Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu biến đổi của một số gen ty thể ở bệnh ung thư đại trực tràng

Chia sẻ: Acacia2510 _Acacia2510 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

32
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận án là tìm hiểu mối liên qua giữa các dạng biến đổi của gen, tỷ lệ mất đoạn 4977 bp, mức độ mất đoạn lớn, sự thay đổi số lượng bản sao ADN ty thể với một số đặc điểm bệnh học của bệnh ung thư đại trực tràng ở Việt Nam, qua đó tìm ra những biến đổi tiềm năng có thể phát triển thành chỉ thị hỗ trợ chẩn đoán và tiên lượng bệnh.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Dự thảo tóm tắt Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu biến đổi của một số gen ty thể ở bệnh ung thư đại trực tràng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------------------- T NG N ỨU NĐ Ủ TS G NT T Ở N UNG T Ư ĐẠ TRỰ TR NG Chuyên ngành: S ờ v vật Mã số: 62420104 ỰT T TẮT UẬN ÁN TI N SĨ SINH HỌC Hà N i – 2017
ô trì ợc hoàn thành t i: Tr n Đ K o T n n ĐHQGHN N ớng dẫn khoa h c: PGS TS Tr n H n T TS. Tô T n T Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .............................. Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .............................. Phản biện: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .............................. Luận án sẽ đ ợc bảo vệ tr ớc Hộ đ ng cấp ơ sở chấm luận án tiến sĩ pt i...................... ............................. vào h i gi p t n à t n năm 201... Có thể tìm hiểu luận án t i: -T v ện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - T v ện Đ i h c Quốc gia Hà Nội
MỞ ĐẦU Un t đ i tr tràn (UTĐTT) đứng thứ ba về mứ độ phổ biến và là nguyên nhân gây tử vong cao thứ t do un t trên toàn cầu (Arnold và cs, 2016). Nhiều yếu tố có thể là n u ơ â bện n ế độ ăn uống thiếu lành m nh, s lão hóa, lối sống ít vận động, l m dụng thuốc và chất kí t í đặc thù nghề nghiệp hay hội chứn đ pol p t eo đìn (Amer n C n er So et 2014-2016). Ở Việt Nam, UTĐTT đứng thứ năm s u un t n p ổi, d dà và un t v về độ phổ biến (Globocan, 2012). Tuy bện n ân t n ó t n l ợng tốt nếu đ ợc chẩn đo n và đ ều tr khi còn ở đo n sớm song tỷ lệ bệnh nhân tử von do UTĐTT vẫn ở mứ o đặc biệt là ở n ớc chậm phát triển (globocan, 2012), đ ều này cho thấy khả năn ẩn đo n bệnh ở đo n sớm còn h n chế. Do vậy, việc tìm ra các dấu hiệu chẩn đo n bệnh sớm đ ợc quan tâm rất nhiều tron đó ó ớng nghiên cứu mối liên quan giữa s biến đổi ADN ty thể với bệnh. Dữ liệu đã ôn bố cho thấy, các biến đổi của ADN ty thể trong tế bào ung t đã un ấp những hiểu biết mới về bệnh sinh của khối u và hứa hẹn là ơ sở tiềm năn ot n l ợn và đ ều tr un t (Br ndon và s 2006; Carew và cs, 2002). Đ ợ o là “n à m ” sản xuất năn l ợng, ty thể có vai trò rất quan tr ng cho m i ho t động sống của tế bào và ơ t ể Đặc biệt, ty thể có hệ gen riêng và nhân bản độc lập với hệ gen nhân. Ở n i, ADN ty thể ó kí t ớc 16.569 bp, sợ đô d ng m ch vòng chứa 37 gen đ ợ đ ều khiển chung bởi một vùng đ ều khiển D-loop. ADN ty thể không có trình t intron, không có protein bảo vệ Histone Hơn nữ ơ chế sửa chữa sai hỏng của ty thể òn đơn ản nên rất dễ b t động và biến đổi (Aral và cs, 2007). S biến đổi này có thể gây ra thiếu hụt hay rối lo n ho t động chứ năn ủa ty thể qu đó â r n ững rối lo n và bệnh tật. Những nghiên cứu gần đâ đã o t ấy, biến đổi của ADN ty thể gây ra những khiếm khuyết trong phức hệ hô hấp l n qu n đến nhiều lo un t (S n và s 2009; Czarnecka và s, 2007, Brandon và cs, 2006). Cụ thể ơn một số đột biến đ ìn ủa các gen ND1, ND3 thuộc phức hệ hô hấp I, COX-1, COX-2 thuộc phức hệ hô hấp IV, các mất đo n lớn và s t đổi số bản sao ADN ty thể đã đ ợ x đ nh ở nhiều lo un t tron đó ó UTĐTT (Br ndon và s 2006 Czarnecka và s, 2007; Lee và cs, 2009) Hơn nữa, một số công bố còn cho thấy s biến đổi ADN ty thể trong mối liên quan với bện ó tín đặ tr n t eo vùn đ a lý và chủng tộc (Dimberg và cs, 2014; Canter và cs, 2005). Tr n đối t ợn n V ệt N m n n ứu t eo ớn nà n đã đ ợ qu n tâm tron n ữn năm ần đâ tu nhiên, mới chủ yếu tập trung vào các bện ơ t ần kinh (Huệ và cs, 2012), Huệ và cs, 2012[Error! Reference source not found.]), bện un t v (An và s 2015 L n và s 2014 Tr n và s 2015) Đối vớ bện UTĐTT mới có công bố của Dimberg và cs (2014) với một số dữ liệu b n đầu về đột biến mất đo n 4977 bp ở một nhóm bệnh nhân Việt N m đ ợc khảo sát cùng nhóm bệnh nhân Thụy Đ ển (Dimberg và cs, 2014. Do vậy, nghiên cứu tiếp theo với ph m vi rộng và mứ độ sâu ơn tr n đối t ợng bệnh nhân Việt Nam về mối liên quan giữa s biến đổi ADN ty thể với bện UTĐTT đặc biệt là với các đặ đ ểm bệnh h c củ UTĐTT rất ó ý n ĩ có thể giúp hiểu thêm về ơ ế bệnh h c hoặc tiến triển của UTĐTT và ó t ể là ơ sở cho việc tìm ra những chỉ th của ADN ty thể để nhận biết bệnh sớm. Từ th c tế nà n tô đã t c hiện đề tài luận án: “ ” với hai mục tiêu: 1. Khảo sát một số d ng biến đổ (đột biến đ ìn ) ủa các gen ND1, ND3, COX-1, COX-2, mất đo n 4977 bp mứ độ mất đo n lớn và số bản s o ADN t t ể ở mẫu mô và mẫu m u ủ một n óm bện n ân UTĐTT V ệt N m
2. Tìm hiểu mối liên quan giữa các d ng biến đổi của gen, tỷ lệ mất đo n 4977 bp, mứ độ mất đo n lớn s t đổi số l ợng bản sao ADN ty thể với một số đặ đ ểm bệnh h c của bệnh UTĐTT ở Việt N m qu đó tìm r n ữn b ến đổ t ềm năn ó t ể phát triển thành chỉ th trợ ẩn đo n và t n l ợn bện Đ ợng nghiên c ị m th c hi n ề tài luận án Nghiên cứu đ ợc th c hiện trên mẫu mô u mô lân ận u (LCU) và một số mẫu m u đ ợ un ấp k m t eo mẫu mô ủa một nhóm bện n ân UTĐTT Mẫu mô và mẫu máu của bện n ân un t đ ợc cung cấp từ K o ả p ẫu bện Bệnh viện K Hà Nội và Bệnh viện Quân y 103 từ năm 2012 - 2016. Mẫu máu củ n i khỏe m n bìn t n (m u đối chứn ) do K o Sàn l m u V ện huyết h c và truyền m u Trun ơn un ấp. Các nghiên cứu của luận n đ ợc th c hiện t i Phòng Proteomics và Sinh h c cấu trúc thuộc Phòng Thí nghiệm tr n đ ểm Công nghệ Enzyme và Protein, Bộ môn Sinh lý h c và Sinh h n i, Khoa Sinh h Tr n ĐHKH T nhiên – ĐHQG Hà Nội. Đ o c nghiên c u Đố t ợng tham gia nghiên cứu hoàn toàn t nguyện. Quy trình lấy mẫu t eo đ n qu đ nh của Bệnh viện. Các thông tin cá nhân của bệnh nhân tham gia nghiên cứu đ ợc mã hóa và bảo mật. Ý ĩ k o ọc và th c tiễn c ề ậ - Kết quả ủ luận n đã un ấp bộ dữ liệu về các biến đổi của một số gen ty thể, tỷ lệ và mứ độ mất đo n lớn, s t đổ số l ợng bản sao ADN ty thể ở một n óm bện n ân UTĐTT V ệt N m Đâ là ngu n dữ liệu tham khảo quan tr ng cho các nghiên cứu về bệnh h c phân tử củ UTĐTT - Luận n đã xâ d n đ ợ p ơn p p x đn đột b ến đ ểm đột b ến mất đo n đ n l ợn mứ độ mất đo n số bản s o ADN t t ể t ơn đố p ơn p p nà ó t ể đ ợ áp dụn ở ơ sở n n ứu và x t n ệm có liên quan ở Việt Nam. - C kết quả ủ n n ứu nà ó t ể đ ợc sử dụn làm ơ sở k o o n n ứu t ếp t eo: xâ d n mô ìn d đo n về ản ởn ủ một số b ến đổi của ADN ty thể n tỷ lệ đột b ến mất đo n 4977 bp mứ độ mất đo n lớn s t đổ số bản s o ADN t t ể và một số đột b ến đ ểm tr n en ND1, ND3, COX-1, COX-2 đến n u ơ mắ và t ến tr ển ủ UTĐTT Đó óp ới c ề ậ - Đề tà luận n là một tron n ữn n n ứu đầu t n về x đ n tỷ lệ và mứ độ mất đo n lớn s t đổ số bản s o ADN t t ể và một số biến đổi ủ en ND1, ND3, COX-1 và COX-2 tr n đố t ợn bện UTĐTT b n p ơn p p PCR p ơn p p đ ìn ều dà đo n cắt giới h n (PCR-RFLP) p ơn p p ả trìn t en p ơn p p re l-t me PCR ở V ệt N m - Đề tà luận n là n n ứu đầu tiên cung cấp dữ liệu và mố l n qu n ữ tỷ lệ đột b ến mất đo n 4977 bp mứ độ mất đo n lớn s t đổ số bản s o ADN t t ể và một số v trí biến đổi ủ gen ND1 (A4164G), ND3 (A1398G), COX-1 (C6340T) và COX-2 (G7853A) vớ đặ đ ểm bện ủ bện UTĐTT n V ệt N m Tron đó, các biến đổ A4164G A10398G và G7853A đều liên quan vớ đo n T của bệnh, các biến đổi A4164G, G7853A liên quan với giớ tín Đặc biệt, biến đổ A4164G và A10398G ó xu ớn đ k m n u và đều xảy ra với tần suất cao nhất ở giai
đo n T1, giảm dần ở đo n T 2, T3 và T4. Mứ độ mất đo n lớn liên quan với v trí un t độ biệt hóa, số bản sao ADN ty thể l n qu n đến v trí un t mứ độ xâm lấn khối u. - Đề tà luận n là n n ứu đầu tiên phát hiện các mất đo n mớ 5094 bp 5169 bp và 5104 bp trên ADN ty thể Đặc biệt, việ tăn mứ độ mất đo n là yếu tố làm tăn n u ơ mắ UTĐTT ó mối t ơn qu n n ch giữa mứ độ mất đo n và số bản sao ADN ty thể ở mô LCU của bện UTĐTT
ƯƠNG 1. T NG QUAN TÀI LI U 1.1. UNG T Ư ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.1.1. Thực tr ng mắ u t i trực tràng Un t đ i tr tràn (UTĐTT) đứng thứ ba về mứ độ phổ biến và là nguyên nhân gây tử vong cao thứ t do un t tr n toàn ầu (Arnold và cs, 2016). T i Việt Nam, số ca bện UTĐTT đ ợc chẩn đo n chiếm tỷ lệ khoảng 7% trong tổng số un t và đ ợc xếp vào v trí thứ năm s u un t n un t p ổ un t d dà và un t v Tỷ lệ tử von do UTĐTT ếm khoảng 6,3%, cao thứ t s u t gan, un t p ổ un t d dày (Globocan, 2012). Nhìn chung, tỷ lệ mắc và tử vong do bện UTĐTT vẫn đ n ó xu ớn tăn ở các quốc gia có thu nhập thấp và trung bình, ổn đ n và ó xu ớng giảm ở n ớc có thu nhập cao (Arnold và cs, 2016). Tuy nhiên, tỷ lệ mắc mới và tử vong còn cao cho thấ đâ là ăn bệnh nguy hiểm và vẫn đ n là n nặng toàn cầu. 1.1.2. Các hệ thố p â a o n bệ ou t i trực tràng Có nhiều hệ thốn p ân đo n cho ung t Đối vớ UTĐTT t ng p ân đo n un t d a vào kí t ớc của khối u (T), mứ độ lâ l n đến các h ch b ch huyết (N) và s hiện diện củ d ăn (M) (Tumor- lymph Node – Metastases, TNM) (American Cancer Society, 2016), (Compto và cs, 2004). 1.1.3. Các yếu tố u â u t trự tr Nhiều yếu tố có thể là n u ơ â bện n ế độ ăn uống thiếu lành m nh, s lão hóa, lối sống ít vận động, l m dụng thuốc và chất kí t í đặc thù nghề nghiệp hay hội chứn đ pol p t eo đình (American Cancer Society, 2014-2016) Đặ b ệt một số biến đổi tr n ADN t t ể n đột biến đ ểm, đ ìn mất đo n, s t đổi số bản sao ADN n đã đ ợ x đn ó l n qu n đến n u ơ mắc ung t (Br ndon và s 2006 Czarnecka và s 2007; Lee và cs, 2009). 1.2. TY TH NGƯỜI 1.2.1. ấu tr v ứ ủa t t ể Ty thể là bào quan có mặt ở tế bào chất của hầu hết các tế bào nhân thật, có nhiều hình d ng khác nhau. Ty thể g m hai lớp màng lipoprotein, giữa hai lớp màng là khoang gian màng, bên trong hai màng là chất nền. Ty thể là “nhà máy” năn l ợng của tế bào, tham gia vào quá trình apoptosis (quá trình tế bào chết t eo u trìn ) (Du và s 2000; L u và s 1996; W n và s 2016 qu trìn lão ó ủ ơt ể (Bratic, 2013) đ ều chỉnh tín hiệu canxi (Rizzuto, 2012) và một số chứ năng khác. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra r ng, biến đổi của hệ gen ty thể ó l n qu n đến việc phát sinh một số bệnh ty thể và bện un t (Dimauro, 2007; Bradon và cs, 2006; Chatterjee và cs, 2006). 1.2.2. Hệ gen ty thể Bào quan ty thể có hệ gen riêng và nhân bản độc lập với hệ gen nhân. ADN ty thể n it nt iở d ng m ch vòng, sợ đô ó kí t ớc 16.569 bp, bao g m 37 gen, mã hóa cho 2 phân tử rRNA (12S, 16S), 22 phân tử tRNA và 13 phân tử protein thuộc các phức hợp của chu i hô hấp (Anderson và s 1981). 1.2.3. Hiệ t ợng d tế bào chất v ỡng biểu hiện của t biến ADN ty thể
Do hệ gen ty thể có nhiều bản sao: vài bản sao trong một ty thể, hàng nghìn bản sao trong một tế bào. Vì vậy, ADN ty thể có hai d ng t n t là đ ng tế bào chất và d tế bào chất Đ ng tế bào chất (homoplasmy) là tr ng thái t n t i mà trong tế bào mô ơ qu n tất cả các bản sao của ADN ty thể giống nhau. D tế bào chất (Heteroplasmy) là t n t đ ng th i cả bản sao ADN d ng bìn t ng và d n đột biến trong cùng tế bào mô ơ qu n ơ t ể (DiMauro và cs, 2007). 1.3. Đ T N NT T V N UNG T Ư Một số nghiên cứu đã ỉ ra r ng, các gốc t do ho t động chứa oxi (Reactive oxygen species, ROS) l n qu n đến s tăn tr ởng của tế bào, s chết của tế bào, s sinh sản, hình thành m ch, s p t s n t ến tr ển và d ăn ủ un t (Desouki và cs, 2005[Error! Reference source not found.], Ishikawa K, 2008). ROS là sản phẩm phụ của quá trình hô hấp ty thể (oxidative phosphorylation, OXPHOS), có từ 2 - 4% oxi tiêu thụ trong hô hấp ty thể t ì đ ợc chuyển thành ROS (Desouki và cs, 2005). Hơn nữa, các đột biến của ADN ty thể có thể làm tăn ốc ROS (Carew và cs, 2012; Brandon và cs, 2006), tuy nhiên, s tăn ROS nội sinh l t động trở l i và có thể gây tổn h i thêm cho cả ADN ty thể và ADN nhân (Carew và cs, 2012). Ngoài ra, s ho t động của NADPH-ox d se 1 (Nox1) n t o ra một l ợng đ n kể ROS trong tế bào. Nox1 l đ ợc kiểm soát bởi s ho t động của các gen trong ty thể, s mất kiểm soát của các gen ty thể góp phần t o ra khối u ở một số lo un t n un t v un t bu ng trứng (Desouki và s 2005) N vậy, ho t động và một số biến đổi của ADN ty thể có thể ản ởng tr c tiếp đến việc t o ra ROS hoặc có thể t động thông qua Nox1 từ đó ó t ể ản ởn đến quá trình phát sinh và phát triển un t . Mặt khác, các khiếm khuyết trong ho t động của chu i hô hấp do đột biến ADN ty thể có thể dẫn đến s biểu hiện quá mức quá trình sản xuất Surperox de k n poptos s tăn i và biểu hiện quá ức của ADN nhân. Những biến đổi này trong kiểu hình tế bào đ ợc biết đến góp phần vào s hình thành, phát triển củ un t (S n và cs, 2009). N ều d n b ến đổ tr n ADN t t ể đã đ ợ x đn ó l n qu n đến bện un t tron đó ó UTĐTT. Các biến đổi có thể là các đ ìn n ó t ể là đột b ến ó t ể dẫn đến t đổi cấu trúc của các enzyme thuộc chu i hô hấp, dẫn đến việ k ôn đảm bảo chứ năn ó t ể làm ản ởng tới dòng vận chuyển đ ện tử bìn t ng của phức hệ hô hấp ty thể. Các biến đổi g m mất đo n lớn, s thay đổi số bản sao, các biến đổi trên các gen ND1, ND3, COX-1 và COX-2. Tuy nhiên, vai trò của các biến đổi, mất đo n và s t đổi số l ợng bản sao ADN ty thể đối với un t nó un tron đó ó UTĐTT vẫn òn nhiều đ ều rõ và cần tiếp tụ đ ợc nghiên cứu. 1.3.1. Mất o n lớn trên ADN ty thể Các mất đo n lớn của ADN ty thể, chủ yếu là mất đo n xảy ra giữ đo n trình t lặp t ơn đ ng (khoảng 68%), có tần suất thấp ơn so vớ đột biến đ ểm, tuy nhiên chúng l i góp phần nhiều ơn vào các bệnh ty thể, bện un t và lão ó (C en và s 2011b P rk và s 2015) T eo Kr s n n và s (2008), mất đo n xảy ra là do quá trình sửa chữa ADN ty thể b sai hỏn (Kr s n n và s 2008). Trong các lo i mất đo n lớn t ì mất đo n 4977 bp là mất đo n phổ biến xả r từ v trí 8470 đến 13447 làm mất đ en mã ó o 4 pol pept de ủa phức hệ I (ND3, ND4, ND4L và ND5), 1 polypeptide (COXIII) của phức hệ IV và 2 polypeptide của phức hệ V (ATP8, ATP6), 5 tARN vận chuyển các axitamin. Mất đo n 4977 bp xảy ra giữ 2 đo n trình t lặp dài 13 nu (ACCTCCCTCACCA) ở đầu v trí 8470–8482 (thuộc gen ATPase 8) và 13447–13495 (thuộc gen ND5) (Chen và cs, 2011;
Dani và cs, 2008). Mất đo n 4977 bp đã đ ợ x đn ó l n qu n đến n ều lo un t k n un un t v p ổi, niêm m c tử cung, th c quản, d dày, gan, thận, tuyến p và UTĐTT (D n và s 2004, Chen và cs, 2011; Ye và s 2008; D và s 2006; D mber 2015 Ar l và s 2007) 1.3.2. Sự t a ổi số bản sao ADN ty thể và bệnh ung t Số l ợng bản sao ADN ty thể t đổ đã đ ợ đề cập đến trong các lo un t v (T r n và s 2013; Yu và s 2007; X v s 2009; M mbo và s 2005) un t p ổ (Hos ood và s 2010) UTĐTT (T r n và s 2012; Qu và s 2011; Fen và s 2011) un t n (Y n và s 2004) un t t ận (Xing và cs, 2008) và một số d n un t k (Lee và s 2009) Tron số đó số bản sao ADN ty thể giảm trong ở mẫu un t t ợng thận un t n un t d dà un t v n n tăn tron un t tu ến n ớc b t un t vùn đầu cổ un t tu ến p un t bu ng trứn un t nội m c tử un un t t ền liệt tuyến và đặc biệt là UTĐTT (Lee và s 2009) N vậy, s t đổi số bản sao ADN ty thể â ởng khác nhau lên các lo un t k n u s tăn số bản sao ADN ty thể có thể để đ p ứng với stress oxi hóa (Lee và cs, 2000). Tuy nhiên, các thông tin về mối liên quan giữa s thay đổi số bản sao ADN ty thể vớ đặ đ ểm bệnh h c củ un t òn n ều đ ều rõ và ần tiếp tục đ ợc nghiên cứu. 1.3.3. Biế ổi của m t số gen ty thể mã hóa cho các protein tham gia chuỗi hô hấp tế bào Các biến đổi của ADN ty thể ở cả vùn đ ều khiển và vùn mã ó đã đ ợ x đ nh ở nhiều lo i ung t k n u với vai trò có thể gây ức chế phức hệ hô hấp tế bào (OXPHOS) tăn sản xuất ROS và t đẩy s phát triển của tế bào un t ở mứ độ nhẹ ơn ó t ể cho phép các khối u thích ứng với mô tr ng mới (Brandon và cs, 2006). Nghiên cứu tr ớ đâ đã ỉ ra r n đột biến G10398A thuộc gen ND3 làm tăn n u ơ un t v ở những bện n ân n i Mỹ gốc phi (Canter và cs, 2005) hay một số đột biến gen COX-1 làm tăn n u ơ p t tr ển un t t ền liệt tuyến (Petros và cs 2004) Đặc biệt, các biến đổi trên gen mã hóa cho các protein thuộc các phức hệ hô hấp tế bào n en ND1, ND3 thuộc phức hệ hô hấp I, COX-1, COX-2 thuộc phức hệ hô hấp IV đã đ ợ x đ nh trên nhiều lo un t tron đó UTĐTT (Yusn t và s 2010; Akou ek n và s 2011; Yuex o 2016; C r và s 2011; Errichiello và cs, 2015). 1.4. NG N ỨU NĐ Ủ NT T ỞV TN Tr n đố t ợn n V ệt N m n n ứu về biến đổi của ADN ty thể đã đ ợ qu n tâm tron nhữn năm ần đâ tu n n n n ứu chủ yếu tập trung vào các bện ơ t ần kinh (Huệ và cs, 2012), Huệ và cs, 2012), bện un t v (An và s 2015 L n và s 2014 Tr n và s 2015) Đối vớ bện UTĐTT mới có công bố của Dimberg và cs (2014) với một số dữ liệu b n đầu về đột biến mất đo n 4977 bp ở một nhóm bệnh nhân Việt N m đ ợc nghiên cứu cùng với một nhóm bệnh nhân Thụy Đ ển (Dimberg và cs, 2014). 1.5. Á ƯƠNG Á ÁT N Đ T BI N GEN TY TH Để x đ n và đ n l ợn b ến đổ tr n ADN t t ể t n p dụn một số p ơn p p s u: PCR-RFLP ả trìn t en PCR đ n l ợng (real-time PCR), Southern blot và một số p ơn p p k C p ơn p p ó t ể dùn kết ợp vớ n u để tăn độ ín x ủ kết quả p ân tí
ƯƠNG 2. NGU N UV ƯƠNG Á NG N ỨU 2.1. NGUYÊN LI U 2.1.1. Mẫu nghiên cứu Bộ mẫu g m 86 cặp mẫu mô u và mô LCU của 86 bện n ân UTĐTT do Bệnh viện K Hà Nội cung cấp. Bệnh viện Quân đội 103 cung cấp bộ mẫu g m 40 cặp mẫu mô u và mô LCU kèm theo 40 cặp mẫu m u đ ợc lấy t i hai th đ ểm tr ớc và sau phẫu thuật của 40 bệnh nhân UTĐTT. 67 mẫu máu củ n i khỏe m nh đến hiến máu dùng làm đối chứng do Viện huyết h c và Truyền m u Trun ơn cung cấp. Các mẫu nghiên cứu đ ợc thu thập từ năm 2012 - 2016 và đ ợc bảo quản ở tủ -80 C với mẫu mô, -200C với mẫu máu. 0 2.1.2. a ất ợ sử ụ tro ứu Các cặp m dùn o p ân tí PCR-RFLP x đ nh mất đo n, real-time PCR đ ợc chúng tôi thiết kế b ng phần mềm primer - BLAST trên NCBI và đ ợ đặt tổng hợp từ hãng IDT và Invitrogen (Mỹ). C đệm ch y PCR, real-t me PCR n Hot Start PCR Master Mix2x (Thermo Scientific, Mỹ, qPCR BIO SyGreen Mix LO-ROX 2X (Biosystem), các enzyme cắt giới h n của hãng Ferment s (Đứ ) và một số ó ất k đều đ t độ t n k ết o p ân tí sn p ân tử 2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THI T BỊ Các máy móc chính dùng trong nghiên cứu bao g m máy đo n n độ ADN tổng số NanoDropTM 2000c (Thermo Scientific, Mỹ), máy nhân gen PCR 9700 (Applied Biosystems, Mỹ), máy Biorad (Mỹ), máy real-time PCR Mygopro (IT-IS Life Science, Anh), máy ly tâm, các thiết b đ ện di (Biorad), hệ thống chụp ản đ ện d Geldo (B or d) và m mó t ết b k t uộ p òn Proteom s và S n ấu tr t uộ P òn t í n ệm tr n đ ểm Côn n ệ En me và Prote n - Tr n ĐHKH T Nhiên. 2.3. ƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. T ết N tổng số từ mẫu ôu t i trự tr v ẫu u ADN tổng số từ mẫu mô mẫu m u đ ợc tách b n k t t ết QIAamp DNA Mini Kit, QIAamp Blood minikit (hãng QIAGEN Đức); Blood Genomic DNA Isolation Mini Kit (hang Norgen, Canada) C b ớ t c ết t eo ớn dẫn ủa nhà sản xuất. 2.3.2. Tách chiết ADN plasmid ADN pl sm d đ ợc tách và tinh s b n k t QIAprep-miniprep củ Q en C b ớ t ến àn t eo t eo ớn dẫn ủ n à sản xuất. 2.3.3. Đ ện di kiểm tra ADN tổng số, các sản phẩm PCR, sản phẩm cắt enzyme S có mặt của ADN tổng số sản p ẩm PCR, sản phẩm cắt enzyme đ ợc kiểm tra b n p ơn p p đ ện di trên gel agarose hoặc gel pol r l m de n uộm et d umbrom e 2.3.4. Nhân bả o n gen ty thể chứa t biến bằng kỹ thuật PCR C đo n ADN chứa các v trí quan tâm thuộc các gen ND1, ND3, COX-1, COX-2, mất đo n 4977bp thuộc ADN ty thể đ ợc khuế đ i b ng phản ứng PCR với các cặp m đặc hiệu. Khuôn cho phản ứng PCR là ADN ty thể có trong ADN tổng số đ ợc tách chiết từ mẫu mô, máu của bện n ân UTĐTT và mẫu máu đối chứng. Mất đo n 4977 bp của ADN ty thể đ ợ x đ nh b ng các phản ứng PCR sử dụng
bốn cặp m i: Mt (g m 2 m i Fmt và Rmt), 4977-1 (4977-1F và 4977-1R), 4977-2 (4977-2F và 4977-2R) và 10398 (10398F và 10398R) (Dimberg và cs, 2014). 2.3.5. Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật a ì ều o n cắt giới h n (PCR-RFLP) Trong nghiên cứu này, các biến đổ (đột biến đ ểm/đ ìn đ ợ x đ nh b ng kỹ thuật PCR-RFLP và với các cặp m i ND1-1, 10398, COX-2.1, COX-1.1 và c en me giới h n NlaIII, DdeI, HincII. Phản ứng cắt đ ợc th c hiện với các thành phần t eo ớng dẫn của nhà sản xuất. 2.3.6. Nhân dòng trực tiếp o n gen chứa t biến vào vector pJet1.2 Chúng tôi tiến hành nhân dòn đo n ADN của các gen ND1, ND4 và HBB để thu các plasmid, tinh s ch các plasmid m n đo n en tr n để phục vụ cho việc d n đ ng chuẩn để đ n l ợng mức độ mất đo n và số bản sao ADN ty thể. 2.3. . G ả trì tự o ứa t biến Giải trình t đo n ADN của các gen ND1, ND3 COX-1 và COX-2 để khẳn đ nh kết quả PCR- RFLP, kết quả nhân dòng và kết quả x đ nh mất đo n. 2.3.9. Tinh s ch sản phẩm PCR Tn s sản p ẩm PCR b n kít QIAqu k el extr t on và ExoSAP-IT® PCR Product Cleanup để thu sản p ẩm t n s o ải trìn t ADN tr t ếp 2.3.10. Đ ợ ứ ất o v số bản sao ADN ty thể bằng kỹ thuật real-time PCR Mứ độ mất đo n và số bản s o đ ợ x đ nh b n p ơn p p PCR đ n l ợng (real-time PCR). D a trên giá tr chu kỳ n ỡng (Ct) x đ n đ ợc từ cặp m i ND1-2 và cặp m i HBB qua phản ứng real- time PCR, số bản sao ADN ty thể đ ợc tính toán theo công thức đ ợ t m k ảo từ n n ứu tr ớ (Xia và cs, 2009; Gu và cs, 2013). 2∆Ct Trong ó: ∆C = CtHBB - CtND1-2 Mứ độ mất đo n lớn của ADN ty thể đ ợ x đ nh b n p ơn p p re l-time PCR. Sử dụng hai cặp m i ND1-2 và ND4 cho phản ứng real-t me PCR tron đó ặp m i ND1-2 nhân bản đ ợ đo n ADN ó kí t ớc 115 bp của gen ND1 là gen thuộc vùng hiếm xảy ra mất đo n. Cặp m i ND4 nhân bản đ ợc đo n ADN ó kí t ớc 128 bp của gen ND4 là gen thuộ vùn t ng xuyên xảy ra mất đo n của ADN ty thể (He và s 2002) N vậy, d a trên s có mặt củ đo n ADN t uộ en ND4 và gen ND1, chúng tô tín đ ợc tỷ lệ % số bản sao ADN ty thể không b mất đo n trong mẫu nghiên cứu (TLND4/ND1) theo công thức: Từ đó mứ độ mất đo n của ADN ty thể đ ợ x đ nh b ng công thức:
2.4. Á ẦN T NS N Ọ ƯƠNG PHÁP TH NG ĐƯ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU P ần mềm B oEd t p n bản 7 0 để phân tích trình t ADN ơn trìn Nucleotide BLAST trên NCBI để so sánh các trình t x đ nh các biến đổi. C p ần mềm Ex el 2010 SPSS 23 0 để n ập và p ân tí dữ liệu. Các kiểm đ n K bìn p ơn (C squ re test (χ2) k ểm đ n ín x ủ F s er (Fisher’s Exact test), kiểm đ nh Man-Withney hoặc Kruskall-W ll s để so s n và đ n mối liên quan của các biến đổi, mất đo n, s t đổi số bản sao vớ đặ đ ểm bệnh h c củ UTĐTT Ản ởng của các yếu tố đến n u ơ mắ UTĐTT đ ợc phân tích b n p ơn p p qu lo st đơn b ến và đ b ến. Các giá tr ó ý n ĩ t ống kê khi P < 0,05 theo 2 phía.
ƯƠNG 3. T QU VÀ TH O LUẬN 3.1. BI N Đ I CỦA CÁC GEN ND1, ND3, COX-1 VÀ COX-2 TY TH Các gen ND1, ND3, COX-1 và COX-2 mã hóa cho các protein thuộc phức hệ hô hấp I và IV ty thể (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/251831106). Biến đổi ở một số v trí củ en nà đã đ ợc xác đ nh ở các bện un t v (C nter và s 2005; Cov rrub s và s 2008; Ism ell và s 2013; L n và s 2014; Tan và cs, 2002) un t bu ng trứn (L u và s 2001) un t ầu thận (Mayr và cs, 2008), ung t p ổ (Yuex o 2016) UTĐTT (Akou ek n và s 2011 Gre ves và s 2006) Tuy nhiên, mối liên quan giữa các biến đổi vớ un t đặc biệt là mối liên quan vớ đặ đ ểm bệnh h c củ un t òn đ ợ x đ nh rõ ràng. Vì vậy, trong khuôn khổ luận n nà n tô đã l n sàn l c tập trung vào 5 lo i biến đổi g m T4216C, A4164G thuộc gen ND1, A10398G thuộc gen ND3 là hai gen thuộc phức hệ hô hấp I và C6340T thuộc gen COX-1, G7853A thuộc gen COX-2 (hai gen thuộc phức hệ hô hấp IV) qu đó tìm ểu mối liên quan của các biến đổi này vớ đặ đ ểm bệnh h c của bệnh UTĐTT 3.1.1. Biế ổ T421 v 41 4G ủa ND1 ở bệ â u t i trực tràng 3.1.1.1. Biế ổi A4164G và m t số biế ổi khác Sử dụn p ơn p p PCR-RFLP với cặp m i ND1-1 và enzyme NlaIII để x đ nh biến đổ T4216C và A4164G ủ en ND1. Kết quả PCR- RFLP của một số mẫu đ i diện trong nghiên cứu đ ợc minh h a trong Hình 3.1. Hình 3.1. ện di sản phẩm PCR và sản phẩm cắt bằng enzyme giới h n NlaIII (gel agarose 2%, nhu m EtBr) Giếng M: Thang ADN chuẩn 100 bp. Giế ẩ ế ẩ ắ ột số mẫu nghiên c u Hình 3.1 ot ấ sản p ẩm PCR ở ến 1 3 5 đều ó một băn rõ n t kí t ớ băn t ơn ứn 335 bp đ n t eo tín to n lý t u ết N vậ ặp m ND1-1 t ết kế là đặ ệu để n ân bản đo n ADN t uộ en ND1 ứ v trí 4164 và 4216 Sản phẩm cắt b ng enzyme NlaIII đ ợ đ ện di ở các giến 2 4 6 tron đó ếng 2, 6 sản phẩm cắt cho một băn ó kí t ớ t ơn ứng 335 bp thể hiện là mẫu không có biến đổi t i v trí 4164, giếng 4 minh h a cho mẫu có biến đổi hoàn toàn ở v trí 4164 hoặc 4216. Sử dụng p ơn p p iải trình t để khẳn đ nh kết quả PCR- RFLP (Hình 3.2).
Hình 3.2. Trình tự o Nt u ND1 ứa v tr 421 v 41 4 Hình A: không bị biế đổi tại vị trí 4216; 4164 nhân #3089), ị biế đổi tại vị trí 4216, biế đổi tại vị Dấu chấ o o đoạn ADN từ vì trí 4168-4213 Kết quả giải trình t trên những mẫu b cắt b ng enzyme NlaIII đã k ẳn đ nh, tất cả những mẫu này đều không có biến đổi t i v trí 4216 mà có biến đổi t i v trí 4164 Hơn nữa, kết quả giải trình t cho thấy t i v trí 4164 chỉ có một đỉn G tron tr ng hợp có biến đổi hoặ đỉn A tron tr ng hợp không có biến đổi vì vậy biến đổi A4164G t n t i ở d n đ ng tế bào chất. Ngoài ra, kết quả giải trình t còn chỉ ra một số v trí biến đổi khác thuộc gen ND1 g m: G4048A, C4071T, T4254C, T4108C, C4137T và A4263G, các biến đổ nà n t n t i ở d n đ ng tế bào chất. 3.1.1.2 Tần suất của biế ổ 41 4G v ố qua vớ ặ ể ệ ủa ệ UTĐTT Tổng hợp kết quả PCR-RFLP n tô đã sàn l đ ợc 11/86 mẫu ( ếm 12 79 ) ó b ến đổi t i v trí 4164, biến đổi trên mô u và LCU là không khác biệt. Sử dụn k ểm đ n ín x ủ F s er để đ n mối liên quan giữa tần suất của biến đổi A4164G với một số đặ đ ểm sinh bệnh h c của bện n ân UTĐTT kết quả cho thấ b ến đổ A4164G l n qu n vớ ớ tín và đo n T (P0 05) H ện nay, mới chỉ có công bố củ Yusn t và s 2010; W n và s 2011 đ r n ững dữ liệu sàng l b n đầu về biến đổi A4164G trên bện n ân UTĐTT n n kết quả n tô t u đ ợc về mối liên quan của biến đổi vớ đặ đ ểm bệnh h c là dữ liệu mới. Đặc biệt, khác với nghiên cứu của Akouchekian và cs (2011) tìm ra s phổ biến củ đột biến T4216C (có 8/30 bệnh nhân có biến đổi T4216C) trên nhóm bện n ân UTĐTT n i Iran (Akou ek n và s 2011), nghiên cứu của chúng tôi không thấ đột biến nà k sàn l ở 86 ặp mẫu mô UTĐTT n i Việt N m Đ ều này cho thấ đột biến T4216C là d ng hiếm gặp ở bện n ân UTĐTT n V ệt Nam. 3.1.2. Biế ổi A10398G thu c gen ND3 ở bệ â t i trực tràng Sử dụn p ơn p p PCR-RFLP với cặp m i 10398 và enzyme giới h n DdeI để x đ nh biến đổi A10398G thuộc gen ND3 Dùn p ơn p p ải trình t ADN để khẳn đ nh kết quả PCR-RFLP. Kết quả PCR-RFLP ả trìn t ở một số mẫu đ ợc minh h a trong Hình 33.
Hình 3.3. ện di sản phẩm PCR-RFLP và trình tự o n ADN chứa v trí 10398 (gel agarose 2%, nhu m EtBr) ếng M: Thang chuẩ N ế ối ch ng âm Giế đối ch d n phẩm cắt bằng enzyme c a plasmid đã đ ợc gi i trình tự dạng 1 9 và đ ợc trộn lại với nhau, Giếng 1,3: s n phẩm PCR: giếng 2, 4 s n phẩm cắt bằ ng c a mẫu nghiên c oạ ự N dạ 9 và 9 Hình 33A cho thấy, giếng 2 là mẫu ở d ng 10398A vì sản phẩm PCR sau khi cắt b ng enzyme DdeI o 2 băn ó kí t ớ t ơn ứng 196, 50bp, giếng 4 là mẫu ở d ng 10398G vì phẩm PCR sau khi cắt b ng enzyme DdeI o 3 băn ó kí t ớ t ơn ứn 158 bp 50 bp và 38 bp (băn 38 bp do kí t ớc nhỏ n n đã trô r n oà bản el) Kết quả PCR-RFLP đ ợ k ẳn đ n là ín x b n ải trình t (Hình 3B). Tổng hợp kết quả sàng l c biến đổi A10398G trên các mẫu nghiên cứu n tô đã x đ n đ ợc trên mô u có 47/86 mẫu (chiếm 54,7%) mang biến đổi A10398G, trên mô LCU là 49/86 mẫu (chiếm 57%). S khác biệt về tần suất A10398G giữ mô u và mô LCU là k ôn ó ý n ĩ t ống kê (P>0,05) (kiểm đ n χ2) . Trên mẫu đối chứng, biến đổ A10398G đ ợ x đ nh ở 31/67 mẫu (chiếm 46,3 %) thấp ơn so với mẫu un t . Sử dụn k ểm ín x F s er và K bìn p ơn (χ2) để đ n mối liên quan giữa biến đổi A10398G vớ đặ đ ểm bệnh h c của bện UTĐTT kết quả cho thấ b ến đổ A10398G l n qu n vớ đo n T (P0 05) Trên gen ND3, biến đổ A10398G đã đ ợ x đ nh ở các bệnh thoái hóa thần k n P rk nson Al e mer (V nder và s 2003; G e và s 2005) bệnh chuyển ó (Juo và s 2010) Đố vớ bệnh un t n ó các công bố l n qu n đến lo b ến đổ nà tu n n v trò ủa biến đổi A10398G liên qu n đến bện òn t ống nhất giữa các nghiên cứu đặc biệt vớ un t v (C nter và s 2005; Cov rrub s và s 2008; Ism ell và s 2013 Tr n đố t ợn UTĐTT dữ liệu l n qu n đến biến đổi A10398G vẫn còn h n chế.
3.1.3. t số v tr ế ổ ủa COX-1 và COX-2 ty thể COX-2 B ng cách giải trình t ADN tr c tiếp từ sản phẩm PCR nhân lên từ cặp m i COX-2.1 trên 31 mẫu mô u của 31 bện n ân UTĐTT n tô đã x đ n đ ợc 13 biến đổ tron đó ó 5 biến đổi làm thay đổi axit amin, tất cả các biến đổ đều ở d n đ ng tế bào chất (Hình 3.4). Hình 3.4. t số v tr ế ổ tr COX-2 t t ể ở mô u của bệ â UTĐTT Biế đổ 9 ở 9 9 ế đổi nucleotide 9 là đổ Biến đổi G7853A làm t đổi axit amin từ Valine (V) thành Isoleucine (I) (Mitomap), xảy ra với tần suất cao nhất trong 31 mẫu đ ợc giải trình t (4/31 tr ng hợp). Vì vậy, biến đổ G7853A đ ợ l n để sàn l c trên 55 bệnh nhân còn l i b n p ơn p p PCR-RFLP với cặp m i COX-2.2 và enzyme HincII. Kết quả PCR-RFLP ở một số mẫu đ ợc minh h a ở Hình 3.5. Hình 3.5. ệ sả p ẩ R-R o N ủa COX-2 (gel agarose 2,5% nhu m EtBr) Giếng M: Thang ADN chuẩn 50bp. Giếng (+) ối ch d n phẩ đ ợc cắt bằng enzyme c a mẫu có biế đổ đã đ ợc khẳ định bằng gi i trình tự); giếng:1,3,5,7,9,11: S n phẩm PCR; giếng: 2,4,6,8,10,12: S n phẩm cắt bằng enzyme HincII ng Hình 3.5 cho thấy, sản phẩm PCR (giến 1 3 5 7 9 11) ó kí t ơn ứn 472 bp băn rõ k ôn ó băn p ụ, chứng tỏ cặp m i COX-2 2 đ ợc thiết kế là đặc hiệu. Sản phẩm cắt en me t ơn ứng ở các giếng 2, 4, 8, 10 và 12 t u đ ợ 2 băn ó kí t ớ t ơn ứng 257, 215 bp là mẫu có biến đổi, giến 6 t u đ ợ 3 băn 215 144 113 bp là mẫu không có biến đổi. Tổng hợp kết quả giải trình t và kết quả phân tích PCR- RFLP đã x đ nh 16/86 (chiếm 18,6%) bệnh nhân có biến đổi G7853A ở mô u hoặc LCU. Trên mô u, tần suất biến đổi G7853A (15,1%) thấp
ơn so với mô LCU (21,3%). Tuy nhiên, s khác biệt nà k ôn ó ý n ĩ t ống kê (P>0,05). Trên mẫu đối chứng, biến đổ G7853A đ ợ x đ nh ở 13/67 mẫu (chiếm 19,4 %), thấp ơn so với mẫu un t . Biến đổ G7853A l n qu n vớ ớ tín và đo n T của bện n ân UTĐTT (P0,05). COX-1 T ơn t p ơn p p sàn l c các biến đổi trên gen COX-2 đối với gen COX-1 n tô đã x đ n đ ợc 17 biến đổ tron đó ó 5 b ến đổi làm t đổ x t m n t uộ en COX-1 t t ể (Hình 3.6). Đặc biệt, biến đổi C6340T t n t i ở d ng d tế bào chất (kết quả giải trình t n oà đỉnh T còn có một đỉnh C ở p í d ới (Hình 3.6C). Vì vậy, biến đổi này đ ợc l a ch n sàng l c ở các bệnh nhân còn l i b ng p ơn p p PCR-RFLP với cặp m i COX-1.2 và enzyme BccI để x đ nh tần suất của biến đổi. Hình 3.6 M t số v trí biế ổi của gen COX-1 ty thể ế đổ ế đổ ế đổ 99 Tổng hợp kết quả sàng l c biến đổi C6340T b n p ơn p p ải trình t và PCR-RFLP cho thấy, ở mô u có 1/86 (1,16%) mẫu biến đổi hoàn toàn từ C thành T, 1/86 mẫu (1,16%) biến đổi ở d n d tế bào ất Trên mô LCU có 1/86 mẫu biến đổi hoàn toàn và 2/86 mẫu có biến đổi ở d n d tế bào ất Tính chung, có 3/86 bệnh nhân có biến đổi C6340T ở mô u hoặc mô LCU. N vậy, biến đổi C6340T xảy ra với tần suất thấp và t n t i ở cả d n đ ng tế vào chất và d tế bào chất ở bện n ân UTĐTT n i Việt Nam. C o đến nay, trên thế giớ đã ó n ững công bố l n qu n đến một số biến đổi của gen COX-1 ty thể ở bện un t v UTĐTT un t t ền liệt tuyến (Ghatak và cs, 2014; Namslauer và cs, 2008; Chihara và cs, 2011 Arnold và cs, 2013). Có những biến đổi có thể gây ra hậu quả làm t đổi cấu trúc phân tử protein (Chihara và cs, 2011) hoặc làm giảm ho t động của phức hệ hô hấp tăn sản xuất các gốc ROS là nguyên nhân dẫn đến tăn tr ởng khối u trong ống nghiệm (Arnold và cs, 2013). Tóm l n tô đã sàn l và x đ n đ ợc tần suất xuất hiện của các biến đổi A4164G, A10398G C6340T và G7853A t ơn ứng ở trên các gen ND1, ND3, COX-1 và COX-2 ty thể ở một nhóm bện n ân UTĐTT n i Việt N m Đã đ n đ ợc mối liên quan của các biến đổi A4164G,
A10398G, G7853A vớ đặ đ ểm bệnh h c của bện UTĐTT Đặc biệt đã x đ n đ ợc các biến đổi A4164G A10398G G7853A đều l n qu n đến mứ độ xâm lấn khối u (gia đo n T) với tần suất cao nhất ở đo n T1, hai biến đổ A4164G A10398G luôn ó xu ớn đ k m vớ n u N vậy, với những kết quả này chúng tôi cho r ng các biến đổi A4164G, A10398G, G7853A có thể đón v trò tron đo n đầu xâm lấn khối u của UTĐTT 3.2. ẤT Đ ẠN ỚN Ủ NT T V UNG T Ư ĐẠ TRỰ TR NG Mất đo n lớn của ADN ty thể đặ b ệt mất đo n 4977 bp đã đ ợ x đn ó l n qu n đến nhiều lo i bện n bệnh ty thể, chuyển ó un t tron đó ó UTĐTT (http://www.mitomap.org; http://www. MitoBreak; C en và s 2011; D mbe và s 2014; Lee và s 2009) Đặc biệt, một số nghiên cứu còn cho thấy tỷ lệ mất đo n có s khác nhau ở các chủng tộ n i khác nhau (Dimbeg và cs, 2014; Dimbeg và cs, 2015). Do vậy, với nghiên cứu này chúng tôi khảo sát tỷ lệ và đ n l ợng mứ độ mất đo n lớn của ADN ty thể, tập trung vào mất đo n 4977 bp đ ng th i tìm hiểu mối liên quan giữa mất đo n vớ đặ đ ểm bệnh h c của bện UTĐTT ở Việt Nam. 3.2.1. Phát hiện mất o n 4977 bp và m t số mất o n lớn mới khác ở bệ â u t i trực tràng 3.2.1.1. X ịnh mấ o n 4977 bp Mất đo n 4977 bp của ADN ty thể đ ợ x đ nh b ng các phản ứng PCR sử dụng bốn cặp m i: Mt (Fmt và Rmt), 4977-1 (4977-1F và 4977-1R), 4977-2 (4977-2F và 4977-2R) và 10398 (10398F và 10398R) (Dimberg và cs, 2014) với khuôn là ADN ty thể có trong ADN tổng số đ ợc tách chiết từ các mẫu nghiên cứu. Tron đó sản phẩm cặp m i Mt (433bp) để x đ nh s có mặt của ADN ty thể trong ADN tổng số, sản phẩm PCR từ cặp m i 4977-1 đ ợc dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp m i 4977-2 (PCR l ng), sản phẩm PCR từ cặp m i 4977-2 (381 bp) để x đ nh có mất đo n 4977 bp, sản phảm PCR kích t ớc 246 bp từ m 10398 để x đ nh bản sao ADN không b mất đo n 4977 bp. Kết quả PCR từ các cặp m đ ợc minh h a ở Hình 3.7. Hình 3.7. ện di sản phẩ R từ ặp ồ t 4 -2 103 ủa t số ẫu nghiên cứu (gel agarose 2 %, nhu m EtBr) Hình A: Giếng M: thang ADN chuẩn 250 bp Giế ối ch d là n phẩm PCR c a các cặp mồi Mt, 4977- 9 đã đ ợ định bằng gi i trình tự. Giếng 2, 4, 6: s n phẩm PCR từ cặp Mt, 4977- 9 ng ở một mẫu nghiên c u. Hình B: Giếng M: thang ADN chuẩn 50 bp, Giếng 1: s n phẩm PCR c a mồi Mt, giếng 2-5: S n phẩm PCR từ cặp mồi 4977-2, giế đối ch ng âm.
Hình 3.7 cho thấy, sản phẩm PCR từ các cặp m mt đều có băn s n đặc hiệu kí t ớ đ n t eo đối chứn d ơn ( ếng 1, 2 Hình 3.7A) đ ều đó ứng tỏ trong ADN tổng số đều có ADN ty thể. Phần lớn các mẫu nghiên cứu đều ó băn 381 bp ( ếng 4 Hình 3.7A; giếng 2, 3, 5 Hình 3.7B) N vậy, kết quả này khẳn đ nh các mẫu phân tích có ADN ty thể b mất đo n 4977 bp. Thống kê kết quả sàng l c từ 86 ặp mẫu mô un t do Bệnh viện K cung cấp, 67 mẫu m u đối chứn n tô đã x đ nh có 60 bệnh nhân có mất đo n đ ng th i trên cả mô u và LCU. Tỷ lệ mất đo n 4977 bp ở mô u là 73/86 mẫu (84,9 ) o ơn so với mô LCU (61/86 mẫu), ở nhóm bện n ân o ơn so vớ n óm đối chứng (10/67 mẫu) (P
Hình 3.8. o n trình tự ADN ty thể ợ ố sau uất hiệ ất o ớn A: mấ đoạ 9 9 ấ đoạ C: mấ đoạ 9 ấ đoạn 4977 bp ũ ê ỉ vị trí nối sau khi mấ đoạn) Kết quả giải trình t đã x đ n đ ợc chính xác ba mất đo n lớn 5169 bp 5104 bp và 5094 bp Cả ba mất đo n lớn nà đều đ ợc công bố tr n ơ sở dữ liệu ngân hàng gen ty thể MITOMAP và MitoBreak, vì vậ đâ là mất đo n mớ mà n tô đã x đ n đ ợc. 3.2.2. Mối liên quan giữa t ệ ất o 4 p với c ặ ệnh h ủa ệ u t i trực tràng Mất đo n 4977 bp k ôn l n qu n đến đặ đ ểm n độ tuổi, giớ tín kí t ớc khối u, v trí un t mứ độ biệt ó đo n T N và đo n bện ủ một n óm bện n ân UTĐTT n i Việt Nam (p>0,05) (kiểm đ nh chính xác của Fisher). Kết quả nà n ó n ữn đ ểm t ơn đ ng với kết quả nghiên cứu của Chen và cs (2011). Tuy nhiên, khác so với kết quả của Chen và cs (2011), chúng tôi không tìm thấy s khác biệt về tỷ lệ mất đo n t eo độ tuổi. Bên c n đó kết quả nghiên cứu n ỉ ra r ng mất đo n 4977 bp là mất đo n phổ biến ở bện UTĐTT n i Việt N m N vậy, kết quả nà n phù hợp so vớ ôn bố tr ớc về tính phổ biến của lo đột biến này ở nhiều lo un t n un t vú (Dimbeg và cs, 2015, un t p ổi (Dai và cs, 2006, UTĐTT (D mber và s 2014; C en và s 2011). Đặc biệt, tỷ lệ mất đo n 4977 bp ở bện n ân UTĐTT n i Việt N m o ơn so với các lo i ung t k đã đ ợc công bố tr ớ đâ (C en và s 2011; Dimbeg và cs, 2015; Dani và cs, 2004). Tóm l i, mất đo n 4977 bp là lo i mất đo n phổ biến, tỷ lệ cao ở mô un t ủ một nhóm bệnh n ân UTĐTT n i Việt Nam và t n tai ở d ng d tế bào chất Tỷ lệ mất đo n ở mô u o ơn ó ý n ĩ t ốn k so vớ mô LCU (p
3.3.1. Xâ ự ờ uẩ op p p r a -t R ứ ất o ớn của ADN ty thể Để d n đ ợ đ ng chuẩn ND1 và ND4 pl sm d m n đo n gen ND1 và ND4 đ ợc tách dòng, tinh s x đ nh n n độ và số bản s o s u đó p loãn số bản sao plasmid theo hệ số 10 và tiến hành phản ứng real-time PCR t đ ểm p loãn đó Tóm tắt p ơn trìn và t ôn số đ ng chuẩn theo Bảng 3. 3. Bảng 3. 2. trì v t ô số của a ờng chuẩ ù o ợng mứ mất o n ADN ty thể ệ số Hệ số ế t T ờ trì ờ ệu quả t uẩ uẩ uế ặp tro ặp tro quan R2 ngày tuầ ND1 y = -3,40x + 33,3 0,999 96,8% 0,21-0,94 0,68-1,05 ND4 y = -3,62x + 37,8 0,999 90,9% 0,46-0,88 0,69-1,79 Bảng 3. cho thấ đ ng chuẩn đều có hệ số t ơn qu n ệu quả khuế đ i cao và hệ số biến thiên thấp N vậy, d a vào các thông số củ đ ng chuẩn ND1 và ND4 chúng tôi khẳn đ n đã xâ d ng đ ợ p ơn p p re l-t me PCR ó độ chính xác, tin cậy và ổn đ n để x đ nh mứ độ mất đo n lớn của ADN ty thể trên các mẫu nghiên cứu. 3.3.2. X nh mứ mất o n trên các mẫu nghiên cứu Áp dụn p ơn p p re l-time PCR với hai cặp m i ND1-2 và ND4, công thức tính mứ độ mất đo n nêu ở mục 2.3.11, mứ độ mất đo n lớn của ADN ty thể đã đ ợ x đ nh ở 60 cặp mô u và LCU của 60 bện n ân UTĐTT do bệnh viện K cung cấp. Những bệnh nhân này đã đ ợ x đ nh có mất đo n đ ng th i trên cả mô u và LCU b n p ơn p p PCR l ng. Kết quả đ n l ợng cho thấ ó 34/60 ( ếm 56 67 ) bện n ân UTĐTT ó mứ độ mất đo n ở mô u o ơn so với mô LCU. Giá tr trung v và khoảng tứ phân v của mứ độ mất đo n ở mô u, LCU t ơn ứng là 55,39 (52,09 - 57,98) và 54,48 (50,30 - 59 90) N vậy, mứ độ mất đo n lớn trên mô u có xu ớn o ơn so vớ mô LCU n n k b ệt k ôn ó ý n ĩ t ống kê. Trên mẫu mô UTĐTT phần lớn bệnh nhân có mứ độ mất đo n thuộc khoảng 50-60% (Hình 3.). Hình 3.9. Mứ mất o n ADN ty thể ở mô u và LCU Dấu tròn trong hộp là giá trị trung vị, các dấu là các giá trị ngoại biên