trên các nghiên cứu 11
của Chen. Y và cộng sự (sốc nhiệt mạn tính); cộng sự (sốc nhiệt cấp tính). a. Khảo sát, lựa chọn hình thức sốc nhiệt b. Gây mô hình và đánh giá hiệu quả can thiệp các mẫu chứa quercetin 2.2.4.4. Phương pháp nuôi dưỡng, thu thập mẫu, kiểm tra trực quan và phân tích các chỉ số cảm quan, hành vi, hóa sinh, huyết học, MDA, GSH a. Điều kiện nuôi dưỡng, thử nghiệm và lấy mẫu động vật thí nghiệm b. Kiểm tra trực quan gan: c. Phân tích chỉ số hóa sinh, huyết học d. Xác định hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA) và glutathion (GSH) trong gan chuột e. Phương pháp bơi gắng sức đánh giá sự mệt mỏi f. Phương pháp test hành vi qua mô hình y-maze để đánh giá hoạt động học tập-trí nhớ g. Phương pháp định tính quercetin trong máu chuột 2.2.5. Xử lý số liệu 2.2.6. Địa điểm nghiên cứu của luận án Viện Công nghệ mới, Viện Khoa học và Công nghệ quân sự, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN; Khoa Hóa thực phẩm, Viện Dinh dƣỡng, Bộ Y tế; Các bộ môn Sinh lý, Dƣợc lý và Y học Quân binh chủng thuộc Học viên Quân y. 2.2.7. Sơ đồ nghiên cứu 12
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG QUERCETIN TRONG MẪU THỰC VẬT LỰA CHỌN Điều kiện chiết xuất đã áp dụng trên các thực vật chủ yếu thực hiện theo kĩ thuật đun hồi lƣu hoặc siêu âm với hệ dung môi chứa methanol hoặc ethanol, có hoặc không có axit HCl [58]. Các mẫu dịch chiết đƣợc thu nhận để định tính thành phần hóa học, khảo sát hàm lƣợng flavonoid tổng số và định lƣợng quercetin bằng phƣơng pháp HPLC làm cơ sở cho thiết lập quy trình thu nhận. 3.1.1. Định tính một số thành phần hóa học và xác định hàm lƣợng flavonoid tổng số trong thực vật Nụ hoa hòe có hàm lƣợng flavonoid cao nhất, sau đó đến lá sen, lá chùm ngây, đài hoa bụp giấm, vỏ củ hành tây, thân cam thảo, lá đinh lăng, toàn cây rau má, hạt ngũ vị tử và thấp nhất là rau đắng biển. 3.1.2. Xác định hàm lƣợng quercetin trong thực vật bằng phƣơng pháp HPLC Để đánh giá hàm lƣợng quercetin, điều kiện sắc ký và xử lý mẫu cần đƣợc chuẩn hóa để đảm bảo tính phù hợp cũng nhƣ độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích HPLC trong các mẫu nguyên liệu khác nhau [152]. a. Tối ưu điều kiện sắc ký Từ các kết quả thu đƣợc, phƣơng pháp HPLC đƣợc xác định với điều kiện sắc ký nhƣ sau: thể tích tiêm mẫu 10 µl, bƣớc sóng 370 nm, hệ pha động có tỉ lệ A/C/D = 15/65/20, tốc độ dòng 1 ml/phút, phân tách theo cách thức đẳng dòng qua cột ZORBAX SB-C18 (Agilent), nhiệt độ phân tích 25oC, thời gian phân tích không quá 7 phút/mẫu. 13
b. Đánh giá tính phù hợp của điều kiện sắc ký Phƣơng trình đƣờng chuẩn này là phù hợp cho xác định hàm lƣợng quercetin theo diện tích píc khi phân tích bằng HPLC. Các thông số sắc ký đều đạt yêu cầu cho phân tích định lƣợng quercetin về độ lặp lại, độ chính xác và khoảng tuyến tính. 3.1.2.2. Khảo sát lựa chọn kĩ thuật đun hồi lưu hoặc siêu âm để thu nhận quercetin từ thực vật Từ kết quả này, kĩ thuật siêu âm và hệ dung môi chứa axit với chu kỳ chiết tƣơng ứng đƣợc sử dụng cho xử lý mẫu và định lƣợng quercetin bằng HPLC. 3.1.2.3. Xác định hàm lượng quercetin trong dịch chiết thủy phân từ thực vật - Với píc sắc ký đạt yêu cầu, diện tích píc quercetin đƣợc sử dụng để xác định hàm lƣợng quercetin theo đƣờng chuẩn HPLC, mức pha loãng từ 5 đến 250 lần 14
- Hàm lƣợng quercetin cao nhất là nụ hoa hòe rồi đến lá sen và lá chùm ngây và 7 thực vật còn lại; 9/10 mẫu có độ lệch chuẩn tƣơng đối đạt yêu cầu (RSD < 11%). - Vấn đề tiếp theo cần quan tâm nghiên cứu là kết hợp siêu âm với ngấm kiệt để giảm thời gian và lƣợng dung môi chiết xuất nhằm thu nhận mẫu quercetin từ thực vật từ lƣợng bột lớn hơn (60 đến 100g) cho thu nhận quercetin để nghiên cứu hoạt tính sinh học. 3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC IN VITRO CỦA CHẾ PHẨM CHỨA QUERCETIN TỪ MỘT SỐ THỰC VẬT Các điều kiện chiết xuất lựa chọn đƣợc đánh giá trên 10 mẫu thực vật theo các tiêu chí về hiệu suất thu nhận quercetin, độ lặp lại và hoạt tính chống oxy hóa in vitro. 3.2.1. Xác định hiệu quả thu nhận quercetin theo thời gian trên mẫu rutin và quercetin chuẩn Từ các kết quả thu đƣợc, thời gian 15 hoặc 30 phút đƣợc lựa chọn cho thu dịch chiết và thời gian 60 phút đƣợc lựa chọn cho thủy phân dịch chiết. 15
3.2.2. Xác định điều kiện chiết xuất phù hợp trên nụ hoa hòe chuẩn Từ các kết quả nghiên cứu trên nụ hoa hòe chuẩn, chúng tôi đã lựa chọn đƣợc điều kiện chiết xuất quercetin từ thực vật gồm ba giai đoạn, trên cơ sở kết hợp 2 kĩ thuật (siêu âm với ngấm kiệt) và 3 điều kiện chiết xuất (gồm trích ly, ngấm kiệt và thủy phân). 3.2.3. Thử nghiệm, đánh giá điều kiện chiết xuất trên 10 mẫu thực vật Kết quả cho thấy, chỉ có 5/10 thực vật có độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD < 11%). Các kết quả đánh giá cho thấy điều kiện chiết xuất là phù hợp để thu nhận mẫu quercetin từ các thực vật có hàm lƣợng quercetin khác nhau, với hiệu suất thu nhận và khả năng tái lặp đạt yêu cầu. 3.2.4. Hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết theo hệ dung môi có hoặc không có axit Hoạt tính sinh học của các mẫu thực vật đƣợc đánh giá thông qua hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết trƣớc và sau khi thủy phân của thực vật 3.2.4.1. Hoạt tính chống oxy hóa trong dịch chiết Thứ tự các mẫu thực vật theo hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết đã bị thay đổi từ lá chùm ngây. Trong đó, phần trăm quét gốc tự do của dịch chiết nụ hoa hòe gấp khoảng 1,5 lần lá sen và cả hai thực vật này cũng gấp trên 3 lần với các thực vật còn lại. 3.2.4.2. Hoạt tính chống oxy hóa trong dịch chiết thủy phân Kết quả cho thấy các mẫu dịch chiết thủy phân có hoạt tính cao hơn các mẫu dịch chiết. Các mẫu thực vật có phần trăm quét gốc tự do trên 20%, là cao thu nhận từ nụ hoa hòe, lá sen và rau đắng biển. Lá chùm ngây mặc dù có hàm lƣợng quercetin xếp thứ 3 trên rau đắng biển nhƣng sau khi pha loãng có hoạt tính chống oxy hóa là 16,31% lại thấp hơn rau đắng biển. 3.2.5. Thu nhận mẫu quercetin từ nụ hoa hòe và lá sen. 16