Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Chiết xuất, phân lập stipuleanosid R2 từ Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) làm nguyên liệu xây dựng chất chuẩn cho dược liệu

Chia sẻ: Chuheo Dethuong25 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:45

Thêm vào BST

Báo xấu

45
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Khóa luận được nghiên cứu với mục tiêu nhằm chiết xuất, phân lập và tinh chế stipuleanosid R2 có độ tinh khiết trên 95% từ dược liệu sâm vũ diệp. Bước đầu xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng stipuleanosid R2: nhiệt độ nóng chảy, dữ liệu phổ. Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập được.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp ngành Dược học: Chiết xuất, phân lập stipuleanosid R2 từ Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) làm nguyên liệu xây dựng chất chuẩn cho dược liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC BÙI THỊ THANH VÂN CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP STIPULEANOSID R2 TỪ SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) LÀM NGUYÊN LIỆU XÂY DỰNG CHẤT CHUẨN CHO DƯỢC LIỆU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2019
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI NU KHOA Y DƯỢC ,V Người thực hiện: Bùi Thị Thanh Vân y ac rm ha CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP STIPULEANOSID R2 TỪ dP SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) an LÀM NGUYÊN LIỆU XÂY DỰNG CHẤT CHUẨN CHO DƯỢC LIỆU ic ine ed KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC M (NGÀNH DƯỢC HỌC) of ol ho Sc @ Khóa : QH.2014.Y Người hướng dẫn: TS. NGUYỄN HỮU TÙNG ht rig py Hà Nội - 2019 Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
LỜI CẢM ƠN NU Trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận này, bên cạnh tôi luôn có sự giúp đỡ vô cùng quý giá đến từ các thầy cô giáo của Khoa Y Dược – Đại ,V học Quốc gia Hà Nội cùng với bạn bè và gia đình thân yêu của tôi. Thời điểm hoàn thành khóa luận cũng là lúc tôi dành những lời tri ân chân thành nhất đến những y người đã chỉ dạy, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. ac Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn của mình rm – TS. Nguyễn Hữu Tùng – Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội - thầy đã dành nhiều thời gian hướng dẫn, dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. ha Tôi xin cảm chị Đặng Thị Ngần – Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt dP tình chỉ dạy, đóng góp ý kiến để khóa luận của tôi được hoàn thiện. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới chị Nguyễn Thị Thu Thủy và anh Nguyễn Hoàng an Việt – Đại học Dược Hà Nội; cùng PGS.TS Dương Thị Ly Hương – Khoa Y Dược Đại học Quốc gia Hà Nội chủ nhiệm đề tài Tây Bắc đã giúp tôi có được kết quả để ine tiếp bước thực hiện nghiên cứu này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm Khoa, các thầy cô trong ic Khoa Y Dược, đặc biệt là bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc đã luôn tạo điều ed kiện cho tôi thực hiện khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể Dược học khóa QH.2014.Y, đặc biệt là M các bạn Hà, Hoa, Nhung, Thảo đã đồng hành cùng tôi suốt thời gian nghiên cứu. of Cuối cùng, tôi xin dành lời tri ân sâu sắc nhất tới gia đình thân yêu của tôi, đã nuôi nấng và tạo động lực để tôi có kết quả như ngày hôm nay. ol ho Sc Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2019 @ Sinh viên ht Bùi Thị Thanh Vân rig py Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN NU DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU ,V DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ y CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN ................................................................................ 2 ac 1.1. CHẤT CHUẨN, CHẤT ĐỐI CHIẾU ............................................................ 2 rm 1.1.1. Khái niệm ................................................................................................ 2 1.1.2. Ứng dụng ................................................................................................. 2 ha 1.1.3. Phân loại .................................................................................................. 3 dP 1.1.4. Sự cần thiết của việc thiết lập chất chuẩn đối chiếu .................................. 4 1.1.5. Phương pháp thiết lập chất chuẩn............................................................. 4 an 1.2. TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP ................................................................ 6 ine 1.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố .................................................................. 6 1.1.2. Thành phần hóa học ................................................................................. 7 ic 1.1.3. Tác dụng dược lý ..................................................................................... 8 ed 1.1.4. Công dụng ............................................................................................... 9 1.2. TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2 ..................................................... 9 M 1.2.1. Công thức hóa học và đặc điểm ............................................................... 9 of 1.2.2. Tác dụng sinh học .................................................................................. 10 1.2.3. Các nghiên cứu về stipuleanosid R2 ....................................................... 10 ol CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 11 ho 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ................................................................................. 11 Sc 2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu ......................................................................... 11 2.1.2. Dung môi, hóa chất ................................................................................ 11 @ 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ .................................................................................... 12 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ........................................................................ 12 ht 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 13 rig 2.3.1. Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế, xác định cấu trúc hóa học của stipuleanosid R2 ........................................................................................ 13 py 2.3.2. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất ...................................................... 14 Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
2.3.3. Phương pháp định tính, định lượng stipuleanosid R2 trong SVD bằng HPLC .............................................................................................................. 14 NU 2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu...................................................................... 15 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 16 ,V 3.1. Chiết xuất, phân lập và tinh chế Stipuleanosid R2 trong Sâm vũ diệp .......... 16 3.1.1. Chiết xuất .............................................................................................. 16 y 3.1.2. Phân lập ................................................................................................. 17 ac 3.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết của stipuleanosid R2 phân lập được bằng SKLM 18 rm 3.2. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng stipuleanosid R2 ........................................ 19 3.2.1. Đặc điểm cảm quan................................................................................ 19 ha 3.2.2. Điểm chảy.............................................................................................. 19 dP 3.2.3. Kết quả đo phổ....................................................................................... 19 3.3. Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 tinh chế được bằng HPLC 22 an 3.3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký .................................................... 22 3.3.2. Nhận dạng pic trên sắc ký đồ của stipuleanosid R2 phân lập được ........ 23 ine 3.3.3. Định lượng stipuleanosid R2 phân lập được ........................................... 24 ic CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ................................................................................... 29 ed 4.1. Về chiết xuất, phân lập và tinh chế .............................................................. 29 4.2. Bước đầu xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng .................................................... 30 M 4.3. Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập được bằng HPLC30 of 4.3.1. Xây dựng phương pháp .......................................................................... 30 4.3.2. Phân tích định tính và định lượng stipuleanosid R2 phân lập được ......... 30 ol KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 32 ho TÀI LIỆU THAM KHẢO Sc PHỤ LỤC @ ht rig py Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT NU BuOH n-Butanol CCĐC Chất chuẩn đối chiếu ,V EtOH Ethanol GC Sắc ký khí y HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao ac MeOH Methanol rm MS Khối phổ ha NRM Phổ cổng hưởng từ proton LOD Giới hạn phát hiện dP LOQ Giới hạn định lượng an RDS Độ lệch chuẩn tương đối SKĐ Sắc ký đồ ine SKLM Sắc ký lớp mỏng ic SVD Sâm vũ diệp ed UV Tử ngoại M of ol ho Sc @ ht rig py Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU NU Bảng 1. So sánh 2 loại chất chuẩn 3 Bảng 3.1. Hàm lượng cắn các phân đoạn chiết xuất từ Sâm vũ diệp 17 ,V Bảng 3.2. Kết quả đo điểm chảy của stipuleanosid R2 20 Bảng 3.3. Số liệu phổ 1H và 13C-NMR, DEPT của stipuleanosid R2 21 y ac Bảng 3.4. Chương trình dung môi 25 rm Bảng 3.5. Sự phù hợp hệ thống xác định độ tinh khiết 26 Bảng 3.6. Kết quả định lượng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn 28 ha dP an ic ine ed M of ol ho Sc @ ht rig py Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ NU Hình 1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) 6 Hình 1.2. Các hợp chất tách được từ rễ cây sâm vũ diệp 8 ,V Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của stipuleanosid R2 9 y Hình 2.1. Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào 11 ac Cai Hình 3.1. Quy trình chiết xuất stipuleanosid R2 18 rm Hình 3.2. Sơ đồ phân lập stipuleanosid R2 từ phân đoạn n-butanol 19 ha Hình 3.3. Sắc ký đồ của stipuleanosid R2 phân lập được sau khi phun TT H2SO4 20 dP 10% /EtOH Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của stipuleanosid R2 24 an Hình 3.5. SKĐ HPLC của stipuleanosid R2 phân lập được (A), cao BuOH (B) và 26 chất chuẩn đối chiếu (C) ine Hình 3.6. Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết của stipuleanosid R2 27 ic ed M of ol ho Sc @ ht rig py Co PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
ĐẶT VẤN ĐỀ Đất nước Việt Nam ta luôn tự hào được thiên nhiên ưu đãi, tạo hóa ban cho NU chúng ta một nguồn dược liệu “giàu có” so với các nước trong khu vực và trên thế giới. Thống kê của Viện Dược liệu cho thấy, cả nước đã ghi nhận 5.117 loài thực ,V vật và nấm, 408 loài động vật và 75 loại khoáng có công dụng làm thuốc, trong đó có nhiều loài dược liệu quý hiếm, đặc hữu như: sâm vũ diệp, sâm ngọc linh, ba y ac kích, ngân đằng, thông đỏ… Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm – Araliaceae) là một rm trong những dược liệu quý, phân bố ở Trung Quốc và dãy núi Hoàng Liên Sơn, Tây ha Bắc nước ta. Về mặt y học, sâm vũ diệp được sử dụng làm thuốc bổ và là thành phần trong một số bài thuốc truyền thống của các dân tộc vùng núi Tây Bắc có tác dP dụng chống ung thư, chống oxy hóa, bổ dưỡng, tăng trí nhớ... Theo như các tài liệu đã được công bố về sâm vũ diệp cho thấy các saponin là thành phần hoạt chất chính an mang lại tác dụng dược lý và giá trị sử dụng của dược liệu quý này trong y học, đặc biệt nói đến là stipuleanosid R2 – một saponin quan trọng có trong sâm vũ diệp. ine Để nâng cao chất lượng nghiên cứu về stipuleanosid R2 nói riêng và các hợp ic chất nói chung, việc kiểm tra, kiểm soát chất lượng dược liệu là vô cùng quan trọng. ed Song thực tế nước ta còn gặp khó khăn trong việc phân tích, kiểm nghiệm do thiếu các chất chuẩn cần thiết. Phần lớn chất chuẩn đang sử dụng phải nhập từ nước ngoài M với giá cao và thời gian đặt hàng kéo dài. Nhằm khắc phục nhược điểm này, cùng với mục tiêu phát triển tiềm năng của vị dược liệu quý sâm vũ diệp, chúng tôi đã of tiến hành nghiên cứu đề tài: “Chiết xuất, phân lập stipuleanosid R2 từ Sâm Vũ Diệp ol (Panax bipinnatifidus Seem.) làm nguyên liệu xây dựng chất chuẩn cho dược liệu”. ho Mục tiêu đề tài: - Chiết xuất, phân lập và tinh chế stipuleanosid R2 có độ tinh khiết trên 95% Sc từ dược liệu sâm vũ diệp. - Bước đầu xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng stipuleanosid R2: nhiệt độ nóng @ chảy, dữ liệu phổ. - Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập được. ht Kết quả của đề tài sẽ góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu thành phần hóa học, rig xây dựng tiêu chuẩn dược liệu sâm vũ diệp làm cơ sở cho các nghiên cứu hoạt tính py sinh học của stipuleanosid R2, nền tảng cho việc phát triển sâm vũ diệp trong điều trị. Co 1 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. CHẤT CHUẨN, CHẤT ĐỐI CHIẾU NU 1.1.1. Khái niệm Chất chuẩn (standard subtances) hay chất chuẩn đối chiếu (reference ,V standards) là chất cần thiết để đánh giá các nguyên liệu, bán thành phẩm, thành phẩm… theo các quy trình đã xác định nhằm đảm bảo kết quả phân tích đạt độ y chính xác, đáng tin cậy [28]. ac Chất chuẩn đối chiếu là một phần quan trọng của đo lường và thiết lập tính rm khả thi trong so sánh (comparability) và có thể truy nguyên được (traceability)[6]. Theo dược điển Việt Nam V: Chất đối chiếu là chất đồng nhất đã được xác ha định là đúng để dùng trong các phép thử đã được quy định về hóa học, vật lý và dP sinh học. Trong các phép thử đó các tính chất của chất đối chiếu được so sánh với các tính chất của chất thử. Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục an đích sử dụng [3]. Theo định nghĩa FDA: “Chất chuẩn đối chiếu (reference standards) là một lô ine hay mẻ của hợp chất làm thuốc được điều chế đặc biệt bằng cách tổng hợp độc lập hoặc bằng cách tinh chế bổ sung của nguyên liệu điều chế và được chứng minh ic bằng một loạt các thử nghiệm phân tích sâu rộng để xác định nó là nguyên liệu xác ed thực có độ tinh khiết tối đa, có thể đạt được một cách hợp lý. Nó thường được dùng M cho việc phân giải cấu trúc và chất làm chuẩn cho các chất chuẩn làm việc (working standards) [19]. of 1.1.2. Ứng dụng ol Chất đối chiếu được dùng trong các phép thử sau: ho - Định tính bằng phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại. - Định lượng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến, Sc quang phổ huỳnh quang. - Các phép thử định tính và định lượng bằng phương pháp sắc ký. @ - Định lượng bằng phương pháp vi sinh vật. ht - Các phép chuẩn độ đo thể tích, phân tích khối lượng. - Các phép thử sinh học. rig - Một số phép thử khác có hướng dẫn trong các chuyên luận riêng [3]. py Ngoài ra chất đối chiếu còn dùng để: - Thẩm định một phương pháp mới. Co - Chuẩn hóa các chất đối chiếu khác. 2 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
- Khẳng định giá trị pháp lý của một phương pháp đã chuẩn hóa [15]. NU 1.1.3. Phân loại Chất chuẩn được phân loại theo nhiều cách khác nhau, trong lĩnh vực khoa học dược phẩm, chất chuẩn được phân làm hai loại: chất chuẩn sơ cấp (primary ,V standards) và chất chuẩn thứ cấp (secondary standards). y - Chất chuẩn sơ cấp (primary standards): là các hợp chất với những chất lượng ac và độ tinh khiết được thiết lập độc lập, được chấp nhận mà không cần tham khảo các tiêu chuẩn khác. rm - Chất chuẩn thứ cấp (secondary standards): là các hợp chất mà chất lượng và ha độ tinh khiết được thiết lập dựa trên sự so sánh với chất chuẩn phân tích. So sánh 2 loại chất chuẩn: dP Bảng 1. So sánh 2 loại chất chuẩn [18] an Chất chuẩn sơ cấp Chất chuẩn thứ cấp Chất chuẩn phòng thí nghiệm, ine Tên gọi khác Chất chuẩn gốc chất chuẩn làm việc ic Độ tinh khiết 99.5% 95% ed Chất lượng Cao Kém hơn chất chuẩn sơ cấp M Được chấp nhận mà không cần so Yêu cầu phải so sánh với chất Đặc tính sánh chuẩn phân tích of - Dùng trong mục đích công ol nghiệp: ho + Quá trình phát triển thuốc Mục đích sử Dùng trong phòng thí nghiệm Sc + Nghiên cứu và phát triển (R&D) dụng và kiểm tra chất lượng (QC) + Chuẩn hóa dụng cụ, phương @ pháp và vật liệu. + Chuẩn hóa chất chuẩn thứ cấp ht Không sử Như thuốc hoặc mỹ phẩm cho Cho mục đích nghiên cứu yêu rig dụng người tiêu dùng cầu độ tinh khiết trên 95% py Được cung cấp từ nhà máy Tổng hợp độc lập và lượng sẵn có Tính sẵn có Bulk hoặc bào chế trong phòng Co vô cùng ít thí nghiệm 3 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
Giá cả Rất cao Thấp hơn NU 1.1.4. Sự cần thiết của việc thiết lập chất chuẩn đối chiếu Hiện nay, trên thế giới đã có một số chất chuẩn là những hợp chất đặc trưng ,V của dược liệu được sản xuất đạt mức độ tinh khiết nhất định. Trong số đó, chỉ có một số ít chất chuẩn được tiếp cận mua được, nhưng thường có giá rất đắt. Hoạt y động nghiên cứu thiết lập và sản xuất các chất chuẩn giúp cho công tác kiểm tra, ac giám sát chất lượng thuốc và nguyên liệu làm thuốc được dễ dàng và thuận tiện. rm Nguồn chất chuẩn ở Việt Nam hiện nay đã có hơn 500 chất chuẩn bao gồm chất chuẩn Quốc tế, chuẩn khu vực, chuẩn Dược điển Việt Nam, chuẩn phòng thí ha nghiệm, chuẩn chính. Tuy nhiên chủ yếu trong đó là chất chuẩn hóa học, rất ít chất dP chuẩn có nguồn gốc từ dược liệu. Sự thiếu hụt này đã và đang gây nhiều khó khăn cho ngành Dược như: an - Không kiểm tra, giám sát Dược liệu và các dạng bào chế có nguồn gốc từ dược liệu đang lưu hành trên thị trường một cách đầy đủ và toàn diện. ine - Không tiêu chuẩn hóa được các thuốc sản xuất trong nước bào chế từ dược liệu hoặc chiết xuất từ dược liệu về hàm lượng dược chất. Do đó khó có thể bào chế ic các thuốc có chất lượng cao phục vụ nhu cầu phòng bệnh và chữa bệnh. ed Do vậy nghiên cứu thiết lập chất chuẩn các hợp chất chiết xuất Dược liệu là M nhiệm vụ khoa học công nghệ cấp thiết, đòi hỏi nhu cầu thực tiễn khách quan. 1.1.5. Phương pháp thiết lập chất chuẩn of 1.1.5.1 Thiết lập, bảo quản và phân phối chất chuẩn sơ cấp Quy trình thiết lập chất chuẩn sơ cấp bao gồm các bước như sau [34]: ol - Đánh giá nhu cầu thiết lập chất chuẩn đối chiếu (CCĐC) ho - Lựa chọn nguồn nguyên liệu dùng để thiết lập CCĐC từ nhà cung cấp - Đánh giá chất chuẩn đối chiếu: Sc + CCĐC dùng cho phép thử định tính: Thông thường chỉ cần kết quả đánh giá @ từ một phòng thí nghiệm đủ tiêu chuẩn. + CCĐC dùng cho phép thử độ tinh khiết: Yêu cầu mô tả đặc tính rộng hơn so ht với phép thử định tính, đặc biệt khi sử dụng trong các phép thử giới hạn. Nếu sử rig dụng kĩ thuật SKLM, thường đề nghị độ tinh khiết tối thiểu (≥ 90%), nhưng yêu cầu độ tinh khiết cao hơn (≥ 95%) đối với kỹ thuật HPLC hoặc GC. Thông thường chỉ py cần một phòng thí nghiệm tham gia đánh giá CCĐC dùng cho phép thử độ tinh khiết. Nếu CCĐC được phân lập hoặc điều chế lần đầu tiên thì cần tiến hành một số Co phép thử hóa lý như phổ NMR, phổ MS và phân tích nguyên tố để mô tả đặc tính. 4 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
+ Các CCĐC dùng cho phép định lượng: Phạm vi các phép thử rất rộng, sử dụng nhiều kỹ thuật đã được thiết lập và thẩm định, bao gồm các phương pháp đã NU được sử dụng để đánh giá tiêu chuẩn chất lượng trong dược điển. Khi định lượng các CCĐC bằng các phương pháp không đặc hiệu, như đo quang phổ UV hay so ,V màu, cần phải xác định hàm lượng nước và lượng dung môi tồn dư. Khi định lượng bằng các phương pháp đặc hiệu, cần phải xác định hàm lượng tạp chất. Trong y trường hợp này, khuyến khích sử dụng thêm các phương pháp tuyệt đối để định ac lượng chất chính. rm + Các CCĐC dùng để hiệu chuẩn thiết bị: Yêu cầu phạm vi các test đánh giá như đối với định lượng. ha - Phân tích định tính, định lượng để đánh giá chất chuẩn sơ cấp. dP - Xác định giá trị ấn định. - Xác định thông tin cần cung cấp kèm theo chất chuẩn sơ cấp. an - Đóng gói, bảo quản, nghiên cứu độ ổn định. 1.1.5.2. Thiết lập, bảo quản và phân phối chất chuẩn thứ cấp ine Trên cơ sở tham khảo quy trình thiết lập chất chuẩn sơ cấp, các hội đồng dược điển quốc gia hay khu vực hoặc các phòng thí nghiệm được ủy quyền của cơ ic quan quản lý dược quốc gia xây dựng quy trình thiết lập chất chuẩn thứ cấp hay ed chất chuẩn làm việc của cơ sở đó. Việc thiết lập chất chuẩn làm việc dựa trên chất chuẩn sơ cấp thường được tiến hành do nhu cầu thực tế, khi nguồn chất chuẩn sơ M cấp không đủ cung cấp cho nhu cầu sử dụng trong công tác nghiên cứu và đảm bảo of chất lượng thuốc. Việc phân loại chất chuẩn làm việc mang ý nghĩa tương đối. Một chất chuẩn ol làm việc của khu vực hay quốc gia có thể được coi là chất chuẩn sơ cấp để thiết lập ho chất chuẩn phòng thí nghiệm hoặc các nhà sản xuất dược phẩm. Trong trường hợp này, các chất chuẩn khu vực hay quốc gia được gọi là chuẩn liên kết. Sc Theo quy định của ASEAN, chương trình đánh giá lại chất chuẩn đối chiếu @ ASEAN (ACRS) được thiết kế để phát hiện các dấu hiệu sớm của quá trình phân hủy bằng các kỹ thuật phân tích phù hợp. Các kỹ thuật này phải đáp ứng được các ht yêu cầu: sử dụng lượng mẫu ít, tiến hành nhanh, độ nhạy cao. Tần suất và cỡ mẫu rig dùng cho đánh giá lại phụ thuộc một số yếu tố như độ ổn định của CCĐC, đồ bao gói, nút đóng của đồ bao gói, điều kiện bảo quản, độ ẩm, tính chất vật lý và mục py đích sử dụng của CCĐC. Đối với ACRS tần suất đánh giá lại được quy định như sau: 3 năm đối với CCĐC dùng cho phép thử hóa học, 2 năm đối với CCĐC dùng Co 5 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
cho phép thử vi sinh, 1 năm đối với các chất đặc biệt nhạy cảm. Chương trình đánh giá lại thường bao gồm một số thử nghiệm sau: NU - Xác định hàm lượng nước, mất khối lượng khi sấy khô. - Xác định tạp chất bằng HPLC hoặc SKLM. ,V - Xác định hàm lượng chất chính. - Xác định độ tinh khiết bằng đo nhiệt vi sai, nếu thích hợp. y ac 1.2. TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 1.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố rm Sâm vũ diệp có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem. [2,12], thuộc chi ha Nhân sâm (Panax. L), họ Ngũ gia bì (Araliaceae), bộ Hoa tán (Apiales) [1]. SVD là cây thân thảo sống nhiều năm, ưa bóng và rất ưa ẩm [2,12]. Thân rễ dP dài có nhiều đốt và những vết sẹo do thân rụng hàng năm để lại. Thân khí sinh mảnh, cao 20 - 30 cm, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, thường an lụi vào mùa đông, mọc chồi thân mới từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3 dương lịch. Lá kép chân vịt, gồm 2 - 3 chiếc mọc vòng. Lá chét gồm 5 - 7 (ít khi 3) lá thuôn, dài ine 2,5 - 14 cm, rộng 1,5 - 4 cm, gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy không ic đều, mép có răng cưa, có lông. Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn; cuống cụm hoa 5 – 10 cm; cụm hoa có từ 20 ed – 90 hoa; cuống hoa mảnh dài 1 – 1,5 cm. Hoa màu trắng đục, mọc thành tán đơn ở M ngọn thân, 5 cánh hoa, bầu 2 - 3 ô [2]. Quả hình cầu đến hình cầu dẹt; đường kính 0,6 – 1,2 cm; khi chín màu đỏ, có chấm đen ở đầu, chứa 1 – 2 hạt. Hạt hình cầu of hoặc gần cầu, màu xám trắng; vỏ cứng, có rốn hạt [2,11]. ol ho Sc @ ht rig py Co Hình 1.1. Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) 6 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
SVD là loài sâm mọc tự nhiên và được phát hiện tương đối sớm ở nước ta. Trên thế giới, SVD được tìm thấy ở Trung Quốc, Ấn Độ và Nepan (vùng cận NU Hymalaya), tại Việt Nam dược liệu này phân bố ở dãy núi Hoàng Liên Sơn: huyện Sa Pa, Bát Xát - Lào Cai và huyện Than Uyên - Lai Châu Tây Bắc [2,11-12] ở độ ,V cao 1900-2400 m, trong rừng ẩm. y 1.1.2. Thành phần hóa học ac Saponin là thành phần chính của lá và rễ cây SVD, trong đó bao gồm saponin khung oleanan với hàm lượng tương đối cao cùng với một số saponin rm khung dammaran với hàm lượng thấp hơn [8,13]. Saponin bao gồm: ginsenoside, ha notoginsenoside và chikusetsusaponin là các hợp chất có hoạt tính chính trong nhóm dược liệu này [35]. dP Năm 1989, các nhà khoa học Trung Quốc đã công bố phân lập được 13 saponin khung dammaran từ lá của dược liệu này ở Trung Quốc trong đó bao gồm an một số ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và ine Rb3 [31]. Năm 2002, nghiên cứu của Trần Công Luận cho thấy kết quả định tính sơ bộ ic trong thân rễ và rễ củ SVD có chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin ed cùng với acid béo, acid amin [12]. Năm 2003, đã xác định thành phần saponin ở thân rễ SVD chủ yếu là M saponin triterpen thuộc nhóm oleanan gồm những chất như chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid Ro. Ngoài ra còn có các saponin triterpen nhóm of dammaran như Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2 [11]. ol Năm 2018, nhóm nghiên cứu của Đại học Quốc gia Hà Nội đã phân lập được ho hai saponin từ rễ của SVD: stipuleanosid R2 và aralosid A methyl este [30]. Như vậy, tổng cộng có 28 hợp chất saponin đã được xác định từ các phần Sc của cây SVD. @ ht rig py Co 7 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
Me Methyl NU Ara(f) α- L-arabinofuranosyl Ara(p) α-L-arabinopyranosyl ,V Glc β-D-glucopyranosyl Xyl β-O-xylopyranosyl y ac rm ha Compoud R1 R2 R3 R4 R5 dP 1: Ara(p) H H Me H 2: H Xy (16)glc H Me H an 3: Xy Ara(p) H Me Glc 4: H H Ara(p) Me H ine 5: H H H Me Glc 6: Xy H H Me H 7: H Glc Arara(f) H H ic 8: Xy H H Me Glc ed 9: Xy Ara(p) H H Glc 10: H Glc Ara(f) Me Glc M Hình 1.2. Các hợp chất tách được từ rễ cây sâm vũ diệp [24] of ol 1.1.3. Tác dụng dược lý ho Năm 2016, nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố kết quả sàng lọc hoạt tính diệt tế bào ung thư từ 57 cây trong cơ sở dữ liệu y học cổ truyền Trung Quốc, Sc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) là một trong số những loài thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư [21]. @ Năm 2017, nghiên cứu về SVD có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu trên in ht vitro ở các phân đoạn và các mức liều: phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol, phân rig đoạn ethylacetat có tác dụng ở các mức liều: 0,5-1-2-5 mg/mL, phân đoạn ether ở các mức liều 1-2-5 mg/mL [10]. py Co 8 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
Ngoài ra, các nhà nghiên cứu khám phá ra SVD nhờ các thành phần ginsenoside Rh1, Rh2, Rg1, Rg2 và chikusetsusaponin L5 có khả năng ức chế hoạt NU động enzyme tyrosinase trên 50% [35] – một enzyme có tác dụng tổng hợp melanin tạo sắc tố da, nếu thừa enzyme này sẽ làm da đen, sạm và nám. ,V 1.1.4. Công dụng y Rễ cây SVD ngâm rượu rồi chiết dưới dạng tinh sâm dùng rất tốt cho sức ac khỏe đặc biệt là chức năng sinh dục. Ngoài ra nhân dân ở vùng trồng còn tận dụng cả thân và lá nấu cao rồi dùng để pha với nước hoặc rượu để uống cũng có tác dụng rm như rễ. Ở Trung Quốc, SVD còn được dùng làm thuốc chữa lao, chảy máu cam, thổ ha huyết, đòn ngã tổn thương [5,11]. dP 1.2. TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2 Stipuleanosid R2 là một hợp chất saponin quan trọng chiếm tỷ lệ lớn nhất an trong SVD tính đến thời điểm nghiên cứu hiện nay, thành phần mang hoạt tính, đang tiếp tục được sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học, hợp chất này ine được phân lập trong một số dược liệu như: sâm vũ diệp, tam thất hoang, Aralia taibaiensis [29], Aralia elata [27] ... ic ed 1.2.1. Công thức hóa học và đặc điểm M of ol ho Sc @ ht rig py Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của stipuleanosid R2 [37] Co 9 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: (2S,3S,4R,5R,6R)-6-[[(3S,4aR,6aR,6bS,8aS,12aS,14aR,14bR)-4,4,6a,6b,11,11,14b- NU heptamethyl-8a-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2- yl]oxycarbonyl-1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14a-tetradecahydropicen-3-yl]oxy]- ,V 3-[(2S,3R,4R,5S)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-5-hydroxy-4- [(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxane-2- y carboxylic acid [33]. ac Công thức phân tử: C53H84O23 [37]. rm Phân tử lượng: 1089,232 g/mol [38]. Tính chất lý hóa: Chất bột màu trắng, độ tan: 0,57 g/l [38], điểm nóng chảy 210 - ha 2150C [22]. dP 1.2.2. Tác dụng sinh học Theo kết quả của một số nghiên cứu in vitro trên thế giới, các nhà khoa học an đã chứng minh rằng stipuleanosid R2 có tác dụng gây độc tế bào ung thư [27]; ức ine chế sự gia tăng các tế bào ung thư bạch cầu đặc biệt là đối với dòng tế bào K562 và U937 [22]; có tác dụng chống oxy hóa [32]; hạ đường huyết, điều hòa miễn dịch và ic hạ lipid máu [31]. ed 1.2.3. Các nghiên cứu về stipuleanosid R2 M Hiện nay trên thế giới và trong nước vẫn chưa có nhiều các nghiên cứu công bố về hợp chất stipuleanosid R2 trong dược liệu. Các nghiên cứu đang dừng lại ở of việc phân lập hợp chất này trong các dược liệu và xây dựng được phương pháp định ol lượng hợp chất stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD [9]. Chính vì vậy để nâng cao chất lượng nghiên cứu cần phải có những tiêu chuẩn cho chất chuẩn stipuleanosid ho R2… Sc @ ht rig py Co 10 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU NU 2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được trồng và thu hái ở Sa Pa, ,V Lào Cai là dược liệu được nghiên cứu trong đề tài này. Mô tả đối tượng nghiên cứu: thân rễ SVD có nhiều đốt và những vết sẹo, y ac cong ngoằn ngoèo, dài 7-12 cm, đường kính 1,2-1,8 cm. Thể chất cứng chắc, giòn, dễ bẻ, mặt bẻ lởm chởm, màu vàng nâu nhạt. Mùi thơm nhẹ, vị đắng, hơi ngọt. rm Xử lí mẫu: thân rễ SVD rửa sạch, để khô, thái lát mỏng, sấy khô ở 500C đến ha hàm ẩm đạt dưới 10%, bảo quản trong túi nilong kín, để nơi khô ráo, thoáng mát để sử dụng trong nghiên cứu. dP an ic ine ed M of Hình 2.1. Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào ol Cai ho 2.1.2. Dung môi, hóa chất Sc - Dung môi công nghiệp được cất lại trước khi dùng (chiết xuất dược liệu, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột) gồm: @ + Ethanol (EtOH) + Methanol (MeOH) ht + n-Hexan rig + Dicloromethan (CH2Cl2) + Cloroform (CHCl3) py + Ethylacetat (EtOAc) Co + n-butanol (BuOH) - Chất chuẩn liên kết stipuleanosid R2 (Wako Chemicals, Nhật Bản, độ tinh 11 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
khiết 98%, mã sản phẩm 155-01701) - Dung môi chạy sắc ký HPLC (Methanol, acetonitril) của Merck, Đức NU - Hạt nhồi dùng cho sắc ký cột loại: + Pha thường silica gel 60 (230-400 mesh, Nacalai Tesque, Nhật Bản) ,V + Pha đảo YMC ODS-A (50 μm, YMC Co. Ltd., Nhật Bản) - Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm loại pha thường Kieselgel 60 F254 và pha y đảo TLC Silica gel 60 RP-18 F254S (Merck, Damstadt, Đức). Phát hiện chất bằng ac đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch rm H2SO4 10% hơ nóng để phát hiện vết chất. ha 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ Trong quá trình nghiên cứu đề tài, chúng tôi đã sử dụng các thiết bị, dụng cụ dP đáp ứng tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và GLP tại Khoa Y Dược, ĐH Quốc gia Hà Nội: an - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1260 Infinity (Agilent ine Technologies, Mỹ) với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động - Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức), tủ hút ic - Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai số ed 0,0001g, Precisa - Thụy Sĩ) - Cân xác định hàm ẩm Prescisa HA 60 M - Máy siêu âm Power sonic 405 (Powersonic - Hàn Quốc) - Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Thụy Sĩ) of - Máy đo điểm nóng chảy BUCHI 535 ol - Bếp điện, bếp đun cách thủy ho - Cột sắc ký các loại kích cỡ - Màng lọc 0,45 µm Sc - Dụng cụ thủy tinh: bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, bình định mức, bình cầu dung tích 50 - 2000 mL, ống nghiệm, pipet chính xác @ 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ht - Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế stipuleanosid R2 từ dược liệu rig sâm vũ diệp. - Bước đầu xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng stipuleanosid R2: nhiệt độ nóng py chảy, dữ liệu phổ. Co - Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 tinh chế được. 12 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma