Tóm tắt dự thảo Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo que thử để phát hiện nhanh các độc tố ruột của tụ cầu khuẩn trong thực phẩm

Chia sẻ: Nguyễn Khắc Hấn | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

90
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án "Nghiên cứu tạo que thử để phát hiện nhanh các độc tố ruột của tụ cầu khuẩn trong thực phẩm" là phát triển một bộ sinh phẩm dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch để phát hiện nhanh các SE từ SEA đến SEE trong thực phẩm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt dự thảo Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo que thử để phát hiện nhanh các độc tố ruột của tụ cầu khuẩn trong thực phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Trần Thị Sao Mai NGHIÊN CỨU TẠO QUE THỬ ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH CÁC ĐỘC TỐ RUỘT CỦA TỤ CẦU KHUẨN TRONG THỰC PHẨM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62420107 (DỰ THẢO) TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC HÀ NỘI - 2014
Công trình đƣợc hoàn thành tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. NGUYỄN THỊ KHÁNH TRÂM 2. TS. LÊ QUANG HÒA Phản biện : ......................................................................... Phản biện : ......................................................................... Phản biện : ......................................................................... Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm Luận án Tiến sĩ họp tại................................................... vào hồi giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm thông tin Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội
MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Ngộ độc thực phẩm đã có từ lâu và hiện vẫn xảy ra ở nhiều nơi trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam làm ảnh hƣởng lớn đến sức khỏe con ngƣời và kinh tế xã hội. Theo cơ quan Quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA), hiện tại mỗi năm trên thế giới vẫn có khoảng 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm (NĐTP) với 325 nghìn ngƣời phải nhập viện và khoảng 5 nghìn ngƣời chết vì NĐTP. Nguyên nhân gây ra NĐTP có thể từ hóa chất, vi sinh vật, độc tố tự nhiên hoặc không rõ nguyên nhân nhƣng ghi nhận từ thực tế các vụ NĐTP đã xảy ra cho thấy nguyên nhân chính là do thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật. Trong số các tác nhân từ vi sinh vật gây NĐTP thì Staphylococcus aureus (S.areus) là một trong những vi khuẩn gây ngộ độc phổ biến nhất. S. aureus là vi khuẩn hình cầu, Gram dƣơng, phân bố rải rác trong tự nhiên nhƣng chủ yếu đƣợc phân lập từ da, tóc, màng nhày, mũi của ngƣời và gia súc. Ngộ độc thực phẩm do tụ cầu đƣợc định nghĩa là sự tiêu thụ các độc tố đƣờng ruột, vốn đã tồn tại sẵn trong thực phẩm, do các chủng tụ cầu có coagulase dƣơng tính, đặc biệt là S. aureus tổng hợp nên. Các phƣơng pháp phân tích độc tố ruột tụ cầu (Staphylococcus Enterotoxin – SE) trong thực phẩm hiện nay còn nhiều bất cập do tính phức tạp trong sử dụng, giá thành cũng nhƣ yêu cầu về trang thiết bị. Phƣơng pháp tiêu chuẩn để phát hiện SE trong thực phẩm hiện nay là phƣơng pháp ELISA. Trên thị trƣờng thế giới hiện nay có nhiều bộ sinh phẩm để phát hiện các SE trong thực phẩm nhƣ TRANSIA, RIDASCREEN, TECRA và VIDAS. Nguyên tắc của các bộ sinh phẩm này đều dựa trên kỹ thuật ELISA kẹp đôi. Toàn bộ quy trình phân tích này thƣờng kéo dài từ 90 phút đến 4 giờ. Ngƣỡng phát hiện của các bộ sinh phẩm này thƣờng dao động từ 0,1-5 ng/g hoặc ml mẫu tùy thuộc vào loại thực phẩm phân tích. Tuy nhiên, một trong những nhƣợc điểm cơ bản của các bộ sinh phẩm này là cần một máy đọc ELISA chuyên dụng để phân tích kết quả. Yêu cầu này hạn chế đáng kể khả năng phân tích hiện trƣờng của các bộ sinh phẩm. Mặt khác, giá thành của các bộ sinh phẩm nhập ngoại rất đắt, quy trình phân tích khá phức tạp. Xu hƣớng trên thế giới hiện nay là phát triển các phƣơng pháp phân tích 1
nhanh, dễ sử dụng để phân tích sàng lọc một số lƣợng lớn mẫu ngay tại hiện trƣờng. Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới đã thành công trong việc phát triển que thử phát hiện SE dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch nhằm đơn giản hóa và rút gọn thời gian phân tích xuống còn 30 phút. Hơn nữa, tại Việt Nam việc kiểm định an toàn thực phẩm phần lớn mới chỉ dừng lại ở việc phát hiện vi khuẩn tụ cầu mà chƣa phân tích tới SE, nguyên nhân chính gây NĐTP do tụ cầu. Từ thực tế trên, tôi thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu tạo que thử để phát hiện nhanh các độc tố ruột của tụ cầu khuẩn trong thực phẩm”. Mục tiêu của đề tài Mục tiêu của đề tài luận án là phát triển một bộ sinh phẩm dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch để phát hiện nhanh các SE từ SEA đến SEE trong thực phẩm. Nội dung nghiên cứu của đề tài - Sản xuất và tinh sạch SE tái tổ hợp SEA, SEC1 và ứng dụng để phát triển que thử; - Sản xuất và tinh sạch kháng thể lòng đỏ trứng: IgY kháng BSA và IgY kháng các SE (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE), ứng dụng để tạo que thử ; - Nghiên cứu tối ƣu hóa quá trình cố định kháng thể lên que thử; - Nghiên cứu xác định độ nhạy của que thử. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài Đến nay, ở nƣớc ta việc đánh giá rủi ro vi sinh vật đối với S. aureus chỉ dựa vào việc xác định và định lƣợng tụ cầu có phản ứng coagulase dƣơng tính đƣợc phân lập trong các sản phẩm thực phẩm, phƣơng pháp này cần nuôi cấy vi khuẩn trong phòng thí nghiệm và thời gian để trả lời kết quả khoảng 1 tuần. Tuy vậy, kết quả phân tích chỉ cho thấy trong mẫu thực phẩm có vi khuẩn tụ cầu vàng hay không mà không tìm ra có độc tố do vi khuẩn tiết ra, là nguyên nhân thực sự gây NĐTP do tụ cầu. Kết quả nghiên cứu của đề tài luận án đã giải quyết hạn chế này. Việc tạo ra que thử đã phát hiện đƣợc các SE với thời gian phân tích ngắn, đơn giản, dễ sử dụng, thích hợp với các phân tích hiện trƣờng không cần các thiết bị phức tạp, đắt tiền. Các nguyên liệu chính để sản suất que thử (các kháng nguyên và kháng thể) đều 2
đƣợc chúng tôi chủ động tạo ra. Kết quả của đề tài luận án góp phần vào việc kiểm soát tốt hơn các độc tố ruột tụ cầu, qua đó giảm thiểu các vụ NĐTP và số ngƣời bị NĐTP do tụ cầu vàng gây ra, nâng cao sức khỏe cộng đồng. Điểm mới của luận án Kết quả nghiên cứu nổi bật của đề tài luận án là đã tạo ra que thử phát hiện đƣợc các SE từ SEA đến SEE qua việc sản xuất đƣợc kháng nguyên tái tổ hợp SEA, SEC1 và việc sản xuất, tinh sạch đƣợc kháng thể lòng đỏ trứng gà (IgY) kháng BSA, kháng thể IgY kháng các đƣợc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED, SEE). Cấu trúc của luận án Ngoài phần mở đầu và kết luận, kiến nghị, luận án gồm 3 chƣơng: - Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu nghiên cứu - Chƣơng 2: Đối tƣợng, vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu - Chƣơng 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận - Phần phụ lục: Một số kết quả và hình ảnh nghiên cứu CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỤ CẦU KHUẨN 1.1.1. Đặc điểm sinh học của tụ cầu khuẩn Tụ cầu khuẩn còn gọi là tụ cầu vàng - Staphylococcus aureus là những cầu khuẩn có đƣờng kính từ 0,8-1,0 μm và xếp lại với nhau thành hình chùm nho, bắt màu Gram dƣơng, coagulase và catalase dƣơng tính, không có lông, không có vỏ, không sinh nha bào [1]. 1.1.2. Những yếu tố ảnh hƣởng tới sản sinh độc tố ruột của tụ cầu vàng Ở các điều kiện thông thƣờng, tụ cầu vàng phát triển đạt số lƣợng khoảng 10 cfu/g là đã có thể tạo ra độc tố. Tụ cầu cần có những axit amin khác nhau 6 cho quá trình sinh trƣởng và sản sinh độc tố [82]. Nhiệt độ tối thiểu cho sản sinh độc tố ruột tụ cầu là 100C và nhiệt độ tối đa là 480C, khoảng tối ƣu là từ 40 đến 450C [97]. Nồng độ muối tối đa cho sự sản xuất độc tố là dƣới 12%, nhƣ vậy nếu nồng độ muối từ 12% trở lên thì sự sản xuất độc tố tụ cầu sẽ bị ức chế [82]. Điều kiện thích hợp nhất cho quá trình hình thành độc tố là pH trung tính, quá trình này bị giảm hay bị ức chế ở pH axit. 3
1.2. ĐỘC TỐ RUỘT CỦA TỤ CẦU VÀNG 1.2.1. Đặc điểm sinh hóa, lý hóa và di truyền của độc tố ruột của tụ cầu Cho đến nay, ngƣời ta đã thống kê đƣợc ít nhất có 21 loại SE, có bản chất là những chuỗi protein đơn có khối lƣợng phân tử thấp (khoảng từ 22 đến 29 kDa), mỗi chuỗi có những vị trí kháng nguyên chuyên biệt. Các độc tố này dễ tan trong nƣớc và trong các dung dịch muối. Đặc biệt, các SE đƣợc mô tả hầu hết là có tính ổn định cao, chúng có tính chịu nhiệt và không bị protease thông thƣờng nhƣ pepsin, trypsin, chymotrypsin, papain, … thủy phân vì thế chúng giữ nguyên đƣợc cấu trúc trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời [82]. 1.2.2. Hoạt tính sinh học của các độc tố ruột tụ cầu Hoạt tính sinh học của SE bao gồm hoạt tính siêu kháng nguyên (superantigen) và hoạt tính gây nôn. Hoạt tính siêu kháng nguyên: gây sốt, kích hoạt hệ miễn dịch và tăng nhanh số lƣợng tế bào T không chuyên biệt. 1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU 1.3.1 Phép thử sinh học Nguyên tắc của các phép thử sinh học dựa trên việc phân tích khả năng gây các triệu chứng điển hình nhƣ nôn, tiêu chảy trên các động vật thí nghiệm hoặc hoạt động siêu kháng nguyên trong nuôi cấy tế bào. Liều lƣợng SE tối thiểu cần sử dụng là khoảng 200 ng [80]. 1.3.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử Các phản ứng PCR thƣờng dùng là uniplex và multiplex PCR và gần đây là real-time PCR [24, 40, 85]. 1.3.3. Phƣơng pháp miễn dịch Phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng nhất hiện nay để phát hiện SE trong thực phẩm là các phƣơng pháp miễn dịch. Những phƣơng pháp này bao gồm: phƣơng pháp khuếch tán trên gel, phƣơng pháp ngƣng kết hạt latex – RPLA sử dụng các bộ kit RPLA và phƣơng pháp ELISA [40]. 1.4. KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH VÀ ỨNG DỤNG 4
1.4.1. Cấu trúc và phân loại của hệ thống sắc ký miễn dịch Cấu trúc của hệ thống sắc ký miễn dịch (HTSKMD) thƣờng gồm các hợp phần đƣợc biểu diễn trong Hình 1.1 dƣới đây [69]: Hình 1.1. Các hợp phần trong hệ thống sắc ký miễn dịch Kỹ thuật sắc ký miễn dịch thƣờng đƣợc chia làm hai loại chính là sắc ký miễn dịch kẹp đôi và sắc ký miễn dịch cạnh tranh. - Sắc ký miễn dịch kẹp đôi: tại vị trí vạch thử nghiệm một kháng thể thứ hai (khác với kháng thể cộng hợp có màu) có khả năng bắt cặp với kháng nguyên cần phân tích đƣợc cố định. Nếu các độc tố có mặt trong mẫu phân tích, chúng sẽ tƣơng tác với kháng thể cộng hợp tạo thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể cộng hợp có màu. Dƣới tác dụng của lực mao quản, dung dịch sẽ chuyển động lên trên que thử đi về phía vùng chứa các kháng thể và kháng nguyên cố định. Phức hợp kháng nguyên-kháng thể cộng hợp khi chuyển động đến vị trí vạch thử nghiệm sẽ bị giữ lại nhờ liên kết của kháng thể vạch thử nghiệm với kháng nguyên. Sự xuất hiện của vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử chứa độc tố ruột tụ cầu. Nhƣ vậy, trong trƣờng hợp dƣơng tính (có độc tố trong mẫu phân tích) sẽ xuất hiện hai vạch màu. Ngƣợc lại trƣờng hợp âm tính chỉ có một vạch màu. Ƣu điểm của sắc ký miễn dịch kẹp đôi là độ nhạy và độ đặc hiệu cao do sử dụng tới hai kháng thể có khả năng bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên ở những vị trí khác nhau mà không gây cản trở về mặt không gian. Nhƣợc điểm của nó là khó có khả năng phát hiện đƣợc cả 5 loại độc tố tụ cầu phổ biến hiện nay: SEA, SEB, 5
SEC, SED, SEE do trên thị trƣờng chƣa có một cặp kháng thể nào có thể bắt cặp với cả 5 loại kháng nguyên trên. - Sắc ký miễn dịch cạnh tranh: + Dạng 1: tại vị trí vạch thử nghiệm, kháng nguyên (hoặc một biến thể của kháng nguyên) đƣợc cố định. Nếu độc tố có mặt trong mẫu phân tích, chúng sẽ tƣơng tác với kháng thể cộng hợp tạo thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể cộng hợp. Dƣới tác dụng của lực mao quản, dung dịch sẽ chuyển động lên trên que thử đi về phía vùng chứa kháng nguyên cố định. Phức hợp kháng nguyên-kháng thể cộng hợp khi chuyển động đến vị trí vạch thử nghiệm sẽ không bị giữ lại do các vị trí liên kết đặc hiệu của kháng thể đã bị bão hòa bởi kháng nguyên trong mẫu phân tích. Do đó, sự không xuất hiện của vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử chứa độc tố đƣờng ruột tụ cầu. Nhƣ vậy, trong trƣờng hợp dƣơng tính, có độc tố trong mẫu phân tích, thì sẽ xuất hiện một vạch màu ở vị trí vạch kiểm chứng. Ngƣợc lại, mẫu âm tính sẽ có hai vạch màu ở cả vị trí vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng. + Dạng 2: Tại vị trí vạch thử nghiệm một kháng thể có khả năng bắt cặp với kháng nguyên cần phân tích đƣợc cố định. Trong trƣờng hợp này, cộng hợp sẽ là kháng nguyên gắn với hạt nano vàng hoặc nano carbon. Nếu độc tố không có mặt trong mẫu phân tích thì khi dung dịch chuyển động lên trên que thử đi về phía vùng chứa các kháng thể cố định, kháng nguyên cộng hợp sẽ tƣơng tác với kháng thể tạo thành phức hợp kháng thể - kháng nguyên cộng hợp có màu ở vị trí vạch thử nghiệm. Sự xuất hiện vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử không chứa độc tố ruột của tụ cầu. Ngƣợc lại, nếu trong mẫu phân tích có độc tố ruột tụ cầu thì chúng cạnh tranh với kháng nguyên cộng hợp về việc bị giữ lại ở vị trí vạch thử nghiệm. Chính vì vậy, sự không xuất hiện vạch màu đồng nghĩa với việc mẫu thử có chứa độc tố ruột tụ cầu. Trong luận án này, chúng tôi đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký miễn dịch cạnh tranh dạng 2 để ứng dụng sản xuất que thử phát hiện 5 loại độc tố (SEA-SEE) trong thực phẩm. Các ƣu điểm của phƣơng pháp sắc ký miễn 6
dịch cạnh tranh để phát hiện 5 loại độc tố SEA, SEB, SEC1, SED, SEE bao gồm: đơn giản hóa quy trình phát triển que thử do chỉ cần sử dụng một kháng thể. 1.4.2. Một số nghiên cứu chế tạo que thử để phát hiện độc tố ruột tụ cầu trong thực phẩm Năm 2009, trong nghiên cứu của Boyle và các cộng sự tạo que thử phát hiện SEB trong sữa với ngƣỡng phát hiện nằm trong khoảng từ 500 ng/ml đến 5 µg/ml [19]. Khi sử dụng máy đo từ để phát hiện tín hiệu, que thử có thể phát hiện đƣợc nồng độ độc tố SEB trong các sản phẩm sữa thấp từ 5 đến 0,25 ng/ml. Năm 2013, Keiko Yamada tạo que thử phát hiện SEA với độ nhạy cao, phát hiện đƣợc nồng độ thấp đến 0,2 ng/ml [83]. 1.5. CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG (IgY) VÀ ỨNG DỤNG CỦA IgY Kháng thể lòng đỏ trứng IgY đƣợc sản xuất bằng phƣơng pháp gây miễn dịch cho gà mái để thu kháng thể đặc hiệu từ trứng gà. Hiện nay, một số phƣơng pháp tách chiết và tinh chế IgY gà đã đƣợc mô tả và có thể đƣợc chia thành hai nhóm chính: Phƣơng pháp kết tủa: liên quan đến amoni, natri sulfat, natriclorua [65, 71], polyetylenglycol (PEG), axit caprylic và caragenean [71]; Phƣơng pháp sắc ký: sắc ký ái lực, sắc ký trao đổi ion, sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc, sắc ký tƣơng tác thiophylic, và sắc ký gel lọc [71]. 1.6. SẢN XUẤT VÀ TINH CHẾ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU 1.6.1. Sản xuất độc tố ruột tụ cầu từ S. aureus và từ phƣơng pháp tái tổ hợp Việc sản xuất độc tố tái tổ hợp biểu hiện trên E. Coli các độc tố ruột tụ cầu ở dạng dung hợp với đuôi His hoặc đuôi GST nên có thể giúp đơn giản hóa quy trình tinh sạch. Năm 2012, nhóm nghiên cứu của chúng tôi cũng đã sản xuất thành công độc tố SEA tái tổ hợp với đuôi GST. Vector đƣợc sử dụng là pGEX-6P-1 và chủng E. Coli BL21 để biểu hiện protein. Sau khi 7
tinh sạch bằng bộ kit GST SpinTrap, protein tƣơng ứng có kích thƣớc 53 kDa ở dạng dung hợp với GST đã đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di SDS-PAGE [3]. 1.6.2. Phƣơng pháp tinh sạch độc tố ruột tụ cầu Đã có nhiều phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong việc tinh sạch SE nuôi trực tiếp từ tụ cầu vàng: tinh sạch bằng trao đổi ion, lọc gel, sắc ký, điện phân, sắc ký Dye ligand, HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao) và FPLC (sắc ký lỏng nhanh protein). Phƣơng pháp sắc ký ái lực có thể cho phép thu protein đích bằng một bƣớc duy nhất, với độ tinh sạch lên tới hơn 90%. Đuôi His có ái lực cao với Ni2+ do có vòng thơm imidazole, vì thế protein dung hợp với đuôi His đƣợc giữ lại trên cột sắc ký chứa các hạt resin có gắn Ni2+, còn những protein không mong muốn sẽ ra khỏi cột này. CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU - Các SE (SEA, SEB, SEC, SED và SEE) của Toxin Technology, Mỹ. - Gà Leghorn trắng, 1 ngày tuổi, cân nặng 35-40g, có nguồn gốc từ Công ty cổ phần giống gia cầm Ba Vì. - Kháng thể lòng đỏ trứng IgY thu đƣợc từ trứng gà Leghorn trắng tự nuôi và đƣợc gây miễn dịch bằng các độc tố ruột tụ cầu và BSA. 2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.2.1. Vi sinh vật và plasmid - Tế bào S.aureus mang gen sec1 đƣợc cung cấp bởi phòng Vi sinh, Viện Dinh dƣỡng Quốc gia. - Tế bào vi khuẩn E. coli khả biến BL21 mua của Biolab. - Plasmid pGEX-6P-1-sea, mang gen mã hóa SEA ở dạng dung hợp với đuôi GST (glutathione-S-transferase) đƣợc cung cấp bởi phòng công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội. 8
- Plasmid pGS-21a (Genescript), dùng làm vector biểu hiện cho nhân dòng và biểu hiện gen sec1 2.2.2. Hóa chất và sinh phẩm Các môi trƣờng, sinh phẩm, các hóa chất, dung môi, các dụng cụ, vật tƣ tiêu hao chuyên biệt của phòng thí nghiệm vi sinh và sinh học phân tử nhƣ các môi trƣờng nuôi cấy, các kháng thể đơn dòng, các hóa chất nhập khẩu từ nƣớc ngoài, màng lọc, các dãy giếng ELISA,…. 2.2.3. Máy, thiết bị: Các máy và thiết bị chuyên dụng nhƣ máy ly tâm, tủ ổn nhiệt, bộ điện di,… có ngồn gốc từ Mỹ, Đức và Trung Quốc. 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn S.aureus Sử dụng các chất tẩy rửa (SDS, CTAB) và chloroform làm biến tính thành tế bào, protein dạng Histon và polysaccharide của S. aureus. Sau đó bổ sung lysozyme, protease K phá vỡ thành tế bào và liên kết peptid . Bổ sung EDTA ức chế hoạt động của Dnase và nồng độ muối CH3COONa cao hỗ trợ cho việc kết tủa DNA. Sau khi ly tâm, hút lớp dung môi phân cực phía trên chứa DNA và thêm ethanol 1000, 1 giờ, nhiệt độ phòng. DNA kết tủa thu đƣợc sau khi ly tâm tiếp tục đƣợc rửa trong ethanol 700 trƣớc khi hòa tan trong đệm TE (Tris-EDTA). 2.3.2. Kỹ thuật PCR Gen sec1 đƣợc khuếch đại bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu (SEC-F và SEC-R) có gắn vị trí cắt của 2 enzyme giới hạn BamHI và HindIII. Trong đó, các thành phần của phản ứng PCR đã đƣợc chuẩn hóa với tổng thể tích là 50 µl và chu trình nhiệt nhƣ sau: biến tính ở 950C, 4 phút và quá trình nhân bản với 35 chu kỳ, kéo dài thêm ở 720C, 5 phút và bảo quản ở 100C. Mỗi chu kỳ gồm ba bƣớc: biến tính ở 950C, 30 giây, gắn mồi ở 550C, 30 giây và kéo dài chuỗi ở 720C, 1 phút. Sản phẩm PCR sau khi tổng hợp đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose. 2.3.3. Thu nhận DNA từ gel agarose Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng kit tinh sạch GeneJET Gel Extraction Kit (Fermentas) theo phƣơng pháp của nhà sản xuất. 9
2.3.4. Phƣơng pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn và nối với vector tạo dòng Gen sec1 (sản phẩm PCR sau khi tinh sạch) đƣợc cắt bằng enzyme giới hạn là BamHI và HindIII và kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%. Sau khi làm tan các hóa chất (trừ T4 DNA ligase) ở nhiệt độ thƣờng, tiến hành đảo trộn bằng máy vortex và ly tâm góp mẫu. 2.3.5. Phƣơng pháp biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.Coli BL21 Phƣơng pháp này làm theo hƣớng dẫn của nhà cung cấp tế bào khả biến E.Coli BL21. 2.3.6. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào E. coli và chuẩn bị dịch protein thô Các dòng tế bào chuyển gen đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung thêm 100 mg/L ampicillin. Canh trƣờng đƣợc nuôi ở 370C trong điều kiện lắc 150 vòng/phút cho đến khi OD600nm đạt khoảng 0,8 thì bổ sung chất cảm ứng IPTG và tiếp tục nuôi cấy ở các điều kiện thí nghiệm về nhiệt độ (160C, 300, 370), thời gian (từ 2h, 5h, 7h, 8h) và chất cảm ứng từ 0,05 đến 1mM IPTG. 2.3.7. Phƣơng pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực GST Trong nghiên cứu này, bộ kit GST SpinTrap (GE Healthcare) đã đƣợc sử dụng để tinh sạch SEA ở dạng dung hợp với GST. 2.3.8. Phƣơng pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực His Tiến hành tinh sạch protein theo kit His Mag SepharoseTM Ni để thu đƣợc protein tinh sạch cho độ tinh khiết cao theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. 2.3.9. Phƣơng pháp điện di biến tính protein (SDS-PAGE) Điện di biến tính protein bằng SDS-PAGE (12,5%) đƣợc tiến hành theo các phƣơng pháp của Laemmli. 2.3.10. Phƣơng pháp ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) Để đánh giá lƣợng SEA trong dịch chiết protein thô, phƣơng pháp ELISA kẹp đôi đã đƣợc sử dụng. 2.3.11. Phƣơng pháp định lƣợng protein bằng OD 10
Nguyên tắc của phƣơng pháp này là các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bƣớc sóng 280nm. 2.3.12. Phƣơng pháp gây miễn dịch cho gà Gây miễn dịch cho gà để sản xuất kháng thể IgY kháng BSA và kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED, SEE) theo quy trình sản xuất kháng thể IgY đặc hiệu của Agro-Bio 2011. 2.3.13. Phƣơng pháp tinh sạch kháng thể IgY gây kết tủa phân đoạn bằng PEG Tinh sạch kháng thể bằng phƣơng pháp gây kết tủa phân đoạn bằng PEG 6000 theo mô tả của Polson 1980. 2.3.14. Phƣơng pháp tinh sạch IgY bằng pha loãng trong nƣớc, chỉnh pH và gây kết tủa bằng Natri clorua Tinh sạch theo phƣơng pháp pha loãng trong nƣớc chỉnh pH và gây kết tủa bằng Natri clorua đƣợc Petr Hokder tối ƣu hóa năm 2013. 2.3.15. Phƣơng pháp tinh sạch IgY bằng cột “ Hi Trap IgY Purification HP” Tinh sạch IgY theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất GE Healthcare Bio- Sciences AB. 2.3.16. Cố định IgY kháng BSA và IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E) lên màng nitrocelullose Màng nitrocelullose AE99 (Whatman) đƣợc cố định lên các lá vinyl Mylar AD back 79373 (Whatman). Kháng thể IgY kháng BSA và kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+D+E) đƣợc phun lên trên màng nitrocellulose lần lƣợt ở vạch kiểm chứng và vạch thử nghiệm bằng thiết bị Linomat V (CAMAG, Thụy Sĩ). Sau khi gắn thêm giấy thấm, màng đƣợc cắt thành từng que thử có bề rộng là 4 mm bằng máy cắt Cutter 4000 (Biodot, Anh). 2.3.17. Chuẩn bị phức hợp phát hiện kháng nguyên - nanocarbon Kháng nguyên tinh sạch SEC1 ở dạng dung hợp đƣợc gắn với hạt nanocarbon ở trạng thái huyền phù theo phƣơng pháp đƣợc mô tả bởi nhà sản xuất Maiia Diagnostics. 11
2.3.18. Phân tích mẫu bằng que thử Mỗi mẫu phân tích có từng loại độc tố SEA, SEB, SEC1, SED, SEE với nồng độ khác nhau đƣợc pha trong 100 µl dung dịch đệm chạy và đƣợc đƣa vào giếng. Tiếp đó, cắm que thử vào giếng và ủ trong 15 phút. Sau đó, bổ sung kháng nguyên cộng hợp. Kết quả âm tính sẽ ứng với việc xuất hiện vạch, kết quả dƣơng tính ứng với việc không xuất hiện vạch tại vị trí vạch in kháng thể. CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1. SẢN XUẤT VÀ TINH CHẾ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU 3.1.1. Sản xuất và tinh chế protein tái tổ hợp SEA 3.1.1.1. Biến nạp plasmid mang gen mã hóa SEA vào tế bào E.Coli Plasmid pGEX-6P-1-sea mang gen mã hóa SEA đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli khả biến bằng phƣơng pháp sốc nhiệt trên môi trƣờng LB có bổ sung ampicillin 3.1.1.2.Chọn dòng các chủng mang gen mã hóa SEA Sau khi tiến hành biến nạp và thu nhận các dòng tế bào E. coli đƣợc chuyển gen, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc các dòng tế bào E. coli để chọn ra những dòng tạo độc tố ruột SEA nhiều nhất bằng việc sử dụng kỹ thuật ELISA kẹp đôi để đánh giá lƣợng SEA đƣợc tạo ra trong canh trƣờng nuôi cấy. Sau khi chọn đƣợc 5 dòng khuẩn lạc cho khả năng sinh SEA cao nhất, chúng tôi tiến hành lặp lại quy trình trên có tính đến nồng độ protein trong mỗi mẫu để tìm ra khuẩn lạc có khả năng sinh SEA cao nhất là dòng tế bào số 2. 3.1.1.3. Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp SEA Tiến hành khảo sát trên ba yếu tố là nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng và thời gian cảm ứng, lựa chọn nuôi ở hai nhiệt độ là 300C và 160C. Quy trình nuôi cũng đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ trong quá trình sàng lọc, nuôi tế bào trong môi trƣờng LB lỏng tới khi đạt OD600 = 0.8 thì thêm chất cảm ứng IPTG với các nồng độ tƣơng ứng là 0,25mM, 0,5mM và 1mM, sau đó tiến hành lấy mẫu ở các mốc thời gian: với nhiệt độ 300C, thời gian lấy mẫu là 2h, 5h, 7h; với nhiệt độ là 160C, thời gian lấy mẫu là 12h, 16h,19h. 12
Hình 3.1. Đồ thị tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp SEA Trong các điều kiện nuôi cấy đã đƣợc thử nghiệm, điều kiện tốt nhất cho sinh tổng hợp protein tái tổ hợp là ở 300C, nồng độ chất cảm ứng là 1mM và thời gian cảm ứng là 5h. 3.1.1.4. Tinh sạch SEA từ dịch chiết protein thô Tinh sạch theo phƣơng pháp sắc ký ái lực để thu đƣợc SEA ở dạng tinh khiết. Để kiểm tra về kích thƣớc của protein thu đƣợc trong dịch rửa giải, chúng tôi tiến hành điện di theo phƣơng pháp điện di biến tính protein SDS-PAGE. Kết quả điện di đã thể hiện rõ: trong dịch rửa giải có sự xuất hiện một vạch protein với khối lƣợng trong khoảng từ 50-60 kDa khi so sánh với thang protein chuẩn, kết quả này là phù hợp với protein mà chúng tôi mong đợi là SEA trong trạng thái dung hợp với GST có khối lƣợng là 53 kDa. Hình 3.2. Điện di đồ protein SEA tái tổ hợp sau tinh sạch Ghi chú: 1: Dịch chiết protein thô, tế bào E. coli không qua biến nạp; 2: Dịch chiết protein thô, tế bào E. coli đã qua biến nạp; 3: Dịch rửa giải thu được từ quá trình tinh sạch; 4: Thang chuẩn protein. 13
3.1.2. Sản xuất và tinh chế protein tái tổ hợp SEC1 3.1.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ Staphylococcus aureus Hình ảnh điện di kiểm tra kích thƣớc DNA tổng số của chủng Staphylococcus aureus cho thấy có 1 băng sáng rõ có kích thƣớc lớn ở trên cao chính là DNA tổng số của S. aureus. Điều này chứng tỏ DNA tổng số sau khi tách chiết không bị đứt gãy, còn nguyên vẹn nên đƣợc chúng tôi dùng làm khuôn trong phản ứng PCR khuếch đại gen sec1. Hình 3.3. Điện di đồ DNA tổng số của chủng Staphylococcus aureus Ghi chú: M: Thang DNA chuẩn 1kb; 1-5: DNA tổng số S.aureus 3.1.2.2. Kết quả khuếch đại gen sec1 bằng kỹ thuật PCR Từ cơ sở nguồn DNA tổng số tách từ chủng S.aureus, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu SEC-F và SEC-R để khuếch đại gen sec1 khoảng 801 bp. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1,2%. Hình 3.4.Điện di đồ sản phẩm PCR trên gel agarose 1,2% Ghi chú: Kênh M: Thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2: Đoạn gen sec1 Kết quả điện di cho thấy với cặp mồi đặc hiệu SEC-F và SEC-R đã thu đƣợc đoạn DNA đặc hiệu, rõ nét không có vạch phụ k m theo, có kích thƣớc khoảng 801 bp, đúng với kích thƣớc lý thuyết khi thiết kế mồi. Do vậy, sản phẩm PCR này đƣợc chúng tôi sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo. 3.1.2.3. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pGS-21amang gen sec1 14
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc xử lý bằng hai enzymegiới hạn BamHI và HindIII đƣợc tinh sạch theo quy trình bộ kit GeneJET PCR Purification Kit (Fermentas) và sản phẩm sẽ là nguyên liệu sử dụng để tạo vector biểu hiện. Tiến hành cắt mở vòng plasmid pGS-21a bằng hai enzym giới hạn BamHI và HindIII trong 3 giờ ở 370C để tạo vết cắt giống với đoạn gen sec1 sẽ đƣợc cài vào. Vector sau khi mở vòng bằng hai enzyme là một băng duy nhất có kích thƣớc khoảng 6169 bp tƣơng ứng với kích thƣớc của vector pGS-21a nhƣ trong lý thuyết. Hình 3.5. Điện di đồ plasmid pGS-21asau khi cắt bằng enzym cắt giới hạn Ghi chú: M: Thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2: vector pGM-1 mở vòng Sau khi mở vòng và tinh sạch vector pGS-21a, chúng tôi ghép nối vector này với gen sec1 nhờ xúc tác của T4 DNA ligase. Sản phẩm ghép nối là Plasmid pGM-1-sec1 sẽ đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.Coli BL21. 3.1.2.4. Kết quả biểu hiện gen mã hóa cho protein tái tổ hợp SEC1 Plasmid pGS-21a-sec1 mang gen mã hóa độc tố ruột tụ cầu SEC1 đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli khả biến bằng phƣơng pháp sốc nhiệt, sau đó, chọn lọc khuẩn lạc biến nạp trên môi trƣờng có ampicillin. Để nghiên cứu sự biểu hiện của protein tái tổ hợp, vi khuẩn sau khi biến nạp thành công đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh ampicillin, lắc với tốc độ 150 vòng/phút, ở 370C cho đến khi OD600 đạt 0,6-0,8 thì bổ sung thêm chất cảm ứng IPTG với nồng độ 1mM và nuôi tiếp ở 300C trong 5 giờ. Protein tổng số của dịch chiết tế bào đã đƣợc phân tích trên gel polacrylamide và cho thấy sự xuất hiện của một băng protein với cƣờng độ đậm, có trọng lƣợng phân tử trong khoảng từ 42,7– 66,2 kDa khi so sánh với thang protein chuẩn, kết quả này là phù hợp với protein SEC1 mà chúng tôi đã tính toán trên lý thuyết. 15
Hình 3.6. Điện di đồ biểu hiện gen SEC1 trong protein tổng số của các tế bào E.coli BL21 Ghi chú: M: thang protein chuẩn; 1: Đối chứng âm (protein tổng số trong dịch chiết dòng khuẩn lạc E.coli BL21); 2: Protein trong dịch chiết dòng E. coli đã biến nạp được cảm ứng IPTG. 3.1.2.5. Tối ưu các điều kiện biểu hiện gen sec1 Để xác định đƣợc điều kiện tối ƣu, chúng tôi đã tiến hành thử biểu hiện gen ở các điều kiện nồng độ chất cảm ứng IPTG, nhiệt độ, thời gian cảm ứng khác nhau. Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp protein SEC1 tái tổ hợp ở các điều kiệnnồng độ chất cảm ứng IPTG (0,05 -1 mM), nhiệt độ (300C và 370C) và thời gian (2 giờ, 5 giờ và 8 giờ). Dịch chiết thu đƣợc sau khi phá tế bào đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel acrylamide 12%. Hình ảnh điện di trên gel polyacrylamide cho thấy điều kiện tốt nhất cho sinh tổng hợp protein tái tổ hợp SEC1 là ở 300C, nồng độ chất cảm ứng IPTG là 0,3mM và thời gian cảm ứng là 8h. Hình 3.7. Điện di đồ protein SEC1 biểu hiện ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian với nồng độ IPTG 0,3mM. Ghi chú: 1: Thang protein chuẩn, 2-8: điều kiện nhiệt độ và thời gian lần lượt là: 8h, 370C; 8h300C; 5h,370C; 5h,300C; 2h, 370C; 2h,300C, 0h 3.1.2.6. Tinh chế protein tái tổ hợp SEC1 Chúng tôi tinh sạch protein tái tổ hợp theo phƣơng pháp sắc ký ái lực sử dụng bi từ HisMag SepharoseTM Ni để thu đƣợc SEC1 ở dạng tinh khiết. 16
Kết quả phân tích SDS-PAGE cho thấy protein SEC1 thu nhận đƣợc có độ tinh sạch cao, không tạp nhiễm các protein của vi khuẩn. Hình 3.8. Điện di đồ protein SEC1 tái tổ hợp sau tinh sạch Ghi chú: Kênh 1,4 : Protein trước khi tinh sạch; Kênh 2,3: Protein sau khi tinh sạch; M: Marker. 3.2. CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG IGY 3.2.1. Kết quả tinh sạch kháng thể IgY Chúng tôi lựa chọn tách chiết IgY bằng hai phƣơng pháp sau: phƣơng pháp tách phân đoạn bằng nƣớc và muối natri clorua đã đƣợc tối ƣu hóa năm 2013 [ 6 5 ] và phƣơng pháp gây kết tủa phân đoạn bởi PEG [27]. Đây là những phƣơng pháp có quy trình đơn giản, hiệu quả, dễ thực hiện, xử lý mẫu đơn giản, sản lƣợng tách chiết và độ tinh sạch IgY c a o , đang đƣợc áp dụng phổ biến trong nhiều nghiên cứu [77]. Chúng tôi so sánh hai phƣơng pháp tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng này để lựa chọn phƣơng pháp phù hợp cho tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng gà. Kết quả điện di của cả hai phƣơng pháp đều cho thấy hình ảnh IgY gồm hai băng đậm, rõ nét có khối lƣợng phân tử tƣơng ứng với khối lƣợng phân tử của chuỗi nặng (khoảng 67kDa) và chuỗi nhẹ (khoảng 25 kDa), ngoài ra trên các đƣờng điện di vẫn còn các vạch khác rất mờ. Do vậy, có thể kết luận rằng đã tách chiết thành công kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà với độ tinh sạch khá cao. Tuy nhiên, khi so sánh hình ảnh điện di IgY của đƣờng số 1 và đƣờng số 2 cho thấy vạch protein tạp không phải kháng thể ở đƣờng số 1 ít hơn so với đƣờng số 2, điều này chứng tỏ phƣơng pháp tinh sạch IgY bằng tách phân đoạn nƣớc và NaCl có độ tinh sạch cao hơn so với phƣơng pháp pháp kết tủa phân đoạn bởi PEG. 17
Hình 3.9. Điện di đồ kháng thể IgY sau tinh sạch Ghi chú: 1: IgY tinh sạch theo phương pháp tách phân đoạn bằng nước và muối natri clorua; 2: IgY tinh sạch theo phương pháp kết tủa phân đoạn bởi PEG. Để tạo ra kháng thể IgY có độ tinh sạch cao, hoạt tính kháng thể mạnh hơn làm nguyên liệu cho que thử phát hiện các độc tố ruột tụ cầu, kháng thể IgY đƣợc tạo ra từ phƣơng pháp tinh sạch bằng tách phân đoạn nƣớc và NaCl đƣợc tinh sạch trên cột sắc ký tƣơng tác thiophylic (Hi Trap IgY Purification HP). Hình 3.10. Điện di đồ các giai đoạn tinh sạch kháng thể IgY qua cột sắc ký Ghi chú: M: thang protein chuẩn; 1: IgY sau tinh sạch bằng tối ưu hóa kết tủa NaCl; 2, 3: Dịch rửa cột sau khi cho mẫu vào; 4: IgY thu được sau tinh sạch; 5:Dịch rửa cột của đệm làm sạch. 3.3. ỨNG DỤNG SEC1 TÁI TỔ HỢP VÀ CÁC KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG IGY ĐỂ TẠO QUE THỬ 3.3.1. Xác định lƣợng kháng thể lên vạch kiểm chứng 18